ES2837380T3

ES2837380T3 - Dispositivo multicapa para separar componentes sanguíneos y usos del mismo

Info

Publication number: ES2837380T3
Application number: ES17757324T
Authority: ES
Inventors: John Degree Henion; Imelda Ryona; Larry Donald Bowers
Original assignee: Partnership For Clean Competition
Current assignee: Partnership For Clean Competition
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2037-02-24
Also published as: US20220268675A1; EP3420334B1; AU2017222642B2; AU2017222642A1; JP6864919B2; EP3800462A1; JP2019512093A; EP3420334A4; CN109073519A; CA3015627A1; EP3420334A1; US20190049353A1; AU2017222642C1; DK3420334T3; PT3420334T; CN109073519B; WO2017147456A1; US11326992B2; CA3015627C

Abstract

Un dispositivo multicapa, que comprende: a) una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior (2) con al menos una muesca, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba (4) con al menos una muesca que tiene la misma forma y tamaño que la al menos una muesca en la cubierta superior (2); y b) una unidad inferior que comprende capas de: una capa absorbente (5) y una cubierta inferior (7) sin muescas, en donde dicha unidad superior es adyacente y está conectada a dicha unidad inferior, dicha unidad de membrana de filtración comprende dos membranas de filtración (1, 2) de tamaños de poro decrecientes, cada una con una forma de dicha muesca, dicha unidad de membrana de filtración está colocada dentro de dicha muesca de dicha cubierta superior (2) y adyacente a dicha membrana hidrófoba (4), dicha membrana hidrófoba (4) está intercalada entre dicha unidad de membrana de filtración y dicha capa absorbente (5), dicha capa absorbente (5) es adyacente a dicha membrana hidrófoba (4), y dicha capa absorbente (5) está por encima de dicha cubierta inferior (7).

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo multicapa para separar componentes sanguíneos y usos del mismo

Campo de invención

Esta invención se refiere en general a la separación de componentes de muestras de fluido para la detección de analitos. Más particularmente, aspectos de la invención se dirigen a un dispositivo fácil y exacto para la separación de diversos componentes de la sangre total, lo que incluye, pero no se limita a, glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y plasma, mediante el uso de un dispositivo multicapa o un dispositivo de separación multicapa para la separación de componentes sanguíneos y métodos de uso de dicho dispositivo para detectar analitos en los diversos componentes sanguíneos, por ejemplo, específicamente en la superficie celular y en los fluidos intra y extracelulares, tales como, pero no limitados a, compuestos químicos, fármacos y metabolitos, ácidos nucleicos, ADN, ARN, ARNm, miARN, proteínas, marcadores intracelulares y de la superficie celular, patógenos, bacterias, virus, microorganismos y similares.0

Descripción de la técnica relacionada

Los eventos deportivos han unido a personas de todas las edades y nacionalidades. Debe protegerse la integridad de los juegos y de los atletas para salvaguardar los poderosos impactos positivos de los deportes. Para mantener esa integridad, los sistemas de prueba deben evolucionar para darle al público la confianza de que los atletas no usan ilegalmente drogas para mejorar el rendimiento. Además de las pruebas deportivas competitivas, las pruebas de sustancias químicas se administran a menudo a empleados potenciales o actuales, prisioneros o personas en libertad condicional, personal militar, posterior a accidentes en vehículos, aviación y navegación, en análisis forenses y similares. Por ejemplo, la tecnología de las manchas de sangre seca se ha usado para detectar enfermedades metabólicas congénitas en los recién nacidos. Aunque el muestreo se consigue ventajosamente mediante una punción en el dedo o el talón para obtener un volumen mínimo, un transporte fácil y una estabilidad de la muestra, todavía existen varios obstáculos.

Los productos y métodos de prueba disponibles tienen muchos desafíos con respecto a las limitaciones en la recolección y procesamiento de muestras, el rendimiento de las muestras, la compatibilidad con el hematocrito (Hct) y la detección espectrofotométrica. Un problema de los análisis posteriores a la recolección es la limitación del procesamiento de la muestra recolectada, que implica la manipulación manual y la detección a partir de un perforador mediante la extracción manual de la mancha de sangre seca, perforar una pequeña porción de la mancha de sangre seca (aproximadamente 3 milímetros - 6 milímetros) y eluir la muestra más pequeña en disolvente para análisis estándar. Este no es un proceso automatizado.

Dos tarjetas de manchas de plasma seco (DPS) existentes son la tarjeta NOVIPLEX™, que está disponible comercialmente en Novilytic LLC (Kim, J.H., y otros, Anal Chem 2013, 85, 11501-11508) y la 'tarjeta DPS automática' informada previamente por Sturm y otros (Bioanalysis 2015, 7, 1987-2002). La funcionalidad del sustrato de recolección de plasma, que es el material de recolección o el papel de celulosa, es una diferencia clave entre las diversas tarjetas de mancha seca. La tarjeta DPS automática tiene un límite de cera. Con el límite de cera de la tarjeta DPS automática, el exceso de plasma filtrado se retiene dentro del límite, lo que da como resultados sesgos de inexactitud en los extremos inferior y superior del hematocrito. A un nivel de hematocrito bajo, hay más plasma disponible y retenido dentro del área delimitada por la cera, mientras que, a niveles altos de hematocrito, se retiene menos plasma. El límite de la tarjeta NOVIPLEX™ es diferente del límite de cera descrito en la tarjeta DPS automática. La tarjeta NOVIPLEX™ tiene un disco que una vez saturado, el exceso de plasma filtrado fluye libremente fuera o más allá del disco. Esta acción es diferente a la tarjeta DPS automática, donde el exceso de plasma queda atrapado dentro del límite. En general, el diseño conceptual de estas dos tarjetas es similar ya que cada una de ellas emplea una técnica de filtración de membrana en la tarjeta para separar los glóbulos rojos del plasma. Sin embargo, las estructuras de la tarjeta y la producción de plasma en cada formato de tarjeta son diferentes y cada una tiene sus propias desventajas. Como se describió anteriormente, la tarjeta DPS automática puede no ser exacta ni eficiente. Según se informa, la tarjeta DPS automática puede utilizar un dispositivo de soporte de muestra también conocido como análisis de superficie de extracción de líquido, LESA™, lanzado por Advion, Inc. (Ithaca, NY, EE. UU.). Aunque la tarjeta NOVIPLEX™ no requiere ningún dispositivo externo para la generación de manchas de plasma, no es compatible para análisis automatizado. Como resultado, el proceso de manipulación de muestras es tedioso y requiere un par de pinzas para remover un pequeño disco de filtro de 2 mm que contiene la muestra y transferir manualmente el disco para procesos de extracción de muestras posteriores. Si bien no se determinó el rendimiento de volumen de plasma por DPS automática, la tarjeta NOVIPLEX™ requiere un mínimo de 25 pl de sangre para producir aproximadamente 2,5 pl de plasma (Kim, J. H. y otros, Anal Chem 2013, 85, 11501-11508). Desafortunadamente, el rendimiento de volumen de plasma es bajo, es decir, 0,100 pl de plasma por pl de sangre. El rendimiento de plasma de la tarjeta NOVIPLEX™ es de aproximadamente 2,5 pl, que es insuficiente para la mayoría de los análisis. La baja cantidad de plasma no se debe a un volumen de muestra de sangre inicial bajo, sino que más bien se debe a una capacidad limitada del sustrato de recolección de plasma. El escalado no es posible.

Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema fácil, exacto, eficiente y rápido para separar componentes de una muestra y detectar analitos, tal como, pero no limitado a, un sistema manual o uno automatizado. Más particularmente, existe la necesidad de un producto y una técnica que utilice un proceso de recolección de muestras simplificado, costos reducidos y envío y almacenamiento simplificados que supere la necesidad de centrifugación para separar los componentes de la sangre total (Sturm, y otros, Bioanalysis 2015, 7, 1987-2002 ("Sturm"); Kim y otros, Anal Chem 2013, 85, 11501-11508 ("Kim"); Li y otros, Rapid Commun Mass Spectrom 2012, 26, 1208-1212 ("Li")), el intervalo estrecho de hematocrito actualmente disponible para la prueba, es decir, Hct 40-55 % (Stunn), bajo rendimiento de volumen de plasma (Sturm; Kim; Li) y ausencia de análisis completamente automatizados (Kim; Li).

El documento US 2014/295415 describe dispositivos y métodos de prueba de diagnóstico molecular para usar dichos dispositivos de prueba de diagnóstico para detectar analitos de importancia biológica en un paciente.

El documento EP0418765 describe un dispositivo de ensayo que incluye un apilamiento de filtros en una carcasa que tiene una porción de base y una tapa. El apilamiento de filtros tiene una membrana hidrófila que tiene un enlazador para un analito sobre ella, una membrana hidrófoba debajo de la membrana hidrófila y una almohadilla de material absorbente debajo de la membrana hidrófoba.

El documento WO 2009/075709 describe un sistema de filtro para separar partículas a partir de un fluido. El sistema comprende un primer elemento de filtro que comprende una superficie de salida de fluido, un segundo elemento de filtro dispuesto sobre el primer elemento de filtro, pero no coextensivo con el primer elemento de filtro en la superficie de salida de fluido, cuyo segundo elemento de filtro comprende una superficie de aplicación de fluido y una vía del flujo de fluido lateral desde la superficie de aplicación hasta la superficie de salida del fluido. Un fluido aplicado a la superficie de aplicación fluye hacia el segundo filtro y lateralmente a través del segundo filtro hasta la superficie de salida del fluido.

"Next generation plasma collection technology for the clinical analysis of temozolomide by HILIC/MS/MS" por Alan J Barnes y otros, describe una tecnología de extracción de plasma que comprende aplicar una muestra de sangre a un apilamiento de membranas laminadas que permite que el plasma fluya a través del filtro asimétrico mientras retiene los componentes celulares de la muestra de sangre.

Breve resumen de la invención

La invención proporciona un dispositivo multicapa según se reivindica en las reivindicaciones adjuntas.

En una modalidad, se describe un dispositivo multicapa para la recolección y separación de, por ejemplo, componentes sanguíneos, que permite la detección de analitos a partir de una muestra de fluido aplicada al dispositivo multicapa, por ejemplo, sangre total. El dispositivo multicapa puede ser una tarjeta de mancha seca compuesta en forma de libro en una modalidad, donde existe una cubierta superior e inferior articuladas en un borde que forma un lomo e intercala múltiples capas de membranas y materiales similares a las páginas de un libro.

Alternativamente, más de uno o todos los bordes están conectados o acoplados temporalmente, y cualquiera o todas las capas del dispositivo multicapa que están conectadas o acopladas en uno o más bordes, pueden desprenderse, retirarse o separarse entre sí y desde el dispositivo. La separación de la muestra de fluido permite análisis individuales posteriores de los componentes separados.

Otro aspecto puede dirigirse a un dispositivo multicapa que comprende capas que pueden retirarse o desprenderse por separado según se desee. Un dispositivo multicapa que tiene una forma rectangular, puede unirse o acoplarse temporalmente en todos los bordes, donde cualquiera o todas las capas del dispositivo multicapa pueden desprenderse o retirarse. Por ejemplo, los bordes de cualquiera o todas las capas pueden perforarse de manera que permita que la capa se arranque o se desprenda de los componentes restantes del dispositivo multicapa. Alternativamente, las capas pueden intercalarse apretadamente entre las cubiertas superior e inferior de manera que la muestra de fluido no se escape y cada una de las capas del dispositivo multicapa permanezca en posición hasta que se separen para su extracción.

La invención proporciona un dispositivo multicapa, que comprende:

a) una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior con al menos una muesca, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba con al menos una muesca y el mismo número de muescas que en la cubierta superior; y

b) una unidad inferior que comprende capas de: un material de recolección y una cubierta inferior sin muescas, donde dicha unidad superior es adyacente y está conectada a dicha unidad inferior, dicha unidad de membrana de filtración comprende al menos dos membranas de filtración de tamaños de poro decrecientes, cada una con una forma de dicha muesca, dicha unidad de membrana de filtración se coloca dentro de dicha muesca de dicha cubierta superior y adyacente a dicha membrana hidrófoba, donde cada una de las capas de la cubierta superior, la unidad de membrana de filtración y la membrana hidrófoba están alineadas por las muescas, dicha membrana hidrófoba es adyacente o está intercalada entre dicha unidad de membrana de filtración y dicho material de recolección, dicho material de recolección es adyacente a dicha membrana hidrófoba, y dicho material de recolección está encima de dicha cubierta inferior. Dado que el plasma es principalmente agua, un material hidrófobo no absorberá ningún volumen de plasma. Una membrana hidrófoba que tiene muescas evitará que ningún volumen de plasma se escape o se extienda más allá de los límites de las muescas, lo que permitirá de esta forma que una mancha seca se coloque en el centro dentro de las muescas. La unidad de membrana de filtración en un aspecto puede estar intercalada entre la cubierta superior y la membrana hidrófoba. El material de recolección, que es una capa absorbente tal como celulosa, papel, etc., en otro aspecto puede estar intercalado entre dicha membrana hidrófoba y dicha cubierta inferior. El dispositivo multicapa puede tener forma de rectángulo que tiene cuatro bordes, donde cada una de las capas de la unidad superior o la unidad inferior se acoplan temporalmente en al menos un borde, forman un contacto suficientemente estrecho para evitar cualquier escape o movimiento de capas, y cada una de las capas de la unidad superior y la unidad inferior es desprendible o extraíble. Un formato alternativo de un dispositivo multicapa incluye además una capa de soporte de contacto adyacente a y debajo de dicho material de recolección y adyacente a o encima de dicha cubierta inferior, o los soportes de contacto forman una porción de una cubierta inferior, donde los soportes de contacto de la capa de soporte de contacto contienen, preferentemente, soportes elevados donde al menos una porción de dichos soportes elevados encaja dentro de la muesca donde se coloca una muestra de fluido. Un aspecto adicional comprende dicho dispositivo multicapa que también puede incluir al menos un soporte de ventana para una capa desprendida para análisis posteriores, preferentemente, para una unidad de membrana de filtración y/o un material de recolección. El soporte de ventana puede ser una capa que contiene una ventana que expone la muestra para la detección de un analito de interés, dicha capa para análisis posteriores está unida o acoplada a dicho soporte de ventana, y dicho soporte de ventana acoplado a dicha capa para análisis posteriores puede retirarse o desprenderse de dicho dispositivo multicapa para análisis biológicos posteriores.

En la presente descripción se describe un dispositivo multicapa que comprende: una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior con al menos una muesca, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba con al menos una muesca; y

b) una unidad inferior que comprende capas de: un material de recolección y una cubierta inferior sin muescas, En otros aspectos, un método de uso del dispositivo multicapa comprende:

a) aplicar un volumen flexible de un fluido a un dispositivo multicapa que comprende (i) una unidad superior que comprende capas de una cubierta superior con al menos una muesca u orificio abierto sobre o en el que se coloca una muestra de fluido, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba; y (ii) una unidad inferior que comprende capas de un material de recolección y una cubierta inferior sin muescas, donde dicha unidad superior es adyacente a dicha unidad inferior, donde dicho volumen puede ser aproximadamente de 10 microlitros a aproximadamente 100 microlitros;

b) esperar aproximadamente 3 minutos con dicha unidad superior en contacto con dicha unidad inferior; c) separar dicha unidad de membrana de filtración y/o dicho material de recolección de dicho dispositivo multicapa;

d) esperar aproximadamente 30 minutos mientras dicha unidad de membrana de filtración y/o dicho material de recolección separados se secan; y

e) analizar dicha unidad de membrana de filtración y/o dicho material de recolección. El análisis de dicha unidad de membrana de filtración y/o dicho material de recolección puede incluir la detección de un analito de interés. Un aspecto adicional puede dirigirse a un método de uso del dispositivo multicapa, que comprende:

a) aplicar un volumen de una muestra de fluido a dicha unidad de membrana de filtración de dicho dispositivo multicapa;

b) esperar aproximadamente 3 minutos con dicha unidad superior en contacto con dicha unidad inferior; y c) almacenar dicho dispositivo multicapa. Después de almacenar el dispositivo multicapa desde unos pocos minutos hasta varios días con o sin transportar el dispositivo multicapa a una instalación para su análisis, el dispositivo multicapa que contiene una muestra segura y a prueba de manipulaciones se somete a una manipulación adicional. Después de almacenar el dispositivo multicapa, el método de uso comprende, además: d) separar la unidad de membrana de filtración y el material de recolección del dispositivo multicapa; y e) analizar la unidad de membrana de filtración y/o el material de recolección para detectar analitos de interés, donde el dispositivo multicapa puede ser un dispositivo impreso en 3D o un dispositivo no impreso en 3D, por ejemplo, cartulina.

Los beneficios del dispositivo multicapa y las técnicas descritas aquí incluyen la recolección de muestras simplificada, costos reducidos, envío y almacenamiento simplificados, y un interés significativo ganado en diversos campos (Tretzel, L. y otros, Analytical Methods 2015, 7, 7596-7605; Sadones, N. y otros, Bioanalysis 2014, 6, 2211 2227). El dispositivo multicapa de la invención supera muchos desafíos en la técnica, lo que incluye el efecto del hematocrito y el muestreo de sangre total en lugar de plasma (De Kesel, P. M. y otros, Bioanalysis 2013, 5, 2023 2041).

En otro aspecto, un dispositivo multicapa se configura para análisis fáciles y rápidos de detección de analitos encontrados en manchas de muestra seca recolectados y separados mediante el dispositivo multicapa, tales como, pero no limitado a, análisis automatizados de alto rendimiento. Por lo tanto, el dispositivo multicapa de la invención descrito aquí se desarrolló para ser compatible con un amplio intervalo de niveles de hematocrito (por ejemplo, 25 %-65 %), un alto rendimiento de volumen de plasma a partir de una muestra de fluido de sangre total y análisis separados de múltiples componentes de una única muestra de fluido.

Breve descripción de los dibujos

La invención puede entenderse mejor mediante referencias a la descripción detallada cuando se considera en relación con los dibujos adjuntos. Los componentes en las figuras no están necesariamente a escala, sino que más bien se hace énfasis en ilustrar los principios de la invención. En las figuras, los números de referencia similares designan partes correspondientes a lo largo de las diferentes vistas.

La invención se refiere en parte a una tarjeta de mancha seca mejorada. Entre otros campos y aplicaciones, la invención puede tener utilidad, por ejemplo, en la detección de compuestos químicos, fármacos, metabolitos, hormonas, opioides, virus, ácidos nucleicos, proteínas y similares, a partir de una muestra de fluido, lo que incluye, pero no se limita a, sangre total, glóbulos rojos, plasma y plaquetas. También puede contemplarse el uso del dispositivo multicapa para detectar analitos de interés en muestras de fluidos que no requieren necesariamente separación, tales como, por ejemplo, orina, saliva, lágrimas, fluido amniótico, semen y similares.

Las figuras representan aspectos de un dispositivo multicapa, lo que incluye la separación de muestras de fluidos y la determinación de la presencia de compuestos químicos, fármacos, opioides, hormonas, ácidos nucleicos, proteínas y similares, de acuerdo con modalidades de ejemplo.

La Figura 1 muestra un dispositivo multicapa tipo libro, donde los números indican el orden de ensamble del 1 al 6, que se describen en detalle en el Ejemplo 1.

La Figura 2 muestra un dispositivo multicapa que contiene siete capas: (1) una primera membrana de filtración que encaja dentro de cada muesca; (2) una cubierta superior con cuatro muescas; (3) una segunda membrana de filtración que encaja dentro de cada muesca y adyacente a la primera membrana de filtración; (4) una membrana hidrófoba que contiene muescas; (5) un material de recolección sin muescas y que tiene opcionalmente un contorno del perímetro de la muesca donde se encuentran las muescas; (6) una capa de soporte de contacto; y (7) una cubierta inferior.

La Figura 3 muestra los resultados de las posiciones de muestreo central y periférica para diversos opioides, donde la columna izquierda y la columna derecha para cada opioide representan una posición central y una posición periférica, respectivamente.

La Figura 4 muestra la estabilidad en la tarjeta de opioides y estimulantes en LLOQ (5 ng/ml) en tres condiciones de almacenamiento diferentes: a TA mantenida en una caja llena con un flujo continuo de nitrógeno (TA nitrógeno), a TA mantenida en un sobre de papel celofán desecante sellado adicionalmente en una bolsa Ziploc (TA aire), y a -20 °C mantenida en un sobre de papel celofán desecante sellado adicionalmente en una bolsa Ziploc (-20 °C aire).

La Figura 5 muestra la estabilidad en la tarjeta de opioides y estimulantes a QC alto (900 ng/ml) en tres condiciones de almacenamiento diferentes: a T^amantenida en una caja llena con un flujo continuo de nitrógeno (TA nitrógeno), a TA mantenida en un sobre de papel celofán desecante sellado adicionalmente en una bolsa Ziploc (TA aire), y a -20 °C mantenida en un sobre de papel celofán desecante sellado adicionalmente en una bolsa Ziploc (-20 °C aire).

La Figura 6 muestra la precisión y exactitud para el análisis con el dispositivo multicapa mediante el uso de sangre con 30 %, 45 % y 60 % de Hct (n = 3) en el LLOQ (A y B) y QC alto (C y D).

La Figura 7 muestra cromatogramas LC/MS por SRM de muestras de sangre fortificadas que contienen morfina (1), codeína (2), oxicodona (3), anfetamina (4), hidrocodona (5), metanfetamina (6), MDMA (7), fentermina (8), y mefedrona (9) para A) una muestra blanco (blanco de matriz sin IS), B) una muestra cero (blanco de matriz con IS, que muestra solo señales de analito), C) muestra LLOQ (matriz fortificada con estándares de 5 ng/ml) y D) su IS deuterado.

La Figura 8 muestra los resultados de los niveles de hematocrito del 25 % - 65 % según se evaluó para diversos opioides.

La Figura 9 muestra gráficos de linealidad para morfina (A) y fentanilo (B).

La Figura 10 muestra una comparación de muestreo volumétrico de 20 pl - 50 pl de sangre total para diversos opioides.

La Figura 11 muestra el % RE y el % CV para diversos opioides y para (A) 20 pl, (B) 30 pl y (C) 50 pl de sangre total.

Los expertos en la técnica apreciarán que los elementos de las figuras se ilustran por motivos de simplicidad y claridad, por lo que no se han mostrado todas las conexiones y opciones para evitar oscurecer los aspectos de la invención. Por ejemplo, los elementos comunes, pero bien entendidos que son útiles o necesarios en una modalidad comercialmente factible no se representan a menudo para facilitar una vista menos obstruida de estas diversas modalidades de la presente descripción. Se apreciará además que ciertas acciones y/o etapas pueden describirse o representarse en un orden particular de aparición, mientras que los expertos en la técnica entenderán que dicha especificidad con respecto a la secuencia no es realmente necesaria. También se entenderá que los términos y expresiones usados en la presente descripción deben definirse con respecto a sus respectivas áreas de investigación y estudio correspondientes, excepto cuando de cualquier otra manera se hayan expuesto en la presente descripción significados específicos.

Descripción detallada

La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los dibujos adjuntos, que forman parte de la misma, y que muestran, a modo de ilustración, modalidades ilustrativas específicas mediante las cuales puede ponerse en práctica la invención. Estas ilustraciones y modalidades ilustrativas se presentan con el entendimiento de que la presente descripción es una ejemplificación de los principios de una o más invenciones y no pretende limitar ninguna de las invenciones a las modalidades ilustradas. La invención se define por las reivindicaciones y puede realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las modalidades expuestas en la presente descripción; más bien, estas modalidades se proporcionan para que esta descripción sea minuciosa y completa, y transmita completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica.

Como se describe aquí, las modalidades ilustrativas describen un dispositivo multicapa para la separación de una muestra de fluido, por ejemplo, sangre total, y el análisis de dicha muestra de fluido para determinar los analitos de interés. Esencialmente, el dispositivo multicapa es un dispositivo de mancha de fluido seco para micromuestreo, separación y análisis de muestras de mancha de fluido seco. Una modalidad de un dispositivo multicapa o tarjeta de dispositivo multicapa comprende: (1) una unidad de membrana de filtración con áreas designadas para la recolección de muestras de fluidos; (2) una capa de soporte o cubierta superior que, preferentemente, está marcada para la identificación de la muestra; (3) un material de recolección; y (4) una capa de soporte o cubierta inferior como se ejemplifica en la Figura 2. Se aplica una muestra de fluido al dispositivo multicapa, donde la muestra de fluido puede ser cualquier fluido, preferentemente, un fluido biológico, para analizarlo para determinar la presencia de analitos. La muestra de fluido o fluido puede incluir, pero no se limita a, sangre total, glóbulos rojos, plasma, fracción de proteínas plasmáticas, fluido cefalorraquídeo o cualquier fluido que contenga posiblemente un analito de interés, y similares. Un experto en la técnica podría modificar los componentes del dispositivo multicapa en consecuencia para adaptarse a los diversos fluidos y analitos deseados. Por ejemplo, los tamaños de las membranas de filtración pueden modificarse para capturar o separar los analitos de interés.

Las muestras para tarjetas de mancha seca disponibles en la técnica tienen limitaciones, en particular, inconsistencias en el volumen de la muestra, que pueden afectar negativamente los resultados. En las técnicas de mancha de sangre seca (DBS), los problemas dependientes del hematocrito (Hct) pueden resolverse al emplear un análisis de la mancha total que después conduce a la necesidad de un volumen de aplicación de mancha exacto de la sangre en la tarjeta. Esto puede lograrse fácilmente si personal capacitado realiza la recolección de muestras y la aplicación de manchas mediante el uso de un dispositivo de muestreo exacto, tal como, por ejemplo, una pipeta volumétrica. Las formas alternativas de recolectar volúmenes conocidos de sangre por punción en el dedo incluyen un sistema de muestreo capilar "volumétrico" (DBS System; Gland, Suiza) como se describe en la técnica (Leuthold, L. A. y otros, Anal. Chem. 2015, 87, 2068-2071; R. Verplaetse y J. Henion, Anal. Chem. 2016, 88, 6789-6796). El sistema DBS proporciona un volumen exacto de 5,5 ul de sangre total a partir de una punción en el dedo. Alternativamente, pueden usarse pipetas volumétricas tales como una pipeta EPPENDORF® (Z683787 Aldrich; pipeta EPPENDo Rf® Research®) plus, volumen variable; 0,5 pl -10 pl; SlGMA-ALDRICH® CO) o un capilar de vidrio (P2174 Sigma; tubo microcapilar DRUMMOND MICROCAPS®; volumen 50 pl).

Típicamente, si la recolección de muestras se realizará por personal no capacitado, representará un punto de control crítico para asegurar que se haya recolectado un volumen de muestra preciso. En la aplicación de una tarjeta de dispositivo multicapa descrita aquí, particularmente aquellos dispositivos que tienen un contacto íntimo entre capas, no se requiere necesariamente un volumen de muestreo exacto para obtener una cuantificación exacta y precisa. El dispositivo multicapa descrito aquí puede acomodar un amplio intervalo de volumen de muestra de fluido de hasta aproximadamente 50 microlitros (pl) de, por ejemplo, sangre total e incluso hasta aproximadamente 100 pl, mientras que la mayoría de los dispositivos disponibles comercialmente o usados actualmente solo pueden manejar volúmenes de un solo dígito de sangre en microlitros (por ejemplo, 5 pl).

Una tarjeta tipo libro u otro dispositivo multicapa que permite un contacto íntimo proporciona la característica de un volumen de muestreo flexible. Se observó que la consistencia en el plasma era independiente del nivel de Hct en sangre según lo presentado por Li y otros (Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2015, 991, 46-52). Basado en los estudios en la sección de Ejemplos, el plasma generado a partir de sangre total que tiene niveles de hematocrito (Hct) de aproximadamente 30 % de Hct o 60 % de Hct tiene la misma consistencia de extensión sobre el sustrato de papel y por lo tanto produce gotas homogéneas. Gotas homogéneas no equivalen a una dimensión de la gota igual. Se refiere a la saturación homogénea del plasma dentro de una gota independientemente del tamaño de la gota. El dispositivo multicapa de la invención descrito aquí es capaz de manejar y procesar volúmenes flexibles y un volumen mayor que el de la técnica, sin afectar negativamente los resultados. De hecho, una muestra de sangre total más grande, que proporciona el dispositivo multicapa descrito, puede dar como resultado rendimientos mayores de glóbulos rojos y plasma. Por ejemplo, los volúmenes de muestra de fluido iniciales que se aplican pueden variar y tener un volumen mínimo de aproximadamente 10 microlitros, y pueden variar de aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 100 microlitros, de aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 75 microlitros y de aproximadamente 25 microlitros a aproximadamente 50 microlitros.

A menudo, los rendimientos de plasma son bajos, lo que dificulta la detección de analitos. Un bajo rendimiento de plasma sería inferior a aproximadamente 4 pl, por ejemplo, inferior a aproximadamente 2 pl. Sin embargo, el dispositivo multicapa descrito aquí puede proporcionar un rendimiento de plasma superior a aproximadamente 2 pl, preferentemente, que varía de aproximadamente 4 pl a aproximadamente 38 pl, lo que incluye de aproximadamente 4 pl a aproximadamente 15 pl, en dependencia del volumen de sangre total aplicado inicialmente. Existen varios factores que pueden dictar el rendimiento de plasma, lo que incluye el volumen de sangre total de partida inicial, el material de recolección y la pérdida de plasma debido a extensión o filtración. Comenzar con un gran volumen de sangre total inicial da como resultado la generación de un gran rendimiento de plasma. El rendimiento final de plasma también depende del material de recolección usado para la recolección de plasma: tamaño y tipo de material. Si el material de recolección, preferentemente, un papel de celulosa o acetato de celulosa es más grueso, puede recolectarse un volumen mayor ya que existe más área superficial. En promedio, el plasma por sangre total del dispositivo multicapa como se prueba aquí es aproximadamente 0,303 ± 0,007 pl de plasma por pl de sangre total. El dispositivo multicapa permite más de 0,100 pl de plasma por pl de sangre total. Mientras, la tarjeta NOVIPLEX™ da como resultado 0,100 pl de plasma por pl de sangre total, que es significativamente inferior que la cantidad alcanzada en el dispositivo multicapa descrito. Además, dado que cada muesca puede acomodar grandes volúmenes, es decir, de aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 100 microlitros según sea necesario, los rendimientos de plasma por muestra/muesca son suficientemente grandes para realizar el análisis. Otras tarjetas pueden requerir la combinación de múltiples muestras de fluido para lograr el mismo volumen de muestra de fluido de una sola muestra.

Además, en modalidades en las que la muestra de fluido es sangre total, el dispositivo multicapa es capaz de procesar un intervalo grande y amplio de niveles de hematocrito. El hematocrito (Hct) es la proporción de glóbulos rojos en una muestra de sangre. Por ejemplo, una muestra de sangre de 20 microlitros que tiene un 30 % de Hct tiene aproximadamente 6 microlitros de glóbulos rojos, mientras que un 45 % de Hct tiene aproximadamente 9 microlitros de glóbulos rojos y un 60 % de Hct tiene aproximadamente 12 microlitros de glóbulos rojos, donde el resto es plasma. Las modalidades de la invención que usan una sola o una combinación de dos membranas de filtración, preferentemente, en una modalidad, membranas asimétricas, pueden proporcionar una capacidad para procesar muestras de sangre que tienen un intervalo de hematocrito de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %. Aunque pueden funcionar niveles de hematocrito más bajos o más altos, se vuelven problemáticos con respecto al proceso de filtración por membrana y no serían tan eficientes. Se prefieren muestras de sangre total que tengan un intervalo de hematocrito de aproximadamente o superior a aproximadamente 30 %, aproximadamente o superior a aproximadamente 35 %, aproximadamente o superior a aproximadamente 40 %, aproximadamente o superior a aproximadamente 45 %, aproximadamente o superior a aproximadamente 50 %, aproximadamente o superior a aproximadamente 55 %, aproximadamente o superior a aproximadamente 60 %, aproximadamente o superior a aproximadamente 65 %, aproximadamente o inferior a 70 %, aproximadamente o inferior a aproximadamente 65 %, aproximadamente o inferior a aproximadamente 60 %, aproximadamente o inferior a aproximadamente 55 %, aproximadamente o inferior a aproximadamente 50 %, aproximadamente o inferior a aproximadamente 45 %, aproximadamente o inferior a aproximadamente 40 %, aproximadamente o inferior a aproximadamente 35 %. Sin embargo, también pueden utilizarse muestras de sangre total que tengan niveles de hematocrito de aproximadamente o superior a aproximadamente 20 % y aproximadamente o inferior a aproximadamente 80 %, pero no son tan eficientes.

Una modalidad se dirige a un dispositivo multicapa para su uso en la recolección de una muestra de fluido, por ejemplo, sangre total, para analizar analitos de interés, tales como, pero no limitados a, compuestos químicos, fármacos, metabolitos de fármacos, hormonas, virus, ácidos nucleicos, ADN, ARN, ARNm, miARN, proteínas, marcadores intracelulares y de superficie celular, y similares, o cualquier analito que sea detectable por cualquier método conocido o cualquiera de los medios descritos aquí, lo que incluye, por ejemplo, espectroscopía o cromatografía. Los ejemplos no limitantes de analitos pueden incluir más específicamente opioides, cannabinoides, estimulantes, potenciadores del rendimiento, morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, anfetamina, metanfetamina, mefedrona, fentermina, 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA), fentanilo, combinaciones y similares. Particularmente en una competencia deportiva que requiere análisis de fármacos para confirmar que un atleta no toma ningún potenciador del rendimiento, los métodos y dispositivos multicapa descritos aquí pueden usarse para recolectar y separar muestras de fluidos para analizar cualquier analito de interés, lo que incluye, pero no se limita, sustancias extrañas y biomarcadores endógenos.

Otro aspecto de un dispositivo multicapa es su capacidad para recolectar y analizar diversos componentes de una única muestra de fluido. Pueden encontrarse diversos analitos en múltiples ubicaciones de una única muestra de fluido, particularmente si la muestra de fluido puede separarse en sus múltiples componentes. A diferencia de los dispositivos de la técnica, el nuevo dispositivo multicapa descrito aquí puede procesar ventajosamente una única muestra de fluido, separar componentes de la única muestra de fluido y analizar individualmente los componentes separados de la única muestra de fluido. Esta doble funcionalidad es particularmente beneficiosa para acelerar el análisis de un gran número de analitos y maximizar el uso de una única muestra de fluido. Una ventaja adicional del dispositivo multicapa es que cualquier volumen de muestra de fluido, por ejemplo, sangre total, puede aplicarse al dispositivo multicapa y aun obtener resultados cuantitativos, ya que una unidad de membrana de filtración comprende al menos un tamaño predeterminado que permite un volumen predefinido. En combinación con la tecnología de elución por flujo continuo, puede lograrse un análisis cuantitativo del plasma recolectado en un material de recolección. Alternativamente, si no se usa la tecnología de elución por flujo continuo, la mancha de plasma puede troquelarse del material de recolección y analizarse con el mismo tamaño de mancha usado al crear una curva de calibración. Por lo tanto, la exactitud de un volumen de muestra aplicado no es un requisito como se mantiene generalmente en las tecnologías actuales.

Otra modalidad se dirige a un dispositivo multicapa que tiene capacidades de función dual donde la aplicación de, por ejemplo, una muestra de sangre total de un solo sujeto da como resultado una capa que contiene componentes celulares recolectados o retenidos, tales como, pero no limitados a, glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y otras células, y una capa que contiene plasma recolectado o retenido. Los componentes celulares pueden analizarse por separado de los componentes del plasma en una muestra, donde cada capa puede contener diferentes analitos que se encuentran en diferentes componentes de la sangre total. Por ejemplo, las proteínas de la superficie celular y otros constituyentes en los glóbulos rojos, así como también las proteínas intracelulares y los constituyentes y fármacos contenidos en los glóbulos rojos, pueden analizarse por separado de los constituyentes del plasma. La capacidad de función dual del dispositivo multicapa de la invención es ventajosa por su eficiencia: muestreo y tiempo. Dado que el dispositivo multicapa puede acomodar múltiples muestras y posteriormente separar las múltiples muestras en su componente celular y su componente de plasma, pueden realizarse múltiples pruebas analíticas simultáneamente.

Una ventaja de un dispositivo multicapa que tiene capacidades de función dual es que facilita la determinación de un coeficiente de partición de glóbulos rojos con respecto a plasma de un fármaco o analito de interés. Otra ventaja es el análisis de múltiples clases de fármacos o analitos realizado simultáneamente. Las muestras de fluido a partir de un solo sujeto o de múltiples sujetos pueden procesarse y analizarse simultáneamente para determinar múltiples analitos, es decir, cada muestra de sujeto colocada o recolectada en cada muesca, pocillo o agujero abierto de un dispositivo multicapa. Por ejemplo, pueden analizarse 4 opioides y 5 estimulantes simultáneamente en un solo proceso que contiene una muestra de fluido de un solo sujeto. Las múltiples capas del dispositivo multicapa de la invención permiten la separación de, por ejemplo, componentes sanguíneos, lo que incluye glóbulos rojos, plasma, plaquetas y similares, así como también el procesamiento de un amplio intervalo de niveles de hematocrito de una muestra de sangre total sin hemólisis.

El dispositivo multicapa descrito aquí puede, en otra modalidad, tener el formato de un libro, que está articulado en un lado y las diversas capas componen las páginas de un libro. Alternativamente, el dispositivo multicapa puede acoplarse o unirse en más de un lado o borde, tal como, por ejemplo, en todos los lados o bordes de un dispositivo multicapa, y cualquiera o todas las capas pueden desprenderse o retirarse. El dispositivo multicapa de la invención puede tener cualquier forma, lo que incluye, pero no se limita a, un círculo, un óvalo, un triángulo, un cuadrado, un rectángulo, un paralelogramo, un diamante, un pentágono, un hexágono, un heptágono, un octágono, y similares. Las muescas u orificios del dispositivo multicapa pueden tener cualquier forma, lo que incluye, pero no se limita a, un círculo, un óvalo, un triángulo, un cuadrado, un rectángulo, un paralelogramo, un diamante, un pentágono, un hexágono, un heptágono, un octágono y similares siempre que las muescas u orificios de la cubierta superior y la membrana hidrófoba, si se utiliza, sean los mismos. Una forma preferida del dispositivo multicapa es rectangular que tiene cuatro bordes, donde el borde largo forma al menos un borde o lado en el que las capas del dispositivo multicapa pueden articularse, acoplarse o unirse. Las dimensiones del dispositivo multicapa en forma de rectángulo pueden ser de aproximadamente 2,5 cm (1 pulgada) a aproximadamente 10 cm (4 pulgadas), preferentemente, de aproximadamente 5 cm (2 pulgadas) por aproximadamente 7,5 cm (3 pulgadas), por ejemplo, de aproximadamente 5 cm (2 pulgadas) por 8,3 cm (3,3 pulgadas). Sin embargo, también se contemplan otras formas y tamaños.

La invención proporciona un dispositivo multicapa, que comprende:

a) una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior con al menos una muesca, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba con al menos una muesca; y

b) una unidad inferior que comprende capas de: un material de recolección y una cubierta inferior sin muescas,

donde dicha unidad superior es adyacente y está conectada a dicha unidad inferior, dicha unidad de membrana de filtración comprende al menos dos membranas de filtración de tamaños de poro decrecientes, cada una con una forma de dicha muesca, dicha unidad de membrana de filtración está ubicada dentro de dicha muesca de dicha cubierta superior y adyacente a dicha membrana hidrófoba, dicha membrana hidrófoba es adyacente o está intercalada entre dicha unidad de membrana de filtración y dicho material de recolección, dicho material de recolección es adyacente a dicha membrana hidrófoba, y dicho material de recolección está encima de dicha cubierta inferior. La unidad de membrana de filtración está intercalada entre la cubierta superior y la membrana hidrófoba. El material de recolección, en otro aspecto, puede estar intercalado entre dicha membrana hidrófoba y dicha cubierta inferior. El dispositivo multicapa puede tener la forma de un rectángulo que tiene cuatro bordes, donde cada una de las capas de la unidad superior o la unidad inferior está temporalmente acoplada en al menos un borde, y cada una de las capas de la unidad superior o la unidad inferior es desprendible o retirable. En una modalidad, la unidad de membrana de filtración puede tener el tamaño y la forma de las muescas, encajar dentro de cada una de las muescas o pocillos de la cubierta superior, de manera que cada capa de la unidad de membrana de filtración se mantiene en su lugar mediante el contacto íntimo de los bordes de la unidad de membrana de filtración y las paredes de la muesca de la cubierta superior y el intercalado de todas las capas en el dispositivo multicapa. Una modalidad preferida se dirige a estas membranas de filtración que son circulares para encajar dentro de las muescas circulares de la cubierta superior, donde estas membranas de filtración circulares o discos pueden retirarse fácilmente para análisis adicionales después de la recolección y separación de las muestras. Por ejemplo, después de aplicar sangre total a las muescas del dispositivo multicapa, se deja tiempo suficiente para que la sangre total se filtre a través de la unidad de membrana de filtración y se recolecte en el material de recolección. Los glóbulos rojos permanecen en las membranas o discos de filtración en una modalidad, mientras que el plasma se recolecta en el material de recolección.

Un formato alternativo de un dispositivo multicapa incluye además una capa de soporte de contacto adyacente y debajo de dicho material de recolección y adyacente o encima de dicha cubierta inferior, o en otra modalidad, la capa de soporte de contacto se combina con la cubierta inferior, de manera que los soportes de contacto son parte de la cubierta inferior, y donde los soportes de contacto de la capa de soporte de contacto contienen, preferentemente, soportes elevados donde al menos una porción de dichos soportes elevados encaja dentro de la muesca donde se coloca una muestra de fluido. Una modalidad adicional comprende dicho dispositivo multicapa que también puede incluir al menos un soporte de ventana para una capa desprendida para análisis posteriores, preferentemente, para una unidad de membrana de filtración y/o un material de recolección. El soporte de ventana puede ser una capa que contiene una ventana que expone la muestra recolectada o capturada para detectar un analito de interés, dicha capa para análisis posteriores está unida o acoplada a dicho soporte de ventana, y dicho soporte de ventana acoplado a dicha capa para análisis posteriores puede retirarse o desprenderse de dicho dispositivo multicapa para análisis biológicos posteriores. Una modalidad comprende el análisis posterior de la unidad de membrana de filtración, donde cada membrana de filtración, o porciones de la misma, puede transferirse para análisis de detección de analitos por separado mediante, por ejemplo, inmunoensayo enzimático (EIA). Otra modalidad comprende el análisis posterior del material de recolección, donde, por ejemplo, el plasma a partir de una muestra de sangre total se analiza mediante cromatografía líquida y/o espectrometría de masas, por ejemplo, cromatografía líquida de extracción en fase sólida espectrometría de masas en tándem (SPE-LC-MS/MS).

Una modalidad dirigida a un dispositivo multicapa comprende una unidad superior y una unidad inferior, donde la unidad superior y la unidad inferior son adyacentes. La unidad superior comprende una cubierta superior, donde la cubierta puede estar compuesta de una construcción rígida y duradera, tal como, por ejemplo, cartulina, una unidad de membrana de filtración adyacente que inicialmente entra en contacto con una muestra de fluido de sangre total a través de una muesca u orificio abierto de la cubierta superior. Una modalidad comprende una unidad de membrana de filtración de al menos dos membranas de filtración adyacentes. Adyacente y por debajo de la unidad de membrana de filtración hay una membrana hidrófoba. La unidad inferior del dispositivo multicapa comprende un material de recolección adyacente a una cubierta inferior. En una modalidad, el dispositivo multicapa puede tener un formato que permita que una unidad superior esté en contacto constante o temporal con la unidad inferior subyacente. La cubierta superior puede tener al menos una muesca o un orificio abierto en el que colocar una muestra, mientras que la cubierta inferior no tiene muescas. Se prefieren múltiples muescas para analizar una muestra de fluido de una sola fuente, por ejemplo, sangre total de un sujeto, y también para incluir controles estándar para análisis simultáneos.

Muestra de fluido/Membrana de filtración

Una modalidad puede dirigirse a una muestra de fluido que se aplica a una unidad de membrana de filtración, donde la unidad de membrana de filtración está expuesta a través de una muesca, pocillo u orificio de una cubierta superior de un dispositivo multicapa. La unidad de membrana de filtración comprende al menos dos membranas de filtración, preferentemente, ubicadas adyacentes entre sí y dentro de los límites de la muesca de la cubierta superior. Si la forma de una muesca u orificio es circular, una unidad de membrana de filtración preferida comprende al menos un disco de membrana de filtración circular. Las membranas de filtración pueden ser asimétricas, no asimétricas, una combinación de asimétricas y no asimétricas, o combinaciones similares de cada una, es decir, una o más de una membrana de filtración asimétrica o una o más de una membrana de filtración no asimétrica. La unidad de membrana de filtración se selecciona y constituye de manera que filtre y capture suficientemente los componentes de una muestra de fluido. Preferentemente, por ejemplo, un dispositivo multicapa descrito aquí comprende una unidad de membrana de filtración que separa componentes de una muestra de sangre total, donde la unidad de membrana de filtración captura glóbulos rojos y permite que el plasma fluya o pase a través de la unidad de membrana de filtración. Las al menos dos membranas de filtración se apilan de manera que existe una membrana de filtración de arriba y una membrana de filtración de abajo, y ambas membranas de filtración tienen la misma forma que la muesca o los orificios de la cubierta superior y la membrana hidrófoba.

La unidad de membrana de filtración comprende al menos dos membranas de filtración, que filtran partículas que son de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 10 micrómetros, de aproximadamente 2 micrómetros a aproximadamente 5 micrómetros. Una membrana de filtración tiene una primera superficie o superior y una segunda superficie o inferior y un grosor suficiente para permitir la filtración y/o captura de partículas deseadas, tal como, por ejemplo, glóbulos rojos a partir de una muestra de sangre total, y permitir que otras partículas o fluidos se filtren a través de ella, por ejemplo, plasma. La membrana de filtración puede tener un grosor que varía de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 0,6 mm, aproximadamente o superior a aproximadamente 0,15 mm, aproximadamente o superior o inferior a aproximadamente 0,2 mm, aproximadamente o superior o inferior a aproximadamente 0,26 mm, aproximadamente o superior o inferior a aproximadamente 0,3 mm o menos. Sin embargo, si el grosor excede estos valores, es probable que se produzca un bloqueo u obstrucción de la membrana de filtración, lo que inhibe por lo tanto la filtración. La unidad de membrana de filtración comprende dos membranas de filtración adyacentes. Cuando se utilizan dos membranas de filtración adyacentes, una superficie inferior de una primera membrana de filtración es adyacente a una superficie superior de una segunda membrana de filtración, donde una muestra ingresa a la superficie superior de una primera membrana de filtración y sale a través de una superficie inferior de la primera membrana de filtración y entra en una superficie superior de una segunda membrana de filtración y sale de una superficie inferior de la segunda membrana de filtración.

Una membrana de filtración puede ser hidrófoba para evitar la absorción de cualquier plasma, pero también puede ser hidrófila en otras circunstancias y anisótropa, y funciona para filtrar y recolectar los componentes deseados de una muestra de fluido. Por ejemplo, los componentes deseados de una muestra de sangre total pueden incluir, pero no se limitan a, glóbulos rojos y plasma. La membrana de filtración puede comprender cualquier material suficiente para filtrar y separar partículas de interés. En una modalidad, la membrana de filtración, que permite la filtración de componentes de la sangre total, puede estar compuesta de, pero sin limitarse a, polímeros polares, no polares y de polaridad intermedia, poliéster, polisulfonas, policarbonato, polimetacrilato o similares, o mezclas o combinaciones de los mismos.

La membrana de filtración funciona para filtrar y separar componentes de una muestra de fluido. Cuando el fluido es sangre total, la muestra puede separarse en componentes individuales, es decir, glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y plasma, y recolectar, por ejemplo, glóbulos rojos para análisis posteriores, a la vez que permite que otros componentes, tales como plasma, se filtren a través de la membrana. Se conoce en la técnica que los glóbulos rojos tienen un tamaño más grande que el plasma o las plaquetas, donde los glóbulos rojos pueden ser de aproximadamente 6 micrómetros (pm), aproximadamente 8 pm, y los glóbulos blancos son más grandes que los glóbulos rojos, es decir, aproximadamente 12 pm - aproximadamente 15 pm. Pueden seleccionarse tamaños de poro de membrana de filtración apropiados en dependencia de la partícula deseada. Una membrana de filtración más cercana o adyacente a una membrana hidrófoba puede tener características suficientes para recolectar o capturar componentes de sangre total, por ejemplo, glóbulos rojos. Una ventaja del dispositivo multicapa sujeto es su novedosa capacidad para separar, recolectar y analizar más de un componente sanguíneo de una sola muestra sujeto o múltiples muestras sujeto de sangre total para análisis separados, donde el dispositivo acomoda un gran volumen de un amplio intervalo de porcentaje de hematocrito de muestra de sangre total.

Otra modalidad se dirige a membranas de filtración que son asimétricas, lo que permite filtrar la muestra de sangre total, y separar componentes de diferentes tamaños dentro de la unidad de membrana de filtración. Por ejemplo, la unidad de membrana de filtración y sus membranas de filtración permite separar y capturar glóbulos rojos a partir de una muestra de sangre total y permitir que el plasma fluya a través de la unidad de membrana de filtración y dé como resultado plasma libre de células. En una modalidad de un dispositivo multicapa, puede usarse una membrana de filtración asimétrica. La membrana de filtración asimétrica tiene una superficie superior que permite que las partículas de gran tamaño y más pequeñas entren en la membrana, mientras que la superficie inferior de la misma membrana de filtración tiene un tamaño de poro más pequeño, lo que elimina de esta manera cualesquiera partículas más pequeñas que el tamaño de poro de la superficie superior y mayores que el tamaño de poro en la superficie inferior de la membrana de filtración al filtrar o pasar a través, es decir, capturar algunas partículas o permitir que pasen partículas más pequeñas que el tamaño de poro en la superficie inferior de la membrana de filtración. Otra modalidad puede dirigirse a una unidad de membrana de filtración que comprende al menos una membrana de filtración asimétrica o al menos dos membranas de filtración asimétricas, donde la membrana de filtración asimétrica puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 5 micrómetros en la superficie superior y un tamaño de poro en la superficie inferior de aproximadamente 2,5 micrómetros, lo que recolecta de esta manera partículas que son más pequeñas de aproximadamente 5 micrómetros y mayores de aproximadamente 2,5 micrómetros en una membrana de filtración y gradualmente permitir o filtrar partículas que son más pequeñas de aproximadamente 2,5 micrómetros. Otra modalidad se dirige a la filtración secuencial mediante el uso de dos membranas de filtración en una unidad de membrana de filtración. Una porción de los glóbulos rojos y cualquier partícula que sea mayor de 5 micrómetros puede capturarse en una primera membrana de filtración o superior y después los glóbulos rojos restantes y cualquier partícula que sea mayor de 2,5 micrómetros y menor de 5 micrómetros puede capturarse en una segunda membrana de filtración o inferior.

El rendimiento óptimo de una membrana de filtración de abajo puede producirse con un tamaño de poro de aproximadamente un (1) micrómetro. Los tamaños de los poros de las membranas de filtración pueden variar de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 10 micrómetros en un dispositivo multicapa de la invención. En un ejemplo, una membrana de filtración superior o de arriba puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 10 micrómetros, lo que proporciona de esta manera una filtración preliminar de partículas más grandes y mitiga la obstrucción de la membrana de filtración de abajo, que puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 1 micrómetro.

Una membrana de filtración bicapa que comprende dos membranas de filtración de un dispositivo multicapa puede procesar una amplia variedad de muestras de fluidos. Cuando se usan dos membranas de filtración en una unidad de membrana de filtración, una primera membrana de filtración adyacente a una cubierta superior y una segunda membrana de filtración, donde la primera membrana de filtración más alta puede tener un tamaño de poro que varía de aproximadamente 35 micrómetros a aproximadamente 3 micrómetros, aproximadamente 5 micrómetros, mientras que la segunda membrana de filtración de abajo adyacente o intercalada por una primera membrana de filtración y una membrana hidrófoba puede tener un tamaño de poro que es generalmente más pequeño que el de la primera membrana de filtración. Un intervalo de tamaño de poro preferido para la segunda membrana de filtración puede ser de 3 micrómetros a aproximadamente 0,2 micrómetros, aproximadamente 2,5 micrómetros. En una modalidad de dos membranas de filtración o una membrana de filtración bicapa, la membrana de filtración puede ser cada una asimétrica o no asimétrica o, alternativamente, una membrana de filtración es asimétrica y la otra no asimétrica.

Una modalidad comprende un dispositivo multicapa compuesto por una unidad de membrana de filtración que es una membrana asimétrica. Otra modalidad se dirige a un dispositivo multicapa que tiene una unidad superior, donde la unidad de membrana de filtración se compone de dos membranas de filtración. En una modalidad, la capa de la membrana de filtración superior o más alta es un producto disponible comercialmente de membrana iPOCDX ™ X asimétrica de 5 mm que tiene una parte superior de 35 pm y una parte inferior de 5 pm (International Point of Care Inc.; Toronto, Canadá), o una membrana de filtración con propiedades similares o propiedades suficientes para filtrar los componentes deseados. Otra modalidad más se dirige a una membrana de filtración inferior o más baja que es un producto disponible comercialmente de membrana iPOCDX ™ S/G asimétrica de 7 mm que tiene una parte superior de 35 pm y una parte inferior de 2,5 pm (International Point of Care Inc.; Toronto, Canadá), o una membrana de filtración con propiedades similares o propiedades suficientes para filtrar los componentes deseados.

Capa de membrana hidrófoba

Adyacente o por debajo de una unidad de membrana de filtración o intercalada entre una unidad de membrana de filtración y una capa de material de recolección, hay una capa de membrana hidrófoba, que ayuda con el contacto completo y directo de una muestra con las diversas capas de membrana y el logro de la uniformidad de la mancha de muestra. Aunque el dispositivo multicapa puede tener éxito en la separación y recolección de diversos componentes de la sangre total sin esta membrana hidrófoba, particularmente en aquellos dispositivos multicapa que tienen una junta íntima o conexión entre las capas, su inclusión da como resultado resultados superiores. Alternativamente, la membrana hidrófoba puede ubicarse encima y adyacente al material de recolección. Por ejemplo, sin la membrana hidrofóbica en dispositivos multicapa que utilizan una cubierta tipo papel o cartón que puede carecer de un cierre hermético o íntimo, en lugar de una mancha circular, la filtración puede dar como resultado una mancha en forma de herradura en un material de recolección, que no es ideal para los análisis espectroscópicos automatizados posteriores preferidos. La membrana hidrófoba puede ser una capa del mismo tamaño, forma y dimensiones que el dispositivo multicapa completo, y contiene muescas u orificios del mismo tamaño, forma y dimensiones que las muescas de la cubierta superior. La membrana hidrófoba puede estar compuesta de cualquier material que sea hidrófobo, preferentemente, poliéster, mezclas de poliéster, polisulfona o policarbonato y similares. La capa de membrana hidrófoba puede ser cualquier material o membrana que sea suficiente para ayudar en la colocación y contención de las capas individuales para evitar el movimiento o desplazamiento, así como también, para ayudar en la uniformidad de la mancha de muestra. En una modalidad, la membrana hidrófoba por debajo y adyacente a la unidad de membrana de filtración que filtra un componente de la sangre total, tal como, por ejemplo, glóbulos rojos, puede estar compuesta, preferentemente, de un poliéster o una mezcla de poliéster, con mayor preferencia, poliéster no tejido Ahlstrom HOLLYTEX® de grado 3256 (Ahlstrom Filtration; MountHolly Springs, PA) que tiene un grosor de aproximadamente 0,058 milímetros y un peso base de aproximadamente 23,9 g/m.

Capa de material de recolección

Otra capa de un dispositivo multicapa útil que se ubica por debajo de una capa de membrana hidrófoba es una capa de material de recolección que actúa como recipiente para recolectar los componentes deseados filtrados a partir de un pequeño volumen de muestra de fluido aplicado inicialmente. Después de secar la muestra recolectada, una mancha seca formada en el material de recolección permite un medio de almacenamiento conveniente para futuros análisis cuantitativos. Otros componentes de la sangre total se separan del plasma en las capas anteriores o por encima del material de recolección. El material de recolección funciona para absorber y/o recolectar el plasma recuperado a partir de la filtración de una muestra de sangre total. El material de recolección tiene características que permiten la captura y recolección de plasma, tal como, por ejemplo, un tamaño de poro, preferentemente, en un intervalo de aproximadamente 35 micrómetros a aproximadamente 0,2 micrómetros y un grosor de aproximadamente 0,1 milímetros a aproximadamente 0,6 milímetros, preferentemente, aproximadamente 0,19 mm. El tamaño de los poros puede ser un factor que exprese el grado de absortividad. En una modalidad preferida, el material de recolección puede estar compuesto de celulosa, papel de celulosa hecho de pulpa de fibrillas de algodón, y también puede ser un material de, pero no limitado a, acetato de celulosa, o el material usado en WHATMAN 903 (WHATMAN®, Springfield Mili, Reino Unido), AHLSTROM® 226 (AHLSTROM® Corporation, Helsinki, Finlandia), etc. Un material de recolección preferido para su uso en un dispositivo multicapa es el papel de celulosa AHLSTROM® 601 (Ahlstrom Filtration; Mount Holly Springs, PA); sin embargo, también puede usarse cualquier material capaz de separar y recolectar, por ejemplo, plasma a partir de una muestra de sangre total o que tenga propiedades similares a las del papel de celulosa. Se prefiere el papel de celulosa como material de recolección por su capacidad para concentrar las manchas dentro del área de la muesca, lo que contribuye a evitar productos químicos no deseados en una muestra recolectada (por ejemplo, el Center for Disease Control and Prevention (CDC) analiza y confirma la pureza de dichos papeles de celulosa usados para tarjetas de mancha seca), y sus propiedades estabilizadoras de fármacos o analitos de interés encontrados en una muestra recolectada. Las capas de material de recolección que diluyen las manchas de muestra son frágiles, y tienen propiedades de estabilización desconocidas, no son ideales ni útiles para la invención. En una fase seca de una muestra, se minimiza la descomposición enzimática de fármacos y otras sustancias químicas. Sin embargo, el fármaco u otros analitos químicos aún pueden descomponerse debido a la oxidación. En algunos casos, las entidades químicas, tales como, por ejemplo, los cannabinoides, son inestables cuando se exponen al aire y la humedad, por lo que existe una necesidad en la técnica de la recolección de muestras de sangre total y análisis para garantizar la estabilidad. Típicamente, puede usarse una atmósfera inerte (es decir, eliminación del oxígeno) o el uso de un agente de secado de gel de sílice. Para los propósitos del dispositivo multicapa descrito y usos del mismo, no es necesaria una atmósfera inerte, tal como, pero no limitada a, nitrógeno o gas argón mantenido en un recipiente a prueba de fugas, durante la recolección de la muestra, pero puede usarse. La estabilidad de los analitos en el dispositivo multicapa es suficiente durante la recolección de muestras en ausencia de una atmósfera inerte. La presencia de un agente de secado o una atmósfera inerte puede ser beneficiosa durante el transporte de la muestra después de que la muestra se ha secado y almacenado, lo que incluye el almacenamiento a largo plazo de meses o años. Un agente de secado empaquetado con el dispositivo multicapa que contiene una muestra no afecta los resultados del análisis para determinar analitos de interés. Sin embargo, para el mantenimiento o almacenamiento a largo plazo, puede usarse un dispositivo de almacenamiento adicional que se llena con un gas inerte, por ejemplo, gas nitrógeno, para almacenar los dispositivos multicapa, en particular la unidad de membrana de filtración y la capa de material de recolección, lo que proporciona de esta manera la estabilidad química de los analitos en las muestras de manchas secas. Si bien los analitos específicos pueden requerir una atmósfera inerte o un agente de secado durante la recolección y/o almacenamiento de muestras, generalmente no son necesarios y se prefieren especialmente en la mayoría de los entornos de campo cuando se recolectan muestras.

Capa de soporte

Otras capas de un dispositivo multicapa descritas aquí pueden incluir aquellas que soportan el dispositivo multicapa. Las cubiertas o cubiertas de soporte de dicho dispositivo multicapa que intercalan la unidad superior y la unidad inferior pueden hacerse de una construcción rígida y duradera, tal como, pero no limitado a, por ejemplo, cartulina, polímeros, plásticos, nailon, poliamidas, acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), ácido poliláctico (PLA), alcohol polivinílico (PVA) y similares. Específicamente, ciertas capas de un dispositivo multicapa impreso en 3D pueden fabricarse mediante el uso de polímeros, plásticos, nailon, poliamidas, acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), ácido poliláctico (PLA), alcohol polivinílico (PVA) y similares. La cubierta de soporte puede estar compuesta de una cubierta de arriba o superior y una cubierta de abajo o inferior, donde la cubierta de arriba es la capa superior que está adyacente o por encima de una capa de membrana de filtración, y donde la cubierta inferior es la capa más baja que está por debajo de una capa de material de recolección o en algunas modalidades, una capa de soporte de contacto. La cubierta superior tiene al menos una muesca, de manera que está expuesta una unidad de membrana de filtración. Otra modalidad se dirige a un dispositivo multicapa que comprende una cubierta superior que contiene al menos dos muescas que exponen una unidad de membrana de filtración. Una modalidad preferida se dirige a una cubierta superior con cuatro muescas que exponen una unidad de membrana de filtración. Sin embargo, el número de muescas puede determinarse por el tamaño y las dimensiones del dispositivo multicapa y el número de muescas que pueden acomodarse en la cubierta superior. La cubierta superior tiene al menos una muesca y puede tener al menos dos muescas, al menos tres muescas, y preferentemente, al menos cuatro muescas. Por el contrario, la cubierta inferior no contiene muescas. Más bien, la cubierta inferior es una construcción sólida para proporcionar soporte a todas las capas anteriores encima de la cubierta inferior.

La cubierta superior tiene muescas de manera que la capa de la unidad de membrana de filtración está expuesta directamente. Una muestra de fluido cuando se aplica a una unidad de membrana de filtración de un dispositivo multicapa forma una mancha que está en o dentro del perímetro de la muesca de la cubierta superior. La unidad de membrana de filtración es una capa que tiene dimensiones que son iguales o aproximadamente del mismo tamaño que la muesca, puede extenderse más allá del perímetro de la muesca de la cubierta superior o es igual al perímetro de toda la capa de soporte de la cubierta y el dispositivo multicapa en su conjunto. Por ejemplo, un dispositivo multicapa puede tener una cubierta superior con muescas circulares que tienen cada una un diámetro de, por ejemplo, aproximadamente 5 mm y una unidad de membrana de filtración en una forma circular similar, por ejemplo, un disco, con un diámetro que es el mismo que el de la cubierta superior, es decir, aproximadamente 5 mm, de manera que la unidad de membrana de filtración se ajuste dentro del perímetro y área de la muesca de la cubierta superior. Alternativamente, la unidad de membrana de filtración es una capa que tiene dimensiones que se extienden más allá del perímetro de la muesca de la cubierta superior y hasta los bordes perimetrales de la cubierta. Otra modalidad se dirige a una unidad de membrana de filtración que comprende al menos una capa de membrana de filtración que tiene la forma de un disco redondo, es decir, la forma de una muesca que encaja dentro de la muesca de la cubierta superior. Si el dispositivo multicapa tiene la forma de un rectángulo con dimensiones de aproximadamente 5,08 cm (2 pulgadas) por aproximadamente 7,62 cm (3 pulgadas), una capa de unidad de membrana de filtración, en otra modalidad, puede tener la misma forma y dimensiones, donde la muesca de la cubierta superior expone una porción de la unidad de membrana de filtración. En una modalidad, puede delinearse un contorno de la muesca en una o más capas del dispositivo multicapa, tal como, por ejemplo, cualquiera o todas las capas de la unidad de membrana de filtración, la membrana hidrófoba y el material de recolección.

Las cubiertas y las capas intermedias se acoplan, preferentemente, en un lado similar al lomo de un libro, donde cada capa intermedia es desmontable. Alternativamente, todos los bordes de las cubiertas están acoplados, o acoplados temporalmente, en una formación de posición cerrada. Por ejemplo, cualquiera o todos los bordes pueden perforarse para permitir la separación y extracción de cualquiera de las capas. Cuando todas las capas del dispositivo multicapa están acopladas y la unidad superior y la unidad inferior están cerradas y en contacto, puede usarse una tarjeta estable tipo libro para la recolección de muestras.

Una modalidad del dispositivo multicapa se dirige a una tarjeta tipo libro de forma rectangular para procesar una muestra de fluido de sangre total, separar componentes sanguíneos y detectar analitos. Las capas del producto comprenden una cubierta superior y una cubierta inferior que intercala las capas intermedias, donde la cubierta superior tiene cuatro muescas, pocillos u orificios abiertos, y las cubiertas de soporte superior e inferior están conectadas o articuladas en al menos un lado o borde del dispositivo multicapa. Por debajo y adyacente a la cubierta superior hay una unidad de membrana de filtración que comprende una primera membrana de filtración y una segunda membrana de filtración. Dondequiera que haya muescas en la cubierta superior, está expuesta una primera membrana de filtración de una unidad de membrana de filtración. De lo contrario, la cubierta superior cubre la primera membrana de filtración y las capas subyacentes. Otra membrana de filtración o segunda membrana de filtración se encuentra adyacente a y por debajo de la primera o la membrana de filtración más alta, de manera que una muestra de fluido fluye desde la superficie superior de la primera o la membrana de filtración más alta hacia abajo y a través de la superficie inferior de una segunda membrana de filtración de la unidad de membrana de filtración. Por debajo y adyacente a la unidad de membrana de filtración hay una capa de membrana hidrófoba que también tiene las mismas dimensiones que las cubiertas de soporte. La unidad de membrana de filtración y la membrana hidrófoba subyacente pueden acoplarse temporalmente juntas a la cubierta superior y formar una unidad superior. Dicha formación permite que todas las capas subyacentes de la unidad de membrana de filtración y la membrana hidrófoba se levanten juntas simultáneamente cuando se levanta la cubierta superior. Cualquiera o todas las capas pueden retirarse del dispositivo multicapa tipo libro para análisis posteriores. Por ejemplo, la unidad de membrana de filtración y las capas de material de recolección pueden unirse o perforarse temporalmente en al menos un borde o lado y retirarse o arrancarse en la perforación, lo que separa de esta manera las capas para análisis posteriores.

Adyacente y por debajo de la capa de membrana hidrófoba en la tarjeta de dispositivo multicapa tipo libro hay una capa de material de recolección que puede carecer o, preferentemente, tiene un contorno que representa la muesca circular de la cubierta superior de manera que el usuario pueda observar donde se colocó inicialmente una muestra y contiene plasma recuperado a partir de una muestra de sangre total.

Otra modalidad puede incluir una capa de soporte de ventana para análisis automatizados, preferentemente, una capa de soporte de ventana accesible en línea, que se acopla al material de recolección, de manera que la capa de soporte de ventana tiene una abertura o ventana que expone el material de recolección, particularmente las muescas circulares delimitadas donde el plasma separado a partir de la muestra de fluido de sangre total ha formado una mancha. El material de recolección puede tener dimensiones menores que las cubiertas o las mismas dimensiones que las cubiertas. El soporte de ventana puede tener una marca identificable, tal como, pero no limitado a, un código de barras que incluye un código QR o código de respuesta rápida que contiene un número de muestra, un paciente de muestra o un identificador o nombre del sujeto, o cualquier otra información para identificar la muestra, así como también cualquier otra información, lo que incluye, pero no se limita a, seguimiento del tiempo, gestión de documentos, URL (localizador uniforme de recursos), GPS (sistema de posicionamiento global), etc.

La capa de soporte de ventana, preferentemente, la capa de soporte de ventana accesible en línea, con una abertura o ventana puede, en una modalidad, estar ubicada por debajo o adyacente a la capa de membrana hidrófoba. Un material de recolección puede tener un borde que se fija o acopla a la parte inferior de la capa de ventana accesible en línea de manera que los círculos delineados donde las manchas de muestra filtrada del material de recolección están expuestos a través de la abertura de la ventana de la capa de soporte de ventana accesible en línea. Puede lograrse una región de superficie sin fugas al fijar un perímetro del material de recolección a la parte inferior de la capa de ventana donde el perímetro del material de recolección hace un contacto físico íntimo y sin fugas que se extiende más allá de la abertura de la ventana. La capa de ventana accesible en línea acoplada al material de recolección puede retirarse juntos del dispositivo multicapa mediante al menos un borde perforado, que también forma el lomo del dispositivo multicapa tipo libro. La capa de ventana accesible en línea con material de recolección puede retirarse del dispositivo multicapa por desgarre en la perforación sin afectar el contenido del material de recolección. Alternativamente, la capa de ventana accesible en línea comprende dos capas que intercalan el material de colección, donde las muescas circulares delineadas del material de recolección están expuestas a través de una ventana en cada una de las dos capas de la capa de ventana accesible en línea. La capa de ventana accesible en línea colectiva bicapa que intercala el material de recolección puede retirarse o desprenderse del dispositivo multicapa para análisis posteriores, particularmente de analitos de interés.

Otra capa de soporte que puede usarse en un dispositivo multicapa es una capa de soporte de contacto que contiene el mismo número de muescas que se encuentran en toda la construcción del dispositivo multicapa. Esta capa de soporte de contacto se eleva para ayudar a que una muestra de fluido haga contacto con todas las capas del dispositivo multicapa. Incluso sin esta capa de soporte, puede lograrse la filtración y separación de los componentes de la sangre total. Sin embargo, la inclusión de esta capa de soporte elevado asegura un contacto físico de la membrana de filtración, la membrana hidrófoba y las capas de material de recolección, lo que contribuye de esta manera a la formación superior de una mancha de muestra uniforme y al rendimiento recolectado. Cuando la unidad superior y la unidad inferior de un dispositivo multicapa están en contacto en una formación cerrada, la capa de soporte de contacto elevada ayudó con la filtración completa a través del contacto físico de las capas. En otra modalidad, una capa de soporte de contacto que asegura un contacto físico entre la unidad de membrana de filtración y el material de recolección puede estar adyacente o por debajo de la porción de material de recolección dentro de la ventana o ventanas de la capa de soporte de la ventana. Esta capa de soporte de contacto puede contener discos elevados hechos de, por ejemplo, cartulina, plástico o cualquier material relativamente rígido o similar, donde se ubican las muescas de la capa superior y también en línea con las muescas circulares delineadas del material de recolección. El soporte de contacto elevado puede comprender un disco o una plataforma elevada de diferentes tamaños, donde uno puede tener el tamaño de una muesca y una plataforma subyacente puede tener un diámetro ligeramente mayor que el tamaño de la muesca. Una formación alternativa puede incluir una capa de soporte completa que tenga las mismas dimensiones que las cubiertas superior e inferior, de manera que la parte elevada de la capa de soporte esté alineada con las ubicaciones de las muescas de muestra circulares y las áreas restantes de la capa de soporte no se elevan ni se extienden a las dimensiones de las cubiertas superior e inferior. Otra modalidad incluye una cubierta inferior que contiene soportes de contacto, lo que proporciona de esta manera una función doble para la cubierta inferior.

Una modalidad adicional abarca todas las características descritas en el dispositivo multicapa sujeto y adicionalmente incluye otra capa de soporte de ventana acoplada o adyacente a una membrana de filtración que contiene un componente diferente de una muestra de sangre total. La capa de soporte de ventana colectiva y la membrana de filtración cuando se retiran o desprenden del dispositivo multicapa permiten análisis posteriores de analitos de interés de manera similar a la capa de soporte de ventana colectiva y el material de recolección.

En esta modalidad de tarjeta de dispositivo multicapa tipo libro, una unidad inferior puede comprender una capa de soporte de ventana, material de recolección, capa de soporte de contacto y una cubierta trasera, donde todas las capas se acoplan temporalmente o se acoplan de forma desmontable en al menos una de los mismos bordes o lados del dispositivo multicapa tipo libro. La unidad inferior colectiva puede entrar en contacto con la unidad superior cuando se desee, o puede separarse de una manera que permita el desprendimiento o extracción de cualquiera o todas las capas del dispositivo multicapa.

Otra modalidad proporciona un dispositivo multicapa, que comprende:

a) una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior con al menos una muesca u orificio y una unidad de membrana de filtración dentro de cada muesca; y

b) una unidad inferior que comprende capas de: un material de recolección y una cubierta inferior,

donde dicha unidad superior está conectada, acoplada o asegurada a dicha unidad inferior, dicha unidad de membrana de filtración comprende al menos dos membranas de filtración de tamaño de poro decreciente, donde cada una tiene una forma de dicha muesca u orificio. Al menos una muesca u orificio puede tener cualquier forma, lo que incluye, pero no se limita a, un círculo, un óvalo, un triángulo, un cuadrado, un rectángulo, un paralelogramo, un diamante, un pentágono, un hexágono, un heptágono, un octágono, y similares, siempre que las muescas u orificios de la cubierta superior y la membrana hidrófoba sean los mismos, dicha unidad de membrana de filtración se ubica dentro de dicha muesca u orificio de dicha cubierta superior y adyacente a dicha unidad inferior, dicha unidad de membrana de filtración es adyacente a dicho material de recolección, y dicho material de recolección está encima y adyacente a dicha cubierta inferior. La unidad de membrana de filtración en una modalidad puede estar intercalada entre la cubierta superior y la unidad inferior. La membrana hidrófoba tiene tantas muescas u orificios como se presentan en la cubierta superior, y en la misma forma y tamaño de las muescas u orificios en la cubierta superior. La membrana hidrófoba está por encima y adyacente al material de recolección. El material de recolección en otro aspecto puede estar intercalado entre dicha unidad superior y dicha cubierta inferior. El dispositivo multicapa puede tener la forma de un rectángulo con cuatro bordes, donde cada una de las capas de la unidad superior o la unidad inferior está acoplada temporalmente en al menos un borde, preferentemente, al menos dos bordes, y con mayor preferencia, al menos cuatro bordes, y cada una de las capas de la unidad superior y la unidad inferior es desprendible o desmontable. Este dispositivo multicapa puede producirse mediante impresión 3D.

Una modalidad puede dirigirse a la aplicación de aproximadamente 20 microlitros de sangre total a un disco de membrana de filtración (~9 mm de grosor) dentro de cada muesca de un dispositivo multicapa e incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 minutos. Una vez que los componentes sanguíneos separados se han secado, el dispositivo multicapa se desmonta al retirar la capa de la membrana de filtración y la capa de material de recolección. El disco o los discos de la membrana de filtración se someten a análisis celular de los glóbulos rojos recolectados en la misma, y las manchas de plasma seco en el material de recolección se someten a análisis químicos.

En una modalidad, el dispositivo multicapa comprende una cubierta superior impresa en 3D, una cubierta inferior que comprende soportes de contacto y un soporte de ventana a través del cual los soportes de contacto pueden estar en contacto físico con una capa de material de recolección que cubre la ventana abierta. La cubierta superior comprende al menos una muesca, preferentemente, 4 muescas, en el que se coloca una unidad de membrana de filtración, y la unidad de membrana de filtración contiene al menos dos discos de membrana de filtración asimétricos que encajan dentro de las muescas de la cubierta superior. Donde dos discos de membrana de filtración asimétricos se apilan para formar una unidad de membrana de filtración, un disco de membrana de filtración está encima del otro disco de membrana de filtración, lo que forma una unidad de membrana de filtración que comprende un disco de membrana de filtración de arriba y un disco de membrana de filtración de abajo, donde cada disco de membrana de filtración tiene una superficie superior y una superficie inferior, donde una muestra de fluido está inicialmente en contacto con la superficie superior del disco de membrana de filtración de arriba y la superficie inferior de un disco de membrana de filtración de abajo está adyacente a una capa de material de recolección, mientras que la unidad de membrana de filtración está dentro del perímetro de la membrana hidrófoba intercalada entre la cubierta superior y el material de recolección. Preferentemente, la superficie inferior de una unidad de membrana de filtración, que comprende dos discos de membrana de filtración, puede conectarse de forma continua a una capa de material de recolección que está unida o fijada a un soporte de ventana, donde el material de recolección cubre una ventana abierta del soporte de ventana. El soporte de ventana puede extenderse más allá de la capa de material de recolección hasta los bordes de la capa de cubierta superior. A través de la ventana del soporte de ventana, los soportes de contacto de una cubierta inferior se colocan en contacto con la capa de material de recolección.

Un dispositivo multicapa impreso en 3D, que comprende:

(a) una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior con al menos un orificio, preferentemente, cuatro (4) orificios, una unidad de membrana de filtración; y una membrana hidrófoba con al menos un orificio, preferentemente cuatro (4) orificios, en donde el número de orificios de dicha cubierta superior es el mismo que el número de orificios de dicha membrana hidrófoba; y

(b) una unidad inferior que comprende capas de: un material de recolección; un soporte de ventana y una cubierta inferior con soportes de contacto elevados,

donde dicha unidad superior está conectada o íntimamente acoplada a dicha unidad inferior, intercala capas intermedias del dispositivo multicapa, en donde dicha unidad de membrana de filtración comprende dos discos de membrana de filtración, en donde dicha unidad de membrana de filtración comprende un disco de membrana de filtración de arriba y un disco de membrana de filtración de abajo, en donde cada disco de membrana de filtración contiene una superficie superior y una superficie inferior, dicha superficie inferior de dicho disco de membrana de filtración de arriba es adyacente a dicha superficie superior de dicho disco de membrana de filtración de abajo, en donde dicha unidad de membrana de filtración separa o separa suficientemente los componentes sanguíneos y se ubica concéntricamente dentro del perímetro de cada uno de los cuatro orificios de dicha cubierta superior y dicha unidad de membrana de filtración se ubica concéntricamente dentro del perímetro de cada uno de los cuatro orificios de dicha membrana hidrófoba; dicha membrana hidrófoba es adyacente a dicha cubierta superior y dicha membrana hidrófoba es adyacente a dicho material de recolección, y dicho material de recolección es adyacente a dichos soportes de contacto elevados de dicha cubierta inferior. El dispositivo multicapa comprende capas impresas en 3D de: una cubierta superior, un soporte de ventana y una cubierta inferior.

En otra modalidad, un dispositivo multicapa puede comprender capas impresas en 3D de una cubierta superior y una cubierta inferior, donde dicha cubierta superior comprende al menos un orificio, preferentemente, cuatro orificios, donde una unidad de membrana de filtración comprende al menos dos discos de membrana de filtración, en donde dicha unidad de membrana de filtración comprende un disco de membrana de filtración de arriba y un disco de membrana de filtración de abajo, en donde cada disco de membrana de filtración contiene una superficie superior y una superficie inferior, dicha superficie inferior de dicho disco de membrana de filtración de arriba es adyacente a dicha superficie superior de dicho disco de membrana de filtración de abajo, en donde dicha unidad de membrana de filtración se ubica concéntricamente dentro del perímetro de cada uno de los cuatro orificios de dicha cubierta superior, y dicha cubierta inferior comprende un canal o pocillo con un borde para asegurar un material de recolección o, alternativamente, asegurar una membrana hidrófoba y dicho material de recolección, donde dicha membrana hidrófoba es adyacente a dicha cubierta superior y a dicho material de recolección, en donde dicha canal o pocillo contiene soportes de contacto elevados ubicados en alineación con dichos orificios de dicha cubierta superior y, si están presentes, dichos soportes de contacto elevados se ubican alineados con dichos orificios de dicha membrana hidrófoba, dicha membrana hidrófoba es adyacente a dicha cubierta superior y dicha membrana hidrófoba es adyacente a dicho material de recolección, y dicho material de recolección, y dicha membrana hidrófoba se aseguran dentro de dicha canal o pocillo de manera que la unidad de membrana de filtración y el material de recolección se conectan de manera continua, y dicha cubierta superior está acoplada, fijada o asegurada a dicha cubierta inferior.

La unidad de membrana de filtración comprende, preferentemente, al menos una membrana de filtración en forma de disco que está preformada y contiene un volumen predefinido de una muestra. El análisis cuantitativo de una capa de material de recolección puede realizarse mediante el uso de un sistema que utiliza elución por flujo continuo de componentes de plasma de sangre total en una capa de material de recolección junto con espectrometría de masas; o alternativamente, perforar una porción de un material de recolección que contenga plasma. Siempre que el tamaño de la mancha de muestra perforada sea del mismo tamaño que los usados en las muestras de la curva de calibración, el tamaño de la mancha de una capa de material de recolección no es motivo de preocupación, ya que se aplicó un volumen predefinido de una muestra de fluido a la unidad de membrana de filtración, es decir, disco preformado de membrana de filtración. Esto es particularmente ventajoso cuando se aplica sangre total obtenida por punción en el dedo al dispositivo multicapa sin usar un dispositivo de control volumétrico tal como, por ejemplo, una pipeta volumétrica o una micropipeta. Dado que típicamente puede haber una variación en el volumen de una muestra de fluido en ausencia de dicho control volumétrico, los tamaños de las manchas de plasma generadas a partir de diferentes volúmenes de sangre pueden analizarse al perforar un tamaño de mancha predeterminado de un material de recolección para su análisis y aplicar el mismo tamaño de mancha para las muestras de calibración. Por tanto, la elución por flujo continuo de manchas de plasma seco o la muestra del mismo tamaño y los puntos de calibración se usan para técnicas distintas de la elución por flujo continuo para análisis posteriores.

Si se va a usar una mancha de plasma completa en lugar de una submancha para el análisis, el análisis cuantitativo también puede lograrse bajo dos condiciones: usar un dispositivo de control volumétrico tal como una pipeta para aplicar un volumen conocido de muestra de sangre total y ajustar el nivel de hematocrito de la muestra de sangre total. Estas condiciones permiten obtener una mancha de plasma de tamaño fijado. Por lo tanto, puede usarse una mancha de plasma completa para el análisis cuantitativo.

Métodos/ Usos del dispositivo multicapa

Una modalidad adicional puede dirigirse al uso o un método de uso de un dispositivo multicapa para el análisis de una muestra de fluido para determinar analitos de interés. Un método comprende aplicar una muestra de fluido biológico, tal como, por ejemplo, sangre total, a la superficie superior de una unidad de membrana de filtración, filtrar la muestra al permitir una cantidad de tiempo suficiente para que la muestra de fluido pase a través de la unidad de membrana de filtración y se recolecte en el material de recolección, separar la unidad de membrana de filtración del material de recolección de manera que, por ejemplo, los glóbulos rojos se capturen o recolecten en la unidad de membrana de filtración y el plasma se capture o recolecte en el material de recolección, y analizar las muestras separadas y recolectadas para determinar los analitos objetivo deseados manualmente, o en otra modalidad, por medios automatizados. Por ejemplo, el análisis puede ser automatizado y en línea, donde los analitos objetivo se analizan por cromatografía líquida (LC), espectrometría de masas (MS), ^lC/MS, LC/MS/MS y similares. Antes de los análisis, en una modalidad, los analitos pueden extraerse por elución directa y extracción en fase sólida (SPE). La muestra de fluido puede ser un volumen pequeño, inferior a aproximadamente 70 pl, aproximadamente o inferior a aproximadamente 50 pl, aproximadamente o inferior a aproximadamente 25 pl y similares. La ventaja de este método es que puede realizarse sin centrifugación y es un método rápido y exacto.

Otra modalidad se dirige a un método de uso de un dispositivo multicapa que comprende:

a) aplicar un volumen flexible de un fluido, tal como un volumen de sangre total a un dispositivo multicapa que comprende: (i) una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior con al menos una muesca o un orificio abierto en el que o sobre el cual se coloca una muestra de fluido, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba; y (ii) una unidad inferior que comprende capas de un material de recolección y una cubierta inferior sin muescas ni orificios abiertos, donde la unidad de membrana de filtración está expuesta a través de la muesca de la cubierta superior del dispositivo multicapa, donde la unidad superior es adyacente a dicha unidad inferior, donde las unidades superior e inferior pueden estar cerradas en contacto físico, donde la muestra de fluido tiene un volumen flexible que varía de aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 50 microlitros, donde el dispositivo multicapa comprende al menos una membrana de filtración, una membrana hidrófoba y un material de recolección;

b) después de la aplicación de la muestra de fluido, esperar aproximadamente 3 minutos o un período de tiempo suficiente para filtrar la muestra de fluido, donde la unidad superior está en contacto con la unidad inferior en una formación cerrada;

c) separar o retirar la capa de unidad de membrana de filtración y/o la capa de material de recolección del dispositivo multicapa, donde la unidad de membrana de filtración y el material de recolección contienen cada uno componentes diferentes de la muestra de fluido;

d) esperar aproximadamente 30 minutos, o hasta que los componentes de la muestra de fluido en la unidad de membrana de filtración y el material de recolección se sequen suficientemente; y

e) analizar la unidad de membrana de filtración y/o el material de recolección que contiene componentes de la muestra de fluido seco para determinar los analitos de interés.

Otra modalidad se dirige al método de uso de un dispositivo multicapa, que comprende:

a) aplicar un volumen de sangre total a dicha unidad de membrana de filtración de dicho dispositivo multicapa; b) esperar una cantidad de tiempo suficiente para la separación de los componentes sanguíneos de dicha sangre total; y

c) almacenar dicho dispositivo multicapa,

y opcionalmente, transportar el dispositivo multicapa para su análisis.

Por ejemplo, un atleta que necesita una prueba de dopaje puede obtener un dispositivo multicapa descrito aquí, y después de aplicar un volumen de sangre total mediante el uso de una técnica de punción digital en cada una de las muescas y esperar un tiempo suficiente para la separación de los componentes sanguíneos de la muestra de sangre total o para que los componentes sanguíneos se sequen, el atleta almacenaría apropiadamente el dispositivo multicapa y devolvería o enviaría el dispositivo multicapa a una instalación en el lugar o separada para realizar análisis y determinar si el atleta estaba limpio, es decir, la muestra de sangre total no contenía ningún fármaco o componente biológico no autorizado o dopaje, es decir, la muestra de sangre total tenía un fármaco o componente biológico no autorizado presente.

Una vez que una instalación recibe un dispositivo multicapa con una muestra contenida en el mismo, el método comprende, además:

d) separar dicha unidad de membrana de filtración y dicho material de recolección de dicho dispositivo multicapa, donde la muestra se ha separado y secado; y

e) analizar dicha unidad de membrana de filtración y/o dicho material de recolección que contiene la muestra. También pueden utilizarse un estándar interno, un control positivo y un control negativo de acuerdo con la prueba.

Una vez que se ha recolectado, separado y secado una muestra de sangre total en el dispositivo multicapa descrito aquí, la unidad de membrana de filtración y el material de recolección pueden separarse del dispositivo multicapa para análisis separados mediante el uso de técnicas comúnmente usadas y conocidas en la técnica. Algunas de estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección UV, cromatografía líquidaespectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS), cromatografía líquida -Tiempo de vuelo/espectrometría de masas (LC-TOF/MS), cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS/MS), HPLC-detección de arreglo de diodos (HPLC-DAD), cromatografía de gases-ionización química con iones negativos-espectrometría de masas (GC-NICI-MS), detector de fluorescencia HPLC con sensibilidad mejorada (HPLC-FLU), LC/MS, ionización por electropulverización-TOF (ESI/TOF), ionización desorción láser asistida por matriz-TOF (MALDI/TOF), tiempo de vuelo cuadrupolo (QTOF), trampa de iones, OrbiTrap, plasma acoplado inductivamente/MS y similares.

El dispositivo multicapa puede estar en una formación abierta o cerrada en el momento en que se aplica una muestra de fluido o una muestra de sangre total a la unidad de membrana de filtración a través del al menos una muesca de la cubierta superior. Un dispositivo multicapa en una formación cerrada se produce cuando una unidad superior que comprende una cubierta superior, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba, y una unidad inferior que comprende capas de un material de recolección, opcionalmente, un soporte de ventana, opcionalmente, un soporte de contacto y una cubierta inferior están en contacto a través de la membrana hidrófoba y el material de recolección. Una formación abierta puede ser una en la que la unidad superior y la unidad inferior no están en contacto, es decir, la membrana hidrófoba de la unidad superior y el material de recolección de la unidad inferior están separados o carecen de contacto. Una modalidad se dirige a un dispositivo multicapa que está en formación cerrada cuando se aplica un volumen de muestra de fluido. Otra modalidad se dirige a un dispositivo multicapa que está inicialmente en la formación abierta cuando se aplica un volumen de muestra de fluido y después se cierra con inicio inmediatamente después de la aplicación y durante el período de espera inicial de, preferentemente, aproximadamente 3 minutos antes de separar las capas. El período de espera inicial puede ser aproximadamente o superior a aproximadamente 3 minutos o cualquier tiempo suficiente para permitir la filtración de toda la muestra de fluido.

Una ventaja del dispositivo multicapa de la invención es la ausencia del uso de una centrífuga para separar los diferentes componentes de una muestra de fluido, tal como sangre total. Centrifugar una muestra de fluido de sangre total permite la separación de, por ejemplo, los glóbulos rojos del plasma. Sin embargo, esta es una etapa engorrosa, además se necesita un volumen de muestra de fluido mucho mayor. El dispositivo multicapa descrito aquí permite un método simple de obtener plasma rápidamente sin el uso de centrifugación o un volumen de muestra de fluido excesivamente grande. En consecuencia, esta sencilla aplicación, en una modalidad, permite realizar pruebas dentro y fuera de competición en antidopaje. Otra modalidad para esta aplicación es en el uso del descubrimiento y desarrollo de fármacos en, por ejemplo, la tecnología farmacéutica.

Un obstáculo en los métodos disponibles en la técnica es que un volumen de muestra debe ser consistente y dentro de un intervalo de volumen limitado. Si se aplica muy poco o demasiado volumen de líquido para la prueba, es posible que el análisis no sea exacto o que tenga resultados nulos. Sin embargo, una de las ventajas del dispositivo multicapa de la invención es su capacidad para procesar de forma exacta y cuantitativa un volumen de aplicación amplio y flexible, donde se elimina la necesidad de garantizar volúmenes exactos muestreados durante la recolección de muestras. La robustez del dispositivo multicapa se mejora en gran medida por sobre los métodos actuales en la técnica. Por ejemplo, el volumen de aplicación de muestra flexible útil para el dispositivo multicapa sujeto puede ser, pero no se limita a, de aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 50 microlitros de sangre total, donde cada área de muesca de un dispositivo multicapa puede recibir volúmenes variables y aun dar como resultado un análisis exacto.

Lamentablemente, un volumen bajo de una muestra recolectada para análisis posteriores ha sido otro impedimento en la técnica. Sin embargo, en una modalidad ventajosa, se descubrió que el dispositivo multicapa objeto descrito aquí no solo es capaz de procesar un volumen de muestra grande y flexible, sino que también recolecta un gran volumen de, por ejemplo, plasma a partir del material de recolección. Por ejemplo, el volumen recolectado puede ser, pero no se limita a, de aproximadamente o superior a aproximadamente 4 microlitros a aproximadamente 15 microlitros, por ejemplo, de aproximadamente 4,6 microlitros a aproximadamente 14,7 microlitros. La Tabla 3 demuestra el volumen de sangre total inicial y el plasma recolectado resultante mediante el uso de un dispositivo multicapa que comprende dos membranas de filtración, donde 0,3 microlitros de plasma con respecto a microlitros de sangre es aproximadamente 3 veces superior que la técnica anterior. La cantidad de glóbulos rojos (RBC) recolectada es una función directa del volumen de sangre total aplicado a un dispositivo multicapa que se describe aquí, tal como el de una punción digital que podría contener un volumen de muestra de sangre total que varía de aproximadamente 5 pl a aproximadamente 100 pl, más generalmente, de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 50 pl, y del hematocrito de la muestra de sangre total recolectada. El hematocrito es el porcentaje de glóbulos rojos en la sangre, siendo el resto plasma. El hematocrito puede variar de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 80 % en una muestra de sangre total, más generalmente, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %.

El dispositivo multicapa descrito aquí supera los problemas relacionados con la recolección de muestras. Dado que solo se necesita un pequeño volumen de muestra de líquido para el análisis, no se requiere un flebotomista. Puede obtenerse una muestra, por ejemplo, de sangre total, al esterilizar primero el área a perforar con una toallita con alcohol y perforar el área de un dedo o un talón con una lanceta estéril desechable, también conocida como micromuestreo de sangre total. El micromuestreo es una técnica usada principalmente en mamíferos, tales como, por ejemplo, roedores, perros, caballos y humanos, que reduce el volumen de sangre de rutina recolectado sin efectos medibles para el sujeto independientemente del tamaño del sujeto. Estos beneficios del micromuestreo son especialmente relevantes e importantes para los lactantes humanos recién nacidos y prematuros extremadamente enfermos, donde la recolección regular de muestras de sangre puede ser perjudicial para el bienestar del lactante. La recolección de múltiples muestras de volúmenes de microlitros para pruebas de diagnóstico de estos lactantes enfermos es mucho menos exigente y perjudicial para sus cuerpos que tomar muestras de volúmenes de mililitros como ha sido la costumbre hasta la fecha. Pueden recolectarse pequeñas muestras líquidas mediante esta técnica, lo que incluye, pero no se limita a, micromuestreo capilar, dispositivos de laboratorio en un chip y otros dispositivos de pequeño volumen. También pueden recolectarse manchas de matriz seca para sangre (manchas de sangre seca-DBS), plasma (manchas de plasma seco-DPS) o para sudor, orina, semen, fluido amniótico, lágrimas, etc., representadas por "X" (manchas X secas-DXS).

El micromuestreo de plasma líquido es una técnica que implica la recolección de sangre total mediante el uso de, por ejemplo, un tubo capilar recubierto MYLAR®, que contiene, preferentemente, un tapón de polímero, y centrifugar el tubo para obtener la separación del plasma de los glóbulos rojos (en dependencia del tamaño de la muestra, los glóbulos rojos pueden ascender hasta aproximadamente 70 microlitros) (Bowen, C.L., y otros (2012) Proc. of the 60th ASMS Conference on Mass Spectrometry. Vancouver, BC. WP 493). Aunque la recolección capilar de sangre total puede ser útil en la invención descrita, la técnica completa que requiere centrifugación no es un método preferido, ya que no proporciona un medio de separación eficiente en cuanto a tiempo o costo y requiere la etapa adicional de centrifugación. Además, el micromuestreo de plasma líquido no proporciona ningún ahorro en los costes de transporte y almacenamiento en comparación con los medios de la invención para recolectar y separar una muestra de células de sangre total.

Otro asunto problemático en la técnica que supera el dispositivo multicapa de la invención es la filtración de sangre total que tiene un intervalo de hematocrito grande y amplio. En una modalidad, la invención filtra ventajosamente sangre total que tiene un nivel de hematocrito amplio y alto de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 % de niveles de hematocrito a través del nuevo dispositivo multicapa sin provocar hemólisis. También puede filtrarse un intervalo de hematocrito más amplio sin tener ningún resultado adverso. La composición única de la unidad de membrana de filtración permite el procesamiento de un intervalo de hematocrito tan amplio.

Un experto en la técnica comprende los obstáculos de usar un DBS. Sin embargo, dado que existen algunas ventajas para la aplicación y en vista de la preferencia de las compañías farmacéuticas por analizar plasma, un dispositivo multicapa novedoso como se describe aquí tiene todos los beneficios de una tarjeta DBS sin ninguna de sus desventajas. Por ejemplo, el sesgo por hematocrito es hipotéticamente inexistente y la farmacocinética (PK) en plasma en lugar de en sangre son ventajas del dispositivo multicapa de la invención.

Aplicaciones del análisis

El dispositivo multicapa descrito aquí puede usarse en una variedad de campos; sin embargo, el denominador común es que el producto puede usarse para un método de bioanálisis robusto, eficiente y confiable acoplado con técnicas de cromatografía y espectroscopía. Las aplicaciones útiles pueden incluir, pero no se limitan a, análisis de fármacos, descubrimiento y desarrollo de fármacos, pruebas genéticas, análisis forenses y similares. Después de micromuestrear, filtrar o separar y recolectar los componentes deseados de una muestra de fluido, la extracción de analitos se logró mediante elución directa seguida de extracción en fase sólida (SPE) y, en algunas modalidades, métodos de análisis automatizados para detectar la presencia de analitos de interés obtenidos a partir de la membrana de filtración y/o capas de material de recolección en una muestra de fluido, lo que incluye, pero no se limita a, cromatografía líquida (LC), espectrometría de masas (MS), LC/MS, LC/MS/MS y similares. Por ejemplo, la capa de material de recolección que contiene los componentes celulares también puede eluirse y los componentes celulares pueden digerirse mediante técnicas comúnmente conocidas y usadas en la técnica, seguida de diversos análisis de proteínas, péptidos, ADN, ARN, etc., asociados a células. El dispositivo es accesible para un análisis cuantitativo completamente automatizado y, en una modalidad, la extracción en fase sólida en línea acoplada directamente con espectrometría de masas o mediante SPE LC/MS/MS, donde se produce una separación cromatográfica posterior del eluato por SPE antes de MS o MS/MS.

Las modalidades de ejemplo pueden implementarse en computadoras y servidores tales como, por ejemplo, computadoras para propósitos generales que pueden tener, entre otros elementos, un microprocesador (tal como de Intel Corporation, a Md o Motorola); memoria volátil y no volátil; uno o más dispositivos de almacenamiento masivo (es decir, un disco duro); diversos dispositivos de entrada de usuario, tal como un ratón, un teclado o un micrófono; y un sistema de visualización de video. Las computadoras y los servidores pueden ejecutarse en cualquiera de los muchos sistemas operativos, lo que incluye, pero no se limita a, WINDOWS, UNIX, LiNuX, MAC OS o Windows (XP, VISTA, etc.). Sin embargo, se contempla que puede usarse cualquier sistema operativo adecuado para la presente invención. En casi todos los casos, los sistemas robóticos comerciales en línea acoplados con LC/MS/MS se controlan completamente por el software del sistema. Un sistema de gestión de información de laboratorio (LIMS) tal como, por ejemplo, THERMO SCIENTIFIC™ Watson LIMS™ es un ejemplo de un sistema de gestión de información para manejar un gran volumen de datos que pueden adquirirse a partir de las modalidades descritas. Las computadoras y los servidores pueden ser un grupo de servidores web, cada uno de los cuales puede basarse en LINUX y soportarse con un equilibrador de carga que decide cual del grupo de servidores web debe procesar una solicitud en función de la carga de solicitud actual del(de los) servidor(es) disponible(s).

Las computadoras y los servidores pueden conectarse a través de redes, lo que incluye Internet, WAN, LAN, Wi-Fi, otras redes de computadoras (conocidas ahora o inventadas en el futuro) y/o cualquier combinación de las anteriores. Debe entenderse por los expertos en la técnica que tengan ante sí la presente memoria descriptiva, dibujos y reivindicaciones que las redes pueden conectar los diversos componentes sobre cualquier combinación de conductos alámbricos e inalámbricos, lo que incluye cobre, fibra óptica, microondas y otras formas de técnicas de comunicación por radiofrecuencia, eléctricas y/u ópticas. También debe entenderse que cualquier red puede conectarse a cualquier otra red de una manera diferente. Las interconexiones entre computadoras y servidores en el sistema 100 son ejemplos. Cualquier dispositivo puede comunicarse con cualquier otro dispositivo a través de una o más redes.

Las modalidades de ejemplo pueden incluir dispositivos y redes adicionales más allá de los descritos. Además, la funcionalidad descrita como realizada por un dispositivo puede distribuirse y realizarse por dos o más dispositivos. También pueden combinarse varios dispositivos en un solo dispositivo, que puede realizar la funcionalidad de los dispositivos combinados.

Los diversos participantes y elementos descritos en la presente descripción pueden operar uno o más aparatos de computadoras para facilitar las funciones descritas en la presente descripción. Cualquiera de los elementos de las Figuras descritas anteriormente, lo que incluye cualesquiera servidores, terminales de usuario o bases de datos, puede utilizar cualquier número adecuado de subsistemas para facilitar las funciones descritas en la presente descripción.

Cualquiera de los componentes de software o funciones descritos en esta aplicación, puede implementarse como código de software o instrucciones legibles por computadora que pueden ejecutarse por al menos un procesador mediante el uso de cualquier lenguaje de computadora adecuado tal como, por ejemplo, Java, C++ o Perl mediante el uso de, por ejemplo, técnicas convencionales u orientadas a objetos.

El código del software puede almacenarse como una serie de instrucciones o comandos en un medio legible por computadora no transitorio, tal como una memoria de acceso aleatorio (RAM), una memoria de solo lectura (ROM), un medio magnético tal como un disco duro o un disquete, o un medio óptico tal como un CD-ROM. Cualquier de dichos medios legibles por computadora puede residir en o dentro de un único aparato computacional y puede estar presente en o dentro de diferentes aparatos computacionales dentro de un sistema o red.

Puede entenderse que la presente invención, tal como se describió anteriormente, puede implementarse en forma de lógica de control mediante el uso de software de computadora de forma modular o integrada. Basado en la descripción y las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, un experto en la técnica puede conocer y apreciar otras formas y/o métodos para implementar la presente invención mediante el uso de hardware, software o una combinación de hardware y software.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de dispositivo multicapa tipo libro

Para preparar la unidad de membrana de filtración, por ejemplo, discos de filtro para RBC, se perforó una hoja de filtro de membrana iPOCDX ™ mediante el uso de un punzón HARRIS Uni-Core™ de 5 mm de diámetro (Amazon, EE. UU.). Se preparó una capa de soporte inferior que comprende discos con muesca de 5 mm de diámetro, que usaban el material de cartulina similar a la cubierta superior o la capa de soporte superior, mediante el uso de un punzón de arco OSBORNE (Amazon, EE. UU.). Como se muestra en la Figura 1, después de preparar cada capa de los materiales, la tarjeta se ensambló al colocar primero una capa de membrana hidrófoba de poliéster (4) en el lado interior de la parte inferior de una cartulina de cubierta superior (2) seguido de perforar cuatro orificios igualmente espaciados a través de la cartulina de arriba o cubierta superior y a través de la capa de membrana hidrófoba de poliéster (4). Los soportes inferiores levantados o elevados (6) se hicieron de dos discos redondos del material de cartulina de soporte de la cubierta fijado en la superficie interior de la cartulina de la cubierta inferior (7) mediante el uso de un adhesivo tal como, por ejemplo, cinta adhesiva. A continuación, se colocó un sustrato de papel basado en celulosa o material de recolección (5) directamente sobre los soportes inferiores levantados o elevados o la capa de soporte de contacto, en el que el material de recolección con los círculos de colocación de muestra delineados se alineó con los orificios de muescas de la cubierta superior y la membrana hidrófoba (4). Esta tarjeta multicapa tipo libro utilizó dos discos de membrana de filtro de RBC ligeramente diferentes: uno más grande que comprende un diámetro de aproximadamente 7 mm a aproximadamente 11 mm (3) y uno más pequeño que comprende un diámetro de aproximadamente 4 mm a aproximadamente 6 mm (1) y la etapa final fue colocar estos dos discos en capas en la tarjeta o dispositivo multicapa. Los discos más grandes (3) se insertaron entre el lado interior de la cartulina de arriba y la capa de la membrana hidrófoba de poliéster mientras se mantenía la alineación con los orificios de apertura. Después, la tarjeta tipo libro se mantuvo cerrada de manera que todas las capas estuvieran en contacto. Un dispositivo multicapa puede utilizar enlazadores temporales tales como, por ejemplo, cuatro sujetapapeles, para lograr un cierre total y completo. Finalmente, los discos de membrana de filtración más pequeños se colocaron en el lado externo de la cartulina de arriba o cubierta superior donde se encuentran los orificios de apertura. Después, podría colocarse una muestra biológica fluida dentro de los orificios de la cubierta superior y en las membranas de filtración.

La tarjeta del dispositivo multicapa consistió en una cartulina plegada (0,350 mm de grosor x 76,2 mm de ancho x 50,8 mm de largo) que tiene la función de soportar capas de diferentes materiales. Para propósitos de ilustración, las capas de soporte de arriba y de abajo o cubiertas de soporte de la cartulina plegada se muestran en forma desprendida en la Figura 2. Vista desde la superficie de arriba, la unidad de membrana de filtración que comprende dos membranas de filtración o discos de filtro iPOCDX ™ (capas 1 y 3) presentaba dimensiones de poro asimétricas. El disco de arriba o primera membrana de filtración (capa 1) era la membrana iPOCDX ™ X más delgada (35 pm en la parte superior, 5 pm en la parte inferior) y se colocó en contacto estrecho directamente sobre el disco de abajo o segunda membrana de filtración (capa 3) que era un disco de membrana iPOCDX ™ S/G, 35 pm en la parte superior, 2,5 pm en la parte inferior. Cuando se combinan para formar una unidad de membrana de filtración, los dos discos pueden filtrar secuencial y eficazmente los RBC a partir de la sangre total con Hct hasta un 60 % sin mostrar ninguna evidencia de hemólisis. Los diferentes tamaños de los dos discos (arriba - 4 a 5 mm de diámetro e inferior - 7 a 11 mm de diámetro) se seleccionaron para adaptarse a volúmenes de muestreo variables y proporcionar la característica de volumen de muestreo flexible para la tarjeta.

Si una tasa de filtración no uniforme fuera problemática a diferentes niveles de Hct, las membranas de filtración pueden modificarse para eludir este problema. Por ejemplo, se perforó un pequeño orificio a través de la membrana iPOCDX ™ X de arriba para crear un pequeño orificio pasante para proporcionar un flujo más uniforme a través de diversos valores de Hct de sangre total. La cartulina de arriba o la cubierta superior o la capa de soporte (capa 2) se perforaron para crear aberturas de cartulina que coincidieran con el diámetro de la membrana de filtración o la membrana iPOCDX ™ X. La función de estas aberturas fue ubicar de forma segura la primera membrana de filtración, la membrana iPOCDX ™ X, centrada sobre la segunda membrana de filtración, la membrana iPOCDX ™ S/G. Se perforó una capa de membrana hidrófoba de poliéster AHLSTROM ™ 3256 (capa 4) (0,058 mm de grosor x 76,2 mm de ancho x 25,4 mm de largo) para crear orificios abiertos de 5 mm de diámetro y se mantuvo en su lugar con una cinta adhesiva de fácil despegue AVERY™ 5667. Esta capa de membrana hidrófoba de poliéster se usó para 1) mantener la segunda membrana de filtración, el filtro de membrana iPOCDX ™ S/G, en su lugar y 2) lograr manchas de muestra o plasma homogéneos y redondos sobre el material de recolección. Cuando se aplicó una gota de sangre a la unidad de membrana de filtración o discos de filtro, la inspección visual mostró una rápida difusión y absorción de sangre a través del primer disco de membrana de filtración en menos de 30 segundos. También se observó que el plasma se difundió más rápidamente que los RBC en el plano horizontal, lo que dio como resultado el desborde del plasma a través del borde de la segunda membrana de filtración, el disco de membrana iPOCDX ™ S/G y sobre el sustrato de papel del material de recolección. Sin la capa de poliéster de la membrana hidrófoba, este patrón de flujo provocó el inicio de la absorción de plasma y la extensión que comenzó desde el borde del disco de la unidad de la membrana de filtración sobre el sustrato de papel del material de recolección y, por lo tanto, dio como resultado una forma de mancha de plasma no homogénea, por ejemplo, un círculo semicompleto o manchas en forma de herradura. Para evitar esto, la capa de poliéster de membrana hidrófoba se colocó entre la segunda membrana de filtración, el disco iPOCDX ™ S/G y el sustrato de papel del material de recolección. Con los orificios de apertura de 5 mm en el poliéster de la membrana hidrófoba y la segunda membrana de filtración de 7 mm, los discos iPOCDX ™ S/G, hubo un contacto estrecho entre la segunda membrana de filtración, el disco iPOCDX ™ S/G y el sustrato de papel de celulosa del material de recolección, pero una compensación de 2 mm desde la segunda membrana de filtración de 7 mm, el disco iPOCDX ™ S/G, evitó el contacto directo entre el borde de la segunda membrana de filtración, el disco iPOCDX ™ S/G y el sustrato de papel del material de recolección. De esta manera, se produjeron manchas de plasma redondas y homogéneas sin ninguna evidencia de hemólisis. El grosor de la membrana hidrófoba de poliéster también desempeñó un papel importante al maximizar el contacto estrecho entre el sustrato de papel del material de recolección y la segunda membrana de filtración, la membrana iPOCDX ™ S/G. El material de recolección de sustrato de papel basado en celulosa (capa 5) era un papel AHLSTROM™ grado 601 (0,190 mm de grosor x 76,2 mm de ancho x 25,4 mm de largo) hecho de pulpa de fibrillas de algodón. La capa de soporte de contacto que contenía soportes elevados (capa 6) ubicados íntimamente por debajo del sustrato de papel del material de recolección se hizo de un apilamiento de dos discos redondos obtenidos de cartulina (disco inferior de 11 mm de diámetro y disco superior de 5 mm de diámetro) mantenidos en su lugar y alineados con la unidad de membrana de filtración, discos de filtro de membrana iPOCDX ™, mediante una cinta adhesiva AVERY ™ 8665 (76,2 mm de ancho x 25,4 mm de largo), pero puede adherirse por cualquier medio siempre que el adhesivo no interfiera con la filtración, la aplicación de manchas, o los análisis. La función del soporte de contacto inferior es asegurar un contacto físico estrecho entre el sustrato de papel del material de recolección y la unidad de membrana de filtración, más específicamente, la segunda membrana de filtración, la membrana iPOCDX ™ S/G. Este dispositivo multicapa tipo libro tiene la capacidad de producir hasta 4 manchas de plasma y/o controles por tarjeta como se muestra en la Figura 1 o la Figura 2. La tarjeta del dispositivo multicapa se construyó para producir 3 manchas de plasma porque el tamaño de pinza de 4 mm empleado tiene las posiciones de lavado del cabezal de la pinza configuradas en la posición de mancha 4.

Ejemplo 2

Elución por flujo continuo acoplada con bioanálisis por SPE-LC-MS/MS en línea de opioides y estimulantes en sangre

Para diseñar, desarrollar y validar un dispositivo multicapa con capacidad para hematocrito que pueda producir plasma sin la necesidad de centrifugación y que sea adecuado para cromatografía líquida automatizada en línea con análisis de detección por espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS), se desarrolló un dispositivo para preparar muestras de mancha de plasma seco a partir de micromuestreo de sangre total. La extracción de la mancha de plasma seco resultante se logró mediante elución directa seguida de una extracción en fase sólida (SPE) en línea y determinación por LC/MS/MS de los analitos de interés, en este caso, opioides y estimulantes. Se seleccionaron cuatro opioides y cinco estimulantes que tenían diferentes propiedades fisicoquímicas para probar en este análisis.

Se preparó una serie de soluciones de trabajo estándar mediante la dilución de soluciones madre primarias con metanol/agua 3:7 (v/v). Además, se prepararon estándares de calibración a 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml y 1000 ng/ml. Se prepararon muestras de control de calidad (QC) a 5 ng/ml, 15 ng/ml, 300 ng/ml y 900 ng/ml.

La preparación de muestras para sangre con hematocrito (Hct) al 30 %, 45 % y 60 % se realizó mediante la medición del nivel inicial de hematocrito (Hct) en un dispositivo de medición de hematocrito, el StatSpin™ CritSpin™ (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EE. UU.). Se midió el nivel de Hct de muestras de sangre total. Se colocó sangre total en tubos capilares y se centrifugó en el dispositivo a 13700 xg durante 2 min. Después de la centrifugación, se midió el nivel de Hct mediante el uso del dispositivo. Para preparar sangre con 30 %, 45 % y 60 % de Hct, se colocó 1 ml de sangre en un tubo LoBind EPPENDORF ™ de 2 ml y se centrifugó a 3000 xg - 5000 xg durante 3 min para fraccionar los RBC del plasma. Con el nivel medido del Hct inicial, se llevó a cabo un cálculo para determinar cuánto plasma debía añadirse o retirarse del 1 ml de sangre centrifugada para lograr los niveles de Hct deseados. Después de ajustar el volumen de plasma, se mezclaron entonces suavemente tubos de muestra de diferentes niveles de Hct en un mezclador de vórtice y se transfirieron 500 pl a LoBind EPPENDORF ™ de 1,5 para la fortificación de los estándares de acuerdo con el método de preparación de muestras descrito anteriormente. La evaluación del efecto del Hct se realizó a QC LLOQ y HQC. Las curvas de calibración se prepararon mediante el uso de sangre con 42 % de Hct.

Todas las muestras se prepararon mediante la fortificación de 500 pl de sangre que contenía Na2EDTA con 10 pl de una solución de trabajo en tubos LoBind Eppendorf de 1,5 ml. Posteriormente, las muestras fortificadas se incubaron a 37 °C con agitación a 200 rpm durante 30 min. Los calibradores de ocho puntos fueron 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml y 1000 ng/ml, mientras que las muestras QC fueron 5 ng/ml a QC LLOQ, 15 ng/ml a QC bajo (LQC), 300 ng/ml a QC medio (MQC) y 900 ng/ml a QC alto (HQC). Después de la incubación, las muestras se dejaron a un lado a temperatura ambiente durante 30 min antes de la preparación de DPS mediante el uso de tarjetas DXS tipo libro o un dispositivo multicapa como se muestra en la Figura 1.

Brevemente, con el dispositivo multicapa en una posición cerrada, se aplicó una alícuota de sangre (de aproximadamente 10 j l a aproximadamente 50 jl) al disco de membrana de filtración de arriba dentro de los orificios de muescas de la cubierta superior, y el dispositivo multicapa permaneció en la posición cerrada durante 3 min para completar el proceso de filtración. A continuación, se recuperó el material de recolección o el sustrato de papel de celulosa que contenía plasma filtrado. En este ejemplo, el material de recolección se fijó a una cartulina de papel adecuada, que era una tarjeta Perkin Elmer 226 con la ventana de muestreo retirada o la capa de soporte de la ventana accesible en línea. Alternativamente, el material de recolección se fija previamente a la capa de soporte de ventana accesible en línea. Puede usarse cualquier cartulina que cumpla con los criterios de configuración automatizada de DBSA.

En un tubo EPPENDORF™ de 1,5 ml, se añadieron 10 microlitros ( jl) de la solución de trabajo a 500 j l de sangre total fortificada con anticoagulante. A continuación, las muestras se incubaron a 37 °C durante 30 minutos a una velocidad de agitación de 200 rpm. Las muestras se equilibraron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de la preparación de la mancha de plasma seco.

Se prepararon manchas de plasma seco mediante la aplicación de una alícuota (de aproximadamente 15 j l a aproximadamente 50 jl) de muestra de sangre total a un dispositivo multicapa cerrado dentro de cada uno de los círculos de muescas para recolectar muestras de fluido, es decir, en una unidad de membrana de filtración. Después de 3 minutos, se abrió el dispositivo multicapa. El plasma se había absorbido sobre el material de recolección y formó una mancha de plasma seca. Se retiró el material de recolección que contenía la mancha de plasma seca y se dejó secar adicionalmente a temperatura ambiente durante 30 minutos antes del análisis automatizado de analitos en línea. Se observó que la muestra del nivel de hematocrito al 60 % no tenía hemólisis.

Los analitos de interés (y estándar interno) incluyeron morfina (y morfina-d3), codeína (y codeína-d3), oxicodona (y oxicodona-d6), hidrocodona (e hidrocodona-d3), anfetamina (y anfetamina-ds), metanfetamina (y metanfetamina-ds), 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) (y MDMA-d5), fentermina (y fentermina-d5) y mefedrona (y mefedrona-d3).

La característica de volumen de muestreo flexible. Como se describió anteriormente, la construcción de la tarjeta de dispositivo multicapa tipo libro utilizó dos discos de membrana de filtración de RBC (filtros de membrana iPOCDX ™ X y S/G) para filtrar de manera secuencial y eficientemente los RBC para muestras con un nivel de Hct de hasta 60 % y obtener plasma. El tamaño de los discos puede determinarse en dependencia del volumen de aplicación. El punto crítico es evitar el llenado excesivo o insuficiente del disco con sangre. El llenado excesivo provocará una saturación excesiva de la capacidad de filtración, lo que dará como resultado que la sangre total se desborde por el borde del disco. Si no se llena suficientemente, una fracción de plasma se retendrá en el disco, lo que dará como resultado menos plasma recolectado disponible y puede dar como resultado una saturación incompleta del sustrato del material de recolección de plasma. La saturación incompleta dará lugar entonces a una imprecisión analítica. Por lo tanto, para probar la capacidad o no del dispositivo multicapa para un intervalo de volumen de aplicación de muestra flexible (bajo, medio y alto), se evaluaron muestras para cuatro diferentes tamaños combinatorios de los 2 filtros. Las combinaciones de 4 mm y 6 mm, 5 mm y 7 mm, 5 mm y 9 mm, y 5 mm y 11 mm se evaluaron para 10 jl, 12,5 j l y 15 jl; 15 jl, 17,5 j l y 20 jl; 20 jl, 27,5 j l y 35 jl; y 35 jl, 42,5 j l y 50 j l de sangre, respectivamente. Se prepararon tres réplicas (tres manchas de plasma secas) por volumen aplicado mediante el uso de sangre de voluntarios con 45 % de Hct fortificado al nivel de HQC. Se prepararon curvas de calibración (n=2) mediante el uso de la combinación de 5 mm y 7 mm para un volumen aplicado de 20 jl. La capacidad de ajustar los tamaños de los dos discos de filtro proporciona la característica de volumen de muestreo flexible en el dispositivo multicapa.

Rendimiento de volumen de plasma. Para medir la cantidad de plasma que se produjo a partir de una muestra de sangre total mediante el uso de la tarjeta del dispositivo multicapa, se prepararon manchas de plasma (n=2) mediante la aplicación de manchas de plasma obtenido a partir de sangre total centrifugada (3 jl, 5 jl, 10 jl, 15 jl, 20 j l y 30 jl) directamente sobre un pequeño trozo de material de recolección o sustrato de papel. El trozo de sustrato de papel se pesó antes e inmediatamente después de la aplicación de las manchas. Estos datos se usaron para trazar una curva de calibración del volumen de plasma frente al peso. Para las muestras de tarjeta o dispositivo multicapa, se pesaron manchas de plasma (n=2 ) generadas a partir del dispositivo multicapa tipo libro o tarjetas mediante el uso de 15 jl, 20 jl, 30 j l y 50 j l de sangre antes e inmediatamente después de la aplicación. Los pesos medidos se usaron para calcular los rendimientos de volumen de plasma. El dispositivo multicapa generó de aproximadamente 4 j l a aproximadamente 15 j l de volumen de plasma en dependencia del volumen de sangre total inicial y una relación promedio de volumen de plasma con respecto a volumen de sangre de aproximadamente 0,3, es decir, aproximadamente tres veces la de la tarjeta NOVIPLEX™ DPS. En la Tabla 3 se muestran rendimientos ilustrativos de volumen de plasma. Para evaluar si la concentración de analito se ve afectada por la posición de elución, se compararon las posiciones de elución central y periférica en una mancha.

Se calcularon las posiciones de muestreo central y periférica para morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, AH 7921 y fentanilo en sangre total. Todos los valores calculados como se ejemplifica en la Figura 3 pasaron los criterios aceptables para % RE y % CV excepto para la morfina que tenía un % Re de -17 %. El nivel fortificado fue de 150 ng/ml para todos los opioides excepto el fentanilo, que tenía un nivel fortificado de 15 ng/ml. Se encontró que la distribución de la concentración dentro de una mancha tiene una variación significativamente menor en comparación con la DBS, donde la diferencia entre las posiciones central y periférica puede ser de hasta el 50 %.

Validación del método. Al adoptar las directrices de la FDA de EE. UU. (FDA. Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation; UCM368107 2013, 1-34), se investigaron la linealidad, precisión, exactitud, transferencia, selectividad, recuperación y estabilidad para validar la funcionalidad de la tarjeta DPS desarrollada para un análisis en línea totalmente automatizado. Las directrices regulatorias definen los criterios de aceptación como dentro de ± 15,0 % de error relativo (RE) para la exactitud y <15 % de coeficiente de variación (CV) para la precisión para todos los niveles de QC, excepto el QC LLOQ que tiene ± 20,0 % RE y <20 % CV (Id.). Los porcentajes de error relativo (% RE) se calcularon mediante (media medida / valor nominal) - 1 x 100) y los porcentajes del coeficiente de variación (% CV) se calcularon mediante (desviación estándar / media) x 100.

Estabilidad en la tarjeta a corto plazo. Se realizó un estudio de estabilidad a corto plazo para evaluar la estabilidad en la tarjeta de los opioides y estimulantes estudiados. La evaluación se llevó a cabo a los 0, 3, 9, 14 y 28 días en los niveles de QC lLo Q y HQC (n=3) en tres condiciones de almacenamiento diferentes: a temperatura ambiente (TA) mantenida en una caja llena de flujo continuo de nitrógeno (TA nitrógeno); a TA mantenida en un sobre de papel celofán con desecante que después se selló en una bolsa Ziploc® (TA Aire); y a -20 °C mantenida en un sobre de papel celofán con desecante sellado en una bolsa Ziploc® (-20 °C Aire). Las muestras se evaluaron a los 0 días, 3 días, 9 días, 14 días y 28 días. En cada punto temporal, se preparó una nueva curva de calibración. Se observó una pequeña disminución para los mismos analitos cuando se almacenaron a -20 °C aire. Esto sugirió que la inestabilidad o descomposición del analito en la tarjeta se debe a la oxidación. Una solución para evitar la inestabilidad o la descomposición de los analitos en una muestra, el almacenamiento a largo plazo del dispositivo multicapa puede ser en un recipiente lleno de nitrógeno. La eliminación del oxígeno evitará entonces los perjuicios de la oxidación. Los resultados indicaron que la estabilidad en la tarjeta del dispositivo multicapa depende del analito y del almacenamiento, como se muestra en la Figura 4 y la Figura 5. La Figura 4 mostró en el día 28 una descomposición significativa (análisis de varianza, ANOVA) para la oxicodona (p = 0,001), hidrocodona (p = 0,004) y mefedrona (p < 0,0001) cuando se almacenaron en presencia de aire (TA Aire y -20 °C Aire). Cuando se almacena a TA N2, puede lograrse la estabilidad en la tarjeta para los nueve analitos durante 28 días. La Figura 5 mostró en el día 28, descomposiciones significativas (ANOVA, p <0,0001) para oxicodona, hidrocodona y mefedrona cuando se almacenaron en presencia de aire (TA Aire y -20 °C Aire). Cuando se almacenaron a TA aire, se observaron descomposiciones (> 50 %) de oxicodona, hidrocodona y mefedrona el día 3. Puede deberse a la oxidación y que los grados bajo cero pueden ralentizar la velocidad de descomposición. Recientemente, se ha informado un patrón de descomposición en la tarjeta similar para la mefedrona con relación a los efectos de las condiciones de almacenamiento en presencia de aire frente al N2 (Verplaetse, R.; Henion, J. Analytical Chemistry, 2016, 88, 6789-6796.

Efectos del hematocrito. Una de las principales preocupaciones informadas para las aplicaciones de DBS son los problemas de Hct para los que se han propuesto varias soluciones posibles (De Kesel, P. M., y otros, Bioanalysis 2013, 5, 2023-2041; "De Kesel"). De las soluciones propuestas, DPS fue una de las alternativas prometedoras (Déglon, J., y otros, Bioanalysis 2015, 7, 2375-2385). Para evaluar si la tarjeta de dispositivo multicapa tipo libro de la invención era compatible con Hct, se prepararon y fortificaron muestras de sangre con 30 %, 45 % y 60 % de Hct a niveles QC LLOQ y HQC. Los resultados no mostraron sesgo por Hct en ambos niveles de QC para todos los analitos como se muestra en la Figura 6. La línea roja de la Figura 6 indica el criterio máximo aceptable de <20,0 % RE y CV en el LLOQ y < ± 15,0 % RE y CV a QC alto. No se observó sesgo por hematocrito en el intervalo de Hct de 30 a 60 %. En comparación con una tarjeta desarrollada previamente (Sturm, R., y otros, Bioanalysis 2015, 7, 1987 2002), esta tarjeta DPS tipo libro parece proporcionar una gama más amplia de aplicabilidad de Hct que se logra a través de un diseño preferido que incorpora dos membranas de filtración o discos de filtro de RBC, que pueden filtrar y capturar RBC.

Característica de volumen de muestreo flexible. Se empleó un análisis de manchas de 4 mm. Con un análisis de mancha parcial, se muestrea un área de mancha de 4 mm dentro de una mancha de plasma seco. Por lo tanto, si una mancha de plasma es homogénea, la exactitud de los resultados no debe verse afectada por si el área de muestreo de 4 mm se tomó parcialmente de una mancha de plasma de 8 mm o 14 mm y si el área de muestreo de 4 mm se obtuvo de la región central o periférica dentro de una mancha de plasma seca. Para apoyar este postulado, se evaluaron volúmenes de sangre que variaban de 10 a 50 pl que produjeron tamaños de manchas de plasma de aprox. 8 a 14 mm mediante el uso del dispositivo multicapa tipo libro. El dispositivo multicapa tipo libro se personalizó para tener diferentes tamaños de membrana de filtración de discos de una primera membrana de filtración, X, y una segunda membrana de filtración, S/G, para acomodar diferentes volúmenes de sangre. La cuantificación se realizó con una curva de calibración construida a partir de 20 pl de sangre mediante el uso de tarjetas de dispositivo multicapa con membranas de filtración de 5 mm y 7 mm, discos X y S/G, respectivamente. Se observó una exactitud comparable a HQC entre diferentes volúmenes de sangre total aplicados. Aunque la mayoría del % de RE estuvo dentro del límite de aceptación (< ±15 %), se observaron tendencias de sesgos negativos en las manchas producidas con <20 |jl de sangre, mientras que se observaron sesgos positivos en las manchas producidas a partir de >20 j l de sangre. Estos sesgos pueden corregirse mediante la preparación de una curva de calibración mediante el uso de un volumen que sea comparable al volumen aplicado de la muestra. También se evaluaron las posiciones de la mancha central frente a periférica a 4 volúmenes de aplicación diferentes (15 jl, 20 jl, 35 j l y 50 jl) lo que produce diferentes tamaños de plasma.

Los resultados en la Tabla 2 no mostraron diferencias en los niveles medidos para todos los analitos entre las posiciones central y periférica a 4 volúmenes de sangre aplicados diferentes o diversos tamaños de manchas de plasma. Estudios anteriores han informado resultados similares en los que se obtuvieron datos comparables de manchas preparadas a partir de manchas de plasma centrifugado de 20 jl, 25 j l y 30 j l mediante el uso del tubo capilar SAFECAP® (Li, W., y otros, Journal of Chromatography B-Analytical Technologies en Biomedical and Life Sciences 2015, 991, 46-52; "Li y otros, 2015"). Aunque se observaron resultados comparables para 20 jl, 25 j l y 30 j l de plasma, se observó un sesgo negativo a 10 j l de plasma (Li y otros, 2015). El tipo de sustrato de papel de celulosa usado en ese estudio fue la tarjeta DMpK C, que es casi 2,5 veces más gruesa que el material de recolección o el sustrato de papel (AHLSTROM™ Grado 601) usado en la tarjeta de dispositivo multicapa tipo libro. Cuando se emplea un sustrato de papel más grueso, la extensión y penetración del plasma por todo el papel puede experimentar una penetración incompleta descrita por Henion y otros (Henion, J., y otros, Bioanalysis 2013, 5, 2547 2565). Si es así, la inexactitud sería más un problema a un volumen menor que a un volumen mayor. Notablemente, los resultados informados en la Tabla 1 y la Tabla 2 respaldan la fundamentación de que la consistencia del plasma es independiente tanto del nivel de Hct en sangre como del volumen de sangre aplicado y muestran el elemento funcional de característica de muestreo flexible en la aplicación de la tarjeta de dispositivo multicapa tipo libro.

El dispositivo multicapa tipo libro frente a las tarjetas DPS existentes. Las dos tarjetas DPS existentes más cercanas a la del dispositivo multicapa que se describe aquí son la tarjeta NOVIPLEX™, que está disponible comercialmente en Novilytic LLC (Kim, J.H., y otros, Anal Chem 2013, 85, 11501-11508) y la 'tarjeta DPS automática' informada previamente por Sturm y otros (Bioanalysis 2015, 7, 1987-2002). En general, el diseño conceptual de estas dos tarjetas y la tarjeta del dispositivo multicapa de la invención es similar ya que cada una de ellas emplea una técnica de filtración por membrana en la tarjeta para separar los RBC del plasma. Sin embargo, las estructuras de la tarjeta y la producción de plasma en cada formato de tarjeta son diferentes. Para una producción exitosa de manchas de plasma en la tarjeta, la tarjeta de dispositivo multicapa de tipo libro de la invención no requiere ningún dispositivo externo. Aunque la tarjeta NOVIPLEX™ tampoco requiere ningún dispositivo externo para la generación de manchas de plasma, el proceso de manipulación de la muestra es tedioso ya que requiere un par de pinzas para retirar el pequeño disco de 2 mm y transferir manualmente el disco para posteriores procesos de extracción de muestras ya que la tarjeta NOVIPLEX™ no es compatible para análisis automatizados. Si bien no se determinó el rendimiento de volumen de plasma por DPS automática, la tarjeta NOVIPLEX™ requiere un mínimo de 25 pl de sangre para producir aproximadamente 2,5 pl de plasma (Kim, J. H. y otros, Anal Chem 2013, 85, 11501-11508). Eso es 0,100 pl de plasma por pl de sangre. Mientras, la tarjeta de dispositivo multicapa tipo libro de la invención produce una mayor cantidad de volumen de plasma (4,6 pl a 14,7 pl en dependencia del volumen de sangre aplicado inicialmente y promedia aproximadamente una relación 3 veces mayor de plasma/volumen de sangre, es decir, 0,303 ± 0,007 por pl de sangre total (Tabla 3).

Tabla 3: Determinación del volumen de plasma generado a partir de un dispositivo multicapa

Membranas iPOCDX ™

(mm)

_{X SG}Volumen de sangre total Volumen de plasma Relación plasma/volumen (pl) (pl) sanguíneo

4 6 15 4,55 0,304

4 6 15 4,71 0,314

5 7 20 6,18 0,309

5 7 20 5,95 0,298

5 9 30 9,07 0,302

5 9 30 9,22 0,307

5 11 50 14,72 0,294

5 11 50 14,68 0,294

Se trazó la curva de calibración para el peso de las manchas de plasma frente al volumen de plasma en el intervalo de 3 pl a 30 pl.

La curva mostró linealidad con un R2 = 0,9994, pendiente = 0,9793x - 0,0995.

La elución de mancha por flujo continuo automatizada y SPE en línea. El sistema robótico empleado en este trabajo se describió previamente (Verplaetse, R.; Henion, J. Drug Testing and Analysis 2016, 8, 30-38; Sturm, R. y otros, Bioanalysis 2015, 7, 1987-2002; Oliveira, R. V. y otros, Anal Chem 2014, 86, 1246-1253). Brevemente, incluyó una elución de flujo continuo automatizada de manchas secas en una tarjeta de celulosa mediante el uso del sistema DBSA (Spark Holland, Emmon, Países Bajos). Este sistema recogió un material de recolección fijado a un soporte de ventana accesible en línea de una tarjeta de dispositivo multicapa, ubicó las manchas secas en la tarjeta seguido de la elución del solvente de mancha acoplada a una etapa de elución/trampa de analito SPE en línea. La desorción de la mancha se realizó mediante un mecanismo de flujo continuo en el que un par de pinzas (equipadas con tubos para el suministro de solvente) formaban un área de elución pinzada en el sustrato de papel del material de recolección. En la posición de pinzamiento, se introdujo el solvente de elución a través del papel de material de recolección y se suministró el extracto al cartucho SPE en línea. Una ilustración y descripción detallada de todo el sistema en línea se encuentran en (Verplaetse, R.; Henion, J. Drug Testing and Analysis 2016, 8, 30-38). En el estudio actual, se empleó un análisis de mancha parcial mediante el uso de un tamaño de pinza de 4 mm acoplado ya sea a los modos de reconocimiento de manchas invisibles o definidos por el usuario. Había cuatro manchas por material de recolección/tarjeta de soporte de ventana disponible en línea con manchas núm. 1, 2 y 3 como manchas de plasma secas y la mancha núm. 4 como posiciones de lavado de la pinza, que se llevaron a cabo entre muestras. La cuarta mancha o área de muesca comprende 3 círculos pequeños colocados en una formación de triángulo para el lavado de la pinza. Si se usó un tamaño de pinza de 2 mm, la posición de lavado estaba en la esquina derecha de cada punto, lo que proporciona de esta forma la capacidad de cuatro manchas de muestra por tarjeta. Se eligió el tamaño de la pinza de 4 mm para mejorar la sensibilidad analítica de la morfina. La elución del punto se realizó con 2 ml de solvente de desorción (NH4OH al 0,2 % MeOH al 2,5 % en H2O) a 100 °C y a 4 ml/min. Se introdujo directamente en la línea de elución del punto un asa de muestra que contenía 20 pl de solución de IS deuterada. Posteriormente, el solvente de elución se cargó en un cartucho ^sP^epreacondicionado (1 ml de MeOH y 1 ml de solvente de desorción a 4 ml/min) (HySphere™ C8HD, 7 |jm, 2 x 10 mm, Spark Holland). Se usó un gradiente de LC para eluir los analitos objetivo del cartucho en la columna de LC para la posterior separación cromatográfica. Para minimizar la transferencia, tanto el cartucho SPE como las pinzas DBS se lavaron secuencialmente con los siguientes 3 solventes diferentes (2 ml de solvente de desorción, 4 ml de H2O:MeOH ACN:IPA 2:4:3:1 v/v con FA al 0,1 % y finalmente 2 ml de FA H2O al 0,1 %) a 6 ml/min entre ejecuciones.

LC-MS/MS. El análisis LC-MS/MS se realizó con un sistema NEXERA® UHPLC acoplado a un espectrómetro de masas LC-MS 8050 (Shimadzu, MD, EE. UU.). El procesamiento de datos se realizó mediante el uso del software LabSolutions de Shimadzu. La columna de LC era una KINETEX® F5 (2,6 jm, 2,1 x 50 mm) equipada con una columna protectora F5 (2,6 jm, 2,1 x 5 mm) de PHENOMENEX® (Torrance, CA, EE. UU.). La fase móvil consistió en (A) formiato de amonio 5 mM y FA al 0,1 % y (B) MeOH. El programa de gradiente de LC fue: 10 % B en la condición inicial, 10 % B a 0,25 min, 40 % B a 1,70 min, 100 % B a 2,20 min, 100 % B a 2,48 min, y reciclado de nuevo hasta 10 % B a 2,90 min. Los primeros 0,25 min del flujo que pasó a través del cartucho SPE en línea se programaron para el puerto de desechos. La tasa de flujo fue de 0,4 ml/min mientras que la columna de HPLC se mantuvo a 50 °C. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en el modo de ionización por electropulverización de ion positivo en las siguientes condiciones instrumentales: voltaje de interfaz de 0,5 kV, temperatura de interfaz de 400 °C, temperatura de la línea de desolvatación de 100 °C, temperatura del bloque de calentamiento de 140 °C, flujo de gas de secado de 3 l/min N2, flujo de gas nebulizador de 2 l/min N2 y flujo de gas de calentamiento de 20 l/min N2. Para cada compuesto, se monitorearon dos transiciones SRM como se indica en la Tabla 4.

Los instrumentos usados para analizar la presencia de analitos de interés incluyeron un muestreador automático de tarjetas de manchas de sangre seca (DBS) (DBS, Spark Holland); bomba dispensadora de alta presión (HPD, Spark Holland); módulo automático de intercambio de cartuchos SPE (ACE, Spark Holland), cromatografía líquida de ultra alto rendimiento NEXERA® (UHPLC, Shimadzu); y LCMS-8050 MS (Shimadzu). La elución directa en línea de las manchas de plasma se realizó al pinzar el material de recolección que contiene la mancha de plasma seca mediante el uso de una pinza (4 mm), donde el análisis parcial de la mancha se produjo a 100 °C.

El sistema de muestreador automático Spark-Holland DBS SPE se modificó para analizar muestras con DXS. El sistema se configuró de manera que el HPD y la bomba de jeringa se conectaron independientemente a una válvula multipuerto con un asa con IS (20 pl de las mezclas de control estándar interno deuterado); otra válvula multipuerto conectada a una pinza para sujetar el material de recolección, donde la pinza tiene un diámetro de aproximadamente 2 mm, que se conecta a una tercera válvula multipuerto con una pinza de cartucho SPE, donde la tercera válvula multipuerto se conecta a una columna LC, eliminación de desechos, bombas de gradiente y un sistema informático para análisis de extracción SPE-LC-HRAMS DXS en línea. Si se usa un sistema automatizado en colaboración con el dispositivo multicapa descrito aquí, pueden usarse otros sistemas además del sistema de muestreador automático Spark-Holland SPE. El dispositivo multicapa también puede analizarse mediante el uso de otro sistema de automatización en línea, tal como, por ejemplo, CAMAG DBS - MS 500 (worldwideweb.camag.com/en/dbs/dbs-ms_500.cfm)

El método SPE utilizó HySphere™ C8 HD, 7 pm, cartucho de 2 x 10 mm (Spark Holland), en condiciones (a 6 ml/min) de 1 mililitro de metanol, 1 ml de hidróxido de amonio al 0,2 % y metanol al 2,5 % en agua; elución (a 3 ml/min) de 1 ml de hidróxido de amonio al 0,2 % y metanol al 2,5 % en agua; y lavado (a 6 ml/min) de 2 ml de hidróxido de amonio 0,25 y metanol al 2,5 % en agua, 4 ml de agua/metanol/acetonitrilo/isopropanol 2:4:3:1 (v/v). Las condiciones del programa LC (LC-MS/MS Shimadzu 8050) fueron como se indica en la Tabla 5 más abajo, donde Bomba A: ácido fórmico al 0,1 %/agua y Bomba B: metanol al 100 %, donde los primeros 0,25 minutos* del gradiente de LC después pasar a través del cartucho SPE se dirigió al desecho.

Tabla 5

Tabla 5

El dispositivo multicapa usado estaba compuesto por varias capas. La muestra de sangre total se aplicó a una primera capa de una unidad de membrana de filtración que comprende una membrana de filtración de una membrana iPOCDX ™ X asimétrica (5 mm de diámetro del disco de membrana de filtración); asimétrica (tamaño de poro superior de 35 pm; tamaño de poro inferior de 5 pm) que tiene un grosor de aproximadamente 0,160 mm a aproximadamente 0,200 mm de muesca (5 mm de diámetro) de una cubierta superior compuesta de una cartulina que tiene un grosor de 0,350 mm. El dispositivo multicapa puede tener 4 muescas. Las capas de la unidad de membrana de filtración son capas de muescas confinadas (es decir, no flexibles), que tienen las mismas dimensiones que las muescas de la cubierta superior. Debajo de la primera capa de una unidad de membrana de filtración hay una segunda capa de una unidad de membrana de filtración que comprende una membrana de filtración de una membrana iPOCDX ™ S/G asimétrica (7 mm); tamaño de poro superior asimétrico de 35 pm; tamaño de poro inferior de 2,5 pm) que tiene un grosor de aproximadamente 0,260 mm a aproximadamente 0,300 mm. Debajo de la unidad de membrana de filtración hay una membrana hidrófoba compuesta por una membrana de poliéster AHLSTROM® HOLLYTEX® 3256 con 4 muescas (por ejemplo, 5 mm de diámetro) que tienen las mismas dimensiones que las muescas circulares de la cubierta superior. Esta membrana hidrófoba tiene un grosor de aproximadamente 0,0584 milímetros. Por debajo de la membrana hidrófoba hay un material de recolección con contornos de las muescas, pero sin muescas confinadas reales (es decir, flexible) que permite un material de recolección flexible. El material de recolección puede estar compuesto por papel de celulosa AHLSTROM® 601 que tiene un grosor de 0,190 mm de plasma absorbido a partir de la muestra de fluido de sangre total. Por debajo del material de recolección hay una capa de soporte elevada que aseguró un contacto físico estrecho entre la unidad de membrana de filtración, la membrana hidrófoba y el material de recolección. La capa de soporte elevada eran los discos de muescas obtenidos de cartulina con un grosor de 0,7 mm que se mantenían en su lugar mediante el uso de una cinta adhesiva AVERY 8665®. Por debajo de la capa de soporte elevada había una cubierta inferior, que sostenía todas las capas anteriores. La capa inferior estaba compuesta por una cartulina de aproximadamente 0,350 mm.

Se validó la aplicación funcional del dispositivo multicapa desarrollado y los resultados demostraron una buena selectividad y límites aceptables de precisión entre días y exactitud a cuatro niveles de control de calidad (QC). El límite más bajo de detección (LLOQ) se alcanzó a 5 ng/ml y se observó linealidad a R2 > 0,9964 de 5 ng/ml a 1000 ng/ml. La recuperación promedio fue superior a (>) 87,9 %. El dispositivo multicapa probado también mostró compatibilidad con hematocrito del 30 % al 60 % para los opioides y estimulantes probados. Un estudio de estabilidad a corto plazo sugirió que la estabilidad del dispositivo multicapa es limitada y depende del compuesto cuando se almacena a temperatura ambiente en aire o atmósfera.

Los cromatogramas de los cuatro opioides probados y los cinco estimulantes de la Figura 7 mostraron estándares internos que tenían tiempos de retención (min) como se muestra en la Tabla 6 más abajo. La Figura 7 (A) era la muestra blanco doble, (B) era la muestra blanco, (C) era la muestra LLOQ (5 ng/ml) y (D) era el estándar interno deuterado.

Tabla 6:

Los resultados de precisión y exactitud para el análisis de manchas de plasma seco mediante el uso de sangre que tiene un nivel de hematocrito del 30 %, 45 % y 60 % se presentan en la Figura 6. Se analizó cada uno de los analitos de interés para cada uno de los diferentes niveles de hematocrito. La precisión se evaluó mediante el coeficiente de variación (CV) que es igual a (desviación estándar (DE)/media) x 100, mientras que la exactitud se evaluó mediante el error relativo (RE) que equivale a [(media-nominal)/nominal] x 100. La Figura 7 (A) muestra el coeficiente de variación QC LLOQ de cada nivel de hematocrito y cada analito analizado y (B) muestra el error relativo. La Figura 7 (C) muestra el alto coeficiente de variación QC de cada nivel de hematocrito y cada analito analizado y (D) muestra el error relativo. También se probó un intervalo más amplio de niveles de hematocrito. La Figura 8 y la Tabla 7 más abajo muestran los resultados de los niveles de hematocrito del 25 % al 65 % según se probaron para morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, AH 7921 y fentanilo. Para AH 7921 y fentanilo, se encontró que la recuperación se correlacionaba inversamente con el nivel de hematocrito en sangre total. Si bien se demostró que la morfina, la codeína, la oxicodona y la hidrocodona eran compatibles con el hematocrito, AH 7921 y el fentanilo no lo eran. Se observó la misma tendencia en LQC, MQC y HQC.

Tabla 7: Morfina Codeína Oxicodona Hidrocodona AH 7921 Fentanilo

25 % HCT

% RE 3 % -6 % -4 % -5 % 6 % 34 %

% CV 7 % 11 % 4 % 8 % 5 % 19 %

35 % HCT

% RE -2 % -6 % 6 % -1 % -1 % 28 %

% CV 11 % 4 % 2 % 4 % 11 % 20 %

45 % HCT

% RE -11 % 1 % -6 % -8 % -14 % 12 %

% CV 3 % 6 % 5 % 3 % 3 % 14 %

55 % HCT

% RE -10 % 1 % -4 % -5 % -31 % -5 %

% CV 13 % 12 % 3 % 10 % 9 % 17 %

65 % HCT

% RE -18 % 4 % -7 % -2 % -49 % -3 %

% CV 7 % 16 % 14 % 8 % 18 % 13 %

También se probó la estabilidad de los opioides y estimulantes. La Figura 4 muestra el LLOQ (5 ng/ml) durante 14 días almacenada en tres condiciones diferentes:

(1) Temperatura ambiente (TA) mantenida en una caja llena con flujo continuo de nitrógeno (TA nitrógeno); (2) Temperatura ambiente (TA) mantenida en un sobre de papel celofán con desecante (TA aire); y

(3) -20 °C mantenida en sobre de papel celofán con desecante (-20 °C aire).

Se logró y comparó el volumen de plasma obtenido a partir del dispositivo multicapa. En la Tabla 4 anterior, el volumen promedio de plasma/sangre fue de 0,303 pl y una desviación estándar de 0,007.

Se calculó la linealidad y recuperación de los cuatro opioides y cinco estimulantes. La Tabla 8 más abajo resume los resultados.

Tabla 8: Linealidad y recuperación de cuatro opioides y cinco estimulantes

También se determinó la exactitud y la precisión entre días y entre lotes de cuatro opioides y cinco estimulantes y se muestran en la Tabla 9 más abajo.

En conclusión, los resultados de la validación mostraron el beneficio funcional del dispositivo multicapa de la invención que tiene una buena precisión, exactitud, selectividad, recuperación y sensibilidad analítica. La evaluación de la estabilidad en el producto para los nueve analitos probados sugirió que la estabilidad del dispositivo multicapa depende del compuesto cuando se almacena a temperatura ambiente en aire. Por lo tanto, antes de la comercialización, debe evaluarse la estabilidad en el producto para cada analito de interés y proporcionar al consumidor las instrucciones adecuadas. Los beneficios de este dispositivo multicapa incluyen micromuestreo sin la ayuda de un profesional médico o flebotomista, uso de una centrífuga, capacidad para probar un intervalo más amplio de niveles de hematocrito para el análisis de analitos de interés tales como opioides y estimulantes, compatibilidad para un análisis LC/MS/MS en línea completamente automático, y un alto rendimiento de volumen de plasma a partir de sangre (es decir, mayor que los rendimientos de los métodos disponibles comercialmente).

Ejemplo 3

Compuestos de prueba para probar el dispositivo multicapa

El dispositivo multicapa de la invención se probó mediante el uso de un fármaco conocido para la hipertensión y el ADHD, guanfacina, con su estándar interno [13C, 15N3]. La guanfacina (CsHsChNaO) tiene una masa monoisotópica de 245,0123 Da, mientras que el estándar interno [13C, 15N3]-guanfacina (13CC8H9Cl215N3O) tiene una masa monoisotópica de 249,0067 Da. Estos compuestos se probaron mediante el uso de una muestra de sangre total con una relación de unión a sangre:plasma (Ke/p) de 1,5 y se analizaron mediante el uso de bioanálisis LCMS/MS de acuerdo con el protocolo descrito aquí.

Ejemplo 4

Método para usar el dispositivo multicapa

Como cuestión inicial, se recolectó una muestra de fluido como sangre total sin tocar ninguna de las capas intercaladas entre la cubierta superior y la cubierta inferior, ya sea antes o después de la recolección, donde se evita particularmente la unidad de membrana de filtración expuesta a través de una muesca de la cubierta superior. Incluso después de la recolección de la muestra, debe evitarse el contacto con la unidad de membrana de filtración expuesta sobre la cual se aplicó la muestra de fluido. Para la recolección de muestras por punción en el dedo o en el talón, se seleccionó un sitio de punción y se limpió con isopropanol al 70 %. Se usó una lanceta estándar, estéril y desechable. Mientras se mantenía el dedo o el talón en una posición hacia abajo al nivel del corazón o por debajo de él, la lanceta perforó el sitio limpio. La primera gota de sangre se limpió con un trozo estéril de gasa o similar. Cuando apareció una segunda gota de sangre, preferentemente grande, la sangre total en un volumen de al menos aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 50 microlitros se recolectó mediante un tubo capilar desechable estéril o se aplicó directamente a la superficie superior de la unidad de membrana de filtración expuesta a través de la muesca de la cubierta superior. Si el área de muesca de una sola muesca era inferior a aproximadamente 10 microlitros, se añadió inmediatamente una segunda gota hasta que un volumen suficiente llenaba el área de la muesca. Una vez que todos los círculos de muesca de un único dispositivo multicapa se llenaron con sangre total en un lado de la unidad de membrana de filtración, las muestras de sangre total o los especímenes de la unidad superior se ubicaron en contacto con la unidad inferior en una posición cerrada durante aproximadamente 3 minutos de manera que al menos la unidad de membrana de filtración, la membrana hidrófoba y el material de recolección estuvieran en contacto íntimo. Después de aproximadamente 3 minutos o más, tiempo en el que la unidad de filtración absorbió la muestra de sangre total y el plasma se recolectó en el material de recolección, las capas del dispositivo multicapa se separaron para análisis de analitos. Puede dejarse un tiempo adicional para secar aún más las muestras recolectadas, preferentemente, aproximadamente 30 minutos o cualquier cantidad de tiempo para que las muestras recolectadas se sequen antes de los análisis. Por ejemplo, el material de recolección, una vez separado, se analizó por LC/MS (cromatografía líquida/espectroscopía de masas), LC-MS/MS, DPS-SPE-LC-MS/MS (Mancha de Plasma Seco-Extracción en Fase Sólida-LC/MS/MS), espectroscopía de masas en tándem o técnicas similares para analitos, lo que incluye los opioides. Una ventaja significativa del dispositivo multicapa de la invención es su capacidad para obtener múltiples componentes a partir de una única muestra de fluido y realizar simultáneamente múltiples pruebas. Por ejemplo, los glóbulos rojos (RBC) y el plasma se recolectaron por separado y los bioanálisis de inmunoensayo enzimático (EIA) y SPE-LC-MS/MS se realizaron por separado, respectivamente. La unidad de membrana de filtración o porciones de la misma que contenían RBC se analizaron mediante inmunoensayo enzimático (EIA) en fase sólida, mientras que el material de recolección que contenía plasma a partir de la muestra de fluido se analizó mediante SPE-LC-MS/MS. Brevemente, el procedimiento de EIA implicó separar una unidad de membrana de filtración que comprende al menos una capa de membrana de filtración en forma de disco que tiene el tamaño, la forma y las dimensiones de las muescas, donde los discos contenían RBC del dispositivo multicapa y transferir cada disco a una placa de micropocillos individual para el análisis de los RBC para determinar analitos de interés. Se transfirieron múltiples membranas de filtración a múltiples pocillos de una placa de micropocillos. Se añadió un diluyente a cada pocillo y se incubó la placa (O/N; 4 °C). A continuación, la placa se sometió a agitación suave para mezclar y diluir. Se añadió eluyente a cada pocillo de la placa de micropocillos y se incubó durante 90 minutos a 37 °C. La placa se lavó varias veces y se añadió un conjugado IgG-enzima a cada pocillo para una incubación adicional a 37 °C. Se añadió el sustrato y se incubó a 25 °C. A continuación, se añadió una solución de parada a cada pocillo para detener la reacción. Después se leyó la placa a 405 nm y se determinó la presencia de los analitos de interés.

Ejemplo 5

Micromuestreo de manchas de plasma seco compatible con hematocrito de dispositivo multicapa para el bioanálisis en línea de DBSA-SPE-LC-MS/Ms completamente automatizado de opioides en sangre

Las técnicas de mancha de sangre seca (DBS) conocidas y usadas en la técnica se enfrentan a una limitación con respecto a la compatibilidad con el hematocrito. Aunque este problema puede mitigarse con la opción de análisis de mancha total frente a análisis de mancha parcial, el beneficio de la facilidad de uso y la complejidad del muestreo, ya que en lugar de micromuestreo, se requeriría un muestreo volumétrico. En su lugar, se desarrolló una tarjeta de mancha de plasma seco (DPS) compatible con hematocrito o un dispositivo multicapa que ofrece beneficios de facilidad de uso y no requiere un muestreo volumétrico complicado. Esencialmente en este ejemplo, el dispositivo multicapa tiene una forma intercalada de una cubierta de cartulina que, en orden de arriba hacia abajo, contiene una unidad de membrana de filtración de dos membranas de filtración (o filtros de membrana de glóbulos rojos (RBC)), una membrana hidrófoba hecha de poliéster, un material de recolección que es un sustrato de papel basado en celulosa recolector de plasma, y un soporte elevado para facilitar un contacto directo e íntimo para una absorción eficiente del plasma.

Mediante el uso de un solo dispositivo multicapa, se generaron cuatro manchas al aplicar una alícuota de sangre total directamente sobre los filtros de RBC seguido por el cierre del dispositivo multicapa si estaba inicialmente en la formación abierta. Posteriormente, se retiró el material de recolección de plasma y se fijó a otro soporte compatible para un sistema en línea totalmente automatizado. El sistema en línea usado incluyó un sistema de desorción Spark-Holland DBSA y una unidad de extracción en fase sólida (SPE) en línea automatizada acoplada a un LC-MS/MS (UHPLC Shimadzu y 8050 triple cuadrupolo equipado con una columna RAPTOR Biphenyl, 2,7 pm, 2,1 mm x 50 mm). Se monitorearon seis analitos de interés u opioides representativos, lo que incluye morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, AH 7921, fentanilo y sus correspondientes análogos marcados con deuterio o estándares internos por ionización por electropulverización de ion positivo SRM LC/MS.

El dispositivo multicapa se usó para analizar las manchas de plasma seco generadas a partir de sangre total de un solo sujeto. Se empleó una opción de mancha parcial mediante el uso de una pinza de 2 milímetros (mm). La desorción de las manchas se realizó con 1 mililitro (ml) de solvente de elución (hidróxido de amonio (NH4OH) al 0,1 % y metanol (MeOH) al 3 % en agua) a 60 °C mediante desorción de flujo continuo donde un asa de 20 microlitros (pl) de estándar interno deuterado se introdujo directamente en la línea de desorción. Posteriormente, el volumen de desorción se cargó en un cartucho SPE preacondicionado. Se usó gradiente de LC (A: ácido fórmico al 0,1 %/agua y B: MeOH al 100 %) para eluir los analitos del cartucho. Los resultados preliminares mostraron una buena linealidad (R2>0,990) que varía de 2 a 1000 ng/ml para todos excepto el fentanilo que tenía el intervalo de 0,2 a 100 ng/ml, buena precisión (<20 % CV), exactitud (<20 % RE) en el punto de calibrador más bajo (LLOQ), buena selectividad ya que está libre de efecto matriz y recuperación de extracción de >90 % tanto a LLOQ como a ULOQ. Con un área de muestreo de solo 2 mm, establecer un LLOQ de bajo a sub ng/ml podría ser un desafío, pero se logró gracias al sistema de preparación y análisis de muestras en línea totalmente integrado descrito.

Los datos preliminares también mostraron una filtración exitosa de glóbulos rojos para generar manchas de plasma libres de hemólisis a niveles de HCT que variaban de aproximadamente 25 % a aproximadamente 65 %. Aunque no se habían realizado ensayos espectrofotométricos, se contempló que las manchas de plasma libres de hemólisis generadas a partir de este nuevo dispositivo multicapa también se usarían para dichos ensayos. A diferencia de la sangre total, la homogeneidad de las manchas de plasma es independiente del nivel de HCT. Por lo tanto, el análisis de las manchas producidas a partir de diversos niveles de HCT puede realizarse mediante el uso de un análisis de manchas parciales y, por lo tanto, no se requiere un muestreo volumétrico. Este dispositivo multicapa se usó para volúmenes de muestreo flexibles, lo que incluye los que varían de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 50 pL de sangre total al ajustar el tamaño del filtro de RBC en consecuencia.

Ejemplo 6

Elución por flujo continuo automatizada acoplada con bioanálisis por SPE-LC-MS/MS en línea de analitos mediante el uso de un dispositivo multicapa

Se probaron la precisión, exactitud, estabilidad, posiciones de elución de la mancha y el volumen de plasma generado mediante el uso de una muestra de líquido de sangre total aplicada a un dispositivo multicapa.

Productos químicos, reactivos y materiales: La morfina, [2H3]-morfina, codeína, [2H3]-codeína, oxicodona, [2H6]-oxicodona, hidrocodona, [2H3]-hidrocodona, anfetamina, [2H5] anfetamina, metanfetamina, [2H5] metanfetamina, MDMA, [2H5]-MDMA, fentermina, [2H5]-fentermina, mefedrona y [2H3]-mefedrona se adquirieron de CERILLIANT™ (Round Rock, TX, EE. UU.). Solventes de grado LC-MS: El acetonitrilo (ACN), isopropanol (IPA) y metanol (MeOH) se adquirieron de Honeywell Burdick & Jackson (Muskegon, MI, EE. UU.). El agua Milli Q se obtuvo de un sistema interno MILLIPORE®. El formiato de amonio, el hidróxido de amonio y el ácido fórmico (FA) se obtuvieron de EMD® Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ, EE. UU.). Se recolectaron muestras de sangre humana de voluntarios sanos en tubos Monoject™ tratados con Na2EDTA, se almacenaron a -4 °C y se usaron dentro de los cuatro días desde el punto de extracción. Las soluciones madre y de trabajo se prepararon y almacenaron en viales de vidrio ámbar de borosilicato de 4 ml de Kimble Chase (Vineland, NJ, EE. UU.). Las muestras de sangre se prepararon en tubos Protein LoBind de 1,5 ml de EPPENDORF® (Hamburgo, Alemania). Las pipetas volumétricas eran de la serie Pipet-Lite XLS de RAININ® Instrument LLC (Oakland, CA, EE. UU.). Los materiales y herramientas artesanales usados para fabricar el dispositivo multicapa tipo libro se compraron en Amazon, excepto lo siguiente: las tarjetas Perkin Elmer 226 que se compraron a Perkin Elmer (Boston, MA, EE. UU.), las cartulinas dobladas (50,8 mm (largo) X 76,2 mm (ancho)) eran de Cards and Pockets (South Easton, MA, EE. UU.). El sustrato de papel de celulosa de grado 601 y la membrana de poliéster Hollytex®3256 (denominada en lo adelante como capa de poliéster) se donaron por AHLSTROM® Filtration, LLC (Mt Holly Springs, PA, EE. UU.) y los filtros de membrana iPOCDX ™ se donaron por International Point Care Inc. (Toronto, Ontario, Canadá).

Preparación de soluciones de trabajo: Los estándares de opioides y estimulantes y sus análogos deuterados se compraron en soluciones metanólicas de 1 mg/ml y 0,1 mg/ml, respectivamente. Las soluciones de trabajo de calibrador y QC se prepararon por dilución de las soluciones madre primarias con MeOH:H2O (3:7 v/v) lo que proporcionó 0,25 pg/ml, 0,50 pg/ml, 1,25 pg/ml, 2,50 pg/ml, 5,00 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25,0 pg/ml, y 50,0 pg/ml para los calibradores de 8 puntos y 0,25 pg/ml, 0,75 pg/ml, 15 pg/ml, 45 pg/ml para los 4 niveles de QC. La solución de estándar interno deuterado (IS) fue una mezcla de [2H3]-morfina 5 ng/ml, [2H3]-codeína 4 ng/ml, [2H6]-oxicodona 2,5 ng/ml, [2H3] hidrocodona 2,5 ng/ml, [2H5]-anfetamina 10 ng/ml, [2H5] metanfetamina 10 ng/ml, [2H5]-MDMA 10 ng/ml, [2H5]-fentermina 10 ng/ml, y [2H3]-mefedrona 10 ng/ml en MeOH: H2O (3:7 v/v). Todas las soluciones se almacenaron a -20 °C.

Linealidad, precisión, exactitud y recuperación: en un análisis de lote, se analizó un conjunto de ocho calibradores al principio y otro conjunto al final del lote. Entre los dos conjuntos, se analizaron cuatro niveles de QC (n=6) y muestras de recuperación (n=2). Mediante el uso de sangre total del mismo voluntario, este análisis se repitió en tres días diferentes para obtener valores de precisión y exactitud intra y entre días. La plataforma automatizada de una elución de mancha de flujo continuo no puede adoptar el enfoque convencional de determinación de la recuperación. Para eludir esto, la recuperación de la extracción se determinó al eluir o extraer repetidamente la misma mancha por cinco veces sucesivas en el LLOQ y 10 veces en el ULOQ. La recuperación se calculó mediante (área del pico de analito de la primera extracción / suma de 5 o 10 extracciones) X 100. Esto proporcionó una recuperación de extracción relativa en ausencia de la recuperación de SPE en línea. Las curvas de calibración (n=2) se representaron mediante el uso de relación de área de pico de analito/IS y se observó que tienen linealidad de R2> 0,9963 sobre el intervalo cuantitativo mediante el uso de regresión lineal ponderada 1/x2 (Tabla 8).

El intervalo de la curva cubre tanto los intervalos terapéuticos como tóxicos para los compuestos del título (Regenthal, R., y otros, J Clin Monit Comput 1999, 15, 529-544; Schulz, M., y otros, Critical Care 2012, 16, R136-R136). En los análisis DBS y DPS, la introducción de IS puede realizarse de diversas formas como se describió anteriormente (Abu-Rabie, P., y otros, Analytical Chemistry 2015, 87, 4996-5003; van Baar, B. L., y otros, Bioanalysis 2013, 5, 2137-2145). En este ejemplo, se introdujo el IS en el solvente de elución por flujo continuo; por lo tanto, el estándar interno (IS) no pudo compensar ninguna discrepancia en la extracción de la tarjeta, tal como el sesgo de recuperación del analito y el sesgo de recuperación relacionado con Hct. Una forma de eludir este problema fue optimizar la recuperación del ensayo, como señalaron Abu-Rabie y otros, (op. cit.) que no informa ningún sesgo de recuperación observable relacionado con el Hct para la recuperación del ensayo de más del 90 %. La recuperación para este ensayo fue >90,0 % para todos excepto para la anfetamina que fue 87,8 % como se muestra en la Tabla 8. Los resultados de precisión y exactitud en el mismo día también mostraron valores aceptables (Tabla 11). La precisión y la exactitud entre días se calcularon mediante el uso de los valores promedio en el mismo día (n=3) y los resultados mostraron que se aprobaron los criterios aceptables en todos los niveles de QC para los nueve analitos, excepto la codeína en el nivel de QC LLOQ que fue del 23 % (Tabla 9).

La linealidad también se probó con morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona y AH 7921 con un intervalo de calibración de 2 ng/ml a 1000 ng/ml. También se probó el fentanilo y se encontró que tenía linealidad. El intervalo de calibración del fentanilo fue de 0,2 ng/ml a 100 ng/ml. La Figura 9 muestra gráficos de linealidad para la morfina y el fentanilo. Se observó que la codeína, oxicodona, hidrocodona y AH 7921 tenían una linealidad similar a la de la morfina. La Tabla 10 más abajo muestra los valores R2 para cada compuesto analizado.

Tabla 10:

Selectividad y arrastre: la selectividad se evaluó al analizar el blanco doble (blanco matriz sin IS), el blanco (blanco matriz con IS) y las muestras fortificadas en los niveles LLOQ (5 ng/ml) y ULOQ (1000 ng/ml) de seis lotes de matriz individuales (seis muestras de sangre total humana diferente). Para evaluar los efectos de transferencia, se analizaron dos muestras blanco (tarjeta en blanco sin manchas de plasma) después del ULOQ. Como se muestra en la Figura 7, la muestra de blanco doble mostró señales de IS transferidas insignificantes (aproximadamente el 1 % de la intensidad de IS total) mientras que la muestra blanco mostró señales de analito no detectables. Se observó una buena resolución y detección cromatográfica en el nivel LLOQ para los nueve analitos. Puede observarse la separación de los isómeros codeína e hidrocodona y de los isómeros metanfetamina y fentermina. La precisión y exactitud entre lotes en LLOQ y ULOQ estuvieron dentro de los criterios de aceptación para todos los analitos (Tabla 9). La transferencia se evaluó al ejecutar una mancha blanco (una tarjeta en blanco sin mancha de muestra) después del calibrador ULOQ. Se observaron señales de transferencia inaceptables (>20 % de la intensidad de la señal LLOQ) para anfetamina, metanfetamina, MDMA y fentermina. Se probaron una variedad de lavados y procedimientos con solventes y los resultados mostraron una mejora, pero no lograron reducir la transferencia a niveles aceptables. Por lo tanto, el problema de la transferencia se mitigó al emplear dos blancos secuenciales (sin mancha de plasma) después del calibrador ULOQ. Con el procedimiento de lavado, el tiempo del ciclo de LC MS/MS por ejecución aumentó de 4,3 a 6,2 min.

Se realizó un muestreo volumétrico flexible a partir de 20 pl, 30 pl y 50 pl de sangre total. Los opioides probados fueron morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona, AH 7921 y fentanilo. La curva de calibración se preparó mediante el uso de 30 pl de sangre total. El nivel fortificado estaba en QC LLOQ (2 ng/ml o 0,2 ng/ml). La Figura 10 y la Figura 11 muestran los resultados de las pruebas para muestreos volumétricos flexibles de 20 pl a 50 pl. Se demostró que las concentraciones de opioides de cada uno de los opioides en los volúmenes de muestra de sangre total variables - 20 pl, 30 pl, y 50 pl (columnas de izquierda a derecha para cada opioide) - de la Figura 10 eran similares para morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona y AH 7921, pero el fentanilo tenía una concentración mucho más baja en todos los volúmenes. La Figura 11 muestra que la precisión y exactitud en QC LLOQ aprobó los criterios requeridos en ±20 % para el error relativo (RE) y 20 % para el coeficiente de varianza (CV) para (A) 20 pl, (B) 30 pl y (C) 50 pl de sangre total.

Ejemplo 7

Una mancha de plasma seco generada a partir de la aplicación de sangre total a un dispositivo multicapa descrito aquí permitió la filtración de glóbulos rojos (RBC) que generó plasma a partir de una simple recolección de muestras en el punto de atención y sin la necesidad de centrifugación. Se desarrolló y validó un dispositivo multicapa para el análisis automatizado de analitos de interés en una muestra de fluido de sangre total mediante el empleo de elución por flujo continuo completamente automatizada junto con SPE-LC-ESI-MS/MS en línea. La determinación cuantitativa de cuatro analitos representativos de interés incluyó opioides (morfina, codeína, oxicodona, hidrocodona) y cinco estimulantes (anfetamina, metanfetamina, 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA), fentermina y mefedrona) y en un método se usaron sus análogos marcados con deuterio correspondientes como estándares internos. Los resultados de la validación del método mostraron una buena linealidad (R2>0,9963) que variaba de aproximadamente 5 a aproximadamente 1000 ng/ml. La precisión y la exactitud en el mismo día y entre días estuvieron dentro de los límites aceptables en cuatro niveles de control de calidad (QC). La recuperación de la extracción fue >87,9 % tanto en el límite inferior de cuantificación (LLOQ) como en el límite superior de cuantificación (ULOQ) junto con una selectividad y sensibilidad aceptables. La estabilidad a corto plazo de DPS en la tarjeta fue dependiente del compuesto y dependiente del almacenamiento. Los beneficios adicionales del dispositivo multicapa tipo libro validado incluyen un intervalo de aplicabilidad más amplio de Hct (30 % a 60 %), compatibilidad de análisis automatizado en línea, un mayor rendimiento de volumen de plasma y una característica de volumen de muestreo flexible.

Ejemplos

Análisis de proteínas de superficie de RBC y reticulocitos mediante el uso del dispositivo multicapa

Un disco de membrana de filtración en la unidad superior del dispositivo multicapa que contiene glóbulos rojos y sus precursores se retiró de la unidad superior y se analizó para determinar proteínas y otros constituyentes de la membrana de filtración mediante el uso de técnicas de inmunoensayo o LC-MS/MS. Después de retirar el disco de membrana de filtración del dispositivo multicapa, se cubrió una porción del disco o un disco de membrana de filtración completo con una solución tampón etanólica y se colocó en un sonicador durante un período de tiempo suficiente para extraer las proteínas solubles. Las proteínas unidas a la membrana tales como, pero no limitadas a, Band 3 o el receptor de transferrina se liberaron de la membrana de filtración después de la digestión con una enzima proteasa, y los péptidos resultantes se analizaron cuantitativamente mediante LC-MS/MS.

Pueden usarse enfoques similares conocidos y usados en la técnica para cuantificar proteínas intracelulares.

La capacidad de recolectar componentes celulares secos en ubicaciones remotas y cuantificar las proteínas de la superficie celular ofrece una ventaja significativa por sobre otras tecnologías de recolección de muestras. Por ejemplo, los cambios de maduración de los reticulocitos observados durante el almacenamiento de una muestra líquida de sangre se evitan mediante el uso de la técnica de sangre seca descrita aquí.

La descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de la descripción. Por lo tanto, el alcance de la invención no debería determinarse con referencia a la descripción anterior, sino que debería determinarse con referencia a las reivindicaciones en trámite.

Una o más características de cualquier modalidad pueden combinarse con una o más características de cualquier otra modalidad sin apartarse del alcance de la invención. La mención de "un", "una" o "él/ella" pretende significar "uno o más" a menos que se indique específicamente lo contrario. La mención de "y/o" pretende representar el sentido más inclusivo del término a menos que se indique específicamente lo contrario.

Uno o más de los elementos del presente sistema pueden reivindicarse como medios para realizar una función particular. Cuando dichos elementos de medios más función se usan para describir ciertos elementos de un sistema reivindicado, los expertos en la técnica que tengan ante sí la presente especificación, las figuras y las reivindicaciones, entenderán que la estructura correspondiente es una computadora de propósito general, procesador o microprocesador (según sea el caso) programado para realizar la función mencionada en particular mediante el uso de la funcionalidad que se encuentra en cualquier computadora de propósito general sin programación especial y/o al implementar uno o más algoritmos para lograr la funcionalidad mencionada. Como entenderán los expertos en la técnica, el algoritmo puede expresarse en esta descripción como una fórmula matemática, un diagrama de flujo, una narración y/o de cualquier otra manera que proporcione una estructura suficiente para los expertos en la técnica para implementar el proceso mencionado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo multicapa, que comprende:

a) una unidad superior que comprende capas de: una cubierta superior (2) con al menos una muesca, una unidad de membrana de filtración y una membrana hidrófoba (4) con al menos una muesca que tiene la misma forma y tamaño que la al menos una muesca en la cubierta superior (2); y

b) una unidad inferior que comprende capas de: una capa absorbente (5) y una cubierta inferior (7) sin muescas,

en donde dicha unidad superior es adyacente y está conectada a dicha unidad inferior, dicha unidad de membrana de filtración comprende dos membranas de filtración (1,2) de tamaños de poro decrecientes, cada una con una forma de dicha muesca, dicha unidad de membrana de filtración está colocada dentro de dicha muesca de dicha cubierta superior (2) y adyacente a dicha membrana hidrófoba (4), dicha membrana hidrófoba (4) está intercalada entre dicha unidad de membrana de filtración y dicha capa absorbente (5), dicha capa absorbente (5) es adyacente a dicha membrana hidrófoba (4), y dicha capa absorbente (5) está por encima de dicha cubierta inferior (7).

2. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho dispositivo tiene una forma rectangular con cuatro bordes.

3. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 2, en donde cada una de las capas (1, 2, 3, 4) de la unidad superior y cada una de las capas (5, 7) de la unidad inferior está acoplada en al menos un borde de dicha forma rectangular.

4. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 3, en donde cada una de las capas (1, 2, 3, 4) de la unidad superior y cada una de las capas (5, 7) de la unidad inferior es extraíble.

5. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además una capa de soporte de contacto (6) ubicada debajo de dicha capa absorbente (5) y encima de dicha cubierta inferior (7).

6. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 5, en donde dicha capa de soporte de contacto (6) comprende al menos un soporte elevado colocado dentro de la muesca y en contacto con dicha capa absorbente (5).

7. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además un soporte de ventana que comprende una ventana unida a una capa para análisis posteriores.

8. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 7, en donde dicho soporte de ventana es compatible con un sistema de análisis en línea totalmente automatizado.

9. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 7, en donde dicha capa para análisis posteriores es una unidad de membrana de filtración o una capa absorbente (5).

10. El dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha al menos una muesca comprende de 1 muesca a 4 muescas.

11. Un método de uso de dicho dispositivo multicapa de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: a) aplicar un volumen de una muestra de fluido a dicha unidad de membrana de filtración de dicho dispositivo multicapa;

b) esperar aproximadamente 3 minutos con dicha unidad superior en contacto con dicha unidad inferior; c) separar dicha unidad de membrana de filtración y dicha capa absorbente (5) de dicho dispositivo multicapa;

d) esperar aproximadamente 30 minutos mientras dicha unidad de membrana de filtración y/o dicha capa absorbente (5) separada(s) se secan: y

e) analizar dicha unidad de membrana de filtración y/o dicha capa absorbente (5).

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde dicho volumen es de aproximadamente 10 microlitros a aproximadamente 100 microlitros.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde dicha unidad de membrana de filtración está acoplada a un soporte de ventana que es compatible con un sistema de análisis en línea totalmente automatizado.

14. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde dicha unidad de capa absorbente está acoplada a un soporte de ventana que es compatible con un sistema de análisis en línea totalmente automatizado.