BR112013002064B1 - Dispositivo e metodos para filtragem do plasma sanguíneo - Google Patents
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Abstract
DISPOSITIVOS E MÉTODOS PARA A FILTRAGEM DO PLASMA SANGUÍNEO. A presente invenção fornece sistemas, dispositivos, kits e métodos para separação de plasma sanguíneo do sangue total. Especificamente, a presente invenção fornece sistemas, dispositivos e métodos para separação de um volume fixado de plasma sanguíneo do sangue total com consumo mínimo de energia.
Description
Este pedido relvindica priori-dade DO Hedi do de Patente Provisbrip U.S. No. de serie 61/368,1*)6, deposit-ado em 27 de julho de 2'313, que neste assunto e 1 no orpora do por referencia dm sua tdtalidade.
A presente invenpao fornece sistemas, dispositivos, kits e metodos para separagao de plasma sanguineo do sangue total. Especialmente-, a presente invenpao fornece sistemas, dispositivos e metodos para separagao de um volume (o. ex., volume fixado) de plasma sanguineo db sangue total com consume minimo de energia.
Diversos processes a montante sao necessaries antes que. um fluido biol.ogico complexo possa ser analisado quanto a analitos. Por exemplo, para realizar deteepao de carga viral de HIV, a separate entre- plasma e sangue a a primeira etapa a montante uma vez quo homoglobina e colulas sanguineas interfered na amplificapao e na deteepao do RNA viral. A separaqao do plasma e tambem um processo decisive a montante para a deteegao e o diagnostico de doengas infecciosas. Por exemplo, a deteepao de HIV em adultos usando-se anticorpps anti- HIV especi I iou a deteegad de I1T.V em liictentes usando-se uma pre^terna p2/i do nuc I eo do HIV requer a separacad de plasma do sangue total.
Em condiQoes laboratoriais, a separaqao de plasma do sangue Lol.al e rea i i zada po.r centr i lugagao do sangue por z.Q mimuLos a i.QUO g. Dense modo, os GOmponentes sblidos do sangue dcpQsitam-.se no sediniento e o liquido sobrenadante consists em plasma. Esse protocolo usualmente requer um tecnico treinado para extrair manualmente por pipeta o sobrenadante para analise posterior. Embora sistemas de proparacao de amostras automatizados em grande escala possam ellminar a etapa manual, esses equipamentos sao de instrumenta$3o dispendiosa, o que os torna inadequadas para testes com recur.sos limitados ou equipamentos portateis de t e s t e .
Mdtodos ten side? desenvol vidos para .integrar a separagao de sangue por centrifuga com outras etapas a jus-ante por meio de uma plataforma de microfluido (Brenner et al. Special Publication-Royal Society of Chemistry 200'4, 296:566-568; Haeberle et al. Lab on a Chip 200 6, 6:776-781;Kang et al. Special Publication-Royal Society of Chemistry 2004, 2 96:614 -61 6; M.adou et al. Biomedical Microdevices 2001, 3:245-254; Toner & Irimia. Annual Review of Biomedical Engineering 2005, 7:77-103; Luo et al. J Clin: Microbio/2005, 4 3 :1851 -1857 , neste assunto incorporados por referenda em sua totaiidade) . Entretanto, esses metodos trab.alham com um volume extremamente limitado de sangue, requerem o uso de um instrumento para criar a forgacentrifuga, tendem a obstrucao por residuos e/ouproporcionam pureza apenas limitada. 0 uso de membranas sinthtieas para separar sangue de plasma evita alguns dos probleraas or.ginados por centrifugapao c sistemas de micro tluddos; todavia, os dispositivos s<-lo uomplexos em. razao da necessidade de multiplas camadas de filtro (Vogel el. al. Boehringer Mannheim GmbH, 1.984; Vogel et al. Boehringer Mannheim GmbH, 1989, neste assunto incorporados por referencia em sua totaiidade), sac inerentementeif rage is e os materiais de membrana empreg.ados sao de dificil uso (p. ex., fibra de vidro), compreendem materials que interferem em analises (Baumgardner & Loewen. Ahlstrom Filtration, Inc., 1993; Loewen & Baumgardner. Tappi Journal 1996, 79:183-184, neste assunto incorporados por referenda em sua totalidade) e contem materials que retardam o fluxo de sangue para os filtros (Suzuki & Ho: A magnetic force driven chaotic micro-mixer, PP. 40-43, 2.002:40-43, neste assunto incorporados por referenda em ?ua totalidade) .
Em algumas modalidades, a presents invengao fornece um metodo de filtraqao de plasma sangufneo compreendendo (a) fornecimento de: (i) um modulo de filtro, em que o modulo de filtro compreende um filtro configurado para permitir passagem de plasma sanguineo mas nao de outros componentes do sangue; (ii) urn modulo de coleta do plasma, em que o modulo de coleta de plasma compreende uma membrana de coleta configurada para extrair plasma sangufneo para o modulo de coleta de plasma por aqao capi.lar; e ( i i :i J uma amostra de sangue; (b) administragao da amostra de sangue no filtro do modulo de filtro; (c) colocagao da membrana de coleta do modulo de coleta de plasma em con La to dire to com o filtro do modulo de filtro; e (d) extragao do plasma sanguineo atraves: do fill.rg. para o modulo de coleta de plasma. Em algumas modalidades, a cxl. racao e passive. Em algumas modalidades, a cxtracao nao rc-’quer elelroforcse, centrifugagSo ou Lensao maior que a pressao aLmosfer.i ca. Em algumas modalidades, o modulo de filtro acomoda um volume fixado da amostra de sangue. Em algumas modalidades, o modulo de coleta do plasma acomoda um volume fixado de plasma. Em algumas modalidades, o volume fixado do m/xiulude Coleta de plasma e menor que o volume fixado do modulo de filtro. Em algumas modalidades, o volume fixado do modulo de coleta de plasma independe do volume da amostra de sangue. Em algumas modalidades, o volume fixado do modulo de coleta de plasma independe do hematocrito da amostra de sangue. Em algumas modalidades, o filtro compreende uma membrana VIVID GF. Em algumas modalidades, a membrana de coleta compreende um coxim de coleta de fl bra AHLSTROM 142. Em algumas modalidades, as membranes de coleLa compreendem um coxim de coleta de fibra PALL A/D. Em algumas modalidades, o metodo compreende ainda (e) um suprimento de plasma no modulo de coleta de plasma.
Em algumas modalidades, a presente i.nvenqao fornece um dispositivo para separaqao de plasma do sangue total compreendendo: (a) um modulo de filtro, em que o modulo de filtro compreende um filtro confiqurado para permitir passagem de plasma sanguineo mas nao de outros componentes do sangue; e (b) um modulo de coleta de plasma, cm quo o modulo de coleta de plasma compreende uma membrana do coleta configurada para extrair plasma sanguineo para o modulo de coleta de plasma por agao capdlar. Em algumas modalidades, o modulo de filtro acomoda um volume fixado de sangue total.. Em algumas modalidades, o modulo de coleta de plasma acomoda um volume iixado de plasma. Em algumas modalidades, o volume fixado do modulo de coleta de plasma e menor quo o volume fixado do modulo de rilt.ro. Era algumas modalidades, o filtro compreende uma membrana VIVID GF ou VIVID GR. Em algumas modalidades, a membrana de coleLa compreende um. coxim de coleta de fibru AHLSTROM 142, l-’Al.l. ACCUWIK ou PALL A/D. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende PMPs no modulo de coleta. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende reagentes de analise no modulo de coleta.Modalidades ad.i cionais sao descritas aqui.
A Figura 1 mostra incidencia lateral que exinc o ponto de adigao de sangue sobre a membrana, o lado do sangue e o lado do plasma na membrana.
A Figura 2 mostra uma configuragao do fluxo lateral exibindo. o coxim da amostra que separou as celulas sanguineas do plasma, o coxim do coleta que recolhe um volume fixado de plasma e um coxim de absorgao para coletar o plasma extra.
A Figura 3 mostra um arrange de fluxo vertical; as membranas de separagab de celulas e de coleta do plasma sao clampeadas entre uma lamina plastics superior e uma lamina da base.
A Figura 4 mostra a estrutura quimica do poll cation Merquat.
A Figura 5 mostra um grafico de limiar ciclico (CT) versus log1-0 (copies de RNA viral do HTV-1) : os quadrados denotam os valores de C., obtidos quando uma amostra de plasma cont endo 11.1V—] foi puriticada usandu-sc o metodo IFF; os losangos denotam os valores de CT obLidos quando V’Fl Cod usada pa' a soparar plasma do sangue total contendo HIV-1 e Ahlstrom 142 fol usada para coleta do plasma.
A Figura 6 mostra uma incidencia de segao transversal de fragmonte colunar feito por tecnologlas 1 OX exibindo pilares que tem 14 pm de altura e dimensao da bast? de 152 pm.-
A Figura 7 mostra um desenho ilustrativo da unidado de plasma Bangui neo. A unidade de plasma sanguine® possui duas partes, um modulo de soparagac de ceil o Las e ura modulo de plasma. Apos a separagao, o modulo de plasma e removido e t cans fer ido para o cartucho para processamento no analisador do sistema.
A Figura 8 mostra um modulo ilustrativo de separagao e coleta de plasma de primeira geragao: (a esquerda) membrana de separagao de c^lulas PALL VIVID GR conectada com o modulo de separagao; (no centro) membrana de coleta de plasma PALL ACCUWLK conectada com o modulo de coleta; (a direita) modules de separagao e de coleta conectados entre si para separagao de plasma do sangue total.
A Figura 9 mostra mpdulos ilustrativos de separagao e de coleta de plasma de segunda geragao: (da esquerda para a direita) o modulo de separagao de eelulas- conectado a membrana PALL VIVID com o adesivo, o acessorio antirrotagao conectado a PALL ACCUWLK e o dispositive de posicionamento rosqueado.
A Figura 10 mostra um mecanismo de posicionamento para estudos da pressao da unidade de sangue-plasma.
A Figura 11 mostra um graf.Lco do limiar ciclico do volume de plasma coletado. (quadrados) e nsLlrrtado para 600 Cop Las de virus HIV-1 por mL de sangue (tri Angulos) VOZSJUS volume de sangue total adicionado a unidade de sanciuc- p Lasma.
A Figura 12, mostra um graftco do volume de plasma colet.ado na membrana PALL ACCDWIK (modulo de coleta de plasma) por; meio da adigao de 125 uL de sangue a unidade de sangue-plasma em t. res da ferentes tamanhos da membrana VIV I D.
A Figura 13 mostra um graflcp do ll.mJ.ar ciclico do volume de plasma coletado (quad fades) d ostimado para 600 coplas de virus HIV-1 por mL de sangue (ci reales) versus niveis do hematocrito no sangue (%).
A Figura 14 mostra um grafico do volume de plasma separado (uL) de 125 pL de sangue total usando-se o modulo de separagao e de coleta de plasma versus o hematocrito do sangue (porcentagem). Os quadrados denotam a quantidade media de plasma obtida de uma amostra de sangue diferente medida em duplicates. A linha sol Ida denota o volume medio de sangue coletadu de todas as amosl raa e as J inhas tracejadas mostram a m6dia ± 2 desvios padroes.
A Figura 15 mostra um desenho esquematico dos processes de IPF: (a esquerda)1 PM P's ligam-se a NA e sao removidas por um magneto extern© do tampao de Use para o tampao de eluigao por rrieio de cera liquida.; (a dlreita) cartucho moldado contendo tampao de Lise, tampao de e)uiqao e uma cera liquida colorida.
A Figura 16 mostra um grafico de Jimiar ciclico (CT) versus log10 (copias de HIV-1 por pL de plasma) . Os quadrados denotam amostras separadas usando-se o modulo do separaqao e cd'lota do plasma e as. formas ovals denotam po.nLos separados usaiido-sc centri I uga<;ao.
A Figura 17 most ra R'T-PCR quant i LaL i va para HIV-1 de plasma com PMPs da Ambion armazenadas cm membrana. ACCUWIK: a curve padrao dos valpres de pura 4 d Lterenl.es concentragoes de RNA representada graflcamentc versus o log10 do numero de capias virais de HIV-1. Os quadrados solidos sao os valores de CT.
A Figura 18 mostra um graficO' do Bl and-Altmar, comparando as amostras corn BMPs em Lampsp de lise e na membrana ACCUW.IK: quadratics sei Idas mestrani a diferenga entre os dots metodos.
A Figura 19 mostra que as membranas de separagao de sangue .e coleta de plasma nao atraem significativamente analito proteina p24.
A Figura 20 mostra que -nenhuma perda de sinal especifico de analito e observada no plasma coletado de sangue total corn pi cos de analito separado com ijm dispositivo da presente invengao.
A Figure 21 mostra que nenhuma perda de slna.l especilico de anal i Lo e observada no plasma coletado de sangue total com pices de analito separado com um dispositivo^ da presente Invengao.
A Figura 22 mostra que a produce:.) de sinal dos coxins de coleta dessecados com detergentes especifices da anali.se e comparavel a reagoes com detergentes em solupao.
A Figura 23 mostra que a produpao de sinal de coxins de coleta dessecados com detergentes e analito proteico espeefficos da ana Li se e comparavel. a reapoes com detergentes e analito em solUQao.
A Figura 24 mostra urn desenho esqiiemat I co de um components de pl.ast.lco desca r La vol (do uso uni.co) em form;.: de concha., parle do elemorito do filLro. A concha Integra urn filtro de soparaqap proprio e ostabeleco inLorfuce com um GlcmenlQ extdrnc do coleta do plasma, que coru ora a mombrana;de coleta.
A Figura 25 mostra: (a) a metade superior de uma concha e dobrada e fechada. As algas de travamento direita e esquerda prendem e mant&m a concha fechada, conforme mostrado na projegao de corte transversal em (b).
A Figura 2 6 mostra (a esquerda) uni desenho esquematico da parte piastica da concha. Um filt.ro de separagao e alinhado e unido a concha, aqui, por meio de um gerenciador de energia usando-se soldadura ultrassonica;. e (a direita) urn desenho esquematico da concha integrada e o filtro de separagao. 0 plastics gerenciador de energia funde-se com o filtro de separagao e o circunda, criando uma barreira do tipo pseudoanel.
A Figura 27 mostra (a esquerda) um desenho esquematico de uma concha fechada e prendida, que possui um filtro de separagao ligado a ej a (p. ex., por meio de soldadura ultra.ssoni ca usahdo-se um gerenciador de energia); e [a direita) uma projcgao de corte transversal do desenho esquematico da esquerda mostrando que o filtro de separagao esta ligado de modo que, quando a concha 6 fechada, e nivelado com a metade inferior da concha.
A Figura 28 mostra (a), no desenho esquematico do elemento de coleta de plasma na vista superior, uma fita pias.tica para teste do substrate com uma poquena porgao de adesivo bilateral compa t.i vol com diagnosi. i co, quo se Liga a mombrana de coleta da fita para taste de subsLrato; (b) vi.sLa lateral do elemento de coleta; (c) projegao da wist a lateral ampliada (rel.angulo em linhas 1. r. accj adas) mosLrando a dobra, a perfuragao e a camada dclgada de adesivo quo so.11 ga a fi ta para Lqstc de substrato o Si membrana de coleta.
A Figura 29 mostra (S esquerda) desenho esquematico do elemento de coleta de plasma e do elemento do filtro com sua membrana e seu filtro respectivos; e (a direita) o elemento de coleta encaixado no elemento do filtro pela fen da e alinhado com a parede posterior.
A Figura 30 mostra (a esquerda) o elemento de coleta integrado com o elemento de filtro, onde a metade superior da concha foi descida e travada pelas algas do travamento. (a direita) isto permits que o filtro de separagao e a membrana de coleta se sobreponham e se comprimam, o que facilita a separagao do sangue.
A Figura 31 mostra (a esquerda) um desenho esquematico que exibo o modulo montado para a separagao do sangue; e (a direita) uma vista lateral transparente do modulo montado mostrando a aba que se encaixa com a dobra na fiLa para teste de substrate do elemento de coleta.
A Figura 32 mosLra uma perspectiva geral pot etapas do prdeesso do separacao de sangue usando-se um elemento de filtro e um elemento de coleta de plasma do tipo concha: (a) distribuigao da amostra se sangue no filtro de separagao; (b) o filtro de separagao conduz o plasma para a membrana de coleta; (c-d) o operador comprime a metade inferior das algas de travamento esquerda e direita para abrir a metade superior do elemento de filtro; e .(e) o elemento do filtro e o elemento de coleta sho soparados um do outro e podem ser usados para processes de teste subsequenLe (p. ex., contagem de CD4, PCR, imunoensa i o) - DF.FINIQOES
Para fuel I i Lar a compreensao da pregentc invengSo,di versos Lermos c expressdes- sao def in Ido s adiante:
Conforme se usa aqui , o termo "individuo" refere-se a organismos a serem tratados pelos metodos da presents invengao. Tais organismos preferivelmente incluem, mas nao se limitam a, mamiferos (p. ex., murines, simios, equinos, bovinos, suites, card.nos, felines, primatas etc.) e mats preferivelmente a humanos. No con.textd da Invenpao, o termo. "individuo" tipicamente se refere aquele que fornece a amostra ou do qual a amostra foi retirada (p. ex., amostra de tecido, amostra de fluido [como amostra de sangue]). 0 termo "paciente" e ern geral usado quando a referenda d a um individuo humano.
O termo "diagnosticado", conforme se usa aqui, refere- se a detecgao de uma doenqa por seas sinais e sintomas (p. ex., resistencia a terapias convencionais) ou por analise genetica, analise patologica, analise histologies e o equivalente.
Conforme se usa aqui, a express®© "in vitro" refere-Se a um ambiente artificial, e a processes ou reaqdes que ocorrem. dentro de um ambiente artificial. Ambientes in vll.ro incluem, mas nao se limitam a., tubes de teste. A expressao "in vivo" re.fere-se ao ambiente natural (p. ex., um animal ou uma ceiula) e a processes ou reapdes que ocorrem dentro de um ambiente natural.
Conforme se usa aqui, o termo "amostra" e usado em seu sentido mats ample. Uma amostra pode compreender uma ceiula, um tecido ou fluidos (p. ex., sangue, plasma etc.), material is,dad© do uma ceiula, DNA qendmico (em solugao ou ligado a um suporte sblido a exemplo de analise de Southern biot), RNA (em. solugao ou ligado a um suporte s6Lido a exemplo de analise de Northern blot), cDNA, (em solugao ou ligado a um suporte sd.lido) e o equivalent®.
Confprme se usa aqui, os termos "iso1ar" ou "iso1ado" refere;:? so a uma amostra cue e identificada e sepa.rada de pelo menos um components ou contaminant® ao qual ela esta ordinariamente -associada em sua for. Lu natural. Uma amostra isolada esta na presente em uma forma ou condigao que e diferente daquela em que ela e encontrada na natureza. Ao cgntr&.rio, qma amostra nao isolada e encontrada no estado em que ela existe na natureza.
Conforme se usa aqui, os termos "purd.fic.ado" ou "puriftear" referenr-se a remogao dos componentes (p. ex., contaminantes, componentes nao desejados) de uma amostra. Conforme se usa aqui, a expressao "substancialmente purlfioada" refere-sc a moleculas que sao pelo menos 60% livres, preferivelmente 75% livres e mais preferivelmente 90%, 95%, 99%, ou mais, livres de outros componentes aos quads ela usua1mente esta associada.
A presente invenpao fornece si.stern.as, disposi.Li.vos, kits e metodos para separaqao de plasma sanguineo do sangue total. Especificamente, a presente invengao fornece sistemas, disposiLivos e metodos para separagao do um volume (p. ex., um volume fixado). de plasma sanguineo do sa.ngue .total com consume miniino de energia. Em algumas modalidades, a presente invengao tornoco sistemas e dispositivos para soparaqad de plasma sanguined do sangue total. Em algumas modalidades, dispositivos separam. plasma sanguineo de outros componentes do sangue (p. ex., celulas s.anguineas) . I:’.m algumas modalidades, dispositivos purificam plasma sanguineo. Em algumas modalidades, dispositivos isolam plasma sanguineo. Em algumas modalidades, dispositivos concent, ram plasma sanguineo. Em algumas modalidades, dispositivos separam e concentram -ef etivamente um volume fixado de plasma do sangue total, Em algumas modalidades, a piesehte invenqSo separa, isola, putifIda e/ou concentra plasma sanguineo do sangue total set consumo adicional de energia (p. ex., sem exigencia de aquecimento, cent.rifugag.ao, eletricidade etc.). Em algumas modalidades, a presents- invenpao fornece um elemento- de filtro c urn elemento de coleta. Em algumas modalidades, sangue total, (p. ex., nao fl 1. trade) e adicionado a um elemento de filtro, e o sangue e aspirado (p. ex., por agao capilar, por gravidade etc.) atraves do elemento de filtro para o elemento de coleLa.Em algumas modalidades, a presente invengao fornece um element©- de filtro. Erri algumas modalidades, um ou mais componentes do sangue (p. ex., c-omponen Les celulares) movem-se mats lentamente atraves do elemento de filtro doque o plasma do sangue. Em algumas modalidades, componentes do sangue a excegao do plasma (p, ex., componentes celulares) movem-se mais lentamente atraves do elemento do filtro do que o plasma. Km algumas moda Iidadea, um ou mais componentes do sangue (p. ox., componentes celulares) sao incapaz.es de s.& mover atraves do elemento de fi itrp, Em algumas modalidades, componentes do sangue a excegao do plasma (p. ex., componentes celulares) sao ineapazes de se mover atraves do elemento de filtro. Em algumas modalidades, plasma sanguineo rapidamente Cp. ex., mais rapidamente que outros componentes do sangue.) avanpa atravds do elemento de filtro rumo ao elemento de filtro e/ou no elemento. de filtro. Em algumas modalidades, o elemento de filtro compreende um filtro, uma membrana, uma matriz e/ou um coxim capaz.es de separar plasma sanguineo de outro® componentes do sangue com base em capIlaridade. Embora a presente invengao nao se Limite a nenhum wecanismo de agao especificp e a compreensad do mecanismo de agao nao seja necessaria para praticar a presente invengao, o movimento de um liquido atraves de um material por agao capilar e controlado pela equagao:
em que y e a lensSp superficial na interface liquido-ar (energla/arca), 0 e o angulo de contato, p e a densidade do liquido (massa/volurae) , g e aceieragao decorrente de gravidade (comprimento/tempo'-') e r e a trajer.dria do ralo atraves do material (comprimento). Portanto, diferentes liquidos movem-se atraves de um material em diferentes taxas com base ria tensao superficial na interface liquido- ar e na densidade dos liquidos. Em algumas modalidades, plasma move-se mais rapldamente atraves de um material (p. ex., elemento do filtro) do que oulros componentes do sangue (p. ex., componentes celulares). Em algumas modalidades, a presente invengao sep-ara plasma sanguineo de qut.ros componentes do sanquo total com base em diferengas na l.axa do movimento gapijar atraves de um material de filtro. Em algumas modalidades, um elemento de filtro compreende um filtro e/ou membrana eonf 1 gurados para permit)r passagem de plasma sanqulneo e outros componentes do sangue total cm diferentes taxas. Em algumasmodalidades, um elemento de filtro compreende uma membrana de separaqao tie -plasma. Em algumas modalidades, um elemento de filtro compreende uma Membrana de Separaqao de Plasma VIVID. Em algumas modalidades, um elemento de filtro compreende uma Membrana de Separaqao de Plasma VIVID GF. Em algumas modalidades, um elemento de filtro e configurado para separa.r um volume definldo de sangue total (p. ex., 15 pL, 25 pL, 50 pL, 75 pL, 100 pL, 125 pL, 150 pL, 200 pL, 300 pL, 400 pL, 500 pL, 750 pL, 1 mL, 2 mL, 3 mL etc.,) . Em algumas modalidades, o elemento de filtro compreende uma membrana de qualquer tamanho apropriado. Em algumas modalidades, o elemento de filtro compreende uma membrana de qualquer diametro apropriado (p, ex., 5 mm... 8 mm... 10 mm... 12 mm... 15 mm .... 18 mm. . . 20 mm. . . 25 tnm. . . 30 mm . . . 40 mm... 50 mm... etc.). A presente invengao nao se limite aos materials usadqs no elemento de filtro, e qualquer material inferido por uma pessoa no campo que fornepa qualidades adequadas de filtragao pode encontrar uso na presente invenpao. Em algumas modalidades, um elemento de filtro e descartavpl. Em algumas modalidades, um elemento de filtro e reutilizavel. Em algumas modalidades, um filtro compreende uma concha moldada (p, ex., concha moldada descartavel) (VER FIGS. 24-25). Em algumas modalidades, um elemento de fill,rq compreende uma concha (p. ex., concha do use unico) e um filtro de sep.araqao (VER FISH. 25-27). Em algumas modalidades, um componenle da concha e mol dado por injeqao (a partir de uma resina plasl.J.ca moldada),. Em alqumas modal [dudes, um elemento de filtro. uomproonde um cornponento da concha inteqrado com um filtro de s¶pao. A presents, invenpao nao se Jimi La aos materials ou a confiquraqao usados no elemento de filtro, e qualquer material inferido por uma pessoa no campo- que fornega qualidade.s de fl Itragao adequadas pode cncontrar uso na presents invengao.
Em algumas modalidades, a presente invengao fornece um elemento de coleta. Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende um substrato, um coxim, um material da matrix e/ou um filtro. Em algumas modalidades, um elemento de coleta e configurado para coletar um volume fixado deplasma de uma amostra de sangue total :(p. ex., 10 pL, 20pL, 30 pl.., 4 0 pL, 50 pL, 60 pL, 60 pt, 30 pL, 80 pL, 90 pL,100 pL, 200 pL, 300 pL, 400 pL, 500 pL, 1 mL etc.). Emalgumas modalidades, um elemento de coleta compreende uma membrana de separaqao de plasma, um coxim de coleta, uma matrix de coleta etc. Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende um ou mais de materials como fibra de vidro, poliester, nitroceLplose e/ou celulose. Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende um ou mais materials selecionados das membranas WHATMAN Fusion 5 (Whatman Diagnostic Catalogue 2010, pagina 8; neste assunto Jncorporado por referenda em sua totalidade) , PALL ACCUWIK, PALL A/D, AHLSTROM 111 (Ahlstrom Laboratory Products Catalog (2009), pagina 15; neste assunto i n corpo rado por referenda em sua total idade), AHLSTROM 151 (Ahlstrom. Laboratory Products Catalog (2009), pagina lb; neste assunto. incorporado por rererencia cm sua totalidade) c/ou AHLSTROM 142 (Ahlstrom Laboratory Product is Catalog (2009), pagina 15; neste assunto incorporado por reterencia em sua totalidade) c/ou quaisquer outras membranaa, coxins ou materials da matrix apropri ados conhecidbs. por aquoles com experi&ncia prat.Lea. Em algumas modalidades, um element© de coleta compreende uma membrana: de coleta AHLSTROM 142. Em algumas modalidades, o elemento de filtro compreende uma membrana de qualquer dlfimetxo adequado (p. ex., 2 mm... 4 mm... 6 mm... 8 mm... 10 mm... 12 mm... 15 mm ... 20 mm... 30 mm... 40 mm.. . 50 mm. . . etc.) . Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende uma fita para teste de substrate, um adesivo de diagnostic© de dupla face e uma membrana de coleta. Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende uma membrana de coleta. Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende urn adesivo de dlagnostico de dupla face. Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende uma fita teste de substrate. Em algumas modalidades, um elemento de coleta compreende uma fita teste de substrate, um adesivo de diagndstico de dupla face e uma membrana de coleta. A presente invencao nao so limite aos materiais usados no elemento de coleta ou a sua configuragao, o qualquer- material ou configuragao i nl'eridos por uma pessoa no campo quo fornega qualidados adequadas de coleta pode encontrar uso na presente invencao.Era algumas modalidades, um elemento de filtro e um elemento de coleta compreendem uma unidade imca. Em algumas modal idados, um elemento de filtro e um elemento de coleta compreendem modules de coleta e do filtro separados. Em algumas modalidades, um modulo de sepa.raquo c um mddu 1 o do filtro sao opcrAveis conectados e/ou conuuLAvcis. Km algumas modalidades, um modulo de IJJt.ro compreende um element© de filtro. Em algumas modalidades, um elemento de filtro (p. ox. r membrana) em um rtroduJo de filtro e substituivel e o modulo de filtro e reutil izavel com um novo elemento de filtro (p. ex., membrana) . Em algumas modalidades, um modulo de coleta compreende um elemento de coleta. Em algumas modal I dados, um elemento de coleta (p. ex., membrana) cm um modulo de coleta e substituivel ,e o modulo de coleta 6 routi 11zavel com um novo elemento de coleta (p. ex., membrana).
Em algumas modalidades, a presente invenpao fornece uma matriz dentro de um modulo de coleta para coletar sangue (p. ex., de pungao digital, de uma veia etc.) . Em algumas modalidades., a presente invengao fornece uma matriz para doletar sangue por pungao digital. Em algumas modalidades, a presente invengao separa celulas de plasma quando sangue total c adicionado. Em algumas modalidades, a quantidade de sangue necessaria e minimi zada por maximizaqao da eficiencia de separate do plasma..
Em algumas modalidades, dispositivos da presente invengao proporcionam separagSo de componentes do sangue total (p. ex., celulas sanguineas) do plasma. Em algumas modalidades, o plasma e os componentes celulares separados podem cada um ser usa.dos para apl icagbes subsoquentes (p. ex., testes). Por exemplo, componentes celulares sanguineos sao separados do plasma para monitorar contagem de CD4, e o cpmponente do plasma e usado para dcterminacao de cargo viral. U11lizando-se os componentes tanto celulares quanto do. plasma, dispositivos da presente invengao fornecem amostras para multi plus analises diferentes (VI-.'R PIC. 7) .i'-tm algumas modalidades, sistemas, dispose I i vos o metodos proporc i onam soparagao s i ncrori Lzada ent.re componentes do plasma e eotnponentes celulares no sanguetotal. Em algumas modulidades, a separagao de plasma deoutros componentes do sangue e concluida em menos de 1 hora(p. ex., 45 minutos... 30 minutos... 20 minutos... 15 minutos... 10 minutos... 8 minutos... 6 minutos... 5 minutos... 4 minutos... 3 minutos... 2 minutos... 1 minute. . . 30 segundos) .
Em algumas modalidades, sistemas, dispositivos: emetodos eoletam uma quantidade fixada de plasma. Em algumas modalidades, sistemas, dispositivos e metodos eoletam uma quantidade fixada de plasma em uma membrana, um filtro e/ou pm coxim (p. ex., 71HLSTROM 142) . Em algumas modalidades, a presente invengao coleta um volume fixado de plasma e portanto fornece um dispositivo de mod:da. Em algumas modalidades, dispositivos da presente invenpao eoletam um volume fixado de plasma, independents do volume de sangue adicionado. Em algumas modalidades, dispositivos da presence invengao eoletam um volume fixado de plasma, independents do hematocr ito do sangue ad.icionado. Em algumas modalidades, sistemas, dispositivos e mdtodos da presents invenpao eoletam um volume fixado de plasma de uma amostra de sangue total (p. ex., 10 pl,, 20 pL, 30 pL, 40 pL, 50 pl,, 60 pL, 7G Ilk W SB pin 3 00 ut, 200 gt., 3.00 pL, 400 pl,, 500 pL, 1 m,I. etc. ) . Jim algumas modalidades, sistemas, dispositivos e metodos da presbiiLe iriveriqa& eoletam aproximadament.e 50 pL de plasma, sanguineo. Em algumas modalidades, dispositivos da presentc invengao proporcionam coleta de um volume de plasma seTeeionado para fornecer uma carga viral desejada na amostra (p. ex., um volume de 50 pl. proporciona uma sens ibi 15 dado de analise de 600 copias de lIIV/ml.. de sangue para deteeQ^o do carga viral por RT-PCR).
Em algumas modalidades, dispositivos, sistemas emetodos da presente invengao operam pass! vamente., naonecessitando de nenh.um process© ativo de bombeamento,gentrifugagao, eletrof orese. e/ou eietricidade para operar. Rm algumas medalJ dadesmediante agao capilarmodalidades, dispositivosinvengao proporcionamnao laboratorial, emcampo) e/ou a beira doseparagao pass-ivae/ou gravidade.sistemase metodosEmdaaLcangadaa1guma sp re s e n teseparagao. dolocalizegoesleito.plasma emlocal!zagaoremotas(P-no
Em algumas modalidades, um elemento de coleta membrana.) e mcr.tr que: p elemento de separagao membrana). Em algumas modalidades, um dispositivo e/ou um sistema em que o elemento de coleta (p. ex., membrana) e menor que o elemento de separagao (p. ex., membrana) servem para concentrar plasma etn um pequeno volume.. Em algumas modalidades, a concentragao de plasma sangulneo em urn elemento de coleta e util para etapas de ana U se a ju.sarite que requerem sensibilidade aumen Iada (p. ex,, um imunoensaio ou para captura melhorada de ac-ldo nucleico em uma particula paramagnetica).
Em algumas modalidades, um dispositivo da presente invengao, um eJemenlu de coleta e/ou. um moduilio de. colc’ta fornecerri e/o'u servem como um eJcmento de a.rmazenamento de plasma sangulneo. Fm a I guinas modalidades, a presence invengao forneee uin elemento de armazenamen I. o de plasma sanguined. Em algumas modalidades, plasma sangulrieo e armazenado no elemento de coleta (p. ©X., matriz de coleta). Em algumas modalidades, plasma e transportado enquanto contido dentro do elemento do coleta. Em algumas mods 1 idades, um elemento de filtro contendo componentes do sangue filtrado e descartado antes de armazenamento e/ou transport'd de plasma sanguineo.
Em algumas modalidades, um dispositive da presente invengao, um elemento de coleta e/ou um modulo de coleta sao integrados com processes a jusante (p. ex., caxtucbo ou outro dispositivo para extraqao, purificaqao e amplificaqao de RNA viral do HIV; um sistema de- fluxo lateral para a detecgao de ancicorpos anti-HIV ou de proteina p24; etc.). Em alqumas moda11 eta des, um dispositivo ou sistema da presente invencao compreende modules a jusanle para anafise ou manipulaqao adicional de plasma sanguineo separado. Em algumas moda J, idadesum elemento de coleta permite extragao de plasma coletado diretamente para g tampao destinado a analise e/ou manipuJ agao adicional. Para procedimentos com cargas virais, a membrana de coleta de plasma permite a extraqao do RNA viral presente- no plasma diretamente para o tampao (p. ex., tampao de ii.se/] Lgapgo Ambion [Applied Biosystem,]) para processamento adicional a jusanto. Em algumas modalidades, a extrapao direta do elemento de coleta elimina etapas de manipulagao associadas a outros protocol os que podem resuitar em perda, contaminagao ou dariQ da amostra. Bara procediinentos de f l uxo lateral, a membrana do coleta de plasma permite a extraqao do protelnas (p. ex., ari-ti-corpus anti-HIV esped 1 f i Cos, protcinas p24 do nilcleo etc.) para processamento adicional a jusante'. Em algumas modalidades, reagen tes de analise podem ser armazenados (p. ex., dcssecados ou 1 iort1Lzados) no mddulo de coleta de plasma. Em algumas modalidades-, um elemento de coleta fornece uma matrix para armazenamenLo(p. ex., armazenamento por periodo prolongado) de parti.eu.las paramaqn6ticas (PMPs). Em algumas modalidades, PMPs sao usadas para capturar acidos nucleicos (p. ex., RNA viral) e subsequence processamento. Em algumas modalidades, um elemento de coleta permit® que PMPs sejam extraldas para fora da membrana usando-se uma forga magnetica (p. ex., gerada por um magneto permanence ou um eletromagneto), eliminando a necessidade de agitagao e centrifugagao da solugao, etapas usualmente associadas a amostras coletadas em membranas de filtros para procedimentos de PCR.
Em algumas modalidades, s5o fornecidos kits que compreendem um ou mais ou a totalidade dos componentes necessaries, suficiont.es ou uteis para preparagao ou uso de qualquer um dos dispositivos describes aqui. Em algumas modalidades, os kits compreendem reagentes de controle, instrugoes (p. ex., software), dispositivos de analise de dados ou quaisquer outros componentes desejados.EXPER1MENTAQAO
Separagao de fluxo lateral. Tres diferent.es membranas de fluxo lateral, a saber, Pall Cytosep 1662, Watman Fusion 5, Whatman MFI, fr'oram test adas quanto a sepa cacao do plasma em uma con ( > gu raqao de f.luxo lateral (VER FIG. 1). As membranas foram seiectonadas com base nas rccomendagSes do fabricante, na capacidado do scparar plasma do 100-200 pL de sangue total scm obstrugao, tamanho do poro e capacidade de f.iltracao. A modi da que o sangue flui al. raves da membrana, o lado do plasma move-se mats rapidamente do que o lado do sangue (VER Fl Cl 1) . A secao do sangue pode ser e.I i.minada por corte da seqgo verraelha da membrana. 0 volume de plasma coletado foi determinado por pesagem do cape.. de filtro antes e depots da coleta p res s upondo-s e ser a densidad©. do plasma de 1025 kg/mJ (Benson K: MACAT review.Emory University 1999: 1.41-1.99, neste assento incorporado por referenda em sua tdtalidade) . Usando-se uma amostra de sangue coletada por pungao venosa com um hematocrito' de 50%, a recuperaqao mais elevada de plasma foi observada com. a membrana Cytosep em 75%. Embora essa porcentagem derecuperapfio possa ser melhorada pela adicAo de um coxim de coleta com um nuftier& mais elevado de cap (lares (VER FIG.2), este mdtodo exi.biu as s.eguintes limitaqo.es: (1) a taxa de fluxo foi lent.a, tornando o proeesso demorado, (?) aposiqao do lado do sangue variou de acordo com ohematocrito, o volume de sangue adicJonado e outras propriedades reoldgicas do sangue, exigindo do usudrio localizar manualmente o '..ado do sangue e seccionar amembrana para separar o plasma do sangue total, (3) acoleta de um volume fixado de plasma tambem exigiria dcsviopara fora de um comprimento fixado de membrana contendoplasma, o que deper.de da capacidade da membrana.A necessidade da etapa de dcsvio foi climinada peloemprego de uma configuragao alternative) (VER FIG. 2), .emque o sangue e co", elude em um coxim da amostra que impedeque as celulas Banguineas f'luam para o coxim de coleta. 0 coxim de coleta possui o tamanho apt opr lado- papa eojetar urn0 p.l a.sma extra r'fui para o coxim modalidades da presente invenpao demonstrarum que o lado 24/69das hemacias nao se interrompe cbmpletamente, e rlenhuma das membranas acima mencionadas impede extravasamento complete das celulas para o coxim de coleta. Para eliminar este problema, o coxim da amostra fol dimensionado o suficlenta 5 para aeomodar a varjabiJidado do volume de sangue associadoa coleta por pungao digital. Entretanto., isto reduz a eficiencia da coleta de plasma. Outra solugao para o problema foi adicionar uma quantidade exata de sangue ao coxim da amostra. Isto pode ser alcangado mediante aprimeira coleta do sangue em um tube capilar com um indicador para volume de sangue e entao sua adigao ao coxim da amostra. Todavia, tai metodo acrescenta uma etapa extraao processo.SeparapSo tie fluxo vertical. Separagao de plasma foireali.zada em uma configuragio de fluxo vertical (VER Fid 3) , Hemacias e leucocitos sao capturados pela membrana de separagao gragas a seu poro de pequeno tamanho ao mesmo tempo em que o components plasma do sangue flui atraves da membrana de coleta. A taxa de fluxo de plasma, Q, ediretamente proporciona1 a area de segao transversal do fluxo e inversamerite proportional ao comprimento do fluxo. Em razao da qrande area de segao transversal e do pequeno comprirneriLo do fluxo em comparagad- com. o fluxo lateral, a separagao entre plasma e ceLulas e mais rapida no fluxovertical do que no fluxo lateral.
Membranas foram so loc i onadas corn base pin criterios severos, isto &, «f iclfihc'ia de exl. do plasma d;o sangue30 total e Cacilidade de exlcacao de RNA da membrana no tampao de Lise/ligagao (Applied Biosystem, Carlsbad, GA) contendo etanol e tiocianato de guanidinio (GuSCN). Experimentos foram realizados durante o desenvolvimento de modalidades da presente invencAo para determiner a eficiencia de separapao de plasma do sangue total e coleta da amostra para membranas seiecidnadas (VER FIG. 3). FALL Cytosep 1662, Whatman VF1 e PALL VIVID GR foram testadas quanto a separagSo de plasma e Ahlstrom 111, Ahlstrom 142, WhatmanMFI e PALL ACCUWIK Ultra foram testadas quanto a colegao da amost ra.
Separapao do plasma. A membrana de separaqao foi dimensionada para 100 pL de sangue ■.sar.de -se as recomendagbos do fabricante. A membrana de coleta foi dimenstonada para 50 pL de plasma usando-se a capacidade da membrana recomendada pelo fabricante. Uma amostra de sangue fresco contendo agente anticoagulante foi usada. O hemaLocrito da amostra de sangue fo.i ajustado para b0°i mediante estabelecimento da aliquota de uma quantidade conhecida de plasma e celulas em um tubo de microcentrifuga. 0 plasma e as celulas foram bem misturados em um misturador durante 20 rninutos. As membranas de filtro foram pesadas e entao configuradas para teste (VER FIG, 3). Pressao foi aplicada por ajuste dos parafusos para promover Contato entre as membranas. 100 pL de sangue foram adicionados a membrana de soparagao, deixados em repouso por 10 rninutos. 0 coxim de coleta to i subsoquontemenl.e pcsado novamente. O volume de plasma coletado foi calculado por estabelecimento da diferenga entre os pesos pre- e postil trados d.Lvidida pela dens.Ldado do plasma. A donstdade do plasma foi estimada fem 102.5 kq/m3 (revisao de Benson K: MCAT. Emory University 1999:141-199, neste assuntQ incorporado por referenda em sua totalidade) , que e urn valor medio aproximado. A recuperapao de plasma foi entao calculada por divisao do volume de plasma coletado pela quantidade total de plasma: na. amostra original. As membranas de separagao e de coleta foram colocadas em urn reci-pi ente de risco biologic©. 0 conjunto e lavado com etanol a 70%, dessecado e entao usado para estud-os adicionais.
Os resultados dos experimentos realizados durante o desenvolvimento de modalidades da presente invencao sugerem que VFI e VIVID GR demonstraram propriedades ideals para separagao de plasma e 111, 142 e ACCUWIK Ultra exibempropriedades uteis na coleta de plasma (VER TABELA 1).
TABKT.A 1: PORCENTAGEM DE RECUPERACAO DE PLASMA OBTXDA COM DTFERENTES COMBI NACOES DE MEMBRANAS DE SF.PARACAO E DE COLECAO. Vlfil 1- VFI REFERE- CK AO USO DE l/W! VF1 PiXADAS ENTRE Sil NA "ARTE SURER I OR,Vi-’l COM MIWUAT REFKRE-.3E A VHi CCWTHNlio JAT.. VI-1 I G931-AII RKFERE-BE- AS- DIMS MEMBRANAS- FIXADASJ KNTKF S'; W\ PARTE SUWRlaR.
A elj.eiencia de .separagao e controlada por di versos fatores. 0 numero de cap!lares DU o Larnunbo do poro da membrana de coleta interfere na cfidenda da extragzjo. Quanto menor o tamariho do poro, maior a eficiencia de extraqao, o que indicaria maior eficiencia pelo uso damembrana '111 em comparagSo com a 14-2. Embora a membrana de separagao deva separar plasma sem obstrugao por formapao de geT ou entupimento, sua capacidade deve ser minima. Uma membrana com capscidade de Liquido elevada resultaria em S menor e_fIcrdnGla de extragao na membrana de coleta.
A membrana VF1 consists em poros de varies tamanhos e apenas retards o fluxo da membrana. Considerando-se o espapo de tempo sufisientemente longo (> TO minutos), consequenternente as celulas extravasarao da membrana para o 10 coxim de coleta. A membrana VF1+G934mAH e uma combinapao de um coxim de separagao e uma membrana de barroira e apenas atua com membranas de coleta com poros de pequeno tamanho como a 111. A membrana de barrelra possui poros de pequeno tamanho como 3 pm e impede a passagem das celulas. A VF’l e 15 importante para impedir que a membrana de barroira se torne obstruida. 0 uso de MFI como uma membrana de coleta diminui a velocidade do fluxo suficientemente para impedir que qualquer hemacia se move LentameriLe para a membrana de coleta, por dm eJa lambern reduz a eficiencia de extragao.20 Como. ouLra alternativa, a membrana VF’l foi mergulhada em uma solugao a 2% de um po. 1 i cat ion, Merquat 550 (Nalco Company, IL), (VhiR FIG. 4).
ELluipao. Foram rea.lizados e,xper Lmentos durante o desen vol v imento de moda.1 idades d,a presenlei Invengao para 25 determinar a membrana mais adequada para exLragao de RNA da membrana de coleLa do amostra no tampdo 1 i se./Li gagao. A ef i ci encia da eficii clnxri.a do acid© nucle i co pode? ser afetada pela Ligacao. do acido nucleicb com o RNA na prescnca do tampao de l.i se/ligaqao contendo alta. concent ragAe do GuSCN 30 e isopropanol. Membranas com tamanhos de poros exlremamentc pequenos podem permit!r que virus se difundam para a membrana a partir da membrana de separaqao, mas podem nSo permitir que o RNA viral do virus que sofreu lise se dlfunda para f ora de La quando a membrana e mergulhada no tampao de li.se/liqacao.
A membrana de separaqao foi dimensionada para 50 pl« do plasma usando-se as recomendaqd.es do fabricant©. 0 virus HIV-1, adquirido de Rush Virology Quality Assurance Laboratory na proporpao de 1.5: X 106 cop.Las/mL de plasma, foi diluido em plasma soronegativo para se obter concentragoes de HIV-1 de 300 copies/pL. A amostra de plasma contendo HIV foi adicionada a membrana de filtro e deixada em ropouso por 5 rninutos. A membrana de filtro foi colocada em um tubo de microcentrLfuga e 600 pL de tampao de lise foram' adic.ior.ados a ela e mi st u rados por vortex durante 10 rninutos. Como parte do liquid© e absorvida na membrana de filtro, 400 pL do tampao de ]ise foram removidos, e uma mistura; de esferas consistindo em 5 pL de particuias paramagneLicas (PMPs) Amblon e 5 pL de BindingEnhancer (Applied Biosystera; Foster Ci ty, CA) foiadicionada a ela. Essa soiuqao foi miscurada por vortex durante 4 rninutos para ligapao do RNA as PMPs. Apurif1 cacao por Immiscible Phase Filler (TPF) foi efetuada.Quantificaqao da carga viral de HIV-1 foi realizada usando- se o Abbott RealTimo HiV-l Amplification Reagent. Kit (Huang et al. 'Nuc Acids Res ?.()07, 35:el01, neste assuntoin co root a co pgr1 ref c rd ncLa em sua totalidade) (Abbott Molecular, Des Pl.aines, |:L) cm volumes da reagao de 25 pl. com a adigao de 0.2 mg/mL de albumina s&rica bovina (B8667; Sigma), 150 mM de trealose (1'9531; Sigma) e 0.27, de "i'woon 20 (28320; Pierce Thermo Fisher Scientific) e 5 pL como modelo. Reaqoes de amplifLcagSo foram realizadas em Cepheid SmartCycler 11' (Sunnyvale, CA.) .
Todas as membranas retiveram parte do RNA (Tabela 2).A PALL. ACCUWIK reteve a menor quantidade de RNA e tambem mostrou a minima variabilidade da quantidade de captura de RNA. As membranas de fibra de vidro e as membranas de celulose ligaram-se ao RNA na presehga de tampao de lise.
TABELA 2: MfiDIA DO LLM1AR Ct Ci .ICO (C, ) E DRRVTO. PADRAO DE C OBTIDOS POR ELOIQAO DE RNA VIRAL A PARTTR DE DIFERENTES PAPE1S DE FILTRO NO TAMPAO DE LISE AMBTON, COM SUBSEQUENT^ PURXflCAVAO POR I Pl' E KtACAO I'M CADEIA DA POLIMERASE PEL.A TRANSCRIPTASE REVEKSA (RT-BCR) . SEM MEMBRANA REFERE-SE A UMA AMOSTHA EM QUE A AMOSTRA DE PLASMA FOL ADTCIONADAD1RETAMENTE AO TAMPAO DE LISE AMBTQN.
Foram reallzados experiment os. durante odcsenvo i v i men to da prescribe invengao par.a con 1 1 rifen a perda de RNA em Ahlstrom 142. Sangue Lola! contendo H.LV-1 foi sepaiado usando-so o procedimento descrito na Figura 3.Whatman VFI foi usada para separagao de celula.s c Ahlstrom 142 foi usada para coleta de plasma, O RNA f.oi oxL.r'aAdo e amplif icado pot meio do protocol.© descrito acima. Como controle, plasma contendo H.LV-1 foi t.ambern purif icado o arnpl.i t i cado pelo protocolo de TPF. Uma diferenga de 1.5 ap CT seria esperada entre a amostra de plasma e a amostra ■capturada em Ah 1 sLrom 142 com base nos resultados mostrados r..-: Tabela 2; entretanto, lama perda extra no C.? de 0.5 foi observada (VER FIG. 4) . A perda adicional foi causada pela perda de partlculas virais em Vfl . Um estudo similar realizado com plasma separado usando-se VF1 contendo Merquat nao forneceu nenbum resultado, indicando que c virus foi capturado pelo Merquat positivamente carregado ou que o Merquat que se Lorna transportado com o plasma inibe a PCR mesmo apos purificacao por IFF.
Foram. tealizados experumentos durante o desenvolv.imento da present® invenqSo para examiner o uso de aplicadores de swab esteril COPAN (Copan Diagnostics Inc., Murrieta, CA) como um dispositivo de coleta de amostra. Esses swabs iisaro uma tecnologia denomlnada floculaqao que transmit® milhares de borrifos de fibras de nailon de um angulo perpendicular para a ponta do aplicador. Com esse procedirriento para a coleta, o especime liquido e absorvido entre os fragmentos adjacentes dos .filamentos de nan 1 on por aqao Cap! I ar. 'Os especimos sao e 1 u i dos d'os swabs uma vck cqlocados em um meio liquido. Um benelicio adicional, alem de coleta mais extensa, e quo os Flocked fwabs Jiberam especim.es mais. rapidamente. 0 modelo do swab inclui uma uex.ru ru seme 1 han be a uma cscova de veludo. Embora os swabs usados para teste tenham sido seme.l hantes: a varotas de imersao, a tecnologia pode ria sor usada para1 criar umasuperficie de membrana revestida com flocos,
Virus HIV-1, adquirldos de Rush Virology Quality Assurance Laborslory na proporqao de 1.5 X 106 copias/mL de plasma, foram dll. uidos em plasma soronegativo para se obter uma concontraqao de HIV-1 de 300 copias/pL. A amostra de plasma foi sepaxada no swab, e 0 swab foi mergulhado em um tubo de microcentr.if uga contendo 400 pL de tampao de Use Ambion, mistura de esferas foi adicionada e a amostra foi misturada por vortex gentilmente durante z- rninutos e deixada em repouso por 2 rninutos adicionais. As PMPs foram removidas usando-se uma ferramenta de extraqao e colocadas em uma soiuqao contendo 200 pL de tampSo de lise Ainbion tambem removida do tubo de microcentrifuga. A purificaqao por Immiscible Phase Filter (IFF) foi efetuada. Quantificaqao da carga viral de HIV-1 toi realizada usando- se o Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagen Kit (Abbot! Molecular, Des Plaines, II.) em volumes da reagao do 25 pL com a adigao de 0.2 mg/mL de albumins serica bovina (Sigma), 150 mM de trealose (Sigma) e 0.2% de Tween 20 (Pierce Thermo Fisher Scientific) e 5 pi como modelo. Reaqoes de amplificaqao foram realizadas em Cepheid SmartCycler II (Sunnyvale, CA).
Os swabs sao de natureza hidrofbbica e nao absorvem. fficiIm.ente. Hin razao da est-rulura dos pords dos flocos, tem baixa capacidade de absorcSo. Hritretantd, ser Lam mais apropriada para amosl ras viscosas. 0 swab tambem absorvo RNA, e uma difcreriga no (.> do 2.0 fol observada entre as amosLtas depos i I.adds no swab e o controle positive em que a amostra foi deposiLada no tampSo do lise. Isto Lndica que tres quartos do RNA foram absorvidos nos swabs. A lavagem do swab com agua, etanol ou tampao de lise antes do teste nao alterou os resultados. As BMPs tambem tendem a agregar- se quando entram em contain com o swab. tsto poderia decorrer de desprendimento dos I Loco s do swab na presenpa do tampao de Lise/iigaqao contendo alcool, sal c detergents, embota a presence invengao nAo seja limitada a nenhum mecanismo de agfio especifico e uma ecmpreenaao do mecanismo de agao nao seja necessaria para a pratica da presente invenpao.
Virus HIV-1, adquiridos de Rush Virology Quality Assurance Laboratory na proporpao de 1.5 X 106 cdpias/mL de plasma, foram espalhados no swab. 0 swab foi ime.rso em 300 pL de tampao de eluigfiO' Ambion (Applied Biosystem; Foster City, CA) e deixado ea repouso por 1 minute. Como muito liquido quanto possivel foi temovido do swab, 800 pL do tampao de lisa Ambion foram adicionqdps ao tampao acima mencionado ■contendo as amo.stras de plasma, 800 pL foram usados em lugar de 40:0 pL uma vez que o volume da amostra e grande (350 pL). Um grande volume de solupao de eluiqao foi usado, de modo que o swab poderia ser completamente submerse no tampao. 20 pL de mistura de csferas contendo 10 pL de PMPs e 10 pL de intensificador de ligapao foram adicionados. AS PMPs foram removidas com um estilete de extracan e cdl.ocadas em 400 pl> de tampao de lisa. Pu.rificacao por EPF foi eteluad'a com 50 p.L do tampao de eluipao. QuantiTicagao da carga viral de HIV-1 foi real Lzada usando-se o. Abbott RcalTime HIV-1 Amplification Reagent Kill (Abbott Molecuar, Des plainer, IL) em volumes da reagao de 25 pH com .a adiqao de 0.2 mg/mL. de albumina series bovina (Sigma), 150 mM de treaiose (Sigma) G 0.2% do Tween 20 (Pierce 'Thermo Fisher Scientific.) e 5 pL como model©. Reaqoes de Ampl.ificaqao foram realizadas em Cepheid SmartCycler II (Sunnyvale, SA; usando-se o Roche TtH. Como controle positive, a amostra de plasma contendo HTV-i If.’ adiedonada dirctamenLe a 300 pL de tampao de eluiqao Amnion sem ser aplicada e:t; um swab. Como controls 'negative, plasma negative para HIV-L e aplicado ao swab. Os controles foram processados da mesma maneira que as amostras.
Mais de metade do RNA viral e perdida quando as amostras sao coletadas em swabs (Tabela 3). Essa perda nao pode ser atribuida a perda de tampao de eluigao removido com o swab. Parte do RNA ou das partlculas virais e absorvida no swab.
A utilidade de s.e usar f ragmen t os colunares para coieLa foi explorada . Eraqmontos colunares sao si.met r i cos e nao ox i bem a va rd abi I. i.dade no d Lariiotro do po ro associada a mtHnbr arias de filtro.. Eles sao fc.Ltos de piastieo c sSo comurnente usados como. tamiriaQbos refletivasmicroprismaticas para sinais de trafego de alto brilho (10X Technology, Libertyville, IL) . A tecnologia pode ser modificada para criar f ragmentos colunares de baixo custo (p. ex., VER FIG. 6). Escudos preliminary® mostrarara que 5 sua capacidade pox unidade de area f:oi baixa em razao do grande diametro da base e da pequena altura da coluna, tornando-os inadequado.s para utilizacao em volume elevado como e o easo aqui. Entretanto, fragmentos colunares poderiam eneontrar utilidade em procedimentos que requerem 10 <25 pL de amostra.
Foram cohduzidos experimentos durante o desenvolvimento de modalidades da presents invengao para a 15 criagao de um Sistema de separagao por papel do filtro que possa efetivamente separar e coletar plasma e eluir RNA (Ver Exemplos 1 — 3) . A PALL VIVID GR Plasma Separation Membrane e a PALL ACCUWIK Ultra Medium filtram e coletam 80% do volume de plasma contido na amostra do sangue total 20 e eJuem quase todo o RNA coletado para amp!iEicagao, com uma diferenga no CT interior a 0.5 em compel ragao com a amostra plasmatica direta. Foram realizados experimentos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invengao para a criagdo de uma unidade du soparagAo e 25 coleta de plasma (PSC) por oLimizacao do tamanho das membranas e da pressao de contal.o entre as duas membranas usando-se as membranas VIVID GR e ACCUWIK Ultra.
Tatriarifiu da Membrana VIVID. l\ membrana VIVID Plasma Separation e uma membrana ass Lm&trica, h i'droEdbiCa c 30 po l issu L f oni ca com baixa ligagao biomol ecular. A natures assimetrica do material permits que os componentes celulares do sangue (hemacias, leucocitos e plaquetas) sejam retidos em grandes poros ao mesmo tempo em que permits que plasma flua 1 iv remen te para 6 outro lado da membrana atraves do poros menores. Os componen tes celu Lar es sao filtrados sem lise, removerido completamente seus con tarn loan ties. da amosLr-a de plasma. Como componentes celulares sao coletados dentro da membrana, e importante dimensiohar o papel da VIVID para que plasma nao fique retido pelos poros obstruidos. A capacidade volume de sangue da VIVID e definida como a quantidade de sangue total por centimetro quadrado de meio que pode ser rapidamente e efetivamente separada com hemol.ise minima. A capacidade de volume de sangue esta diretamente relacionada com a eliminaq^O de volume do material e e definida como 40-50 uL por centimetro quadrado para o grau de material da GR. Con.siderado o material de coleta apropriado, a VIVID GR e fixada com taxa <80% de recuperacao de plasma. Em um paciente habitual com hematocrito de 50%, seriam necessaries 125 uL de sangue total para se coletar 50 gL do plasma. Portanto, para assegurar que nao ocorra nenhuma coagulaqao ou Use, a membrana VIVID deve ter 2.5 cent, imetros quadrados do area, o que cerresporide a um corte circular de 18 mm de diametro.
Tamanho da Membrana ACCUWfK. A ACCUWIK 6 usada para coletar a quantidade fixada de plasma. A capacidade de absorqao conforme dednido por Pa'll Life Sciences e de 38 pl, por centimetre quadrado, o que corrospo.nde a um corte circular com 12,9 mm de diametro para uma amostra de plasma com 50 pL. Esse pequeno tamanho da ACCUWIK em relaqao aotamanho da membrana de separaqsao VIVID permite concentragao do plasma em um pequeno volume. A ACCUWIK porosa proporr.iona uma matriz para transports facil do liquido e para analises quimicas adicionais dentro da matriz.
Experimentos foram feitos para confirmar ainda mais otamanho Util da membrana ACCUWIK. A capacidade de absorbancia da ACCUWIK Ultra foi determinada em pL por centimetro quadrado mediante adigao de um volume fixado de plasma e determinacao da area ocupada resultante. A ACCUWIKUltra Medium e uma membrana fibrosa hidrofilica composta de poliester hidroxilado e caracterizada por captaqao uniforms e liberaqao rapida. As tiras da ACCUWIK foram seccionadas usando-se um cortador de papel comercialmente d.isponivel. A largura de cada lira foi medida e registrada. 0 comprimentode cada lira foi de aproximadamente 1QD mm. 50 pL de plasma foram adiciohados a extremidade das liras, permitindo-se absorqao lateral ate que o movimento da borda da frente fosse interrompido. 0 comprimento da area preenchida foi medido e registxado. 100 pL de plasma foram adicionados aextremidade de um segundo grupo de tiras, permitindo-se absorqao lateral ate que o movimento da borda da frente fosse interrompido. 0 comprimento da area preenchida fol medido e rogl.st rado. I5ara determinar a capacidade or- absorqao, a volume de plasma (50 ou 100 pl.) 6 dividido pelaarea total, preenchida, que e calculada mu I t i p I i cando-sc o comprimento preenchido pela largura da lira. As capacldades de absprqao cm pl. por uentimotro quadrado para os dois grupos de tiras testes foram estimadas. Embora a capacidade relatada da ACCUWIK Ultra Medium tenha side, de 3-8 pL L/mm2,o valor medio calculado a partir de teste experimental sugere que a capacldade e na realidade 2igeiramente maior na proporpao de 4 4,5 ± 2,2 juL L/mm2., Usandp-se essa capacldade de absorbancta para a membrana, um corte circular coni 12 mm de diamet.ro se-ria necessario para manter o volume de plasma neeess.ar.i o de 50 uL.
A unidade de coleta e separagao de plasma, compreende duas partes: o modulo de separagao de celulas e o modulo de plasma. 0 modulo do. separagao de celulas abriga o filtro VIVID, ao passo que o modulo de plasma contem a membrana ACCUWIK (VER FIG. 7). Uma vez montada, a membrana situa-se em contato direto com o filtro VIVID, fornecendo forga capilar para absorgao de plasma da membrana. A pressao de contato e estabelecida polo posicionamento do modulo de plasma com relapao ao modulo de separagao de celulas. A amostra de sangue total e adicionada atraves da abertura na parte superior do dispositivo e colocada diretamente na membrana VIVID. Depois quo um espago de tempo adequado se passou, p modulo de plasma e desconectado do modulo de separagao de celulas e Inserido no cartucho de teste para processamento posterior. 0 modulo de- separagao de celulas contendo o material filtrado pode entao set apropriadamento desca rLado.
O primeiro sistema de geragao roi consLruido de polipropileno (VER FIG. 8), Pol i prop.i.leno foi seiecionado porque 6 quimicamen t.e inerto . En tret.anI.o, o polipropileno nao ex i be. propriedades mecan.lcas Inadoquadas. A membrana de filtro 6 conectada com os mbdulos por um adesivo de dupla face. Embora varies metodos de aderencia possam encontrar uso com o dispositivo da present© invengao, como soldagem uJtrssdnica, vedaqao termica, soldagem por laser, clampeamen I: o mecanico etc,, o adesivo foi seIecionado para o dispositivo de primeira geraqiao porque ele permit© que o modulo do plastlco seja reut i 11 z.ado. O adesi vo exibiu excelente forga de ligagao a maioria das superficies incluindo plasticos de baixa energia de superficie como o polipropi leno. 0 anel em 0 no modulo de coleta forma um lacre impermeavel e mantdm os dois modules juntos graqas a uma adaptagao por frieqao. Estudos preliminarcs conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente fnv.engSo demons ttaram que foi dific.il controlar preqi samente o contato entre as duas. membranas nesSc procedimento quo resultou cm eficiencia do separagao do plasma variavcl. A pressao do contato foi, portanto., identificada como um paramel.ro chave a ser ot.imizado para separagao consistente e gficiente de plasma.
Modules de segunda geragao foram cons tru'i dos de polipropileno para inlegrar um mecanismo de trava rosqueada que permitiu posicionamento exato das membranas do filtro entre si (VER FIG. 9). Para impedir compromet imento das membranas por cisalhamento a medida quo o modulo de plasma 6 atarraXeido ao modulo de co Lota, um acessorio antirrg l.aqao foi projetado (VER FIG.. 9). 0 modulo de separagao de cel ulus possui um pino em forma de cavilha de feohamento que se projot,a para dentro. 0 acessorio antirrotagao possui uma ineisura em que o pi.no em forma de cavil ha sc assenta. isl.o impede que o acessorio ant. i rrotagao gl re, mas permits que ele se mova 11 v r onto nt© para cima o para baixo. 0 movimento vortical e ainda aLcanqado por rotaqao do dispositivo de posicionamento rosqueado mostrado na figura. Cada modulo do separapao de cd Lula e o correspondente dispositivo de posicionamento rosqueado sao configurados para permitir quo os dots sejam acopJ ados. Quando completamente starraxados um no outro, a distancia "d" mostrada na Figura 10 e de 1 mm. Neste ponto, os riuineros estampados no modulo de separagao de celulas e o correspondente dispositivo do modulo em parafuso situam-se no mesmo eixo vertica.l. Quando os mimeros emparelhados sSo aparafusados juntos, a distancia "d" e mantida.
Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenego para determiner o posicionamento ideal da membrana ACCUWIK em relagao a membrana VIVID de modo que seja mantido contato permanent© e a pressed ideal seja aplicada a toda a interface do papel de Ciltro. A colocagao ideal do papel de filtro foi definida como a posigao que gera o mats alto volume de plasma coletado com a menor variabilidade entre testes.
Papeis de filtro e adesivos foram secci onados para o tamanho apropriado usando-se uma maquina de corte pot laser. Os modu'. os do sepairacao de cel ul.as o de plasma foram lavados em IftOII a IS1 e deixados secar. Um adesivo circular de J 2 mm foi usado para prendor o corte de ACCUWIK do 12. mm ao acBss&rio anti froragdo. O acessdrio ant i.rmtagao c a ACCUWIK foram pes,idos cm uma balanga e o peso .Lol registrado. 0 acessorlo antirrotagao foi entao colocado nemodulo de separagao de celulas c a peca de posicionamento rosqueada foi atarraxada no modulo de separaqao de celulas da parte de baixo. Os numeros estampados tanuo nos modules de separagao de celulas quanto nas pegas de posicionamento ’■osgucadas foram. usados para ©stabelecer a posipao com uma volta compile La correspondendo a 1 mm de movimento vertical, A pega antirrotagao foi prLmeiramente colocada logo abaixo da plataforma VIVID sobre o mddulo de separagao de celulas para permitir que o corte de VIVID de 18 mm seja aderido, 0 anel adesivo de 18 mm fpi usado para prender a VIVID de 18 mm ao modulo de separagao de celulas usando-se as margens como guia. 0 dispositivo de posicionamento rosqueado foi entao usado para posicionar a ACCUWIK nas distancias de 0,5 mm, 0 mm, '0,25 mm e 0,5 mm da superficie inferior da membrana VIVID, A distancia, d, e definida como a distancia entre a superficie inferior da VIVID e a superficie superior da pega atit-irrotagao (superficie inferior da ACCUWIK) (VER FIG. 10). A diregao ascendents e negativa. 125 pL de sangue total (hematocrito de 50%) foram adicionados a VIVID. Hematocrito de 50% foi conseguido mediante rotagao das amostras de sangue total em uma centrifuga (4.000X) durante 10 minuLos, transferindo-so todo o plasma para um novo tubo e se adicionando o mesmo volume de componentes celulares a amostra de plasma. Sangue com hematocrito suficiente de 50% foi preparado de modo. quo a mesma Conte de sangue fosse usada para todos os testes. A amostra foi deixada em fLltragao durante 10 minutos. As membranas VIVID fotam entao removidas e apropriadamente desca r i.adas em um re® Lp j onte da riseu biologico. A pece antirrotagao foi tambem rcmovida e pesada pm uma balanpa. Opeso foi reg is trade. A membrana ACCUWIK foi entao descartada em um rec i pie rite de rise© biolog!co. 0 volume de plasma coletado foi calculado selecionando-se a diferenga entre os pesos pre- e p6s-f il trades c c i vldindo-s e pela densidade do plasma. A densidade do pJasma 'foi estimada em1025 kg Ar . A recuperacap dp plasma foi entao calc u .1 adad: vid ;.nric-se o volume de plasma coletado pela quantidade total de plasma na amostra original, que neste caso foi de 57,5 pL, e multiplicando-se por 100.
As distancia.s 0 mm e 0,25 mm produzi ram a mais altarecuperaqao de 52 pL e 53 pt. Entretanto, a uma distancia de 0,25 a variabilidade (desvio padrao) foi 5,9111 em comparagao corn 0,9411 a 0 mm. Na distancia de 0,5 mm, a membrana ACCUWIK (espessura - 0,38 - 0,53 mm) pode nao mais estar em contato com a membrana VIVID e, portanto, naocpletar outra Lanto de pl asma como resuitadd da dim i nu i g.l& na forcas capilar. Na distancia de 0,5 mm [indicativa de que a ACCUWIK esta completamente comprimida contra a VIVID}, Col observada alta recuperagao de plasma; contudo, a recuperagao de plasma nao foi tao elevada quanto nasoutras duas distancias. Isto se deve mais provavelmente a grande rociugao no volume esvaziado causada pela compressao das fibftas do material, embora a presente Invengao nao se limits a nenhum rnecarilsmo de agao es-peci I i'uu e uma cotnprcensao do mecanismo de acao nao seja nccessari.a paraprati cur a presence invoncao . Com base- nos expor i mcnr.os conduzidos durante d desenvolvimento de -odalidados da present® invenv^o, uma dLslancia de 0 mm foi usada nos Ex-emp I os 7^13.
Experimentos foram condu zidos durante o. desenvolvimento de modalidades da presente invenpao para determinar o efeito do volume de sangue sobre a coleta de plasma com metodos, sistemas e dispositivos da presente invengao. 0 volume de sangue obtido de um dispositivo de pungao especifico depende de Lres fatores principals: fisico/mecanico (p. ex., o proprio dispositivo de pungUo), bioldgico (p. ex., a espessura da pele, o hematocriuo do individuo, o peso do individuo, a quantidade e a potencia dos fatores da coagulagao no sangue do individuo etc.) e do processo (p. ex., a posigao de pungao, a capacidade de manter contato adequado entre a pungao e a pele durante o processo de pungao etc.). Embo.ra o volume de sangue coletado seja variavel, em algumas modalidades, metodos, sistemas e dispositivos devem coletar volume constants de plasma para mensurar quantitativamence os constituintes do plasma, tais como c6pi as vi reais de HIV-1 no plasma.
Habitual mente na prat.ica., uma aliquota de plasma e coletada para teste, apos ter side separada do sangue por centri fugaqao. Entretanto, isto complies um procedimento; geralmente requer o uso de dois dispositivos: 1) uma centrifuga para separagSo entre sangue e plasma e 2) equa pamento: de precisao para mensurar plasma; e l.orna um procedimento adequado para uso no campo. Portanto, em algumas modalidades a presente invenctlo fornece um dispositive simples e de baixo custo para uolelar uma quantidade fixada de plasma, independentemente do volume da amostra original (p. ex., a quantidade de sangue obtida de uma pungao digital).
Em algumas -modalidades, a presente invengao fornece uma membrana abSorvente (p. ex., ACCUWIK) que c dimensionada para coletar uma quantidade fixada de plasma, deixando p resLanto do plasma sobre a membrana VIVID GR. Em algumas modalidades, a presents invengao forriece um dispositivo de baixo custo que permits, coleta direta de sangue em um papel de filtro, e nao- em um tubo cap Liar.
Expe.rimenLos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invengao para demonstrar que um dispositivo da presence invengao coletaria uma quantidade fixada de plasma independentementeda quantidade de sangue adicionada, Sangue fresco de um individuo humano foi usado para o estudo. Um volume conhecido de sangue com um nivelL de hematocrito de 45% foi adicionad.o ao dispositive. 0 dispositivo foi deixado em repouso durante 1U minutos, e o volume de plasma coletado foi medido. 100, 125, 150 e 175 p-L de sangue foramadicionados aos dispositivos, e o volume do plasma foi. medido (VER FIG. Hl) . A adigao. de menos de H 25 pL resultou na coleta de 3 9.6 gL de plasma, com eficiencia de 88.1%. Portanto, urn volume minimo de 125. pL e necessario para coletar 50 de plasma. A adigao gradual de volumesanguineo do ate 175 ph. nao resultou em aumento no volume de plasma coletado. A eticienuia maxima de coleta de plasma do 94.6% e obi Ida com a adigao de 12.5 pL de plasma, que e roduzida com a u me progressive no volume de sangue. A Figura 11 tambem mostra o cfciLo da va r i abi 1 idade d-os niveis de colpta de plasma sobrt; o Limiar Ciqlico para 600 coplas de IltV-l/mL do sangue. Isto foi estlmado pelo uso da curva padrao de HIV-1 (y -3,33x i 3.1,5) obtida por purificagao de diferentes concentragoes de virus no plasma e sua amplificaqao. Em algumas modalidades da presente invengao, 600 copias/ml e o limite inferior de detecqao;portanto, o efeito de alteragao no volume sobre o CT seria o mais alto com esse numero. 0 CT altera-se de 25.49 para 25.56 quando o sangue adicionado ao dispositivo de sangue- plasma se altera de 125 pL para 175 pL. Is.Lo esta satisfatoriamente dentro da faixa aceita de +0,5 especificada pelo nosso dispositivo teste.Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invengao em que a membrana VIVID Plasma Separation GR foi dimensionada deacordo com os protocolos do fabricante, e tamanhos diferentes da membrana PALL VIVID foram testados, ao mesmo tempo mantendo a pressSo de contato otimizada entre a membrana VIVID e a ACCUWIK e o tamanho da membrana ACCUWIK(VER FIG. 12). Aumento do tamanho da membrana reduz a eficiencia de purifioagao. Em todos os grupos testes, 0 modulo de coleta de plasma foi separada do modulo de separate 10 rninutos apos a adigao do sangue a uni'dade do plasma sanguineo.
Em algumas modalidades, experimentos foram conduzidos para delcnninar o efeito do hemat.6cr.Lto sobre a coleta de plasma. O hematberito e a proporqao, por volume, do sangueque consists em hemacias. Um nivel normal de hematperiLeva ria siqnificallvamontc de acordo com sexo, Idado, estadode sailde etc. Considurado um volume fixado de sangue, a.l teraqSes nos niveis do hematocr i to afelum a quantidade de plasma disponivel para purificaqao. Tambem afetam aviscosi,dade do sangue, inter terindo portanto na taxa de fluxo atraves de um dispositivo. A membrana PALL VIVID Plasma Separation GR e uma membrana altamente assimetrica que separa hemaclas do plasma mediante filtrapao por exclusao de tamanho. Por conseguinte, niveis elevados do hematocrito podem obstrui.r a membrana resu l.tando em separagao inadequada de plasma. Experimentos foram realizados para determinar o efeito de tais alteraqdes no hematocrito sobre o volume de coleta de plasma a partir de um volume fixado de sangue total. Um dispositivo da presente invengao foi preparado conforme descritopreviamente, e sangue de um tinico individuo foi centrifugado a 3.500 rpm durante 20 minutos para sepatar as c^lulas. Os niveis do plasma foram ajustados para criar amostras de sangue com 5 niveis diferentes de hematocrito entre 15-60%. 125 IJL da amostra de sangue foram entao adicionados ao modulo de sangue-plasma e o volume de plasma coletado no modulo de plasma foi medido. O volume sofreu alterapSo de 53.2 pL para 47.6 pL nos cinco niveis diferentes de hematocrito, correspondcndo a uma alteragao estimada do CT de 0.16 a uma concentragao de 600 copias deHIV-l/mL, estimada usando-se a curva padrao do HIV-1 (y = - 3,33x + 31,5) obtida por purificaggo de diferentesconcfiiiIraqdos de virus no plaama o sua ampl ificaqao. Os resultados most ram quo o modulo de sangue-plasma pode scparar com succsso plasma em diferentes niveis de hematocrito sem nenhuma obstrugao da membrana VIVID Plasma Separation GR. 0 volume de plasma coLeLado declina de acordo com aumento do. hematocrito dec.orr.onte de quantidade reduzida de plasma na amostra- Em urn. nivel de hematocrito de 60%, 125 pL de sangue contem apenas 50 yL de plasma.Portanto, o plasma coletado e tambem baixo. Em um nivel de hematocrito de 15%, o plasma disponivel e 106,25 pL. Todavia, apenas 51,3 uL sao co 1 e!.ados no modulo de plasma, uma vez. que a membrana PALL ACCUWIK esta saturada e nao 5 pormite mais fluxo de plasma para © modulo.
Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenpao para 10 demonstrar a eficacia do modulo de separagao e colepao de plasma para separar de modo eficiente plasma de sangue total obtido de diferentes pacientes humanos. Como sangue e uma matrix oxtremamente compJexa, sua va ri ab i. .L.idade entre pessoas pode afetar suas propriedades reologicas e de fluxo 15 aLraves da membrana, o que por sua vez afetaria a eficiencia de puri.ficaqao da amostra.Sangue fresco foi obtido de Northwestern Memorial Hospital para este estudo. A amostra de sangue foi homogeneizada mediante a colocagao do tubo em um misturador 20 rotatorio durante 2 minutos. O hematocrito das amostras de sangue foi medido por rotagao de 30 pL do sangue em Light Cycler PCR Tubes (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Suiga) a 3.000 rpm. durante 10 minutos. O hema 1.6c r i L© foi medido. 125 pl. de sangue foram adici onados e plasma toil coletado. O 25 modulo de separagao e coleta de plasma soparou com sutesso plasma das diforentes amostras de sangue (VER FIG. 14) . O volume medio de plasma coletado de 125 pl. de plasma foi ■19,5 pL, 0 desv I o padrSo do volume de plasma coletado e 3,3b pl.i. Obscrvou-se quo a oiiciencla do separagao foi 30 s.i gnificativamente melhor quando se co.leLou sangue f resco e diiminuiu a medida que a amostra de sangue se torn.ava envelhecida. Todds os testes foram reaiizados com amostras de sangue coletadas pgr pung^o venosa em um tub© a vacuo contendo um anticoagulants.
Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presents invenpao para testar a eficacia de separagao e coleta de plasma de sangue com contagem celular elevada de leucocdtos. 53 pL de plasma foram coletados com sucesso de 125 pL de sangue total sugerindo que contagem celular elevada de leucocitos nao obstrui a membrana. 0 teste foi realizado usando-se o protocol© descrito acima.
Experimentos foram conduzidos durante Q desenvolvimento de modalidades da presence invengao, em que determinado de carga viral foi usada para demonstrar a exequibilidade do sistema de separagao de plasma para aplicaqbes allnteas. Esse Objetivo foi separa r celula.s sanguineas de plasma, concentrar o plasma em um disco ACCUWIK menor e dal em diante usa-lo para extraqao de RNA viral do I1IV-1, para purlfic.aqao e para deLeccao com base na PCR sem perda siqnif 1 caL i.va no RNA nos modules. de separagao o coleta. 1*1 asma foi, separado de1 sangue total usando:“-se urn disposi l i.vo da preserito invengao: ou contrifugacao laboratorial padrao,
Amostras para tecnica de processamento foram preparadas por separagao de Celulas sanguinoas e plasma de sangue mediante centpi fugagao a 3.500 rpm durante 10minutos. A proporgao de celulas ® plasma a sercm misturadospara reconstituir uma amostra sanguinea com percentage® de hematomrito de 4 5 fo.i calculada. Plasma f oi inoculado com virus HFV-1 obtido de Northwestern Memorial Hospital (concentragao do suprimenio de 1.50'0 eopias/pL de plasma) 5 para produzir urea concent raped de 300, 60 e 12 Oopia.s/pLrespectivamente, 0 sangue foi reconstituido usando-se esse plasma e celulas mediante mistura deles em uma proporpao de 4 5% de celulas e 55% de plasma.
Para amostras proc os s ada s por um dispositivo da 10 presents invenpao, 125 pL do sangue acima foram adicionados a membrana VIVID do modulo de coleta e separaqao de plasma e deixados em repouso durante 10 rninutos para periniri r separapao do plasma . A VIVID foi cutdado-samente removida. A ACCUWIK foi inserida em um tubo de inicrocent rifuga (Tubo 1) 15 contendo 400 pL de tampao do lise Ambion que inclui Ambion Blnding/Lysis Concentrate, alcool isoprop)T, ico e Ambion Carrier RNA.
Para as amostras- processadas por cent. r I fugaqao laboratorial padrao, sangue foi centri fugadp a 3.000 rpm 20 durante 10 rninutos para separar o plasma das cblulas. 50 pl. de plasma foram entag adicionados a ACCUWIK do mesmo tamanho que o usado para o modulo de separapao e coleta de plasma. A ACCUWIK e inserida cm um tufe& de r.:crc;:er L r 1 fuga contendo tampao de Use Ambion que inclui Ambion 25 B i nding/Lysis COT iGKnt rate, ail cool isoprop) 1 i Co e Ambion Ca r r i e r RNA.
Todas as amosira.s [otara entao misl.uradas por vo-rLex durante 2 minul.os. 10 pl. de mistura de esf.eras contendo PMRs Ambion e LnLonslf1cador do ligagao Ambion foram 30 adicionados e nbvamemte misturados por vortex durante 4 minutos. 200 p-L da solugao foram extraidos por pipet a etransferidos para outrocuidadosamente removidasPickpen-1 Magnetic (SunrDiego, CA)tubo (Tubopor meioScienceAsde umaProd uc: tscolocadas tambem on outro tube.remanescente no primeiro tubo foi eliminada. APMPs .foramf erranientaInc. ,A solugao:amostra noTubo 2 foi entao processada usando-se o metodoI PF (VERFIG.grande doA amostra do Tubocartucho e misturadaau t oma 1.1 zado . 5 0 pL2 foi adicionadadurante 4 minutosde tampao dea camarausando-seforamadicioriados como aliquota a camara: menor do cartucho de I PFos do's fluidos aquosos foram cobertos como mostrado naFigura 15. 0 sistema automat!zado agregou as'PIMP'S; durante 2minutostampaominutosusando o magneto externo e rn.oveuo agregadodorise paracontendo aspara eluirremovidas do tampaotampao de eluiqSo.PMI’s foi aquecido0 tampaode10o RNA. As PMPs foram agregadasdo eluiqao. Quantificagao de cargaviral do HIV-1 foi. realizada usando-se bHIV-1 Amplification Kitem volumes da reacao deaIbumina(T9531 ;Fisherseries bovinaSigma) e 0.2%Scientific)ampli f Leagao foram(Sunnyvale, CA) .quadrup'la.sugerindo queAbbott Rea(Time(Abbott Molecular25 pL com a adigaoDesde(B8667, Sigma), 159 mMde Tween 20 (28320;pL.ada cargaPlaines, IL)0.2 mg/m.L dede trealoseThermocomo mode I O'-em Cepheidviral foieonduz IdadeIIemd quadrupla.
Eficienia da BCR dedeplasmafoiobservada,produtiva semt. ransportchemacias queini.bem a PCR.Os resultadosobtidos da centrifugagao de sangue e da separagao usando-se os modules de separagao e coleta de plasma foram identicos, demonstrando que nao ilouve perda siqnificativa em part.iculas virais na membrana de preenchimento,
Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invengao para demonstrar a exequibilidade de armazenamenLo de PMPs na membrana ACCUWIK. Em algumas modalidades, o plasma contendo o virus HIV-1 e separado em diregao a membrana ACCUWIK atraves da membrana VIVID. Essa membrana e subsequentemente inserida no tubo contendo o tampao de lise, por meio do que o virus sofre lise e o RNA viral se liga as PMPs. 0 RNA viral difunde-se para fora do papel em diregSo ao tampao de lise contendo as PMPs. Para facilitar: o processo, a solugao contendo o papel e agitada. Uma porgao do RNA e perdida no papel em consequencia de absorgSo pelas fibras da membrana. Em algumas modalidades, para rninimizar a perda de RNA nas membranas de filtro e eliminar a necessidade de agitagao, as PMPs sao pre-distribuidas na ACCUWIK. Quando uma amostra contendo RNA viral e adicionada ao papel, o virus e as PMPs estao ambos localizados na matriz. porosa da membrana ACCUWIK. Com a adigao de reagent.es de lise, d RNA viral pode imediatamente se Ilgar as PMPs sen difundir-se para fora do papel. A membrana, portanto, al.ua Como uma matriz para armazenamen. to do rcagenie e subosoquenl e capLura de RNA. Para processamenLo adicionaI da amostra, as particulas magnet icas sao extra i-das do papel por meio do um magneto ou um eletroTnagneto permanent© de baixo custo. Esse processo elimina a necessidade de agitacao, aquecimento e centrifugagSo associados a extragSo de RNA do filtro. Albin disso, proporciona uma localIzagao convenlente para artnazenamento de reagente em eases de assisLdncia a beira do 1 el to.
Em experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invengao, BMPs do kit Arab i Ph Magmax foram adicionadas como allquota em um tubo de micro.centrif.uga e colocadas em um suporte magnetic© para coletar as PMPs. O liquido foi removido e aS PMPs. foram suspensas novamente em Ambion Binding Enhancer. Para cada amostra teste, 10 in. de PMPs e 10 ylj de Ambion Binding Enhanuet foram usadds. Uina soiuqao de 5 pi, contendo BSA a 4% e Triton-X a 0,4% fe adicionada. A soiuqao foi adicionada a um disco de 12 mm de ACCUWIK Ultra com uma area suficiente para manter 50 pL de amostra e deixada secar ao ar durante 3. dias a temperatura ambiente. Plasma foi inoculado com virus HIV-1 obtido de Northwestern Memorial. Hospital .(concentragao do suprimento de 1.500 qdpias/pl. do plasma) para produzir uma concentragao de 300, 60 e 1'2 copias/pL, respectivamente. A ACCUWIK Ultra secada ao ar foi inserida em um tubo de microcentrituga (Tube 1 ) ©50 pL do amostra. de plasma foram adicionados ao papel. 4Q0 pL de tampao de lise Ambion foram adicionados d solugao, que fol deixada em repouso durante 6 rninutos. As particular magnet icas foram removi.das dp Tubo 1 usando-se uma: ferramonta Pi.ckpeh-1 Magnetic (Sunrise Sejonoe Products Inc., San Diego, CA) e I. ransferidas para 400 pL de Ambion Wash Buffer-1 no Tubo 2. amostra no Tubo 2 foi entfio procossada usando-sc 0 metodo TPF (VER FIG. 15.). A amostra do Tubo 2 foi adi.cionada a clmara grande do cartucho e misturada durante 4 minutos por meio de- um sistema automatizado. 50 uL de tampao de eluicao foram adicionados ■como al.tqu.ota a camara menor do cartucho de IPF e os dots liquidos aqupsos foram cobertps corn cera liquids CHILLOUT (laboratories Biorad; VER FIG. 15). 0 sistema automatizado agregou as PMPs durante 2 minutos por meio de um magneto externo e moveu o agregado do tampao de lise para o tampao de eluigao. O ta.mpSo de dluigSo contendo as PMPs foi aquecido a 55“C durante 10 minutos para el.uir o. RNA. As PMPs foram agregadas e removidas do tampao. de eluiqao. Quantificaqao de carga viral do HIV-1 foi realizada usando- se o Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Kit [19] (Abbott Molecular, Des Plaines, IL) em volumes da solupao de 25 pt com a adiqSo de 0.2 mg/ml de albumina .sitrica. bovina (138661; Sigma), 150 mM de Lrealose (T9531 ; Sigma) e 0.2% de Tween 20 (28320; Pierce Thermo Fisher Scientific) e 5 pL como modelo. Reaqoes de amplif:icagSo foram realizadas em Cepheid SmartCycler II (Sunnyvale, CA) .
Para amostras froscas, plasma foi inoculado com virus HIV-1 obtido de Northwestern Memorial Hospital(concentrapao do supri.mento de 1.500 cbpias/piL de plasma) para produzir uma concent race o do 300, 60 e 12 cop i a s/kti respect i va men to. 50' pL da aitiostra de plasma contendo diferentes concentraqbes do virus HIV-1 foram adicionados a um tubo de microcent r if uqa (Tubo J). 400 uL. de tampao de lise Amb i on foram adicionados ao Tubo 1 e mis Lu:: ados por vertex durante 30 segundo®. 20. gL de mistura de eSferas contendo 10 u'L de PMP.s c 10 pL de i rrtensifi cador de ligacao foram adicionados e m.i sturados por vbrtcx durante 4 mi nuto-s. As partlculas magneticas foram removidas do Tubo 1 usando-se uma ferramenta Pickpen-1 Magnetic (Sunrise Science Products Inc., San Diego CA) e transferIdas para 4 00 pL de Ambion Wash Buffer-1 no Tubo 2. A amostra no Tubo 2 foi entao processada usando-se o metodo IFF (VER FIG. 15) . A amostra do Tubo 2 foi adicionada a camara maior do cartucho e misturada durante 4 minutos por urn sistema automatizado. 50 pL de tampao de eluiqao foram adicionados como aliquota na camara menor do cartucho de IFF e os dois liquidos aquosos foram cobertos com cera liquids CHILLOUT (Laboratories Biorad; VER FIG. 15 ): . 0' sistema automatizado agregou as PMPs durante 2 minutos usando um magneto externo e moveu o agregado do tampao de lise para o tampao de eluigao. 0 tampao de eluigao contendo as PMPs foi aquecido a 55“C durante 10 minutos para eluir o RNA. As PMPs foram agregadas e rernovidas do tampSo de elulcao.
Quant ificagao de carga viral do HIV-1 foi realizad.a usando-se o Abbott Real!ime HIV-1 Arnpiif: ica L..1 on Reagent Kit [IB] (Abbott Molecular, Des Plaines, IL) em volumes da reagao de 25 pL com a adigao de 0.2 mg/mL de aIbumina serica bovina (138667, Sigma;), 150 mM de trealose (T9531; Sigma) e 0.2% de Tween 20 (28320; Pierce Thermo Fisher.Scientific) e 5 pl, como modelo. ReacQ.es de ampll ficaqaocm Cepheid SmartCycler IL (Sunnyvale, CA) . fri i tconduzida em dupl. IgaLas. Como Go.ntrdle negativo para HIV-1 foi usado c prpeessado quo as ouLras amostras.
O RNA viral foi purificado de 50 pl de plasma inoculado com virus HJV-1. O RNA purificado foi amplificadousando-.se o Abbott R.ealTlme HIV-1 Amplification Kit. Eficiencia da PCR de 107.7% foi observada (VER FIG. 17), indicando que as PMPs podem ser armazenadas na membrana sem ■pexda de eficiencia na captdra de RNA e podem ser prontamente extraidas por processamento a jusanl.e. A pe.rda de RNA viral na membrana de filtro 6 minima (VER FIG. 18) .
O sistema de fluxo lateral tem sido usado na detecpao e no diagnostico do HIV. Tecnologias Laboratdriais atuais baseiam-se na detecgao combinada e simultanca da proteins (p24) do nucleo do HIV e de anticorpos anti-H.IV e sped fl cos dirigidos contra proteinas transmerabrana do HIV. Anticorpos contra tais protcinas aparecem consi stenternente durante soroconversao de individuos infectados pelo HIV o permanecem por todo o curso da infeeqao. Nos primeiros 2 meses apos o nascimento, lactentes positives para o HIV tem carga viral em eievapao progressiva, mas sao soropositiVos em consequencia da herange de anticorpos anti-HIV maternos, o que Lorna testes de existSncia ineficazes. Al6m disso, lactentes negatives para o HIV podem se soropositivos em decorrencia da mesma heranpa de anticorpos anti-HIV ma Lemos. A deteegao de HIV em lactentes impoe visar como alvo a proteina p24 do nucleo do HIV como o principle marcador para datccgSo com o obietivo de verificar sen estado verdadeiro do infeeqao independentemente da heranga seric.a materna.
Experimentos foram real 1 zados durante o desenvolvimento de modalidades da presents invengao para estateLecer a ulilidade de separaqao de sangue por meio de membrana com o objei.ivo do ajustar a coleta de plasma em um coxim de coleta. Dispositivos c.c separagao de plasma foram montados usando-se uma membrana VIVID GT' de 18 mm e u® coxim de coleta S base de fibra de vidro Ahlstrom 142 de 8 mm ou Pall A/D de 6 mm. O coxim de coleta foi comprimido 0.5 mm para dentro da membrana VIVID GF. A membrana VIVID foi dlinens ionad-a para acomodar um volume fixado de sangue, ate .12 5 pL, e as membranas Ahlstrom/Pa .11 foram dimensionadas para acomodar um volume fixado de 50 U.L. A membrana VIVID foi pre-tratada com uma solupao contendo proteina BSA a 1%, sacarose a 0,5% e Tween 2 0 a 0,1%. 100 uL da soluqao pre-tratamento foram adicionados a cada membrana VIVID e deixados secar ao ar por 24 horas a temperatura ambiente antes de ser usados. Amostras de sangue humano fresco de 100 pl ou 125 pF, em volume foram adiciona.das aos dispositivos e o volume de coleta de plasma foi calculado com base nas dlferengas em massa da membrana de coleta antes e depots de separagao do sangue.
Para 1.25 p.L de sangue total, 48±2 pl. de plasma foram coletados com tempo medio de coleta de 8±2 minutos por ambas as membranas Ahlstrom e Pall. Para 100 pL de sangue total, 37 ± 2 pli de plasma foram coletados com tempo medio de coleta de 5 ± 2 minutos tambem por ambas as membranas Ahlstrom e Pall. Tais dados indicam que esse sistoma baseado em membrana pode ser usado ofetivamente para sinctonizai e ajuskar coleta de plasma de uma amostra. de sangue total.
Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invengao para determinar a extensSo de perdas de analito nao especifico para o coxim de coleta das. membranas VIVID e Ahlstrom, em que o anfigeno proteico p24 do. HIV foi di luido em plasma humano e passado atraves de dispositivos de separagao. Dispositivos de separagSo foram montados conforme descrito acima. Para um dispositivo de separagao, a membrana VIVID nao fol pre-l. raLada com BSA/sacarose/'Tween. Em um segundo., a soiuqao de BSA a 0,1%, sacarose a 0,5% e Tween 20 a 0,1% foi utllizada como um pre-tratamento conforme descrito anteriormente. Uma terceira amostra foi preparada com 50 pL de plasma contendo 1 ng/mL do analito p24 adicionado diretamente ao coxim de coleta da Ahlstrom. Por ultimo, 50 pL de plasma contendo o analito p24 foram adicionados diretamente a um tubo: contendo tampao de analise, e essa reaqao de referencia teve a composiqao e a liiedi da rotuladas. Cada tubo de reagao foi submetido a vortex de pulso para misturar completamente a reaqao. Cada tubo foi entao aquecido a 95°C durante 4 rninutos. Cada tubo entao foi deixado resfriar a temperatura ambiente (2.3°C) durante 4 rninutos . Antlcorpo morioc' on.al biotinilado contra um epitopo de p24 foi adicionado a cada recipients da reaqao. Apos 1 minuto, 13,5 pL de conjugado de carbono revestido com um anticorpo monoclonal contra um segundo epitopo de p24 foram adicionados a reaqao. Apos breve mistura, uma fita teste contendo uma linha teste de neutrav i d.f.na a uma linha controle anticamundongo foi adicionada a reaqao. As fitas testes foram qua.nl.ificadas usando-se uma camera depois de secadas por subtraqao do piano de fundo do Sinai da Linha teste. Apenas perdas de recuperaqao marginal (p. ex., ILgaqao nao espeuirica) da p24 foram observadas no dispositivo de separagao ajustado com uma membrana VIVID nao Lratada (VDK EIG. 19). Para- todas as outras amostras.um resultado equivalents como o da mistura de referenda e das reagoes de condugao foi obtido, indicando nenhuma perda significative do sinal de analito canto em relaga.o a membrana VIVID: quanto ao coxim de coleta. Ahlstrom.
Experimentos foram. real i zados durante odesenvolvimento de modalidades da presente invengao para avaliar a recuperacao do analito p.24 inoculado em sangue total e recuperado do plasma apos separagao. Amostras de sangue foram recon st i.tuidas a partir de uma amostra de sangue fresco com dois valores de hematocrito (Ht) (Ht de 50% e 35%) que refletem a faixa clinica encontrada na especie humafia. Volumes de cada amostra foram usados (125 u.’, do Ht de 50% e 100 pL do Ht de 35%) de modo que o volume total de plasma disponivel para recuperacao foi o mesmo (60. pL, do qual urn maximo de 50: pL pode ser ab.sorvido pela membrana de coleta). Dispositivos de separagao foram montados e sangue total re-const itui do (125 pL do Ht de 50% e 100 pL do Ht de 35%) foi aplicado aos dispositivos de separagao, e plasma coletado do coxim de cada um deles foi submotido a aval ;agao para leitura de sinal., uma reapao de Teferencla adicional foi roalizada por meio da. qua! 50 pl. de plasma contendo 1 ng/mL do analito p21 foram adicionados diretamente ao tampao de ana) i.so com a composigao e a determinagao rotijladas. A quantidade de analito recupbrada da apl.icapao das amostras do sangue tanl.o com Ht de 35% quanto de 50%: e comparav.el A composigao e a determinagao da reapao de referencia (VER ELG. 20), IndLcando que esse dispositivo de sepamagao de plasma pode ser usado para rccuperar com sucesso analita proteico de amostras de sangue total sem nenhuma perdu detectavel de analito ocorrida atraves da separagao da fase sariguinea Gelular.
O mesmo experimento foi realizado por montagem de dispositivos de separagao ajustados com a membrana Pall A/I) em lugar da Ahlstrom 142 e reconstltuiqao de sangue total com Ht de 35% inoculado com 1 ng/ml de analito p24. Come antes, uma reagao de referenda adicional foi realizada por meio da qual 50 pL de plasma contendo 1 ng/mL de analito p24 foram adicionados diretamente ao tampao de aria Use com a compos!gSo e a medida rotuladas. A quantidade de analito recuperada da aplicagSo das amostras de sangue com Ht de 35% contendo p24 e comparavel a composigao e a determinacao da reagao de referenda (VER. FIG. 21). Este resultadoconfirma que a ca'pacidade de coletar e eluir analito p24 em uma membrana e aplicavel a diferentes composigoes da membrana de: coleta.
Experimentos foram realizados durante o desenvolvimento de modalidades da presente invengao para demonstrar a exequibil idado de atmazenamento de reagentes de analise na membrana de coleta de plasma. Em algumas modalidades, a analise do fluxo Lateral utiliza uma concentragao especlfica de detergentos, a saber, SOS o NP— 40, para permit ir rompj.mento viral (HIV) e L i be ra gap do analito Cp24) de amostras infectadas com IILV. Assim, para uma amostra de plasma de 50 p.L, 100 u.L de tampSo PH.S contendo SDS a 0,2% e NP-40 a 0,67% sAo pre Ferencialmonte necessaries para rompimenco do virion e recuperate de p24. Foram realizados experimentos em que 10 U-L de um sypcimerito de solupao detergents dez vezes concentrada (SDS a 2,0% e NP-40 a 6,7%) foram apl.icados a um coxim de coleta e deixados secar durante 24 horas a temperatura ambiente. Foram entao montados em um dispositivo de separagao e plasma coletado de uma amostra de sangue total de 100 pi., inoculado com 1 ng/mL do analito p24. O resultado foi mensurado contra uma reagao de referenda de composigao e determinacao do tipo solugao-fase com um volume equivalente (50 pL) de plasma. 0 resultado da analise do detergente dessecado no coxim foi comparavel ao da soluqao de referenda de composigao e dete rmin agao do tipo soluqao- fase, indicando que o dessecamento dos reagentes da analise e exequivel e compaLivel na membrana do coxim de coleta (VER FIG. 22)■
Foram Eeitas aval iagoos por meio das qpais 10 pt de suprimento de soluqao detergente dez vezes Concentrada (SDS a 2,0% e NP-40 a 6,7%) foram aplicados a um coxim de coleta e deixados secar durante 24 horas a temperatura ambiente. Em seguida, 50 pl de plasma com ou sem 1 ng/mL do analito p24 foram adidonados ao coxim o deixados secar durante 24 horas a temperatura ambiente. As amostras foram entao reepnstituidas corn 125 pL de tampao PBS, misLuradas por agiLagSo do tubo conLendo o coxim e o tampSo e analisadas. 0 resultado da analise dd detcrgente/p24 dessecadds no. coxim toi comparavel ao da reagao de rcferoncia de composigao e det.erminaqao do tipo solugao-fase, indicando que a dessecagao dos teagentes de analise bem como da proteina. p24 usados como potencia! padrao de referenda (controles positive e negative) para uma analise e exequivel e compativel na membrana do coxim de coleta (VER FTG. 23).
Em algumas modalidades, a presente invenpao fornece um modulo de filtro com um padrao do tipo concha (VER FIG. 24) que e fechado por dobra e trava da metade superior por abas de travamento (VER FIG. 23). Em algumas modalidades, um modulo de filtro do tipo concha compreende uma fenda para uma ti ra tosto de coleta destinada a acomodar a largura da tira teste de coleta. Em algumas modalidades, a entrada para a fenda possui ambas as bordas chan.Trad.as e uma borda inferior preenchida para ajudar a guiar um modulo de coleta para a concha sem interferencia. Em algumas modalidades, a profundidade da fenda e projetada de Lal maneira que ha uma sobreposigSo entre a membrana de. coleta e o filtro de separagao (VER FIG. 30). Em algumas modalidades, um modulo de filtro do tipo concha compreende algas de travamento (p. ex., algas de travamento esquerda e direita) que. permilom trancar a metade superior foehada (VER FIG. 25). Em algumas modalidades, a concha e a.berca por um operador mediante pressao sobre a metade inferior das algas de travamento para gira-la e liborar a metade superior da concha. Em algumas modalidades, uma dobradiga e inl.egrada ao projeto da concha. Em algumas modalidades, um compone'nte plastlco da concha e feita de polipr.opileno. Em algumas modalidades, a dobradiga proporciona a capacldade de abrir e fechar a concha milhares de vezes, embora o real processo exija apenas flex.So por pouco tempo-. Em algumas modalidades, um modulo de filtro do tipo concha compreende uma ou mais bolsas (p. ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10..., 20). Em algumas modalidades., as bolsas servem para manter espessura uniforme da parte moldada, que impede empenamento e marcas de depressao, como aquelas causadas por congelamento desigual. Em algumas modalidades, a .espessura da parede para as bolsas e uniforme. Em algumas modalidades, um modulo de filtro do tipo concha compreende uma aba. Em algumas modalidades,- quando a metade superior da concha e travada usando-se as algas de travamento, a aba encaixa-se com uma dobra nos modifies de coleta. (VER FIG- 31) . Uma ve.z encaixada e travada no local, a fita teste- de coleta nao pode sair da concha por si mesma a nao ser que o operador libere a metade superior da concha. Em. algumas modalidades, o modulo de filtro do tipo concha compreende protegees de trava (p. ex., 4 protepdes de trava). Em algumas modalidades, protegees de trava impedem que -a metade superior da concha deslize para tras e para a frente uma vez que tenha sido travada no local pelas algas de travamento, Em algumas modalidades, as protegees de trava. oncaixam-se com as bordas da algas de travamento (VER FID. 25) . Em. aJqumas modal rdade-s, o modulo de fl !trb do tipo concha compreende urn gerenciador de energia. Km algumas modalidades,. um gerenciador de energia facilita ligapao do filtro de separata com a concha po.r meio de soldagem u!urassonica (VER LUGS. 26-27) . Em algumas imadul i Jades, o gerenciador triangular de energia 6 prpjetado de tai maneira que sua aitura e aprox Lniadamionto a mesma da espessura do fi.lt ro de separagao. Em algumas modalidades, a solda ult ra ssdnica c-ria uma barreira do tipo pseudoanel vis to que o plastico do gereneiador de energia se fundo e flui para o filtro de separagao. A barreira do tipo pseudoanel facil.ita maior realizagao de separagbe-s.. Em algumas modal idades, a membrana e ligada usando-se vedagao termica, soldagem com laser, adesivos etc. Em algumas modalidades, um modulo de filtro do tipo concha compreende uma parede posterior. Em algumas modalidades, a parede posterior da fenda serve como um ponto de interrupgao para posicionamento dos modules de coleta. Quando o modulo de coleta e posicionado para fazer .contato com a pared® posterior, a dobra se alinha automaticamente com a .aba da concha (VER FIG. 31} .
Em algumas modalidades, o modulo de filtro do tipo concha e configurado para conectar-se a, funclonar com e/ou integrar-se com um filtro de separagao. Em algumas modalidades, um modulo de filtro do tipo concha e integrado com um filtro de separagao (p. ex., Pall Vivid) (VER FIG. 26). Em algumas modalidades, o filtro do soparagao e qualquer filtro apropriado, conforme descrito aqui e Cm outros locals. Em algumas modalidades, o filtro de separagao e ligado a metade superior da concha por me i o de wol'd-agcm ulbrassdnica usandg-se o qerenciadd.r de energia. Em outras modalidades, o filtro de separagao e ligado usando-se vedagao termica, soldagem por laser, adesivos etc,. Em algumas modalidades, quando o filtro do separagao e ligado a metade superior da concha e fechado, p filtro de separagao esta dssencialmente riivelado com a metade Inferior da concha (VER FTC. 27, a dire! ta) - Em algumas modalidades, soldagem ultras.sonica proporciona a capacldade do plastico moldado do gerenciador de energia de fundir-se, flui r e unir-se ao filtro de separagao, criando uma barroira do tipo pseudoanel que facilita ainda mais a separaqao mediante .1. i rn:i Laqao de volume excessive- de escoamento dentro do filtro de separagao que reduz a quantidade de plasma capturado pela membrana de coleta.
Em algumas modalidades, p modulo de filtro do tipo concha e configurado para conectar-se a, funcionar com e/ou integrar—se coin urn modulo de coleta (p. ex., modulo de coleta de plasma, modulo de coleta de plasma etc.). Em algumas modalidades, um modulo de coleta compreende uma membrana de coleta (p. ex., Pall A/D). Em algumas modalidades, a membrana de coleta e o compononte que Coleta o absorve o especime de interesse, J's to 6, plasma. Em algumas modalidades, um modulo de coleta compreende tres componentes principals - fita para teste de substrate, adesivo e membrana de coleta. Em algumas modalidades, a fita para teste de substrate e uma lAmlna plastica delgada que e flexivel o bastante para ser dobrada e perfurada, mas tambem suficientemente inflexivel para manter o adesivo e a membrana de coleta. Em algumas modalidades, o modulo de coleta e fabr.Leads empreqando-se Leenoloqia padrao atualrnonte utilizada em fita.s para test e de fluxo lateral similares. Em algumas modalidades, a dobra ha fiLa de teste serve para al inhar c jusLapor a aba com a concha (VER FIG. 31) . Em algumas modalidades, orientaqao apropriada da dobra assegura que a aba se encaixo com o angul’p reLo de modo exato para impedlr que a fiLa saia da concha. Em algumas modalidades, a fita 6 tambem perfurada para permit, i r que o operador a puxe com facilidade sobre o modulo de coleta e para corta-la em dois pedaqos separadcs, se desejado para o prpcedlmento de analise. Em algumas modalidades, um adesivo de dupla lace (3M, St Paul, MN) compativel com diagnostloo e usado para unir a membrana de coleta a fita para teste de substrato. Em algumas modalidades, o adesivo e compativel com diagnostico (isto e, nao contem nem libera nenhum dos inibidores bioquimicos que interfeririam ria analise bioquimica) e e de dupla face para unir-s© seguramente a ambos os tipos de substrato (fita para teste de substrato e membrana de coleta). Em algumas modalidades, o adesivo resists a exposiqoes rigorosas a temperatures elevadas (< 100°C) o liquidos (plasma, solugoes salinas, tamponadas com concentraQoes 150 mM e detergentes, como SDS e NP-40, com conceriLragbes S 0,15% e 0,5%, respect i vameril.e) . Em algumas modalidades, a membrana de coleta (p. ex,, Pall A/D) c dimensionada para ter a mesma largura da fita de coleta e iguala-se com a geometria do adesivo no outro eixo.
Em algumas modalidades, para separar a amostra de sangue, o modulo de coleta de plasma (PCM) e inserido no modulo do filtro (VER FIG. 29) . Com o m6dulo do filtro na posiQao aberta, o PCM e deslizado despendentemente pela fenda e alinhado com a parede posterior, garantindo quo a membrana de coleta seja eonc&ntrica com o Tilt to de separagao o a aba se alitihara com a dobra, da f i La para LesLe do substrato do PCM.Erii algumas modalidades, a altijra da fenda no modulo do filtro e projelada de modo quo haja uma sob repos.i qao entre o filtro de separagao e a membrana de coleta. Em algumas modalidades, a sobreposigao facilita compressao entre o filtro de separagao e a membrana de coleta. Em algumas modalidades, a cotnpressao facilita separagao de sangue (VER FIG. 30) .
Em algumas modalidades, quando o PCM e inserido no modulo de filtro e a concha e fechada, a aba da concha (VER FIG. 24) encaixa-se coni a dobra na fita para teste do substrato (VER FIG. 28) . Em algumas modalidades, a aba comprime-se suavemente para o interior do PCM, assegurando que ela esta mantida firmemente no PCM. Em algumas modalidades, a borda posterior da aba encaixa-se na borda da dobra (VER FIG. 31), o que impede deslizairiento do PCM para fora da concha.
Esta modalidade da presente invengao b usada para realizar separagao de uma amostra de sangue (VER FIG, 32). 0 operador distribui o volume de sangue prescrito no filtro de separagao. Depois de aguardar poucos minutos, o filtro de separagao permit® passagem do plasma sanguineo, mas ndo de outros componentes do sangue, para a membrana de coleta no modulo do coleta. Con La to Intimo entre o filtro de separagao e a membrana de- coleta permits passagem de plasma sanguineo e facilita separagao do sangue (VER FIG. 30). Uma vez concluida a separagao, o operador pressiona a metade inferior das algas de travamento osquerda e d i re i a para qirar as abas para fora o I i be rar a metade superior do modulo de filtro. Nesse estagio, a dobra da. coleta nao e mais oncaixada ria aba, e o modulo de coleta pode ser removido polo usuario. 0 modulo do coleta e retnov i do do modulo de I i Itro. Qualquer um ou amfesS: os ih6dul.os podem ser usados para procc&sos subsequente de LesLc>. Em algumas modalidades, a contagem de CD4 do paciente pode ser monitorada por meio do modulo de filtro que contem os componentes celulares do sangue. Em alguns casos, o modulo de coleta, que contem o componente plasma sanguineo, pode ser mpregado para determinagao de carga viral usando-se PCR ou reagao bioqui mi ca relacionada. Por exemplo, PMRs separadas do PCM ou alojadas nele podem ser usadas para extragao de RNA viral do plasma sanguineo e sua eluigao diretamente no tampao para processamento relacionadc com PGR. Em algumas circunstancias, o PCM pode ser usado em um sistema de fluxo lateral para a detecgao de anticorpos anti-HIV, proteina p24 etc. Em algumas circunstancias, o modulo do filtro e/ou o PCM podem set transportados ate uma instituigao secundaria para qualquer um dos processes bioquimicos anteriormente mencionados. REFERENCIAS
Todas as publicagoes e patentes mencionadas na DESCRIÇÃO precedent© e/ou relacionadas adiante sao aqui incorporadas por referencia. Diversas modificagdes e variagdes das composigoes e metodos descritos da invengao serao evident.es para aqueles com experiencia pratica sem desviar-se do objetivo e do principle da invengao. Embora a invengao tenha sido descrita em conexao com modalidades especiricas preferidas, deve ser comprcendido que a invengao conforme reivindicada nao deve ser indevldamente limitada a tais modalidades cspec.1.fleas. De fato, varias modificagocs dos modelos descritos para conduzir a Invengao que sao bbvias para aqueles com experidneia nos campos reldvantes tem por final idade estar dentro do cscopo da presente invengao. As referdnelas a seguir sfto incorporadas por referenda cm sua totalidade:
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Claims (16)
1. Metodo de filtragao de plasma sanguineo caracterizado pelo fato de compreender:prover um dispositivo que compreende uma membrana de coleta configurada para permitir a passagem do plasma sanguineo mais rapidamente do que os componentes celulares do sangue e um modulo de coleta de plasma configurado para extrair o plasma sanguineo para dentro do mesmo por agao da capilaridade, em que o modulo de coleta de plasma acomoda um volume fixado de plasma;com o modulo de coleta de plasma em contato direto com a membrana de coleta, aplicando uma amostra de sangue para a membrana de coleta, em que o plasma sanguineo e coletado no modulo de coleta de plasma;em que o volume fixado de plasma do modulo de coleta de plasma e maior do que o volume de plasma coletado no modulo de coleta de plasma; eseparar o modulo de coleta de plasma da membrana de coleta.
2. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida extragao de plasma sanguineo atraves da membrana de coleta e passiva.
3. Metodo, de acordo com a reinvindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida extragao nao requer eletroforese, centrifugagao ou mais que pressao atmosferica.
4. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida membrana de coleta acomoda um volume fixado da referida amostra de sangue.
5. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido volume fixado do referido modulo de coleta de plasma e menor que o referido volume fixado da referida membrana de coleta.
6. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido volume fixado do referido modulo de coleta de plasma e independente do volume da referida amostra de sangue.
7. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido volume fixado do referido modulo de coleta de plasma e independente do hematocrito da referida amostra de sangue.
8. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda armazenamento do referido plasma no referido modulo de coleta de plasma.
9. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a inserpao do modulo de coleta de plasma dentro de um modulo para analise.
10. Dispositivo para separapao de plasma do sangue total caracterizado pelo fato de que compreende:um modulo de filtro que compreende (i) uma membrana de coleta configurada para permitir apenas a passagem do plasma sanguineo, e (ii) um modulo de coleta que compreende um modulo de coleta de plasma, em que o modulo de filtro e o modulo de coleta sao ligadas de modo que a membrana coletora e o modulo de coleta de plasma estao em intimo contato para extrair o plasma sanguineo da membrana coletora por apao da capilaridade; e em que o modulo de coleta de plasma e separavel da membrana de coleta;em que o modulo de coleta de plasma acomoda um volume fixado de plasma que e maior do que o volume de plasma extraido para dentro do modulo de coleta de plasma
11. Dispositivo, de acordo com a reinvindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida membrana de coleta acomoda um volume fixado de sangue total.
12. Dispositivo, de acordo com a reinvindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido volume fixado do referido modulo de coleta de plasma e menor que o referido volume fixado da referida membrana de coleta.
13. Dispositivo, de acordo com a reinvindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida membrana de coleta compreende uma membrana de separagao de plasma a base de polissulfona assimetrica.
14. Dispositivo, de acordo com a reinvindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida membrana de coleta compreende coxim de coleta a base de fibra de vidro.
15. Dispositivo, de acordo com a reinvindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende particulas paramagneticas no referido modulo de coleta de plasma.
16. Dispositivo, de acordo com a reinvindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende reagentes de analise no referido modulo de coleta de plasma.
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