ES2831408T3 - Una composición farmacéutica que comprende un derivado sulfatado de 3,5-diyodo-O-[3-yodofenil]-L-tirosina - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende 3,5-diyodo-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina (T3S) como principio activo, en forma micronizada y en una cantidad de 1 a 1000 μg, que comprende además: a) un diluyente seleccionado de entre celulosa y derivados de la misma, junto con un segundo diluyente, hasta el 35% de diluyente total (p/p); b) un disgregante que consiste en sal sódica de croscarmelosa, presente en una cantidad que varía del 0,5 al 10% (p/p); c) un deslizante que consiste en dibehenato de glicerol, presente en una cantidad que varía del 1 al 10% (p/p); d) un lubricante que consiste en estearato de magnesio y sílice coloidal hidratada, presente en un intervalo de cantidad total comprendido entre el 0,1 y el 7% (p/p).

Description

DESCRIPCIÓN
Una composición farmacéutica que comprende un derivado sulfatado de 3,5-diyodo-O-[3-yodofenil]-L-tirosina
Campo de la invención
El campo de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende 3,5-diyodo-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina como principio activo.
Antecedentes de la invención
La hormona tiroidea triyodotironina (3,5-diyodo-O-[3-yodofenil]-L-tirosina o T3) es la hormona tiroidea metabólicamente más activa. Al igual que la tiroxina (T4), se produce fisiológicamente por la tiroides y se almacena junto a la misma, en forma de tiroglobulina, un precursor de glicoproteína. En promedio, una molécula de tiroglobulina contiene tres o cuatro residuos de T4 y, como máximo, un residuo de T3. La producción de TSH activa la proteólisis de tiroglobulina a través de las enzimas catepsina D, B y L con la liberación de hormonas tiroideas T3 y T4. Sin embargo, la generación de T3 no está limitada a este mecanismo: de hecho, en los tejidos periféricos, la tiroxina se transforma en triyodotironina (el 80% de la triyodotironina se produce periféricamente por tiroxina y el 20% se produce dentro de la glándula tiroides).
La importancia de la T3 no es solo la que se debe al hecho de ser la hormona tiroidea más activa. En realidad, a este respecto, se conocen diversas condiciones patológicas que están provocadas por su deficiencia. En particular, por ejemplo, en el tejido nervioso durante el desarrollo embrionario y la infancia, la deficiencia de T3 da lugar a una reducción en el crecimiento de la corteza cerebral y cerebelosa, la proliferación de axones, la migración celular, la mielinización, la ramificación dendrítica y la génesis de sinapsis. Como consecuencia de la deficiencia de T3 en las etapas iniciales de la vida, se observa un retraso en el desarrollo del sistema nervioso seguido de un déficit cognitivo y motor, que puede ocasionar un cuadro clínico denominado cretinismo. También en adultos se ha demostrado mediante PET cerebral que, cuando se reducen los niveles de triyodotironina, el flujo sanguíneo en el interior del cerebro y el metabolismo cerebral de la glucosa son más reducidos. Estos datos pueden explicar el déficit psicomotor en los individuos hipotiroideos.
Además de los efectos observados en el tejido nervioso, también se conocen los del tejido óseo, en el que la osificación endocondral está estimulada por la triyodotironina, que alarga así linealmente el hueso mediante la maduración de los centros óseos de la epífisis. Incluso aunque no fuera necesaria después del nacimiento para el crecimiento lineal óseo, la triyodotironina es esencial para el desarrollo adecuado de los huesos del feto.
Además, se han comprobado efectos de la T3 en los tejidos de la epidermis, en los que la triyodotironina no solo participa en su maduración y de anexos cutáneos, sino también en la degradación de los mismos favoreciendo así la regeneración celular. Por lo tanto, tanto el exceso como la deficiencia de esta hormona pueden provocar problemas dermatológicos.
Por tanto, la hormona tiroidea T3 puede considerarse definitivamente como una hormona pleiotrópica, con efectos bien documentados, además de los antes mencionados, en el tejido sanguíneo, en el que aumenta la producción de eritropoyetina y, en consecuencia, la hematopoyesis; en los tejidos grasos, en los que favorece la maduración de preadipocitos a adipocitos, aumenta la lipólisis de los ácidos grasos y finalmente también regula el metabolismo del colesterol.
El hipotiroidismo, muy frecuentemente generado por patologías autoinmunitarias, es bastante común: de hecho, la prevalencia en italianos es de aproximadamente el 1,5% entre las mujeres y el 1% entre los varones. Se trata farmacológicamente de forma satisfactoria por medio de tratamientos sustitutivos, principalmente basados en levotiroxina (T4) sintética, fármaco de elección por la muy corta semivida de la forma más activa, es decir, T3, que por este motivo no puede utilizarse de forma rutinaria.
Sin embargo, también el tratamiento con levo-tiroxina muestra algunas desventajas relacionadas con el hecho de que aunque se restaure el eutiroidismo plasmático, no siempre lo hace el tisular. El estudio de alternativas farmacológicas, como las que se proponen en base a la actividad tiromimética T3 descrita en el documento EP 1560575 B, podría representar una alternativa deseable a los tratamientos actuales de elección.
Sin embargo, en lo que respecta a T3S, el principal obstáculo parece estar representado por las dificultades encontradas para una síntesis a gran escala. De hecho, hasta la fecha ha sido posible producir T3S solo a escala de laboratorio.
A este respecto, la preparación de T3S a partir de T3 mediante agentes sulfatantes, por ejemplo ácido sulfúrico concentrado (H2 SO4) o ácido clorosulfónico (CSA) en gran exceso se ha descrito, por ejemplo, en el documento US2970165 y en Biochim. Biophys. Acta, 33, 461 (1959), que describen la preparación de t 3s a partir de la forma T3, mediante la adición directa de ácido sulfúrico concentrado, a bajas temperaturas.
Endocrinology, Vol. 117, N° 1, 1-7 (1985) y Endocrinology, Vol. 117, N° 1, 8-12 (1985) prevén la síntesis de T3S a partir de T3 mediante la adición con enfriamiento de una solución de ácido clorosulfónico (CSA) en dimetilformamida, seguida de una etapa de purificación mediante Sephadex LH-20.
Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de los procesos de la técnica anterior puede ampliarse para la producción de gramos del producto final en forma pura, principalmente porque los procedimientos de purificación descritos necesitan volúmenes extremadamente altos.
Ventajosamente, se ha encontrado ahora que la reacción de sulfatación a partir de triyodotironina con ácido clorosulfónico (CSA) como agente sulfatante, en presencia de DMAC, ofrece altas tasas de conversión. Además, la purificación se puede llevar a cabo con volúmenes inferiores a los descritos en los procesos conocidos de la técnica anterior. Eventualmente, el producto T3S se puede purificar hasta los niveles requeridos para su uso clínico tanto en la calidad como en la cantidad necesaria (cientos de gramos), también en condiciones aplicables a escala industrial. Además, dado que hasta la fecha se han descrito solo ensayos radioactivos para detectar niveles de T3S en suero, tales como el RIA descrito por Chopra et al. (J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194), existe la necesidad de inmunoensayos más seguros basados, por ejemplo, en reactivos no radiactivos. El uso de dichos reactivos también permitiría a las estructuras clínicas y/o de investigación llevar a cabo estas medidas. Con este fin, se han desarrollado inmunoensayos no radiactivos y se describen en el presente documento.
Por último, se han publicado los documentos siguientes que divulgan composiciones farmacéuticas de hormonas tiroideas:
El documento US 2005/272816 A1 divulga el uso de T3S como medicamento y una formulación de uso oral que comprende T3S con una combinación específica de excipientes.
El documento EP 1291021 A2 divulga composiciones farmacéuticas a base de hormonas tiroideas, en particular T3 y/o T4, que permiten una administración oral segura y estable en caso de trastornos tiroideos.
El documento EP 0550108 A1 describe preparaciones farmacéuticas útiles en el tratamiento de reemplazo de hormonas tiroideas que comprenden una forma de liberación mantenida de liotironina (T3) en combinación con tiroxina (T4).
El documento US 5955105 A divulga preparaciones estables que contienen fármacos de tiroxina en combinación con una sal inorgánica, un carbohidrato y glicina.
El documento WO95/20953 A1 divulga una forma de dosificación sólida de dispersión rápida de una composición farmacéutica adecuada para administración oral que comprende al menos una hormona tiroidea y una combinación de un agente disgregante, un agente aromatizante y un agente lubricante.
El documento US 2008/003284 A1 divulga composiciones farmacéuticas estabilizadas que contienen fármacos de hormona tiroidea, preferentemente en una forma de dosificación sólida de liberación inmediata, y procedimientos para fabricarlas y utilizarlas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Panel a) Curva de calibración de T3S por ELISA competitivo; Panel b) Curva de calibración DELFIA. Se analizó T3S a 33,6, 56, 93,3, 155,5, 259, 432, 720, 1200, 2000 pg/ml.
Figura 2. Esquema de la síntesis de DTPA-T3S-monoamida.
Sumario de la invención
La presente divulgación describe un proceso para la preparación de una sal monocatiónica de 3,5-diyodo-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina de fórmula II (T3S), partiendo de 3,5-diyodo-O-(4-hidroxi-3-yodofenil)-L-tirosina de fórmula I o una sal de la misma, según el esquema:
Figure imgf000003_0001
en el que M es un metal alcalino, preferentemente
Figure imgf000003_0002
que comprende las etapas siguientes:
a) sulfatación del compuesto de fórmula I o de sus sales con ácido clorosulfónico (CSA) en presencia de dimetilacetamida (DMAC) como disolvente;
b) salificación del derivado sulfatado obtenido en a) para dar el compuesto de fórmula II (T3S) mediante la adición de la mezcla de reacción obtenida en a) a una solución acuosa de una sal inorgánica de metal alcalino, preferentemente un sodio monocatiónico, de forma incluso más preferida NaHCO3.
El compuesto de fórmula I (T3) se obtiene mediante la yodación de un compuesto de fórmula III (T2):
Figure imgf000004_0001
con un agente de yodación, preferentemente con NaI e I2 , en presencia de una amina alifática, preferentemente seleccionada entre monoalquilo lineal (C1-C4)-aminas alifáticas, entre las cuales se prefiere la etilamina.
La adición del agente de yodación se lleva a cabo en presencia de un disolvente acuoso, preferentemente agua, a una temperatura preferentemente inferior a 25 °C. Preferentemente, el agente de yodación está presente en una relación molar comprendida entre 0,9 y 1,1 mol/mol de compuesto III (T2).
Así, el proceso para la preparación de T3S comprende la preparación de T3 mediante la yodación de T2 en las condiciones descritas anteriormente y después su sulfatación con ácido clorosulfónico en dimetilacetamida, tal como se describe mejor en la descripción detallada.
La invención comprende la formulación del principio activo, T3S en composiciones farmacéuticas, preferentemente sólidas, en las que T3S, preferentemente en forma de polvo, se mezcla con un agente diluyente y después se añaden a la mezcla un agente de fluidez, un agente lubricante, preferentemente dibehenato de glicerol, y un disgregante, preferentemente croscarmelosa o derivados de la misma, se tamizan y se mezclan posteriormente con la mezcla diluyente que comprende el principio activo.
Así, según esta forma de realización, el proceso comprende una etapa en la que el diluyente, por ejemplo celulosa microcristalina, se añade en una o más fracciones, se mezcla, después se realiza la preparación de una mezcla que comprende un agente de flujo, preferentemente dibehenato de glicerol, un agente lubricante, preferentemente estearato de magnesio o zinc, sílice coloidal hidratada, dióxido de silicio coloidal y preferentemente también un agente disgregante, preferentemente croscarmelosa o derivados de la misma; después se tamiza y se mezcla posteriormente con la mezcla que comprende el principio activo junto con el diluyente. A continuación, se pueden añadir y mezclar durante un tiempo variable otros excipientes, estabilizantes y diluyentes (tales como por ejemplo carbonato cálcico).
En consecuencia, la invención divulga un comprimido preparado mediante el proceso descrito anteriormente que comprende T3S como principio activo en una cantidad comprendida entre 1 y 1000 pg y que comprende los diluyentes, excipientes, deslizantes y lubricantes siguientes: carbonato cálcico, dibehenato de glicerol, sal sódica de croscarmelosa, sílice coloidal hidratada, estearato de magnesio, celulosa microcristalina. Las cantidades preferidas para una dosis única se proporcionan en la tabla siguiente:
Figure imgf000004_0002
Una forma de realización adicional de la divulgación está representada por inmunoensayos no radiactivos.
Preferentemente, el inmunoensayo es un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), de forma más preferida un ELISA competitivo, de forma más preferida realizado en una placa de múltiples pocillos, utilizando como resto detectable un grupo fluorescente o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.) o un resto detectable derivado de avidina (es decir, biotina).
Como desarrollo adicional de los ensayos de detección no radiactivos de T3S, se han desarrollado reactivos para el inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos. Este ensayo, los reactivos sintetizados y los kits para la cuantificación de T3S basados en los nuevos reactivos se describen en el presente documento.
Descripción detallada de la invención
Una forma de realización de la presente divulgación es un proceso para la preparación de una forma sulfatada de la hormona tiroidea T3, 3,5-diyodo-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina (T3S) que tiene fórmula II como una sal monocatiónica, partiendo de 3,5-diyodo-O-[4-hidroxi-3-yodofenil]-L-tirosina de fórmula I o de un derivado salificado de la misma:
Figure imgf000005_0001
en la que M es un metal alcalino, preferentemente Na, que comprende las etapas siguientes:
a) sulfatación del compuesto de fórmula I (T3) con ácido clorosulfónico (CSA) en presencia de dimetilacetamida (DMAC) como disolvente,
b) salificación del derivado sulfatado obtenido en a) para dar el compuesto de fórmula II. La salificación se obtiene generalmente mediante la adición de la mezcla de reacción obtenida en a) a una solución acuosa de una sal inorgánica de metal alcalino, preferentemente una sal de sodio, de forma incluso más preferida Na2CO3 o NaHCO3.
Para los fines de la presente invención, por T3S se entiende el compuesto de fórmula II que comprende la forma sulfatada de tri-yodotironina o las sales monocatiónicas de la misma (compuesto de fórmula II).
La etapa a) se lleva a cabo añadiendo CSA a una suspensión de T3 en DMAC con enfriamiento, mientras se mantiene la solución con agitación vigorosa.
La temperatura se mantiene a valores inferiores a aproximadamente 10 °C, de forma más preferida comprendidos entre -10 °C y 8 °C, de forma más preferida entre -8 °C y 6 °C, de forma incluso más preferida entre -5 °C y 5 °C.
La adición de CSA a la suspensión se realiza lentamente, preferentemente en un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 60 min dependiendo de la cantidad de reactivos empleados y preferentemente en atmósfera inerte, por ejemplo en atmósfera de nitrógeno o argón.
Según una forma de realización preferida, la relación molar entre CSA y T3 es superior a 4, estando preferentemente comprendida entre 4,5 y 10, de forma incluso más preferida comprendida entre 7 y 9. De forma incluso más preferida está comprendida entre 7,5 y 8,5 moles de CSA/mol de T3. La concentración de T3 en DMAC, expresada como mol de T3/l de DMAC, está comprendida entre 0,06 y 0,15 mol/l, de forma más preferida entre 0,12 y 0,14 mol/l. Se deduce que la relación entre CSA y disolvente puede estar comprendida entre 0,35 y 1,28 mol de CSA/l de DMAC, preferentemente entre aproximadamente 0,8 y 1,15 mol/l, de forma incluso más preferida entre aproximadamente 0,96 y 1,1 mol de CSA/l de DMAC.
Después de añadir CSA, la mezcla se deja reaccionar durante un periodo de tiempo no superior a 4-5 horas, generalmente sin enfriamiento, permitiendo que la temperatura alcance la temperatura ambiente (20-25 °C).
La sulfatación generalmente se completa, en las condiciones descritas, cuando más del 85%, preferentemente más del 90%, de forma incluso más preferida más del 95% de T3 se ha convertido en T3S.
Según una forma de realización particularmente preferida, la etapa a) del proceso prevé la adición de CSA a una solución de T3 en DMAC a una concentración de 0,12-0,14 mol de T3/l de DMAC, con una relación preferida de aproximadamente 8 moles de CSA por mol de T3, a una temperatura comprendida entre aproximadamente -5 °C y aproximadamente 5 °C, en un periodo de tiempo de 30-40 min. Al final de la adición, generalmente se detiene el enfriamiento y se deja que la temperatura se eleve hasta la temperatura ambiente (comprendida entre aproximadamente 15 y 25 °C), durante no más de 4-5 horas, preferentemente no más de 2-3 horas.
La mezcla de sulfatación se añade después según la etapa de salificación b) a una solución acuosa de una sal alcalina inorgánica, preferentemente monocatiónica, en la que Na es un catión particularmente preferido, en una cantidad tal que neutralice el ácido clorosulfónico presente.
La salificación se realiza preferentemente con una solución acuosa de carbonato de sodio (Na2 CÜ3 ) o hidrogenocarbonato de sodio (NaHCÜ3), en cantidades en función de la cantidad de ácido clorosulfónico utilizada en la primera etapa, y al menos suficientes para neutralizar el pH de la solución resultante. En general, cuando se utiliza Na2CÜ3 , es suficiente una cantidad de aproximadamente 1,5 moles por mol de CSA. Según esta forma de realización, la concentración de la solución de Na2CÜ3 es de aproximadamente 0,7 mol/l de solución. En dichas condiciones, se obtiene un pH de la solución después del enfriamiento rápido comprendido entre 6,5 y 7,5.
Según esta forma de realización, la correspondiente sal monocatiónica del compuesto T3S obtenido tiene la fórmula II, en la que M es preferentemente Na.
La adición de la mezcla de reacción según la etapa b) se realiza en un periodo de tiempo variable, típicamente comprendido entre 1 h y 3 h, manteniendo mientras una temperatura inferior a 30 °C.
El compuesto T3S de fórmula II, obtenido en solución como una sal monocatiónica según la etapa b) descrita anteriormente, se purifica por cromatografía, según una etapa adicional c). La cromatografía está precedida previamente y opcionalmente por precipitación y/o filtración, por ejemplo gravimétrica o al vacío, de la mezcla de reacción obtenida en b), con el objetivo de reducir parte de las sales inorgánicas que se forman como subproductos.
La cromatografía (c) se realiza sobre una resina adsorbente, de tipo polimérico. Preferentemente, dicha resina está constituida por una matriz polimérica aromática macrorreticular. Ejemplos de resinas preferidas son XAD™ Amberlites™, de forma incluso más preferida Amberlite™ XAD™ 1600.
Como es sabido, antes de su uso, la resina se activa mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, lavados con agua, acetona o similares (para una referencia general, véase Rohm y Haas en "Laboratory Column Procedures and Testing of Amberlite and Duolite Polymeric Adsorbents", sección "Preparation of Resins"). Según el proceso de la invención, la resina se activa preferentemente con el disolvente seleccionado para la siguiente elución (es decir, acetona o una mezcla de agua/acetona).
La T3S se eluye preferentemente de la resina mediante una mezcla de elución de disolventes con un gradiente de polaridad decreciente, partiendo de la mezcla que tiene mayor polaridad. Según una forma de realización preferida, dicha mezcla de elución es al principio agua, seguida de sucesivas diluciones con un disolvente orgánico polar adecuado, en relaciones recíprocas adecuadas.
Las mezclas de elución preferidas están representadas por agua/acetonitrilo y agua/acetona en relaciones comprendidas entre 1:0 y 0,7:0,3. Preferentemente, la mezcla de elución está representada por una mezcla de agua y acetona en una relación comprendida entre 1:0 y 0,85:0,15 y la velocidad de elución a través de la columna generalmente está comprendida entre 0,9 y 1,1 volúmenes de columna/h.
Las fracciones eluidas de la columna y que contienen el producto final con un nivel de pureza superior al 95%, de forma más preferida superior al 96%, 98%, 99% (medido por procedimientos analíticos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, detección UV y analizados por análisis por HPLC) se recogen juntas y el principio activo puede aislarse evaporando el disolvente, es decir, al vacío mediante liofilización o por otros procedimientos conocidos.
No obstante, según una forma de realización preferida, las fracciones eluidas se concentran, por ejemplo, mediante evaporación parcial al vacío hasta una concentración de aproximadamente 10 g/kg de solución.
A esta concentración, el pH de la solución se ajusta a valores inferiores a 6,5, preferentemente comprendidos entre 5,5 y 6,5, mediante la adición de una solución diluida de ácido inorgánico fuerte, preferentemente un ácido seleccionado entre ácido sulfúrico y ácido clorhídrico, siendo el ácido clorhídrico particularmente preferido, y se utiliza en forma diluida a una concentración comprendida entre 0,9 y 1,1 N.
La solución se concentra adicionalmente unas 10-15 veces y la T3S se puede aislar como un sólido, por ejemplo, mediante liofilización, secado por pulverización o, preferentemente, se trata con un disolvente orgánico, preferentemente de tipo polar para aislarla en forma sólida y luego, de forma opcional, adicionalmente, se microniza.
Por tanto, según esta forma de realización preferida, el compuesto de fórmula II se aísla en forma sólida mediante tratamiento con un disolvente seleccionado del grupo que consiste en: acetona, acetonitrilo y alcoholes C1 -C4. No obstante se pueden emplear otros disolventes, los cuales se seleccionan de entre: alcanos aromáticos, éteres, disolventes clorados, ésteres, dimetilformamida, nitrometano, dimetilsulfóxido, 2-metoxietanol, o mezclas de los mismos, que permitan obtener una sal en forma sólida y aislable.
Así, en detalle, después de la cromatografía y la concentración de las fracciones que contienen T3S hasta una concentración de aproximadamente 10 g/kg de solución, el ajuste del pH a valores inferiores a 6,5, preferentemente comprendidos entre 5,5 y 6,5 y la posterior evaporación hasta una concentración del compuesto de fórmula II comprendida entre 170 y 500 g/kg de suspensión o gel, la solución concentrada se trata con un disolvente orgánico.
Preferentemente, dicho disolvente es un disolvente orgánico polar seleccionado de entre: acetona, alcoholes inferiores, tales como por ejemplo, etanol, propanol, isopropanol y similares, y acetonitrilo, siendo la acetona particularmente preferida.
La adición de acetona a la solución concentrada de T3S se produce a una temperatura comprendida entre 20 y 25 °C, preferentemente dejando la mezcla en agitación durante 1-3 horas a una temperatura comprendida entre 0 y 25 °C, para dejar que la forma sólida de la sal mono-catiónica de T3S precipite completamente.
La adición del disolvente a la suspensión se produce según proporciones conocidas: cuando se utiliza acetona, se añade en una cantidad comprendida entre 1-11 g de acetona/g de T3S, a una temperatura comprendida entre 20­ 25 2C.
El derivado monocatiónico de fórmula II, o de forma más preferida la sal sódica del mismo, se obtiene así en forma sólida después de la separación de la fase líquida de la sólida, por ejemplo mediante filtración, con una pureza HPLC superior al 95%, de forma más preferida , superior al 96%, 98% o incluso > 99%.
Así, tomado en su conjunto, el proceso según la divulgación permite obtener el aislamiento del producto final (T3S) con altos rendimientos (rendimiento global: > 60%) y con un alto nivel de pureza (HPLC > 99%).
De hecho, ventajosamente, con los procesos de la técnica anterior, ya en la mezcla de sulfatación a) en presencia de DMAC, la cantidad de subproductos es inferior al 10%, generalmente inferior al 7%.
El alto porcentaje de conversión en la reacción de sulfatación y la salificación posterior permiten obtener un producto en forma pura mediante una etapa cromatográfica de aplicación industrial y con volúmenes limitados.
El T3S se separa eficazmente de los demás subproductos y tiene una alta pureza (> 99%) incluso cuando se prepara en cientos de gramos, lo que hace posible el uso de este derivado de triyodotironina en la práctica clínica.
Con el fin de preparar formulaciones para uso clínico, la T3S, en forma sólida y con una pureza de hasta el 99%, preferentemente se microniza adicionalmente, por ejemplo, bajo presión de nitrógeno, para reducir el tamaño de partícula.
Particularmente preferido es un tamaño de partícula inferior a 25 gm (al menos el 90%, de forma más preferida al menos el 95%, de las partículas con dimensiones inferiores a 25 gm) que resulta ser estable durante al menos un mes cuando se somete a ensayos de estabilidad acelerada en una cámara climática.
Por lo tanto, según un aspecto preferido de la divulgación, el proceso comprende la micronización de la T3S sólida en forma pura, para dar partículas del tamaño definido anteriormente y el uso de las mismas para preparar formulaciones sólidas, para administración oral.
Según este aspecto, después de la micronización, la T3S se formula junto con componentes adicionales adecuados en mezclas en polvo, opcionalmente también en forma granular o microgranular, preferentemente se formula en forma de comprimidos o píldoras obtenidas mediante compresión directa de la mezcla en polvo.
La formulación de T3S en forma sólida o de forma más preferida en comprimidos, prevé añadir, al principio activo micronizado (o principios cuando se encuentra preferentemente en combinación con levo-tiroxina), en primer lugar una parte de la cantidad del diluyente final necesario, preferentemente el 30, el 40 o preferentemente al menos el 50% del diluyente, y mezclar para proporcionar la mezcla a).
El diluyente preferido es celulosa o sus derivados, por ejemplo celulosa microcristalina. Otros agentes diluyentes adecuados son caolín, almidón o sales inorgánicas alcalinas tales como carbonato de magnesio o calcio. Es particularmente preferido el carbonato cálcico, de forma más preferida en asociación con celulosa microcristalina. A continuación, la mezcla a) se mezcla con una mezcla b) que contiene otros componentes, en general: un agente deslizante, un agente lubricante y un agente disgregante, se tamiza y se mezcla posteriormente con la mezcla a) que comprende el principio activo.
Entre los agentes disgregantes, se prefiere particularmente la croscarmelosa o sus derivados. Otros agentes que pueden utilizarse para este propósito son crospovidona, polimetacrilatos, maltodextrinas, almidón glicolato de sodio, almidón pregelatinizado, alginato de sodio.
Entre los agentes deslizantes, se prefiere particularmente el dibehenato de glicerol. Otros deslizantes que pueden utilizarse son: fosfato de calcio tribásico, talco, almidón o derivados de los mismos.
Entre los agentes lubricantes particularmente preferidos se encuentran el estearato de magnesio o de zinc, la sílice coloidal hidratada y el dióxido de silicio coloidal. Pueden añadirse sucesivamente y mezclarse durante un tiempo variable otros excipientes, estabilizantes y diluyentes (tales como, por ejemplo, carbonato de calcio). Después se mide la mezcla final y los comprimidos se preparan preferentemente por compresión directa. La T3S está presente en las unidades de dosificación sólidas en cantidades comprendidas entre 1 y 1000 pg, de forma más preferida entre 2,5 y 500 pg, de forma incluso más preferida entre 5 y 250 pg, como único principio activo, o en combinación con otros principios activos, preferentemente T4 (levo-tiroxina). Según esta forma de realización, la T4 está presente en cantidades comprendidas entre 1 y 800 pg, o entre 5 y 400 pg, de forma más preferida entre 10 y 200 pg. Por consiguiente, en el proceso de preparación de comprimidos que comprenden tanto T3 como T4 como principios activos, estos se mezclan con el o los diluyentes preferidos en la mezcla a) y se mezclan adicionalmente con los otros componentes, a su vez premezclados, tal como se ha descrito anteriormente.
Por lo tanto, según un aspecto preferido, la invención divulga un comprimido preparado mediante el proceso descrito anteriormente, que comprende T3S como principio activo, en una cantidad comprendida de 1 a 1000 pg junto con los componentes adicionales siguientes:
- el diluyente, seleccionado de entre celulosa o derivados de la misma, preferentemente junto con un segundo diluyente, preferentemente carbonato de calcio, hasta un 35% de diluyente total (p/p);
- el deslizante, seleccionado de entre dibehenato de glicerol (el más preferido), talco, derivados de sílice entre los que el trisilicato de magnesio, las amidas, el fosfato de calcio tribásico están normalmente presentes en la composición en un intervalo de cantidades del 1 al 10%, de forma más preferida del 4 al 6% (p/p);
- el disgregante, seleccionado de entre almidón, croscarmelosa sódica y crospovidona. Se prefiere la sal sódica de croscarmelosa en una cantidad que varía del 0,5 al 10%, de forma incluso más preferida comprendida entre el 1 y el 5%, de la forma más preferida comprendida entre el 2 y el 4% (p/p);
- el lubricante, seleccionado de entre estearato de magnesio, sílice coloidal hidratada y talco, de forma más preferida estearato de magnesio y sílice coloidal, en un intervalo de cantidades total comprendido entre el 0,1 y el 7%, de forma incluso más preferida, el primero comprendido entre el 0,1 y el 2% y el segundo comprendido entre el 0,5 y el 5% (p/p).
Se prefieren particularmente como excipientes los ingredientes siguientes: carbonato de calcio, dibehenato de glicerol, sal sódica de croscarmelosa, sílice coloidal hidratada, estearato de magnesio, celulosa microcristalina, según las cantidades preferidas siguientes:
Figure imgf000008_0001
En una forma de realización más preferida, la composición comprende de 2,5 a 500 pg de T3 S o de forma más preferida 5-250 pg T3 S.
Para composiciones de combinación en las que también está presente T4, T3S está presente preferentemente en una cantidad de 2,5-500 pg y T4 de 1 -800 pg, o, de forma incluso más preferida: T3 S: 5-250 pg y T4 : 5-400 pg, o T3 S: 10­ 100 pg y T4 : 10-200 pg.
Se pretende que las cantidades anteriores se refieran a unidades de dosificación individuales, preferentemente comprimidos de aproximadamente 110 mg, preferentemente para la administración de una dosis única diaria, aunque el experto en la técnica puede contemplar ajustes debido a formas de composición alternativas, el peso del comprimido y/o protocolos de tratamiento terapéutico.
Los comprimidos según la forma de realización preferida muestran velocidades de disolución óptimas (véase la tabla siguiente) y una estabilidad óptima del o de los principios activos (al menos 24 meses).
Las siguientes propiedades se midieron en condiciones según las directrices ICH:
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0002
En el proceso según la divulgación, todos los reactivos, incluido T3 (compuesto de fórmula I), están disponibles comercialmente.
Sin embargo, según una forma de realización particularmente preferida, T3 se prepara mediante yodación de un compuesto de fórmula III (3,5-diyodo-tironina, Levoditi o T2):
Figure imgf000009_0001
con un agente de yodación, preferentemente NaI y I2 , en presencia de una amina alifática, preferentemente seleccionada entre las monoalquilo (C1 -C4)-aminas alifáticas lineales, entre las que se prefiere la etilamina. T2 se prepara preferentemente tal como se describe.
La adición del agente de yodación se lleva a cabo en presencia de un disolvente acuoso, preferentemente agua, a una temperatura preferentemente inferior a 25 °C.
Preferentemente, el agente de yodación está presente en una relación molar comprendida entre 0,9 y 1,1 mol/mol de compuesto III (T2).
Después de la yodación, el T3 se aísla, preferentemente por filtración, como sal de sodio, después se convierte en forma ácida por resuspensión en agua y acidificación con un ácido, preferentemente ácido acético o ácido sulfúrico. La forma ácida se aísla, preferentemente por filtración, se resuspende de nuevo en agua para eliminar las sales y se filtra.
La T3, como un sólido húmedo, se suspende en N,N-dimetilacetamida, la suspensión se anhidrifica y se somete a una reacción de sulfatación.
Según una forma de realización preferida, la relación molar entre CSA y T3 es superior a 4, estando preferentemente comprendida entre 4,5 y 10, de forma incluso más preferida comprendida entre 7 y 9. De forma incluso más preferida comprendida entre 7,5 y 8,5 moles de CSA/mol de T3. La concentración de T3 en DMAC, expresada como mol de T3/l de DMAC, está comprendida entre 0,10 y 0,15 mol/l, de forma más preferida entre 0,12 y 0,14 mol/l. De ello se deduce que la relación entre CSA y disolvente puede estar comprendida entre 0,58 y 1,28 mol de CSA/l de DMAC, preferentemente entre 0,89 y 1,15 mol/l, de forma incluso más preferida entre 0,96 y 1,09 mol de CSA/l de DMAC. Después de añadir CSA, se deja que la mezcla reaccione durante un periodo de tiempo no superior a 4-5 horas, generalmente sin enfriar, permitiendo que la temperatura se eleve a la temperatura ambiente.
La sulfatación generalmente se completa, en las condiciones descritas, cuando más del 85%, preferentemente más del 90%, de forma incluso más preferida más del 95% de T3 se ha convertido en T3S.
Según una forma de realización particularmente preferida, la etapa a) del proceso prevé la adición de CSA a una solución de T3 en DMAC a una concentración de 0,12-0,14 mol de T3/l de DMAC, con una relación preferida de aproximadamente 8 moles de CSA por mol de T3, a una temperatura comprendida entre aproximadamente -5 °C y aproximadamente 10 °C, en un periodo de tiempo de 30-40 min. Al final de la adición, generalmente se detiene el enfriamiento y se deja que la temperatura se eleve hasta la temperatura ambiente (comprendida entre aproximadamente 15 y 25 °C), durante no más de 4-5 horas, preferentemente no más de 2-3 horas.
La mezcla de sulfatación se añade después según la etapa de salificación b) a una solución acuosa de una sal alcalina inorgánica, preferentemente dicatiónica, en la que Na es un catión particularmente preferido, en una cantidad tal que neutralice el ácido clorosulfónico presente.
La salificación se realiza preferentemente con una solución acuosa de Na2CÜ3 o NaHCÜ3 , en cantidades en función de la cantidad de ácido clorosulfónico utilizado, al menos suficientes para neutralizar el pH de la solución resultante. En general, cuando se utiliza Na2CÜ3 , una cantidad de sal de al menos 1,5 moles por mol de CSA es suficiente.
Cuando, según un aspecto particularmente preferido, la sal inorgánica de metal alcalino es Na2CO3 , su concentración final es de al menos 0,7 mol/l de solución. En dichas condiciones, después de un enfriamiento rápido, se obtiene un pH de la solución comprendido entre 6,5 y 7,5.
Según esta forma de realización, la correspondiente sal monocatiónica del compuesto T3S obtenido tiene la fórmula II, en la que M es preferentemente Na.
La adición de la mezcla de reacción según la etapa b) se realiza en un periodo de tiempo variable, típicamente comprendido entre 1 h y 3 h, manteniendo una temperatura inferior a 30 °C.
El compuesto T3S de fórmula II se obtuvo en solución como una sal monocatiónica según las etapas b) y c) tal como se ha descrito anteriormente.
El proceso según la invención describe por primera vez, según los mejores conocimientos del solicitante, la preparación de T3S a partir o bien de T3 o bien T2, con una pureza de al menos el 95%, de forma más preferida de al menos el 96%, 98% o > 99%, para uso clínico.
Según una forma de realización adicional, se divulga un inmunoensayo de T3 S no radiactivo, basado en detección colorimétrica, fluorescente o quimioluminiscente.
Preferentemente, el inmunoensayo es un ensayo inmunológico ligado a enzimas (ELISA), de forma más preferida es un ELISA competitivo en el que cantidades crecientes de T3 S compiten por la unión a un anticuerpo anti-T3S unido en fase sólida (por ejemplo, el anticuerpo policlonal divulgado por Chopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194) con una cantidad fija de T3 S conjugada con un resto detectable, tal como un grupo fluorescente o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.) o un derivado de unión a avidina (es decir, biotina) opcionalmente unido a un resto detectable.
Figure imgf000010_0001
Los derivados de T3S útiles para los ensayos no radiactivos generalmente están comprendidos en la fórmula general A:
Figure imgf000010_0002
en la que R se selecciona del grupo que consiste en:
a) un resto detectable, seleccionado del grupo que consiste en: un grupo fluorescente o una enzima seleccionada del grupo que consiste en: peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina,
c) un derivado de unión a avidina opcionalmente unido a un resto detectable,
d) un agente quelante de lantánidos.
Cuando R es un agente quelante de lantánidos, el derivado de T3 S es preferentemente el compuesto de fórmula IV. El ensayo se lleva a cabo preferentemente en una placa de múltiples pocillos. Preferentemente, el resto detectable es un grupo fluorescente o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.) o un derivado de unión a avidina (es decir, biotina). Según esta última forma de realización, la detección se lleva a cabo preferentemente con un derivado de avidina, preferentemente estreptavidina que comprende una enzima tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, preferentemente peroxidasa de rábano picante (HRP), que convierte sustratos específicos en productos coloreados, fluorescentes o quimioluminiscentes. El uso de la interacción biotina-avidina, combinado con las diversas técnicas de detección de luminiscencia tales como técnicas para el desarrollo de señales, permite la amplificación de la señal y una mayor sensibilidad comparable a un ensayo RIA (véase, por ejemplo, Chopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194) pero sin necesidad de radiactividad, una clara ventaja con respecto al estado de la técnica.
El ensayo ELISA, los derivados de T3 S, tales como el derivado de biotina, su síntesis y kits para la cuantificación de T3 S que comprenden dichos reactivos también se divulgan en el presente documento.
Como forma de realización alternativa, el inmunoensayo de T3 S no radiactivo está desarrollado para una técnica de fluorescencia, llamada inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos, descrita por Hemmila I et al., Anal Biochem., marzo de 1984; 137 (2): 335-43, mediante el cual se obtiene una sensibilidad de 1-1000 pg/ml de T3 S. Este ensayo desarrollado para la detección de T3S, los reactivos sintetizados y los kits para la cuantificación de T3S que comprenden dichos reactivos, representan un objeto adicional de la invención.
Por lo tanto, en consecuencia, una DTPA-T3S-monoamida (3,5-diyodo-N-[[(carboximetil)[2-[(carboximetil)[2-[bis(carboximetil)amino]etil]amino]etil]amino]acetil]-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina) de fórmula IV representa un compuesto quelante según una forma de realización preferida:
Figure imgf000011_0001
Otras moléculas pueden diseñarse o sintetizarse por un experto en la técnica, mediante la conjugación de T 3 S con una diversidad de restos quelantes, entre los que son adecuados para la complejación de iones lantánidos, por ejemplo, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), etilendiamina-N,N'-bis(ácido 2-hidroxifenilacético) (EDDHA), ácido etilendiaminodisuccínico (EDDS), ácido propanodiaminotetraacético (PDTA), ácido dietilentriaminotetraacético (DTTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y moléculas similares. La conjugación entre el agente quelante y T3S se puede obtener mediante una diversidad de procedimientos conocidos por el experto en el campo, incluida la formación de un enlace amida directo, tal como se ejemplifica en la parte experimental, o el uso de agentes quelantes bifuncionales, que incluso pueden ser productos comerciales, tales como ácido (S)-1-p-isotiocianatobencildietilentriaminopentaacético (isotiocianato de DTPA - cat. de Invitrogen N° I24221), o productos similares.
Los metales lantánidos adecuados para su uso como marcadores quelatos se seleccionan del grupo que consiste en: samario, terbio, disprosio y europio. Es particularmente preferido el quelato de europio de 3,5-diyodo-N-[[(carboximetil)[2-[(carboximetil)[2-[bis(carboximetil)amino]etil]amino]etil]amino]acetil]-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina (fórmula V).
Figure imgf000011_0002
En la figura 2 se muestra un esquema de su síntesis. El proceso se puede resumir de la forma siguiente: el dianhídrido de DTPA se hidroliza parcialmente añadiendo una cantidad aproximadamente equimolar de agua disuelta en un disolvente orgánico adecuado, después el producto, compuesto principalmente por monoanhídrido de DTPA, se hace reaccionar con T3 S, en presencia de una base orgánica o inorgánica adecuada. Después de la evaporación del disolvente, el residuo oleoso se diluye con agua. El precipitado resultante se recoge, se lava con agua y se disuelve en una mezcla de agua/acetona. Este producto de reacción bruto se purifica en una columna de Amberlite XAD1600, o resina similar, desarrollada con mezclas o gradientes de agua/acetona. El producto que contiene las fracciones se recoge y se evapora a sequedad, produciendo la DTPA-T3 S-monoamida deseada.
La complejación de lantánidos se obtiene según procedimientos conocidos añadiendo una cantidad equimolar de una sal de lantánido a la solución acuosa de monoamida y ajustando el pH a 7 con una base adecuada (por ejemplo, NaOH). Opcionalmente, el producto quelado de lantánidos se puede desalar mediante adsorción en una columna de resina (por ejemplo, Amberlite XAD1600) y elución con mezclas de agua/disolvente.
También en este caso, se obtiene una sensibilidad comparable al ensayo RIA conocido (véase Chopra et al., anteriormente) mientras se evita el uso de isótopos radiactivos, lo que representa una clara ventaja sobre el ensayo de la técnica anterior.
A partir de las enseñanzas anteriores, el experto puede contemplar formatos alternativos del ELISA que, de todas las maneras, están comprendidos en la presente invención. Por ejemplo, la hormona T3 S diana puede unirse covalentemente a la placa y al anticuerpo, opcionalmente ligado a una enzima trazadora o utilizarse en combinación con un anticuerpo ligado a una enzima trazadora, que se utiliza para medir competitivamente el nivel de T3S en una muestra desconocida. Según otra forma de realización, el trazador es el propio antígeno (T3 S) unido directamente a una enzima detectable (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante) según procedimientos conocidos por el experto, también disponible en un kit de conjugación listo para su uso.
Según otra forma de realización, se divulga un kit para la administración y la dosificación de T3 S en suero, en el que dicho kit comprende un kit de dosificación para inmunodetección de T3 S mediante los ensayos no radiactivos divulgados anteriormente y un kit de administración/terapéutico con una serie de dosis diarias de T3 S o composición de T3 S y T4 (es decir, las necesidades semanales, quincenales, mensuales o quincenales), preferentemente en forma de comprimidos tal como se ha descrito anteriormente.
El kit de dosificación para la inmunodetección de T3 S no radiactiva puede comprender, según una primera forma de realización preferida, anticuerpos policlonales, el derivado de T3 S de unión a avidina, en el que preferentemente el conjugado es T3S-biotina y el resto detectable derivado de avidina es, a saber, estreptavidina. De forma más preferida, el derivado de avidina es estreptavidina y el resto detectable comprende un resto quimioluminiscente de enzima (tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante), preferentemente HRP.
Según la forma de realización derivada del inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos, el kit puede comprender, junto con anticuerpos, reactivos desarrollados específicamente para dicha detección, tales como derivados de un complejo de T3 S quelado con metales lantánidos, en los que el metal se selecciona del grupo que consiste en: samario, terbio, disprosio y europio. Particularmente preferido es el quelato de europio de 3,5-diyodo-N-[[(carboximetil)[2-[(carboximetil)[2-[bis(carboximetil)amino]etil]amino]etil]amino]acetil]-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina (compuesto de fórmula V).
El kit también puede comprender patrones de T3 S para la preparación de una curva de calibración. El patrón puede estar prediluido y listo para su uso como solución a la concentración correcta o para su solubilización en un disolvente adecuado. El kit también puede comprender otros reactivos seleccionados del grupo que consiste en: un diluyente, una molécula colorante, un tampón, un conservante, un anticuerpo anti-T3 S, un folleto de instrucciones.
Sección experimental
Ejemplo 1. Preparación de T3 S en DMAC
Todas las cantidades de las materias primas se expresan con referencia a 100 g de T3.
Se suspendió 3,5-diyodo-O-(4-hidroxi-3-yodofenil)-L-tirosina (100 g; 0,154 mol) en DMAC (2,0 l) en atmósfera de nitrógeno y se agitó vigorosamente para evitar la precipitación de sólidos. Después de enfriar a -5 °C, se añadió gota a gota CSA (142,2 g; 1,229 mol) en un periodo de 40 min mientras se mantenía la temperatura entre -5 -f 5 °C. Al final de la adición, se detuvo el enfriamiento y la mezcla de reacción se dejó en agitación durante aproximadamente 4 h. La mezcla de reacción se añadió gota a gota en un periodo de 1,5 h a una solución acuosa agitada de bicarbonato de sodio (335,5 g; 3,994 mol en agua, 4,5 l). Al final de la adición, a partir de la solución así obtenida con el tiempo se observó la precipitación de un sólido cristalino en forma de una mezcla de sales inorgánicas. Se separó por filtración dicho sólido, a continuación se purificó la solución obtenida en Amberlite™ XAD™ 1600 mediante elución con mezclas de agua/acetona que tenían polaridad decreciente recogiendo el eluato en fracciones. Las fracciones que contenían el producto con un nivel de pureza apropiado se evaporaron al vacío hasta una concentración de 10 g/kg. El pH de dicha suspensión se ajustó a 6,2 con HCl 1 N. La suspensión se concentró adicionalmente hasta una relación de aproximadamente 1:3 de sólidos y agua residual. Dicho residuo se trató con acetona con enfriamiento durante 2 h, después se filtró y se lavó con acetona. El producto se secó a 40 °C al vacío. Se obtuvieron 74 g de T3 S como un sólido blanco. Rendimiento sobre la base anhidra: 62%.
Ejemplo 2. Preparación de T3S a partir de T2 (Levoditi)
El esquema de reacción se presenta a continuación:
Figure imgf000013_0001
Se cargaron yodo (aproximadamente 0,48 kg, fuente: SQM), NaI (aproximadamente 0,65 kg, fuente: Ajay - SQM) y agua en un reactor a 18-22 °C y se agitaron hasta disolución completa. La mezcla de yodación resultante se mantuvo con agitación a temperatura ambiente hasta su uso.
Se cargaron Levoditi obtenido a partir de L-tirosina según el proceso descrito por Chalmers, J. R. et al., A. J. Chem. Soc. 1949, 3424-3433), Nal (aproximadamente 0,32 kg) y agua en otro reactor y se añadió monoetilamina al 70%. La mezcla de yodación se añadió a la mezcla de reacción.
La suspensión obtenida se agitó durante al menos 6 h a 18-22 °C, después se enfrió a 0 °C en un periodo de 1 h, se agitó durante 3-4 h y se filtró. La torta se lavó con agua.
El sólido húmedo se suspendió en agua y se añadió ácido acético a la mezcla y se agitó. La suspensión se filtró y la torta se lavó con agua.
El sólido húmedo se resuspendió en agua, se agitó, se filtró y se lavó con agua.
A continuación, la torta se suspendió en DMAC (aproximadamente 12,15 kg) y la suspensión se deshidrató mediante destilación al vacío.
La suspensión se enfrió a 5-10 °C y, en atmósfera de nitrógeno, se añadió lentamente CSA (aproximadamente 1,54 kg) y se mantuvo la temperatura por debajo de 15 °C.
La solución se calentó a 18-22 °C en un periodo de 1 h y se mantuvo durante otra hora, después se añadió en un reactor que contenía una solución de Na2CÜ3 (aproximadamente 2,27 kg) en agua (aproximadamente 29,02 kg), previamente preparada, manteniendo la temperatura por debajo de 30 °C.
La solución se purificó sobre una columna de Amberlite XAD 1600 (12,5 l) mediante elución de agua (87,5 l) y mezclas de agua/acetona (125 l) con polaridad decreciente comenzando desde 95:5 hasta 70:30. Las fracciones con alta pureza por HPLC se recogieron y se destilaron al vacío hasta lograr la composición deseada (aproximadamente 0,04 kg de T3S/l de suspensión).
La suspensión se enfrió a 40 °C y se añadió etanol (aproximadamente 5,22 kg), obteniéndose una solución.
La mezcla se enfrió a 0 °C en un periodo de 2 h, provocando la precipitación, se agitó durante otra hora y después se filtró. La torta se lavó con una mezcla de etanol/agua a temperatura ambiente.
El sólido húmedo se secó a aproximadamente 40 °C al vacío.
Se obtuvieron 0,98 kg de sal sódica de sulfato de T3 pura (% de área de HPLC > 99%) como un sólido blanco.
Rendimiento global de T2 (sobre la base anhidra): 68,5%.
Ejemplo 3. Preparación de comprimidos de T3
El principio activo, también en combinación con diferentes cantidades de levo-tiroxina, se premezcla durante quince minutos con el 50% del contenido de celulosa microcristalina.
A esta premezcla se añadieron los ingredientes siguientes en este orden: dibehenato de glicerol, sílice coloidal hidratada, croscaramelosa sódica, estearato de magnesio y carbonato de calcio (previamente tamizado a través de un tamiz de luz/malla limpia de 0,6 mm), junto con el 50% restante de la celulosa microcristalina, mezclando durante 20 minutos adicionales.
La uniformidad de distribución del principio activo en la mezcla se comprobó tomando muestras de seis puntos del mezclador; el análisis mostró que el principio activo (o los principios activos) se distribuye uniformemente dentro de la mezcla, también en el caso de la formulación con levo-tiroxina.
A continuación, la mezcla de polvos se comprimió mediante una prensa de comprimidos rotatoria equipada con un punzón plano redondo y los comprimidos se sometieron a ensayos de friabilidad, tiempos de disgregación y distribución del o de los principios activos.
Los resultados de los análisis realizados sobre el proceso de mezclado y prensado confirmaron la reproducibilidad de ambos, para dosis de T3 S comprendidas entre 25 y 200 gg. Además, demostraron que los comprimidos así obtenidos tenían parámetros correspondientes a los requisitos previstos por la Farmacopea Europea (VI Ed.) oficial.
Composición de comprimido
Figure imgf000014_0001
Los comprimidos preparados tal como se ha descrito anteriormente se utilizaron en ensayos clínicos de fase I en individuos tiroidectomizados, lo que demuestra que pueden utilizarse como tratamiento de reemplazo de hormona tiroidea (véase el documento US 2011/0245342).
De hecho, se demostró que la T3 S se absorbe (cruzando la barrera gastrointestinal), se encontraba en el suero después de la administración oral y se convirtió en la T3 clínicamente activa de una forma relacionada con la dosis. Los niveles de T3 en suero eran aún detectables 48 horas después de la administración de una dosis única.
Ejemplo 4. Cuantificación de T3 S por inmunoensayo con detección por quimioluminiscencia
Síntesis del derivado de T3S-biotina
En resumen, el derivado de T3S-biotina se sintetizó de la forma siguiente: se solubilizó N-hidroxisuccinimidil-d-biotina-15-amido-4,7,10,13-tetraoxapentadecilato A (50 mg; 0,0849 mmol) en DMAC (2 ml), al que se añadió DIPEA (14,5 ul; 0,0866 mmol), mientras se mantenía la mezcla de reacción con agitación continua a 0 °C. Después se añadió T3S (68,4 mg; 0,0908 mmol, preparado tal como se describe por Mol y Visser, Endocrinology 1985, 117: 1-7) y después de unos minutos se dejó calentar la suspensión a temperatura ambiente para proporcionar una solución transparente. Se dejó en agitación durante 2 h, después se mantuvo durante la noche a la misma temperatura. Se evaporó DMAC a presión reducida (10 mbar; 40 °C) para dar un aceite incoloro. El producto bruto así obtenido se disolvió en H2 O y se purificó mediante HPLC semipreparativa. Las fracciones que contenían el producto se recogieron, se concentraron y finalmente se liofilizaron para dar T3S-biotina como un sólido blanco (59,6 mg; 0,0495 mmol). Rendimiento del 58%.
Se obtuvo un antisuero policlonal anti-T3S en conejos tal como se describe por Chopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194.
El ensayo se basó en un ELISA competitivo en el que cantidades crecientes de T3S compitieron por la unión al anticuerpo con una cantidad fija de T3S conjugado con biotina, en una placa blanca de 96 pocillos. El empleo de la interacción biotina-avidina, que permite la amplificación de la señal, combinada con la luminiscencia como técnica para el desarrollo de la señal, permitió una sensibilidad comparable al ensayo RIA (descrito por Chopra et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1992, 75: 189-194).
Se prepararon soluciones patrón de T3S a las concentraciones siguientes: 1000, 200, 40, 8, 1,6 pg/ml en tampón diluyente: PBS, Tween al 0,05%, BSA al 0,3%.
Se preparó la solución trazadora (T3S-Biotina, 180,6 pM) en el tampón diluyente anterior. Solución de anticuerpo: el antisuero de conejo T3S se diluyó 1:50000 en tampón diluyente más ANS (sulfonato de 1-anilino-8-naftaleno) 8 mM, 1,2 mg/ml de salicilato de sodio.
Se revistió una placa blanca de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con 100 pl/pocillo de 2 pg/ml de IgG anti-conejo diluida en tampón de fosfato, pH 7,8. Al mismo tiempo, se combinaron soluciones patrón de T3S marcado con biotina con el antisuero diluido y la solución de T3S-biotina tal como se indica en la tabla A. Las muestras mezcladas se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad, durante la noche. Al día siguiente, la placa se lavó cuatro veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en PBS), después se incubó en tampón de bloqueo (BSA al 2% en tampón de lavado) durante 1 h a temperatura ambiente.
A continuación, la placa se enjuagó cuatro veces con tampón de lavado, se añadieron por triplicado 100 pl/pocillo de las muestras mezcladas y la placa se incubó 3 h a temperatura ambiente.
Después, la placa se enjuagó tres veces con tampón de lavado y se incubó con estreptavidina poli-HRP (10 ng/ml en RASA, 100 pl/pocillo) durante 1 h a temperatura ambiente.
Después de seis lavados adicionales, la placa se incubó con sustrato de máxima sensibilidad SuperSignal ELISA Femto (100 pl/pocillo) durante 5 minutos en la oscuridad y la luz emitida se leyó como recuentos por segundo (CPS) con un lector de placas de luminiscencia.
Tabla A: Preparación de la curva de calibración
Figure imgf000015_0002
La curva de calibración se preparó en tampón utilizando cinco concentraciones del elemento de ensayo en el intervalo de 1,6 - 1000 pg/ml. La curva se muestra en la figura 1, panel a).
Ejemplo 5. Cuantificación de T3S mediante el inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos
Preparación del compuesto de fórmula V: [[3,5-diyodo-N-[[(carboximetil)[2-[(carboximetil)[2-[bis(carboximetil)amino]etil]amino]etil]amino]acetil]-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosinato(6-)]europato(3-)] trisódico (fórmula V).
Figure imgf000015_0001
Síntesis de Eu-DTPA-T3S-monoamida
El esquema de reacción de la síntesis de 3,5-diyodo-N-[[(carboximetil)[2-[(carboximetil)[2-[bis(carboximetil)amino]etil]amino]etil]amino]acetil]-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina (DTPA-T3S-monoamida) se muestra en la figura 2.
Se añadió gota a gota una solución de H2 O (0,282 ml; 15,64 mmol) en DMAC (43 ml) a una suspensión de N,N-bis[2-(2,6-dioxilenol naranja-4-morfolinil)etil]glicina A (4,27 g; 11,94 mmol) en DMAC (85 ml) a temperatura ambiente. Al final de la adición, la mezcla se calentó a 80 °C. Después de 4,5 h, la mezcla de reacción se enfrió a 25 °C y se añadió gota a gota una solución de T3S/1 (3 g; 3,98 mmol) y DIPEA (2,71 ml; 15,92 mmol) en DMAC (85 ml) a lo largo de 20 min. El DMAC se evaporó a presión reducida (10 mbar; 40 °C). El residuo oleoso se diluyó con H2 O (200 ml), obteniéndose la precipitación de un sólido amarillento que se filtró, se lavó con H2 O y se secó. El producto bruto así obtenido se disolvió en acetona/H2O 20:80 (v/v), la solución (pH = 2,97) se cargó en una columna de resina Amberlite® XAD-1600 (200 mL; diámetro: 6 cm) y se eluyó con un gradiente de acetona/H2 O. Las fracciones que contenían el producto que tenían una composición similar se recogieron y se evaporaron para dar el ligando DTPA-T3S como un sólido (1,27 g; 1,15 mmol). Rendimiento del 26%.
Se añadió en porciones cloruro de europio hexahidratado (0,17 g, 0,46 mmol) a una solución del ligando DTPA-T3S (0,51 g; 0,46 mmol) en H2 O (50 ml) a 20 °C (pH 2,93); después de cada adición, la suspensión se agitó hasta su completa disolución. Una vez que se completó la complejación, el pH se ajustó a 7 con NaOH 0,1 N y la solución se desaló por elución con agua/acetona a partir de una columna de resina Amberlite® XAD-1600 (100 ml; diámetro: 3 cm). Las fracciones que contenían el producto deseado y estaban desprovistas de sales se recogieron y se evaporaron para dar el compuesto de fórmula IV (0,37 g, 0,28 mmol), un sólido amarillo. Rendimiento del 61%.
El procedimiento de inmunoensayo se diseñó según: Hemmila I et al. Anal Biochem., marzo de 1984; 137 (2): 335-43. Las soluciones utilizadas fueron las descritas en el ejemplo 4 con las excepciones siguientes: se utilizó un DELFIA® Wash (Perkin Elmer) en lugar del tampón de lavado anterior. La solución madre del trazador contenía europio 100 pM y se almacenó a 4 °C, protegida de la luz. Justo antes de su uso se diluyó 1:300.000 en tampón de ensayo para obtener una concentración final de 440 pg/ml.
El ensayo se realizó en placas DELFIA® Yellow (Perkin Elmer).
Después de la incubación de 3 h con las muestras mezcladas, se añadió la solución de compuesto diluido de fórmula V (50 pl por pocillo) a todos los pocillos. A continuación, las placas se sellaron con láminas adhesivas de plástico y se incubaron con agitación durante 1 h a 37 °C.
Después de tres lavados, las placas se secaron con golpecitos sobre papel absorbente y se añadió la solución de realce Delfia (Perkin Elmer) (200 pl). Después de 1 h a 25 °C, las placas se leyeron en un instrumento Victor3 de acuerdo con el protocolo del fabricante "Europium".
Se preparó una curva de calibración utilizando nueve concentraciones del elemento de ensayo en el intervalo de 30 a 2000 pg/ml. La curva se muestra en la figura 1, panel b).
Ejemplo 6. Síntesis de HRP-T3S-monoamida
El conjugado se preparó directamente utilizando un kit comercial que contenía HRP activada (por ejemplo, el kit de marcado HOOK™ HRP PLUS - G-Biosciences). Se disolvieron 1-2 mg de T3S en 1 ml del tampón de carbonato suministrado, después se dispensó esta solución en un vial que contenía la HRP activada liofilizada, mezclando suavemente mediante pipeteo repetido para reconstituir la enzima activada. Después de aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 20 pl de la solución de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) suministrada, y después se dejó reaccionar durante aproximadamente 15 min a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 50 pl de tampón de extinción, después se incubó con un suave volteo o agitación durante 15 min. El conjugado final se desaló y se cambió el tampón por PBS mediante diálisis o desalinización en columna. Se prepararon diluciones apropiadas del conjugado T3S-HRP y se utilizaron como trazador en un ELISA de una sola etapa, tal como se describe en el ejemplo 4, omitiendo la etapa de incubación de estreptavidina-HRP.
Figure imgf000016_0001
Ejemplo comparativo: Síntesis de T3S en DMF y ensayos de elución
Figure imgf000017_0001
La reacción se llevó a cabo según el esquema anterior, en DMF. En resumen: se disolvió T3 (40 mg) en etanol amoniacal.
Esta solución se evaporó bajo una corriente de nitrógeno.
Al residuo se añadieron 2 ml de una solución caliente de ácido clorosulfónico (obtenida mezclando 2,5 ml de ácido clorosulfónico al 99% y 8 ml de N,N-DMF). Posteriormente, se dejó que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente con agitación y se continuó la reacción durante la noche.
La mezcla se diluyó con agua (5 ml) y después se eluyó en una columna de Sephadex LH-20 (5 ml), obteniéndose la fracción A. Se continuó la elución con HCl 0,1 N (5 ml), obteniéndose la fracción B.
Estas fracciones se volvieron a cargar en la columna y se purificaron mediante elución en serie de HCl 0,1 N (aproximadamente 4 ml), agua y etanol absoluto.
No obstante, se utilizaron cinco cantidades diferentes de agua y etanol absoluto para la purificación. Los rendimientos y purezas de T3S obtenidos mediante estas cinco condiciones se han resumido en la tabla B.
Tabla B: Ensayos de purificación
Figure imgf000017_0002
La tabla B muestra que cuando la síntesis se lleva a cabo en las condiciones descritas anteriormente y se utiliza DMF como disolvente, se puede lograr una alta conversión, pero el rendimiento general es bastante bajo.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende 3,5-diyodo-O-[3-yodo-4-(sulfooxi)fenil]-L-tirosina (T3 S) como principio activo, en forma micronizada y en una cantidad de 1 a 1000 pg, que comprende además:
a) un diluyente seleccionado de entre celulosa y derivados de la misma, junto con un segundo diluyente, hasta el 35% de diluyente total (p/p);
b) un disgregante que consiste en sal sódica de croscarmelosa, presente en una cantidad que varía del 0,5 al 10% (p/p);
c) un deslizante que consiste en dibehenato de glicerol, presente en una cantidad que varía del 1 al 10% (p/p); d) un lubricante que consiste en estearato de magnesio y sílice coloidal hidratada, presente en un intervalo de cantidad total comprendido entre el 0,1 y el 7% (p/p).
2. La composición según la reivindicación 1, en la que el derivado de celulosa es celulosa microcristalina y el segundo diluyente es carbonato cálcico.
3. La composición según la reivindicación 1, en la que la croscarmelosa sódica está presente en una cantidad comprendida entre el 1 y el 5% (p/p).
4. La composición según la reivindicación 1, en la que el dibehenato de glicerol está presente en una cantidad comprendida entre el 4 y el 6% (p/p).
5. La composición según la reivindicación 1, en la que el estearato de magnesio está comprendido en una cantidad entre el 0,1 y el 2% (p/p) y la sílice coloidal está comprendida en una cantidad entre el 0,5 y el 5% (p/p).
6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende T3 S en combinación con T4.
7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la T3 S se encuentra en una cantidad de 2,5 a 500 pg.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la T3 S se encuentra en una cantidad de 5 a 250 pg.
9. La composición de la reivindicación 6, que comprende T3 S y T4 como principios activos, en las siguientes cantidades T3 S: de 2,5 a 500 pg y T4 de 1 a 800 pg, T3 S: de 5 a 250 pg y T4: de 5 a 400 pg, T3 S: de 10 a 100 pg y T4 de 10 a 200 pg.
10. La composición según la reivindicación 1, en la que la T3 S tiene un tamaño de partícula inferior a 25 pm.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en la que el carbonato de calcio se encuentra en una cantidad de 20 a 40 mg.
12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en la que el dibehenato de glicerol se encuentra en una cantidad de 2 a 15 mg.
13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en la que la sal sodica de croscarmelosa se encuentra en una cantidad de 1 a 10 mg.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en la que la sílice coloidal hidratada se encuentra en una cantidad de 0,1 a 5 mg.
15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en la que el estearato de magnesio se encuentra en una cantidad de 0,01 a 2 mg.
16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en la que la celulosa microcristalina se encuentra en una cantidad de al menos 30 mg.
17. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en forma de comprimido.
18. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso como dosis administrada diariamente.
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