ES2856798T3 - Composiciones antimicrobianas que comprenden mupirocina y neomicina - Google Patents

Abstract

Una composición para una administración tópica a un sujeto que comprende mupirocina y neomicina como los únicos agentes terapéuticamente activos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones antimicrobianas que comprenden mupirocina y neomicina

La presente invención proporciona una composición que comprende mupirocina y neomicina para prevenir y tratar infecciones microbianas.

Antecedentes de la invención

La mupirocina es un agente antimicrobiano que inhibe la aminoacilación de Ile-ARNt mediada por isoleucil-ARNt sintetasa bacteriana y por ende, la traducción de proteínas. Véase Hughes J, Mellows G., "On the mode of action of pseudomonic: inhibition of protein synthesis in Staphylococcus aureus," The Journal of Antibiotics, 31:330-335 (1978); Hughes J, Mellows G., "Inhibition of isoleucyl-transfer ribonucleic acid synthetase in Escherichia coli by pseudomonic acid," The Biochemical Journal 176:305-318 (1978); Hughes J, Mellows G., "Interaction of pseudomonic acid A with Escherichia coli B isoleucyl-tRNA synthetase," The Biochemical Journal 191:209-219 (1980). El agente despliega actividad antibacteriana excelente hacia la mayoría de las especies gram-positivas, carece de resistencia cruzada a antibióticos actuales y es bien absorbido en seres humanos pero también se degrada rápidamente in vivo, y por ende, no es ideal para uso sistemático. Véase Sutherland R, Boon RJ, Griffin KE, Masters PJ, Slocombe B, White AR., "Antibacterial activity of mupirocin (pseudomonic acid), a new antibiotic for topical use," Antimicrob Agents Chemother 27:495-498 (1985). Sin embargo, se ha comprobado que los ungüentos a base de mupirocina son efectivos para el tratamiento de infecciones cutáneas y de heridas por S. aureus y también han surgido, recientemente, como el estándar de cuidado para la descolonización prequirúrgica nasal. Véase Beale AS, Gisby J, Sutherland R., "Efficacy of mupirocin calcium ointment in the treatment of experimental wound infections caused by methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus," Journal of Chemotherapy (Florencia, Italia) 1:397-398 (1989); Moy JA, Caldwell-Brown D, Lin AN, Pappa KA, Carter DM., "Mupirocin-resistant Staphylococcus aureus after long-term treatment of patients with epidermolysis bullosa, Journal of the American Academy of Dermatology 22:893-895 (1990); Rode H, de Wet PM, Millar AJ, Cywes S., "Bactericidal efficacy of mupirocin in multi-antibiotic resistant Staphylococcus aureus burn wound infection, The Journal of Antimicrobial Chemotherapy 21:589-595 (1988); Rode H, Hanslo D, de Wet PM, Millar AJ, Cywes S., "Efficacy of mupirocin in methicillin-resistant Staphylococcus aureus bum wound infection," Antimicrob Agents Chemother 33:1358-1361(1989); Coates T, Bax R, Coates A., "Nasal decolonization of Staphylococcus aureus with mupirocin: strengths, weaknesses and future prospects," The Journal of Antimicrobial Chemotherapy 64:9-15 (2009). Es más, se ha demostrado que la descolonización nasal mediada por mupirocina es eficaz en la reducción de infecciones por quemaduras, infecciones pulmonares, infecciones en pacientes con diálisis, infecciones en la zona quirúrgica, infecciones ortopédicas y por transmisión de S. aureus entre trabajadores de la salud y pacientes en la unidad de cuidados intensivos. Véase Mupirocin Study Group, "Nasal mupirocin prevents Staphylococcus aureus exitsite infection during peritoneal dialysis," Journal of the American Society of Nephrology : JASN 7:2403-2408 (1996); Gaspar MC, Uribe P, Sanchez P, Coello R, Cruzet F., "Hospital personnel who are nasal carriers of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Usefulness of treatment with mupirocin," Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica 10:107-110 (1992); Gernaat-van der Sluis AJ, Hoogenboom-Verdegaal AM, Edixhoven PJ, Spies-van Rooijen NH., "Prophylactic mupirocin could reduce orthopedic wound infections. 1,044 patients treated with mupirocin compared with 1,260 historical controls," Acta Orthopaedica Scandinavica 69:412-414(1998); Kluytmans JA, Mouton JW, VandenBergh MF, Manders MJ, Maat AP, Wagenvoort JH, Michel MF, Verbrugh HA., "Reduction of surgical-site infections in cardiothoracic surgery by elimination of nasal carriage of Staphylococcus aureus," Infection Control and Hospital Epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America 17:780-785 (1996); Mackie DP, van Hertum WA, Schumburg TH, Kuijper EC, Knape P, Massaro F., "Reduction in Staphylococcus aureus wound colonization using nasal mupirocin and selective decontamination of the digestive tract in extensive burns," Burns : Journal of the International Society for Burn Injuries 20 Suppl 1: S14-17; discussion S17-18 (1994); Talon D, Rouget C, Cailleaux V, Bailly P, Thouverez M, Barale F, Michel-Briand Y., "Nasal carriage of Staphylococcus aureus and cross-contamination in a surgical intensive care unit: efficacy of mupirocin ointment," The Journal of Hospital Infection 30:39-49 (1995); Wenisch C, Laferl H, Szell M, Smolle KH, Grisold A, Bertha G, Krause R., "A holistic approach to MRSA eradication in critically ill patients with MRSA pneumonia," Infection 34:148-154 (2006). Sin embargo, la resistencia a la mupirocina de S. aureus ha reducido la eficacia del agente como agente de descolonización nasal y como opción de tratamiento para infecciones cutáneas y de heridas.

Las cepas de S. aureus con baja resistencia a la mupirocina se definen comúnmente como que exhiben una MIC de 8 a 256 |jg ml-1 debido a las mutaciones en el gen de la isoleucil ARNt sintasa (ileRS) del organismo y se desarrollan rápidamente en un laboratorio como en un ámbito clínico. Véase Lee AS, Gizard Y, Empel J, Bonetti EJ, Harbarth S, Francois P., "Mupirocin-induced mutations in ileS in various genetic backgrounds of methicillin-resistant Staphylococcus aureus," J Clin Microbio' 52:3749-3754 (2014); la alta resistencia a la mupirocina (MIC de > 512 mg/L) ocurre con menos frecuencia y se atribuye a la adquisición de elementos genéticos móviles que alojan mupA, que codifica una isolecil ARNt sintetasa alternativa o un gen mupB menos caracterizado. Véase Fierobe L, Deere D, Muller C, Lucet JC, Marmuse JP, Mantz J, Desmonts JM., "Methicillin-resistant Staphylococcus aureus as a causative agent of postoperative intra-abdominal infection: relation to nasal colonization," Clin lnfect Dis 29:1231-1238 (1999); Seah C, Alexander DC, Louie L, Simor A, Low DE, Longtin J, Melano RG., "MupB, a new high-level mupirocin resistance mechanism in Staphylococcus aureus," Antimicrob Agents Chemother 56:1916-1920 (2012). Es más, una encuesta retrospectiva de aislados nasales y en sangre de S. aureus (MRSA) resistentes a la meticilina recolectados de 23 hospitales estadounidenses relevó que entre el 3 % y el 5 % de los aislados probados desplegaron una resistencia alta a la mupirocina, mientras que la resistencia baja a la mupirocina en un hospital oscila entre el 0 % y el 8 %. Véase Hetem DJ, Bonten MJ., "Clinical relevance of mupirocin resistance in Staphylococcus aureus," The Journal of Hospital Infection 85:249-256 (2013). Por lo tanto, aunque se ha demostrado que la mupirocina es un medio efectivo de mediación de la descolonización de S. aureus y la reducción de la infección, la resistencia a la mupirocina ha generado un nuevo interés en el desarrollo de una descolonización alternativa y las estrategias de tratamiento de la infección de heridas.

La RNasa P de S. aureus es un complejo riboproteico fundamental que consiste de RnpA y ribozima rnpB que actúa corriente arriba de las ARNt sintetasas en la vía de maduración del ARN transferencia. Más específicamente, RNasa P cataliza la eliminación de las secuencias líder 5' de las especies de ARNt precursor creando sustratos de ARNt maduros para ARNt sintetasas que incluyen isoleucil ARNt sintetasa (la diana celular para mupirocina). Con el reconocimiento de que dos antimicrobianos dirigidos a etapas independientes de la misma vía metabólica bacteriana pueden tener efectos antibacterianos combinados, se ha llegado a la hipótesis de que las terapias de combinación que incluyen mezclas de inhibidores ARNasa P junto con mupirocina desplegarían una mayor eficacia antimicrobiana y el potencial de superar la resistencia a la mupirocina. Sin embargo, la combinación de los inhibidores de ARNasa P con los inhibidores de ARNt sintetasa para el tratamiento de una infección bacteriana o la inhibición del crecimiento bacteriano no ha demostrado, de manera uniforme, los efectos terapéuticos sinérgicos in vitro, y hasta ahora, ninguna de las terapias de combinación conocidas que usan los compuestos de estas dos categorías ha demostrado efectos sinérgicos in vivo en el tratamiento de infecciones bacterianas o en la inhibición del crecimiento bacteriano.

Boyce ST, Warden GD, Holder IA, "Noncytotoxic combinations of topical antimicrobial agents for use with cultured skin substitutes", Antimicrob. Agents Chemother. 39:1324-1328 (1995) describe la administración de una composición que comprende 700U/ml de polimixina B, 40 pg/ml de neomicina y 40 pg/ml de mupirocina en combinación con 0,25 de amfotericina B o 100 U/ml de nistatina y 20 pg/ml de ciprofloxacina o 20 pg/ml de norfloxacina en varias células in vitro para determinar la inhibición del crecimiento de queratinocitos o fibroblasto, así como la actividad contra bacterias gramnegativas, grampositivas y hongos.

Boyce ST, Harriger MD, Supp AP, Warden GD, Holder IA, "Effective management of microbial contamination in cultured skin substitutes after grafting to athymic mice", Wound Repair Regen. 5:191-197 (1997) describe la administración de una composición que comprende 700000 U/I de polimixina B, 40 mg/l de neomicina, 20 mg/l de mupirocina, 20 mg/l de ciprofloxacina, 1 mg/l de amfotericina B, 5 mg/l de insulina y 0,5 mg/l de hidrocortisona para heridas infectadas experimentales en ratones, con el fin de desarrollar un protocolo para una mayor supervivencia de sustitutos cutáneos.

Blanchard C, Brooks L, Beckley A, Colquhoun J, Dewhurst S, Dunman PM, "Neomycin Sulfate Improves the Antimicrobial Activity of Mupirocin-Based Antibacterial Ointments", Antimicrob. Agents Chemother. 60:862-872 (2016) demuestra que el sulfato de neomicina, antibiótico, potencia la actividad antimicrobiana de la mupirocina. La actividad antimicrobiana de neomicina y mupirocina se mantuvo en formulaciones de ungüento y redujo la carga bacteriana de S. aureus en modelos murinos de colonización nasal e infecciones en el lugar de la herida.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona una composición que tiene una eficacia antimicrobiana mejorada y es eficaz para inhibir, reducir o tratar infecciones microbianas como infecciones bacterianas, y/o par descolonizar un organismo microbiano y/o para destruir, interrumpir, inhibir o reducir la formación de biopelícula bacteriana. En la presente se describe el sorprendente e inesperado descubrimiento de que una composición que comprende una combinación de mupirocina y neomicina, cuando se usa para tratar un organismo microbiano, demuestra un efecto sinérgico contra una colonización o infección microbiana o formación de biopelícula.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para la administración tópica a un sujeto que comprende mupirocina y neomicina como los únicos agentes terapéuticamente activos. En una realización, la relación en peso entre mupirocina y neomicina oscila entre 10: y 1:10.

En una realización, la concentración total de mupirocina y neomicina en la composición de la presente invención es de un 50 por ciento en peso (% en peso), un 40 % en peso, un 30 % en peso un 25 % en peso, un 20 % en peso, un 15 % en peso, un 10 % en peso, un 5 % en peso, un 3 % en peso, un 2 % en peso, un 1 % en peso por unidad de la composición.

La composición descrita en la presente es para la administración tópica a un sujeto. En una realización, el sujeto tiene una infección microbiana. Preferiblemente, la infección microbiana se caracteriza por colonias microbianas o formación de biopelícula. Preferiblemente, la infección microbiana es una infección bacteriana. En una realización, la infección por bacterias es de una bacteria grampositiva o gramnegativa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación tópica que comprende mupirocina y neomicina como los únicos agentes terapéuticamente activos y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de mupirocina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de neomicina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de mupirocina y entre un 0,001 % en peso y un 8 % de neomicina por unidad de la formulación.

En una realización, la formulación tópica de la presente invención comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de mupirocina y entre un 0,001 % en peso y un 8 % de neomicina en una relación de 10:1 y 1:10 entre mupirocina y neomicina por unidad de la formulación.

En una realización, la formulación tópica de la presente invención puede tener la forma de una crema, una loción, un ungüento, un hidrogel, un coloide, un gel, una espuma, un aceite, una leche, una suspensión, un paño, una esponja, una solución, una emulsión, una pasta, un parche, un hisopo, un apósito, un spray o una almohadilla.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición como se describe en la presente para uso en un método de descolonización de un organismo microbiano en un sujeto que comprende contactar el organismo microbiano con la composición mencionada.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición como se describe en la presente para uso en un método de destrucción o interrupción o inhibición o reducción de la formación de biopelícula de un organismo microbiano en un sujeto que comprende contactar el organismo microbiano con la composición mencionada.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición como se describe en la presente para uso en un método de para tratar una infección microbiana en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha composición.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método ex vivo de descolonización de un organismo microbiano o de destrucción o interrupción o inhibición o reducción de la formación de un organismo microbiano en una superficie de un dispositivo que comprende contactar el organismo microbiano con la composición mencionada.

La formación de biopelícula puede ser en una superficie de un dispositivo. La formación de biopelícula puede ser en una superficie de un sujeto o en un tejido de un sujeto. La formación de biopelícula puede ser en la piel, en los ojos, en la membrana de la mucosa o en la superficie de una cavidad.

Descripción breve de las figuras

La Figura 1 muestra que la neomicina inhibe la capacidad de la RNasa P de S. aureus de catalizar la maduración del precursor de ARNttYr in vitro.

Las Figuras 2A a 2C muestran que la formulación de ungüento no se opone a la inhibición microbiana de la mupirocina o neomicina y que la combinación de mupirocina y la neomicina en la formulación de ungüento tiene una depuración antimicrobiana.

Las figuras 2D y 2E muestran que las combinaciones de mupirocina y otros antibióticos exhiben una depuración antagonista o no exhiben depuración antimicrobiana mejorada en la formulación de ungüento.

Las figuras 3A-3C muestran efectos de descolonización mejorada por el tratamiento de combinación de mupirocina y neomicina.

Las figuras 4A-4C muestran efectos de descolonización mejorada de la herida por el tratamiento de combinación de mupirocina y neomicina.

La figura 5 muestra actividad antimicrobiana hacia otras especies de bacterias por el tratamiento de combinación de mupirocina y neomicina.

Las figuras 6A y 6B muestran que la combinación de mupirocina y neomicina no afecta negativamente el curado de heridas, la contracción de heridas o el peso de los animales tratados.

Las figuras 7A y 7B muestran datos comparativos sobre los efectos antimicrobianos de la mupirocina y el tratamiento de combinación RNPA2000 en la descolonización nasal y de heridas.

Las figuras 8A y 8B muestran la actividad antimicrobiana hacia S.aureus del aislado clínico por el tratamiento de combinación de mupirocina y neomicina.

Descripción detallada

A los efectos de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y cuando corresponda, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa.

Como se usa en la presente, el término “organismo microbiano” o “microbio” o “microbiano” o “microorganismo” se refiere a un dominio (bacteria) de microorganismos procariotas redondos, en forma de espiral o en forma de vara, unicelulares, pluricelulares o acelulares que pueden carecer de paredes celulares o son grampositivos o gramnegativos o una alteración de estos (es decir, micobacteria) si tienen paredes celulares, que suelen agruparse en colonias o móviles mediante flagelos, que viven, generalmente, en suelo, agua, materia orgánica o los cuerpos de plantas y animales, que suelen ser autótrofos, saprófitos o parásitos en nutrición y que tienen efectos bioquímicos y patogenicidad. El término pretende abarcar las células procariotas y eucariotas u organismos que tienen un tamaño microscópico e incluye bacterias, virus, arqueas, y eubacteria de todas las especies, así como también microorganismos eucariotas como levadura y hongos. El término también incluye cultivos celulares de cualquier especie que se pueden cultivar para la producción de un bioquímico. En un ejemplo no limitante, la actividad de un organismo microbiano se puede medir calculando la reducción logarítmica en número del microorganismo.

Como se utiliza en la presente, el término “colonización microbiana” se refiere a la formación de grupos de población compacta del mismo tipo de microorganismo, como las colonias que se desarrollan cuando una célula microbiana comienza a reproducirse. La colonización microbiana puede causar síntomas de enfermedad o no. La descolonización se refiere a una reducción en el número de organismos microbianos presentes. Cuando los organismos microbianos se descolonizan por completo, los organismos microbianos han sido erradicados y son no detectables.

Como se utiliza en la presente, el término “biopelícula” se refiere a acumulaciones microbianas encerradas por una matriz en superficies biológicas o no biológicas en donde los microorganismos se dispersan y/o forman colonias. La biopelícula está hecha, típicamente, de polisacáridos y otras macromoléculas. La formación de biopelículas representa un modo protegido de crecimiento que permite a las células sobrevivir en entornos hostiles.

Como se usa en la presente, el término “formación de biopelícula” pretende incluir la formación, el crecimiento y la modificación de las colonias microbianas contenidas con estructuras de biopelícula, así como la síntesis y el mantenimiento de una matriz de polisacáridos de las estructuras de biopelícula. Asimismo, dentro del alcance de este término se encuentra la formación de biopelículas basadas en proteínas que no secretan polisacáridos en la matriz pero que comprenden proteínas que permiten que las bacterias formen una arquitectura de biopelícula.

Como se usa en la presente, el término “sujeto” se refiere a un animal. Preferiblemente, el animal es un mamífero. Un sujeto también hace referencia a, por ejemplo, primates (por ejemplo, seres humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces y pájaros. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano.

Como se usa en la presente, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” de un compuesto de la presente invención se refiere a una cantidad del compuesto de la presente invención que suscitará la respuesta biológica o médica de un sujeto, o aliviará síntomas, ralentizará o demorará el avance de la enfermedad o evitará una enfermedad. En una realización, el término se refiere a la cantidad que inhibe o reduce la colonización o infección microbiana. En una realización, el término se refiere a la cantidad que inhibe o reduce la infección bacteriana, o evita o destruye la formación de biopelículas bacterianas. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a dicho ingrediente por sí solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que generan un efecto terapéutico, ya sea que se administren en combinación, en serie o en forma simultánea.

Como se usa en la presente, el término “vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a un medio portador o un excipiente que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos de la composición y que no es excesivamente tóxico al huésped en las concentraciones en las que se administra. En el contexto de la presente invención, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable es preferiblemente adecuado para la formulación tópica. El término incluye un disolvente, un estabilizador, un solubilizador, un agente mejorador de la tonicidad, un agente formador de estructuras, un agente de suspensión, un agente dispersante, un agente quelante, un agente emulsionante, un agente antiespumante, una base de ungüento, un emoliente, un agente protector de piel, un agente formador de gel, un agente espesante, un agente ajustador del pH, un conservante, un mejorador de la penetración, un agente acomplejante, un lubricante, un demulcente, un mejorador de la viscosidad, un polímero bioadhesivo, o una combinación de estos. El uso de los agentes mencionados para la formación de sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA).

Como se usa en la presente, el término “que trata” o “tratamiento” de una enfermedad o trastorno hace referencia en una realización, a la mejora de la enfermedad o el trastorno (es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de estos). En otra realización, “que trata” o “tratamiento” hace referencia a mejorar al menos un parámetro físico, que puede no ser discernible por el paciente. En otra realización, “que trata” o “tratamiento” hace referencia a la modulación de la enfermedad o del trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico) o ambos. En otra realización, “que trata” o “tratamiento” se refiere a evitar o demorar el comienzo o el desarrollo o la progresión de la enfermedad o del trastorno. El término “que trata” o “tratamiento” también hace referencia a una reducción en la gravedad de uno o más síntomas en un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 100 %.

Como se utiliza en la presente, el término “administración tópica” se refiere a la administración a un sujeto por contacto de la formulación directamente con una superficie o región localizada del sujeto. La forma más común de administración tópica es la piel, pero una composición divulgada en la presente también puede aplicarse, directamente, en otras superficies del cuerpo, p.ej., los ojos, la membrana de la mucosa, las superficies de una cavidad corporal o una superficie interna. Como se mencionó anteriormente, la administración tópica más común es la piel. El término abarca varias vías de administración que incluyen la administración tópica y transdérmica. Estos modos de administración incluyen, típicamente, la penetración de la barrera de permeabilidad de la piel y la administración eficiente al tejido o estrato diana. La administración tópica se puede usar como un medio para penetrar la epidermis y la dermis y finalmente lograr la administración sistémica de la composición.

Como se usa en la presente, el término “formulación tópica” (sinónimo de “composición tópica”) se usa en la presente para hacer referencia a una preparación farmacéutica dirigida a la aplicación tópica o local en una región afectada de un sujeto que lo necesita, e incluye formas de dosis como gel, crema, ungüento, emulsión, suspensión, solución, gotas, loción, pintura, pesario, ducha, supositorio, comprimido, spray, esponja, película o espuma. Preferiblemente, la formulación tópica tiene la forma de una crema, un gel o un ungüento.

Como se usa en la presente, el término «un», «una», «el/la» y los términos similares usados en el contexto de la presente invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) se debe interpretar como que cubre tanto el plural como el singular a menos que en la presente se indique lo contrario o claramente esté contradecido por el contexto. El recitado de rangos de valores sirve meramente como un método abreviado de hacer referencia individualmente a cada valor independiente abarcado por el rango. Salvo que se indique lo contrario, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si fuera enumerado de manera individual en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario o a menos que el contexto claramente lo contradiga. El uso de cualquiera de los ejemplos, el lenguaje ejemplar (como por ejemplo, “como”) proporcionado en la presente tiene como intención meramente clarificar la invención. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica un elemento no reivindicado fundamental para la práctica de la invención.

Como se usa en la presente, el término “aproximadamente” se refiere a dentro del 10 %, preferiblemente dentro del 5 %, y más preferiblemente dentro del 1 % de un valor o rango determinado. Alternativamente, el término “aproximadamente” se refiere a dentro de un error estándar aceptable de significado, cuando es considerado por un entendido en la técnica

La presente invención proporciona una composición que tiene una eficacia antimicrobiana mejorada y es eficaz para inhibir, reducir o tratar infecciones microbianas como infecciones bacterianas, y/o par descolonizar un organismo microbiano y/o para destruir, interrumpir, inhibir o reducir la formación de biopelícula bacteriana. En la presente se describe el sorprendente e inesperado descubrimiento de que una composición que comprende una combinación de mupirocina y neomicina, cuando se usa para tratar un organismo microbiano, demuestra un efecto sinérgico contra una colonización o infección microbiana o formación de biopelícula. Como se usa en la presente, el término «sinérgico» hace referencia al efecto obtenido de combinar compuestos y/o agentes que es mayor que el efecto obtenido por la adición independiente de cada compuesto. El tratamiento de combinación de la presente invención ha demostrado un efecto sinérgico como es medido, por ejemplo, por el grado de respuesta, la duración de la respuesta, la velocidad de la respuesta, la tasa de estabilización, la duración de la estabilización, el tiempo para reducir o limpiar infecciones, el tiempo para erradicar a los microorganismos, hasta el alcanzable en la administración de uno u otro de los compuestos del tratamiento de combinación en su dosis convencional. Por ejemplo, el efecto del tratamiento de combinación de la presente invención es sinérgico porque el tratamiento de combinación es terapéuticamente superior al efecto alcanzable con un componente solo o el efecto aditivo de los componentes de combinación que actúan por separado. El efecto superior puede ser una mejor reducción en la resistencia al fármaco de los organismos microbianos, el grado en el que los organismos microbianos son erradicados y se vuelven no detectables por el tratamiento de combinación. También, por ejemplo, el efecto del tratamiento de combinación de la presente invención es sinérgico dado que lleva menos tiempo eliminar los microorganismos y limpiar las infecciones. También, por ejemplo, el efecto del tratamiento de combinación de la presente invención es sinérgico porque el tratamiento de combinación ofrece un espectro más amplio de actividades microbianas que aquellas con un solo componente. También, por ejemplo, el efecto del tratamiento de combinación de la presente invención es sinérgico porque uno de los componentes en la composición descrita en la invención se administra en su dosis convencional y los otros componentes se administran a una dosis reducida y el efecto terapéutico, medido por ejemplo, por el grado de eliminación y/o inhibición del crecimiento de microorganismos como bacterias, el tiempo para eliminar y/o inhibir el crecimiento de microorganismos como bacteria, o el tiempo para destruir o inhibir colonias microbianas, o el tiempo para interrumpir o inhibir o reducir la formación o el crecimiento de biopelícula, es equivalente al alcanzable en cantidades convencionales de dosis de los componentes del tratamiento de combinación.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende mupirocina y neomicina como los únicos agentes terapéuticamente activos. En una realización, la relación en peso entre mupirocina y neomicina oscila entre 10: y 1:10. En una realización, la relación en peso entre mupirocina y neomicina oscila entre 4: y 1:4. En una realización, la relación en peso entre mupirocina y neomicina oscila entre 2: y 1:2. En una realización, la relación en peso entre mupirocina y neomicina es 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 3:1, 4:1, o 5:1. En una realización, la concentración total de mupirocina y neomicina en la composición de la presente invención oscila entre 1 % en peso y 50 % en peso. En una realización, la concentración total de mupirocina y neomicina en la composición de la presente invención es de un 50 por ciento en peso (% en peso), un 40 % en peso, un 30 % en peso un 25 % en peso, un 20 % en peso, un 15 % en peso, un 10 % en peso, un 5 % en peso, un 3 % en peso, un 2 % en peso, un 1 % en peso por unidad de la composición.

La composición descrita en la presente es para la administración tópica a un sujeto. En una realización, el sujeto tiene una infección microbiana o una colonización por microbios. Preferiblemente, el lugar de la infección o la colonización microbiana se caracteriza por colonias microbianas o formación de biopelícula. Preferiblemente, la infección microbiana es una infección bacteriana. En una realización, la infección por bacterias es de una bacteria grampositiva o gramnegativa. En una realización, la infección bacteriana se selecciona de uno de Staphylococcus spp., p.ej., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Enterococcus spp., p.ej., Enterococcus faecalis; Klebsiella spp., p.ej., Klebsiella pneumoniae; Acinetobacter spp., p.ej., Acinetobacter baumannii; Pseudomonas spp., p.ej., Pseudomonas aeruginosa; Enterobacter spp.; Streptococcus pyogenes; Listeria spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacterium spp., p.ej., Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacterspp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., p.ej., Streptococcus Grupo A o B, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., p.ej., Helicobacter pylori; Neisseria spp., p.ej., Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis; Borrelia burgdorferi; Shigella spp., p.ej., Shigellaflexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp., p.ej., Haemophilus influenzae; Chlamydia spp., p.ej., Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Francisellafularensis; Bacillus spp., p.ej., Bacillus anthracis; Clostridia spp., p.ej., Clostridium botulinum; Yersinia spp., p.ej., Yersiniapestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; p.ej., Burkholderia malleiand B pseudomallei, o la combinación de estos. Preferiblemente, la infección proviene de uno de los patógenos ESKAPE que incluyen Enterococcus spp., p.ej., Enterococcus faecalis; Staphylococcus spp., p.ej., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Klebsiella spp., p.ej., Klebsiella pneumoniae; Acinetobacter spp., p.ej., Acinetobacter baumannii; Pseudomonas spp., p.ej., Pseudomonas aeruginosa; Enterobacterspp., o la combinación de estos. Asimismo, en una realización, las bacterias se seleccionan de Acidothermus cellulyticus, Actinomyces odontolyticus, Alkaliphilus metalliredigens, Alkaliphilus oremlandii, Arthrobacter aurescens, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidiobacterium longum, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium ace-tobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium botulinum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium difficile, Clostridium kluyveri, Clostridium leptum, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium thermocellum, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Desulfitobacterium hafhiense, Desulfotomaculum reducens, Eubacterium ventriosum, Ex-iguobacterium sibiricum, Finegoldia magna, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus thermodenitrificans, Janibacter sp., Kineococcus radiotolerans, Lactobacillus fermentum, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria welshimeri, Moorella thermoacetica, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vanbaalenii, Nocardioides sp., Nocardia farcinica, Oceanobacillus iheyensis, Pelotomaculum thermopropionicum, Rhodococcus sp., Saccharopolyspora erythraea, coagulase-negative Staphylococcus species, Staphylococcus aureus, methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Staphylococcus epidermidis, methicillin resistant Staphylococcus epidermidis, (MRSE), Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus delphini, Streptococcus agalactiae, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis, Streptococcus suis, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter tengcongensis, o la combinación de estos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación tópica que comprende mupirocina y neomicina como los únicos agentes terapéuticamente activos y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de mupirocina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de neomicina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de mupirocina y entre un 0,001 % en peso y un 8 % de neomicina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,001 % en peso y un 4 % en peso de mupirocina y entre un 0,001 % en peso y un 4 % de neomicina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,015 % en peso y un 2 % en peso de mupirocina y entre un 0,015 % en peso y un 2 % de neomicina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica comprende entre un 0,25 % en peso y un 1 % en peso o un 2 % en peso de mupirocina y uno seleccionado de entre un 0,25 % en peso, un 0,5 % en peso, o un 1 % en peso de neomicina por unidad de la formulación.

En una realización, la formulación tópica de la presente invención comprende entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso de mupirocina y entre un 0,001 % en peso y un 8 % de neomicina en una relación de 10:1 y 1:10 entre mupirocina y neomicina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica de la presente invención comprende entre un 0,001 % en peso y un 4 % en peso de mupirocina y entre un 0,001 % en peso y un 4 % de neomicina en una relación de 4:1 y 1:4 entre mupirocina y neomicina por unidad de la formulación. En una realización, la formulación tópica de la presente invención comprende entre un 0,015 % en peso y un 0,5 % en peso de mupirocina, entre un 0,015 % en peso y un 0,5 % de neomicina y una relación de 2:1 y 1:2 entre mupirocina y neomicina por unidad de la formulación.

En una realización, la formulación tópica de la presente invención puede tener la forma de una crema, una loción, un ungüento, un hidrogel, un coloide, un gel, una espuma, un aceite, una leche, una suspensión, un paño, una esponja, una solución, una emulsión, una pasta, un parche, un hisopo, un apósito, un spray o una almohadilla.

La formulación tópica de la presente invención comprende uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen materiales portadores como disolvente, un estabilizador, un solubilizador, un relleno, un agente mejorador de la tonicidad, un agente formador de estructuras, un agente de suspensión, un agente dispersante, un agente quelante, un agente emulsionante, un agente antiespumante, una base de ungüento, un emoliente, un agente protector de la piel, un agente formador de gel, un agente espesante, un agente ajustador de pH, un conservante, un mejorador de la penetración, un agente acomplejante, un lubricante, un demulcente, un mejorador de la viscosidad, un polímero bioadhesivo, o una combinación de estos.

Los ejemplos de disolventes son agua o agua purificada, alcoholes (por ejemplo, etanol, alcohol bencílico), aceites vegetal, marino y mineral, polietilenglicoles, propilenglicoles, glicerol, y polialquilsiloxanos líquidos.

Los diluyentes o rellenos inertes pueden ser sacarosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa microcristalina, almidones, carbonato de calcio, cloruro de sodio, lactosa, fosfato de calcio, sulfato de calcio, o fosfato de sodio.

Los ejemplos de los agentes amortiguadores incluyen ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido hidrogenofosfórico, dietilamina, hidróxido de sodio y trometano (por ejemplo, hidrocloruro de tris(hidroximetil)aminometano).

Los agentes de suspensión son, por ejemplo, gomas naturales (por ejemplo, goma arábiga, xantana, y goma tragacanto), celulosas (por ejemplo, carboximetil-, hidroxietil-, hidroxipropil- e hidroxipropilmetilcelulosa) alginatos y quitosanos).

Los ejemplos de agentes de exceso de humedad dispersantes son, naturalmente, fosfátidos (por ejemplo, lecitina, o lecitina de soja), productos de condensación de óxido de etileno con ácidos grasos o con alcoholes alifáticos de cadena larga (por ejemplo, estearato de polioxietileno, monooleato de sorbitol polioxietilenado y monooleato de sorbitán polioxietilenado).

Los conservantes se pueden agregar a una composición tópica de la invención para evitar la contaminación microbiana que puede afectar la estabilidad de la formulación y/o causar infección en el paciente. Los ejemplos adecuados de conservantes incluyen parabenos (como metilo, etilo, propilo, /p-hidroxibenzoato, butilo, isobutilo e isopropilparabeno), sorbato de potasio, ácido sórbico, ácido benzoico, metil benzoato, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hidantoína, yodopropinil butil-carbamato, cloruro de benzalconio, cetrimida, y alcohol bencílico.

Los ejemplos de agentes quelantes incluyen EDTA sódico y ácido cítrico.

Los ejemplos de bases de gel o agentes que aumentan la viscosidad son parafina líquida, polietileno, ácidos grasos, sílice coloidal o aluminio, glicerol, propilenglicol, carbonato de propileno, polímeros de carboxivinilo, silicatos de magnesio y aluminio, polímeros hidrofílicos (como por ejemplo, almidón o derivados de celulosa), hidrocoloides que absorben la humedad, carragenanos, hialuronatos, alginatos y acrilatos.

Las bases de ungüento adecuadas para uso en las composiciones de la presente invención pueden ser hidrófobas o hidrofílicas, e incluyen parafina, lanolina, polialquilsiloxanos líquidos, cetano, cetil palmitato, aceites vegetales, ésteres de sorbitán de ácidos grasos, poletilenglicoles, y productos de condensación entre ésteres de sorbitán de ácidos grasos, óxido de etileno (por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado), polisorbatos, petrolato blanco y cera blanca.

Los ejemplos de humectantes son etano, glicerina de isopropanol, propilenglicol, sorbitol, ácido láctico y urea. Los emolientes adecuados incluyen colesterol y glicerol.

Los ejemplos de protectores cutáneos incluyen vitamina E, alatoína, glicerina, óxido de zinc, vitaminas y agentes bloqueadores.

Los agentes espesantes se usan generalmente para aumentar la viscosidad y mejorar las propiedades bioadhesivas de composiciones farmacéuticas o cosméticas. Los ejemplos de agentes espesantes incluyen celulosas, polietilenglicol, óxido de polietileno, gomas naturales, gelatina, karaya, pectina, ácido algínico, povidona, y polímeros de Carbopol® son de particular interés los agentes espesantes con propiedades tixotrópicas (es decir, agentes cuya viscosidad disminuye por agitación). La presencia del agente mencionado en una composición permite la reducción de la composición al momento de la administración para facilitar su aplicación en la piel, y el aumento después de la aplicación para que la composición permanezca en el lugar de administración.

Los polímeros bioadhesivos son útiles para hidratar la piel y mejorar su permeabilidad. Los polímeros bioadhesivos pueden también funcionar como agentes espesantes. Los ejemplos de polímeros bioadhesivos incluyen pectina, ácido algínico, quitosano, polisorbatos, poletilenglicol, oligosacáridos y polisacáridos, ésteres de celulosa y éteres de celulosa, y polímeros de celulosa modificados.

Los agentes mejoradores de la permeabilidad son vehículos que contienen agentes específicos que afectan la administración de componentes activos a través de la piel. Los agentes mejoradores de la permeabilidad se dividen, generalmente en dos clases: disolventes y compuestos activos de superficie (moléculas anfifílicas). Los ejemplos de los agentes mejoradores de la permeabilidad de disolventes incluyen alcoholes (por ejemplo, etilenglicol, alcohol isopropílico), dimetil formamida, dimetil acetamida, dimetil sulfóxido, 1-dodecilazocilheptano-2-ona, N-decilmetilsufóxido, ácido láctico, N,N-dietil-m-toluamida, N-metil pirrolidona, nonano, ácido oleico, petrolato, polietilenglicol, propilenglicol, ácido salicílico, urea, terpenos y tricloroetanol. Los agentes mejoradores de la permeabilidad de tensioactivos pueden ser no iónicos, anfotéricos, catiónicos o zwitteriónicos. Tensioactivos no iónicos adecuados incluyen copolímeros en bloque de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno), comercialmente conocidos como poloxámeros; aceites de ricino hidrogenados y etoxilados; polisorbatos, como Tween® 20 o Tween® 80. Tensioactivos anfotéricos incluyen derivados de imidazol cuaternizados, tensioactivos catiónicos incluyen cloruro de cetipiridinio, y tensioactivos zwitteriónicos incluyen betaínas y sulfobetaínas. Otros ejemplos de mejoradores de la permeabilidad adecuados incluyen pentadecalactona, 2-pirrolidina, 1-dodecal-azacicloheptano-2-ona, tioglicolato de calcio, hexanol, derivados de 1,3-dioxanos (es decir, 1,3-dioxaciclohexanos) and 1,3-dioxalanos (es decir, 1,3-dioxaciclopentanos), ácido 1-N-dodecil-2-pirrolidona-5-carboxílico, ácido 2-pentil-2-oxo-pirrolidineacético, ácido 2-dodecil-2-oxo-l-pirrolidineacético, y ácido 1-azacicloheptan-2-ona-2-dodecilacético, entre otros.

En la presente se divulga un método para tratar una infección microbiana en un sujeto que comprende administrar al sujeto por separado, de manera simultánea o secuencial una cantidad terapéuticamente efectiva de mupirocina y neomicina. El método puede comprender administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende mupirocina y neomicina descrita en la presente. El método puede comprender administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación tópica que comprende mupirocina y neomicina descritas en la presente y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, donde la formulación tópica y los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables se definen a través de la memoria descriptiva. En una realización, la infección es una infección tópica. La infección tópica es una infección en una superficie o región localizada de un sujeto que incluye la piel, los ojos, una membrana de la mucosa y una superficie de una cavidad. En una realización, la infección tópica es la infección en la piel. En una realización, la infección tópica tiene la forma de herida, úlcera y lesión. De conformidad con cualquiera de los métodos aquí descritos, el organismo microbiano es una bacteria. Preferiblemente, la bacteria es una seleccionada de los patógenos ESKAPE que incluyen Enterococcus spp., p.ej., Enterococcus faecalis; Staphylococcus spp., p.ej., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Klebsiella spp., p.ej., Klebsiella pneumoniae; Acinetobacter spp., p.ej., Acinetobacter baumannii; Pseudomonas spp., p.ej., Pseudomonas aeruginosa; Enterobacter spp., o la combinación de estos.

En una realización, la presente invención proporciona una composición como se discute en la presente para uso en un método de descolonización de un organismo microbiano que comprende contactar el organismo microbiano con mupirocina y neomicina. El método puede comprender poner en contacto el organismo microbiano con una formulación tópica que comprende mupirocina y neomicina descritas en la presente y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, donde la formulación tópica y los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables se definen a través de la memoria descriptiva. De conformidad con cualquiera de los métodos aquí descritos, el organismo microbiano es una bacteria. Preferiblemente, la bacteria es una seleccionada de los patógenos ESKAPE que incluyen Enterococcus spp., p.ej., Enterococcus faecalis; Staphylococcus spp., p.ej., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Klebsiella spp., p.ej., Klebsiella pneumoniae; Acinetobacter spp., p.ej., Acinetobacter baumannii; Pseudomonas spp., p.ej., Pseudomonas aeruginosa; Enterobacter spp., o la combinación de estos. De conformidad con cualquiera de los métodos ex vivo aquí descritos, la formación de biopelícula está en una superficie de un dispositivo. De conformidad con cualquiera de los métodos aquí descritos, la formación de biopelícula está en una superficie de un sujeto o tejido de un sujeto. En una realización, la formación de biopelícula está en la piel, en los ojos, en la membrana de la mucosa o en la superficie de una cavidad.

En una realización, la presente invención proporciona una composición como se discute en la presente para uso en un método de destrucción o interrupción o inhibición o reducción de la formación de biopelícula de un organismo microbiano que comprende contactar el organismo microbiano con mupirocina y neomicina. El método puede comprender poner en contacto el organismo microbiano con una formulación tópica que comprende mupirocina y neomicina descritas en la presente y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, donde los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables se definen en la presente a través de la memoria descriptiva. De conformidad con cualquiera de los métodos aquí descritos, el organismo microbiano es una bacteria. Preferiblemente, la bacteria es una seleccionada de los patógenos ESKAPE que incluyen Enterococcus spp., p.ej., Enterococcus faecalis; Staphylococcus spp., p.ej., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Klebsiella spp., p.ej., Klebsiella pneumoniae; Acinetobacter spp., p.ej., Acinetobacter baumannii; Pseudomonas spp., p.ej., Pseudomonas aeruginosa; Enterobacter spp., o la combinación de estos. De conformidad con cualquiera de los métodos ex vivo aquí descritos, la formación de biopelícula está en una superficie de un dispositivo. De conformidad con cualquiera de los métodos aquí descritos, la formación de biopelícula está en una superficie de un sujeto o tejido de un sujeto. En una realización, la formación de biopelícula está en la piel, en los ojos, en la membrana de la mucosa o en la superficie de una cavidad.

Se divulga en la presente el uso de mupirocina y neomicina para tratar una infección microbiana o para descolonizar un organismo microbiano, o para destruir o interrumpir o inhibir o reducir la formación de biopelícula de un organismo microbiano.

Se divulga en la presente el uso de una combinación que comprende mupirocina y neomicina para tratar una infección microbiana o para descolonizar un organismo microbiano, o para destruir o interrumpir o inhibir o reducir la formación de biopelícula de un organismo microbiano.

Se divulga en la presente el uso de una formulación tópica para tratar una infección microbiana o para descolonizar un organismo microbiano, o para destruir o interrumpir o inhibir o reducir la formación de biopelícula de un organismo microbiano, dicha formulación tópica comprende mupirocina y neomicina y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La terapia de combinación de la presente invención puede realizarse por sí sola o junto con otra terapia. Por ejemplo, la terapia de combinación de la presente invención se puede usar junto con un desinfectante, un antiséptico, un antibiótico, o biocida, en una superficie como, por ejemplo, dispositivos médicos y dispositivos permanentes que incluyen stents, catéteres, tubos para diálisis peritoneal, dispositivos de drenaje, prótesis articular e implantes dentales.

A modo ejemplificativo, la presente invención proporciona una terapia de combinación sinérgica que comprende mupirocina y neomicina que se pueden administrar tópicamente para el tratamiento de una superficie o infección colonizada por microbios. Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención.

EJEMPLOS

Introducción

Staphylococcus aureus ha sido designado como uno de los seis patógenos bacterianos ESKAPE de mayor preocupación respecto de la salud en EE.UU. Véase Rice LB. 2008. Federal funding for the study of antimicrobial resistance in nosocomial pathogens: no ESKAPE. J Infect Dis 197:1079-1081. El organismo es una causa predominante de infecciones bacterianas asociadas con hospitales y la comunidad y ha desarrollado resistencia a todos los antibióticos actualmente disponibles. Véase Pendleton JN, Gorman SP, Gilmore BF. 2013. Clinical relevance of the ESKAPE pathogens. Expert review of anti-infective therapy 11:297-308. Las tasas anuales de mortalidad en EE.UU. por S. aureus han superado las de VIH/SIDA y probablemente empeoren dada la eliminación, reducción y/o redirección de programas antimicrobianos dirigidos a otros organismos por la mayoría de las empresas farmacéuticas Véase Klevens RM, Morrison MA, Nadie J, Petit S, Gershman K, Ray S, Harrison LH, Lynfieid R, Dumyati G, Townes JM, Craig AS, Zell ER, Fosheim GE, McDougal LK, Carey RB, Fridkin SK. 2007. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA: the journal of the American Medical Association 298:1763-1771; Projan SJ, Shiaes DM. 2004. Antibacterial drug discovery: is it all downhill from here? Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and infectious Diseases 10 Suppi 4:18-22. Sencillamente, se necesitan con urgencia nuevas estrategias para prevenir y tratar infecciones estafilocócicas.

Las fosas nasales anteriores de seres humanos es un nicho ecológico principal para S. aureus y el cartílago nasal es un factor de riesgo reconocido para la enfermedad estafilocócica, particularmente entre poblaciones de pacientes que se someten a procedimientos quirúrgicos, hemodiálisis, o que requieren internación a largo plazo en unidades de terapia intensiva [revisado en Kluytmans J, van Beikum A, Verbrugh H. 1997. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underiying mechanisms, and associated risks. Clin Microbiol Rev 10:505-520.]. Los estudios indican que la descolonización nasal de S. aureus reduce la colonización de otros lugares del cuerpo y el riesgo de transmisión y posterior infección. Por lo tanto, las prácticas de control de la infección de rutina incluyen los procedimientos de descolonización nasal como un medio para evitar la infección de S. aureus y finalmente la confianza en la intervención antibiótica de la enfermedad estafilocócica.

La RNasa P de S. aureus es un complejo riboproteico fundamental que consiste de RnpA y ribozima rnpB que actúa corriente arriba de las ARNt sintetasas en la vía de maduración del ARN transferencia. Más específicamente, RNasa P cataliza la eliminación de las secuencias líder 5' de las especies de ARNt precursor creando sustratos de ARNt maduros para ARNt sintetasas que incluyen isoleucil ARNt sintetasa (la diana celular para mupirocina). Con el reconocimiento de que dos antimicrobianos dirigidos a etapas independientes de la misma vía metabólica bacteriana pueden tener efectos antibacterianos combinados, se ha llegado a la hipótesis de que las terapias de combinación que incluyen mezclas de inhibidores ARNasa P junto con mupirocina desplegarían una mayor eficacia antimicrobiana y el potencial de superar la resistencia a la mupirocina. En apoyo a esta predicción, se demostró que RNPA2000, una pequeña molécula inhibidora de la actividad ARNasa P de S.aureus, despliega actividad sinérgica con mupirocina pero no con otros antibióticos testeados durante las condiciones de crecimiento de laboratorio. Desafortunadamente, como se muestra a continuación, RNPA2000 pierde las propiedades microbianas en el entorno del huésped y no despliega sinergia con mupirocina en modelos huésped de colonización e infección. Por lo tanto, aunque los inhibidores de RNasa P pueden conferir actividad sinérgica durante condiciones de laboratorio, no es evidente qué inhibidores de RNasa P, de haber, conferirán efectos sinérgicos en el huésped si, por ejemplo, las bacterias no requieren una función RNasa P para sobrevivir durante la colonización, infección, o en el entorno del huésped.

En la presente se describen los resultados de una pantalla de una bibliografía de fármacos aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los EE.UU. para agentes que potencian las propiedades antimicrobianas de mupirocina hacia S. aureus. El sulfato de neomicina antibiótico, que está aprobado para uso tópico y que se mostró que inhibe la RNasa P de Escherichia coli estuvo entre los tres resultados identificados. Los ensayos in vitro revelaron que la neomicina también inhibe la función de la RNasa P de S. aureus, confiere una ventaja antimicrobiana aditiva a la mupirocina y la combinación podría formularse efectivamente en formato tópico. Los estudios en animales demostraron que la combinación de aplicación tópica de neomicina mupirocina redujo la carga bacteriana de S. aureus en modelos murinos de colonización nasal e infecciones en el lugar de la herida. Además, la terapia de combinación mejoró con los efectos del agente por sí solo y fue eficaz en el tratamiento de cepas de S. aureus susceptibles a meticilina, resistentes a meticilina y con alta resistencia a la mupirocina.

Ejemplo 1

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y animales. Todos los estudios sobre bacterias fueron realizados con la cepa UAMS-1 de Staphylococcus aureus, un aislado clínico bien caracterizado, susceptible a la meticilina, comúnmente utilizado para estudiar la formación de biopelícula del organismo y las propiedades de colonización, USA300, un aislado clínico resistente a la meticilina adquirido en la comunidad o una cepa resistente a la mupirocina BAA-1708 de alto nivel que contiene mupA obtenido de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Véase Gillaspy AF, Hickmon SG, Skinner RA, Thomas JR, Nelson CL, Smeltzer MS. 1995. Role of the accessory gene regulator (agr) in pathogenesis of staphylococcal osteomyelitis. Infect Immun 63:3373-3380; McDougal LK, Steward CD, Killgore GE, Chaitram JM, McAllister SK, Tenover FC. 2003. Puised-field gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the United States: establishing a national database. J Clin Microbiol 41:5113-5120. Salvo que se indique lo contrario, las cepas se cultivaron durante la noche en suspensión de soja tríptica, luego se utilizaron para inocular un medio fresco (dilución 1:100), se cultivaron hasta la fase exponencial temprana (1x108 UFC/mL) y se procesaron como se describe a continuación. Ratones hembra Balb/C de 4 a 6 semanas fueron obtenidas de Charles River (Wilmington MA) y se albergaron de conformidad con los protocolos del Medical Center Council on Animal Research (UCAR) de la Universidad de Rochester.

Preparación de artículos de prueba. Se preparó una base de ungüento de polietilenglicol (PEG) con la mezcla de PEG 400 (70 % p/v) con PEG 3350 (30 % p/v) como se describe en la Farmacopea de los Estados Unidos y The National Formulary (USP 24-NF 19). La mupirocina (AppliChem, Chicago IL; A47180005) y la neomicina (Sigma, St. Louis MO; N6386) se suspendieron en 250 pL de dimetilsulfóxido (DMSO) para crear concentraciones de trabajo de 100 mg y 50 mg, respectivamente. Las mezclas se incorporaron directamente a 5 g de ungüento de PEG prelicuado por calentamiento a 60°C durante 30 minutos con el fin de crear suspensiones con un 2 % de mupirocina y un 1 % de neomicina, y luego se enfriaron a temperatura ambiente. El procedimiento se usó para crear un control de vehículo de DMSO y mezclas PEG con 2 % de mupirocina y 1 % de neomicina mediante la incorporación de una combinación de 100 mg de mupirocina y 50 mg de neomicina en un total de 250 pL de DMSO.

Selección de Biblioteca de Selleck. Miembros de los fármacos aprobados por Biblioteca Selleck de la Asociación de Alimentos y Medicamentos fueron seleccionados como agentes para potenciar la actividad microbiana de mupirocina hacia la cepa de S. aureus UAMS-1. Para ello, se agregaron 1x105 unidades formadoras de colonias de UAMS-1 a pocillos individuales de una placa de microtitulación de 96 pocillos con 0,03 pg/mL de mupirocina (una concentración inhibitoria mínima de 0,5x) y 50 pM de agente de prueba en la suspensión de Mueller Hinton (MHB; volumen de pocillo total de 100 pl). Las placas de microtitulación se incubaron a 37 °C durante 16 horas y los pocillos individuales se inspeccionaron para verificar su crecimiento. Se consideró que los pocillos que no crecieron representan agentes que potenciaron las propiedades microbianas de mupirocina o las propiedades microbianas y antimicrobianas independientes de la mupirocina. Todos los fármacos que no condujeron a un crecimiento fueron confirmados por duplicado y fueron colocados en placas sin mupirocina para medir su actividad antimicrobiana inherente.

Ensayo de procesamiento de RNasa P y ARNpt Se realizaron los ensayos de la actividad de la RNasa P de S. aureus como se describió anteriormente. Véase Eidem TM, Lounsbury N, Emery JF, Bulger J, Smith A, Abou-Gharbia M, Childers W, Dunman PM. 2015. Small-molecule inhibitors of Staphylococcus aureus RnpA-mediated RNA turnover and tRNA processing. Antimicrob Agents Chemother 59:2016-2028. Brevemente, la RNasa P fue reconstituida en primer lugar con la mezcla de una relación equimolar de mpB y RnpA desnaturalizados durante 15 minutos a 37 °C, luego se agregó (5 pmol) a 10 pmol de ARNptTyr y concentraciones mayores de la concentración de neomicina indicada o el inhibidor de PNasa P conocido, RNPA2000, en un volumen total de 20 pl. Las mezclas se incubaron durante 5 minutos a 37 °C, se detuvieron con la incorporación de 20 pL de un tinte de carga de ARN 2x (un 95 % de formamida, un 0,025 % de SDS, un 0,025 % de bromofenol azul, un 0,025 % de xileno cianol FF, 0,5 mm de EDTA), y 30 p de cada muestra fueron sometidos a electroforesis en un gel de 7m de urea y un 8 % de poliacrilamida y teñidos con bromuro de etidio (0,5 pg/ml). Se usó un sistema de imágenes FluorChem 5500 para visualizar los productos de ARN y se cuantificaron usando el software ImageJ (Institutos nacionales de Salud - Bethesda, MD). La actividad porcentual de RNasa P se calculó posteriormente usando la siguiente ecuación: señal del compuesto de prueba de ARNptTyr / señal de prueba de ARNpfX

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. Se probó la concentración inhibitoria mínima (MIC) de conformidad con las pautas del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Brevemente, se agregó 1x105 UFC de la cepa indicada de S. aureus en pocillos individuales de una placa de microtitulación que contiene 88 pL de medio MHB y concentraciones que aumentaron al doble de mupirocina o agente de prueba (0-128 pg ml-1). Las placas se incubaron durante 16 horas a 37 °C y los pocillos se inspeccionaron visualmente para verificar crecimiento. La concentración más baja de mupirocina o agente de prueba que inhibió el crecimiento de S. aureus se consideró la concentración inhibitoria mínima. Se realizó la prueba del índice de concentración inhibitoria fraccional (FIC) para medir las interacciones entre la mupirocina y la neomicina, como se describió anteriormente. Véase Odds FC. 2003. Synergy, antagonism and what the chequerboard puts between them. The Journal of antimicrobial chemotherapy 52:1. Brevemente, en el formato de tablero de ajedrez, cada fila de la placa contenía concentraciones en aumento de mupirocina (aumentos dobles; 0 - 0,5 |jg/mL), mientras que cada columna contenía concentraciones en aumento de neomicina (incrementos dobles; 0 - 32 jg/mL). En cada pocillo (volumen total de 100 j l) se agregó MHB que contiene 3 x 105 UFC de cepa UAMS-1 de S. aureus y la placa se incubó a 37 °C durante la noche (16 - 20 horas). Se determinó la concentración inhibidora fraccional (FIC) usando la siguiente fórmula: (MIC del fármaco A en combinación/MIC del fármaco A solo) (MIC del fármaco B en combinación/MIC del fármaco B solo) = FIC. Una interacción sinérgica se definió como un valor de FIC 0,5, aditivo como valor de FIC 0,5 - 1,0, sin interacción como una FIC de 1-4 o una interacción antagonista FIC > 4.

Prueba antimicrobiana de ungüento in vitro. Las zonas antimicrobianas de la inhibición se midieron para las compilaciones de ungüento PEG usando las cepas indicadas de S. aureus. Para ello, se colocaron 1004 de 1x108 UFC ml-1 de S. aureus en placas TSA. Las placas se secaron durante 10 minutos y 40 j l de ungüento se introdujeron en los viales hacia el centro de la placa. Las placas se incubaron a 37 °C durante 16 horas y las zonas de eliminación bacteriana se midieron usando el software ImageJ (NIH).

Colonización nasal y tratamiento de ratones. Los ungüentos se evaluaron para verificar la actividad antimicrobiana in vivo usando un modelo de colonización nasal de S. aureus como se describió anteriormente, pero con modificaciones. Véase Kiser KB, Cantey-Kiser JM, Lee JC. 1999. Development and characterization of a Staphylococcus aureus nasal colonization model in mice. Infect Immun 67:5001-5006. Las fosas nasales de ratones despiertos fueron inoculadas con 1 x 107 de la cepa indicada de S. aureus mediante la colocación de 10 j l de cultivo directamente en las fosas nasales y se confirmó con la visualización de burbujas de aire que aparecieron a medida que el ratón respiraba. Las fosas nasales de los ratones fueron tratadas, posteriormente con 10 j l de ungüento PEG (que llegó a 55 °C en un bloque caliente para licuar) que contenía vehículo solo o el antibiótico indicado 45 minutos después de la inoculación y los tratamientos se repitieron cada 8 horas durante tres días. Los ratones fueron sometidos a eutanasia mediante la asfixia con CO² y luxación cervical, según la metodología aprobada por UCAR. Las fosas nasales completas desde la parte trasera del paladar blando hasta la punta de las fosas nasales se recolectaron de la disección bruta y se colocaron en tubos de microcentrífuga que contenían 1 ml de PBS fresco. Las muestras se homogeneizaron durante cinco minutos, se diluyeron en serie y se colocaron en placas con agar manitol salado (MSA, ThermoScientific, Waltham MA; R453902). Las placas se incubaron durante 16 horas y se enumeró la cantidad de S. aureus.

Modelo de infección de herida dérmica y tratamiento de ratones. Los efectos de las compilaciones de ungüento se evaluaron para la actividad microbiana in vivo usando el modelo de herida dérmica, pero con modificaciones. Véase Guthrie KM, Agarwal A, Tackes DS, Johnson KW, Abbott NL, Murphy CJ, Czuprynski CJ, Kierski PR, Schurr MJ, McAnulty JF. 2012. Antibacterial efficacy of silver-impregnated polyelectrolyte multilayers immobilized on a biological dressing in a murine wound infection model. Annals of surgery 256:371-377. Los ratones fueron anestesiados con inyección intraperitoneal con una mezcla de 100 mg ml-1 de ketamina (Hospira Inc., Lake Forest IL) y 20 mg ml-1 de xilazina (Lloyd Laboratories, Shenandoah IA) en NaCl a 5 j l por 1 g de peso corporal. El alivio de dolor en la forma de 20 j l de 0,5 % de sensorcaína (APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL) se administró antes de la herida dérmica. La sección media dorsal del ratón se afeitó y limpió con una serie de parches de povidona y yodo frotados con betadina (Fisher Scientific) (Professional Disposables International Inc.; Orangeburg, NY) y almohadillas de alcohol isopropílico (Fisher Scientific) durante un tiempo de contacto total de dos minutos. Se creó una única herida en este campo estéril en el ratón con un punzón para biopsia de 6 mm (Fisher Scientific) para remover únicamente la capa dérmica y no interrumpir la musculatura subyacente. Las heridas de los ratones fueron inoculadas con 1x107 de la cepa indicada de S. aureus mediante la colocación de 10 j l de cultivo directamente en la herida. Los ratones fueron tratados, posteriormente con compilaciones de ungüento (50 j l ) que contenía vehículo solo o el antibiótico indicado 45 minutos después de la inoculación y los tratamientos se repitieron cada 12 horas durante tres días. Los ratones se sometieron a eutanasia mediante asfixia con CO2 y luxación cervical, según la metodología aprobada por UCAR, la herida y el músculo subyacente fueron extirpados con un punzón para biopsia (PDI) de 8 mm y se colocaron en tubos de microcentrífuga que contenían 1 ml de PBS fresco. Las muestras se homogeneizaron durante cinco minutos, se diluyeron en serie y colocaron en placas en MSA. Las placas se incubaron durante 16 horas y se enumeró la cantidad de S. aureus.

Prueba de toxicidad in vivo. La toxicidad del ungüento se probó en un modelo de herida dérmica modificado. Los ratones en grupo de tres por grupo de tratamiento indicado fueron heridos como se describió anteriormente sin inoculación de la herida con S. aureus. La herida se trató con vehículo, ungüentos de 2 % de mupirocina, un 1 % de neomicina, o una combinación de 2 % de mupirocina más un 1 % de neomicina dos veces por día durante 14 días. Los ratones fueron pesados, evaluados para aseo y atención y se obtuvieron las imágenes de la herida diariamente para medir la contracción de la herida usando Image J (NIH). La contracción de la herida se calculó como un porcentaje de reducción del área de la herida usando la siguiente fórmula: WCd= (1-WAd/WAO)x100, donde WC es contracción de herida, WA es área de la herida, d es día y O indica el día inicial. Véase Amegbor K, Metowogo K, Eklu-Gadegbeku K, Agbonon A, Aklikokou KA, Napo-Koura G, Gbeassor M. 2012. Preliminary evaluation of the wound healing effect of Vitex doniana sweet (Verben-aceae) in mice. African journal of traditional, complementary, and alternative medicines: AJTCAM / African Networks on Ethnomedicines 9:584-590.

Ejemplo 2

Agentes que potencian la actividad antimicrobiana de mupirocina

Miembros de los fármacos aprobados por Biblioteca Selleck de la FDA 853 fueron seleccionados como agentes para potenciar la actividad microbiana de mupirocina. Para ello, se inoculó la cepa UAMS-1 de S. aureus en pocillos individuales de una placa de microtitulación que contiene 0,25X de concentración inhibidora mínima de mupirocina de la cepa (MIC; 0,3 pl ml-1) y 50 pm de material bibliográfico. Un total de 108 miembros (12,6 %) inhibieron el crecimiento bacteriano, lo que sugiere que pueden representar agentes que potencian la actividad antimicrobiana de mupirocina, exhiben actividad antimicrobiana independiente de mupirocina, o ambos. Para distinguir entre estas posibilidades, las concentraciones crecientes de cada compuesto se volvieron a probar para verificar la actividad antimicrobiana en un medio que carece o contiene 0,25X de una MIC de mupirocina de la cepa. 105 de los 108 compuestos (97,2 %) evaluaron la actividad antimicrobiana similar desplegada independientemente de si la mupirocina estaba presente. En cambio, la actividad antimicrobiana de sulfato de nitazoxanida, nitrofurazona, y de neomicina aumentó en presencia de mupirocina. Es más, las mediciones del índice de concentración inhibidora fraccional (FIC) revelaron un efecto aditivo con cada agente (FIC = 0,75) cuando se combinó con mupirocina lo que indica que son agentes microbianos que también tienen la capacidad de potenciar la actividad de mupirocina, tal vez, mediante la inhibición de RNasa P (Tabla 1).

Tabla 1. Miembros de la biblioteca Selleck con actividad mejorada asociada con mupirocina

MIC (ug ml-1)

Fármaco (-) Mup. (+) Mup. Índice de concentración inhibidora fraccional

Nitazoxanida 16 8 0,75

Nitrofurazona 16 8 0,75

Sulfato de neomicina 0,5 0,25 0,75

Ejemplo 3

Neomicina inhibe la actividad in vitro de RNasa P de S. aureus

Los antibióticos aminoglucósidos, como neomicina, contienen un anillo de deoxistreptamina central decorado con modificaciones de azúcar amino y actúan con la unión a una ranura principal de ARNr 16S para interrumpir la fidelidad de la sección de ARNt y bloquear la traducción de proteínas. Los estudios más recientes han revelado que los aminoglucósidos también pueden unir y afectar la función de ARNm, ARNt y ARN catalíticos. Véase Mikkelsen NE, Brannvall M, Virtanen A, Kirsebom LA. 1999. Inhibition of RNase P RNA cleavage by aminoglycosides. Proc Nati Acad Sci U S A 96:6155-6160; Mikkelsen NE, Johansson K, Virtanen A, Kirsebom LA. 2001. Aminoglycoside binding displaces a divalent metal ion in a tRNA-neomycin B complex. Nature structural biology 8:510-514; Tok JB, Cho J, Rando RR. 1999. Aminoglycoside antibiotics are able to specifically bind the 5'-untranslated region of thymidylate synthase messenger RNA. Biochemistry 38:199-206; von Ahsen U, Davies J, Schroeder R. 1992. Non-competitive inhibition of group I intron RNA self-splicing by aminoglycoside antibiotics. Journal of molecular biology 226:935-941. En este sentido, la neomicina B y/o sus derivados han demostrado que se unen al componente rnpB de las moléculas de RNasa P y/o ARNt precursor de una manera que inhibe la función ARNasa P de Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Porphyromas gingivalis, Streptococcus pneumoniae y Bacillus subtilis. Véase Eubank TD, Biswas R, Jovanovic M, Litovchick A, Lapidot A, Gopalan V. 2002. Inhibition of bacterial RNase P by aminoglycoside-arginine conjugates. FEBS letters 511:107-112; Liu X, Chen Y, Fierke CA. 2014. A real-time fluorescence polarization activity assay to screen for inhibitors of bacterial ribonuclease P. Nucleic acids research 42:e159. Por lo tanto, se evaluó si la neomicina también inhibe la actividad RNasa P de S. aureus en una ensayo de procesamiento de ARNt precursor in vitro. Como se muestra en la figura 1, los resultados revelaron que altas concentraciones (250 pM) de neomicina inhiben la capacidad de RNasa P de S. aureus de catalizar la maduración del precursor ARNtTyr durante las condiciones in vitro, lo que sugiere que la capacidad del agente de potenciar la mupirocina puede, en parte, estar mediada por su capacidad para inhibir la actividad de RNasa P.

Ejemplo 4

Efectos antimicrobianos de la combinación de mupirocina y neomicina en la formación de ungüento

Como se indicó anteriormente, el ungüento de mupirocina está perdiendo eficacia como agente de descolonización estafilocócico y de tratamiento de heridas debido a la resistencia emergente a la mupirocina y se necesitan nuevas opciones para la prevención y el tratamiento de la infección de S. aureus. Dado que la neomicina mejora la potencia antimicrobiana de mupirocina y los dos antibióticos tienen diferentes mecanismos de acción, se examinó si los ungüentos de combinación que contienen ambos agentes pueden haber mejorado las propiedades antimicrobianas en comparación con el agente por sí solo. Además, la terapia de combinación superaría la resistencia a la mupirocina, y la incorporación de neomicina, que afecta, predominantemente, las especies gramnegativas en ungüentos de mupirocina, ofrecería el potencial de mejorar el espectro de la actividad antimicrobiana que puede ser beneficiosa en términos de reducir la incidencia de infecciones secundarias o infecciones de heridas polimicrobianas. Como primera prueba de estas posibilidades, se midió el rendimiento microbiano de cada agente en un ungüento a base de polietilenglicol (PEG).

Los ensayos de placas se usaron inicialmente para monitorear los efectos antimicrobianos de ungüentos a base de PEG que contienen DMSO (vehículo), un 2 % de mupirocina, un 1 % de neomicina o combinación (2 % de mupirocina un 1 % de neomicina) hacia la cepa UAMS-1 de S. aureus, un aislado clínico de neomicina y mupirocina. Como se muestra en la figura 2A, las mediciones de cada zona de inhibición del tratamiento revelaron que aunque el vehículo por sí solo no afectó el crecimiento del organismo, ambos antibióticos, solos y en combinación produjeron zonas de inhibición del crecimiento, lo que sugiere que la formulación de ungüento no antagonizó las propiedades antimicrobianas del agente. Un dos por ciento de mupirocina generó una zona de inhibición 21,1 (-± 2) cm2, mientras que un 1 % de neomicina generó una zona promedio de limpieza de 9,7 (-± 1) cm2. La combinación de un 2 % de mupirocina y 1 % de neomicina desplegó la zona más grande inhibición (29,9 (-± 0,25) cm2) que se consideró estadísticamente mejorada respecto de la de mupirocina sola, que podría atribuirse a los efectos aditivos de la combinación específica de antibiótico o meramente reflejar un aumento general en ingredientes antimicrobianos activos. Sin embargo, no se observaron mejoras similares en la depuración antimicrobiana en pruebas de un 2 % de mupirocina en combinación con un 1 % de vancomicina (figura 2D) u oxacilina (figura 2E) que no demostraron mejora antagonista y en combinación, respectivamente. Estos resultados indican que los efectos aditivos de la combinación mupirocina neomicina observados en condiciones de cultivo líquido fueron específicos y también existen en formato de ungüento.

Como medio preliminar de prueba del rendimiento del ungüento de combinación respecto de un panel más amplio de cepas de S. aureus, los ensayos de placa se expandieron para incluir un aislado clínico resistente a la meticilina contemporaneo, USA 300, que es resistente a la neomicina (MIC = 128 |jg ml-1; no se muestran los datos), y la cepa BAA-1708 que contiene el gen mupA que confiere una resistencia a la mupirocina de alto nivel (MIC > 256 jg ml-1; (no se muestran los datos). Como se muestra en la figura 2B, la mupirocina suscitó una zona clara de inhibición del crecimiento de USA300-LAC (14,0 (-± 4) cm2). Es interesante que un 1 % de ungüento de neomicina produjo una zona pequeña tipo halo (3,6 (-± 0,25) cm2) de inhibición a pesar de la resistencia de la cepa al agente, lo que indica que la concentración testeada puede superar el fenotipo de resistencia del organismo hasta cierto grado. Además, el tratamiento de combinación demostró una zona de inhibición aumentada significativa (24,0 (-± 3) cm2) en comparación con el agente solo. Como se muestra en la figura 2C, la prueba de la cepa resistente a la mupirocina de alto nivel BAA-1708 demostró que la cepa fue resistente al ungüento de 2 % de mupirocina en comparación con ambas mediciones de UAMS-1 y USA300 generando una zona de inhibición del crecimiento (3,6 (±1) cm2). Por el contrario, el ungüento de 1 % de neomicina suscitó una zona clara de inhibición (4,8 (-± 1,1) cm2), que aumentó significativamente con el tratamiento de combinación (7,5 (-± 0,2) cm2).

En su conjunto, estos resultados indican que la mupirocina y la neomicina son compatibles en el formato de ungüento probado aquí. Además, la combinación de un 2 % de mupirocina 1 % de neomicina exhibió una actividad antimicrobiana aumentada de manera significativa en comparación con agente solo y desplegó actividad contra todas las cepas independientemente de su perfil de resistencia. Desde estas perspectivas, se llegó a la hipótesis de que la combinación sería terapéuticamente beneficiosa de manera similar en los entornos del huésped, ya que la mupirocina (sola) se usa típicamente para la prevención y/o la intervención terapéutica de infecciones estafilocócicas. Pero como se indicó anteriormente y se elaboró a continuación, se reconoció que el inhibidor de RNasa P, RNPA2000, no desplegó eficacia en los entornos huésped a pesar de las impresionantes propiedades antimicrobianas in vitro del agente, que incluyen superioridad a la neomicina en sinergia con mupirocina. Por lo tanto, se reconoció que es posible que la neomicina falle de manera similar en las pruebas del entorno huésped.

Ejemplo 5

Los efectos de la mupirocina en la descolonización nasal de S. aureus

Un modelo murino de colonización nasal de S. aureus se usó para comparar la eficacia antimicrobiana de mupirocina, neomicina, y los dos agentes cuando se aplican en combinación. Para ello, el pasaje nasal de ratones Balb-c se inoculó con -1 x 107 de unidades formadoras de colonias de S. aureus, luego se trató tres veces un día durante un total de tres días, punto en el cual la carga bacteriana se midió y se midió la susceptibilidad antibiótica de diez aislados de cada animal mediante prueba de MIC.

En consistencia con informes previos, el tratamiento con 2 % de mupirocina resultó en una reducción del logaritmo 1 en la colonización de la cepa UAMS-1 de S. aureus, Figura 3A. Sin embargo, dos ratones desplegaron cargas inusitadamente más altas, en comparación con otros miembros de la cohorte (que se muestran en rojo), que, con la prueba de estos aislados, exhibieron un aumento 4 veces mayor en la tolerancia a la mupirocina (MIC de 0,5 |jg ml-1) en comparación con la cepa de inoculación así como los aislados de los otros animales dentro del grupo de tratamiento (MIC de 0,125 jg ml-1), lo que sugiere que la dosis de mupirocina (sola) se selecciona para derivados resistentes de bajo nivel. Aunque el tratamiento con 1 % de mupirocina pareció suscitar la descolonización, los efectos fueron menores que con mupirocina (sola). Se alcanzó la descolonización significativa máxima con el tratamiento con un 2 % de mupirocina un 1 % de neomicina y no pareció seleccionar para resistencia antibiótica de bajo nivel. Se observaron resultados similares para la descolonización nasal USA300 (Figura 3B). Más específicamente, un tratamiento con un 2 % de mupirocina resultó en una disminución logarítmica de 1 en la carga bacteriana, pero no pareció seleccionar para derivados tolerantes a la mupirocina. El tratamiento con un 1 % de neomicina (sola) resultó en cerca de una reducción logarítmica de 2 en la carga de USA300, pero también suscitó en mayor variabilidad que el grupo de mupirocina (sola), mientras que la combinación parece que redujo, de manera constante, la carga bacteriana hasta el mayor grado posible (reducción logarítmica de 1,8). Un efecto similar se observó con pruebas de la cepa BAA-1708 de S. aureus, que a pesar de desplegar un fenotipo de resistencia alta a la mupirocina, exhibió una reducción moderada en la carga (logaritmo de 0,54) tras el tratamiento con mupirocina (sola), una reducción logarítmica de 0,8 en animales tratados con un 1 % de neomicina y una reducción logarítmica de 1,2 tras el tratamiento de combinación (figura 3C).

En su conjunto, estos resultados indican que la aplicación tópica de la combinación de un 2 % de mupirocina un 1 % de neomicina mejoró significativamente la descolonización nasal de S. aureus para las tres cepas probadas que el agente solo. En función de la observación, combinados con una resolución notoriamente baja de los modelos nasales disponibles, los estudios se expandieron para evaluar el rendimiento de la colonización en un modelo de herida murina de infección con S. aureus.

Ejemplo 6

Los efectos de la mupirocina y la neomicina en la limpieza de la herida de S. aureus

Se usó un modelo de herida dérmica murina para evaluar las propiedades de descolonización de un 2 % de mupirocina, un 1 % de neomicina y un 2 % de mupirocina un 1 % de neomicina. Para ello, se creó una herida dérmica en la espalda de ratones Balb-c, se inocularon con una cepa UAMS-1, USA300 o BAA-1708 de S. aureus y posteriormente fueron tratados con agente de prueba suspendido en ungüento a base de PEG dos veces en un día durante un total de 3 días, momento en el cual se midió la carga bacteriana.

Como se muestra en la figura 4A, el tratamiento de 3 días con un 2 % de mupirocina resultó en una reducción logarítmica de cerca de 6 en la colonización de UAMS-1 (1,8 x 101 ufc por lesión) del lugar de la herida en comparación con animales que fueron tratados solo con vehículo (7 x 107 ufc por lesión). Un tratamiento con un 1 % de neomicina exhibió una mejor limpieza en comparación con mupirocina (sola), lo que resultó en 1 x 101 ufc por lesión sin bacterias recuperadas de 5 de los 10 (un 50 %) de los animales en el grupo de tratamiento. El tratamiento de combinación desplegó la mayor eficacia. No se recuperó bacteria de 9 de los 10 animales (90 %) tratados con un 2 % de mupirocina un 1 % de neomicina, mientras que se recuperó una sola colonia de UAMS-1 del animal restante (1 x 101 ufc). La prueba de la cepa resistente a la neomicina, USA300, demostró que el 2 % de mupirocina fue eficaz, lo que resultó en una reducción logarítmica de 5 en la carga en el lugar de la herida bacteriana, sin que se haya recuperado bacteria de 4 de los 10 animales (40 %) en el grupo de tratamiento (Figura 4B). Mientras que el tratamiento con neomicina (sola) tuvo efectos mínimos en la descolonización, presumiblemente debido al fenotipo de resistencia a la neomicina de la cepa, se observó la mayor eficacia para el grupo tratado con combinación, en el que no se recuperaron células de USA300 de 7 de los 10 (70 %) animales tratados. De manera similar, la combinación de mupirocina y neomicina desplegó la mayor eficacia en pruebas de la cepa resistente a la mupirocina BAA-1708 (figura 4C). Más específicamente, como se esperaba, el tratamiento con un 2 % de mupirocina (sola) no redujo la colonización en el lugar de la herida en comparación con las células tratadas con vehículo, mientras que el tratamiento con neomicina (sola) resultó en una disminución logarítmica de aproximadamente 5 en las bacterias recuperables. La combinación de mupirocina neomicina produjo la mayor reducción en la colonización, lo que resultó en una disminución logarítmica de 7 en las bacterias en el lugar de la herida y no hubo bacterias recuperables en 3 de los 10 (30 %) animales testeados. En conjunto, estos resultados indican que los ungüentos de mupirocina neomicina son más eficaces reduciendo la carga de S. aureus en el lugar de la herida que el agente solo y que la combinación es capaz de superar la resistencia a cualquier agente.

Ejemplo 7

El potencial antimicrobiano del ungüento de combinación de mupirocina y neomicina hacia otras especies bacterianas

La mupirocina y la neomicina son predominantemente activas hacia especies grampositivas y gramnegativas, respectivamente. Por lo tanto, se predijo que la combinación desplegaría mayor espectro de actividad en comparación con el agente solo, lo que mejoraría las opciones de tratamiento para las infecciones policlonales en el lugar de la herida compuestas de mezclas de organismos grampositivos y gramnegativos.

Como prueba preliminar de dicha hipótesis, los ensayos de la zona de inhibición se realizaron para un 2 % de mupirocina, un 1 % de neomicina, y un 2 % de mupirocina un 1 % de neomicina usando A. baumannii y P. aeruginosa, dos organismos gramnegativos que son causas frecuentes de infecciones en el lugar de la herida. Como se muestra en la figura 5, el ungüento con 2 % de mupirocina no pareció restringir el crecimiento de la cepa 98-37-09 de A. baumannii o la cepa PA01 de P. aeruginosa. En cambio, la neomicina sola y en combinación con mupirocina, restringió el crecimiento de organismos, lo que indica que la combinación de un 2 % de mupirocina un 1 % de neomicina puede ser útil en la prevención y/o el tratamiento de infecciones complicadas en la herida. Ambos agentes, en forma independiente o en combinación, también limitaron a ciertos grados, el crecimiento de las cepas testeadas de S. epidermidis, Escherichia coli, y Streptococcus pyogenes (no se muestran los datos).

Ejemplo 8

Efectos de mupirocina y neomicina en la cura de las heridas

Los resultados anteriores indican que los ungüentos de combinación que comprenden mupirocina y neomicina desplegaron una mayor eficacia antimicrobiana, superaron la resistencia a la mupirocina y posiblemente exhiban un espectro de actividad mayor hacia otras especies bacterianas, en comparación con mupirocina (sola). Se consideró que dicha terapia de combinación sería de valor en el contexto del marco de la herida. En ese sentido, aunque la mupirocina y la neomicina son antibióticos aprobados por la FDA para uso tópico, se evaluó cada agente, solo y en combinación, como un medio para evaluar si la mezcla de los dos agentes exhibió efectos laterales perjudiciales manifiestos. Para ello, se crearon heridas dérmicas y los animales fueron tratados con vehículo, un 2 % de mupirocina, un 1 % de neomicina o la combinación (un 2 % de mupirocina 1 % de neomicina) dos veces por día durante un total de 14 días. Cada día, los animales fueron evaluados para verificar la atención y el aseo, el peso y el tamaño de la herida.

No se observaron diferencias significativas en la contracción de la herida en ninguno de los grupos de tratamiento (N = 3 para cada tratamiento) en comparación con el ungüento que contiene vehículo (figuras 6A y 6B). Independientemente del ungüento usado, el tamaño de la muestra creció 3 días después de la formación de la lesión y fue acompañada de un aumento lineal en la contracción de la herida, de modo que el curado de la herida se completó y se restauró el crecimiento del cabello a los 14 días del tratamiento. De manera similar, no se registraron diferencias significativas en el peso para animales en alguno de los grupos de tratamiento (figura 6C).

En su conjunto, estos resultados demuestran que la combinación de mupirocina y neomicina es superior a aquella de agente solo en términos de eficacia antimicrobiana, superando la resistencia antibiótica y el espectro antimicrobiano de la actividad hacia otras especies bacterianas. La combinación no despliega ninguna citotoxicidad animal evidente.

Ejemplo 9

El inhibidor de la RNasa P, RNPA2000, no es eficaz en modelos murinos de descolonización nasal o de la herida.

Como se indicó anteriormente, RNPA2000 se ha identificado previamente como un inhibidor de RNasa P con una promesa terapéutica importante. Es más, estudios previos han demostrado que el agente despliega actividad antimicrobiana contra aislados clínicos de S. aureus contemporáneos, así como otros patógenos bacterianos problemáticos. Además, RNPA2000 exhibe una sinergia superior con mupirocina (mediciones de FIC < 0,5) en comparación con neomicina. Aun así, RNPA2000 por sí solo no exhibe actividad microbiana hacia la cepa UAMS-1 de S. aureus en modelos murinos de descolonización nasal o de la herida (no se muestra). De manera similar, RNPA2000 en cualquier concentración probada en combinación con mupirocina no impone efecto sinérgico en ninguno de estos modelos. Los datos representativos se muestran en las figuras 7A y 7B, en donde el 2 % de mupirocina despliega propiedades de desconolonización en el modelo nasal y de heridas, respectivamente, pero incluso la concentración más alta de la mezcla que sigue siendo soluble en la formulación de ungüentos (un 2 % de mupirocina y un 2 % de RNPA2000) no exhibe ningún efecto sinérgico.

Desde estas perspectivas, se anticipó que la falla de RNPA2000 puede explicar una ausencia de confianza de S. aureus en la función de la RNasa P en el entorno in vivo, de modo que la inhibición de la actividad de la enzima a través de la intervención química tendría efectos perjudiciales en el organismo cuando está en el entorno del huésped, y consecuentemente, carecería de valor terapéutico. Extendiendo las enseñanzas de RNPA2000, se anticipó inicialmente de manera similar que esto podría ser verdadero de combinaciones de mupirocina y neomicina. Sin embargo, la anulación grave en el canal antibacteriano y la terapia limitada en desarrollo actual, excedieron estas predicciones e impulsaron el curso de la caracterización de la combinación de neomicina mupirocina detallada más arriba.

Ejemplo 10

Las propiedades antimicrobianas del ungüento de combinación de mupirocina y neomicina contra S. aureus en un aislado clínico humano con infección cutánea

Se realizaron ensayos de placa en aislados clínicos donde los sujetos humanos sufrieron una infección cutánea de S. aureus. Las bacterias del aislado clínico se expandieron en una placa de agar y se cargaron 40 microlitros de ungüento en el centro. Se ve la zona de inhibición del crecimiento celular mediada por antibiótico después de 48 horas de incubación. Los ungüentos que contienen un 1 % de neomicina o un 2 % de mupirocina despliegan formación de colonia resistente mientras que la combinación no (figura 8A).

Las bacterias en el aislado clínico también fueron probadas para verificar la viabilidad de la célula antes y después del tratamiento con mupirocina, neomicina y la combinación de las dos (ensayo de curva de eliminación). Se usó la cepa BAA-1708 de S. aureus para las pruebas. La figura 8B muestra recuentos de viabilidad celular de la cepa BAA-1708 de S. aureus antes del tratamiento (PT) y por hora tras el tratamiento con vehículo (DMSO; azul), un 2 % de mupirocina (rojo), un 1 % de neomicina (verde) o la combinación (morado). Los resultados indican que la combinación exhibe un efecto bactericida más rápido que el agente solo. Se muestra la desviación estándar.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para una administración tópica a un sujeto que comprende mupirocina y neomicina como los únicos agentes terapéuticamente activos.

2. La composición de la reivindicación 1, donde el sujeto tiene una infección microbiana, opcionalmente donde la infección microbiana es una infección bacteriana.

3. La composición de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, donde la relación en peso entre la mupirocina y la neomicina oscila entre 1:10 y 10:1.

4. La composición de la reivindicación 3, donde la relación en peso de mupirocina y neomicina oscila entre 1:4 y 4:1, donde la relación en peso entre la mupirocina y la neomicina es 1:4, donde la relación en peso entre mupirocina y neomicina es 1:2, o donde la concentración total de mupirocina y neomicina en la composición oscila entre un 1 % en peso y un 50 % en peso.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que consisten de mupirocina, neomicina y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

6. Una formulación tópica que comprende mupirocina y neomicina como los únicos agentes terapéuticamente activos y uno o más vehículos o excipientes terapéuticamente aceptables.

7. La formulación tópica de la reivindicación 6, donde la cantidad de mupirocina oscila entre un 0,001 por ciento en peso (% en peso) un 8 % en peso por unidad de formulación.

8. La formulación tópica de la reivindicación 6 o 7, donde la cantidad de neomicina oscila entre un 0,001 % en peso y un 8 % en peso por unidad de formulación, opcionalmente donde la relación en peso entre mupirocina y neomicina es 10:1 a 1:10.

9. La formulación tópica de la reivindicación 6, donde la cantidad de mupirocina oscila entre un 0,001 por ciento en peso (% en peso) y un 4 % en peso por unidad de formulación, y la cantidad de neomicina oscila entre un 0,001 % en peso un 5 % en peso por unidad de formulación, opcionalmente donde la relación en peso entre mupirocina y neomicina es 4:1 a 1:4.

10. La formulación tópica de la reivindicación 9, donde la cantidad de mupirocina oscila entre un 0,015 % en peso y un 2 % en peso por unidad de formulación y la cantidad de neomicina oscila entre un 0,015 % en peso y un 2 % en peso por unidad de formulación o donde la cantidad de mupirocina se selecciona de un 0,25 % en peso, 1 % en peso, o un 2 % en peso por unidad de formulación y la cantidad de neomicina se selecciona de un 0,25 % en peso o un 1 % en peso, por unidad de formulación.

11. La formulación tópica de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde la formulación tiene la forma de una crema, una loción, un ungüento, un hidrogel, un coloide, un gel, una espuma, un aceite, una leche, una suspensión, un paño, una esponja, una solución, una emulsión, una pasta, un parche, un hisopo, un apósito, un spray o una almohadilla.

12. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en un método de descolonización de un organismo microbiano en un sujeto que comprende poner en contacto el organismo microbiano con dicha composición.

13. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en un método de destrucción o interrupción o inhibición o reducción de la formación de biopelícula de un organismo microbiano en un sujeto que comprende contactar el organismo microbiano con la composición mencionada.

14. La composición para uso de la reivindicación 12 o 13, donde el organismo microbiano es una bacteria.

15. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en un método de tratamiento de una infección microbiana en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha composición.

16. La composición para uso de la reivindicación 15, donde la infección microbiana es una infección bacteriana, opcionalmente donde la infección bacteriana se caracteriza por la colonización de una bacteria, u opcionalmente donde la infección bacteriana se caracteriza por la formación de biopelícula.

17. La composición para uso de la reivindicación 15 o 16, donde la infección microbiana es una infección tópica.

18. Un método ex vivo de descolonización de un organismo microbiano o de destrucción o interrupción o inhibición o reducción de la formación de un organismo microbiano en una superficie de un dispositivo que comprende contactar el organismo microbiano con la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.