ES2835267T3 - Polimorfos hidratados de 2'-O-fucosil-lactosa y procedimientos para su preparación - Google Patents
Polimorfos hidratados de 2'-O-fucosil-lactosa y procedimientos para su preparación Download PDFInfo
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Abstract
Hidrato de 2'-O-fucosil-lactosa (2'FL) con fórmula molecular C18H32O15*nH2O en la cual n es un número en el intervalo entre 1 y 3; en forma cristalina del polimorfo A, n es 3/2, en el que dicho polimorfo A es 2'FL-3/2 H2O, que tiene picos característicos de XRPD a 9,89±0,20, 17,05±0,20, 18,86±0,20 2Θ; o en forma cristalina del polimorfo B, n es 5/2, en el que dicho polimorfo B es 2'FL-5/2H2O, que tiene picos característicos de XRPD a 9,96±0,20, 11,90±0,20, 20,48±0,20 2Θ; en el que las mediciones se realizan usando radiación de Cu-K-alfa (lambda = 1,5418) en el intervalo de 2Θ 4 a 60°.
Description
DESCRIPCIÓN
Polimorfos hidratados de 2'-O-fucosil-lactosa y procedimientos para su preparación
Campo de la invención
Esta invención se refiere al campo de los nuevos compuestos hidratos y un polimorfo anhidro de 2'-O-fucosil-lactosa (2'FL) y sus procedimientos de preparación, y en particular se refiere a dos nuevos polimorfos hidratados y anhidros.
Estado de la técnica
En los últimos años se han realizado numerosos esfuerzos para sintetizar oligosacáridos, dada su implicación en numerosos procesos biológicos. Desde un punto de vista comercial se ha dado mucha importancia a los oligosacáridos secretados en la leche materna, tanto por su valor alimenticio como por su función terapéutica. Uno de los principales, presente en las concentraciones más altas, es 2'FL (el diagrama 1 muestra la fórmula estructural) no solo importante desde el punto de vista nutricional y probiótico, sino, pero también por su anti-adhesividad, inmunoestimulación, desarrollo neuronal, etc ...
Un objetivo comercial interesante es utilizar este oligosacárido en alimentos para bebés como fórmulas infantiles, suplementos nutricionales o formulaciones cosméticas y farmacéuticas. Para hacer esto, se necesitaría tener un procedimiento simple y económico de aislamiento y purificación, como la cristalización.
Las primeras muestras de oligosacáridos secretados en la leche materna, se obtuvieron por cromatografía de la propia leche, con purezas no muy elevadas, dada la gran cantidad de isómeros estructurales presentes. En el caso específico de la 2'-O-fucosil-lactosa, la presencia del isómero estructural 3-O-fucosil-lactosa dificultó su aislamiento durante mucho tiempo.
Téngase en cuenta que las diversas fases cristalinas o amorfas de una molécula activa (como 2'FL), pueden poseer propiedades químicas, físicas y mecánicas que pueden ser bastante diferentes entre sí (por ejemplo, solubilidad y biodisponibilidad, higroscopicidad, conductividad térmica y eléctrica, estabilidad química, dureza, etc.), con consecuencias considerables sobre su uso, manejo y depuración. Además, la posibilidad de interconversión entre las distintas formas puede tener consecuencias muy graves en la vida de un producto y en el mantenimiento de las propiedades deseadas (eficacia terapéutica en el caso de un fármaco, propiedades cromáticas en el caso de un pigmento, etc.). Más específicamente, se debe considerar que, dependiendo de variables como temperatura, presión y humedad relativa, una forma metaestable se puede transformar en una forma termodinámicamente más estable, o bien una forma cristalina anhidra se puede transformar en una forma cristalina hidrato mediante la absorción de vapor de agua del ambiente y una forma cristalina solvato pueden, a su vez, transformarse en una forma cristalina anhidra o con un grado diferente de solvatación debido a la pérdida de disolvente.
Con respecto a 2'FL, la primera forma cristalina está dada en la literatura por Kuhn et al. (Chem. Ber. 1955, 88, 1135; ibid., 1956, 89, 2513), que describe la cristalización del oligosacárido aislado de la leche materna. Obtienen un cristal que no tiene agua de hidratación, que creen que está en forma anomérica a y que tiene un punto de fusión (con descomposición) de 230-231 °C. Como describe Kuhn, esta forma cristalina se puede obtener a partir de la 2'FL aislado de la leche materna (en forma de jarabe o amorfo) disolviéndolo en metanol caliente al 75 % al que, en presencia de cristales semilla, se añade gradualmente etanol absoluto. Los cristales semilla se obtuvieron porque, después de un almacenamiento prolongado, se encontró que se precipitaban en las paredes de los matraces que contenían el jarabe de 2'FL o bien se precipitaban a partir de una solución acuosa de metanol, n-butanol y n-hexanol a 4 °C. C durante varias semanas.
Después de Kuhn, se divulgan formas cristalinas en la solicitud de patente WO/2011 150939 en la que se iforma acerca de dos polimorfos de 2'-O-fucosil-lactosa denominados Polimorfo I y Polimorfo II.
El polimorfo I tiene una difracción de rayos X en polvo con picos característicos en ángulos de 20 21,34°, 20,92°, 18,37°, 16,70°, 9,91°, 13,13°, 7,87° y 8,90°. El polimorfo I se describe como predominantemente en forma anomérica
a, libre de agua de cristalización o disolvente y con una curva de DSC endotérmica cuyo pico máximo está a 260 ± 1 °C o 246 ± 1 °C a medida que disminuye el porcentaje de anómero p (de 20 ± 3 % a 12 ± 3 %). Este Polimorfo I se describe como obtenible por cristalización, en ausencia de cristales semilla, a partir de una mezcla acuosa de metanol o etanol. El polimorfo II tiene una difracción de rayos X en polvo con picos característicos en ángulos 2016,98°, 13,65°, 18,32°, 21,70°, 15,22°, 20,63° y 11,94°. El polimorfo II se describe como anhidro y no solvato. Puede ser una mezcla de los dos anómeros o simplemente uno de los dos. Éste, en DSC, presenta una curva endotérmica que tiene un pico máximo a 259,5 ± 2 °C. Este Polimorfo II se describe como obtenible por cristalización, en presencia de cristales semilla, a partir de una mezcla acuosa de metanol, o alternativamente puede obtenerse por cristalización, sin semilla, a partir del Polimorfo I con acetato de etilo.
Para la preparación de 2FL se sigue sintiendo la necesidad de adquirir más conocimientos sobre sus posibles formas cristalinas para mejorar las características del producto y mejorar las posibilidades de preparación, purificación y vida útil a largo plazo.
El propósito de esta invención es proporcionar polimorfos adicionales de 2'FL y sus procedimientos de preparación, que preferiblemente serían explotables industrialmente.
Definiciones y abreviaturas
XRPD: difracción de rayos X en polvo
IR: infrarrojos
DSC: calorimetría diferencial de barrido
RMN: resonancia magnética nuclear
TGA: análisis termogravimétrico
DTA: análisis térmico diferencial
LOD = pérdida por secado
KF: Karl Fischer
Resumen de la invención
Esta invención resuelve los problemas anteriores mediante el aislamiento e identificación de nuevos compuestos hidratos y un nuevo polimorfo anhidro de 2'FL:
- compuestos hidratos con fórmula general 2 'FL-n^O donde n es un número entre 1 y 3.
En particular, se han identificado los siguientes dos nuevos compuestos hidratos:
- 2 'FL3/2 H2O, preferiblemente en la forma cristalina del polimorfo A con picos característicos de XRPD a 18,86 ± 0,20, 9,89 ± 0,20, 17,05 ± 0,2020,
- 2 'FL5/2 H2O, preferiblemente en la forma cristalina del polimorfo B con picos característicos de XRPD a 9,96 ± 0,20, 20,48 ± 0,20, 11,90 ± 0,2020,
Esta invención también se refiere a procedimientos para preparar estos polimorfos.
Sorprendentemente, el aislamiento de los polimorfos de 2'-O-fucosil-lactosa según la invención es fácilmente factible con excelentes rendimientos a escala industrial. En particular, de hecho, los polimorfos A y B se aíslan, al final del procedimiento de síntesis 2'FL, con alta pureza y, por lo tanto, pueden usarse como ingredientes en diversos tipos de formulaciones farmacéuticas o alimentarias.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 1
La figura 2 muestra el espectro IR del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 2
La figura 3 muestra la curva de análisis de calorimetría de barrido diferencial del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 2
La figura 4 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo
La figura 5 muestra el diagrama ORTEP de la estructura monocristalina del Polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 2
La figura 6 muestra el análisis termogravimétrico y térmico diferencial del Polimorfo A del ejemplo 2
La figura 7 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 4
La figura 8 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 6
La figura 9 muestra el espectro de IR del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 6
La figura 10 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 7
La figura 11 muestra el espectro de IR del polimorfo A 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 7
La figura 12 muestra el espectro IR del polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 8
La figura 13 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 8
La figura 14 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 9
La figura 15 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 10
La figura 16 muestra el espectro de 1HRMN del Polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 11
La figura 17 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo A de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 13
La figura 18 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo a diferentes temperaturas del polimorfo A y B de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 14
La figura 19 muestra el espectro IR del polimorfo B de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 15
La figura 20 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo de la 2'-O-fucosil-lactosa Polimorfo B del ejemplo 15
La figura 21 muestra el espectro IR del polimorfo B de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 17
La figura 22 muestra la curva de análisis de calorimetría de barrido diferencial del polimorfo B de 2'-O-Fucosillactosa del ejemplo 17
La figura 23 muestra el análisis termogravimétrico y térmico diferencial de Polimorfo B del ejemplo 17
La figura 24 muestra el espectro de difracción de rayos X en polvo del Polimorfo B de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 17
La figura 25 muestra el espectro de 1HRMN del polimorfo B de 2'-O-fucosil-lactosa del ejemplo 18
Descripción detallada de la invención
Para los propósitos de esta invención, la difractometría de rayos X en polvo se refiere a mediciones realizadas usando radiación de Cu-Ka.
Para obtener los nuevos compuestos hidratos, la 2'FL pudo haberse obtenido mediante extracción, de forma enzimática, química (véanse, por ejemplo, los procedimientos de síntesis descritos en los documentos WO 2010/070616, WO 2010/115934, WO 2010/115935), o mediante una combinación de estas formas.
Esta invención también se refiere a un procedimiento para obtener el Polimorfo A que se obtiene por cristalización a partir de una mezcla que comprende agua y al menos otro disolvente. Dicho disolvente puede seleccionarse entre alcoholes, cetonas (por ejemplo, acetona), nitrilos (por ejemplo, acetonitrilo), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético glacial) o ésteres (por ejemplo, acetato de etilo). Los disolventes preferidos son el alcohol de C1-C3 y, en particular, el alcohol de C2 y la cristalización puede realizarse con o sin siembra de semilla.
La relación de agua a disolvente puede variar entre el 40 y el 10 % (v/v), y la cantidad preferida está entre el 25 y el 15 % (v/v).
El polimorfo A es hidrato 3/2 y con un contenido de disolvente de menos de 1100 ppm, preferiblemente menos de 550 ppm, aún más preferiblemente menos de 200 ppm y en particular menos de 100 ppm.
El polimorfo A obtenido, sorprendentemente, en estado sólido, se presenta exclusivamente en forma anomérica p como lo muestra la estructura monocristalina (véase la figura 5). El porcentaje anomérico también se determinó a partir del espectro de 1HRMN registrado en disolvente deuterado en disolución (véanse los detalles en la sección experimental). Los espectros registrados en estas condiciones muestran un porcentaje de anómero a de menos del 15 %, preferiblemente menos del 10 %.
El polimorfo que se obtiene puede alcanzar una pureza muy alta, con impurezas totales de menos del 5 %, preferiblemente menos del 3 %, más preferiblemente menos del 1 %, aún más preferiblemente menos del 0,5 %. Las impurezas residuales pueden ser pequeños porcentajes de disolventes residuales, azúcares simples (lactosa, galactosa, glucosa, fucosa), intermedios de reacción, intermedios sin reaccionar y productos de reacciones secundarias, dependiendo de la ruta de síntesis empleada.
Para obtener el Polimorfo A, la 2'FL (amorfo, como cristal o ya en solución) se prepara como una solución acuosa a una concentración en peso entre 53 % y 75 % y luego se carga con disolvente.
Incluso más preferiblemente, para los propósitos de esta invención y esta descripción, la 2'-O-fucosil-lactosa es aquella en solución que proviene directamente de la reacción de hidrogenación, el paso final de la síntesis como se muestra en el documento WO2010/070616, que se lleva a una concentración en peso de entre 53 % y 75 % y luego se carga con el disolvente, como se mencionó anteriormente para obtener el Polimorfo A.
La concentración preferida de la solución acuosa está entre 60 y 65 % en peso, y a esto se le agrega el disolvente que puede ser absoluto o tener un contenido de agua variable, de hasta el 20 %, preferiblemente hasta el 15 %, aún más preferiblemente hasta el 10 %, e incluso más preferiblemente hasta el 4 %.
En la preparación del polimorfo A uno de los procedimientos implica concentrar 2'-O-fucosil-lactosa hasta un jarabe, manteniendo la solución caliente entre 35 y 70 °C, preferiblemente entre 45 y 67 °C, aún más preferiblemente entre 50 y 60 °C, y añadiendo el disolvente caliente o a temperatura de ebullición. El disolvente se agrega gradualmente y la mezcla se deja en agitación tibia entre 1 y 15 horas. Luego se deja que la mezcla regrese espontáneamente a una temperatura entre 13 y 28 °C, preferiblemente entre 20 y 25 °C, se filtra, se lava con una mezcla de agua/disolvente, y se seca el sólido obtenido.
La mezcla de cristalización se mantiene, durante la adición del disolvente, a una temperatura entre 35 y 70 °C, preferiblemente entre 45 y 67 °C, aún más preferiblemente entre 50 y 60 °C. Normalmente, se puede observar la formación de algunos núcleos de cristalización durante o al final de la adición del disolvente. Alternativamente, la cristalización puede iniciarse con una pequeña cantidad de cristales de polimorfo A.
La mezcla de cristalización después de la adición del disolvente, se mantiene durante 1-24 horas, preferiblemente durante 1-16 horas, aún más preferiblemente durante 2-8 horas, a una temperatura entre 40 y 70 °C, preferiblemente entre 45 y 67 °C, e incluso más preferiblemente entre 55 y 65 °C. Luego, la mezcla se enfría o se deja enfriar a temperatura ambiente en 1-24 horas. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente (20-25 °C) durante un tiempo que varía desde unas pocas horas hasta unos pocos días, preferiblemente entre 1 y 24 horas, aún más preferiblemente entre 8 y 18 horas. Opcionalmente, la mezcla, antes de filtrarse para recoger el sólido cristalino, puede enfriarse más a 2-18 °C, preferiblemente a 5-15 °C.
Las operaciones de recogida del sólido cristalino son las bien conocidas por los expertos en la materia con los medios habituales de filtración y adecuado lavado con alícuotas del sistema agua/disolvente utilizado para la cristalización.
Esta invención también proporciona un procedimiento para preparar el Polimorfo A a partir del Polimorfo B. Este cambio de fase es posible mediante el secado del Polimorfo B en un desecador con gel de sílice anhidro durante 12 48 horas, preferiblemente 18-36 horas. Incluso más preferiblemente, el secado se puede llevar a cabo a 46-65 °C, preferiblemente a 48-55 °C a presión ambiente o menor y posterior enfriamiento a temperatura ambiente. Con el último procedimiento, el polimorfo B, antes de transformarse en A, pasa por una nueva fase anhidra con picos característicos de XRPD a 9,96 ± 0,20, 18,88 ± 0,20, 1,17 ± 0,20, 11,79 ± 0,2, 16,09 ± 0,20, 12,62 ± 0,2, 15,70 ± 0,2, 14,20 ± 0,220.
El polimorfo A exhibe picos de IR característicos a 3338 ± 4 cm-1, 2938 ± 4 c irr1, 1655± 4 c irr1, 1344 ± 4 cirr1, 1021 ± 4 cm-1, 819 ± 4 cm-1, 760 ± 4 cm-1, preferiblemente a 3338 ± 4 cm-1, 2938 ± 4 cm'1, 1655 ± 4 cm-1, 1344 ± 4 cm-1,1237 ± 4 cm'1, 1171 ± 4 cm-1, 1131 ± 4 cm'1, 1021 ± 4 cm'1, 819 ± 4 cm'1, 760 ± 4 cm'1, 687 ± 4 cm'1. En particular está presente el pico a 1655 ± 4 cm'1, mucho más intenso que en los polimorfos anhidros.
Bajo el análisis de DSC, muestra una tendencia caracterizada por tres picos endotérmicos. El primero tiene el pico máximo a la temperatura de 61 ± 3 °C, el segundo a 182 ± 3 °C y el tercero a 247 ± 3 °C. El primer pico es atribuible a la deshidratación, el segundo a la fusión y el tercero a la descomposición de la muestra.
La pérdida por secado del Polimorfo A, realizado con el Procedimiento 1 (véase sección experimental), varía del 1,5 % en peso al 3 % en peso, preferiblemente del 1,1 % en peso al 2,5 % en peso.
El polimorfo A muestra valores característicos de Karl-Fischer entre 4,0 % y 6,0 % en peso y preferiblemente entre 4,4 % y 5,2 % en peso.
En particular, el Polimorfo A, se sometió a estudios de estabilidad ambos acelerados a 40° ± 2 °C; 75 ± 5 % de HR y a 25° ± 2 °C, 60 ± 5 % de HR. A partir de estos estudios se observó que la muestra tiende a adsorber humedad de forma inmediata (1-3 meses) mostrando, en comparación con el inicio, un incremento en el valor de KF que permanece constante en el tiempo.
En particular, el porcentaje de agua toma valores entre 5 % y 7 %, preferiblemente entre 5,5 % y 6,5 %, aún más preferiblemente entre 5,7 % y 6,2 % (véase Tabla 1). Esta agua extra detectada por KF, sin embargo, no es agua de cristalización porque el espectro XRPD de estas muestras continúa mostrando los picos característicos del Polimorfo A. Lo que cambia es la pérdida por secado que pasa a valores entre 2,5 % en peso a 4,8 % en peso, preferiblemente entre 3,0 % en peso y 4,3 % en peso, y más preferiblemente entre 3,2 % en peso y 4,0 % en peso. Véase la figura 7
Tabla 1: estabilidad acelerada 40°±2° C^ 75±5 % RH Polimorfo A
El polimorfo A tiene picos XRPD característicos a 18,86 ± 0,20, 9,89 ± 0,20, 17,05 ± 0,2020, preferiblemente a 18,86 ± 0,20, 9,89 ± 0,20, 17,05 ± 0,20, 21,65 ± 0,2, 14,20 ± 0,2020, más preferiblemente a 18,86 ± 0,20, 9,89 ± 0,20, 17,05 ± 0,20, 21,65 ± 0,2, 14,20 ± 0,20, 21,80 ± 0,2, 20,36 ± 0,220, aún más preferiblemente en 18,86 ± 0,20, 9,89 ± 0,20, 17,05 ± 0,20, 21,65 ± 0,2, 14,20 ± 0,20, 21,80 ± 0,2, 20,36 ± 0,2, 15,55 ± 0,220. La lista de picos con las intensidades relativas y la d (distancias interplanar) del polimorfo A se muestra en la Tabla 2.
El polimorfo A como monocristal tiene un grupo espacial del tipo P2-|2-|21. Está dispuesto en un sistema de cristal ortorrómbico y la celda unitaria tiene los siguientes parámetros: a =12,4098(8) A, b = 12,737(2) A, c = 13.756(2) A y un volumen de 2212,5 A3
La unidad asimétrica del cristal de la muestra contiene una molécula de 2'-O-fucosil-lactosa y dos sitios que contienen moléculas de agua. El sitio correspondiente al átomo de oxígeno O26 (véase la figura 5) está completamente ocupado, mientras que en el caso del sitio del átomo de oxígeno 027 la ocupación calculada es igual al 50 %. De esto vemos claramente que la composición química del cristal es tal que por cada molécula de polisacárido hay 1,5 moléculas de agua o 2'-O-fucosil-lactosa.1,5H2O.
El análisis de rayos X monocristalino también muestra que el Polimorfo A está presente exclusivamente en forma p (véase la figura 5).
Esta invención también se refiere a un procedimiento para preparar el Polimorfo B que se obtiene por cristalización en agua. La cristalización se puede realizar con o sin imprimación.
El polimorfo B es 2,5 hidratado y sorprendentemente se presenta predominantemente en forma anomérica p, con un porcentaje de anómero a inferior al 10 %. El porcentaje anomérico se determina a partir del espectro de 1HRMN registrado en disolvente deuterado en disolución (véase sección experimental).
El polimorfo obtenido tiene una pureza muy alta, superior al 95 %, preferiblemente superior al 97 %, aún más preferiblemente superior al 99 %. Las impurezas, dependiendo del procedimiento de obtención de 2'FL, pueden ser disolventes residuales, azúcares simples (lactosa, galactosa, glucosa, fucosa), intermedios de reacción, intermedios sin reaccionar, productos de reacciones secundarias, 2'-O-fucosil-lactosa en forma polimórfica, u otras fases amorfas (por ejemplo, la del polimorfo A).
Para obtener el Polimorfo B uno de los procedimientos implica concentrarlo (o preparar una solución acuosa) a un porcentaje en peso entre 50 y 80 %. La precipitación de la solución acuosa puede tener lugar opcionalmente por siembra de semilla.
La concentración preferida del jarabe está entre 74 % y 77 % en peso.
En la preparación del Polimorfo B uno de los procedimientos implica concentrar 2'FL hasta formar un jarabe, manteniéndolo caliente entre 30 y 60 °C, preferiblemente entre 35 y 50 °C, más preferiblemente entre 38 y 48 °C, aún más preferiblemente entre 40 y 45 °C en la solución acuosa, y la adición opcional de Polimorfo B como semilla. Al final de la concentración, el jarabe se mantiene caliente durante 1-12 horas, preferiblemente durante 1-8 horas, aún más preferiblemente durante 1-4 horas. Normalmente se puede observar la formación de cristales o, alternativamente, se puede sembrar la cristalización con la adición de una pequeña cantidad de Polimorfo B.
La mezcla de cristalización se mantiene a una temperatura entre 20 y 30 °C, preferiblemente entre 20 y 25 °C durante un tiempo que varía de 10 horas a 10 días, preferiblemente durante aproximadamente 12-120 horas, aún más preferiblemente durante 12-24 horas.
A continuación, la mezcla se enfría entre 2 y 18 °C, preferiblemente entre 10 y 15 °C antes de recoger el cristal.
El cristal se filtra y se lava con alícuotas sucesivas de agua enfriada a 4-15 °C, preferiblemente entre 4 y 10 °C.
El polimorfo B muestra picos de IR característicos a 3340 ± 4 cirr1, 2938 ± 4 c irr1, 1655 ± 4 c irr1, 1348 ± 4 c irr1, 1023 ± 4 cm'1, 819 ± 4 c irr1, 762 ± 4 c irr1, preferiblemente a 3340 ± c irr1, 2938+ cirr1, 1655 ± 4 c irr1, 1348 ± 4 c irr1, 1239 ± 4 cm_1, 1173 ± 4 cm_1, 1133 ± 4 cm_1, 1023 ± 4 cm_1, 819 ± 4 cm_1, 760 ± 4 cm_1, 687 ± 4 cm_1. Incluso el polimorfo B, como el polimorfo A, se distingue de las fases anhidras debido a la presencia de un pico intenso a 1655 ± 4 cm’1.
El análisis DSC del polimorfo B muestra tres picos endotérmicos intensos, el primero con el pico máximo a 83 ± 3 °C, el segundo a 182 ± 3 ° C y el tercero a 242 ± 3 °C. El primer pico es atribuible a la deshidratación, el segundo a la fusión y el tercero a la descomposición de la muestra.
El polimorfo B se caracteriza por valores de Karl-Fischer entre 8,0 % y 8,9 % en peso, así como pérdidas por secado, medidas por el Procedimiento 1, entre 5,2 % en peso y 6,4 % en peso.
El polimorfo B tiene picos característicos de XRPD a 9,96 ± 0,20, 20,48 ± 0,20, 11,90 ± 0,2020, preferiblemente a 9,96 ± 0,20, 20,48 ± 0,20, 11,90 0,20, 19,84 ± 0,2, 22,20 ± 0,20, 20, más preferiblemente a 9,96 ± 0,20 , 20,48 ± 0,20, 11,90 ± 0,20, 19,84 ± 0,2, 22,20 ± 0,20, 14,03 ± 0,2, 9,18 ± 0,220, aún más preferiblemente a 9,96 ± 0,20, 20,48 ± 0,20, 11,90 ± 0,20, 19,84 ± 0,2, 22,20 ± 0,20, 14,03 ± 0,2, 9,18 ± 0,2, 9,26 ± 0,2020. La lista de picos con intensidades relativas y la d (distancias interplanares) del polimorfo B se muestran en la Tabla 3.
continuación
La celda unitaria obtenida de la colección monocristalina del Polimorfo B es ortorrómbica (a =14,762, b = 12,622, c = 12,3540) y está perfectamente de acuerdo con la calculada a partir del espectro de polvo (a = 14,905 (7), b = 12,663 (6), c = 12,447 (5)). El grupo espacial en el que cristaliza es P2-|2-|21 y tiene un volumen de celda de 2349,4 A3 frente a los 2212,5 A3 del polimorfo A.
Las operaciones de recogida del sólido cristalino son las bien conocidas por los expertos en la materia con los medios habituales de filtración y lavado adecuado con alícuotas del disolvente utilizado para la cristalización.
Otro objeto de esta invención es un Polimorfo A o B como se describe anteriormente para su uso como medicamento, como suplemento dietético o como ingrediente en cosméticos.
Por tanto, el alcance de la invención también incluye composiciones farmacéuticas, alimentarias o cosméticas que comprenden cualquiera de los polimorfos A o B como se describió anteriormente. Las composiciones alimenticias particularmente preferidas son las fórmulas infantiles. Esta invención se entenderá mejor a la luz de las siguientes formas de realización.
Sección experimental
Procedimientos analíticos:
1) Análisis DSC
Los análisis calorimétricos diferenciales se llevaron a cabo utilizando un instrumento del sistema Mettler T STARe (Mettler Toledo, Suiza) equipado con una celda DSC. Las muestras pesadas con una microbalanza Mettler MX5 en contenedores A1 adecuados, posteriormente sellados y perforados, se sometieron a análisis, se llevaron a cabo a una velocidad de barrido de 10 °C/min en el intervalo de temperatura de 30 a 300 °C en aire estático.
El instrumento se calibró previamente con indio como estándar (pureza 99,98 %, punto de fusión 156,61 °C, entalpia de fusión 28,71 J/g).
2) Análisis de Karl-Fischer
Determinación del contenido de agua en el producto basada en una reacción de oxidación-reducción específica entre el agua presente en la muestra y el reactivo de Karl Fischer.
Lista de equipos y reactivos
• Titulador automático Metrohm mod. 701 KF Titrino.
• Balanza analítica
• Hydranal composite 2 Riedel de Haen o equivalente
• Hydranal disolvente Riedel de Haen o equivalente
Modos de operación
Los parámetros utilizados son los siguientes:
l (pol) 2 |jA
EP 250 mV
Crit. de detención Deriva
Deriva 20jl/m in
Velocidad máxima 30 ml/min
Incr. Mín. de volumen 9 J
Se pesaron aproximadamente 200 mg de 2'-FL en el recipiente apropiado, la balanza se ajustó a cero y la sustancia se transfirió a la celda previamente deshidratada. El recipiente vacío se colocó en el plato de la balanza para determinar el valor exacto de la sustancia transferida a la celda. Se pone el peso medido en la fórmula:
% H2O = V x T x F / PC
en la cual:
V = volumen de reactivo de Karl Fischer utilizado en el punto equivalente;
T = Título del reactivo en mg / mL;
PC = Peso de la muestra analizada;
F = factor de multiplicación = 100.
La siguiente tabla muestra los porcentajes teóricos en peso de agua en comparación con el grado de hidratación de la molécula.
3) LOD
Procedimiento gravimétrico con calentamiento de la muestra mediante lampa halógena Ohaus themobalance mod. 45 MB
Procedimiento 1
Las condiciones del Procedimiento 1 son las siguientes:
Perfil: fases
Paso 1: 50 °C durante 1 minuto
Paso 2: 60 °C durante 1 minuto
Final: 90 °C
Apagado: alib (<1 mg en 120 segundos)
Unidad. Per.: APAGADO
Peso objetivo: ninguno
Procedimiento 2
Las condiciones del Procedimiento 2 son las siguientes:
Perfil: fases
Paso 1: 50 °C durante 1 minuto
Paso 2: 50 °C durante 1 minuto
Final: temperatura de secado 56 °C
Apagado: alib (<1 mg en 60 segundos)
Unidad. Per.: APAGADO
Peso objetivo: ninguno
4) Análisis de 1HRMN
Los análisis de 1HRMN se llevaron a cabo en un Varian VXR300 o Gemini 200 disolviendo 10 mg de producto en 0,75 ml de D2O o DMSO en un tubo para espectros de RMN. Los espectros se registraron en disolución y en equilibrio. En el primer caso se prepara el tubo con el producto y disolvente deuterado y se registra inmediatamente el espectro.
En el segundo caso se disuelve el producto en disolvente deuterado, se deja equilibrar al menos una noche y luego se registra el espectro.
Para los espectros en D2O, para calcular la relación a/p, se hace referencia a los siguientes picos:
a) pico a 5,3 ppm (H-1 fucosa)
b) pico a 5,2 ppm (H-1 a glucosa)
El cálculo del porcentaje de a en comparación con p es el siguiente:
(Integral de la señal b/integral de la señal) * 100
Para los espectros en DMSO se hace referencia a los siguientes picos:
c) pico a 6,7 ppm (OH glucosa p);
d) pico a 6,3 ppm (OH glucosa a);
El cálculo del porcentaje de a en comparación con p es el siguiente:
[Integral de la señal d/ (integral de la señal c integral de la señal d)] * 100
5) Punto de fusión
Los análisis del punto de fusión se llevaron a cabo con un BUCHI Melting Point B-540.
Se coloca una alícuota del sólido en un tubo capilar de punto de fusión y se inserta en la ranura correspondiente del instrumento. Se realiza un análisis preliminar con calentamiento rápido para comprobar la temperatura aproximada de fusión. A continuación, se repite el análisis estableciendo un calentamiento rápido a 10-15 °C por debajo de la temperatura de fusión y luego un calentamiento de 2 °C/minuto hasta que se observa la fusión/descomposición de la muestra.
6) Espectros de polvo
Se molió una alícuota de la sustancia, entre 10 y 20 mg, y se colocó en un portamuestras de fondo cero. Para cada muestra, los espectros se registraron en un difractómetro X'PERT PRO con radiación de Cu-Ka (A = 1,5418) en el intervalo 204- 60°.
Los espectros a diversas temperaturas se han registrado con los mismos instrumentos. La termodifractometría in situ se llevó a cabo en una cámara de alta temperatura Anton Para HTK1200N. Los espectros de polvo se registraron a las temperaturas de 25, 50, 75, 100, 125 y 150 °C con una rampa de calentamiento de 5 °C/min. De manera similar, los espectros se registraron a 125, 100, 75, 50, 25 °C mientras se enfriaba.
7) Radiografía
Los datos se recogieron a 100K utilizando un difractómetro Oxford Diffraction Xcalibur 3 equipado con radiación de Cu-Ka y un detector CCD. Los datos se recopilaron utilizando el programa CrysAlis CCD mientras que la reducción de datos se llevó a cabo con el programa CrysAlis CCD. La corrección de la absorción se aplicó con el programa ABSPACK. La estructura se resolvió por procedimientos directos utilizando el programa SIR97 y se refinó a través de las F2 con las técnicas de mínimos cuadrados de matriz completa con el programa SHELXL. Todos los átomos, excepto los de hidrógeno, se refinaron de forma anisotrópica. Los átomos de hidrógeno enlazados a los átomos de carbono y los grupos hidroxilo se colocaron en posiciones calculadas y con un factor isotrópico de 20 % o 50 % mayor que el de los átomos a los que están enlazados.
8) TGA y DTA
El análisis termogravimétrico (TGA) y el análisis térmico diferencial acoplado (DTA) se realizaron en un analizador termogravimétrico Seiko EXSTAR 6200 (TGA / DTA) bajo un flujo de nitrógeno (50 mL/min) con una rampa de calentamiento de 5 °C min'1.
9) Determinación de IR
Equipo utilizado
Perkin Elmer IR mod. BX2
Modos de operación
En un mortero de ágata se muele a fondo una mezcla formada por 1 a 2 mg de producto y 100 a 150 mg de KBr de grado infrarrojo previamente secado a 105 °C durante la noche. La mezcla se transfiere a un soporte apropiado y se mantiene al vacío y bajo una presión de 100 kg/m2 (10 toneladas/pie2) durante al menos 30 minutos.
El espectro se registra en el intervalo 4000 600cm-1
10) HPLC
Los análisis de HPLC se llevan a cabo para comparación con un patrón pesado con el siguiente equipo:
Línea de HPLC con detector de índice de refracción de celda termostatizada, bomba isocrática y automuestreador. Columna de acero inoxidable de 300 mm de longitud rellena con fase estacionaria transgenómica IC-SEP ICE-ION-300 (Stepbio cod. ICE-99-9850) equipada con un cartucho de protección similar (código ICE-99-2364).
Temperatura de la columna: 45 °C.
Inyecciones: 20|jl.
Flujo: 0,4 ml/minuto.
Integrador: estación de trabajo Perkin Elmer Totalchrom
La sección experimental muestra ejemplos donde se obtuvo la fucosil-lactosa de partida como se describe en la patente WO2010/070616 para lo cual a continuación se detalla el esquema de la síntesis y el último paso:
Ri = grupos bencilo sustituidos con grupos cloro, bromo, alcoxi o nitro
R2 = un grupo seleccionado de acilo, alquilo o arilo, bencilo, P, tritilo, derivado de sililo; preferiblemente R3 es acilo, y más preferiblemente acetilo o benzoílo, opcionalmente mono o di, sustituido con cloro, bromo, alcoxi o grupos nitro.
Se cargaron en un reactor 65,00 g de O-[2,3,4-Tri-O-(4-clorobencil)-6-desoxi- a-L-galactopiranosil]-(1 ^ 2)-O- p-D-galactopiranosil-(1^- 4)-D-glucosa, 20 g de acetato de sodio, 9,3 g de Pd/C al 5 % sin reducir y 880 g de metanol. La solución, mantenida con agitación, después de 3 ciclos de vacío/nitrógeno, tenía hidrógeno soplado en la misma hasta 1,5 bar. La mezcla se calentó a 60 °C en 3 horas y se mantuvo la temperatura a 1,8 bares durante 16 horas. El control de TLC (tolueno, metanol, AcOH 10:10:1) muestra que se completa la reacción.
A continuación, la suspensión se filtró sobre dicalite, se concentró hasta formar un jarabe y se reconstituyó con 150 ml de agua desmineralizada. La solución acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 ml), se concentró a 20-25° Brix y se desionizó en un par de resinas de intercambio iónico (IR 120(H+) y FPA 55).
En el producto obtenido después de la desionización existe una impureza, metilglicósido de 2'-fucosil-lactosa, en un porcentaje variable hasta el 5 %.
La solución de 2'-O-fucosil-lactosa así obtenida puede llevarse a una cierta concentración sacarométrica para cristalizarla o secarla al vacío (80 mbares) y calentarla (50 °C) para producir un sólido amorfo.
Polimorfo A
Ejemplo 1
Se llevan 24 kg de 2'FL a una concentración de 64° Brix y se calientan a 55-60 °C. Durante un período de 70 minutos, se agregaron 112 l de etanol al 96 %, manteniendo la temperatura a 45 ± 10 °C. La mezcla, a mitad de la adición, se autoceba a 37 °C. La suspensión se dejó en agitación durante 4 horas a 55 °C y luego se llevó a temperatura ambiente en 13 horas. Después de aproximadamente 72 horas con agitación a temperatura ambiente, se enfrió a 10 °C en 3 horas. El sólido se filtró, se lavó con 1 volumen de agua/etanol = 9/1 y se secó al vacío a 60 °C durante 10 horas y luego una noche en vacío estático sin calentar.
El sólido obtenido (20,7 kg seco) presenta:
KF = 5,0 %;
LOD = 1,98 % (procedimiento 1)
PF = 177-186
1HRMN (D2O) en disolución (300 MHz; nt = 1): anómero a/anómero p = 10/90;
Espectro de difracción de polvo = muestra la fase del polimorfo A (2'FL1,5H2O) (véase la figura 1) Ejemplo 2
50 kg medidos de 2'FL se llevaron a una concentración de 63° Brix. La temperatura interna se aumentó y se mantuvo a 55 °C durante la adición de 222 l de etanol al 96 % (35 minutos). La mezcla se sembró con 200 g de Polimorfo A y se mantuvo, después de que ocurriera la cristalización, durante 6 horas a 56 °C, luego se redujo a 25 °C en 4 horas. La suspensión, después de 18 horas a 23 °C, se enfrió a 11 °C en 3 horas y luego se filtró. El sólido se lavó con 1,5 volúmenes de mezcla de etanol/agua = 9/1.
Después de secar al vacío a 60 °C, se obtuvieron 49,5 kg de sólido seco.
KF = 4,54%
LOD = 0,73 % (procedimiento 2); 1,86 % (procedimiento 1)
PF = 175-184 °C
1HRMN(D2O) en disolución (300 MHz; nt = 1): anómero a/anómero p = 13 /87
IR = 3337, 9; 2978, 44; 2938, 35; 1655, 55; 1388, 36; 1342, 33; 1237, 40; 1171, 19; 1132, 16; 1072, 8; 1023, 6; 877, 47; 818, 37; 760, 29; 722, 38; 686, 30; 644, 30. (véase la figura 2)
DSC = Efecto endotérmico ampliado inicial, que varía entre 45 y 85 °C, índice de fenómenos de desolvatación, seguido de un pico endotérmico intenso (Tinicio = 178,10 °C; Tpico = 184,68) atribuible a la fusión de la muestra, seguido, a temperaturas más altas por una banda endotérmica intensa con un pico a 247,8 °C debido a fenómenos de descomposición térmica. (véase la figura 3)
Espectro de XRPD en polvo = muestra la fase del polimorfo A (2'FL.3/2H2O). véase la figura 4 XRD Refinamiento de monocristal:
Tabla 5. Datos cristalo ráficos detalles del refinamiento de la estructura
continuación
La unidad asimétrica del cristal de la muestra contiene una molécula de 2'-O-fucosil-lactosa y dos sitios que contienen moléculas de agua. El sitio correspondiente al átomo de oxígeno O26 está totalmente ocupado, mientras que en el caso del sitio del átomo de oxígeno O27 tenemos una ocupación calculada del 50 %. A partir de esto, vemos claramente que la composición química del cristal es tal que por cada molécula de polisacárido hay 1,5 moléculas de agua o 2'-O-fucosil-lactosa.3/2H2O (véase la figura 5). Esta relación entre moléculas de agua y 2'-O-fucosil-lactosa se confirma mediante termogravimetría (TGA).
Tabla 6 Coordenadas atómicas
= TGA muestra una pérdida de agua del 5,45 %, consistente con un tipo hidratado 1,5 veces. Véase la figura 6
Ejemplo 3
1371,6 g medidos de 2'FL se concentraron a 58° Brix y se calentaron a 55 °C. Se añadieron 5,5 litros de etanol absoluto, calentado a 56 °C, en el transcurso de 1 hora. La solución, ya opalescente, se sembró y se dejó caliente, siempre en agitación, durante varios minutos, y luego se añadió 1 litro de etanol absoluto calentado a 50 °C. La suspensión se dejó a 57 °C durante 1 hora y 30 minutos, y luego se inició una rampa de enfriamiento que llevó la temperatura a 26 °C en 3 horas. La mezcla se dejó durante la noche con agitación a temperatura ambiente, luego se filtró y se lavó con 1 volumen de mezcla de etanol/agua = 9/1. El sólido se secó al vacío (80 mbares) a 50 °C durante 21 horas.
Se obtuvieron 1412 gramos con un título del 92,6 %.
KF = 4,37 %
1HRMN(D2O) en disolución (300 MHz, nt = 12): anómero a/anómero p = 12/88
LOD = 1,13 % (procedimiento 1)
Ejemplo 4
210 g medidos de 2'-O-fucosil-lactosa se concentraron al vacío y en caliente, a 70° Brix. El jarabe se calentó a 60 °C y, con agitación, se añadieron 250 ml de etanol al 96 %. La suspensión se sembró, de nuevo con Polimorfo A, y después de 10 minutos con agitación y caliente, se añadieron 50 ml más de etanol al 96 %. La mezcla se mantuvo en agitación durante 2 horas y 30 minutos a 60 °C, y luego se dejó volver lenta y espontáneamente a t.a. Después de unos días (5) con agitación a temperatura ambiente, se enfrió a 10 °C y se mantuvo a esta temperatura durante 1 hora. El sólido enfriado se filtró, se lavó con 1 volumen de etanol/agua = 9/1 y 0,5 volúmenes de etanol al 96 %, ambos fríos. Se obtuvieron 206,8 gramos de sólido después de secar a 55 °C al vacío (80 mbares).
KF = 4,54 %
KF después de 6 meses = 6,00 %
LOD = 2,17 % después de 6 meses (procedimiento 2)
PF = 174-176
1HRMN (DMSO) en disolución (300 MHz; nt = 1): anómero a/anómero p =14/86 Espectro de polvo después de 6 meses: véase la figura 7
HPLC = pureza 98,4 %
Ejemplo 5
8 kg medidos de 2'-O-fucosil-lactosa se concentraron a 71° Brix. En el transcurso de 40 minutos, manteniendo la temperatura entre 50-58 °C, se añadieron 17 litros de etanol al 96 %. La solución se sembró y se dejó enfriar a temperatura ambiente en el transcurso de 18 a 20 horas. La mezcla se enfrió a 15 °C en 4 horas y el sólido se filtró, se lavó con 1 volumen de mezcla de etanol/agua = 9/1 y se secó al vacío (80 mbares) a 60 °C. Se obtuvieron 7,4 kg de sólido seco.
KF = 4, 4
LOD = 1,1 % (procedimiento 1)
PF = 175-181 °C
1HRMN (D2O) en disolución (300 MHz, nt = 4): anómero a/anómero p = 11 /89
1HRMN (D2O) en equilibrio después de una noche a temperatura ambiente (300 MHz; nt = 1): anómero a/anómero p = 39 /61
Ejemplo 6
Se disolvieron en caliente 10 g de 2'-O-fucosil-lactosa a 60° Brix. La solución, que pesaba 16,5 g, se mantuvo a 55 °C durante la adición de 32,5 ml de propanol calentado a 60 °C. Se observó opalescencia a mitad de la adición. Con la adición completa, la suspensión se dejó durante 1 hora a 55-60 °C y luego, de nuevo bajo fuerte agitación, se dejó volver espontáneamente a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 12 horas a temperatura ambiente, la suspensión se enfrió a 15 °C durante 1 hora. El sólido se filtró, se lavó con 1 volumen de propanol/agua = 9/1 y se secó al vacío (80 mbares) a 55 °C durante la noche y se almacenó en un desecador con gel de sílice durante 18 horas. Se obtuvieron 8,95 g de sólido seco que presenta:
KF = 5,11 %
LOD = 1,30 % (procedimiento 2); 2,14 % (procedimiento 1)
PF = 175-186
1HRMN (DMSO) en disolución (200 MHz, nt = 24): anómero a/anómero p = 8/92
Espectro de XRPD en polvo = muestra la fase del polimorfo A (2'FL1,5 H2O) véase la figura 8
IR = 3340, 1,62; 2977, 29; 2940, 22; 1656, 40; 1343, 19; 1237, 27; 1171, 8; 1132, 7; 1072, 1; 1023, 1; 875, 36; 819, 25; 762, 19; 722, 38; 688, 18; 646, 19. Véase la figura 9
HPLC = pureza 99,5 %
Ejemplo 7
50 g de 2'FL se llevaron a un jarabe de 72,5° Brix. A 30 °C se diluyó con 70 mL de metanol calentado a 35 °C y se cebó. Se dejó que la mezcla volviera a temperatura ambiente con agitación. La suspensión se calentó de nuevo a 40 °C y se añadieron 70 ml de metanol calentado a 45 °C. Se dejó que la suspensión volviera a la temperatura ambiente y se mantuvo en agitación durante algunos días.
El sólido se filtró, se lavó con 50 ml de metanol frío y se secó a presión y temperatura ambiente. Se obtuvieron 42 g de producto seco
KF = 5,16%
LOD = 2,22 % (procedimiento 1); 1,30 (procedimiento 2)
PF = 176-186
1HRMN (DMSO) en disolución (200 MHz; nt = 12): anómero a/anómero p = 8/92
1HRMN (DMSO) en equilibrio después de una noche a temperatura ambiente (200 MHz, nt = 12): anómero a/anómero p = 24 /76
1HRMN (D2O) en disolución (200 MHz, nt = 20): anómero a/anómero p = 12/88; Espectro de polvo = muestra la fase del polimorfo (2'FL-3/2H2O). Véase la figura 10
IR = 3334, 1; 2976, 27; 2939, 17; 1657, 42; 1386, 20; 1344, 14; 1237, 25; 1172, 4; 1132, 3; 1072, 1; 1025, 1; 875, 36; 819, 21; 762, 14; 724, 22; 689, 13; 646, 14. Véase la figura 11
Ejemplo 8
Se disolvieron 10 g de 2'FL de Polimorfo A en agua (5,6 g), mientras estaba caliente, 64° Brix. La solución se mantuvo a 60 °C durante la adición de acetona calentada a 50 °C. La adición se completó en treinta minutos. Después de otros 30 minutos con agitación mientras estaba caliente, se dejó que la mezcla volviera espontáneamente a temperatura ambiente. Después de 10 horas con agitación a temperatura ambiente, la suspensión se enfrió a 10 °C en 1 hora, se filtró y se lavó con 10 ml de acetona fría. El sólido se secó en una estufa a vacío (80 mbares) a 50 °C y se almacenó en un desecador durante 20 horas. Se obtuvieron 9,29 gramos de producto seco.
KF = 4,7 %
LOD = 1,39 (procedimiento 2), 2,21 (procedimiento 1)
1HRMN (D2O) en disolución (300 MHz, nt = 20) anómero a/anómero p = 13/87
PF = 175-179
IR = 3340, 10; 2978, 42; 2940, 34; 2875, 35; 1655, 53; 1343, 32; 1237, 40; 72, 19; 1132, 17; 1072, 8; 1023, 6; 875, 46; 818, 36; 761, 30; 687, 30; 645, 30. Véase la figura 12
Espectro de polvo: muestra la fase del polimorfo A (2'FL.3/2H2O). Figura 13
Ejemplo 9
Se disolvieron en agua 5 g de 2'FL, secados a partir de jarabe, hasta su solubilización. Se utilizaron en total 5,3 g de agua. Con agitación, a 60 °C, se agregaron 20 ml de ácido acético glacial. Con la adición completa se notó una ligera opalescencia. La suspensión se mantuvo 1 hora más a 60 °C y luego se detuvo el calentamiento y se dejó en agitación durante la noche. Después de aproximadamente 10 horas a temperatura ambiente, se filtró el sólido, se lavó con 1
volumen de ácido acético al 80 % y se secó al vacío (80 mbares) a 55 °C durante 16 horas y en un desecador durante 6 horas. Se obtuvieron 2,87 g de sólido seco, que presentaba:
KF = 4,37 %
LOD = 0,74 % (procedimiento 2)
PF = 175-183 °C
1HNMP (D2O) en disolución (200 MHz, nt = 120): anómero a/anómero p = 12/88 Espectro de polvo: véase la figura 14
Ejemplo 10
Se disolvieron en agua 10 g de 2'FL, secados a partir de jarabe, hasta su solubilización. La solución se llevó a 64° Brix y se añadieron gota a gota 60 mL de acetonitrilo a 50 °C, mientras estaba caliente (60 °C) y con agitación enérgica. La opalescencia ya se notó a mitad de la adición. La suspensión se mantuvo 30 minutos en agitación a 60 °C y luego se apagó el calentamiento y se dejó volver, lenta y espontáneamente, a temperatura ambiente. Después de 10 horas a temperatura ambiente, la mezcla se enfrió lentamente a 10 °C. El sólido se filtró, se lavó con 1 volumen de acetonitrilo, se enfrió a 10 °C y se secó al vacío (80 mbares) a 55 °C durante 4 horas (9,3 g).
KF = 4,67 %
LOD = 2,51 (procedimiento 1); 0,93 (procedimiento 2)
PF = 176-179
1HRMN (D2O) en disolución (300 MHz, nt = 20): anómero a/anómero p = 12/88
1HRMN (D2O) en equilibrio después de una noche a temperatura ambiente (200 MHz, nt = 16): anómero a/anómero p = 40 /60 Espectro de polvo: véase la figura 15
Ejemplo 11
Se disolvieron 20 g de 2'FL, secados a partir de jarabe, a 64° Brix, se calentaron a 55 °C y se añadieron 75 ml de una mezcla de metanol/etanol = 3/2 calentada a 50 °C. Al final de la adición gota a gota, la solución se llevó a 62 °C; ya tenía suspensión. Después de 1 hora a 62 °C, la temperatura se redujo a 56 °C, se mantuvo durante 3 horas y luego se dejó volver espontáneamente a la temperatura ambiente. Después de 12-15 horas con agitación a temperatura ambiente, el sólido se enfrió a 3 °C, se filtró, se lavó con 1 volumen de una mezcla de metanol/etanol/agua = 3/4/1 y se secó al vacío (80 mbares). a 55 °C durante 2 horas.
KF = 4. 46 %
LOD = 1,89 %
1HRMN (D2O) en disolución (300 MHz, nt = 20): anómero a/anómero p = 6/94. Véase la figura 16
1HRMN (D2O) en equilibrio después de una noche a temperatura ambiente. (300 MHz, nt = 20): anómero a/anómero p = 42/58
Ejemplo 12
20 g de 2'FL del Ej. 3 se disolvieron en agua y se concentraron a 56° Brix. La solución se calentó a 60 °C y se añadieron con agitación 75 ml de etanol absoluto calentado a 57 °C. La mezcla se mantuvo 1 hora a 66-64 °C, 14 horas a 60 °C y luego se enfrió a 5-8 °C en 3-4 horas. El sólido se filtró, se lavó con una mezcla de agua/etanol y se secó tanto a temperatura y presión ambientales (15 horas), como también al vacío (80 mbares) a 55 °C durante 4 horas para obtener 16,33 g de sólido.
KF = 4,61 %
LOD = 1,24 % (procedimiento 1)
1HRMN (D2O) en disolución (200 MHz, nt = 28): anómero a/anómero p = 9 /91
Ejemplo 13
Se colocaron 6,59 g de 2'FL Polimorfo B en una placa de Petri colocada en un desecador con gel de sílice anhidro durante 46 horas. El sólido se retiró del secador y se analizó.
KF = 4, 37 %
LOD = 2,41 % (procedimiento 1)
Espectro de polvo = muestra la fase del polimorfo A (2'FL.3/2H2O). Véase la figura 17
Ejemplo 14
Se sometieron 50 mg de polimorfo B a termodifractometría de polvo. El polvo se calentó, con una rampa de calentamiento de 5 °C/min, hasta 150 °C y luego se enfrió gradualmente, con el mismo modo que para calentar, a 25 °C. Una vez a temperatura ambiente se obtiene el Polimorfo A.
Espectro de polvo = del Polimorfo B por calentamiento y posterior enfriamiento se obtiene el Polimorfo A pasando por una nueva fase cristalina. El espectro del polimorfo A, registrado inmediatamente después de enfriar, todavía contiene un pequeño porcentaje del polimorfo anhidro. Véase la figura 18
POLIMORFO B
Ejemplo 15
Se concentraron 22,9 kg de 2'FL a 79° Brix. A 38 °C el jarabe se auto sembró. Se agregaron 600 400 ml de agua a la suspensión y se dejó en agitación a 38-48 °C durante 1 hora, luego se dejó que alcanzara la temperatura ambiente durante la noche. La suspensión se mantuvo en agitación a 23-28 °C durante un día, luego se enfrió a 15 ± 2 °C en 6 horas y se filtró. El sólido se lavó con 0,05 V de agua fría y se secó en una estufa al vacío, primero a 30 °C, luego a 35 °C durante 15 horas.
Se obtuvieron 18,4 kg de sólido seco.
KF = 8,31 %
LOD = 6,6 % (procedimiento 1)
PF = 176-181
1HRMN (DMSO) en disolución (300 MHz; nt = 20): anómero a/anómero p = 4/96
1HRMN (DMSO) en equilibrio después de una noche a temperatura ambiente (300 MHz, nt = 12): anómero a/anómero p = 8 /82
1HRMN (DMSO) en equilibrio después de 5 días (300 MHz, nt = 12): anómero a/anómero p = 48 /52
IR = 3342, 3; 2975, 28; 2939, 21; 2894, 23; 1657, 37; 1445, 27; 1370, 24; 1347, 20; 1318, 20; 1278, 31; 1238, 28; 1172, 10; 1132, 9; 1072, 3; 1023, 2; 932, 38; 895, 37; 874, 33; 819, 24; 762, 20; 690, 17; 647, 18. (véase la figura 19)
Espectro de XRPD en polvo = muestra la fase del polimorfo B (2'FL.5/2H2O). Véase la figura 20
Ejemplo 16
Se concentraron 24,8 g de 2'FL a 77° Brix y se sembraron con 200 mg de Polimorfo B a 37 °C. La suspensión se dejó a 40 ± 4 °C durante 4 horas y luego, siempre bajo agitación, se dejó volver espontáneamente a temperatura ambiente. La suspensión se mantuvo aproximadamente 24 horas a 23 °C, luego se enfrió y se filtró a 18 °C. El sólido se lavó con agua a 4 °C (400 mg x 3) y se secó al vacío (80 mbares) mientras estaba caliente (35-40 °C) durante 11 horas más una noche en vacío estático sin calentar.
Se obtuvieron 17,7 g de sólido.
KF = 7,99 %
LOD = 5,18 % (procedimiento 1) 18,4 % (procedimiento 2)
PF = 178-184
1HRMN (D2O) en disolución (300 MHz, nt = 4): anómero a/anómero p = 8/92
Ejemplo 17
Se disolvieron 67 kg de polimorfo A de fucosil-lactosa en agua y se concentraron a 74° Brix. La solución se llevó a 40 °C, se sembró con Polimorfo B y se dejó 2 horas en agitación mientras estaba caliente. Se apagó el calentamiento y se dejó que la suspensión volviera lentamente a 21 °C. El sólido se mantuvo en agitación a 20-22 °C durante 24 horas y luego se enfrió a 15 °C. La suspensión se mantuvo durante 6 horas a 15 °C y se enfrió a 10 °C. Después de 3 horas
a 10 °C, el sólido se centrifugó y se lavó con 0,10 volúmenes de agua a 5 °C. El sólido se secó al vacío (80 mbares) a 35 °C durante 10 horas y al vacío estático sin calentar durante 10 horas.
KF = 8,88
LOD = 6,4 (procedimiento 1); 5,36 (procedimiento 2)
1HRMN (DMSO) en disolución (200 MHz; nt = 4): anómero a/anómero p = 6 /94
IR = 3344, 31; 2939, 50; 1656, 62; 1348, 53; 1239, 58; 1173, 45; 133, 44; 1072, 34; 1023, 31; 874, 57; 819, 53; 762, 51; 688, 48. (véase la figura 21)
DSC: Efecto endotérmico ampliado inicial (55-100 °C) atribuible a fenómenos de deshidratación, seguido de un pico endotérmico intenso (Tinicio = 173,92 °C; Tpico = 181,73 °C) atribuible a la fusión de la muestra. A temperaturas más altas le sigue una banda endotérmica intensa con un pico a 241,8 °C, debido a fenómenos de descomposición. (véase la figura 22)
TGA = muestra una pérdida de agua del 7,90 % compatible con el tipo hidratado 2,5 veces (2'FL.5/2H2O). Véase la figura 23
Espectro XRPD en polvo: muestra la fase del polimorfo B (2'FL5 / 2H2O) y del polimorfo A (menos del 5 %).
El grupo espacial en el que cristaliza es P2-|2-|21. La celda es ortorrómbica con un volumen de 2349,4 A3
a (A) = 14,905(7)
b (A) = 12,663(6)
c (A) = 12,447(5)
a (°) = 90
p (°) = 90
Y (°) = 90
Véase la figura 24
Ejemplo 18
Se concentraron 88 g de 2'FL a 70° Brix. El jarabe calentado a 40 °C cristaliza espontáneamente. Después de 1 hora con agitación a 40 °C, se enfrió a 30 °C, se mantuvo durante 2 horas y luego se dejó volver espontáneamente a temperatura ambiente. Después de 10 horas a temperatura ambiente, la suspensión se enfrió en 3 horas a 5 °C. Después de mantenerse fresco durante 2 horas y media el sólido se filtró, se lavó con 0,1 volúmenes de agua helada y se secó al vacío (80 mbares) a 35 °C durante 6 horas para obtener 51 g de producto.
KF = 8,10%
LOD = 6,14 % (procedimiento 1)
PF = 179-181
1HRMN (D2O) en disolución (300 MHz, nt = 4): anómero a/anómero p = 7/93. Véase la figura 25
1HRMN (D2O) en equilibrio después de una noche a temperatura ambiente (300 MHz, nt = 4): anómero a/anómero p = 41/59
HPLC = pureza 98,4 %
Claims (16)
1. Hidrato de 2'-O-fucosil-lactosa (2'FL) con fórmula molecular
C18H32O15*nH2O
en la cual n es un número en el intervalo entre 1 y 3;
en forma cristalina del polimorfo A, n es 3/2, en el que dicho polimorfo A es 2'FL-3/2 H2O, que tiene picos característicos de XRPD a 9,89±0,20, 17,05±0,20, 18,86±0,2020; o
en forma cristalina del polimorfo B, n es 5/2, en el que dicho polimorfo B es 2'FL-5/2H2O, que tiene picos característicos de XRPD a 9,96±0,20, 11,90±0,20, 20,48±0,2020;
en el que las mediciones se realizan usando radiación de Cu-K-alfa (lambda = 1,5418) en el intervalo de 20 4 a 60°.
2. El polimorfo cristalino A según la reivindicación 1, que tiene picos característicos de XRPD a 18,86±0,20, 9,89±0,20, 17,05±0,20, 21,65±0,2, 14,20±02020.
3. El polimorfo cristalino A según la reivindicación 2 que tiene picos de XRPD característicos como se describe en la tabla 2
T l 2: Li i XRPD r l lim rf A
4. El polimorfo cristalino A según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el monocristal tiene un grupo espacial P2-|2-|21 que está dispuesto dentro de un sistema cristalino ortorrómbico y la celda elemental tiene los siguientes parámetros: a = 12,4098(8) Angstrom, b = 12,737(2) Angstrom, c = 13,756(2) Angstrom y un volumen de 2212,5 Angstrom3.
5. Polimorfo cristalino A según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que tiene conformación beta-anomérica.
6. Un procedimiento para obtener el polimorfo cristalino A, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y dicho procedimiento comprende la cristalización de 2'FL a partir de una mezcla que comprende agua y al menos un disolvente, en el que dicho disolvente puede seleccionarse entre alcoholes, cetonas, nitrilos, ácidos orgánicos, ésteres; el que el 2'FL se prepara como una solución acuosa a una concentración en peso entre 53 y 75 por ciento a una temperatura entre 35 y 70 °C y luego se carga con el disolvente caliente o a temperatura de ebullición.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el disolvente se selecciona de alcohol de C1-C3.
8. Un procedimiento según la reivindicación 6 o 7, en el que la cantidad de agua con respecto al disolvente puede oscilar entre el 40 y el 10 % (v/v).
9. El polimorfo cristalino B según la reivindicación 1, que tiene picos característicos de XRPD a 9,96±0,20, 20,48±0,20, 11,90±0,20, 19,84±0,2, 22,20±0,2020.
10. El polimorfo cristalino B de acuerdo con la reivindicación 9 que tiene picos de XRPD característicos como se divulga en la tabla 3
11. El polimorfo cristalino B según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 9-10, en el que el monocristal tiene un grupo espacial P2-|2-|21 que está dispuesto dentro de un sistema cristalino ortorrómbico y la celda elemental tiene los siguientes parámetros: a = 14,905(7) Angstrom, b = 12,663(6) Angstrom, c = 12,447(5) Angstrom y un volumen de 2349,4 Angstrom3.
12. El polimorfo B cristalino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 9-11, que tiene conformación betaanomérica.
13. Un procedimiento para obtener el polimorfo B cristalino, según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 9-12, y dicho procedimiento comprende la cristalización de 2'FL a partir de una solución acuosa, en el que el procedimiento incluye preparar una solución acuosa caliente de 2'FL a una concentración de 50-80 % en peso, mantener la solución caliente a 30 a 60 °C durante 1-12 horas y opcionalmente sembrar con polimorfo B.
14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el porcentaje en peso de 2'FL en solución acuosa está en el intervalo entre 50 y 80 %.
15. Hidrato de 2'-O-fucosil-lactosa (2'FL) según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 10-12 para su uso como medicamento o como suplemento nutricional o como ingrediente cosmético.
16. Una composición farmacéutica o nutricional o cosmética que comprende 2'FL hidrato según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 10-12.
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