ES2855098T3 - Procedimiento de detección de la drepanocitosis - Google Patents

Abstract

Procedimiento de detección de drepanocitosis en un individuo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas sucesivas, pudiendo ser implementadas las etapas a/ y b/ sucesiva o simultáneamente, en donde dicho procedimiento no comprende una etapa de puesta en contacto de dicha muestra de sangre con un agente de lisis celular: a/ puesta en contacto de una muestra (44) de sangre de dicho individuo con un agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos capaz de colocar los glóbulos rojos contenidos en la muestra de sangre en una condición de hipoxia, b/ filtración de dicha muestra (44) de sangre que contiene glóbulos rojos a través de una membrana (24) porosa de tamaño de poros determinado para poder retener los glóbulos rojos que han sufrido dicha falciformación (47), y permitir el pasaje de glóbulos rojos que no han sufrido falciformación, c/ y detección de la posible presencia de un residuo (47) en dicha membrana (24), durante y/o al final de la etapa de filtración, estando asociada dicha presencia a un rasgo afectado de dicho individuo para la drepanocitosis.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de detección de la drepanocitosis

La presente invención se enmarca dentro del campo de la detección de la drepanocitosis. Más particularmente, se refiere a un procedimiento para tal detección a partir de una muestra de sangre de un individuo.

La drepanocitosis, también llamada anemia falciforme, es una enfermedad genética autosómica recesiva, debida a una anomalía de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos, más precisamente, una anomalía estructural de la cadena p de la hemoglobina, caracterizada por la mutación de un aminoácido en esta cadena p, desde el ácido glutámico hasta la valina.

La drepanocitosis constituye la hemoglobinopatía más importante del mundo. Se cree que casi 120 millones de personas serían portadoras del rasgo de células falciformes.

La drepanocitosis se encuentra en determinadas regiones del subcontinente indio, en América del Sur y en la cuenca mediterránea. El África intertropical, es decir, el territorio ubicado entre el paralelo 15 sur y el paralelo 20 norte, es el más afectado, con una tasa de alrededor de 1 caso de drepanocitosis en 65 nacimientos. Los países más afectados son la República Democrática del Congo, Senegal, Benín y Angola. Se puede citar una correlación, en estas áreas, con la resistencia a la malaria, lo que apoya la hipótesis según la cual la drepanocitosis resultaría de un proceso de selección natural por resistencia a la malaria, debido a la dificultad del plasmodio para realizar su ciclo en los drepanocitos.

En Francia, la drepanocitosis homocigótica representa un nacimiento en 1200. Se trata del primer riesgo genético en Isla de Francia. En las Indias Occidentales, se alcanza una tasa de 1 caso cada 260 nacimientos. La drepanocitosis también afecta a la población afroamericana, lo que se explica fácilmente por el origen histórico del nacimiento de esta comunidad en los Estados Unidos, a saber, la deportación masiva de africanos en el marco del comercio triangular cuyos descendientes siguen siendo hoy afectados por la drepanocitosis.

La drepanocitosis constituye así un verdadero problema de salud pública, tanto más cuanto que los portadores sanos, sin signos clínicos, pueden ignorar que son capaces de transmitir esta enfermedad a su descendencia. La Organización Mundial de la Salud predice, en unas pocas décadas, una tasa del número de portadores de tal anomalía de la hemoglobina que llegará al 8% de la población mundial.

En la actualidad, existen varias pruebas que permiten la detección o el diagnóstico de la drepanocitosis. Estas pruebas se basan en particular en las propiedades particulares de la hemoglobina anormal, llamada hemoglobina S. Estas propiedades son, por ejemplo, en estado desoxigenado, una disminución de la solubilidad y un cambio de forma, llamado falciformación. En condiciones de hipoxia, la hemoglobina de los glóbulos rojos sufre una gelificación y se polimeriza en fibras que deforman el glóbulo rojo alargándolo, lo que le da la apariencia de una hoz.

Por lo tanto, la naturaleza anormal drepanocítica de la hemoglobina puede detectarse mediante una prueba de insolubilidad, denominada prueba ITANO, o mediante una prueba de falciformación inducida por hipoxia, como la prueba de Emmel. Más precisamente, la prueba de Emmel, bien conocida por los expertos en la técnica, consiste en colocar una muestra de sangre en presencia de un agente reductor, de manera que se desencadene el fenómeno de la falciformación de los glóbulos rojos drepanocíticos, y observar bajo el microscopio el efecto de este agente sobre la forma de los glóbulos rojos. Sin embargo, estas pruebas requieren equipo de laboratorio específico. Además, no se pueden automatizar.

El documento US 2012/0077218 describe un procedimiento de diagnóstico de la drepanocitosis derivado de la prueba de insolubilidad de Itano, que consiste en someter una muestra de sangre a una etapa de lisis celular, en presencia de un agente reductor en un tampón fosfato, de manera de provocar la liberación de hemoglobina S que estaba contenida en los glóbulos rojos de la muestra, y su desoxigenación y su precipitación en el tampón.

Otras pruebas de identificación implementadas actualmente se basan en técnicas de electroforesis, cromatografía en fase líquida de alta resolución (HPLC) o técnicas relevantes de la biología molecular, en particular, técnicas para detectar la desaparición de un sitio de restricción en la secuencia de nucleótidos de la hemoglobina o reacción de polimerización en cadena (PCR). Además del hecho de que estas pruebas requieren equipos específicos y costosos, así como la experiencia del operador, su implementación lleva mucho tiempo.

La presente invención tiene como objetivo remediar los inconvenientes de los procedimientos para detectar el carácter drepanocítico de un individuo propuestos por el estado de la técnica, en particular, los descritos con anterioridad, proponiendo un procedimiento para la detección de la drepanocitosis a partir de una muestra de sangre de un individuo, lo que permite obtener un resultado fiable a la vez que es fácil y rápido de utilizar. La invención también pretende reducir los costes asociados con la implementación de este procedimiento.

Un objetivo adicional de la invención es que este procedimiento se pueda implementar, por un lado, sin requerir un equipo complejo específico, ni gran experiencia del operador, y, por otro lado, mediante un dispositivo automatizado.

Para ello, la presente invención aprovecha ventajosamente una propiedad particular de la hemoglobina S producida por el individuo drepanocítico, a saber, la propiedad de polimerizarse, en condiciones de hipoxia, en el interior del glóbulo rojo. Como se explicó con anterioridad, en condiciones de hipoxia, la formación de polímeros intracelulares provoca una alteración del citoesqueleto de la hemoglobina, en el origen del fenómeno falciforme, así como de la deshidratación y del endurecimiento de los eritrocitos. Estas modificaciones en la deformabilidad de los eritrocitos contribuyen a la crisis vasooclusiva, que es la principal complicación de la enfermedad.

Los presentes inventores descubrieron que, si bien los glóbulos rojos normales son capaces de deformarse y pasar fácilmente a través de poros de un tamaño mucho más pequeño que su diámetro, en particular unos pocos micrones más pequeño que este diámetro, por otro lado, los glóbulos rojos drepanocíticos, que han sufrido el fenómeno de la falciformación, debido a su forma de hoz y su característica de rigidez particulares, no son o son muy poco deformables y son incapaces de atravesar poros del mismo tamaño. Por lo tanto, los presentes inventores han descubierto que la diferencia en la deformabilidad de los glóbulos rojos drepanocíticos en comparación con los glóbulos rojos normales hace posible diferenciar muestras de sangre de pacientes drepanocíticos de muestras de sangre de pacientes normales, mediante la filtración de tales muestras a través de una membrana de tamaño de poro adecuado.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de detección de drepanocitosis en un individuo según se define en la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas sucesivas, pudiendo ser implementadas las etapas a/ y b/ sucesiva o simultáneamente, en donde el procedimiento no comprende la etapa de poner en contacto la muestra de sangre con un agente de lisis celular:

a/ puesta en contacto de una muestra de sangre del individuo para el que se desea detectar si tiene o no drepanocitosis, con un agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos, es decir, un agente capaz de colocar los glóbulos rojos contenidos en la muestra de sangre en condiciones de hipoxia, de modo de provocar la falciformación de los glóbulos rojos drepanocíticos,

b/ filtración de la muestra de sangre que contiene glóbulos rojos, en particular cuando sea apropiado, glóbulos rojos que hayan sufrido el fenómeno de falciformación, a través de una membrana porosa, cuyo tamaño de poro se determina de manera que dicha membrana sea apta para los retener glóbulos rojos que hayan sufrido una falciformación, y para permitir el pasaje de glóbulos rojos que no hayan sufrido falciformación,

c/ y detección, durante y/o al final de la etapa b/ de filtración, de la posible presencia de un residuo en la membrana, estando asociada dicha presencia a un carácter afectado del individuo por la drepanocitosis.

Dicho residuo opcional se presenta en forma de gelatina, formada por agregados de glóbulos rojos en forma de hoz, de coloración roja.

En la presente descripción, se entiende por “carácter afectado por la drepanocitosis” el hecho de que el individuo sea del tipo homocigoto SS, es decir, afectado por la enfermedad, o heterocigoto SA, es decir, portador de la enfermedad.

El procedimiento según la invención es sencillo y rápido de implementar. En particular, permite la detección de la drepanocitosis en pocos minutos y, además, a bajo coste. Los únicos consumibles necesarios para su implementación son el agente de inducción de la falciformación y la membrana. Su fiabilidad también ha sido ampliamente verificada por los presentes inventores, y esto para un gran número de individuos, tanto sanos como afectados por la drepanocitosis, en comparación con los resultados de las pruebas biológicas del estado de la técnica anterior realizadas para las mismas personas.

El procedimiento según la invención se implementa a partir de una muestra de sangre total, de modo que no requiere equipos complejos para el tratamiento preliminar de la muestra de sangre. En función de las condiciones de implementación del procedimiento, el único pretratamiento al que puede tener que someterse esta muestra es su presencia con un agente anticoagulante cuando se extrae del individuo, por ejemplo, en presencia de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), en una forma convencional, en sí misma para muestras de sangre para análisis biológicos.

En particular, el procedimiento según la invención no incluye ninguna etapa de puesta en contacto de la muestra de sangre con un agente de lisis celular, tal como la saponina. De hecho, es una muestra de sangre que contiene glóbulos rojos que se somete a la etapa b/ de filtración, y no una solución que contiene hemoglobina, que podría obtenerse de la muestra de sangre mediante una etapa de lisis celular.

Según la presente invención, esta muestra de sangre que contiene glóbulos rojos puede someterse a la etapa de filtración simultáneamente con la etapa de puesta en contacto con el agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos. Cuando, por el contrario, la muestra de sangre se somete a la etapa b/ de filtración después de la etapa a/ de puesta en contacto con el agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos, esta etapa b/ se lleva a cabo de preferencia directamente después de la etapa a/, es decir, tras la ejecución de la etapa a/ de puesta en contacto con el agente de inducción de la falciformación, la muestra de sangre, que aún contiene glóbulos rojos, se somete directamente a la etapa b/ de filtración, sin pasar por una etapa intermedia de tratamiento, centrifugación, separación de determinados componentes, etc.

El procedimiento según la invención es aplicable tanto en adultos como en recién nacidos, para un diagnóstico precoz de la enfermedad, a partir de una muestra de sangre extraída del cordón umbilical. En particular, incluso en los recién nacidos, la diferencia en el aspecto de la membrana al final de la etapa de filtración, entre una muestra de sangre drepanocítica y una muestra de sangre normal, es ventajosamente visible a simple vista, a pesar de la pequeña cantidad de glóbulos rojos drepanocíticos presentes en la sangre umbilical, incluso para muestras de esta sangre de pequeño volumen. Por tanto, el procedimiento según la invención puede ser ventajosamente parte de un proceso más general y no invasivo para el recién nacido.

Una ventaja adicional del procedimiento según la invención es la posibilidad de archivar la membrana obtenida tras la etapa de filtración, y sobre la que se ha detectado un residuo formado por glóbulos rojos drepanocíticos, con vistas a la posterior implementación de pruebas biológicas a partir de estos glóbulos rojos drepanocíticos ubicados en la membrana, o bloqueados en los poros de esta última. Por ejemplo, entonces es posible realizar la extracción del ADN de estos glóbulos rojos, para un análisis de este ADN mediante técnicas de biología molecular. Esto resulta particularmente ventajoso cuando el procedimiento de detección según la invención se implementa en países en vías de desarrollo, pobremente equipados con equipos de análisis genético. Tras la etapa de filtración, las membranas obtenidas para los pacientes, en los que el procedimiento según la invención ha permitido establecer un estado afectado por la enfermedad, pueden enviarse fácilmente a los laboratorios de referencia ubicados a distancia del lugar de la prueba, para la implementación de exámenes adicionales.

El archivo de las membranas al final del procedimiento según la invención también permite asegurar la trazabilidad de los resultados.

El agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos, capaz de colocar los glóbulos rojos contenidos en la muestra de sangre con el que se pone en contacto en condiciones de hipoxia, puede ser de cualquier tipo convencional en sí mismo. Es competencia del experto en la técnica identificar los agentes correspondientes a tal característica, sobre la base de sus conocimientos generales y/o de manera experimental. Para ello, un experto en la técnica podrá evaluar, para una muestra de sangre puesta en contacto con un agente de inducción candidato, la presión parcial de oxígeno o la saturación de oxígeno, una baja presión parcial de oxígeno y una saturación de oxígeno disminuida que son testigos gasométricos de una hipoxia. Más específicamente, una presión de oxígeno parcial menor 0 igual a 20 mm Hg o una saturación de oxígeno comprendida entre el 30 y el 60% son representativas de una hipoxia capaz de inducir una falciformación en un individuo drepanocítico.

También es competencia de los expertos en la técnica determinar el tamaño de los poros de la membrana porosa que permita retener los glóbulos rojos que han sufrido una falciformación y permitir el pasaje de los glóbulos rojos que no han sufrido falciformación. Para ello, un experto en la técnica podrá confiar en particular en el hecho de que un glóbulo rojo normal tiene un diámetro de aproximadamente 8 pm, y que su deformabilidad le permite pasar a través de capilares de 2 a 3 pm, cuando los glóbulos rojos drepanocíticos son incapaces de hacerlo. La determinación del tamaño de los poros adecuados podrá ser determinada, por ejemplo, empíricamente por un experto en la técnica, a partir de una muestra de sangre de un individuo sano con respecto a la drepanocitosis y de una muestra de sangre de un individuo que padece drepanocitosis, colocando estas muestras de sangre en condiciones de hipoxia, en particular según el método de Emmel, que es convencional en sí mismo, y una prueba de filtración en una membrana de un tamaño de poro determinado, para verificar si este tamaño de poro se ajusta o no a la presente invención, es decir, permite el pasaje de glóbulos rojos normales, al tiempo que prohíbe el de los glóbulos rojos falciformes.

En realizaciones particulares, el procedimiento según la invención además reúne las siguientes características, implementadas por separado o en cada una de sus combinaciones técnicamente operativas.

El agente de inducción de la falciformación de los glóbulos rojos drepanocíticos es preferiblemente un agente reductor que, al consumir el oxígeno del medio, de modo que la hemoglobina presente en este medio se encuentra en condiciones de hipoxia, provoca la reacción de falciformación de los hematíes drepanocíticos.

En realizaciones particulares de la invención, el agente de inducción de la falciformación de los glóbulos rojos drepanocíticos es una sal de metabisulfito, por ejemplo, el metabisulfito de sodio.

En variantes de la invención, la puesta en contacto de la muestra de sangre con el agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos se realiza mezclando la muestra de sangre con una solución tampón de pH comprendido entre 6,8 y 7,4, que contiene el agente de inducción de la falciformación. En particular, esta solución está desprovista de un agente de lisis celular, tal como la saponina.

Esta solución puede contener entre el 1 y el 10%, preferiblemente entre el 2 y el 5%, por ejemplo, aproximadamente el 5% en peso del agente de inducción de la falciformación, con respecto al volumen total de la solución.

Un intervalo de concentración de este tipo del agente de inducción de la falciformación en la solución permite provocar, en forma ventajosa, la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos en un tiempo reducido.

En realizaciones particulares de la invención, la puesta en contacto de la muestra de sangre con el agente de inducción de la falciformación se lleva a cabo durante un período mayor o igual a 30 segundos, preferiblemente mayor o igual a 1 minuto, y preferiblemente comprendido entre 2 y 3 minutos. Tal período de incubación de la muestra de sangre con el agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos permite obtener de manera ventajosa una tasa de falciformación suficiente para que la diferencia de aspecto de la membrana al final de la etapa de filtración sea visualmente detectable a simple vista.

En otras variantes de la invención, la membrana utilizada para la filtración está preimpregnada con el agente de inducción de la falciformación, de modo que la puesta en contacto de la muestra de sangre con el agente de inducción de la falciformación se realiza incluso durante la filtración de la muestra de sangre a través de la membrana. Por tanto, el tiempo necesario para implementar el procedimiento según la invención es tanto más corto.

En aún otras variantes de la invención, que son particularmente ventajosas en términos de viabilidad y rapidez de implementación del procedimiento, la puesta en contacto de la muestra de sangre con el agente de inducción de la falciformación se lleva a cabo, antes de la etapa b/ de filtración, depositando la muestra de sangre sobre un filtro poroso de tamaño de poros determinado para poder permitir el pasaje de glóbulos rojos que no han sufrido falciformación y el pasaje de glóbulos rojos que han sufrido dicha falciformación, e impregnada con el agente de inducción de la falciformación. Este filtro se coloca sobre la membrana. Se entiende por “dispuesto sobre” el hecho de que el filtro esté situado por encima de la membrana, en la dirección del flujo de la muestra de sangre, y preferiblemente en contacto con la membrana, para permitir el pasaje de la muestra de sangre a través del filtro a la membrana por fenómeno de capilaridad.

Este filtro puede presentar, por ejemplo, un tamaño de poro superior a 8 pm.

Un filtro de este tipo puede ser en particular de tipo absorbente, por ejemplo, a base de fibras, en particular fibras de algodón, como los papeles de filtración comercializados con la marca Whatman®.

Este filtro se impregnó, antes de la implementación del procedimiento según la invención o en una etapa preliminar de la misma, con una solución que contenía el agente de inducción de la falciformación, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente el 25% en peso, referido al volumen total de la solución. Esta impregnación se puede realizar en particular sumergiendo el filtro en la solución. Preferiblemente, va seguido de una etapa de secado del filtro así impregnado, por ejemplo, al aire libre y a temperatura ambiente, o bajo calentamiento suave.

Después del secado, este filtro retiene ventajosamente una cantidad suficiente de agente de inducción de la falciformación para inducir la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos contenidos en una muestra de sangre que lo atraviesa por efecto de capilaridad, antes de entrar en contacto con la membrana superpuesta bajo el filtro.

La inducción de la falciformación se produce entonces ventajosamente en un tiempo muy corto, del orden de unos pocos segundos.

El procedimiento según la invención se puede implementar ventajosamente a partir de un volumen de sangre muy pequeño, en particular comprendido entre 10 y 50 pl, preferiblemente comprendido entre 15 y 25 pl, por ejemplo, comprendido entre 12 y 18 pl o incluso aproximadamente igual a 20 pl.

La membrana utilizada para la etapa de filtración puede ser de cualquier tipo, siendo la única condición que los materiales que entran en su constitución sean inertes con respecto a los componentes de la muestra de sangre. Por ejemplo, la membrana utilizada está formada por policarbonato.

En realizaciones particulares de la invención, el tamaño de los poros de la membrana está comprendido entre 2 y 8 pm, preferentemente comprendido entre 3 y 6 pm o comprendido entre 6 y 7 pm. Esta porosidad permite ventajosamente el pasaje a través de la membrana de glóbulos rojos derivados de la sangre de individuos normales, así como de leucocitos, al tiempo que evita el pasaje de glóbulos rojos drepanocíticos que han sufrido el fenómeno de falciformación.

La membrana también puede presentar cualquier grado de porosidad.

La detección de la posible presencia de un residuo en la membrana de filtración se puede realizar mediante la observación visual del aspecto de la superficie de la membrana, en particular a simple vista, o mediante medios de detección óptica del tipo de rayo infrarrojo, rayo láser, etc.

En realizaciones particulares de la invención, la detección de la posible presencia de un residuo en la membrana se lleva a cabo por detección de una posible coloración roja de la membrana, durante y/o después de la etapa de filtración.

De lo contrario, la detección de la posible presencia de un residuo en la membrana de filtración se puede realizar por detección de un grosor extra de la membrana, debido al grupo de glóbulos rojos drepanocíticos que no podrían atravesar los poros de la membrana.

Además, los glóbulos rojos drepanocíticos que han sufrido la falciformación, al permanecer en la membrana durante la filtración, conducen a la obstrucción de la membrana, al bloquear los poros de esta última y, por lo tanto, a una disminución del caudal de la filtración. Esto resulta en un tiempo de filtración más largo que en ausencia de glóbulos rojos drepanocíticos en la muestra. Esta diferencia en la duración de la filtración, para condiciones de filtración idénticas, es del orden de unas pocas decenas de segundos, suficiente para poder determinar, por ejemplo, en comparación con un individuo de control normal, si el individuo para el que se realiza la detección tiene o no drepanocitosis.

En realizaciones particulares de la invención, la membrana se coloca sobre un órgano hecho de material absorbente. Se entiende que ello significa que un órgano hecho de material absorbente está ubicado debajo de la membrana, en la dirección del flujo de la muestra de sangre, y preferiblemente en contacto con la membrana, para permitir el pasaje de la muestra de sangre a través de la membrana hasta el órgano de material absorbente por fenómeno de capilaridad.

La detección de la posible presencia de un residuo en la membrana se realiza detectando un posible cambio de coloración de este órgano en material absorbente. La ausencia de tal cambio de color es representativa de la presencia de un residuo en la membrana y de un individuo que padece drepanocitosis. La ocurrencia de tal cambio de color, hacia el color rojo, es, por su parte, representativa de la ausencia de residuo en la membrana y de un individuo sano frente a la drepanocitosis.

Este órgano hecho de material absorbente puede ser, por ejemplo, del tipo a base de fibras, tales como los papeles de filtración comercializados bajo la marca Whatman®.

En caso contrario, en la ventajosa configuración de la invención en la que se coloca sobre la membrana un filtro impregnado con agente de inducción de la falciformación, la detección de la posible presencia de un residuo sobre la membrana se puede realizar mediante la detección de una posible coloración roja de este filtro, al final de la etapa de filtración b/. La aparición de tal coloración roja es entonces representativa de la presencia de un residuo sobre la membrana y de un individuo que padece drepanocitosis. La ausencia de dicha coloración roja es, por su parte, representativa de la ausencia de residuo sobre la membrana y de un individuo sano frente a la drepanocitosis.

En realizaciones particularmente ventajosas de la invención, la membrana se intercala entre el filtro poroso y el órgano de material absorbente, preferiblemente para estar en contacto con cada uno de ellos, antes de realizar la etapa a/ de poner en contacto de la muestra de sangre con el agente de inducción de la falciformación.

La etapa de filtración se puede llevar a cabo por aspiración o empujando la muestra de sangre a través de la membrana, mediante métodos convencionales en sí mismos para los expertos en la técnica. De lo contrario, se puede realizar por transferencia por capilaridad, superponiéndose entonces la membrana de filtración, por ejemplo, sobre un órgano hecho de material absorbente. En una realización de este tipo, en la que la membrana de filtración se superpone a un órgano hecho de material absorbente, la etapa de filtración b/ también puede ser asistida por aspiración o empuje de la muestra de sangre a través de la membrana.

La presión utilizada para la etapa de filtración es preferiblemente constante. Su valor puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica, teórica o empíricamente, dependiendo de la duración deseada para la etapa de filtración, el volumen de muestra por filtrar y las características de la membrana utilizada, en particular su tamaño de poros y su tasa de porosidad. Preferiblemente, las condiciones anteriores del procedimiento de acuerdo con la invención se eligen para obtener un tiempo de filtración corto, por ejemplo, de aproximadamente dos minutos, o incluso menos.

El procedimiento según la invención se puede implementar a partir de unos pocos microlitros hasta unos pocos mililitros de sangre. En particular, se puede realizar de modo ventajoso a partir de aproximadamente 10 pl de sangre, lo que corresponde sustancialmente al volumen de una gota de sangre extraída del dedo.

Los medios para implementar un procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser de diferentes tipos, siendo cada uno particularmente adecuado para la configuración de un tipo de territorio en el que es probable que se implemente el procedimiento de acuerdo con la invención.

Un kit para la detección de la drepanocitosis en un individuo comprende un agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos, capaz de colocar los glóbulos rojos contenidos en una muestra de sangre en una condición de hipoxia, y una membrana porosa de tamaño de poros determinado para poder retener los glóbulos rojos que han sufrido dicha falciformación y permitir el pasaje de los glóbulos rojos que no han sufrido falciformación. Este kit está desprovisto de agente de lisis celular.

El agente de inducción de la falciformación y la membrana pueden cumplir una o más de las características indicadas con anterioridad con referencia al procedimiento de detección según la invención.

El agente de inducción se puede impregnar sobre la membrana.

En variantes, el kit comprende una solución tampón con un pH comprendido entre 6,8 y 7,4, que contiene el agente de inducción de la falciformación y carece de agente de lisis celular. Esta solución puede cumplir, en particular, una o más de las características descritas con anterioridad.

Por ejemplo, el kit puede comprender una solución tampón de pH comprendida entre 6,8 y 7,4, que contiene metabisulfito de sodio al 5% en peso en volumen, y una membrana de tamaño de poros de 3,5 pm, 4,5 pm o 6,5 pm.

En diferentes realizaciones, el kit comprende un filtro poroso de tamaño de poros determinado para poder permitir el pasaje de glóbulos rojos que no han sufrido falciformación y glóbulos rojos que han sufrido dicha falciformación, e impregnado con el agente de inducción de la falciformación.

El kit también puede comprender un órgano hecho de material absorbente, que preferiblemente se puede superponer con la membrana, en contacto con esta última.

Este filtro y este órgano hecho de material absorbente pueden cumplir cada uno una o más de las características descritas con anterioridad con respecto a ellos con referencia al procedimiento de detección de la drepanocitosis según la invención. Pueden estar hechos del mismo material o de materiales diferentes.

La membrana, el filtro y el órgano de materiales absorbentes pueden estar presentes en el kit separados entre sí. De lo contrario, pueden estar presentes en forma de un conjunto estratificado del que forman las capas constituyentes que se presionan preferiblemente entre sí, intercalando la membrana entre el filtro y el órgano hecho de material absorbente. Este conjunto se puede guardar en un soporte sólido.

En realizaciones particulares, el kit comprende, además, un módulo de filtración, por ejemplo, del tipo que comprende, ensamblado o ensamblable entre sí:

- un depósito para la muestra por filtrar,

- un receptáculo de membrana, en el que la membrana de filtración puede estar ya colocada, o estar prevista para su colocación,

- y una boquilla que comprende un orificio para la descarga del filtrado, así como, preferiblemente, la aplicación de una presión reducida provocando la aspiración de la mezcla contenida en el depósito a través de la membrana.

Este módulo de filtración puede incluir, además, medios de aspiración del líquido contenido en el depósito a través de la membrana, en particular, un tubo a presión interna reducida, tal como un tubo Vacutainer®.

El kit puede incluir, además, un receptáculo para recolectar una muestra de sangre de un individuo, tal como un tubo a presión interna reducida equipado con un tapón que comprende un órgano de cierre perforable, del tipo Vacutainer®, que contiene opcionalmente un agente anticoagulante, por ejemplo, EDTA.

El kit también puede incluir instrucciones de uso para la implementación de un procedimiento según la invención.

Preferiblemente, todos los componentes del kit son de tipo desechable.

Un equipo de este tipo, fácilmente transportable, es particularmente adecuado para su uso en países en vías de desarrollo, por ejemplo, en regiones africanas, que disponen de pocas infraestructuras de análisis médico.

Un dispositivo para implementar un procedimiento según la invención comprende:

- medios automatizados para poner en contacto la muestra de sangre del individuo con el agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos,

- medios automatizados de filtración, a través de la membrana, de la muestra de sangre que contiene glóbulos rojos directamente después de la etapa de puesta en contacto de la muestra de sangre con el agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos, es decir, sin etapa intermediaria distinta al desplazamiento, en particular, sin una etapa intermedia de tratamiento, centrifugación, separación de constituyentes, etc. Estos medios de filtración automatizados pueden ser los mismos que los medios automatizados para poner la muestra de sangre en contacto con el agente de inducción de la falciformación,

- y medios de detección óptica de la posible presencia de un residuo en la membrana, durante o al final de la etapa de filtración, por ejemplo, medios de lectura de la membrana del tipo por rayo láser.

Este dispositivo puede incluir, además, un módulo automatizado para transportar un receptáculo que contiene la muestra de sangre de uno de los módulos automatizados anteriores a otro, por ejemplo, tal como un módulo comúnmente designado por la expresión “cambiador de muestras”, así como un módulo de control automático de uno o más de los diferentes módulos anteriores para la implementación de una o más de las etapas de un procedimiento para la detección de la drepanocitosis según la invención.

Un dispositivo automatizado de este tipo es particularmente adecuado para su uso en los países denominados industrializados, equipados de laboratorios de análisis sofisticados, para la detección de alto rendimiento.

Las características y ventajas de la invención se evidenciarán con mayor claridad a la luz de los ejemplos siguientes, proporcionados a título meramente ilustrativo y no limitativo de la invención, con el apoyo de las Figuras 1 a 4, en las que:

- la Figura 1 representa esquemáticamente los componentes de un kit para la detección de la drepanocitosis de acuerdo con la presente invención, e ilustra las diferentes etapas de un procedimiento de detección de la drepanocitosis de acuerdo con la presente invención, implementado en forma de este kit;

- la Figura 2 muestra una fotografía de las membranas obtenidas al final de la implementación de un procedimiento según la invención, a partir de una muestra de sangre, (A) de un individuo normal, (B) de un individuo drepanocítico, para niveles de dilución de la muestra de sangre en una solución que contiene un agente de inducción de la falciformación de 100, 50 y 10 pl de muestra de sangre, respectivamente, en un volumen total de 8,6 ml de esta solución;

- la Figura 3 muestra imágenes obtenidas por observación bajo el microscopio, con un aumento de 200 veces, de las membranas de la Figura 2, correspondientes al volumen de 10 pl de muestra de sangre, (A) para el individuo normal, (B) para el individuo drepanocítico;

- y la Figura 4 ilustra esquemáticamente las etapas de un procedimiento de detección de la drepanocitosis según una variante de la invención.

En la Figura 1, se representa esquemáticamente un kit para la detección de la drepanocitosis según la invención. Las dimensiones relativas de los diversos componentes de este kit no son representativas de la realidad.

Este kit comprende un primer tubo 10 de muestreo, que comprende un cuerpo 11 y un tapón 12 que comprende un órgano 13 de obturación que puede perforarse con una aguja, conocido como septo. Un agente anticoagulante, en particular EDTA, está contenido en el cuerpo 11 del tubo 10.

El kit comprende, además, un módulo 20 de filtración. Este módulo de filtración puede ser en particular como se describe en los documentos de patente FR-A-2952 069 o FR-A-2926090 a nombre del presente solicitante.

Esquemáticamente, el módulo 20 de filtración comprende los siguientes elementos. Por razones de claridad, algunos de estos elementos están representados en la Figura 1 separados entre sí, mientras que, en realidad, están inicialmente ensamblados entre sí.

El módulo 20 de filtración comprende así un depósito 21 para recibir la muestra por filtrar, que comprende, en un primer extremo 211, una abertura para la alimentación de la muestra.

En un segundo extremo 212, en particular opuesto a dicho primer extremo 211, el depósito 21 es solidario de un órgano 25 de recepción de una membrana 24 de filtración. Esta membrana 24 de filtración está montada a tal efecto en un soporte 241 de membrana rígida.

La membrana 24 está formada, por ejemplo, de policarbonato. Presenta, por ejemplo, una distribución de poros aleatoria, un diámetro de poro de 3,5 pm y una densidad de poros de 100.000 poros/cm2.

El módulo de filtración comprende, además, una pieza 22 terminal hueca, fijada de manera reversible alrededor del órgano 25 de recepción de la membrana, y que comprende un soporte 23 para una punta de perforación de un septo, perforado con un canal 231 que se abre en su extremo, para la evacuación del filtrado y la aplicación de la aspiración.

El módulo de filtración también comprende un tubo 26 a presión interna reducida, del tipo Vacutainer®, llamado tubo de recolección, que comprende un cuerpo 27 y un tapón 28 de septo 29. La presión interna en el tubo de recolección 26, por ejemplo, está comprendida inicialmente entre 76 y 200 mm Hg.

El kit comprende, además, una solución tampón a pH 7,2, denominada solución reductora, que contiene para 1 litro de solución, 8,41 g de solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1,8 g de EDTA, agua destilada en cantidad suficiente para obtener el volumen total de 1000 ml. El pH se ajusta al valor deseado con hidróxido de sodio (NaOH). El agente reductor, metabisulfito de sodio, se agrega a esta solución a una concentración del 5% p/v.

Un procedimiento de acuerdo con una realización particular de la invención se lleva a cabo como sigue, por medio de este kit.

Para que un individuo sea analizado, se toma una muestra de sangre y se recolecta en el tubo 10 de recolección, de acuerdo con el protocolo estándar de muestreo de sangre dedicado a la prescripción de hemograma (CBC). De modo esquemático, después de colocar un torniquete en el brazo, se perfora la vena radial o cubital utilizando un dispositivo de vacío, por ejemplo, mediante una aguja biselada conectada al tubo 10 de recolección. Se recoge un volumen 111 de sangre, por ejemplo, 5 ml, en el tubo 10 de recolección, e inmediatamente se pone en contacto con EDTA.

Las muestras de sangre se usan preferiblemente dentro de las 24 horas posteriores a la recolección.

A continuación, se extrae el volumen deseado de la muestra de sangre del tubo 10 de recolección y se diluye en la solución reductora para alcanzar el volumen total deseado. Los glóbulos rojos drepanocíticos posiblemente contenidos en la muestra de sangre sufren el fenómeno de falciformación.

Después de 1 a 2 min, la solución final así obtenida se coloca en el depósito 21 del módulo 20 de filtración, como se indica en 31 en la Figura 1. La punta fijada en el soporte 23 de punta de la boquilla 22 se inserta luego a través del septo 29 del tubo 26 de recolección, como se indica en 32 en la Figura 1.

Debido a la presión reducida en el tubo 26 de recolección, se produce una aspiración del contenido del depósito 21, a través de la membrana 24. El filtrado 33 que atraviesa esta membrana 24 y se recoge en el tubo 26 de recolección comprende la sangre que contiene los glóbulos rojos normales y los leucocitos. Los glóbulos rojos drepanocíticos rígidos y en forma de hoz son retenidos por la membrana 24.

Al final de la filtración, se retira el módulo 20 de filtración, como se indica en 34 en la Figura 1, para recoger la membrana 24, como se indica en 35.

Esta membrana 24 se observa visualmente, con el fin de detectar una posible coloración roja de la misma y/o detectar la posible presencia de un exceso de espesor en su superficie. Tal coloración y/o tal espesor adicional opcional son indicativos de un individuo que padece de drepanocitosis.

Un procedimiento de este tipo según la invención se implementó de la siguiente manera, para 16 pacientes que padecían drepanocitosis y para 16 pacientes normales.

El diagnóstico biológico de la drepanocitosis se había establecido de antemano por electroforesis en presencia de anfolinas (diagnóstico conocido como focalización de la hemoglobina) o por HPLC.

Se diluyeron en la solución reductora volúmenes de 100, 50 y 10 pl, respectivamente, de sangre de cada uno de los individuos, hasta alcanzar un volumen total de 8,6 ml.

Para cada individuo y cada dilución, la muestra diluida así obtenida se colocó en el depósito 21 de un módulo 20 de filtración y se sometió a filtración a través de la membrana 24.

La duración de la filtración estuvo comprendida entre 1 y 2 min.

Al final de la etapa de filtración, cada membrana se recuperó y se observó visualmente.

Para las tres velocidades de dilución, en la Figura 2, se muestra un ejemplo de las membranas obtenidas para un individuo normal (A) y para un individuo drepanocítico (B). Estos resultados son representativos de cada categoría de individuos analizados.

Se observa claramente una coloración de las membranas del paciente drepanocítico, para todos los volúmenes iniciales de muestra de sangre, incluso para el volumen de 10 pl. Este color es rojo oscuro en realidad. No se observa coloración en las membranas obtenidas del individuo sano.

Se realizó una observación bajo el microscopio de las membranas obtenidas para un volumen inicial de muestra de sangre de 10 pl. Las imágenes obtenidas se muestran en la Figura 3. Allí se observa que la membrana utilizada para la filtración de la muestra de sangre normal no contiene glóbulos rojos en su superficie, mientras que la membrana utilizada para la filtración de la muestra de sangre drepanocítica comprende agregados de glóbulos rojos en su superficie.

Estos resultados son representativos de todos los resultados obtenidos, para cada una de las dos categorías de individuos evaluados. Para todas las muestras tomadas, se observó un depósito de glóbulos rojos en la superficie de las membranas cuando la sangre provenía de pacientes afectados. Este depósito nunca se ha observado cuando la sangre provenía de individuos sanos. La falciformación inducida por el metabisulfito de sodio hizo que los glóbulos rojos drepanocíticos fueran rígidos e indeformables, incapaces de penetrar por deformabilidad a través de los poros de la membrana, como lo hacían los glóbulos rojos de los individuos normales.

Esto demuestra claramente la fiabilidad del procedimiento según la invención para la detección de la drepanocitosis. Incluso a partir de una muestra de sangre con un volumen de 10 pl, este procedimiento permite discriminar a las personas que padecen la enfermedad de las personas sanas.

La Figura 4 ilustra una realización particularmente ventajosa de la invención, a partir de un kit que comprende un conjunto 40 de filtro estratificado que comprende las siguientes capas constituyentes sucesivas: un filtro 41 poroso, una membrana 24 y un órgano 42 de material absorbente. En esta Figura, estas diferentes capas se muestran separadas entre sí por razones de claridad. En realidad, están en contacto entre sí. Además, los espesores relativos de estas diferentes capas no son de modo alguno representativos de la realidad.

La membrana 24 cumple las características descritas con anterioridad.

El filtro 41 y el órgano 42 hecho de material absorbente pueden formarse del mismo material o de diferentes materiales.

El filtro 41 presenta un tamaño de poros suficiente para permitir el pasaje de glóbulos rojos que no han sufrido falciformación y glóbulos rojos que han sufrido una falciformación.

Por ejemplo, el filtro 41 y el órgano 42 de material absorbente son ambos papeles de filtración Whatman® número 40, a base de fibras de algodón, de 22 pm de espesor, con un gramaje de 95 g/m2 y retención de 8 pm.

Este filtro 41 y este órgano 42 de material absorbente se presentan, por ejemplo, en forma de discos, en particular con un diámetro comprendido entre 8 mm y 2 cm, por ejemplo, de aproximadamente 90 mm.

El filtro 41 se impregnó previamente sumergiéndolo en una solución que contenía el agente de inducción de la falciformación, por ejemplo, metabisulfito de sodio, a una concentración del 25% p/v, y luego se secó.

Por medio de tal conjunto 40 de filtro, se puede implementar un procedimiento de detección de drepanocitosis de la siguiente manera.

En una primera etapa, ilustrada en 43 en la Figura 4, se deposita una muestra 44 de sangre sobre la superficie superior del filtro 41. El volumen de esta muestra 44 de sangre es, por ejemplo, de aproximadamente 15 pl, es decir, sustancialmente el equivalente a una gota de sangre.

Esta muestra atraviesa el filtro 41, por efecto de capilaridad. Durante esta fase, entra en contacto con el agente de inducción de la falciformación. En este contacto, los glóbulos rojos drepanocíticos posiblemente contenidos en la muestra 44 de sangre sufren el fenómeno de falciformación.

Dependiendo de si la muestra de sangre proviene de un individuo que padece drepanocitosis o de un individuo sano con respecto a esta enfermedad, ocurren los siguientes eventos.

Si el individuo está sano frente a la drepanocitosis, como se indica en 45 en la Figura 4, la muestra 44 de sangre, que no contiene glóbulos rojos que hayan sufrido la falciformación, atraviesa la membrana 24, siempre por efecto de capilaridad, y es absorbida por el órgano 42 hecho de material absorbente. Este último cambia de color, hacia una coloración roja. El filtro 41, por su parte, conserva su coloración inicial. La detección de una ausencia de carácter alcanzada por la drepanocitosis se realiza así observando el filtro 41 y/o el órgano 42 hecho de material absorbente, habiendo conservado el primero su coloración inicial y el segundo estando coloreado de rojo.

Si el individuo padece drepanocitosis, como se indica en 46 en la Figura 4, los glóbulos 47 rojos contenidos en la muestra 44 de sangre y que han sufrido la falciformación son bloqueados por la membrana 24. Una observación del órgano 42 de material absorbente después de unos segundos muestra que este último ha conservado su coloración inicial, ya que los glóbulos rojos nunca la han alcanzado. El filtro 41, por su parte, está siempre en contacto con los glóbulos 47 rojos falciformes, parte de los cuales, a diferencia de lo que se muestra en la Figura 4, aún permanece atascada en sus poros. Por tanto, presenta una coloración roja. Así, la detección de un rasgo afectado por la drepanocitosis se realiza también observando el filtro 41 y/o el órgano 42 de material absorbente, estando el primero coloreado de rojo y el segundo, habiendo conservado su coloración inicial.

Esta prueba de detección resultó ventajosamente muy simple y rápida de realizar, además de un volumen muy pequeño de sangre.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de detección de drepanocitosis en un individuo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas sucesivas, pudiendo ser implementadas las etapas a/ y b/ sucesiva o simultáneamente, en donde dicho procedimiento no comprende una etapa de puesta en contacto de dicha muestra de sangre con un agente de lisis celular:

a/ puesta en contacto de una muestra (44) de sangre de dicho individuo con un agente de inducción de la falciformación de glóbulos rojos drepanocíticos capaz de colocar los glóbulos rojos contenidos en la muestra de sangre en una condición de hipoxia,

b/ filtración de dicha muestra (44) de sangre que contiene glóbulos rojos a través de una membrana (24) porosa de tamaño de poros determinado para poder retener los glóbulos rojos que han sufrido dicha falciformación (47), y permitir el pasaje de glóbulos rojos que no han sufrido falciformación,

c/ y detección de la posible presencia de un residuo (47) en dicha membrana (24), durante y/o al final de la etapa de filtración, estando asociada dicha presencia a un rasgo afectado de dicho individuo para la drepanocitosis.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente de inducción de la falciformación es una sal de metabisulfito.

3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la porosidad de la membrana (24) está comprendida entre 2 y 8 pm.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la puesta en contacto de la muestra (44) de sangre con el agente de inducción de la falciformación se realiza mezclando dicha muestra de sangre con una solución tampón de pH comprendido entre 6,8 y 7,4 que contiene dicho agente de inducción y está desprovista de agente de lisis celular.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha solución contiene entre el 1 y 10% en peso de dicho agente de inducción de la falciformación, con respecto al volumen de dicha solución.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la puesta en contacto de la muestra (44) de sangre con el agente de inducción de la falciformación se lleva a cabo durante un período superior o igual a 30 segundos.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la puesta en contacto de la muestra (44) de sangre con el agente de inducción de la falciformación se realiza, antes de la etapa b/ de filtración, depositando dicha muestra (44) de sangre sobre un filtro (41) poroso de tamaño de poros determinado para permitir el pasaje de los glóbulos rojos que no han sufrido falciformación y los glóbulos rojos que han sufrido dicha falciformación (47), e impregnada con dicho agente de inducción de falciformación, estando dispuesto dicho filtro (41) sobre dicha membrana (24).

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la detección de la posible presencia de un residuo (47) sobre la membrana (24) se realiza por detección de una posible coloración roja de dicha membrana (24).

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la membrana (24) se dispone sobre un órgano (42) de material absorbente y la detección de la posible presencia de un residuo (47) sobre la membrana (24) se realiza por detección de un posible cambio de coloración de dicho órgano (42) de material absorbente, siendo representativa la ausencia de dicho cambio de coloración de la presencia de un residuo (47) sobre la membrana (24).