CN109073519B - 用于分离血液成分的多层装置及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的实施例总体上涉及分析物检测和便于收集、分离样品组分及分析物检测的产品。在本发明的不同实施例中描述了多层装置和使用多层装置收集、分离组分以及测试的方法，其中多层装置允许针对感兴趣的分析物，快速、容易、准确且高效地测试流体样品。

Description

用于分离血液成分的多层装置及其应用

相关申请的交叉引用

本国际PCT申请要求2016年2月24日递交的、名称为“Dried Plasma Spot CardFor Automated Online Determination Of Opioids”的美国临时专利申请No.62/299226的优先权的权益，该美国专利申请通过引用整体并入本申请中。

技术领域

本发明总体上涉及用于分析物检测的液体样品成分的分离。更具体地，本发明的方面涉及用于使用用来分离血液成分的多层装置或多层分离装置来分离全血的各种成分的简便且准确的装置，以及使用这种装置检测例如具体在细胞表面上和细胞内液体与细胞外液体中的各种血液成分中的分析物的方法，其中所述全血的各种成分包括但不限于红细胞、白细胞、血小板和血浆；所述分析物包括但不限于化合物、药物和代谢物、核酸、DNA、RNA、mRNA、miRNA、蛋白质、细胞表面和细胞内标记物、病原体、细菌、病毒、微生物等。

背景技术

体育赛事使所有年龄和国籍的人联合在一起。必须保护比赛和运动员的纯洁，以保障体育的有力的正面影响。为了保持这种纯洁，测试系统必须发展，以使公众相信运动员没有非法使用提高成绩的药物。除了竞争性运动测试之外，化学物质测试通常对未来的或现在的雇员、囚犯或假释者、军事人员实施；在车辆事故后、航空事故后和航船事故后实施；在法医分析中实施等。例如，干血斑技术已被用于筛查新生儿的先天性代谢疾病。尽管通过刺破手指或脚跟有利地实现采样以获得最小体积、易于运输和样品稳定性，但仍存在若干障碍。

可用产品和测试方法在样品收集和处理、样品产率、血细胞比容(Hct)相容性和分光光度(spectrophotometric)检测的限制方面存在许多挑战。一个收集后分析的问题是处理收集的样品的限制，其涉及源自打孔的手动操纵和检测，其通过手动移除干血斑、对干血斑的一小部分打孔(约3毫米-6毫米)、和在溶剂中洗脱(elute)较小的样品用于标准分析。这不是一个自动化过程。

两种现有的干血浆斑点(DPS)卡是NOVIPLEX^TM卡，其可从Novilytic LLC(Kim，JH等人，Anal Chem 2013,85,11501-11508)和先前由Sturm等人(Bioanalysis 2015,7,1987-2002)报道的'auto DPS card'商购获得。作为收集材料或纤维素(cellulose)纸的血浆收集基底的功能是各种干斑点卡(dried spot card)之间的关键差异。AutoDPS卡具有涂蜡边界。利用autoDPS卡的涂蜡边界，过量的过滤后的血浆保留在边界内，导致血细胞比容的低端和高端的不准确偏差。在低血细胞比容水平处，可获得较多血浆并被保留在蜡结合区域内，而在高血细胞比容水平处，保留较少血浆。NOVIPLEX^TM卡的边界与auto DPS卡中所描述的涂蜡边界不同。NOVIPLEX^TM卡有一个盘，一旦饱和，过量的过滤后的血浆就会自由地流出盘外或超出盘的范围。这个动作不同于autoDPS卡，在autoDPS卡中过量的血浆被圈闭在边界内。通常，这两种卡的概念设计是相似的，因为它们中的每一种都采用卡上膜过滤技术将RBC与血浆分离。然而，在每种卡格式中，卡结构和血浆产生是不同的，并且每种都有其自身的缺点。如上所述，autoDPS卡可能不准确也不高效。据报道，autoDPS卡可以使用由Advion，Inc.(Ithaca，NY，USA)推出的也称为液体提取表面分析LESA^TM的样品支持装置。尽管NOVIPLEX^TM卡不需要任何外部设备来产生血浆斑点，但它与自动化分析不兼容。结果，样品处理过程繁琐，需要一把镊子去除包含样品的小的2-mm过滤盘并手动转移盘以进行进一步的样品提取过程。虽然没有确定过用autoDPS的血浆体积的产率，但NOVIPLEX^TM卡需要最少25μL血液以产生约2.5μL血浆(Kim，J.H.等人，Anal Chem 2013,85,11501-11508)。遗憾的是，血浆体积的产率低，即每μL血液有0.100μL血浆。来自NOVIPLEX^TM卡的血浆产量为约2.5μL，这对于大多数分析来说是不够的。低血浆量不是由于初始血液样品体积小，而是由于血浆收集基底的容量有限。扩大容量是不可能的。

因此，需要一种用于分离样品成分和检测分析物的简便、准确、高效和快速的系统，例如但不限于手动或自动系统。更具体地，需要一种利用简化的样品收集过程、降低的成本和简化的运输和储存的产品和技术，其克服了对离心分离全血成分的需要(Sturm等人，Bioanalysis 2015,7，1987-2002(“Sturm”)；Kim等人，Anal Chem 2013,85,11501-11508(“Kim”)；Li等人，Rapid Commun Mass Spectrom 2012,26,1208-1212(“Li”))，目前可用于测试的窄血细胞比容范围，即Hct 40-55％(Sturm)，低产率的血浆体积(Sturm；Kim；Li)，以及缺乏完全自动化分析(Kim；Li)。

发明内容

在一个实施例中，本发明提供了一种用于收集和分离例如血液成分的多层装置，其允许从施加到多层装置的诸如全血的流体样品中检测分析物。在一个实施例中，所述多层装置可以是呈书本形式构成的干斑点卡，其中所述干斑点卡具有顶盖和底盖，所述顶盖和底盖在一个边上铰接形成脊，并夹着类似于书页的多层膜和材料。替换地，多于一个边或所有边被临时连接或耦接，并且所述多层装置的在一个或多个边上连接或耦接的任何或所有层可以彼此拆开、移除或分离和从所述装置拆开、移除或分离。流体样品的分离允许分离后的成分的随后单独分析。

另一方面可涉及一种包括可根据需要分别地移除或拆开的层的多层装置。具有矩形形状的多层装置可以在所有边上临时附接或耦接，其中所述多层装置的任意或所有层可被拆开或移除。例如，任意或所有层的各个边可以以使允许所述层从所述多层装置的其余部件撕开或拆开的方式来穿孔。替换地，所述各层可以以如下方式紧紧地夹在所述顶盖和底盖之间，使得所述流体样品不泄漏并且所述多层装置的每一层保持就位直至为移除而分离。

一个方面涉及一种多层装置，包括：

a)顶部单元，其中所述顶部单元包括相邻于疏水膜的过滤膜单元；和

b)底部单元，其中所述底部单元包括收集材料和底盖，

其中，所述顶部单元与所述底部单元相邻并且相连接，所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜，所述过滤膜单元具有顶表面和底表面，并且所述疏水膜具有顶表面和底表面，其中所述过滤膜单元的所述底表面与所述疏水膜的所述顶表面相邻，其中所述收集材料具有顶表面和底表面，所述疏水膜的所述底表面与所述收集材料的所述顶表面相邻，并且所述收集材料的所述底表面与所述底盖相邻。

另一方面提供一种多层装置，包括：

a)顶部单元，其包括以下层：具有至少一个切口的顶盖、过滤膜单元、和疏水膜，所述疏水膜具有至少一个切口且切口数量与所述顶盖中的切口数量相同；和

b)底部单元，其包括以下层：不具有切口的收集材料和底盖，

其中，所述顶部单元与所述底部单元相邻并且相连接，所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜，优选地，孔径大小减小的两个过滤膜，其中每个过滤膜在一个方面具有所述切口的形状，所述过滤膜单元定位在所述顶盖的所述切口内并且与所述疏水膜相邻，其中所述顶盖、过滤膜单元、和疏水膜中的每一层通过切口对准，所述疏水膜与所述过滤膜单元和所述收集材料相邻或者夹在所述过滤膜单元和所述收集材料之间，所述收集材料与所述疏水膜相邻，并且所述收集材料位于所述底盖上方。由于血浆主要是水，疏水材料不吸收任何血浆。具有切口的疏水膜将阻止任何血浆泄漏或者扩散超过所述切口的边界，因而使干斑点居中地定位在所述切口内。所述过滤膜单元在一个方面可夹在所述顶盖和所述疏水膜之间。所述收集材料是诸如纤维素、纸等的吸收层，在另一方面可夹在所述疏水膜和所述底盖之间。所述多层装置可以呈具有四个边的矩形形状，其中所述顶部单元或底部单元的每一层临时耦接在至少一个边上，形成充分紧的接触以避免任何泄漏或层的移动，并且所述顶部单元和底部单元的每一层是可拆开的或可移除的。多层装置的替换格式进一步包括接触支撑层，所述接触支撑层相邻于所述收集材料且位于所述收集材料下方，并且所述接触支撑层相邻于所述底盖或者位于所述底盖上方，或者各接触支撑部形成底盖的一部分，其中所述接触支撑层的各接触支撑部优选包含凸起的支撑部，其中所述凸起的支撑部的至少一部分装配在放置流体样品的所述切口内。另一方面包括所述多层装置，其可还包括至少窗支撑件，用于被拆开用于随后分析的层，优选地用于过滤膜单元和/或收集材料。所述窗支撑件可以是这样的层，其包含暴露样品以检测感兴趣的分析物的窗，用于随后分析的所述层附接或耦接到所述窗支撑件，并且所述耦接到用于随后分析的所述层的所述窗支撑件可以从所述多层装置移除或拆卸以便随后作生物分析。

又一方面涉及一种多层装置，包括：顶部单元，所述顶部单元包括以下层：具有至少一个切口的顶盖、过滤膜单元、和具有至少一个切口的疏水膜；和

b)底部单元，所述底部单元包括以下层：不具有切口的收集材料和底盖，

在其他方面，一种使用所述多层装置的方法包括：

a)将柔性体积的流体施加到多层装置，所述多层装置包括(i)顶部单元，其包括以下层：具有至少一个切口或开孔的顶盖、过滤膜单元和疏水膜，其中流体样品放置在切口或开孔上或中；和(ii)底部单元，其包括以下层：不具有切口的收集材料和底盖，其中所述顶部单元与所述底部单元相邻，其中所述体积可以是约10微升到约100微升；

b)等待约3分钟，其中所述顶部单元与所述底部单元接触；

c)将所述过滤膜单元和/或所述收集材料从所述多层装置分离；

d)等待约30分钟，同时干燥所述分离的过滤膜单元和/或所述收集材料；和

e)分析所述过滤膜单元和/或所述收集材料。所述过滤膜单元和/或所述收集材料的分析可包括检测感兴趣的分析物。

又一方面可涉及一种使用所述多层装置的方法，包括：

a)将一定体积的流体样品施加到所述多层装置的所述过滤膜单元；

b)等待约3分钟，其中所述顶部单元与所述底部单元接触；和

c)存放所述多层装置。在所述多层装置存放几分钟到几天后，运输或不运输所述多层装置到用于分析的设施，包含安全和防干扰的样品的所述多层装置经历进一步操作。在存放所述多层装置后，使用方法进一步包括：

d)将所述过滤膜单元和所述收集材料从所述多层装置分离；和

e)分析所述过滤膜单元和/或所述收集材料以分析感兴趣的分析物，

其中所述多层装置可以是3D打印的装置或者不是3D打印的装置，例如卡片构材(card stock)。

这里描述的多层装置和技术的益处包括简化样品收集、降低成本、简化运输和存储、以及在各领域获得的显著的利益(Tretzel,L等人，Analytical Methods 2015,7,7596-7605；Sadones,N等人，Bioanalysis 2014,6,2211-2227)。本发明的多层装置战胜了本领域中的许多挑战，包括血细胞比容效应和全血而不是血浆的采样(De Kesel,P.M等人，Bioanalysis 2013,5,2023-2041)。

在另一方面中，一种多层装置被配置成简便且快速检测分析在由多层装置收集和分离的干样品斑点中发现的分析物，诸如但不限于自动化、高吞吐量分析。因此，这里描述的本发明的多层装置被发展成兼容于宽范围的血细胞比容水平(例如25％-65％)、来自全血流体样品的高血浆体积产率、和分析单个流体样品的多个成分。

附图说明

当结合附图考虑时，参考详细说明可更好地理解本发明。附图中的要素不必然按比例绘制、强调，相反地着重在于图示本发明的原理。在附图中，相同的附图标记在所有不同视图中表示相对应的部分。

本发明部分地涉及改进的干斑点卡。在其它领域和应用中，本发明可具有例如从流体样品中检测化合物、药物、代谢物、激素、阿片类物质(opioids)、病毒、核酸、蛋白质等的效用，其中所述流体样品包括但不限于全血、红细胞、血浆和血小板。多层装置的用途也可设想为检测例如尿液、唾液、眼泪、羊水、精液等的流体样品中的不是一定要求分离的感兴趣的分析物。

附图描绘了根据示例性实施例的多层装置的多个方面，包括流体样品分离和测定存在化合物、药物、阿片类物质、激素、核酸、蛋白质等。

图1示出了书本型多层装置，其中数字表示在示例1中详细描述的从1到6的组装顺序。

图2示出了包含7个层的多层装置：(1)装配在每个切口内的第一过滤膜；(2)具有四个切口的顶盖；(3)装配在每个切口内且相邻于第一过滤膜的第二过滤膜；(4)包含切口的疏水膜；(5)不具有切口的收集材料，且所述收集材料可选地在切口所在的地方具有切口周缘的外轮廓；(6)接触支撑层；和(7)底盖。

图3示出了用于各种阿片类物质的中心和周缘采样位置的结果，其中用于每个阿片类物质的左侧柱和右侧柱分别表示中心位置和周缘位置。

图4示出了在三种不同存放条件时在LLOQ(5ng/mL)下阿片类物质和兴奋剂的卡上稳定性：在RT下保持在填充有连续氮气流的盒子中(RT+氮气)，在RT下保持在格拉辛纸(glassine)封套+干燥剂中，进一步密封在Ziploc袋中(RT+空气)，和在-20℃下保持在格拉辛纸封套+干燥剂中，进一步密封在Ziploc袋中(-20℃+空气)。

图5示出了在三种不同存放条件时，在高QC(900ng/mL)下阿片类物质和兴奋剂的卡上稳定性：在RT下保持在填充有连续氮气流的盒子中(RT+氮气)，在RT下保持在格拉辛纸封套+干燥剂中，进一步密封在Ziploc袋中(RT+空气)，和在-20℃下保持在格拉辛纸封套+干燥剂中，进一步密封在Ziploc袋(-20℃+空气)中。

图6示出了在LLOQ(A和B)和高QC(C和D)下使用具有30％，45％和60％Hct(n＝3)的血液的多层装置分析的精确度和准确度。

图7示出了显示了对于A)空白样品(没有IS的基质空白)，B)零样品(具有IS的基质空白，仅显示分析物信号)，C)LLOQ样品(用5ng/mL标准强化的基质)和D)它们的氘化的IS，来自含有吗啡(1)、可待因(codeine)(2)、氧可酮(3)、苯丙胺(4)、氢可酮(5)、甲基苯丙胺(6)、MDMA(7)、苯丁胺(8)和甲氧麻黄酮(mephedrone)(9)的强化血液样品的SRMLC/MS色谱图。

图8示出了在测试各种阿片类物质时血细胞比容水平为25％-65％的结果。

图9示出了吗啡(A)和芬太尼(B)的线性图。

图10示出了对于各种阿片类物质，来自20μl-50μl全血的体积采样的比较。

图11示出了对于各阿片类物质和(A)20μl，(B)30μl与(C)50μl全血的％RE和％CV。

本领域普通技术人员将理解，附图中的要素是为了简单和清楚而示出的，因此并未示出所有连接和选项以避免模糊本发明的方面。例如，通常不描绘可商业购买的实施例中有用或必要的常见但易于理解的要素，以便于更少地妨碍对本申请的这些不同实施例的观察。将进一步理解，可以以特定的发生顺序描述或描绘某些动作和/或步骤，而本领域技术人员将理解，实际上并不需要这样关于顺序的特定性。还应理解，这里使用的术语和表述是关于其相应的各自调查和研究领域来定义的，除非本文另有说明专门含义。

具体实施方式

现在将参照附图更全面地描述本发明，附图形成本发明的一部分，并且通过图示的方式示出了可以实践本发明的特定示例性实施例。提供这些图示和示例性实施例的理解是，本申请是一个或多个发明的原理的示例，并且不旨在将任何一项发明限制于所示的实施例。本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于这里阐述的实施例；相反，提供这些实施例是为了使本申请全面和详尽，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。

如本文所述的，示例性实施例描述的多层装置用于分离诸如全血的流体样品，并且针对感兴趣的分析物分析这种流体样品。基本上，所述多层装置是干燥的流体斑点装置，用于微采样、分离和分析干燥的流体斑点样品。如图2所示，多层装置或多层装置卡的一个实施例包括：(1)过滤膜单元，其具有指定用于流体样品收集的区域；(2)支撑层或顶盖，优选标记为用于样品识别；(3)收集材料；(4)支撑层或底盖。将流体样品施加到多层装置，其中流体样品可以是任何流体，优选生物流体，用于测试分析物的存在。流体或流体样品可包括但不限于全血、红细胞、血浆、血浆蛋白质组分、脑脊髓液、或可能含有感兴趣的分析物的任何流体等。本领域技术人员可相应地改变多层装置的部件以适应各种流体和所希望的分析物。例如，可以改变过滤膜的尺寸以捕获或分离感兴趣的分析物。

本领域可获得的干斑点卡样品具有局限性，特别是样品体积不一致，这可能对结果产生负面影响。在干血斑(DBS)技术中，可以通过采用整个斑点分析来解决依赖于血细胞比容(Hct)的问题，这会导致需要在卡上准确地点注(spotting)血液的体积。如果由经过培训的人员使用诸如体积移液管的精确的采样装置进行样品收集和点注，则可以容易地实现这一点。收集已知体积的手指刺血的替代方法包括“体积”毛细管采样系统(DBS System；Gland，Switzerland)，其通过引用如本领域中公开的文献被并入(Leuthold，LA等人，AnalChem.2015,8，2068-2071；R.Verplaetse和J.Henion，Anal.Chem.2016,88,6789-6796)。DBS系统从手指穿刺提供5.5uL的准确体积的全血。或者，可以使用体积移液管，如

移液管(Z683787Aldrich；

加移液管，可变容积；0.5μL-10μL；SIGMA-

CO)或玻璃毛细管(P2174Sigma；微毛细管

体积50μL)。

通常，如果样品收集是由未经训练的人员执行的，则将产生关键控制点以确保已收集了准确的样品体积。在这里描述的多层装置卡的应用中，特别是在层之间具有紧密接触的这种装置中，不一定需要精确的采样体积来获得准确且精确的定量。这里描述的多层装置可适应高达约50微升(μL)的宽流体样品体积范围，例如全血，甚至高达约100μL，而大多数市售或当前使用的装置仅可处理以微升计的个位数体积的血液(例如，5μL)。

允许紧密接触的书本型或其它多层装置卡提供灵活的采样容积的特征。观察到血浆浓度独立于血液中Hct水平，如Li等(Journal of Chromatography B-AnalyticalTechnologies in the Biomedical and Life Sciences 2015，991，46-52)所给出的。基于示例部分中的研究，从具有约30％血细胞比容(Hct)或60％Hct的血细胞比容水平的全血产生的血浆在纸基底上具有相同的扩展一致性，因此产生均质斑点。均质斑点不等同于相等的斑点尺寸。它指的是斑点内的血浆的均质饱和，而无关于斑点尺寸。这里描述的本发明的多层装置能够处理和加工灵活的体积和比现有技术中更大的体积，但不会不利地影响结果。事实上，所描述的多层装置提供的较大全血样品可导致较大的红细胞和血浆产率。例如，所施加的初始流体样品体积可以变化并且具有大约10微升的最小体积，并且可以在从大约10微升到大约100微升、大约10微升到大约75微升、以及大约25微升到大约50微升的范围内。

通常，血浆产率是低的，这使分析物的检测更困难。低血浆产率将小于约4μL，例如小于约2μL。然而，这里描述的多层装置可以提供大于约2μL，优选从约4μL到约38μL，包括约4μL-约15μL的血浆产率，这取决于最初施加的全血体积。存在可决定血浆产率的若干因素，包括初始全血体积、收集材料和由于扩散或泄漏引起的血浆损失。以较大的初始全血体积为起点导致产生大的血浆产率。最终的血浆产量也取决于用于血浆收集的收集材料-尺寸和材料类型。如果收集材料，优选纤维素或醋酸纤维素纸，较厚，则可以收集更大的体积，这是因为存在更大的表面积。平均来说，这里测试的多层装置的每全血的血浆为约0.303±0.007μL血浆/μL全血。多层装置允许大于0.100μL血浆/μL全血。而NOVIPLEX^TM卡产生0.100μL血浆/μL全血，其显著小于在所描述的多层装置中获得的量。此外，由于每个切口可适应大的体积，即，必要时大约10微升到大约100微升，每个样品的血浆产率/切口足够大以执行分析。其它卡可能需要多个流体样品的组合，以便实现单个样品的相同流体样品体积。

此外，在流体样品是全血的实施例中，所述多层装置能够处理大且宽范围的血细胞比容水平。血细胞比容(Hct)是血液样品中红细胞的比例。例如，具有30％Hct的20微升血液样品具有约6微升红细胞，而45％Hct具有约9微升红细胞，60％Hct具有约12微升红细胞，其余为血浆。本发明的使用单个过滤膜或组合的两个过滤膜的实施例，优选在一个实施例中使用不对称膜，这可提供处理具有约30％至约70％的血细胞比容范围的血液样品的能力。尽管可能较低或较高的血细胞比容水平也可以，但它们就膜过滤过程而言变得有问题并且将不那么有效率。优选全血样品具有的血细胞比容范围是约或大于约30％、约或大于约35％、约或大于约40％、约或大于约45％、约或大于约50％、约或大于约55％、约或大于约60％、约或大于约65％、约或小于70％、约或小于约65％、约或小于约60％、约或小于约55％、约或小于约50％、约或小于约45％、约或小于约40％、约或小于约35％。然而，也可利用血细胞比容水平为约或大于约20％和约或小于约80％的全血样品，但它们并不那么有效率。

一个实施例涉及一种多层装置，用于收集诸如全血的流体样品，用于测试感兴趣的分析物，例如但不限于，化合物、药物、药物代谢物、激素、病毒、核酸、DNA、RNA、mRNA、miRNA、蛋白质、细胞表面和细胞内标记等，或可通过任何已知方法或本文描述的包括例如光谱或色谱的任何方法检测的任何分析物。分析物的非限制性示例可以更具体地包括阿片类物质、大麻素、兴奋剂、体能增强剂(performance enhancers)、吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮、苯丙胺、甲基苯丙胺、甲氧麻黄酮、苯丁胺、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、芬太尼、它们的组合等。特别是在需要药物测试来确认运动员没有服用任何体能增强剂的运动竞赛中，本申请描述的方法和多层装置可用于收集和分离用于测试任何感兴趣的分析物的流体样品，包括但不限于外来物质和内生性生物标记物。

多层装置的另一方面是其收集和分析单个流体样品的各种组分的能力。在单个流体样品的多个位置中可以发现各种分析物，特别是如果流体样品可以分离成其多个组分。与现有技术的装置相反，这里描述的新型多层装置可有利地处理单个流体样品、单个流体样品的分别的组分，并且单独分析单个流体样品的分离组分。该双重功能对于加速大量分析物的测试和最大化单个流体样品的使用特别有益。多层装置的另一个优点是，任何体积的流体样品-例如全血-可以施加到多层装置，并且仍然导致定量结果，因为过滤膜单元包括允许预定体积的至少一个预定尺寸。与流过式(flow-through)洗脱技术结合，可以实现收集材料上收集的血浆的定量分析。可替代地，如果不使用流过式洗脱技术，则血浆斑点可以从收集材料中打孔(punched)出来，并且使用在产生校准曲线时用的相同斑点尺寸进行分析。因此所施加的样品体积的精度不像当前技术中通常认为的那样是一个要求。

另一实施例涉及一种具有双功能能力的多层装置，其中例如来自单个受试者的全血样品的施用导致含有收集或保留的例如但不限于红细胞、白细胞、血小板和其它细胞的细胞组分的层，以及含有收集或保留血浆的层。细胞组分可与样品中的血浆组分分开分析，其中每个层可含有在全血的不同组分中发现的不同分析物。例如，红细胞中的细胞表面蛋白质和其它成分以及包含在红细胞内的细胞内蛋白质、成分和药物可以与血浆成分分开分析。本发明的多层装置的双功能能力有利于其效率-采样和时间。由于多层装置可以容纳多个样品并且随后将多个样品分离成它们的细胞组分和它们的血浆组分，所以多个分析测试可以同时进行。

具有双功能能力的多层装置的一个优点是，其便于确定药物或感兴趣的分析物的红细胞与血浆的分开系数。另一个优点是同时进行多种药物或分析物的分析。来自单个受试者或多个受试者的流体样品可以同时处理和分析多种分析物，即，每个受试者样品放置或收集在多层装置的每个切口、阱(well)或开孔中。例如，4种阿片类物质和5种兴奋剂可以在包含单个受试者的流体样品的单一过程中同时测试。本发明的多层装置的多个层能够分离例如包括红细胞、血浆、血小板等的血液成分，以及在没有溶血的情况下处理宽范围的血细胞比容水平的全血样品。

在另一实施例中，这里描述的多层装置可以是书型格式，其在一边上铰接，并且各层构成书的页面。替换地，所述多层装置可在多于一边或边缘处，例如在多层装置的所有边或边缘上耦接或附接，并且任意或所有层都可以拆开或移除。本发明的多层装置可以是任何形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形、平行四边形、菱形、五边形、六边形、七边形、八边形等。所述多层装置的切口或孔可以是任何形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形、平行四边形、菱形、五边形、六边形、七边形、八边形等，只要——如果使用的话——顶盖和疏水膜的切口或孔是一样的。所述多层装置的优选形状为具有四个边缘的矩形，其中长边缘形成至少一个边缘或边，多层装置的各层可以铰接、耦接或附接于其上。呈矩形形状的多层装置的尺寸可以为约1英寸至约4英寸，优选约2英寸×约3英寸，例如约2英寸×3.3英寸。然而，还可以设想其它形状和尺寸。

一个实施例涉及一种多层装置或多层装置卡，其包括：

a)顶部单元，其中所述顶部单元包括相邻于疏水膜的过滤膜单元；以及

b)底部单元，其中所述底部单元包括收集材料，

其中所述顶部单元相邻于并连接到所述底部单元，所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜，所述过滤膜单元具有顶表面和底表面，并且所述疏水膜具有顶表面和底表面，其中所述过滤膜单元的所述底表面相邻于所述疏水膜的所述顶表面，其中所述收集材料具有顶表面和底表面，并且所述疏水膜的所述底表面相邻于所述收集材料的所述顶表面。

另一实施例提供一种多层装置，所述多层装置包括：

a)顶部单元，其包括以下层：具有至少一个切口的顶盖、过滤膜单元和具有至少一个切口的疏水膜；以及

b)底部单元，其包括以下层：不具有切口的收集材料和底盖，

其中所述顶部单元相邻于并连接到所述底部单元，所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜，优选两个具有减小孔径大小的过滤膜，每个过滤膜具有所述切口的形状，所述过滤膜单元位于所述顶盖的所述切口内并相邻于所述疏水膜，所述疏水膜相邻于或夹在所述过滤膜单元和所述收集材料之间，所述收集材料相邻于所述疏水膜，并且所述收集材料在所述底盖上方。在一个实施例中，所述过滤膜单元可以夹在所述顶盖和所述疏水膜之间。另一方面，所述收集材料可以夹在所述疏水膜和所述底盖之间。所述多层装置可以是具有四个边缘的矩形形状，其中所述顶部单元或底部单元的每个层临时耦接在至少一个边缘上，并且所述顶部单元或底部单元的每个层是可拆开或可移除的。在一个实施例中，所述过滤膜单元可以具有所述切口的尺寸和形状，装配在所述顶盖的每个切口或阱内，使得所述过滤膜单元的每个层通过所述过滤膜单元的边缘与所述顶盖的切口的壁紧密接触并且将所有层夹在多层装置中而保持就位。优选的实施例涉及这些过滤膜，这些过滤膜是圆形的以便装配在所述顶盖的圆形切口内，其中这些圆形过滤膜或盘在样品收集和分离后可容易地移除以用于进一步分析。例如，在将全血施加到所述多层装置的切口之后，允许全血经过足够的时间过滤通过所述过滤膜单元并收集在所述收集材料上。在一个实施例中，红细胞保留在所述过滤膜或盘上，而血浆收集在所述收集材料上。

多层装置的替代形式进一步包括相邻于且在所述收集材料下方和相邻于或在所述底盖上方的接触支撑层，或在另一实施例中，所述接触支撑层与所述底盖结合，使得所述各接触支撑部是所述底盖的一部分，并且所述接触支撑层的各接触支撑部优选地含有凸起的支撑部，其中所述凸起的支撑部的至少一部分装配在放置流体样品的所述切口内。进一步的实施例包括所述多层装置，所述多层装置还可以包括至少一个窗支撑件，用于被拆开用于后续分析的层，优选用于过滤膜单元和/或收集材料。窗支撑件可以是包含窗的层，该窗暴露所收集或捕获的样品以用于检测感兴趣的分析物，用于随后分析的所述层附接或耦接到所述窗支撑件，并且耦接到用于后续分析的所述层的所述窗支撑件可以从所述多层装置移除或拆开以用于后续的生物分析。一个实施例包括所述过滤膜单元的后续分析，其中每个过滤膜或其部分可以被转移以通过例如酶免疫测定(EIA)用于单独的分析物检测分析。另一实施例包括所述收集材料的后续分析，其中，例如通过诸如固相提取液相色谱串联质谱(SPE-LC-MS/MS)的液相色谱和/或质谱来分析来自全血样品的血浆。

涉及多层装置的实施例包括顶部单元和底部单元，其中所述顶部单元和所述底部单元相邻。所述顶部单元包括顶盖，其中所述顶盖可由刚性耐用的结构组成，如例如卡片；相邻的过滤膜单元，所述过滤膜单元最初通过顶盖的切口或开孔与流体样品的全血接触。一个实施例包括由至少一个过滤膜、优选两个相邻过滤膜构成的过滤膜单元。相邻于过滤膜单元且位于其下面的是疏水膜。所述多层装置的底部单元包括相邻于底盖的收集材料。在一个实施例中，所述多层装置可以是允许顶部单元与下面的底部单元持续或暂时接触的形式。所述顶盖可具有其中放置样品的至少一个切口或开孔，而所述底盖不具有任何切口。优选多个切口以测试来自单个来源的流体样品，例如来自受试者的全血，并且还包括用于同时测试的标准对照。

流体样品/过滤膜

一个实施例可涉及施加到过滤膜单元的流体样品，其中所述过滤膜单元通过多层装置的顶盖的切口、阱或孔暴露。所述过滤膜单元可以包括至少一个过滤膜，优选两个过滤膜，其中这两个过滤膜彼此相邻并且位于顶盖的切口边界内。如果切口或孔的形状为圆形，则优选的过滤膜单元包括至少一个圆形过滤膜盘。所述过滤膜可以是不对称的、非不对称的、不对称的和非对称的组合、或者每个的类似组合，即，一个或多于一个不对称的过滤膜或一个或多于一个非不对称的过滤膜。选择所述过滤膜单元，并且所述过滤膜单元以充分过滤和捕获流体样品组分的方式组成。优选地，例如，这里描述的多层装置包括将全血样品的组分分离的过滤膜单元，其中所述过滤膜单元捕获红细胞并允许血浆流过或穿过所述过滤膜单元。如果使用至少两个过滤膜，它们堆叠成使得存在上部过滤膜和下部过滤膜，并且，两个过滤膜都具有与顶盖和疏水膜的切口或孔相同的形状，如果使用的话。

所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜，所述过滤膜过滤约1微米至约10微米、约2微米至约5微米的颗粒。过滤膜具有顶表面或第一表面和底表面或第二表面以及足以允许过滤和/或捕获诸如来自全血样品的红细胞的期望颗粒的厚度，并且允许其它颗粒或诸如血浆的流体过滤流过。所述过滤膜可具有的厚度是约0.1mm至约0.6mm、约或大于约0.15mm、约或大于或小于约0.2mm、约或大于或小于约0.26mm、约或大于或小于约0.3mm。然而，如果所述厚度超过这些值，则可能发生过滤膜的阻塞或堵塞，从而抑制过滤。另一实施例涉及包含两个相邻过滤膜的过滤膜单元。当使用两个相邻的过滤膜时，第一过滤膜的底表面相邻于第二过滤膜的顶表面，其中样品进入所述第一过滤膜的顶表面并通过所述第一过滤膜的底表面离开，然后进入所述第二过滤膜的顶表面并离开所述第二过滤膜的底表面。

过滤膜可以是疏水性的，以避免吸收任何血浆，但在其他情况下也可以是亲水性的，和各向异性的，用于过滤和收集流体样品的期望组分。例如，全血样品的期望组分可包括但不限于红细胞和血浆。所述过滤膜可包括足以过滤和分离感兴趣的颗粒的任何材料。在一个实施例中，允许过滤全血组分的所述过滤膜可包括但不限于极性、非极性和中间极性聚合物(polymer)、聚酯(polyster)、聚砜(polysulfone)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)等，或者它们的混合物或组合物。

所述过滤膜用于过滤和分离流体样品的组分。当流体是全血时，所述样品可被分离成单独的组分，即红细胞、白细胞、血小板和血浆，并且收集例如红细胞用于进一步测试，同时允许诸如血浆的其它组分过滤通过所述膜。在本领域中已知红细胞的尺寸大于血浆或血小板，其中红细胞可以是约6微米(μm)-约8μm，而白细胞比红细胞大，即约12μm-约15μm。根据所需颗粒可以选择合适的过滤膜孔径大小。最靠近或相邻于疏水膜的过滤膜可具有足以收集或捕获全血的例如红细胞的组分的特性。本发明主题的多层装置的一个优点是其分离、收集和测试全血的单个受试样品或者多个受试样品的多于一种血液成分用于分别分析的新能力，其中所述装置适应大体积和宽血细胞比容百分比范围的全血样品。

另一个实施例涉及不对称的过滤膜，允许过滤全血样品，在过滤膜单元内分离不同大小的组分。例如，过滤膜单元及其过滤膜允许从全血样品分离和捕获红细胞，并允许血浆流过过滤膜单元并产生无细胞血浆。在多层装置的一个实施例中可以使用不对称的过滤膜。所述不对称的过滤膜具有允许大尺寸的和更小的颗粒进入所述膜的顶表面，而同一过滤膜的底表面具有更小的孔径大小，由此通过过滤或通过而除去小于过滤膜的顶表面的孔径大小并且大于底表面的孔径大小的任何颗粒，即捕获一些颗粒或允许小于过滤膜的底表面上的孔径大小的颗粒通过。另一实施例可涉及一种过滤膜单元，其包括至少一个不对称的过滤膜或至少两个不对称的过滤膜，其中所述不对称的过滤膜在顶表面处可以具有约5微米的孔径大小，并且在底表面处具有约2.5微米的孔径大小，从而在过滤膜中收集小于约5微米并且大于约2.5微米的粒子并且逐渐允许或过滤小于约2.5微米的粒子。又一实施例涉及在过滤膜单元中利用两个过滤膜进行连续过滤。一部分红细胞和大于5微米的任意颗粒可以在顶部或第一过滤膜上捕获，然后剩余红细胞和大于2.5微米且小于5微米的任意颗粒可以在底部或第二过滤膜上被捕获。

较低过滤膜的最佳性能可能采用大约一(1)微米的孔径大小而出现。在本发明的多层装置中，过滤膜孔径可以为从约1微米到约10微米。在一个示例中，上部顶部过滤膜可具有约10微米的孔径大小，从而提供较大颗粒的初步过滤并减轻下部过滤膜的阻塞，所述下部过滤膜可具有约1微米的孔径大小。

包含多层装置的单一过滤膜或含有两个过滤膜的双层过滤膜的过滤膜单元可处理多种流体样品。当在过滤膜单元中使用两个过滤膜时，第一过滤膜相邻于顶盖和第二过滤膜，其中第一最上面过滤膜可具有从约35微米至约3微米、约5微米的孔径大小，而相邻于或夹在第一过滤膜和疏水膜之间的第二、下部过滤膜的孔径大小可通常小于第一过滤膜的孔径大小。第二过滤膜的优选孔径大小范围可以是3微米至约0.2微米，约2.5微米。在两个过滤膜或双层过滤膜实施例中，所述过滤膜可以各自是不对称的或非不对称的，或者替换地，一个过滤膜是不对称的，另一个是非不对称的。

一个实施例包括由作为不对称膜的过滤膜单元组成的多层装置。另一个实施例涉及具有顶部单元的多层装置，其中所述过滤膜单元由两个过滤膜组成。在一个实施例中，顶部或最上面过滤膜层是可商购的产品

非对称5mm膜，其具有35μm顶部和5μm底部(International Point of Care Inc.；Toronto，Canada)，或具有类似性质或者足以过滤所需组分的性质的过滤膜。又一个实施方案涉及底部或最下面过滤膜，其为可商购的产品

不对称7mm膜，其具有35μm顶部和2.5μm底部(International Point ofCare Inc.；Toronto，Canada)，或具有类似性质或足以过滤所需组分的过滤膜。

疏水膜层

在一个实施方案中，疏水膜相邻于过滤膜单元或夹在过滤膜单元和收集材料层之间，其有助于样品与各种膜层的完全和直接接触并实现样品斑点均匀。尽管多层装置可以在没有此疏水膜的条件下成功地分离和收集各种全血组分，但是，特别是在这些层之间具有紧密密封或连接的那些多层装置中，包含疏水膜导致优异的结果。或者，疏水膜可位于收集材料的上方并相邻于收集材料。例如，在那些可能缺乏紧密或密切闭合的使用纸或纸板型盖的实施例中，在没有疏水膜的情况下，代替圆形斑点，过滤可导致收集材料上的马蹄形斑点，这对于优选的后续自动光谱分析并不是理想的。所述疏水膜可以是与整个多层装置具有相同大小、形状和尺寸的层，并且包含与顶盖中的切口相同大小、形状和尺寸的切口或孔。所述疏水膜可由疏水的任何材料组成，优选是聚酯、聚酯混合物、聚砜或聚碳酸酯等。所述疏水膜层可以是足以帮助各个层的放置和容纳以避免移动或位移以及有助于样品点均匀性的任何材料或膜。在一个实施例中，疏水膜位于过滤例如红细胞的全血组分的过滤膜单元下面且相邻于所述过滤膜单元，所述疏水膜可优选由聚酯或聚酯混合物组成，更优选地由Ahlstrom

等级3256无纺聚酯(Ahlstrom Filtration；Mount HollySprings,PA)，其具有约0.058毫米的厚度和约23.9g/m的基重。

收集材料层

位于疏水膜层下面的有用的多层装置的另一层是收集材料层，其充当用于从小体积的最初施加的流体样品收集过滤的所需组分的容器。在干燥所收集的样品之后，在收集材料上形成的干燥斑点允许用于将来定量分析的方便的存放装置。全血的其它组分在收集材料之前或者其上方的各层中与血浆分离。所述收集材料用于吸收和/或收集从全血样品的过滤取得的血浆。所述收集材料具有允许捕获和收集血浆的特征，例如优选在约35微米至约0.2微米范围内的孔径大小和约0.1毫米至约0.6毫米，优选约0.19毫米的厚度。所述孔径大小可以是表示吸收率的程度的因素。在优选的实施例中，所述收集材料可以由纤维素、由棉绒纸浆(cotton linter pulp)制成的纸纤维素组成，并且也可以是但不限于醋酸纤维素的材料，或者在WHATMAN 903(

Springfield Mill,United Kingdom)，

226(

Corporation,Helsinki,Finland)等中使用的材料。在多层装置中使用的优选的收集材料是

601纤维素纸(AhlstromFiltration；Mount Holly Springs,PA)；然而，也可以使用能够从全血样品分离和收集例如血浆或具有与纤维素纸类似性质的任何材料。纤维素纸优选作为收集材料的原因是其将斑点集中在切口区域内的能力，对避免所收集的样品中的不期望的化学物质(例如，用于疾病控制和预防(CDC)的中心测试并且证实了用于干燥的斑点卡的纯度)的作用，以及她的对在收集的样品中发现的药物或感兴趣的分析物的稳定化性质。稀释样品斑点的收集材料层是易碎的，并且具有未知的稳定化性质，对于本发明不是理想的或有用的。在样品的干燥阶段，药物和其它化学物质的酶分解被最小化。然而，药物或其他化学分析物可能由于氧化而仍然分解。在一些情况下，化学品，例如大麻素，在暴露于空气和水分时是不稳定的，因此在全血样品收集和测试技术中需要确保稳定性。通常可以使用惰性气氛(即，除去氧气)或使用硅胶干燥剂。为了描述的多层装置及其用途，惰性气氛例如但不限于，保存在防漏容器中的氮气或氩气，在样品收集期间不是必需的，而是可以使用。在没有惰性气氛的情况下收集样品期间，多层装置上的分析物的稳定性是足够的。在样品已经干燥后的样品运输和包括数月或数年的长期存放的存放期间，干燥剂或惰性气氛的存在可能是有益的。与含有样品的多层装置包装在一起的干燥剂不影响对感兴趣的分析物的测试结果。然而，对于长期维护或存放，填充有例如惰性气体的附加存放装置可用于存放多层装置，特别是过滤膜单元和收集材料层，从而提供在干燥的斑点样品中的分析物的化学稳定性。虽然特定分析物在样品收集和/或存放期间可能需要惰性气氛或干燥剂，但是通常它们不是必需的，并且尤其在收集样品时的大多数现场设置中是这样。

支撑层

这里描述的多层装置的其它层可以包括支撑多层装置的那些层。将顶部单元和底部单元夹在一起的这种多层装置的盖或支撑盖可以由刚性耐用的结构制成，例如但不限于，卡片构材、聚合物、塑料、尼龙、聚酰胺、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)等。具体地，3D打印的多层装置的某些层可以使用聚合物、塑料、尼龙、聚酰胺、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)等制造。支撑盖可以由上盖或顶盖和下盖或底盖组成，其中上盖是相邻于过滤膜层或在过滤膜层上方的最上层，其中底盖是位于收集材料层下面的最底层，或在一些实施例中是接触支撑层。顶盖优选地具有至少一个切口，使得过滤膜单元被暴露。另一个实施例涉及一种多层装置，其包括含有暴露过滤膜单元的至少两个切口的顶盖。一个优选实施例涉及具有暴露过滤膜单元的四个切口的顶盖。然而，切口的数量可以通过多层装置的大小和尺寸以及在顶盖上可以容纳的切口的数量来确定。所述顶盖可具有至少一个切口、至少两个切口、至少三个切口，并且优选地具有至少四个切口。相反地，所述底盖不包含任何切口。确切地，所述底盖是实心结构，以便为底盖的顶部上的所有在前的层提供支撑。

所述顶盖可具有切口，使得所述过滤膜单元层被直接暴露。当施加流体样品到多层装置的过滤膜单元时，流体样品形成在顶盖切口的周缘内侧或之内的斑点。所述过滤膜单元是其尺寸与所述切口的尺寸相同或大致相同的层，可以延伸超过所述顶盖切口的周缘，或者与整个盖支撑层和多层装置的周缘作为一个整体相同。例如，多层装置可具有顶盖和过滤膜单元，其中所述顶盖具有圆形切口，每个切口具有例如约5mm的直径，所述过滤膜单元具有类似的圆形形状，其直径与所述顶盖的直径相同，即，约5mm，使得所述过滤膜单元装配在所述顶盖切口的周缘和区域内。替代地，所述过滤膜单元是具有延伸超过所述顶盖切口的周缘且达到所述盖的周边边缘的尺寸的层。另一实施例涉及一种包括至少一个过滤膜层的过滤膜单元，所述过滤膜层呈圆盘形状，即，装配在所述顶盖的切口内的切口的形状。如果所述多层装置是尺寸为大约2英寸×大约3英寸的矩形形状，在另一个实施例中，过滤膜单元层可具有相同的形状和尺寸，其中所述顶盖切口暴露所述过滤膜单元的一部分。在一个实施例中，所述切口的轮廓可以描绘在所述多层装置的一个或多个层上，例如所述过滤膜单元、所述疏水膜和所述收集材料的任意或所有层。

所述盖和中间层优选地耦接在与书脊类似的一边上，其中每个中间层可移除地可拆开。替换地，所述盖的所有边缘均以闭合位置形式耦接或临时耦接。例如，任意或所有边缘可以被穿孔以允许分离和移除所述层中的任意层。当所述多层装置的所有层都被耦接并且所述顶部单元和底部单元闭合并且接触时，稳定的书本型卡可以用于样品收集。

所述多层装置的一个实施例涉及一种用于处理全血流体样品、分离血液组分和检测分析物的矩形书本式卡。产品的各层包括将中间层夹在中间的顶盖和底盖，其中所述顶盖具有四个切口、阱或开孔，并且所述顶部支撑盖和底部支撑盖连接或铰接在所述多层装置的至少一边或边缘上。过滤膜单元位于所述顶盖下方并且相邻于所述顶盖，并且包括第一过滤膜和第二过滤膜。在所述顶盖中存在切口的任何地方，过滤膜单元的第一过滤膜被暴露。否则，所述顶盖覆盖所述第一过滤膜和下面的层。另一过滤膜或第二过滤膜相邻于第一或最顶部过滤膜并在其下方，使得流体样品从所述第一或最顶部过滤膜的顶表面向下流动并通过所述过滤膜单元的第二过滤膜的底表面。疏水膜层位于过滤膜单元下面并且与所述过滤膜单元相邻，并且所述疏水膜层也具有与所述支撑盖相同的尺寸。所述过滤膜单元和下面的疏水膜可以一起临时耦接在顶盖上，形成顶部单元。这种构造允许所述过滤膜单元和疏水膜下面的所有层在所述顶盖被提升时同时一起提升。任意或所有层可从书本式多层装置移除以用于后续分析。例如，所述过滤膜单元和收集材料层可以在至少一个边缘或边上临时附接或穿孔，并且在穿孔处被移除或撕下，从而分离所述层用于后续分析。

收集材料层相邻于且位于所述书本型多层装置卡中的疏水膜层下方，并且所述收集材料层可缺少或优选具有描绘所述顶盖中的圆形切口的轮廓，使得用户可观察样品最初放置在何处且含有从全血样品提取的血浆。

另一实施例可包括用于自动分析的窗支撑层，优选地，可在线处理的(online-amenable)窗支撑层，其耦接到所述收集材料，使得所述窗支撑层具有暴露所述收集材料的开口或窗，特别是圆形轮廓的切口，此处从全血分离的血浆形成了斑点。所述收集材料的尺寸可以小于所述盖的尺寸或者与所述盖的尺寸相同。所述窗支撑件可具有可识别的标记，例如但不限于包括QR码或快速响应码的条形码，其包含样品编号、采样患者或受试者识别符或名字，或用于识别样品的任何其它信息，以及包含但不限于时间跟踪、文档管理、URL(统一资源定位符)、GPS(全球定位系统)的任何其它信息等。

在一个实施例中，具有开口或窗的窗支撑层，优选为可在线处理的窗支撑层，可以定位于所述疏水膜层的下面或与其邻近。收集材料可具有固定或耦接到所述可在线处理窗层的下侧的边界，使得过滤了所述收集材料的样品斑点的轮廓圆形通过所述可在线处理窗支撑层的所述窗开口被暴露。非泄露表面区域可以通过将所述收集材料的周缘固定到所述窗层的下侧来实现，在此处，所述收集材料周缘形成延伸超过窗开口的紧密的、非泄漏的物理接触。耦接到所述收集材料的可在线处理窗层可通过至少一个穿孔边缘一起从所述多层装置移除，其中所述至少一个穿孔边缘还形成书本型多层装置的脊。在不影响收集材料的内容物的情况下，所述可在线处理窗层与收集材料可以通过在穿孔处撕下来从所述多层装置移除。替换地，可在线处理窗层包括将所述收集材料夹在中间的两个层，其中所述收集材料的轮廓圆形切口通过可在线处理窗层的两层中的每一层上的窗暴露。将所述收集材料夹在中间的共同的两层式可在线处理窗层可以从所述多层装置移除或拆开用于进一步分析，特别是分析感兴趣的分析物。

在多层装置中可使用的另一支撑层是接触支撑层，其包含与在整个多层装置构造中发现的相同数量的切口。该接触支撑层凸起以帮助流体样品接触所述多层装置的所有层。即使没有该支撑层，也可以实现全血组分的过滤和分离。然而，包括该凸起的支撑层确保了过滤膜、疏水膜和收集材料层的物理接触，从而有助于形成均匀的样品斑点和收集的产率。当多层装置的顶部单元和底部单元在闭合构造中接触时，所述凸起的接触支撑层通过所述各层的物理接触来辅助完全过滤。在另一实施例中，确保所述过滤膜单元与所述收集材料之间的物理接触的接触支撑层可以相邻于在所述窗支撑层的窗或多个窗内的收集材料部分或在其下方。该接触支撑层可以包含由例如卡片构材、塑料或任何相对刚性或类似材料制成的凸起盘，其中所述顶层切口位于并且也与所述收集材料的轮廓圆形切口一致。所述凸起的接触支撑件可以包括不同尺寸的盘或凸起平台，其中一个可以是切口的尺寸，并且下面的平台的直径可以稍大于切口尺寸。替代的构造可以包括具有与顶盖和底盖相同尺寸的整个支撑层，使得所述支撑层的凸起部分与圆形样品切口位置对准并且所述支撑层的剩余区域不升高并且延伸到所述顶盖和底盖的尺寸。另一实施例包括含有接触支撑件的底盖，从而为所述底盖提供双重功能。

另一实施方案包括如在主题多层装置中所描述的所有特征，并且另外包括耦接或相邻于包含全血样品的不同组分的过滤膜的另一窗支撑层。当从所述多层装置移除或拆开时，共同的窗支撑层和过滤膜允许后续分析感兴趣的分析物，类似于共同的窗支撑层和收集材料。

在该书本式多层装置卡的实施例中，底部单元可包括窗支撑层、收集材料、接触支撑层和后盖，其中所有层临时耦接或可移除地耦接在所述书本式多层装置的相同边缘或边中的至少一个上。所述共同的底部单元可以在需要时与所述顶部单元接触，或者可以以允许拆开或移除所述多层装置的任何或所有层的方式分离。

另一实施例可涉及一种多层装置，包括：

a)顶部单元，其中所述顶部单元包括过滤膜单元；以及

b)底部单元，其中所述底部单元包括至少一收集材料，

其中所述顶部单元连接、耦接或固定到所述底部单元，所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜，所述过滤膜单元具有顶表面和底表面，其中所述收集材料具有顶表面和底表面，并且所述过滤膜单元的所述底表面相邻于所述收集材料的所述顶表面或在其上方。所述顶部单元可以任选地包含疏水膜，其中所述疏水膜位于所述过滤膜单元下方或相邻于所述过滤膜单元，并且在所述收集材料上方或相邻于所述收集材料。该多层装置可以使用卡片构材或任何其它坚固的结构或替代地通过增材制造或3D打印来制造。

另一实施例提供了一种多层装置，包括：

a)顶部单元，其包括以下层：具有至少一个切口或孔的顶盖，和在每个切口内的过滤膜单元；以及

b)底部单元，其包括以下层：收集材料和底盖，

其中所述顶部单元连接、耦接或固定到所述底部单元，所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜，优选两个具有减小孔径大小的过滤膜，每个过滤膜具有所述切口或孔的形状。至少一个切口或孔可以是任何形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形、平行四边形、菱形、五边形、六边形、七边形、八边形等，只要在使用时所述顶盖的切口或孔和疏水膜的相同，所述过滤膜单元优选定位在所述顶盖的所述切口或孔内并相邻于所述底部单元，所述过滤膜单元与所述收集材料相邻，并且所述收集材料位于所述底盖上方并相邻于所述底盖。在一个实施例中，所述过滤膜单元可以夹在所述顶盖和所述底部单元之间。或者，所述过滤膜可具有不同于所述顶盖和/或疏水膜的切口或孔的形状。例如，在一个实施例中，所述顶盖的孔或切口是圆形的；然而，位于所述顶盖的孔或切口下方的所述过滤膜单元是矩形的，尺寸选定为足以在下方跨越至少一个孔或切口，并且优选在下方跨越所述顶盖的所有孔或切口。然而，在该实施例中，所述矩形过滤膜单元具有边界或界限，以在将流体样品施加到顶盖的切口或孔之后使样品斑点集中,并防止所述过滤膜单元吸收血浆。包括含有边界或界限的过滤膜单元可允许除去疏水膜，但可任选地仍用于提高有效性。如果使用疏水膜，则所述疏水膜具有如在所述顶盖中存在的一样多的切口或孔，并且具有与所述顶盖中的切口或孔相同的形状和尺寸。如果使用疏水膜，则所述疏水膜优选在所述收集材料下面且与其相邻；然而，在另一实施例中，所述疏水膜可以位于所述收集材料上方且相邻于所述收集材料。另一方面，所述收集材料可以夹在所述顶部单元和所述底盖之间。所述多层装置可以是具有四个边缘的矩形形状，其中所述顶部单元或底部单元的每个层临时耦接在至少一个边缘上，优选地耦接在至少两个边缘上，并且更优选地耦接在至少四个边缘上，并且所述顶部单元和底部单元的每个层是可拆开或可移除的。该多层装置可以通过3D打印来制造。

另一个实施例包括用于分离血液组分的3D打印的多层装置，包括：

顶部单元，其包括以下层：具有四个(4)切口的顶盖，和至少一个过滤膜，其中所述至少一个过滤膜呈装配在所述四个切口中的每一个内的盘的形式；和

底部单元，其包括以下层：固定到窗支撑件的收集材料，和具有接触支撑件的底盖，

其中所述顶部单元相邻于所述底部单元并且紧密地耦接或连接到所述底部单元，将在此描述的多层装置的中间层夹在中间，其中足以分离血液组分的每个过滤膜定位在所述顶盖的每个所述切口内并且相邻于所述底部单元，所述过滤膜的每个盘与所述收集材料相邻，并且所述收集材料位于含有凸起的接触支撑件的所述底盖上方并且相邻于所述底盖。在一个实施例中，所述过滤膜可以夹在所述顶盖和所述底部单元之间。所述收集材料可以夹在所述顶部单元和具有接触支撑件的所述底盖之间。所述多层装置可以是具有四个边缘的矩形形状，其中所述顶部单元和底部单元的每个层临时耦接在所述多层装置的至少两个边缘上，并且所述顶部单元和底部单元的每个层与其相邻层紧密接触，并且每个层是可拆开的或可移除的。

一个实施方案可以涉及将约20微升全血施加到多层装置的每个切口内的过滤膜盘(约9mm厚度)，并在室温下温育约3分钟。一旦分离的血液组分已经干燥，则拆卸所述多层装置，移除过滤膜层和收集材料层。对一个或多个过滤膜盘进行其上收集的红细胞的细胞分析，并且对所述收集材料上的已经干燥的血浆斑点进行化学分析。

在一个实施例中，所述多层装置包括3D打印的顶盖、底盖和窗支撑件，其中所述底盖包括接触支撑件，所述接触支撑件可通过所述窗支撑件而与覆盖打开窗的收集材料层物理接触。所述顶盖包括至少一个切口，优选4个切口，其中过滤膜单元放置在所述切口中，并且所述过滤膜单元包含至少一个过滤膜盘，优选两个不对称过滤膜盘，其装配在所述顶盖的切口内。在堆叠两个不对称过滤膜盘形成过滤膜单元的情况下，一个过滤膜盘位于另一个过滤膜盘的上面，形成包括上部过滤膜盘和下部过滤膜盘的过滤膜单元，其中每个过滤膜盘具有顶表面和底表面，其中流体样品最初与所述上过滤膜盘的顶表面接触，所述下过滤膜盘的底表面相邻于收集材料层，而所述过滤膜单元位于被夹在所述顶盖和所述收集材料之间的疏水膜的周缘内。替代实施例设想了过滤膜单元层，即，不呈盘形式，其中所述过滤膜单元层包含边界或界限以使样品斑点居中并且防止所述过滤膜单元吸收血浆，从而消除对疏水膜的需求。优选地，包括两个过滤膜盘的过滤膜单元的底表面可以流体连接到收集材料层，该收集材料层附接或固定到窗支撑件，其中所述收集材料覆盖所述窗支撑件的打开窗。所述窗支撑件可以延伸超过所述收集材料层到达所述顶盖层的边缘。通过所述窗支撑件的窗，底盖的接触支撑件放置成与所述收集材料层接触。

一种3D打印的多层装置，包括：

(a)顶部单元，其包括以下层：顶盖，所述顶盖具有至少一个孔，优选为四个孔；过滤膜单元；和疏水膜，所述疏水膜具有至少一个孔，优选为四个孔，其中所述顶盖的孔的数量与所述疏水膜的孔的数量相同；以及

(b)底部单元，其包括以下层：收集材料；窗支撑件和具有凸起接触支撑件的底盖，

其中所述顶部单元连接或紧密耦接到所述底部单元，将所述多层装置的中间层夹在中间，其中所述过滤膜单元包括两个过滤膜盘，其中所述过滤膜单元包含上部过滤膜盘和下部过滤膜盘，其中每个过滤膜盘包含顶表面和底表面，所述上部过滤膜盘的所述底表面相邻于所述下部过滤膜盘的所述顶表面，其中所述过滤膜单元分离或充分分离血液组分，并且同心地定位在所述顶盖的所述四个孔中的每一个孔的周缘内，并且所述过滤膜单元同心地定位在所述疏水膜的所述四个孔中的每一个孔的周缘内；所述疏水膜相邻于所述顶盖并且所述疏水膜相邻于所述收集材料，并且所述收集材料相邻于所述底盖的所述凸起的接触支撑件。所述多层装置包括有顶盖、窗支撑件和底盖的3D打印层。

在另一实施例中，多层装置可包括有顶盖和底盖的3D打印层，其中所述顶盖包括至少一个孔，优选四个孔，其中过滤膜单元包括至少一个过滤膜盘，优选两个过滤膜盘，其中所述过滤膜单元包括上部过滤膜盘和下部过滤膜盘，其中每个过滤膜盘包含顶表面和底表面，所述上部过滤膜盘的所述底表面相邻于所述下部过滤膜盘的所述顶表面，其中所述过滤膜单元同心地定位在所述顶盖的所述四个孔中的每一个孔的周缘内，以及

所述底盖包括槽或阱，所述槽或阱具有唇缘以紧固收集材料或替代地紧固疏水膜和所述收集材料，其中所述疏水膜相邻于所述顶盖和所述收集材料，其中所述槽或阱包含定位成与所述顶盖的所述孔对准的凸起的接触支撑件，且如果存在，所述凸起的接触支撑件定位成与所述疏水膜的所述孔对准，所述疏水膜与所述顶盖相邻，并且所述疏水膜与所述收集材料相邻，和所述收集材料，并且如果存在，所述疏水膜紧固在所述槽或阱内，使得所述过滤膜单元和收集材料流体连接，并且所述顶盖耦接、固定或紧固到所述底盖。

所述过滤膜单元优选包括至少一个过滤膜，所述至少一个过滤膜呈盘形式，其预先成型并包含预定体积的样品。收集材料层的定量分析可以通过使用如下系统来实现，即该系统利用伴随质谱分析的收集材料层上的全血血浆组分的流过式洗脱；或可选地，对包含血浆的收集材料的一部分进行打孔。只要经过打孔的样品斑点尺寸与在校准曲线样品中使用的尺寸相同，收集材料层的斑点尺寸是无关紧要的，因为预定体积的流体样品被施加到所述过滤膜单元，即过滤膜预先成型盘。当在不使用例如体积式移液管或微吸液管的体积控制装置的情况下将刺指全血施加到多层装置时，这是特别有利的。由于在缺少这样的体积控制的情况下通常流体样品的体积可能存在变化，所以可以通过打孔出用于分析的收集材料的预定斑点尺寸并对校准样品应用相同的斑点尺寸来分析由不同体积的血液产生的血浆斑点尺寸。因此，干燥的血浆斑点或相同尺寸的样品和校准斑点的流过式洗脱被用于除流过式洗脱之外的技术以进行后续分析。

如果整个血浆斑点代替子斑点用于分析，定量分析也可以在两个条件下实现，即使用诸如移液管的体积控制装置来施加已知体积的全血样品和调整全血样品的血细胞比容水平。这些条件允许固定尺寸的血浆斑点。因此，整个血浆点可用于定量分析。

一种3D打印的多层装置，包括：

(a)顶部单元，包括以下层：顶盖和过滤膜单元，其中所述顶盖具有至少一个孔，优选地具有四个孔；所述过滤膜单元包括至少一个过滤膜盘，优选两个过滤膜盘，并且所述过滤膜单元位于所述顶盖的每个孔中；以及

(b)底部单元，包括以下层：收集材料和底盖，其中所述底盖具有凸起的接触支撑件，

其中所述顶部单元相邻于并紧密耦接或连接到所述底部单元，将所述多层装置的中间层夹在中间，其中包含两个过滤膜盘的所述过滤膜单元包括上部过滤膜盘和下部过滤膜盘，其中每个过滤膜盘包含顶表面和底表面，所述上过滤膜盘的所述底表面相邻于所述下过滤膜盘的所述顶表面，其中所述过滤膜单元同心地定位在所述顶盖的每个孔的周缘内，并且所述过滤膜单元同心地定位在每个凸起的接触支撑件上方，所述收集材料相邻于所述收集材料，所述底盖定位在所述顶盖的每个所述切口内，所述过滤膜单元相邻于所述收集材料，并且所述收集材料被紧固到所述底盖并相邻于所述底盖，所述底盖包含凸起的接触支撑件。

该3D打印的多层装置可以是一次性的，以避免样品之间的污染，或可替换地，使用新的或未经使用的过滤膜盘和收集材料，进行仔细消毒和清除污染以便多次使用。优选的实施例涉及3D打印的多层装置，其使用产生在此描述的多层装置的多种方法中的任一种来制造，其使得这里描述的多层装置使所收集的样品保持安全或防篡改。

多层装置的方法/用途

另一实施例可以涉及使用多层装置针对感兴趣的分析物分析流体样品的用途或方法。一种方法包括将诸如全血的生物流体样品施加到过滤膜单元的顶表面，通过将样品过滤一允许足以使流体样品穿过过滤膜单元并收集在收集材料上的时间量，将所述过滤膜单元与所述收集材料分离，使得例如红细胞被捕获或收集在所述过滤膜单元上和血浆被捕获或收集在收集材料上，并且通过手动或在另一实施例中通过自动装置，针对希望的目标分析物来分析所分离和收集的样品。例如，所述分析可以是自动化的和在线的，其中通过液相色谱(LC)、质谱(MS)、LC/MS、LC/MS/MS等分析目标分析物。在分析之前，在一个实施例中，所述分析物可以通过直接洗脱和固相提取(SPE)来提取。流体样品可以是小体积的，小于约70μl、约或小于约50μl、约或小于约25μl等。该方法的优点在于，该方法可以在不用离心分离的情况下执行，并且是快速且准确的方法。

另一实施例涉及一种使用多层装置的方法，所述方法包括：

a)将灵活体积的流体，例如一定体积的全血，施加到多层装置，所述多层装置包括：(i)顶部单元，其包括以下层：顶盖、过滤膜单元和疏水膜，其中，所述顶盖具有至少一个切口或开孔，流体样品被放置在所述切口或开孔上或其中；和(ii)底部单元，其包括以下层：收集材料和底盖，其中所述底盖不具有切口或开孔，其中所述过滤膜单元通过所述多层装置的顶盖的切口暴露，其中所述顶部单元与所述底部单元相邻，其中所述顶部单元和所述底部单元可以以物理接触方式闭合，其中所述流体样品具有从约10微升到约50微升范围的灵活体积，其中所述多层装置包括至少一个过滤膜、疏水膜和收集材料；

b)在施加所述流体样品之后，等待约3分钟或足以过滤所述流体样品的一段时间，其中所述顶部单元与所述底部单元以闭合形式接触；

c)从所述多层装置分离或去除所述过滤膜单元层和/或所述收集材料层，其中所述过滤膜单元和所述收集材料各自包含所述流体样品的不同组分；

d)等待约30分钟，或直到所述过滤膜单元和所述收集材料上的流体样品的组分充分干燥；以及

e)针对感兴趣的分析物，分析包含干燥的流体样品的所述过滤膜单元和/或所述收集材料。

另一实施例涉及使用多层装置的方法，包括：

a)将一定体积的全血施加到所述多层装置的所述过滤膜单元：

b)等待足以分离所述全血的血液组分的时间量；以及

c)存放所述多层装置，

和任选地，输送所述多层装置用于分析。

例如，需要测试兴奋剂的运动员可以获得在此描述的多层装置，并且在使用手指穿刺技术将一定体积的全血施加到所述切口中的每个切口并等待足以分离全血样品的血液组分或使血液组分干燥的时间量之后，运动员将适当地存放所述多层装置并且将所述多层装置返回或送到现场或单独的设施以执行分析，从而确定运动员是否干净，即，全血样品不存在任何未经授权的药物或生物组分或兴奋剂，或全血样品存在未授权的药物或生物组分。

一旦设备接收了其上含有样品的多层装置，该方法还包括：

d)从所述多层装置分离所述过滤膜单元和所述收集材料，其中所述样品已被分离和干燥；以及

e)分析包含所述样品的所述过滤膜单元和/或所述收集材料。根据测试也可以利用内部标准、阳性对照和阴性对照。

在全血样品已经在这里描述的多层装置中被收集、分离和干燥之后，所述过滤膜单元和收集材料可以使用本领域常用的和已知的技术从所述多层装置分离，用于单独分析。这些技术中的一些技术包括但不限于液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)、具有UV检测的高性能液相色谱(HPLC)、液相色谱-高分辨率质谱(LC-HRMS)、液相色谱-渡越时间/质谱(LC-TOF/MS)、超性能液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)，HPLC-二极管阵列检测(HPLC-DAD)、气相色谱-负离子化学电离质谱(GC-NICI-MS)、具有增强灵敏度的HPLC荧光检测器(HPLC-FLU)、LC/MS、电喷电离-TOF(ESI/TOF)、辅助矩阵激光解吸和/电离-TOF(MALDI/TOF)、四极渡越时间(QTOF)、离子阱、轨道阱(OrbiTrap)、电感耦合血浆/MS等。

在流体样品或全血样品通过所述顶盖的至少一个切口施加到过滤膜单元时，所述多层装置可以处于打开或闭合形式。当包括顶盖、过滤膜单元和疏水膜的顶部单元与包含收集材料层、任选的窗支撑件、任选的接触支撑件和底盖的底部单元通过所述疏水膜和所述收集材料接触时，多层装置呈闭合形式。若所述顶部单元和所述底部单元不接触，即所述顶部单元的疏水膜和所述底部单元的收集材料分离或缺少接触，则多层装置可能呈打开形式。一个实施例涉及一种多层装置，当施加一定体积的流体样品时，所述多层装置处于闭合形式。另一个实施例涉及一种多层装置，当施加一定体积的流体样品时，所述多层装置最初处于打开形式，然后在施加之后立即开始闭合，并且在分离所述各层之前持续优选约3分钟的初始等待时间。所述初始等待时间段可以是大约或大于大约3分钟或足以允许过滤整个流体样品的任何时间。

本发明的多层装置的一个优点是不使用离心作用分离诸如全血的流体样品的不同组分。离心分离全血样品允许例如红细胞与血浆分离。然而，这是麻烦的步骤，而且需要非常大的流体样品体积。这里描述的多层装置允许在不使用离心作用或过大流体样品体积的情况下快速获得血浆的简单方法。因此，在一个实施例中，该简单的应用允许反兴奋剂中的赛内和赛外测试。该应用的另一实施例是在例如药物技术中的药物发现和开发的用途。

现有技术中可用的方法中的障碍在于样品体积必须是一致的并且在有限的体积范围内。如果施加过少或过多的流体体积用于测试，则分析可能不准确或可能具有无效结果。然而，本发明的多层装置的优点之一是其用于精确且定量地处理宽且灵活的施加体积的能力，其中排除了保证在样品收集期间采样的精确体积的需求。所述多层装置的鲁棒性大大优于现有技术中的当前方法。例如，对受试多层装置有用的灵活样品施加体积可以是但不限于约10微升到约50微升全血，其中多层装置的每个切口区域可以接收变化的体积但仍然产生精确的分析。

用于后续分析的所收集样品的不幸的低体积是本领域中的另一阻碍。然而，在有利的实施例中，发现这里描述的受试多层装置不仅能够处理大的和灵活的样品体积，而且能够从所述收集材料收集大体积的例如血浆。例如，收集的体积可以是但不限于大约或大于大约4微升到大约15微升，例如大约4.6微升到大约14.7微升。表3显示了初始全血体积和使用包括两个过滤膜的多层装置得到的收集血浆，其中0.3微升血浆/微升血液比现有技术大大约3倍。所收集的红细胞(RBC)的量是施加于这里描述的多层装置的全血的体积和所收集的全血样品的血细胞比容的直接函数，其中，施加于多层装置的全血的体积例如是从手指穿刺可获得约5μl-约100ul、更一般地约10ul-约50μl。血细胞比容为血液中红细胞的百分比，其余为血浆。血细胞比容在全血样品中可以为约30％至约80％，更一般地约30％至约60％。

这里描述的多层装置克服了有关样品收集的问题。由于仅需要小的流体样品体积用于测试，所以不需要抽血。例如全血的样品可通过首先用酒精湿巾消毒待穿刺的区域并用消过毒的一次性刺血针穿刺手指或脚跟区域来获得，也被称为全血微采样。微采样是主要用于诸如啮齿动物、狗、马和人的哺乳动物的技术，该技术不管受试者的大小对受试者没有任何可观测的影响，减少了所收集的常规血液体积。微采样的这些益处对于极其严重的病人、新生儿和早产婴儿是特别相关和重要的，其中血液样品的定期收集对婴儿的安康可能是有害的。与到目前为止已成为惯例的采集毫升体积的样品相比，从这样的患病婴儿收集微升体积的多个样品用于诊断测试对其身体的要求更低，对其身体的损害更小。小的液体样品可以通过这种技术收集，包括但不限于毛细管微采样、芯片上实验室装置和其它小体积装置。对于血液(干燥的血液斑点-DBS)、血浆(干燥的血浆斑点-DPS)、或汗液、尿液、精液、羊水、泪液等也可以收集干燥的基质斑点，用“X”表示(干燥的X斑点-DXS)。

液体血浆微采样是一项包含使用例如

涂覆毛细管收集全血的技术，优选含有聚合物塞，并且对所述管进行离心以获得血浆与红细胞的分离(取决于样品大小，红细胞可达到约70微升的量)(Bowen，C.L.等(2012)Proc.Of the 60^th ASMS Conference onMass Spectrometry.Vancouver，BC.WP 493)。尽管全血的毛细管收集在所描述的发明中可能是有用的，但需要离心作用的完整技术不是优选的方法，因为它不提供关于分离的时间或成本高效的手段并且需要离心分离的附加步骤。而且，与用于收集和分离全血细胞样品的本发明方法相比，液体血浆微采样不提供运输和存放成本的任何节省。

本发明的多层装置克服的本领域中的另一个问题在于，具有大且宽血细胞比容范围的全血的过滤。在一个实施方案中，本发明有利地通过新型多层装置过滤具有约30％至约60％血细胞比容水平的宽和高的血细胞比容水平的全血，但不引起任何溶血。较宽的血细胞比容范围也可被过滤而不具有任何不利的结果。独特的过滤膜单元结构允许处理这种宽的血细胞比容范围。

本领域技术人员了解使用DBS的障碍。然而，由于对于应用具有一些优点并且鉴于制药公司对测试血浆的偏好，如这里描述的新型多层装置具有DBS卡的所有益处但没有其任何缺点。例如，血细胞比容偏差假定不存在，血浆中的药物代谢动力学(PK)而不是血液中的药物代谢动力学是本发明的多层装置的优点。

分析应用

这里描述的多层装置可以用于各种领域；然而，共同的线索是该产品可以用于与气相色谱分析和光谱学技术结合的、鲁棒、高效和可靠的生物分析方法。有用的应用可包括但不限于药物测试、药物发现和开发、基因检测、法医分析等。在微采样、过滤或分离、和收集流体样品的所需组分之后，通过直接洗脱，随后进行固相提取(SPE)实现分析物的提取，而在一些实施方案中，应用用于检测在流体样品中存在从过滤膜和/或收集材料层获得的感兴趣分析物的自动化分析方法，包括但不限于液相色谱(LC)，质谱(MS)、LC/MS、LC/MS/MS等。例如，也可以通过本领域已知的和使用的技术来洗脱包含细胞组分的收集材料层并水解(digest)细胞组分，然后进行细胞相关蛋白、肽、DNA、RA等的各种分析。所述多层装置适合于完全自动定量分析，并且在一个实施例中，在线固相提取直接与质谱结合或经由SPELC/MS/MS结合，其中SPE洗脱物(eluate)的后续色谱分离在MS或MS/MS之前发生。

示例性实施例可以在计算机和服务器上实现，所述计算机或服务器诸如例如可以具有微处理器(诸如来自英特尔公司、AMD或Motorola)；易失性存储器和非易失性存储器；一个或多个大容量存储设备(即，硬盘驱动器)；各种用户输入设备，诸如鼠标、键盘或麦克风；以及视频显示系统的通用计算机。计算机和服务器可以在包括但不限于Windows、Unix、Linux、Mac OS或Windows(XP、Vista等)的许多操作系统中的任何一个上运行。然而，可以设想，任何合适的操作系统都可以用于本发明。在几乎所有情况下，与LC/MS/MS结合的商业在线机器人系统完全由系统软件控制。实验室信息管理系统(LIMS)，例如THERMOSCIENTIFIC^TM Watson LIMS^TM是用于处理可从所描述的实施例获取的大数量数据的信息管理系统的示例。计算机和服务器可以是web服务器的集群，每个web服务器可以是基于Linux的并且由负载均衡器支持，其中所述负载均衡器基于可用服务器的当前请求负载来决定web服务器集群的哪个服务器应当处理请求。

计算机和服务器可以经由包括互联网、WAN、LAN、Wi-Fi、其他计算机网络(现在已知的或将来发明的)、和/或前述的任意组合的网络来连接。本说明书、附图和权利要求书在其面前的本领域普通技术人员应当理解的是，网络可以通过有线和无线管线(conduit)的任意组合来连接各种部件，所述有线和无线管线包括铜、光纤、微波和其它形式的射频、电和/或光通信技术。还应当理解，任何网络可以以不同的方式连接到任何其它网络。系统100中的计算机和服务器之间的互连是示例。任何装置都可以经由一个或多个网络而与任何其他装置通信。

示例性实施例可以包括除了所公开的那些之外的附加装置和网络。此外，如由一个装置执行的被描述的功能可以由两个或更多个装置来分担和执行。多个装置也可以组合成单个装置，其可以执行组合的设备的功能。

本申请描述的各种参与者和元件可以操作一个或多个计算机装置以促进这里描述的功能。上述附图中的任何元件，包括任何服务器、用户终端或数据库，可以使用任何合适数量的子系统来促进本申请描述的功能。

本申请中描述的任何软件组件或功能可以被实现为软件代码或计算机可读指令，其可以由至少一个处理器使用任何合适的计算机语言来执行，例如使用如常规的或面向对象的技术的Java、C++或Perl的任何合适计算机语言。

软件代码可存储为非暂时性计算机可读介质上的一系列指令或命令，所述非暂时性计算机可读介质例如是随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、例如硬盘驱动器或软盘的磁性介质、或光学媒体(例如，CD-ROM)。任何这样的计算机可读介质可驻留在单个计算装置上或其内，并且可存在于系统或网络内的不同计算装置上或不同计算装置内。

可以理解，如上描述的本发明可以使用呈模块化或集成方式的计算机软件，以控制逻辑的形式实现。基于本申请所提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员可以了解并领会使用硬件、软件、或硬件和软件的组合来实现本发明的其他方式和/或方法。

示例1

书本型多层装置的结构

为了制备过滤膜单元，例如RBC过滤盘，

膜滤片使用具有5mm直径的HARRIS Uni-Core^TM打孔器(Amazon，USA)打孔。使用OSBORNE拱式打孔器(Amazon，USA)制备包括5mm直径的切口盘的底部支撑层，其使用类似于顶盖或顶部支撑层的卡片构材材料。如图1所示，在制备每一层材料之后，通过首先将聚酯疏水膜层(4)放置在顶盖卡片构材(2)的下侧的内侧上，接着等距地打出四个贯穿上部卡片构材或顶盖和贯穿聚酯疏水膜层(4)的孔，组装该卡。底部升高或凸起的支撑件(6)由使用诸如胶带的粘合材料固定在底盖卡片构材材料(7)的内表面上的盖支撑卡片构材材料的两个圆盘制成。然后将基于纤维素的纸基底或收集材料(5)直接放置在升高的或凸起的底部支撑件或接触支撑层的顶部上，其中具有所描绘轮廓的样品放置圆的收集材料与顶盖和疏水膜(4)的切口孔对准。这种书本式多层卡使用了两个略微不同的RBC过滤膜盘：一个较大(3)，其具有为约7mm至约11mm的直径，另一个较小(1)，其具有约4mm至约6mm的直径，最后的步骤是将这两个盘放置在卡或多层装置上。较大的盘(3)被插入在上部卡片构材的内侧和该聚酯疏水膜层之间，同时保持与开孔对准。然后将书本式卡保持闭合，使得所有层都接触。多层装置可利用临时活页夹，例如四个回形针(paper clips)，实现充分且完全的闭合。最后，将较小的过滤膜盘放置在上部卡片构材或顶盖的外侧设置有开孔的地方。接着，可以将流体生物样品放置在顶盖的孔内和过滤膜上。

所述多层器件卡由具有支撑不同材料层的功能的折叠卡片构材(0.350mm厚x76.2mm宽x50.8mm长)组成。为了说明的目的，在图2中以拆开形式示出了折叠卡片构材材料的上部和下部支撑层或支撑盖。从上表面观察，所述过滤膜单元包括以不对称的孔径尺寸为特征的两个过滤膜或

过滤盘(层1和3)。所述上部盘或第一过滤膜(层1)为较薄的

膜(35μm顶部、5μm底部)，并且紧密接触地直接定位在所述下部盘或第二过滤膜(层3)上方，所述下部盘或第二过滤膜(层3)为

膜盘，35μm顶部，2.5μm底部。当两个盘结合而形成过滤膜单元时，两个盘可以连续且有效地从具有Hct高达60％的全血过滤掉RBC，但不显示溶血的任何迹象。两个盘选择不同的尺寸(上部-4至5mm直径和底部-7至11mm直径)以适应可变的采样体积并为卡提供灵活的采样体积特征。

如果在不同的Hct水平下不均匀的过滤速率是有问题的，则可以更改过滤膜来避开该问题。例如，通过刺穿上部

膜得到针孔，以形成小的通孔来对各种全血Hct值提供更均匀的流动。对上部卡片构材或顶盖或支撑层(层2)打孔以产生与过滤膜或

膜的直径相匹配的卡片构材开口。这些开口的功能是将第一过滤膜、

膜牢固地定位在第二过滤膜、

膜的中心上方。对AHLSTROM^TM3256(层4)聚酯疏水膜层(0.058mm厚x76.2mm宽x25.4mm长)打孔以产生5mm直径的开孔并由AVERY^TM 5667易剥离胶带保持就位。该聚酯疏水膜层用于1)将第二过滤膜、

膜过滤器保持就位，和2)获得收集材料上的圆形、均匀的血浆或样品斑点。当将血滴施加到过滤膜单元或过滤盘上时，目视检查显示血液在少于30秒内通过第一过滤膜盘快速扩散和吸收。还注意到血浆比RBC在水平面更快速地扩散，导致血浆溢出第二过滤膜、

膜圆盘的边缘，到达收集材料纸基底上。在没有疏水膜聚酯层的情况下，这种流动方式引起血浆开始吸收并且从过滤膜单元盘的边缘开始扩散到收集材料纸基底上，并因此产生不均匀的血浆斑点形状，例如半全圆或马蹄形斑点。为了避免这一点，将疏水膜聚酯层放置在第二过滤膜、

盘和收集材料纸基底之间。利用在疏水膜聚酯上的5mm开孔和7mm第二过滤膜、

S/G盘，在第二过滤膜、

盘和收集材料纤维素纸基底之间存在紧密接触，然而从7mm第二过滤膜、

盘的2mm偏移防止了第二过滤膜、

盘的边缘和收集材料纸基底之间的直接接触。以此方式，产生了圆形的、均匀的血浆斑点，且没有任何溶血证据。通过使收集材料纸基底和第二过滤膜、

膜之间的紧密接触最大化，聚酯疏水膜的薄度也发挥重要作用。基于纤维素的纸基底收集材料(层5)是由棉绒纸浆制成的AHLSTROM^TM级601纸(0.190mm厚×76.2mm宽×25.4mm长)。紧密地定位在收集材料纸基底下方的包含凸起支撑部的接触支撑层(层6)是由保持就位并与过滤膜单元

膜过滤器盘对准的从卡片获得的两个圆盘(11mm直径底盘和5mm直径顶盘)的堆叠通过AVERY^TM8665粘合带(76.2mm宽x25.4mm长)制成，但可通过任何方式粘附，只要粘合剂不干扰过滤、点注(spotting)或分析即可。底部接触支撑部的功能是确保收集材料纸基底和过滤膜单元，更具体地第二过滤膜

膜，之间的紧密物理接触。如图1或图2所示，这种书本型多层装置具有产生每个卡高达4个血浆斑点和/或对照的能力。构造所述多层装置卡以产生3个血浆斑点，因为所采用的4mm夹具尺寸具有在斑点位置4处配置的夹具头洗涤位置。

示例2

与血液中阿片类物质和兴奋剂的在线SPE-LC-MS/MS生物分析耦接的自动流通式洗脱

为了设计、开发和验证能够产生血浆而不需要离心的、适于使用串联质谱检测(LC/MS/MS)分析的自动在线液相色谱的能用于血细胞比容的多层装置，开发了一种多层装置用以从全血微采样来制备干燥的血浆斑点样品。通过直接洗脱，随后进行感兴趣分析物的在线固相提取(SPE)和LC/MS/MS测定，实现所得干燥血浆斑点的提取，在本示例中，感兴趣的分析物是阿片类物质和兴奋剂。在该分析中选择具有变化的物理化学性质的四种阿片类物质和五种兴奋剂进行测试。

通过用3∶7甲醇/水(v/v)稀释初级原料溶液制备一系列标准工作溶液。还以5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL和1,000ng/mL制备校准标准物。以5ng/mL、15ng/mL、300ng/mL和900ng/mL制备质量控制(QC)样品。

30％、45％和60％血细胞比容(Hct)血液的样品制备通过在血细胞比容测量装置-StatSpin^TM CritSpin^TM(Thermo Fisher Scientific；Waltham，MA，USA)上测量初始血细胞比容(Hct)水平来进行。全血样品的Hct水平被测量。将全血置于毛细管中并在所述装置中在13,700xg下旋转2分钟。离心后，使用所述装置测量Hct水平。为了制备具有30％、45％和60％Hct的血液，将1mL血液置于2mL LoBind EPPENDORF^TM管中并以3000xg-5000xg旋转3分钟，以从血浆中分离RBC。采用测量的初始Hct水平，进行计算以确定要将多少血浆添加到1mL离心血液中或者从1mL离心血液中去除，以便实现期望的Hct水平。在调节血浆体积之后，则将不同的Hct水平样品管在涡旋混合器(vortex mixer)上轻柔地混合，并且将500μL转移至1.5LoBindEPPENDORF^TM以根据上述样品制备方法进行标准强化。在LLOQ QC和HQC下执行Hct效果的评估。使用具有42％Hct的血液制备校准曲线。

通过在1.5mL LoBind Eppendorf管中加入10μL工作溶液强化500μL的含Na₂EDTA的血液来制备所有样品。随后在37℃用200rpm搅拌样品30分钟来培养经强化的样品。八点校准器为5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL，而QC样品在LLOQ QC下为5ng/mL，在低QC(LQC)下为15ng/mL，在中等QC(MQC)下为300ng/mL，和在高QC(HQC)下为900ng/mL。在培养后，在使用如图1所示的书本式DXS卡或多层装置进行DPS制备之前，样品在室温下放置30分钟。

简言之，在所述多层装置处于闭合位置的情况下，将等份血液(约10μL至约50μL)施加到顶盖的切口孔内的上部过滤膜盘，并且所述多层装置保持在闭合位置3分钟以完成过滤过程。接着，取回包含过滤的血浆的收集材料或纤维素纸基底。在本示例中，将收集材料固定到适当的纸质卡片上，该卡片是Perkin Elmer 226卡，其中该Perkin Elmer226卡具有可在线处理窗支撑层或被移除的采样窗。可替换地，收集材料被预先固定到可在线处理窗支撑层上。可以使用满足DBSA的自动配置标准的任何卡片构材。

在1.5mL EPPENDORF^TM管中，将10微升(μL)的工作溶液加入到500μL的用抗凝剂强化的全血。然后在37℃下以200rpm搅拌速度搅拌30分钟来培养样品。在干燥的血浆斑点制备之前，在室温下至少30分钟来平衡样品。

通过施加等份(约15μl至约50μl)的全血样品到每个切口圆内的闭合的多层装置以用于收集流体样品，即在过滤膜单元上，来制备干燥的血浆斑点。在3分钟后，打开多层装置。血浆被吸收到收集材料上，形成干燥的血浆斑点。含有干燥血浆斑点的收集材料被移去，并使其在室温下进一步干燥30分钟，然后进行自动在线分析物分析。应注意，60％血细胞比容水平的样品没有溶血。

感兴趣的分析物(和内部标准)包括吗啡(和吗啡-d3)、可待因(和可待因-d3)、氧可酮(和氧可酮-d6)、氢可酮(和氢可酮-d3)、苯丙胺(和苯丙胺-d5)、甲基苯丙胺(和甲基苯丙胺-d5)、3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)(和MDMA-d5)、苯丁胺(和苯丁胺-d5)，和甲氧麻黄酮(和甲氧麻黄酮-d3)。

灵活采样体积的特征。如上所述，书本型多层装置卡的构造利用了两个RBC过滤膜盘(

和S/G膜过滤器)依次且高效地对具有高达60％Hct水平的样品过滤掉RBC并获得血浆。这些盘的尺寸可以根据施加体积来确定。关键之处是应避免用血液过量填充或欠量填充盘。过度填充将引起过滤能力过饱和，导致全血溢出盘的边缘。如果欠量填充，则血浆的一部分将被保留在盘中，导致较少的可用的收集的血浆，并且可能导致血浆收集材料基底的不完全饱和。不完全饱和则将导致分析不精确。因此，对多层装置的容量是否适于灵活样品施加体积范围(低、中和高)进行测试，针对2个过滤器的四种不同组合尺寸评估了样品。4mm和6mm、5mm和7mm、5mm和9mm、和5mm和11mm的组合分别针对10μL、12.5μL、和15μL；15μL、17.5μL、和20μL；20μL、27.5μL、和35μL；和35μL、42.5μL、和50μL血液进行评估。使用具有在HQC水平下强化的45％Hct的志愿者的血液来制备每个施加体积的三份同样的样品(三个干燥的血浆斑点)。使用5mm和7mm组合针对20μL施加体积制备校准曲线(n＝2)。调整两个过滤盘的尺寸的能力提供了多层装置中的灵活采样体积的特征。

血浆体积产率。为了测量使用多层装置卡从全血样品产生多少血浆，通过将从离心全血(3μL、5μL、10μL、15μL、20μL和30μL)获得的血浆直接点注到小片收集材料或纸基底上来制备血浆斑点(n＝2)。在点注之前和紧接着点注之后称重纸基底片。这些数据用于绘制血浆体积对重量的校准曲线。对于多层装置或卡样品，使用15μL、20μL、30μL和50μL全血从书本型多层装置产生的血浆斑点(n＝2)，在施加之前和紧接着施加之后立即称重。测量的重量用于计算血浆体积产率。根据初始全血体积和平均血浆体积与血液体积之比约0.3，多层器件产生约4μL至约15μL血浆体积，即，约三倍于NOVIPLEXTM DPS卡产生的血浆体积。示例性血浆体积产率如表3所示。为了评估分析物浓度是否受洗脱位置影响，比较了斑点中的中心和周缘洗脱位置。

针对全血中的吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮、AH 7921和芬太尼计算中心和周缘采样位置。除了具有-17％的％RE的吗啡之外，如图3中例示的所有计算值都通过了对％RE和％CV的可接受标准。除了具有15ng/mL的强化水平的芬太尼以外，对于所有阿片类物质，强化水平是150ng/mL。发现斑点内的浓度分布与DBS相比具有显著更小的变化，其中对于DBS，中心和周缘位置之间的差可能高达50％。

方法验证。采用美国FDA指南(FDA，Guidance for Industry–BioanalyticalEmthod Validation用于工业-生物分析方法验证的指引；UCM3681072013，1-34)调查线性度、精度、准确度、携带(carry-over)、选择性、恢复和稳定性，以验证用于全自动化在线分析的开发的DPS卡的功能。对于所有QC水平，管理指南关于精度将接受标准定义为±15.0％相对误差(RE)内；关于准确度，定义为≤15％变异系数(CV，coefficient of variation)，但具有±20.0％RE和≤20％CV(Id.)的LLOQ QC除外。相对误差百分比(％RE)通过(测量的平均值/标称值)-1X100)来计算，并且变异系数百分比(％CV)通过(标准差/平均值)X100来计算。

短期卡上稳定性。进行短期稳定性研究以评价经研究的阿片类物质和兴奋剂的卡上稳定性。在三个不同的存放条件下，在LLOQ和HQC QC水平(n＝3)下在0、3、9、14和28天进行评价：在室温(RT)下保持在填充有连续氮气流的箱中(RT+氮气)；在室温下保持在具有干燥剂的格拉辛纸封套中(RT+空气)，其中干燥剂密封在

袋中；和在-20℃下保持在具有干燥剂的格拉辛纸封套中(-20℃+空气)，其中干燥剂密封在

袋中。在0天、3天、9天、14天和28天评价样品。在每个时间点，制备新的校准曲线。当存放在-20℃+空气时，对于相同的分析物，注意到有较小的减少。这表明分析物的卡上不稳定性或分解是由于氧化。用于避免样品中分析物的不稳定性或分解的方案中，多层装置的长期存放可以位于充氮容器中。去除氧气则将防止氧化的损害。结果表明，如图4和图5中所示，多层装置的卡上稳定性是依赖于分析物的和依赖于存放的。图4显示了在第28天，在空气(RT+空气和-20℃+空气)存在下存放时,氧可酮(p＝0.001)、氢可酮(p＝0.004)和甲氧麻黄酮(p＜0.0001)的显著分解(方差分析，ANOVA)。当在RT+N₂下存放时，能够获得所有九种分析物28天的卡上稳定性。图5显示在第28天，在空气存在(RT+空气和-20℃+空气)下存放时，氧可酮、氢可酮和甲氧麻黄酮显著分解(ANOVA，p＜0.0001)。在RT+空气下存放时，注意到氧可酮、氢可酮和甲基麻黄酮在第3天之前分解(＞50％)，这可能归因于氧化，且零摄氏度以下可能减慢分解速率。最近，甲基麻黄酮的关于在空气对N₂存在下存放条件的影响的类似卡上分解模式已经被报道了(Verplaetse，R.；Henion，J.Analytical Chemistry，2016，88，6789-6796。

血细胞比容影响。针对DBS应用所报道的主要担心之一是已经提出了许多可能的解决方案的Hct问题(De Kesel，P.M.等。Bioanafysis 2013，5，2023-2041；“De Kesel”)。在所提出的解决方案中，DPS是有前途的替代方案之一(Déglon，J.等。Bioanalysis 2015，7，2375-2385)。为了评估本发明的书本型多层装置卡是否为Hct相容的，制备具有30％、45％和60％Hct的血液样品并在LLOQQC和HQC水平下强化。对于所有分析物，如图6所示，结果显示在两个QC水平下都没有Hct偏差。图6的红线表示最大可接受标准：在LLOQ QC下≤20.0％RE和CV，并且在高QC下，≤±15.0％RE和CV。在30％至60％的Hct范围下没有观察到血细胞比容偏差。与先前开发的卡(Sturm，R.等。Bioanalysis 2015，7，1987-2002)相比，该书本式DPS卡似乎提供更宽范围的Hct适用性，其通过结合了两个过滤膜或RBC过滤器盘的优选设计来实现，这可过滤和捕获RBC。

灵活采样体积特征。采用4mm部分斑点分析。利用部分斑点分析，在干燥的血浆斑点内采样4-mm斑点区域。因此，如果血浆斑点是均匀的，则结果的准确性不应受4-mm采样区域是否从8mm或14mm血浆斑点部分地获取以及4-mm采样区域是否从干燥血浆斑点内的中心或周缘区域获取的影响。为了支持这种假设，使用书本型多层装置评估从10变化到50μL的、产生大约8到14mm的血浆斑点大小的血液体积。所述书本型多层装置被定制为具有不同过滤膜尺寸的第一过滤膜X和第二过滤膜S/G盘，以便适应不同的血液体积。使用分别具有5mm和7mm过滤膜X和S/G盘的多层装置卡，用20μL血液构造的校准曲线进行定量。观察在HQC下在不同的施加的全血体积中的可比较的精度。尽管大多数RE％位于接受极限(≤±15％)内，从由＜20μL血液产生的斑点观察到负偏差的趋势，而从由＞20μL血液产生的斑点观察到正偏差。这些偏差可以通过使用与被施加样品体积可比较的体积制备校准曲线来校正。还在4个不同的施加体积(15μL、20μL、35μL，和50μL)产生的不同血浆大小下评价了中心对周缘斑点位置。

表2中的结果显示在4个不同的施加血液体积或各种血浆斑点尺寸下，中心位置和周边位置之间所有分析物的测量水平没有差异。以前的研究已经报道了类似的结果，其中使用

毛细管(Li，W.等，Journalof Chromatography B-AnalyticalTechnologies in the Biomedical and Life Sciences 2015，991，46-52；“Li等2015”)从通过对20μL、25μL和30μL离心的血浆点样来获得可比较的数据斑点。尽管对20μL、25μL和30μL血浆观察到可比较结果，但在10μL血浆处观察到负偏差(Li等，2015)。在该研究中使用的纤维素纸基底的类型是DMPK C卡，其与在书本型多层装置卡中使用的收集材料或纸基底(AHLSTROMTM等级601)相比厚接近2.5倍。当采用较厚的纸基底时，血浆在整个纸上的扩散和渗透可能经历由Henion等人(Henion，J.等，Bioanalysis 2013，5，2547-2565)描述的不完全渗透。如果这样的话，则不精确将在较小的体积处比在较大的体积处更成问题。值得注意的是，表1和表2中报告的结果支持如下基本原理，即血浆一致性独立于血液中的Hct水平和所施加的血液体积，并且显示了在书本型多层装置卡的应用中灵活采样特征的功能特征。

表1 柔性采样体积：使用不同尺寸的过滤膜时不同范围的血液施加体积

过滤膜尺寸是指第一过滤膜X和第二过滤膜S/G盘的直径。为了定量，使用具有5mm和7mm过滤膜组合的书本型多层装置卡和20μL全血来建构校准曲线。

表2：用于从一定范围的全血体积产生的不同大小的血浆斑点的中心与周缘斑点洗脱位置

水平是以HQC(900ng/mL)。为了定量，使用具有5mm和7mm过滤膜组合的书本型多层装置卡和20μL全血施加来建构校准曲线。所测量的水平对于中心位置样品归一化为100％。

书本型多层装置与现有的DPS卡相比。与这里描述的多层装置的两个最接近的现有DPS卡是NOVIPLEX^TM卡，其可从Novilytic LLC(Kim，J.H.等，Anal Chem 2013，85，11501-11508)商购获得，和Sturm等以前报道的‘auto DPS卡’(Bioanalysis 2015,7,1987-2002)。总体上，这两种卡和本发明的多层装置卡的概念设计类似，因为它们中的每一种卡都采用了卡上膜过滤技术将RBC从血浆分离。然而，卡结构和每种卡格式中的血浆的产生是不同的。为了成功地产生卡上血浆斑点，本发明的书本型多层装置卡不需要任何外部装置。尽管NOVIPLEX^TM卡也不需要任何用于产生血浆斑点的外部装置，但是由于NOVIPLEX^TM卡与自动分析不兼容，其需要一把镊子移除小的2-mm盘且手动地转移该盘以用于进一步的样品提取过程，因而样品处理过程是冗长乏味的。虽然没有确定由自动DPS的血浆体积产率，但NOVIPLEX^TM卡需要最少25μL的血液来产生约2.5μL血浆(Kim，J.H.等，Anal Chem 2013，85，11501-11508)。即每μL血液产生0.100μL血浆。然而，本发明的书本型多层装置卡产生更大数量的血浆体积(4.6μL至14.7μL)，取决于最初施加的血液体积，平均大于约3倍的血浆/血液体积比，即，每μL全血0.303±0.007血浆(表3)。

表3：从多层装置产生的血浆体积的确定

校准曲线是针对血浆斑点的重量关于从3μL变化到30μL的血浆体积来绘制的。

所述曲线显示具有R²＝0.9994，斜率＝09793x-0.0995的线性度。

自动流过式斑点洗脱和在线SPE。以前描述了在该工作中采用的机器人系统(Verplaetse，R.；Henion，J.，Drug Testing and Analysis 2016,8,30-38；Sturm，R.等，Bioanalysis 2015，7，1987-2002；Oliveira,R.V.等，Anal Chem 2014,86,1246-1253)。简言之，其包括使用DBSA系统(Spark holland，Emmon,荷兰)在纤维素卡上的干燥斑点的自动流过式洗脱。该系统拾取被附着到多层装置卡的可在线处理窗支撑件上的收集材料，定位卡上的干燥斑点，随后斑点溶剂洗脱耦合到在线SPE分析物捕获/洗脱步骤。通过流过机构进行斑点解吸，其中一对夹具(配备有用于溶剂输送的管具)在收集材料纸基底上形成夹持洗脱区域。在夹持位置，通过收集材料纸引入洗脱溶剂，并将提取物输送到在线SPE载具(catridge)。整个在线系统的详细说明和描述通过引用(Verplaetse，R.；Henion，J.。DrugTesting and Analysis 2016,8,30-38)并入。在当前研究中，采用耦合到不可见或用户定义的斑点识别模式的使用4mm夹具大小的局部斑点分析。每个收集材料/可在线处理窗支撑卡有四个斑点，表征为斑点NO.1、2和3为干燥的血浆斑点和斑点NO.4为夹持洗涤位置，其在样品之间进行。第四斑点或切口区域包括三个小圆圈，这三个小圆圈以三角形形式定位以用于夹持洗涤。如果使用2mm夹具尺寸，则洗涤位置在每个斑点的右拐角处，从而提供每个卡四个样品斑点的容量。选择4mm夹具尺寸以增强对吗啡的分析灵敏度。用2ml解吸溶剂(H₂0中0.2％NH₄OH+2.5％MeOH)在100℃和4mL/min下进行斑点洗脱。将含有20μL氘化免疫血清(IS)溶液的样品环直接引入斑点洗脱线中。随后，将洗脱溶剂加载到预先调节的(以4mL/min的速度，1mL MeOH和1mL解吸溶剂)SPE载具(HySphere^TM C8HD，7μm，2X10mm，SparkHolland)。使用LC梯度将目标分析物从载具洗脱到LC柱(column)上，用于随后的色谱分离。为使携带最小化，SPE载具和DBS夹具两者在不同次运行之间依次用以下三种不同的溶剂(2mL解吸溶剂，4mL H₂O:MeOH CAN:IPA 2:4:3:1v/v,含有0.1％FA和最终2mL0.1％FA H₂O)以6mL/min洗涤。

LC-MS/MS。LC-MS/MS分析使用与LC-MS 8050质谱仪(Shimadzu，MD，USA)耦接的

UHPLC系统进行。使用Shimadzu公司的LabSoIutions软件进行数据处理。LC柱是配备有

(Torrance,CA.USA)的防护F5柱(2.6μm,2.1x5mm)的

F5(2.6μm,2.1x5mm)。流动相包括(A)5mM甲酸铵和0.1％FA与(B)MeOH。LC梯度程序为：在初始条件下10％B，在0.25min时10％B，在1.70min时40％B，在2.20min时100％B，在2.48min时100％B，并在2.90min时循环回到10％B。通过在线SPE载具的第一0.25min的流动被调度到废料口。流速为0.4mL/min，而HPLC柱保持在50℃。质谱仪在以下仪器条件下以正离子电喷电离模式操作：接口电压为0.5kV，接口温度为400℃，去溶线温度为100℃，加热块温度为140℃，干燥气流为3L/min N2，雾化气流为2L/min N₂，加热气流为20L/min N₂。对于每种化合物，如表4所示监测了两个SRM转变。

表4：研究的阿片类物质和兴奋剂的结构、物理特性和选择的m/z值

表4(续)：

☆表示IS中氘标签的位置。CE＝collision energy(碰撞能量)

用于测试感兴趣的分析物存在的仪器包括干燥血液斑点(DBS)卡自动采样器(DBS，Spark Holland)；高压分配器泵(HPD，Spark Holland)；自动化SPE载具交换模块(ACE，Spark Holland)，

超高性能液相色谱仪(UHPLC，Shimadzu)；和LCMS-8050MS(Shimadzu)。血浆斑点的直接在线洗脱通过使用夹具(4mm)夹持在含有干燥血浆斑点的收集材料中来进行，其中部分斑点分析在100℃下进行。

改进Spark-Holland DBS SPE自动采样器系统以分析DXS样品。所述系统的构建方式是：HPD和注射泵独立地连接到具有IS回路的多端口阀(20μl的氘化内部标准对照混合物)；另一个多端口阀连接到夹具以保持收集材料，其中所述夹具具有约2mm的直径，其通过SPE载具夹具连接到第三多端口阀，其中第三多端口阀还连接到LC柱、废物消除部、梯度泵和用于在线SPE-LC-HRAMS DXS提取分析的计算机系统。如果自动化系统与这里描述的多层装置协作使用，则可以使用除Spark-HollandSPE自动采样器系统之外的其它系统。所述多层装置也可以通过使用另一个在线自动化系统，例如CAMAGDBS-MS 500(WorldWideWeb.camag.com/en/dbs/dbs-ms_500.dfm)，来分析。

SPE方法利用HySphere^TMC₈HD，7μm，2x10mm柱体(Spark Holland)，条件是1毫升甲醇，1mL 0.2％氢氧化铵和2.5％甲醇水溶液(in water)，(以6mL/min)；以lmL 0.2％氢氧化铵和2.5％甲醇水溶液(以3mL/min)洗脱；和以2mL 0.25氢氧化铵和2.5％甲醇水溶液，4mL2∶4∶3∶l(v/v)水/甲醇/乙腈/异丙醇(以6mL/min)洗涤。LC程序条件(LC-MS/MS Shimadzu8050)如下表5所示，其中泵A：0.1％甲酸/水和泵B：100％甲醇，其中在通过SPE载具之后的LC梯度的前0.25分钟*是针对废物。

表5

时间(min)	泵B浓度
		初始	10％
0.25*	10％
		1.70	40％
2.20	100％
		2.48	100％
2.90	100％

所使用的多层装置包括多个层。将全血样品施加到过滤膜单元的第一层，所述过滤膜单元的第一层包括非对称

膜的过滤膜(5mm直径的过滤膜盘)；非对称的(35μm顶孔径大小；5μm底孔径大小)具有大约0.160mm至0.200mm顶盖切口(5mm直径)的厚度，其中顶盖由厚度为0.350mm的卡片构材构成。多层装置可具有4个切口。过滤膜单元层是约束的(即，非柔性)切口层，其具有与顶盖切口相同的尺寸。过滤膜单元的第一层下方是过滤膜单元的第二层，所述过滤膜单元的第二层包括非对称

膜(7mm)的过滤膜；非对称的(35μm顶孔径大小；5μm底孔径大小)，具有大约0.260mm至0.300mm的厚度。过滤膜单元下面是疏水膜，所述疏水膜包括具有四个切口的

聚酯膜，其中所述四个切口具有与顶盖的圆形切口相同的尺寸。该疏水膜的厚度为约0.0584毫米。疏水膜下面是收集材料，所述收集材料具有所述切口的轮廓但没有实际受约束的切口(即，柔性)，从而允许柔性收集材料。所述收集材料可以包括

601纤维素纸，具有从全血流体样品吸收的厚度为0.190mm的血浆。收集材料下面是凸起的支撑层，其确保过滤膜单元、疏水膜和收集材料之间的紧密物理接触。所述凸起的支撑层是从厚度为0.7mm的卡片构材获得的切口盘，使用

胶带保持就位。在所述凸起的支撑层下面是底盖，其支撑所有前述层。底层包括0.350mm的卡片构材。

所开发的多层装置的功能性应用已经被验证了，并且结果证明了在四个质量控制(QC)水平下的日间准确度和精度的良好选择性和可接受的限制。检测的最低限制(LLOQ)在5ng/mL时实现，并且在R2＞0.9964时从5ng/mL到1000ng/mL观察线性度。平均回收率(recovery)大于(＞)87.9％。对于测试的阿片类物质和兴奋剂，测试的多层装置还显示了从30％至60％的血细胞比容相容性。短期稳定性研究表明，当在室温下在空气或大气中存放时，多层装置稳定性受限并且依赖于化合物。

图7的测试的四种阿片类物质的和五种兴奋剂的色谱图显示具有如下表6所示的保留时间(min)的内部标准。图7(A)是双空白样品，(B)是空白样品，(C)是LLOQ样品(5ng/mL)，和(D)是氘代内部标准。

表6：

编号	内部标准	保留时间(min)
			1	吗啡-d<sub>3</sub>	1.305
2	可待因-d<sub>3</sub>	1.520
			3	氧可酮-d<sub>6</sub>	1.669
4	氢可酮-d<sub>3</sub>	1.770
			5	苯丙胺-d<sub>5</sub>	1.73l
6	甲基苯丙胺-d<sub>5</sub>	1.841
			7	MDMA-d<sub>5</sub>	1.951
8	苯丁-d<sub>5</sub>	2.037
			9	甲氧麻黄酮-d<sub>3</sub>	2.076

表6中显示了使用血细胞比容水平为30％、45％和60％的血液的干燥血浆斑点分析的精确度和准确度结果。对每种不同的血细胞比容水平，测试每种感兴趣分析物。通过等于(标准差(SD)/平均值)X100的变异系数(CV)来评估准确度，而通过等于[(平均值-标称值)/标称值]x100的相对误差(RE)来评估精度。图7(A)示出测试的每个血细胞比容水平和每种分析物的LLOQ QC变异系数，并且(B)显示相对误差。图7(C)示出了测试的每个血细胞比容水平的和每种分析物的高QC变异系数，并且(D)显示了相对误差。还测试了较宽范围的血细胞比容水平。图8和下表7显示了如针对吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮、AH 7921和芬太尼测试的从25％至65％的血细胞比容水平的结果。对于AH 792l和芬太尼，发现回收率与全血中的血细胞比容水平成逆相关。虽然吗啡、可待因、氧可酮和氢可酮被示出为血细胞比容相容的，但AH 792l和芬太尼不是。在LQC、MQC和HQC下观察到相同的趋势。

表7：吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮、AH 7921芬太尼

还测试了阿片类物质和兴奋剂的稳定性。图4示出了在三种不同条件下存放超过14天的LLOQ(5ng/mL)：

(1)室温(RT)保持在填充有连续氮气流的箱中(RT+氮气)；

(2)室温(RT)保持在具有干燥剂的格拉辛纸封套中(RT+空气)；以及

(3)-20℃保持在具有干燥剂的格拉辛纸封套中(-20℃+空气)。

实现了从多层装置获得的血浆体积并进行比较。在上表4中，平均血浆/血液体积为0.303μl，标准差为0.007。

计算了四种阿片类物质和五种兴奋剂的线性度和回收率。下表8总结了结果。

表8：四种阿片类物质和五种兴奋剂的线性度和回收率

四种阿片类物质和五种兴奋剂的日间和批次间准确度和精度也被确定并且在下表9中示出。

总之，验证结果显示本发明的多层装置具有良好的分析精度、准确度、选择性、回收率和灵敏度的功能益处。测试的九种分析物的产品上稳定性的评价表明，当在室温下在空气中存放时，多层装置稳定性是依赖于化合物的。因此，在商业化之前，应评估每种感兴趣的分析物的产品上稳定性并将适当的使用说明提供给消费者。该多层装置的益处包括微采样而无需借助于医疗专业人员或抽血师、使用离心机、测试较宽的血细胞比容水平范围以分析感兴趣的分析物，例如阿片类物质和兴奋剂、完全自动化的在线LC/MS/MS分析的相容性、和从血液的高血浆体积产率(即，大于商购方法获得的产率)。

表9：

示例3

用于测试多层装置的测试化合物

本发明的多层装置使用已知的高血压和ADHD药物、胍法新来测试，所述胍法新具有[¹³C,¹⁵N₃]内部标准。胍法新(C₉H₉Cl₂N₃O)具有245.0123Da的单一同位素质量，而内部标准[¹³C,¹⁵N₃]-胍法新(¹³CC₈H₉Cl₂ ¹⁵N₃O)具有249.0067Da的单一同位素质量。这些化合物使用血液：血浆结合率(Ke/p)为1.5的全血样品进行测试，并且使用LC-MS/MS生物分析按照本文所述的方案进行分析。

示例4

使用多层装置的方法

作为初始物质，在收集之前或之后，收集诸如全血的流体样品，但不接触被夹在顶盖和底盖之间的任何层，特别地，要避免通过顶盖的切口暴露过滤膜单元。即使在样品收集之后，也应避免与流体样品被施加于其上的暴露的过滤膜单元接触。对于手指穿刺或脚跟穿刺样品收集，选择穿刺部位并用70％异丙醇清洁。使用无菌的一次性标准刺血针。在将手指或脚跟保持在下部位置或低于心脏高度时，刺血针刺穿清洁的部位。用无菌纱布或类似物擦拭掉第一血滴。当出现第二、优选大的血滴时，通过无菌的一次性毛细管收集体积为至少约10微升到约50微升的全血，或直接施加到通过顶盖切口暴露的过滤膜单元的顶表面。如果单个切口的切口区域具有小于约10微升，则立即添加第二滴，直到足够体积填充切口的区域。一旦单个多层装置的所有切口圆都在过滤膜单元的一侧上填充有全血，顶部单元的全血样品或样本定位成与底部单元在闭合位置接触大约3分钟，使得至少过滤膜单元、疏水膜、和收集材料紧密接触。在约3分钟或更长时间期间，全血样品被过滤单元吸收并且血浆收集在收集材料上，在该3分钟或更长时间之后，多层装置的各个层被分离以用于分析物分析。可允许额外的时间以进一步干燥所收集的样品，优选约30分钟或对于收集的样品任何时间量以在分析之前进行干燥。例如，一旦分离，收集材料通过LC/MS(液相色谱/质谱)、LC-MS/MS、DPS-SPE-LC-MS/MS(干燥血浆斑点-固相提取-LC/MS/MS)、串联质谱或适于包括阿片类物质的分析物的类似技术进行分析。本发明的多层装置的显著优点是其从单个流体样品获得多个组分并同时进行多个测试的能力。例如，红细胞(RBC)和血浆分别被单独地收集，并且分别单独地进行酶免疫测定(EIA)和SPE-LC-MS/MS生物分析。通过固相酶免疫测定(EIA)分析包含RBC的过滤膜单元或其部分，同时通过SPE-LC-MS/MS分析包含来自流体样品的血浆的收集材料。简言之，EIA程序涉及分离过滤膜单元，其中所述过滤膜单元包括至少一个呈具有切口大小、形状和尺寸的盘状的过滤膜层，其中所述盘包含来自多层装置的RBCs；并将每个盘转移到单个微孔板，以对感兴趣的分析物分析RBC。将多个过滤膜转移到微孔板的多个孔中。向每个孔中加入稀释剂，并培养所述板(O/N；4℃)。然后对板进行温和摇动以混合和稀释。将洗脱剂加入到微孔板的每个孔中并在37℃培养90分钟。将所述板洗涤多次，并将IgG-酶缀合物(conjugate)加入每个孔中，以在37℃下进一步培养。加入底物(substrate)并在25℃下培养。然后向每个孔中加入停止溶液以停止反应。然后读取该板405nm，并测定感兴趣的分析物的存在。

示例5

用于血液中阿片类物质的全自动在线DBSA-SPE-LC-MS/MS生物分析的多层装置的微采样血细胞比容相容的干燥血浆斑点

本领域已知和使用的干燥血液斑点(DBS)技术面临关于血细胞比容相容性的限制。尽管这个问题可以通过全斑点对部分斑点分析的选择来减轻，但是由于不是微采样，将需要大体量采样，影响了易于使用的益处和采样复杂度。相反地，开发出一种血细胞比容相容的干燥血浆斑点(DPS)卡或多层装置，其提供易用性益处并且不需要复杂的体积采样。实际上，在本示例中，多层装置具有夹层形式的卡片构材盖，按照从上到下的顺序，包含两个过滤膜(或红细胞(RBC)膜过滤器)组成的过滤膜单元、由聚酯制成的疏水膜、为血浆收集纤维素基的纸基底的收集材料、以及用于促进直接且紧密接触以有效芯吸(wicking)血浆的凸起支撑件。

使用单个多层装置，通过将等份全血直接施加到RBC过滤器上，然后在最初处于打开形式的情况下闭合多层装置，产生四个斑点。随后，移除血浆收集材料并将其附接到与全自动在线系统兼容的另一支撑件。所使用的在线系统包括Spark-Holland DBSA解吸系统和自动化在线固相提取(SPE)单元，自动化在线固相提取(SPE)单元耦接到LC-MS/MS(配备有RAPTOR Biphenyl柱，2.7μm,2.1mmx50mm的Shimadzu UHPLC和8050三重四极杆)。六种感兴趣的分析物或代表性的阿片类物质，包括吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮、AH 7921、芬太尼及它们的相应的氘标记的类似物或内部标准，以SRM LC/MS正离子电喷电离被监测。

多层装置用于分析由来自单个对象的全血产生的干燥血浆斑点。使用2毫米(mm)夹具采用部分斑点选项。通过流过式解吸，用1毫升(mL)洗脱溶剂(水中含0.1％氢氧化铵(NH₄OH)和3％甲醇(MeOH))在60℃下进行斑点的解吸，其中将20微升(μl)氘代内部标准的回路直接引入到解吸线中。随后，将解吸体积加载到预先调节的SPE载具。使用LC梯度(A：0.1％甲酸/水和B∶100％MeOH)从所述柱体洗脱分析物。初步结果显示对于除芬太尼(其具有从0.2到100ng/mL的范围)外的所有分析物从2变化到1,000ng/mL的良好的线性度(R²＞0.990)，良好的精度(＜20％CV)，在最低的校准点(LLOQ)处的准确度(＜20％RE)，因为没有基质效应(matrix effect)而引起的良好的选择性，并且在LLOQ和ULOQ二者下提取回收率＞90％。在仅2mm的采样面积的情况下，在低到亚ng/mL下建立LLOQ可能仍是一个挑战，然而由于所述的完全集成的在线样品制备和分析系统，其也被实现。

初步数据还显示成功的红细胞过滤以在从约25％至约65％的HCT水平下产生无溶血的血浆斑点。虽然没有进行光谱学测定，但是从该新型多层装置产生的无溶血的血浆斑点也被考虑用于这样的测定。不同于全血，血浆斑点均匀性独立于HCT水平。因此，可以使用部分斑点分析进行从各种HCT水平产生的斑点的分析，并因此不需要大体量采样。通过相应地调整RBC过滤器尺寸，该多层装置用于灵活的采样体积，包括约10μL至约50μL的那些体积的全血。

示例6

使用多层装置，与分析物的在线SPE-LC-MS/MS生物分析耦联的自动流过式洗脱

测试了使用施加到多层装置的全血样品产生的精度、准确度、稳定性、斑点洗脱位置和血浆体积。

化学品、试剂和材料：吗啡，[²H₃]-吗啡、可待因、[²H₃]-可待因、氧可酮、[²H₆]-氧可酮、氢可酮、[²H₃]-氢可酮、苯丙胺、[²H₅]苯丙胺、甲基苯丙胺、[²H₅]甲基苯丙胺、MDMA、[²H₅]-MDMA、苯丁胺、[²H₅]-苯丁胺、甲氧麻黄酮和[²H₃]-甲氧麻黄酮从CERILLIANT^TM(Round Rock,TX,USA)购买。LC-MS级溶剂：乙腈(ACN)、异丙醇(IPA)和甲醇(MeOH)从Honeywell Burdick&Jackson(Muskegon,MI,USA)购买。Milli Q水从内部的

系统获取。甲酸铵、氢氧化铵和甲酸(FA)从

Chemicals Inc.(Gibbstown，NJ，USA)获取。人类血液样品从健康志愿者收集在Na₂EDTA处理的Monoject^TM试管中，在-4℃存放，并在从采血时的四天内使用。制备原液和工作溶液，并将其存放在来自Kimble Chase(Vineland，NJ，USA)的4mL硼硅酸盐琥珀色玻璃小瓶中。血液样品制备在来自

(Hamburg，Germany)的1.5mL Protein LoBind试管中制备。体积移液管是来自

Instrument LLC(Oakland，CA，USA)的Pipet-Lite XLS系列。用于制造书本型多层装置的材料和工艺工具购自Amazon，但以下各项除外：从Perkin Elmer(Boston，MA，USA)的Perkin Elmer 226卡、来自Cards and Pockets(South Easton,MA,USA)的折叠的卡片构材(50.8mm(长度)x76.2mm(宽度))。等级601纤维素纸基底和3256聚酯膜(在这里稍后称为聚酯层)由

Filtration,LLC(Mt Holly Springs,PA,USA)捐赠，和

膜过滤器由international Point of Care Inc.(Toronto，Ontario，Canada)捐赠。

工作溶液的制备：阿片类物质和兴奋剂标准品及其氘化类似物分别以1mg/mL和0.1mg/mL甲醇溶液购买。校准器和QC工作溶液通过稀释含有MeOH∶H₂0(3∶7v/v)的主原液来制备，得到适于八点校准器的0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.25μg/mL、2.50μg/mL、5.00μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL、和50.0μg/mL和适于4QC水平的0.25μg/mL、0.75μg/mL、15μg/mL、45μg/mL。氘代内部标准(IS)溶液是MeOH∶H2O(3∶7v/v)中5ng/mL[²H₃]-吗啡、4ng/mL[²H₃]-可待因，2.5ng/mL[²H₆]-氧可酮，2.5ng/mL[²H₃]-氢可酮、10ng/mL[²H₅]-苯丙胺、10ng/mL[²H₅]-甲基苯丙胺、10ng/mL[²H₅]-MDMA、10ng/mL[²H₅]-苯丁胺和10ng/mL[²H₃]-甲氧麻黄酮的混合物。所有溶液均在-20℃存放。

线性度、精度、准确度和回收率：在成批分析中，在开始时分析一组八个校准器，在该批结束时分析另一组。在两组之间，分析四个QC水平(n＝6)和回收样品(n＝2)。使用同一志愿者的全血，在三个不同的日子重复该分析以获得日内和日间精度和准确度数值。流过式斑点洗脱的自动化平台不能采用常规的回收率测定方法。为了规避这一点，通过在LLOQ下连续5次和在ULOQ下连续10次重复洗脱或提取同一斑点，测定提取回收率。通过(第一次提取的分析物峰值面积/5或10次提取的和)X100来计算回收率。这在没有在线SPE回收率的情况下提供了相对提取回收率。使用分析物/IS峰值面积比来绘制校准曲线(n＝2)，并观察到在定量范围上使用l/x²加权的线性回归，具有R²≥0.9963的线性度(表8)。

曲线范围涵盖标题化合物的治疗和毒性范围(Regenthal，R.等，J ClinMonitComput 1999，15，529-544；Schulz，M.等，Critical Care 2012，16，R136-R136)。在DBS和DPS分析中，IS的引入可以如以前所述的各种方式(Abu-Rabie、P.等，AnalyticalChemistry 2015，87，4996-5003；van Baar，B.L.等，Bioanalysis 2013，5，2137-2145)进行分析。在该示例中，将IS引入到流过式洗脱溶剂；因此，内部标准(IS)不能补偿任何卡上提取差异，例如分析物回收率偏差。规避该问题的一种方式是优化试验回收率，如Abu-Rabie等人(在上面引用的书中)报告对于超过90％的试验回收率观察不到Hct相关的回收率偏差。如表8所示，对于除苯丙胺外的所有各项，该试验的回收率≥90％，其中苯丙胺的回收率为87.8％。日内精度和准确度结果还显示可接受的值(表11)。使用平均日内值(n＝3)来计算日间精度和准确度，结果显示对于所有九种分析物在所有QC水平下通过可接受的标准，但在LLOQ QC水平下，可待因除外，它的值为23％(表9)。

还用吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮和AH 7921在2ng/mL至1,000ng/mL的校准范围测试了线性度。还测试了芬太尼，并且发现其具有线性。芬太尼校准范围为从0.2ng/mL到100ng/mL。图9显示吗啡和芬太尼的线性图。观察到可待因、氧可酮、氢可酮和AH 7921具有与吗啡类似的线性度。下面的表10显示每种测试的化合物的R²值。

表10：

化合物	R<sup>2</sup>
		吗啡	0.9996
可待因	0.9996
		氧可酮	0.9988
氢可酮	0.9984
		AH 7921	0.9968
芬太尼	0.9983

选择性和携带：选择性通过评估双空白(没有IS的基质空白)、空白(具有IS的基质空白)和来自6个单独的基质批次(6个不同的人类全血)的LLOQ(5ng/mL)和ULOQ(1000ng/mL)水平的强化样品来评定。为了评价携带效应(carry-over effect)，在ULOQ之后分析两个空白样品(没有血浆斑点的空白卡)。如图7所示，双空白样品显示可忽略的携带IS信号(总IS强度的约1％)，而空白样品显示不可检测的分析物信号。对于所有九种分析物，在LLOQ水平下观察到良好的色谱分辨率和检测。可以观察到异构体可待因和氢可酮与异构体甲基苯丙胺和苯丁胺的分离。对于所有分析物，在LLOQ和ULOQ下批次间的精度和准确度都在接受标准内(表9)。通过在ULOQ校准器后执行空白斑点(没有样品斑点的空白卡)来评价携带。对于苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA和苯丁胺，观察到不可接受的(≥20％LLOQ信号强度)携带信号。尝试了多种溶剂洗涤和程序，结果显示了改进但未能将携带降低到可接受的水平。因此，通过在ULOQ校准器之后使用两个连续空白(无血浆斑点)来减轻携带问题。通过洗涤程序，每次运行的LC MS/MS循环时间从4.3分钟增加到6.2分钟。

灵活体积采样由20μL、30μL和50μL全血进行。测试的阿片类物质是吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮、AH 7921和芬太尼。使用30μL全血来制备校准曲线。强化水平是在LLOQ QC(2ng/mL或0.2ng/mL)下的。图10和图11示出了对从20μL-50μL的灵活体积采样的测试结果。图10的在不同全血样品体积-20μL、30μL和50μL(每种阿片类物质的从左到右的柱)的每种阿片类物质的阿片类物质浓度显示为类似于吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮和AH 7921，但芬太尼在所有体积中具有低得多的浓度。图11示出了对于(A)20μL、(B)30μL和(C)50μL的全血，在LLOQ QC下的精度和准确度通过了关于相对误差(RE)的±20％和关于变异系数的20％的要求标准。

示例7

使用多层装置与分析物的在线SPE-LC-MS/MS生物分析耦接的自动流过式洗脱

从全血施加到这里所述的多层装置产生的干燥血浆斑点允许红细胞(RBC)过滤，其由简单的床旁检测(point-of-care)样品收集产生血浆，并且不需要离心。通过采用与在线SPE-LC-ESI-MS/MS耦接的全自动化的流过洗脱来开发和验证用于自动分析全血流体样品中的感兴趣分析物的多层装置。四种代表性的感兴趣的分析物的定量测定包括阿片类物质(吗啡、可待因、氧可酮、氢可酮)和五种兴奋剂(苯丙胺、甲基苯丙胺、3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、苯丁胺和甲氧麻黄酮)以及以使用它们相应的氘标记的类似物作为内部标准的一种方法。方法验证结果显示在从约5至约1,000ng/mL范围内良好的线性度(R²≥0.9963)。在四种质量控制(QC)水平下，日内和日间精度和准确度位于可接受的限度内。提取回收率在定量下限(LLOQ)和定量上限(ULOQ)下为≥87.9％以及可接受的选择性和敏感性。DPS卡上短期稳定性是依赖于化合物的和依赖于存放情况的。经验证的书本型多层装置的额外益处包括Hct的更宽的应用范围(30％至60％)、自动化在线分析兼容性、更高的血浆体积产率以及灵活采样容积的特征。

表11：四种阿片类物质和五种兴奋剂的日内精度和准确度

表11(续)：

示例8

使用多层装置分析RBC和网织红细胞表面蛋白质

从顶部单元中取出包含红细胞和它们的前体的多层装置的顶部单元中的过滤膜圆盘，并使用免疫测定或LC-MS/MS技术分析过滤膜的蛋白质和其它组分。在从多层装置去除过滤膜盘之后，用乙醇缓冲溶液覆盖一部分盘或整个过滤膜盘，并放置在超声发生器(sonicator)中足够长的时间以除去可溶性蛋白质。在用蛋白酶水解后，从过滤膜释放膜结合蛋白质，例如但不限于带3(band 3)或转铁蛋白受体，并通过LC-MS/MS定量分析所得肽。

本领域已知和使用的类似方法可用于定量细胞内蛋白质。

在远程位置收集干燥的细胞组分并定量化细胞表面蛋白质的能力提供了优于其它样品收集技术的显著优点。例如，使用这里描述的干燥的血液技术避免在血液的液体样品的存放期间观察到的网织红细胞成熟变化。

本发明的示例还可以包括：

1.一种干燥血浆斑点卡，其包括：卡片构材；以及血浆收集基底，其耦接到所述卡片构材且包括聚酯膜以提高所收集的血液样品的均匀性。

2.卡I的干燥血浆斑点卡，其中所述纸血浆收集基底控制所收集的血液样品的浓度分布。

3.卡2的干燥血浆斑点卡，其中所述浓度分布基于所收集的血液样品的中心和周缘位置之间的差异。

4.卡1的干燥血浆斑点卡，其中收集所收集的血液样品以确定所收集的血液样品的血细胞比容。

5.卡1的干燥血浆斑点卡，其中所述血浆收集基底具有第一端和第二端。

6.卡5的干燥血浆斑点卡，其中所述纸血浆收集基底相对于所述卡片构材向外弯曲，使得仅所述第一端和第二端耦接到所述卡片构材，并且所述基底的内部区域与所述卡片构材分离。

7.一种方法，包括：提供干燥血浆斑点卡，其包括：卡片构材和血浆收集基底，所述血浆收集基底耦接到所述卡片构材并且包括聚酯膜以提高所收集的血液样品的均匀性；在所述血浆收集基底上收集血液样品；以及针对阿片类物质分析所收集的血液样品。

8.方法7的方法，其中所述纸血浆收集基底控制所收集的血液样品的浓度分布。

9.方法8的方法，其中所述浓度分布基于所收集的血液样品的中心位置与周缘位置之间的差异。

10.方法7的方法，进一步包括测定所收集的血液样品的血细胞比容。

11.方法7的方法，其中所述血浆收集基底具有第一端和第二端。

12.方法11的方法，其中所述纸血浆收集基底相对于所述卡片构材向外弯曲，使得仅所述第一端和所述第二端耦接到所述卡片构材，并且所述基底的内部区域与所述卡片构材分离。

以上描述是说明性的而不是限制性的。通过阅读本申请的公开内容，本发明的许多变型对于本领域技术人员将变得明显。因此，本发明的范围不应参考以上描述来确定，而是应参考待决权利要求及其全部范围或等同物来确定。

在此引用的所有专利、专利申请、公开的文章、摘要、书籍、参考手册、文摘等的内容全部以引用方式并入本文，以更充分地描述本申请所属领域的状况。

在不偏离本发明的范围的前提下，来自任何实施例的一个或多个特征可以与任何其他实施例的一个或多个特征组合。表述“一”、“一个”或“所述”旨在表示“一个或多个”，除非专门指出相反。表述“和/或”旨在表示术语的涵义最丰富的意义，除非专门指出相反。

本系统的元件中的一个或多个要素可以主张为用于实现特定功能的装置。在使用此类装置加功能要素来描述所主张系统的某些要素的情况下，在本说明书、附图和权利要求位于所属领域的技术人员面前时，所属领域的技术人员将理解，对应结构是通用计算机、处理器或微处理器(视情况而定)，其使用在任何通用计算机中发现的功能而无需专门编程和/或通过实施一个或多个实现所述功能的算法，编制程序来执行特别地描述的功能。如本领域的普通技术人员将理解的，算法在本申请内可以表达为数学公式、流程图、文字描述和/或提供本领域普通技术人员实现所述过程及其等同物的足够结构的任何其他方式。

虽然本申请可以以许多不同的形式体现，但是附图和讨论是在理解本申请是一个或多个发明的原理的示例的情况下呈现的，并且不旨在将本发明中的任何一项限制于所示出的实施例。

本申请提供了上述长期感觉需求的解决方案。具体地，这里描述的系统和方法可以被配置为改进对卫生保健服务提供商的管理。本领域技术人员将容易想到上述系统和方法的其它优点和改型。因此，本申请在其更广泛的方面不限于前面显示和描述的具体细节、代表性系统和方法以及说明性示例。在不脱离本申请的范围或精神的情况下，可以对以上说明书进行各种修改和变化，并且本申请意图覆盖所附权利要求及其等同物的范围内的所有这样的修改和变化。

Claims (19)

1.一种多层装置，包括：

a)顶部单元，所述顶部单元包括以下层：具有至少一个切口的顶盖(2)、过滤膜单元、和具有至少一个切口的疏水膜(4)，所述疏水膜(4)的所述至少一个切口与所述顶盖(2)中的所述至少一个切口具有相同的形状和尺寸；和

b)底部单元，所述底部单元包括以下层：不具有切口的吸收层(5)和底盖(7)，

其中所述顶部单元相邻于并且连接到所述底部单元，所述过滤膜单元包括两个孔径大小减小的过滤膜，每个过滤膜具有所述切口的形状，所述过滤膜单元定位在所述顶盖(2)的所述切口内并且与所述疏水膜(4)相邻，所述疏水膜(4)夹在所述过滤膜单元和所述吸收层(5)之间，所述吸收层(5)与所述疏水膜(4)相邻，并且所述吸收层(5)位于所述底盖(7)上方。

2.如权利要求1所述的多层装置，其中所述装置具有带有四个边缘的矩形形状。

3.如权利要求2所述的多层装置，其中所述顶部单元的每个层(1，2，3，4)和所述底部单元的每个层(5，7)耦接在所述矩形形状的至少一个边缘上。

4.如权利要求3所述的多层装置，其中所述顶部单元的每个层(1，2，3，4)和所述底部单元的每个层(5，7)是可移除的。

5.如权利要求1所述的多层装置，还包括位于所述吸收层(5)下方和所述底盖(7)上方的接触支撑层(6)。

6.如权利要求5所述的多层装置，其中所述接触支撑层(6)包括至少一个凸起支撑部，所述凸起支撑部位于所述切口内并与所述吸收层(5)接触。

7.如权利要求1所述的多层装置，还包括窗支撑件，所述窗支撑件包括附接到用于后续分析的层的窗。

8.如权利要求7所述的多层装置，其中所述窗支撑件与完全自动化在线分析系统兼容。

9.如权利要求7所述的多层装置，其中所述用于后续分析的层是过滤膜单元或吸收层(5)。

10.如权利要求1所述的多层装置，其中所述至少一个切口包括1个切口至4个切口。

11.一种使用权利要求1所述的多层装置的方法，包括：

a)将一定体积的流体样品施加到所述多层装置的所述过滤膜单元上；

b)等待约3分钟，其中所述顶部单元与所述底部单元接触；

c)将所述过滤膜单元和所述吸收层(5)从所述多层装置分离；

d)等待约30分钟，同时干燥所述分离的过滤膜单元和/或所述吸收层(5)；和

e)分析所述过滤膜单元和/或所述吸收层(5)。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述体积为约10微升至约100微升。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述过滤膜单元耦接到窗支撑件，所述窗支撑件与完全自动化在线分析系统兼容。

14.权利要求11所述的方法，其中所述吸收层单元耦接到窗支撑件，所述窗支撑件与完全自动化在线分析系统兼容。

15.一种使用权利要求1所述的多层装置的方法，包括：

a)将一定体积的流体样品施加到所述多层装置的所述过滤膜单元上；

b)等待约3分钟，其中所述顶部单元与所述底部单元接触；和

c)存放所述多层装置。

16.如权利要求15所述的方法，还包括：

d)将所述过滤膜单元和所述吸收层(5)从所述多层装置分离；和

e)分析所述过滤膜单元和/或所述吸收层(5)。

17.一种3D打印的多层装置，包括：

(a)顶部单元，所述顶部单元包括以下层：具有四个孔的顶盖(2)；过滤膜单元；和具有四个孔的疏水膜(4)，所述疏水膜(4)的所述孔与所述顶盖(2)中的所述孔具有相同的形状和尺寸；和

(b)底部单元，所述底部单元包括以下层：吸收层(5)；窗支撑件，和具有凸起的接触支撑部的底盖(7)，

其中所述顶部单元连接到所述底部单元，夹住所述多层装置的中间层，其中所述过滤膜单元包括两个过滤膜盘，其中所述过滤膜单元包括上过滤膜盘和下过滤膜盘，其中每个过滤膜盘包含顶表面和底表面，所述上过滤膜盘的所述底表面与所述下过滤膜盘的所述顶表面相邻，其中所述过滤膜单元同心地定位在所述顶盖(2)的四个孔中的每个孔的周缘内，并且所述过滤膜单元同心地定位在所述疏水膜(4)的四个孔中的每个孔的周缘内；所述疏水膜(4)相邻于所述顶盖(2)，并且所述疏水膜(4)相邻于所述吸收层(5)，所述吸收层(5)固定到所述窗支撑件，其中所述窗支撑件具有窗，所述孔和所述吸收层(5)定位在所述窗上方，并且通过所述窗暴露的所述吸收层(5)相邻于所述底盖(7)的所述凸起的接触支撑部。

18.一种使用权利要求17所述的多层装置的方法，包括：

a)将一定体积的全血施加到所述多层装置的所述过滤膜单元；

b)等待足以使所述全血的血液组分分离的时间；和

c)存放所述多层装置。

19.如权利要求18所述的方法，还包括：

d)将所述过滤膜单元和所述吸收层(5)从所述多层装置分离；和

e)分析所述过滤膜单元和所述吸收层(5)。

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