ES2784350T3 - Extracto de fermento de Eupenicillium crustaceum y uso cosmético del mismo - Google Patents

Abstract

Un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum, en el que el extracto de fermento comprende del 31 al 79 % en peso de péptidos, del 1 al 8 % en peso de aminoácidos libres, del 10 al 27 % en peso de carbohidratos y del 15 al 40 % en peso de lípidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Extracto de fermento de Eupenicillium crustaceum y uso cosmético del mismo

Campo de la invención

La tecnología desvelada se refiere a un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum que es útil en el tratamiento y/o cuidado cosmético de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. En particular, el extracto de fermento es activo en el alivio o prevención de los síntomas del envejecimiento de la piel y en el aclarado de color o despigmentación o blanqueamiento de la piel.

Antecedentes de la invención

El envejecimiento de la piel es un proceso complejo inducido por factores cronológicos y medioambientales (principalmente, radiación UV). Los signos o síntomas del envejecimiento de la piel incluyen la pérdida de elasticidad y firmeza de la piel, la aparición de características tales como arrugas y surcos, ojeras, ojos hinchados, bolsas en los ojos, lentigos solares (manchas de la edad) y piel moteada. Los primeros signos del envejecimiento de la piel son evidentes habitualmente en la cara de una persona, específicamente en la región que rodea los ojos. Éstos incluyen la presencia de ojeras (hiperpigmentación periorbital), ojos hinchados (hinchazón periorbital), bolsas en los ojos (bolsas palpebrales infraorbitales) y arrugas (por ejemplo, arrugas periorbitales). La presencia de los signos del envejecimiento en la piel de una persona, especialmente su cara, es estéticamente indeseable. Se desea una piel con una apariencia más joven, esto es, una piel con síntomas reducidos de envejecimiento.

La piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas proporcionan una barrera física entre un organismo y su entorno. La piel está compuesta por dos capas principales, la epidermis y la dermis. La dermis es la capa más gruesa (teniendo un grosor aproximado del 90 % del grosor de la piel) y contiene colágeno, elastina, varias estructuras diferenciadas tales como vasos sanguíneos y muchos tipos celulares tales como fibroblastos (que sintetizan colágeno y elastina). La epidermis está compuesta por queratinocitos, melanocitos y células de Langerhans, con la población celular principal compuesta por queratinocitos.

El colágeno es la proteína más abundante en el tejido conectivo de la piel y juega un papel estructural importante en la piel. Forma una estructura semejante a una malla en el tejido conectivo de la piel que ayuda en el soporte de nuevas células mientras crecen a la vez que proporciona la flexibilidad necesaria. Existe una síntesis y degradación continúa de colágeno en la piel y el equilibrio entre ellas determina tanto la resistencia a la tracción como la elasticidad de la piel. La elastina es una proteína del tejido conectivo que es elástica. La elastina ayuda a mantener la piel flexible pero firme, proporcionando una reacción de recuperación si se tira de la piel. El proceso de envejecimiento está acompañado de degeneración y lisis tanto de las fibras de colágeno como las fibras elásticas en la piel. La desaparición gradual de las fibras elásticas en la piel da como resultado la pérdida progresiva de elasticidad en la piel. La degeneración y lisis de las fibras de colágeno da como resultado que la piel pierde resistencia (firmeza). Una consecuencia adicional de la lisis de las fibras conectivas en la dermis es la reducción gradual del grosor de la dermis como un todo, particularmente a través de la reducción de las fibras de colágeno. [Bonta M, Daina L, Mu{iu G. The process of ageing reflected by histological changes in the skin. Rom J Morphol Embryol. 2013;54(3 Supl):797-804]

Otro factor en el envejecimiento de la piel es la aparición de Productos Finales de Glicosilación Avanzada (AGE, por sus siglas en inglés, "Advanced Glycosylation End Products"). Los AGE se obtienen a partir de una reacción denominada glicación que implica azúcar y proteína. La presencia de estos productos en la piel cambia las propiedades físicas, biomecánicas (la piel se tensa y pierde elasticidad) y biológicas (modulación de la síntesis, degradación de la matriz por las células). Los AGE pueden modular la expresión de proteínas de la matriz extracelular (ECM) como colágeno y también pueden modificar la expresión y síntesis de las enzimas que son responsables de su degradación (elastasa y enzimas metaloproteinasas) [Pageon H. Reaction of glycation and human skin: the effects on the skin and its components, reconstructed skin as a model. Pathol Biol (París). Jun 2010;58(3):226-31]. El resultado es una elasticidad y grosor reducido de la piel. En la piel, la glicación del colágeno Tipo I se ha ligado al desarrollo de la opacidad de la piel y la disminución de la elasticidad de la piel.

Como resultado de la elasticidad, la firmeza y grosor reducidos, pueden aparecer arrugas en la piel, tales como las que aparecen alrededor del ojo. Existe una necesidad de proporcionar un principio activo que pueda ayudar a prevenir la degradación del colágeno y/o estimular la producción de colágeno en la piel. Existe una necesidad de proporcionar un principio activo que pueda ayudar a prevenir la degradación de elastina y/o estimular la producción de elastina en la piel. Existe una necesidad de proporcionar un principio activo que pueda inhibir la formación de AGE en la piel. Dichos principios activos pueden ser útiles en el tratamiento de la piel para prevenir o aliviar los signos del envejecimiento.

El proceso del envejecimiento también afecta la vasculatura en la piel. Los cambios vasculares incluyen el adelgazamiento de las paredes capilares y la ralentización de la microcirculación. La alteración de las paredes de los vasos sanguíneos causa cambios en la permeabilidad vascular y puede dar como resultado la aparición de edema interfibrilar [Bonta M, Daina L, Mu{iu G. The process of ageing reflected by histological changes in the skin. Rom J Morphol Embryol. 2013;54(3 Supl):797-804]. Así, uno de los signos del envejecimiento es la acumulación de fluido intersticial alrededor y bajo los ojos, por ejemplo, ojos hinchados y bolsas en los ojos (también conocido como bolsas bajo el ojo). Éstos son estéticamente antiestéticos y se desea que se reduzca la hinchazón de la piel/volumen de las bolsas. Existe una necesidad de principios activos que sean capaces de disminuir la permeabilidad vascular implicada en el edema formado en los ojos hinchados y las bolsas en los ojos.

Al envejecer la piel, se vuelve más delgada. Por ejemplo, Bonta y col. indican que la eficiencia vascular disminuida, especialmente en la dermis superficial, produce una serie de efectos importantes en la epidermis, adaptándola a la eficiencia de la vasculatura, concretamente reduciendo el número de capas celulares, es decir, reduciendo el grosor [Bonta M, Daina L, Mu{iu G. The process of ageing reflected by histological changes in the skin. Rom J Morphol Embryol. 2013;54(3 Supl):797-804]. Este adelgazamiento puede dar como resultado que se vuelvan más visibles los vasos sanguíneos subyacentes y cromóforos (tales como bilirrubina y melanina). Ésta es una causa de las ojeras, un problema cosmético muy común que afecta a la mayoría de la gente [Ranu H, Thng S, Goh BK, Burger A, Goh CL. Periorbital hyperpigmentation in Asians: an epidemiologic study and a proposed classification. Dermatol Surg. 2011 sep;37(9):1297-303]. Se cree que este problema se exacerba adicionalmente, cuando los vasos sanguíneos se vuelven más permeables con el envejecimiento y, como resultado, la bilirrubina, un producto de degradación de la sangre, se acumula alrededor de los ojos. Específicamente, la bilirrubina es un producto de degradación del metabolismo hemo. Hemo es una porfirina que contiene hierro que se encuentra en la hemoglobina, mioglobina y varias enzimas de las que los citocromos hepáticos son los representantes más importantes. Aproximadamente el 80 % de la producción diaria de bilirrubina deriva de glóbulos rojos senescentes. Éstos son degradados y el hierro se elimina de la molécula hemo y el anillo porfirina remanente se oxida y se escinde en un único sitio para formar la estructura de cadena tetrapirrol de la biliverdina. La reducción adicional de la biliverdina da como resultado la formación de bilirrubina responsable de la coloración que aparece en los párpados infraorbitales como ojera [Stillman AE. Jaundice. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3a edición. Boston: Butterworths; 1990. Capítulo 87]. La ojera es un problema cosmético facial complejo, con múltiples causas y éstas incluyen deposición de melanina, estasis venosa con deposición de hemosiderina y problemas estructurales orbitales. Los depósitos de melanina en la dermis pueden ser congénitos o secundarios a factores ambientales tales como exposición excesiva al sol, estrógenos endógenos o uso de estrógenos exógenos, embarazo y lactancia. Existe una necesidad de proporcionar un principio activo que pueda degradar bilirrubina y/o reducir la cantidad de melanina en la piel, dos de los pigmentos responsables de la pigmentación en las ojeras.

Los signos del envejecimiento tales como arrugas, ojeras, ojos hinchados, bolsas en los ojos pueden exacerbarse por la fatiga, el estrés, el consumo de drogas y alcohol, entre otros factores.

La modificación del color de la piel, incluyendo el aclarado de la piel, por ejemplo, de las ojeras así como la eliminación o atenuación de las manchas de la edad, es un efecto cosmético deseado por mucha gente. Frecuentemente, el objetivo es conseguir un color de la piel homogéneo. Los productos cosméticos despigmentantes se usan para reducir la hipercromía y, típicamente, los agentes despigmentantes actúan mediante la inhibición de una ruta biosintética de la melanina.

Las melaninas son pigmentos complejos que proporcionan a la piel, pelo y ojos de los mamíferos color y fotoprotección frente a la radiación ionizante. La melanogénesis es un proceso fisiológico que resulta de la síntesis de los pigmentos de melanina y se caracteriza, en resumen, por el proceso de producción y distribución posterior de melanina por los melanocitos. Los melanocitos de mamíferos producen dos tipos químicamente distintos de pigmentos de melanina, la eumelanina de negra a marrón y la feomelanina de amarilla a marrón rojiza, por diferentes enzimas en orgánulos complejos denominados melanosomas. Tanto la eumelanina como la feomelanina derivan del precursor común dopaquinona que se forma por la tirosinasa (TYR). La tirosinasa también se denomina polifenol oxidasa y es una enzima multifuncional que contiene cobre. Es la enzima clave en el primer estadio de la cascada de la melanogénesis, catalizando la conversión de L-tirosina en L-dopaquinona (Ito S., Wakamatsu K. y Ozeki, H. Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis. Pigment Cell Res. 2000: 13 Supl. 8. 103­ 9). Además de la tirosinasa, se ha mostrado que dos proteínas relacionadas, denominadas proteínas relacionadas con tirosinasa (TRP), regulan la formación de eumelanina. La TRP-1 (proteína 1 relacionada con tirosinasa) o DHICA (ácido 5,6-dihidroxiindol-2-carboxílico oxidasa) y TRP-2 (proteína 2 relacionada con tirosinasa), también conocidas como dopacromo tautomerasa (Hearing. V. J. The melanosome: the perfect model for cellular response to the environment Pigment Cell Res. 2000; 13 Supl. 8, 23-4). La formación de melanina también se origina de la oxidación de tirosina, por la enzima tirosinasa, a dihidroxifenilalanina (DOPA) en el interior de los melanocitos.

Los melanosomas son orgánulos relacionados con los lisosomas que tienen la capacidad única de producir el pigmento melanina y que progresan a través de cuatro etapas morfológicas secuenciales conforme maduran (estadio I, II, III y IV). Los melanosomas del Estadio I son vesículas redondas, unidas a membrana y translúcidas electrónicamente que generalmente se encuentran en el área perinuclear. La transición a melanosomas de Estadio II implica un alargamiento de la vesícula y la aparición en el interior de estructuras fibrilares distintas. La producción de esas fibras de matriz internas y la maduración de los melanosomas de los Estadios I a II depende de la presencia de una proteína estructural denominada Pmel17 (también conocida como gp100 o SILV). Poco después de su administración a melanosomas del Estadio I, Pmel17 se escinde en varios fragmentos, que forman la matriz fibrilar del orgánulo. En las células pigmentadas, la melanina se deposita en estas fibras, lo que da como resultado una matriz interna progresivamente pigmentada, momento en el que los orgánulos se denominan melanosomas de Estadio III. En los tejidos altamente pigmentados, la síntesis y deposición de melanina continúa hasta que es visible poca o ninguna estructura interna, momento en el que se denominan melanosomas de Estadio IV. Se han identificado varias proteínas como proteínas específicas de melanosoma (Tyr, Trp1, Trp2, MART-1, Pmel17, GPNMB, etc.). MART-1, antígeno asociado a melanoma reconocido por la proteína de células T (también conocida como Melan-A), una proteína específica de melanosoma, no tiene actividad enzimática detectable, está altamente enriquecida en melanosomas tempranos (melanosomas de Estadio I y/o II) y forma un complejo con Pmel17 y afecta a su expresión, estabilidad, transporte y el procesamiento que se requiere para la estructura y maduración de los melanosomas y juega así un papel importante en la regulación de la pigmentación de mamíferos (Hoashi T, Watabe H, Muller J, Yamaguchi Y, Vieira WD, Hearing VJ. MART-1 is required for the function of the melanosomal matrix protein PMEL17/GP100 and the maturation of melanosomes. J Biol Chem. 2005 abr 8;280(14):14006-16. Epub 28 ene 2005). GPNMB (glucoproteína (transmembrana) no metastásica de melanoma proteína b), una proteína transmembrana altamente glucosilada de tipo I, presenta una alta similitud con Pmel17. GPNMB contiene varios dominios relacionados con sus funciones en los melanocitos. Se ha confirmado que el resto arginina-glicina-aspartato (RGD) de GPNMB puede unirse a integrinas para regular la adhesión de los melanocitos con los queratinocitos, lo que indica que está implicada en la transferencia de melanina. Como una proteína estructural importante de los melanosomas, se ha probado que GPNMB está presente en todos los estadios (I-IV) de los melanosomas y está especialmente enriquecida en los estadios maduros. La deleción de GPNMB en los melanocitos atenuó de forma aguda la formación de melanosomas, lo que indica un papel crítico en la síntesis de melanosomas (Zhang P, Liu W, Zhu C, Yuan X, Li D, Gu W, Ma H, Xie X, Gao T. Silencing of GPNMB by siRNA inhibits the formation of melanosomes in melanocytes in a MITF-independent fashion. PLoS One.

2012;7(8):e42955).

Después de la producción, la melanina, en los melanosomas, se transfiere a los queratinocitos adyacentes a través de dendritas presentes en los melanocitos, donde se transportará y degradará. Esta transferencia de melanina puede producirse a través de tres mecanismos diferentes: Proceso de citofagocitosis del extremo dendrítico del melanocito por el queratinocito; migración directa de los melanosomas del citoplasma al queratinocito y; liberación de los melanosomas en el espacio extracelular y su incorporación a los queratinocitos. De esta manera, la pigmentación de la piel depende del número, la naturaleza química de la melanina y contenido (la actividad tirosinasa) y la distribución de los melanosomas producidos y transferidos por cada melanocito a una agrupación de queratinocitos que lo rodea.

La producción aumentada de melanina debida a la estimulación directa o indirecta es una reacción defensiva de la piel con el fin de protegerla frente a la agresión solar. Después de la irradiación UV, los melanosomas se reagrupan alrededor del núcleo con el fin de proteger el material genético de la célula y de esta manera, además de promover la coloración de la piel y el pelo, la melanina promueve la fotoprotección, actuando como un filtro solar, difractando o reflejando la radiación solar. El complejo melanocito-queratinocito responde rápidamente a un amplio intervalo de estímulos ambientales, frecuentemente de maneras paracrina y/o autocrina. De esta manera, los melanocitos responden a UV-R, proteína de señalización agutí, hormona estimulante de melanocitos (MSH), endotelinas, factores de crecimiento, citocinas, etc. Después de la exposición a UV-R, los melanocitos aumentan su expresión de proopiomelanocortina (POMC, el precursor de MSH) y su receptor el receptor de melanocortina 1 (MC1-R), TYR y TYRP1, proteína quinasa C (PKC) y otros factores de señalización. Por otra parte, se sabe que UV estimula la producción de endotelina-1 (ET-1) y POMC por los queratinocitos y que estos factores pueden actuar después de una manera paracrina para estimular la función de los melanocitos. Además de los queratinocitos, los fibroblastos y posiblemente otras células de la piel producen citocinas, factores de crecimiento y mediadores inflamatorios que pueden aumentar la producción de melanina y/o estimular la transferencia de melanina a los queratinocitos por los melanocitos. Los factores de crecimiento de los melanocitos afectan no sólo al crecimiento y pigmentación de los melanocitos sino también a su forma, dendricidad, adhesión a proteínas de la matriz y movilidad.

a-MSH, ACTH, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), endotelinas, factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de acero, factor inhibidor de la leucemia (LIF) y factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) son factores derivados de los queratinocitos que se piensa que están implicados en la regulación de la proliferación y/o diferenciación de los melanocitos, algunos actuando a través de rutas de señalización mediadas por receptor. Se ha mostrado que en la epidermis humana, a-MSH y ACTH se producen en y se liberan por los queratinocitos y están implicados en la regulación de la melanogénesis y/o la formación de las dendritas de los melanocitos. a-MSH y ACTH se unen a un receptor específico de melanocitos, MC1-R, que activa la adenilato ciclasa a través de la proteína G, que entonces eleva el AMPc a partir de adenosina trifosfato. El AMP cíclico ejerce su efecto en parte a través de la proteína quinasa A (PKA), que fosforila y activa la proteína de unión del elemento de respuesta de AMPc (CREB) que se une al elemento de respuesta de AMPc (CRE) presente en el promotor M del gen del factor de transcripción asociado con microftalmia (MITF). El aumento en la expresión de MITF-M induce la regulación al alza de TYR, TYRP1 y DCT, lo que da lugar a la síntesis de melanina.

La hiperpigmentación es un trastorno causado por la producción exagerada de melanina. Los factores tales como exposición solar excesiva, envejecimiento, cambios hormonales, inflamación, alergias, entre otros, pueden causar un desequilibrio en el proceso de producción y distribución de melanina, dando como resultado manchas en la piel. Los lentigos solares (también conocidos como lentigo senil, manchas solares, hepáticas o de la edad) son máculas circunscritas pigmentadas, que habitualmente son marrón claro, pero varían en grado de color hasta negro azabache. Los lentigos solares se encuentran típicamente en áreas del cuerpo expuestas a UV (la cara, el reverso de la mano, antebrazo extensor, parte superior de la espalda y escote). Pueden variar de tamaño en cualquier valor desde 1 mm hasta unos pocos centímetros de diámetro y, en áreas de la piel dañadas gravemente por el sol, pueden coalescer en lesiones incluso mayores. Existe un deseo de proporcionar principios activos cosméticos que puedan aclarar el color de la piel hiperpigmentada tal como lentigos solares (manchas de la edad).

El mecanismo molecular propuesto actualmente para la aparición de lentigos solares implica la estimulación de dos cascadas epidérmicas, que consisten en ET-1/ETBR (iniciada por la unión de ET-1 a su receptor, ETBR) y SCF/c-kit (iniciada por la unión del factor de células madre a su receptor c-Kit) y la intercomunicación entre estas dos después de exposición UV. La exposición a radiación UV induce un aumento en la producción de ET-1 por los queratinocitos y su secreción por lo tanto estimula a los melanocitos para producir melanina. El potencial de los queratinocitos localizados en la epidermis SL lesional para producir ET-1 es significativamente mayor que en los controles normales perilesionales y existe también una expresión acentuada de transcritos ETBR. La producción aumentada y localización de ET-1 fue paralela a cantidades aumentadas de tirosinasa en los melanocitos. Separadamente, SCF (también producido por los queratinocitos) se une al receptor c-KIT en los melanocitos. La epidermis lesional con lentigos solares expresa niveles aumentados de transcritos de ARNm y proteína SCF comparado con controles no lesionales /Costin GE, Hearing VJ. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB J. 2007 abr;21(4):976-94].

Sin embargo, otras cascadas en la piel también pueden contribuir a la hiperpigmentación observada en los lentigos solares. La ruta de señalización Wnt, que desencadena la diferenciación de las células madre de los melanocitos, en lesiones de lentigos solares, está implicada en la diferenciación acelerada de las células madre de los melanocitos, se implicó en la formación de SL. La ruta de señalización Wnt está estrechamente relacionada con la biología de los melanocitos. Esta ruta de señalización también es importante para que las células madre de los melanocitos desencadenen la diferenciación en melanocitos foliculares y melanocitos epidérmicos. La proteína dickkopf 1 inhibidor de la ruta de señalización WNT (DKK1), un inhibidor de la ruta de señalización Wnt, previno la melanogénesis y disminuyó la densidad de los melanocitos. DKK1 suprime la función y el crecimiento de los melanocitos a través de la regulación del factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF) y b-catenina. [Yamaguchi Y, Morita A, Maeda A, Hearing VJ. Regulation of skin pigmentation and thickness by Dickkopf 1 (DKK1). J Investig Dermatol Symp Proc. ago 2009;14(1):73-5]. /Yamada T, Hasegawa S, Inoue Y, Date Y, Arima M, Yagami A, Iwata Y, Takahashi M, Yamamoto N, Mizutani H, Nakata S, Matsunaga K, Akamatsu H.Accelerated differentiation of melanocyte stem cells contributes to the formation of hyperpigmented maculae. Exp Dermatol. sep 2014;23(9):652-8].

De esta manera un principio activo que pueda inhibir una ruta de biosíntesis de la melanina o actuar directamente en ella puede tener un efecto de aclarado o despigmentación en la piel, tal como un principio activo que pueda inhibir la actividad tirosinasa, inhibir la producción de melanina en los melanocitos, o afectar a la expresión de genes implicados en el proceso melanogénico, puede actuar como un agente despigmentante. Existe una necesidad de un nuevo principio activo eficaz que tenga un efecto de aclarado, blanqueante o despigmentante en la piel.

La presente invención pretende resolver algunos o todos los problemas identificados anteriormente y cumple con algunas o todas las necesidades identificadas anteriormente.

Leal J A y col., "Chemical and structural similarities in wall polysaccharides of some Penicillium, Eupenicillium and Aspergillus species", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 90, n.° 2, 1 enero 1992, páginas 165-168 desvelan la composición de monosacárido de fracciones obtenidas a partir del material de la pared celular de Eupenicillium crustaceum Ludwig 635.70. El documento JP H02 268679 A se refiere a la producción de la 1,5-anhidroglicitol deshidrogenasa de un hongo (preferentemente Pestalotia diospyrii IFO-5282) que pertenezca a los Eumicetes. Fujimoto H et al., "Immunomodulatory constituents from an Ascomycete, Eupenicillium crustaceum, and revised ^{absolute structure of macrophorin D.", JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS} Sep ^{2001, vol. 64, n.° 9, septiembre} 2001, páginas 1234-1237 desvela los compuestos inmunosupresores 4'-oxomacroforina D y 4'-oxomacroforina A obtenidos mediante fraccionamiento guiado por la actividad inmunomoduladora de un extracto EtOAc de E. crustaceum IFM42163.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum. Se ha descubierto que un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es particularmente efectivo en el tratamiento y/o cuidado cosmético de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas.

En el contexto de la presente invención, el tratamiento y/o cuidado cosmético incluye: la despigmentación de o el blanqueamiento o el aclarado del color de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas; la despigmentación de o el blanqueamiento o el aclarado del color de manchas de la edad; la despigmentación de o el blanqueamiento o el aclarado del color de la piel de las ojeras; el mantenimiento o mejora de la luminosidad de la piel; el alivio o la prevención de los síntomas del envejecimiento de la piel; tratamiento de las arrugas de la piel, tales como arrugas periorbitales; tratamiento de ojeras; tratamiento de ojo hinchado; tratamiento de bolsas de los ojos; el alisado de o reducción de arrugas de la piel; la reducción del volumen de un ojo hinchado o de bolsas en los ojos; el mantenimiento o mejora de la elasticidad de la piel; el mantenimiento o mejora de la resistencia, firmeza o resistencia a la tracción de la piel.

Sorprendentemente, los inventores han descubierto que el extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es eficaz en el alisado de las arrugas de la piel y en la reducción del volumen de los ojos hinchados o de las bolsas de los ojos. Los inventores también han descubierto que el extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es capaz de promover la síntesis de colágeno y elastina, que forman las fibras de colágeno y elásticas respectivamente, puede inhibir las enzimas responsables de la degradación de colágeno y elastina y puede inhibir la glicación del colágeno. Además, han descubierto que el extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es capaz de reducir la permeabilidad vascular implicada en el edema formado en los ojos hinchados y bolsas de los ojos. En una realización, el tratamiento y/o cuidado cosmético incluye el aclarado del color, blanqueamiento o despigmentación de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que el extracto de fermento de la invención es particularmente efectivo en el aclarado del color o la despigmentación de piel hiperpigmentada tal como manchas de la edad y de ojeras. Los inventores han descubierto que el extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es capaz de inhibir la actividad tirosinasa, inhibir la producción de melanina en los melanocitos y afectar la expresión de genes implicados en el proceso melanogénico y así pueden actuar como un agente despigmentante/blanqueante/de aclarado del color de la piel. Además, han descubierto que este efecto es más pronunciado en la piel hiperpigmentada, por ejemplo, manchas de la edad. Han descubierto que el extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es capaz de reducir la concentración de bilirrubina y melanina, dos de los pigmentos responsables de la pigmentación oscura en la piel de las ojeras.

En un segundo aspecto, la invención proporciona el uso de un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum para el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas.

En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente eficaz de un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de dicha composición en el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas.

En un quinto aspecto, la invención proporciona procedimientos cosméticos no terapéuti

comprenden la administración tópica de un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum o composiciones que comprenden el mismo.

Descripción de la invención

Las realizaciones preferidas como se muestran a continuación son aplicables a todos los aspectos de la invención anteriormente mencionados.

Definiciones

En el contexto de la presente invención se entiende que "piel" es las capas que la comprenden, desde la capa más superior o estrato córneo a la capa más inferior o hipodermis, ambas incluidas. Estas capas están compuestas por diferentes tipos de células tales como queratinocitos, fibroblastos, melanocitos y/o adipocitos entre otros. En el contexto de esta invención, el término "piel" incluye el cuero cabelludo. El término "piel" incluye la piel humana.

El término "tratamiento", como se usa en el contexto de la presente memoria descriptiva cuando no está acompañado por las cualificaciones "cosmético" o "no terapéutico", significa la administración de un compuesto según la invención para aliviar o curar una enfermedad o trastorno, o reducir o eliminar uno o más síntomas asociados a esta enfermedad o trastorno, o aliviar o eliminar las consecuencias fisiológicas de la enfermedad o trastorno.

Cuando el término "tratamiento" o "cuidado" está acompañado por la cualificación "cosmético", significa que el tratamiento o cuidado no es terapéutico y tiene el objeto de mejorar la apariencia estética de la piel. Esto puede ser mejorando las propiedades de la piel tales como, pero no restringido a, el nivel de hidratación, elasticidad, firmeza, brillo, tono o textura, cuyas propiedades afectan a la apariencia cosmética de la piel. El término "cuidado" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere al mantenimiento de las propiedades de la piel. Las propiedades de la piel son susceptibles de mejora y mantenimiento mediante tratamiento y/o cuidado cosmético de la piel tanto en sujetos sanos como en aquellos que presentan enfermedades y/o trastornos de la piel y/o membranas mucosas, tales como y no restringidas a, úlceras y lesiones en la piel, psoriasis, dermatitis, acné o rosácea, entre otros.

El término "prevención", como se usa en la presente invención, se refiere a la capacidad del principio activo de la invención de prevenir, retrasar o dificultar la aparición o desarrollo de una enfermedad o trastorno o propiedad/característica de la piel antes de su aparición.

En el contexto de la presente invención, el término "envejecimiento" se refiere a los cambios experimentados por la piel con la edad (cronoenvejecimiento) o a través de la exposición al sol (fotoenvejecimiento) o a agentes medioambientales tales como humo de tabaco, condiciones climáticas extremas de frío, calor, o viento, contaminantes o contaminantes químicos, e incluye todos los cambios externos visibles y/o perceptibles a través del tacto, tal como y no restringido a, el desarrollo de discontinuidades en la piel tales como arrugas, líneas finas, surcos, irregularidades o rugosidad, aumento del tamaño de los poros, pérdida de elasticidad, pérdida de firmeza, pérdida de tersura, pérdida de la capacidad de recuperar de la deformación, descuelgue de la piel tal como mejillas descolgadas, la aparición de bolsas bajo los ojos o la aparición de una papada, entre otros, cambios en el color de la piel tal como marcas, enrojecimiento, bolsas bajo los ojos o la aparición de áreas hiperpigmentadas tales como manchas de la edad o pecas entre otros, diferenciación anómala, hiperqueratinización, elastosis, queratosis, pérdida de pelo, piel de piel de naranja, pérdida de la estructura de colágeno y otros cambios histológicos del estrato córneo, de la dermis, epidermis, sistema vascular (por ejemplo, la aparición de arañas vasculares o telangiectasias) o de aquellos tejidos cercanos a la piel, entre otros. El término "fotoenvejecimiento" agrupa conjuntamente el conjunto de procesos debidos a la exposición prolongada de la piel a radiación ultravioleta que da como resultado el envejecimiento prematuro de la piel y presenta las mismas características físicas que el envejecimiento, tales como y no restringido a, flaccidez, descuelgue, cambios en el color o irregularidades en la pigmentación, queratinización anormal y/o excesiva. Los cambios en la piel debidos al envejecimiento (por ejemplo, cronoenvejecimiento, fotoenvejecimiento y/o envejecimiento medioambiental) también se refieren en el presente documento como los síntomas o signos del envejecimiento de la piel.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum, como se define en las reivindicaciones adjuntas, que es útil en el tratamiento y/o cuidado cosmético de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. Los presentes inventores han descubierto un nuevo ingrediente cosmético; un extracto de fermento derivado de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum. Ventajosamente, este nuevo principio activo cosmético deriva de recursos naturales y es sorprendentemente eficaz en el tratamiento y/o cuidado cosmético de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. En particular, es eficaz en el alivio o la prevención de los signos del envejecimiento de la piel. Además, es eficaz en el aclarado del color, blanqueamiento o despigmentación de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas.

El extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum usado en la invención es un producto de fermentación de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum. El extracto de fermento es un extracto de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum que se ha sometido a un proceso de fermentación y puede ser un extracto de las células de la especie Eupenicillium crustaceum que se han separado de un caldo de fermentación o puede ser un extracto del caldo de fermentación en sí mismo, que todavía contiene las células de la especie Eupenicillium crustaceum. Se denomina en el presente documento el extracto de fermento o simplemente el extracto.

El extracto de fermento puede obtenerse a través de la fermentación de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum en un medio de cultivo acuoso adecuado. El caldo de fermentación se agita y airea convencionalmente para permitir la síntesis y secreción del producto deseado en el medio de cultivo y esto continúa con el aislamiento y purificación de un extracto de fermento. La fermentación puede llevarse a cabo en un medio agitado y aireado a una temperatura de entre 15 °C y 40 °C, típicamente a 25 °C, teniendo el medio un pH entre 5 y 9, típicamente alrededor de 7,5, ajustado si es necesario durante la fermentación. La duración de la fermentación es entre 2 a 10 días, en una realización entre 3 a 8 días, en otra realización, entre 4 y 7 días.

El procedimiento de aislamiento y purificación del extracto de fermento del caldo de fermentación puede llevarse a cabo por los procedimientos conocidos para un experto en la materia, tales como centrifugación, disrupción y extracción. Por ejemplo, en una primera etapa, puede usarse centrifugación para separar las células de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum del caldo de cultivo; en una segunda etapa, puede usarse disrupción para liberar los compuestos intracelulares; y, en una tercera etapa, puede llevarse a cabo una extracción de los compuestos intracelulares para avituallamiento obtener el extracto de fermento. El extracto incluirá aquellos compuestos intracelulares que son solubles en el disolvente de extracción. El extracto de fermento puede obtenerse simplemente por extracción del caldo de fermentación, esto es, sin etapas de centrifugación ni disrupción. Sin embargo, preferiblemente, se emplea una etapa de disrupción para maximizar el rendimiento del producto deseado.

En la fermentación de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum puede usarse como una fuente de carbono un medio de cultivo que contiene azúcares exógenos, tales como y no restringido a, galactosa, glucosa, manosa, manitol, amigdalina, celobiosa, maltosa, almidón, glucógeno, lactosa, mezclas de los mismos y/o extractos que contienen mezclas de estos azúcares. En una realización, puede proporcionarse un suministro exógeno de manitol de 2 a 40 g/l, o de 3 a 10 g/l.

El medio de cultivo puede comprender fuentes adicionales de nitrógeno o carbono tales como extractos de levadura, extractos de malta o peptonas, con concentraciones de cada uno de estos componentes de 0,1 a 20 g/l, o de 0,5 a 10 g/l.

El medio de cultivo puede comprender sales marinas. Las sales marinas son sales minerales a una concentración entre 5 y 40 g/l, o entre 25 y 35 g/l. En una realización, además de o alternativamente a las sales marinas, también se proporcionan sales minerales al medio de cultivo de la fermentación. Estas sales se seleccionan entre sales que proporcionan los iones Na+, K+, NH4+, Ca2+, Mg2+, PO43-, SO42-, Cl-, F-, I-, CO32-, NO3-, citratos, o elementos traza tales como Cu, Mn, Mo, Fe, Sr, B, Br, Si, Al, Li y Zn.

La etapa de extracción se lleva a cabo usando un disolvente tal como isopropanol. Pueden usarse otros disolventes tales como etanol, acetona y acetato de etilo.

El extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum contiene típicamente péptidos, aminoácidos libres, carbohidratos y lípidos.

El extracto de fermento comprende porcentajes relativos de especies de: 31 al 79 % de péptidos, 1 al 8 % de aminoácidos libres, 10 al 27 % de carbohidratos y 15 al 40 % de lípidos, con la condición de que la suma de los porcentajes no exceda el 100 %. En una realización, el extracto de fermento muestra porcentajes relativos de especies de: 35 al 73 % de péptidos, 2 al 7 % de aminoácidos libres, 12 al 25 % de carbohidratos y 17 al 37 % de lípidos, con la condición de que la suma de los porcentajes no exceda el 100 %. En otra realización, el extracto de fermento muestra porcentajes relativos de especies de: 39,4 al 65,6 % de péptidos, 2,2 al 6,4 % de aminoácidos libres, 13,3 al 22 % de carbohidratos y 18,8 al 32,8 % de lípidos, con la condición de que la suma de los porcentajes no exceda el 100 %. En otra realización, el extracto de fermento muestra porcentajes relativos de especies de: 39 al 46 % de péptidos, 3 al 7 % de aminoácidos libres, 21 al 22 % de carbohidratos y 29 al 33 % de lípidos, con la condición de que la suma de los porcentajes no exceda el 100 %. Estos porcentajes son porcentajes en peso.

Típicamente, el extracto de fermento tiene un peso molecular menor de 3.400 Da. Éste se mide por análisis cromatográfico (HPLC) con una columna de exclusión por tamaño TSK gel G2000SWXL, en las condiciones detalladas en el Ejemplo 2. La columna de exclusión por tamaño tiene un diámetro interno de 7,8 mm, una longitud de 30,0 cm, un tamaño de partícula de 5 mm y un tamaño de poro de 125 A. El eluyente fue tampón fosfato 0,1 M pH 6,7 Na2SO4 0,1 M y la elución se mantuvo isocrática a un caudal de 1 ml/min. El extracto de fermento de la especie Eupenicillium crustaceum, muestra picos entre 11,5 y 13,5 min, picos con una distribución gaussiana que tienen un tiempo de residencia entre 10 y 20 minutos.

En una realización ejemplar y preferida, la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT 20901. Esta cepa se depositó el 20 de marzo, 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino 9, 46980 Paterna, Valencia, España), una institución reconocida legalmente para dicho propósito según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos el 28 de abril, 1977.

En un segundo aspecto, la invención proporciona el uso del extracto de fermento para el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. En particular, se ha descubierto que el extracto de fermento es particularmente eficaz en el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, incluyendo: la despigmentación de o el blanqueamiento o el aclarado del color de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas; la despigmentación de o el blanqueamiento o el aclarado del color de manchas de la edad; la despigmentación de o el blanqueamiento o el aclarado del color de la piel de las ojeras; el mantenimiento o mejora de la luminosidad de la piel; el alivio o la prevención de los síntomas del envejecimiento de la piel; tratamiento de las arrugas de la piel, tales como arrugas periorbitales; tratamiento de ojeras; tratamiento de ojo hinchado; tratamiento de bolsas de los ojos; el alisado de o reducción de arrugas de la piel; la reducción del volumen de un ojo hinchado o de bolsas de los ojos; el mantenimiento o mejora de la elasticidad de la piel; el mantenimiento o mejora de la resistencia, firmeza o resistencia a la tracción de la piel. Se ha descubierto que el extracto de fermento puede estimular la síntesis de colágeno y elastina, inhibir la degradación del colágeno debida a la acción de la colagenasa e inhibir la degradación de la elastina debida a la acción de la elastasa. Se cree que dicho extracto de fermento sirve para reponer y mantener los niveles de colágeno y elastina en la piel envejecida, manteniendo y mejorando así la elasticidad de la piel, resistencia de la piel y/o resistencia a la tracción de la piel. Esto da lugar a una piel más tonificada y firme que tiene una tendencia menor a descolgarse y/o arrugarse. También se ha descubierto que dicho extracto de fermento puede inhibir la formación de Productos Finales de Glicación Avanzada (AGE). Se cree que esto ayuda adicionalmente a la capacidad del extracto de fermento de ayudar a mantener los niveles de colágeno (colágeno Tipo I) en la piel envejecida, y, como resultado, mantener la elasticidad de la piel. Además, esta capacidad de inhibir la formación de AGE da lugar a una disminución en la formación de compuestos que junto con una disminución en la elastina se cree que causan opacidad de la piel y así el uso de este activo cosmético puede mejorar la luminosidad de la piel. De esta manera, en una realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento para el mantenimiento o mejora de la elasticidad de la piel, resistencia de la piel, firmeza de la piel, resistencia a la tracción de la piel y/o luminosidad de la piel. La invención proporciona dicho extracto de fermento para el uso cosmético no terapéutico en el mantenimiento o mejora de la elasticidad de la piel, resistencia de la piel, resistencia a la tracción de la piel y/o luminosidad de la piel y el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento como un agente de firmeza y tonificante de la piel y/o un agente que da brillo a la piel.

Además, se ha descubierto que el extracto de fermento de la invención es eficaz en el alisado de o la reducción del tamaño de las arrugas de la piel, en particular arrugas periorbitales, tales como patas de gallo. De esta manera, en una realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento para el tratamiento de las arrugas. La invención proporciona dicho extracto de fermento para el uso cosmético no terapéutico en el tratamiento de arrugas y el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento como un agente anti-arrugas de la piel.

También se ha descubierto que el extracto de fermento de la invención es efectivo para disminuir el volumen de las bolsas de los ojos. Se cree que esto se debe, al menos en parte, a la eficacia del extracto de fermento para disminuir la permeabilidad vascular (estando asociado un aumento en la permeabilidad vascular con el envejecimiento de la piel) y así reducir la cantidad de fluido retenido en la piel bajo el ojo. De esta manera en una realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento para el tratamiento de las bolsas de los ojos y/u ojos hinchados. La invención proporciona dicho extracto de fermento para el uso cosmético no terapéutico en el tratamiento de las bolsas de los ojos y/u ojos hinchados y el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento como un agente de tratamiento para las bolsas de los ojos y/u ojos hinchados.

También se ha descubierto que el extracto de fermento de la invención es efectivo en el aclarado del color o la despigmentación o el blanqueamiento de la piel. Se cree que esto se debe, en parte, a la eficacia del extracto de fermento para inhibir la formación de melanina en los melanocitos, inhibir la actividad tirosinasa y/o afectar la expresión de genes que están implicados en el proceso melanogénico. Así, en una realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento para el aclarado del color o blanqueamiento o despigmentación de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. La invención proporciona dicho extracto de fermento para el uso cosmético de blanqueamiento o aclarado del color o despigmentación de la piel y el uso cosmético de dicho extracto de fermento como un agente blanqueante de la piel o agente de aclarado del color de la piel o agente de despigmentación de la piel. En particular, el extracto de fermento es efectivo en el aclarado del color o la despigmentación o el blanqueamiento de la piel hiperpigmentada, por ejemplo, manchas de la edad. Se cree que esta capacidad de afectar las manchas de la edad se debe, en parte, a la eficacia del extracto de fermento para regular a la baja la expresión del gen EDNRB y el efecto inhibidor en la ruta de señalización Wnt en los melanocitos (regulación al alza del gen DKK1 y regulación a la baja de genes implicados en esta ruta). Así, en una realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento para el tratamiento de las manchas de la edad. La invención proporciona dicho extracto de fermento para el uso cosmético no terapéutico en el tratamiento de manchas de la edad y el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento como un agente de tratamiento para las manchas de la edad. El extracto de fermento de la invención también es particularmente efectivo en el aclarado del color oscuro de la piel en las ojeras. Se cree que esto se debe, en parte, a la eficacia del extracto de fermento para estimular la degradación de bilirrubina así como su capacidad de afectar la formación de melanina. De esta manera, en una realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento para el tratamiento de las ojeras. La invención proporciona dicho extracto de fermento para el uso cosmético no terapéutico en el tratamiento de las ojeras y el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento como un agente de tratamiento para las ojeras. Esta capacidad de aclarado del color de la piel también contribuye a la capacidad del extracto de fermento de mantener y/o mejorar la luminosidad de la piel.

En una realización del segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso del extracto de fermento de la invención para el alivio y/o prevención de los síntomas o signos del envejecimiento de la piel. De esta manera, la invención proporciona dicho extracto de fermento para el uso cosmético no terapéutico en el alivio y/o prevención de los síntomas del envejecimiento de la piel y el uso cosmético no terapéutico de dicho extracto de fermento como un agente anti­ envejecimiento de la piel. Los síntomas o signos del envejecimiento de la piel incluyen: la aparición de arrugas en la piel, ojeras, manchas de la edad, ojos hinchados y/o bolsas en los ojos, la opacidad de la piel, pérdida de elasticidad de la piel, resistencia de la piel, firmeza de la piel y/o resistencia a la tracción de la piel. De esta manera en esta realización, el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico incluye: el tratamiento de arrugas de la piel, ojeras, manchas de la edad, ojos hinchados y/o bolsas de los ojos; el alisado o reducción del tamaño de las arrugas de la piel; la reducción del volumen de ojos hinchados y/o de bolsas de los ojos; el aclarado del color de la piel de las ojeras; el aclarado del color de las manchas de la edad; el mantenimiento o mejora de la elasticidad de la piel, luminosidad de la piel, resistencia de la piel, firmeza de la piel y/o resistencia a la tracción de la piel. En una realización, el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico es el aclarado, blanqueamiento o despigmentación de la piel e incluye el aclarado del color de las ojeras y/o manchas de la edad y/o el mantenimiento o mejora de la luminosidad de la piel. En una realización, el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico es el tratamiento de la piel alrededor del área de los ojos e incluye el tratamiento de arrugas de la piel, ojeras, ojos hinchados y/o bolsas de los ojos.

En una realización de la invención, el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas es para la piel que está más expuesta al medioambiente tal como la piel facial, la piel de las manos y antebrazos, el escote y las piernas. En una realización de la invención, en la que el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas es para el aclarado del color, blanqueamiento o despigmentación, el tratamiento y/o cuidado es para la piel para la que se desea cosméticamente un color más claro por un individuo, tal como piel hiperpigmentada tal como manchas de la edad o piel que naturalmente es más oscura debido a un alto contenido de melanina tal como la piel del pezón.

En una realización, el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico es para un individuo que es caucásico o asiático. En una realización, el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico es para un individuo que tiene una edad superior a 20.

De acuerdo con el tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente eficaz del extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum y al menos un excipiente, adyuvante y/o ingrediente cosméticamente aceptable. El extracto de fermento es como se describe en el primer aspecto de la invención. Dichas composiciones pueden prepararse por los procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia ["Harry's Cosmeticology", Séptima edición, (1982), Wilkinson J.B., Moore R.J., ed. Longman House, Essex, Gran Bretaña/

La cantidad cosméticamente eficaz del extracto de fermento en la composición de la invención, así como su dosificación, dependerá de numerosos factores, que pueden incluir la edad, condición del paciente, la naturaleza o gravedad de los signos del envejecimiento de la piel, la oscuridad de la piel que se va a tratar y/o cuidar, la ruta y frecuencia de la administración del extracto.

"Cantidad cosméticamente eficaz" se entiende que es una cantidad no tóxica pero suficiente del extracto de fermento para proporcionar el efecto deseado. El extracto de fermento de la invención se usa a concentraciones para conseguir el efecto cosmético deseado y éstas incluyen, basándose en el peso seco del extracto respecto al peso total de la composición, del 0,0000000001 % en peso al 20 % en peso o del 0,00000001 % en peso al 10 % en peso, o del 0,000001 % en peso al 5 % en peso, o del 0,000001 % en peso o el 0,00005 al 1 % en peso.

El extracto de fermento de la invención puede incorporarse en sistemas de administración y/o sistemas de liberación sostenida cosméticos.

La expresión "sistemas de administración" se refiere a un diluyente, adyuvante, vehículo o aditivos con los que se administra el extracto de la invención. Estos vehículos cosméticos pueden ser líquidos, tales como agua, aceites o tensioactivos, incluyendo aquellos de origen en el petróleo, animales, plantas o sintéticos, tales como y no restringido a, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceite de ricino, polisorbatos, ésteres de sorbitán, éter sulfatos, sulfatos, betaínas, glucósidos, maltósidos, alcoholes grasos, nonoxinoles, poloxámeros, polioxietilenos, polietilenglicoles, dextrosa, glicerol, digitonina y similares. Un experto en la materia está al tanto de los diluyentes, adyuvantes o aditivos que pueden usarse en los diferentes sistemas de administración en los que puede administrarse el extracto de fermento de la invención.

El término "liberación sostenida" se usa en un sentido convencional para describir un sistema de administración que proporciona la liberación gradual de un compuesto durante un periodo de tiempo. En una realización, el sistema de administración proporciona niveles de liberación de compuesto relativamente constantes durante un periodo de tiempo.

Los ejemplos de sistemas de administración o liberación sostenida incluyen liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas y nanopartículas lipídicas sólidas, vehículos lipídicos nanoestructurados, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas tensioactivo-fosfolípido, miliesferas, microesferas y nanoesferas, lipoesferas, milicápsulas, microcápsulas y nanocápsulas, así como microemulsiones y nanoemulsiones, que pueden añadirse para conseguir una mayor penetración del principio activo de la invención. En una realización, los sistemas de administración o liberación sostenida se eligen de liposomas, micelas mixtas tensioactivo-fosfolípido y microemulsiones, microemulsiones agua en aceite con una estructura micelar interna inversa y microemulsiones que contienen nanocápsulas.

El sistema de liberación sostenida puede prepararse por procedimientos conocidos en la técnica anterior y las composiciones que los contienen pueden administrarse, por ejemplo, por administración tópica o transdérmica, incluyendo parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos y parches microeléctricos. En una realización, el sistema de liberación sostenida debe liberar una cantidad relativamente constante del extracto de la invención. La cantidad de extracto contenida en el sistema de liberación sostenida dependerá, por ejemplo, de dónde se va a administrar la composición, la cinética y duración de la liberación del extracto de la invención, así como de la naturaleza de la afección, trastorno y/o enfermedad que se va a tratar o prevenir.

La composición que contiene el extracto de fermento de esta invención también puede adsorberse en polímeros orgánicos sólidos o soportes minerales sólidos, tales como y no restringido a, talco, bentonita, sílice, almidón o maltodextrina entre otros.

Las composiciones que contienen el extracto de fermento también pueden incorporarse en tejidos, tejidos no tejidos o dispositivos médicos que están en contacto directo con la piel, liberando así el extracto de la invención ya sea por biodegradación del sistema de unión al tejido, al tejido no tejido o dispositivo médico, o debido a la fricción entre ellos y el cuerpo, debido a la humedad corporal, el pH de la piel o la temperatura corporal. Además, el extracto de la invención puede incorporarse en los tejidos y los tejidos no tejidos usados en la fabricación de prendas que están en contacto directo con el cuerpo.

Los ejemplos de tejidos, tejidos no tejidos, prendas, dispositivos médicos y medios para inmovilizar los compuestos a ellos, entre los que están los sistemas de administración y/o los sistemas de liberación sostenida descritos anteriormente, pueden encontrarse en la bibliografía y son conocidos en la técnica anterior /Schaab C.K. (1986) HAPPI mayo 1986; Nelson G., "Application of microencapsulation in textiles", (2002), Int. J. Pharm., 242(1-2), 55-62; "Biofunctional Textiles and the Skin" (2006) Curr. Probl. Dermatol. v.33, Hipler U.C. y ElsnerP., eds. S. Karger AG, Basilea, Suiza; Malcolm R.K. y col., "Controlled release of a model antibacterial drug from a novel self-lubricating silicone biomaterial", (2004), J. Cont. Release, 97(2), 313-3207. Los tejidos, tejidos no tejidos, prendas y dispositivos médicos preferidos son vendajes, gasas, camisetas, calcetines, medias, ropa interior, fajas, guantes, pañales, compresas, apósitos, colchas, toallitas, parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos, parches microeléctricos y/o máscaras faciales.

Las composiciones cosméticas que contienen el extracto de fermento de esta invención pueden usarse en diferentes tipos de composiciones de aplicación tópica o transdérmica, incluyendo opcionalmente excipientes cosméticamente aceptables necesarios para formular la forma de administración deseada.

Las composiciones cosméticas de la invención pueden ser para aplicación tópica o transdérmica y pueden producirse en cualquier formulación sólida, líquida o semi-sólida, tales como y no restringido a, cremas, emulsiones múltiples tales como y no restringido a, emulsiones de aceite y/o silicona en agua, emulsiones de agua en aceite y/o silicona, emulsiones de tipo agua/aceite/agua o agua/silicona/agua y emulsiones de tipo aceite/agua/aceite o silicona/agua/silicona, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles en crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, sueros cosméticos, películas de polisacáridos, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barras, lápices y pulverizadores o aerosoles (pulverizadores), incluyendo formulaciones sin aclarado y con aclarado. Estas formulaciones de aplicación tópica o transdérmica pueden incorporarse, usando técnicas conocidas para el experto en la materia, en diferentes tipos de accesorios sólidos tales como y no restringido a, vendajes, gasas, camisetas, calcetines, medias, ropa interior, fajas, guantes, pañales, compresas, apósitos, colchas, toallitas, parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos, parches microeléctricos o máscaras faciales, o pueden incorporarse en diferentes productos de maquillaje tales como base de maquillaje, tal como bases fluidas y bases compactas, lociones desmaquillantes, leches desmaquillantes, correctores de ojeras, sombras de ojo, barras de labios, protectores labiales, brillos de labios y polvos, entre otros.

Las composiciones cosméticas de la invención pueden incluir agentes que aumentan la absorción percutánea de los compuestos de esta invención, por ejemplo y no restringido a, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida, dimetilformamida, tensioactivos, azono (1-dodecilazacicloheptano-2-ona), alcohol, urea, etoxidiglicol, acetona, propilenglicol o polietilenglicol, entre otros. Adicionalmente, las composiciones cosméticas o dermofarmacéuticas de esta invención pueden aplicarse a áreas locales que se van a tratar mediante iontoforesis, sonoforesis, electroporación, parches microeléctricos, presión mecánica, gradiente de presión osmótica, cura oclusiva, microinyecciones o inyecciones sin aguja mediante presión, tales como inyecciones por presión de oxígeno, o cualquier combinación de éstos, para conseguir una mayor penetración del extracto de la invención. El área de aplicación se determinará por la naturaleza de la afección, trastorno y/o enfermedad que se va a tratar y/o prevenir.

Entre los excipientes, adyuvantes y/o ingredientes cosméticamente aceptables contenidos en las composiciones cosméticas descritas en esta invención están ingredientes adicionales usados comúnmente en composiciones cosméticas tales como y no restringido a, agentes que disminuyen la producción de sebo, agentes anti-seborreicos, agentes matificantes, agentes anti-acné, agentes que estimulan la síntesis de macromoléculas dérmicas o epidérmicas y/o capaces de inhibir o prevenir su degradación, otros agentes que estimulan la síntesis de colágeno, otros agentes que estimulan la síntesis de elastina, agentes que estimulan la síntesis de decorina, agentes que estimulan la síntesis de laminina, agentes que estimulan la síntesis de defensina, agentes que estimulan la síntesis de chaperona, agentes que estimulan la síntesis de AMPc, agentes que modulan AQP-3, agentes que modulan la síntesis de acuaporina, proteínas de la familia acuaporina, agentes que estimulan la síntesis de ácido hialurónico, agentes que estimulan la síntesis de glucosaminoglucano, agentes que estimulan la síntesis de fibronectina, agentes que estimulan la síntesis de sirtuína, proteínas de choque térmico, agentes que estimulan la síntesis de proteínas de choque térmico, agentes que inhiben la exocitosis neuronal, otros agentes anticolinérgicos, agentes que inhiben la contracción muscular, otros agentes anti-envejecimiento, otros agentes anti-arrugas, agentes antitranspirantes, agentes anti-inflamatorios y/o analgésicos, agentes anti-prurito, agentes calmantes, agentes anestésicos, inhibidores de la agregación del receptor de acetilcolina, agentes que inhiben la acetilcolinesterasa, agentes relajantes de la piel, otros agentes que inhiben la síntesis de melanina, agentes blanqueantes o despigmentantes, agentes que inhiben la NO-sintasa, agentes que inhiben la 5a-reductasa, agentes que inhiben la lisil- y/o prolil hidroxilasa, antioxidantes, secuestradores de radicales libres y/o agentes frente a la contaminación atmosférica, secuestradores de especies de carbonilo reactivas, agentes anti-glicación, agentes antihistamínicos, agentes antivíricos, agentes antiparasitarios, emulsionantes, emolientes, disolventes orgánicos, propelentes líquidos, acondicionadores de la piel, humectantes, sustancias que retienen la humedad, alfa hidroxi ácidos, beta hidroxi ácidos, hidratantes, enzimas hidrolíticas epidérmicas, vitaminas, aminoácidos, proteínas, pigmentos o colorantes, tintes, biopolímeros, polímeros gelificantes, espesantes, tensioactivos, agentes suavizantes, emulsionantes, agentes de unión, conservantes, agentes capaces de reducir o tratar las bolsas bajo los ojos, agentes exfoliantes, agentes queratolíticos, agentes descamantes, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, agentes fungistáticos, agentes bactericidas, agentes bacteriostáticos, agentes que estimulan la síntesis de lípidos y componentes del estrato córneo, ceramidas, ácidos grasos, otros agentes que inhiben la degradación del colágeno, agentes que inhiben metaloproteinasas de la matriz, otros agentes que inhiben la degradación de elastina, agentes que inhiben serina proteasas tales como calicreínas, elastasa de leucocitos o catepsina G, agentes que estimulan la proliferación de fibroblastos, agentes que estimulan la proliferación de queratinocitos, agentes que estimulan la proliferación de adipocitos, agentes que estimulan la proliferación de melanocitos, agentes que estimulan la diferenciación de queratinocitos, agentes que estimulan o retrasan la diferenciación de adipocitos, agentes antihiperqueratosis, agentes comedolíticos, agentes anti-psoriasis, agentes reparadores del ADN, agentes protectores del ADN, agentes protectores de las células madre, estabilizadores, agentes para el tratamiento y/o cuidado de piel sensible, agentes de firmeza, agentes anti-estrías, agentes de unión, agentes lipolíticos o agentes que estimulan la lipolisis, agentes adipogénicos, agentes que modulan la expresión de PGC-1a, agentes que modulan la actividad de PPARy, agentes que aumentan o reducen el contenido de triglicéridos de los adipocitos, agentes anti-celulitis, agentes que inhiben la actividad de PAR-2, agentes que estimulan la cicatrización, agentes cicatrizantes coadyuvantes, agentes que estimulan la reepitelización, agentes de reepitelización coadyuvantes, factores de crecimiento citocina, agentes que actúan en la circulación y/o microcirculación capilar, agentes que estimulan la angiogénesis, agentes que inhiben la permeabilidad vascular, agentes venotónicos, agentes que actúan en el metabolismo celular, agentes que mejoran la unión dérmica-epidérmica, agentes que inducen el crecimiento del pelo, agentes que inhiben o retardan el crecimiento del pelo, agentes que retardan la caída del pelo, conservantes, perfumes, absorbentes del olor y/o desodorantes que enmascaran el olor corporal, agentes quelantes, extractos de plantas, aceites esenciales, extractos marinos, agentes obtenidos de un proceso biotecnológico, sales minerales, extractos celulares, pantallas solares y agentes fotoprotectores orgánicos o minerales activos frente a rayos ultravioleta A y/o B y/o rayos infrarrojos A, o mezclas de los mismos, siempre que sean físicamente y químicamente compatibles con el resto de componentes en la composición y particularmente con el extracto de fermento producido por la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum. Asimismo, la naturaleza de estos ingredientes adicionales no debe alterar de manera inaceptable los beneficios del extracto de esta invención. La naturaleza de estos ingredientes adicionales puede ser sintética o natural, tales como extractos de plantas, o provenir de un procedimiento biotecnológico, o de una combinación de un procedimiento sintético y un procedimiento biotecnológico. Pueden encontrarse ejemplos adicionales en CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary & Handbook, 12a Edición (2008). En el contexto de esta invención, se entiende que procedimiento biotecnológico es cualquier procedimiento para producir el principio activo, o parte de éste, en un organismo, o en parte de éste.

En una realización, la composición cosmética de la invención contiene:

- entre el 0,0000000001 % (en peso) y el 20 % (en peso) del extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum;

- entre el 0,1 % (en peso) y el 20 % (en peso) de un humectante seleccionado del grupo de (Nombres INCI) Glycerin, Propylene Glycol, Butylene Glycol, Pentylene Glycol, Caprylyl Glycol, Lactic Acid, Urea, Sodium Hyaluronate;

- entre el 0,1 % (en peso) y el 20 % (en peso) de un emoliente o acondicionador de la piel seleccionado del grupo de (Nombres INCI) Dimethicone, Glyceryl Stearate, Caprylic/Capric Triglyceride, Cetearyl Alcohol, Lecithin, C12-15 Alkyl Benzoate, Squalane, Lanolin, Behenyl Alcohol, Tocopheryl Acetate, Panthenol, Butyrospermum Parkii Butter, Retinyl Palmitate, Retinol;

- entre el 0,1 % (en peso) y el 20 % (en peso) de un tensioactivo seleccionado del grupo de (Nombres INCI) Xanthan Gum, Sodium Laureth Sulfate, Steraric Acid, Polysorbate 20, Polysorbate 80, Stearyl Alcohol, Cetyl Alcohol, Steareth-2, Ceteareth-20, Cocamidopropyl Betaine.

La composición puede comprender además un agente que disminuye la producción de sebo, un agente antiseborreico, un agente matificante y/o un agente anti-acné, por ejemplo y no restringido a, un agente seleccionado del grupo formado por Mat-XS Clinical [INCI: Sarcosine, Xanthan gum], Mat-XS Bright [INCI: Orthosiphon Stamineus Leaf Extract, Maltodextrine, Xanthan Gum], Betapur [INCI: Reumus Boldus Leaf Extract, Xanthan Gum] o Neurobiox [INCI: Achillea Millefolium Extract, Xanthan Gum] comercializado por BASF, Evermat [INCI: Enantia Chlorantha Bark Extract, Oleanolic Acid], Ac.net [INCI: Butylene Glycol, Peg-60 Almond Glycerides, Caprylyl Glycol, Glycerin, Carbomer, Nordihydroguaiaretic Acid, Oleanolic Acid] o Sebuless [INCI: Maltodextrin, Syringa Vulgaris (Lilac) Extract] comercializado por Sederma/Croda, Phytessence Purple Ginseng [INCI: Glycerin o Polygonum Bistorta Root Extract] comercializado por Crodarom, P-Refinyl [INCI: Lens Esculenta (Lentil) Seed Extract], comercializado por Silab, EPS Seamat [INCI: Planktonic Exopolysaccharide-5, Phenoxyethanol] o Epidermist 4.0 [INCI: Plankton Extract], comercializado por Codif, Seborami [INCI: Sisymbrium Ofiicinale Extract, Arctium Lappa Root Extract, Citric Acid, Glycolic Acid, Zinc PCA, Sclerotium Gum] comercializado por Alban Muller, Poreaway [INCI: Pistacia Lentiscus Gum/Pistacia Lentiscus (Mastic) Gum, Lecithin] comercializado por Mibelle, Citrustem [INCI: Xanthan Gum, Sodium Benzoate, Gluconolactone, Calcium Gluconate] o Affipore [INCI: Barosma Betulina Leaf Extract, Citric Acid], comercializado por Provital, Sweetone [INCI: Saccharide Hydrolysate, Maltodextrin], comercializado por Laboratories Expanscience, Seboxyl [INCI: Ribes Nigrum (Black Currant) Leaf Extract, Rubus Idaeus (Raspberry) Leaf Extract] o Saniskin [INCI: Polygonum Cuspidatum Root Extract, Myristyl Alcohol], comercializado por Solabia, Alpaflor Alp-Sebum [INCI: Epilobium Fleischeri Extract, Citric Acid, Potassium Sorbate] o Regu-Seb [INCI: Argania Spinosa Kernel Extract, Serenoa Serrulata Fruit Extract, Sesamum Indicum (Sesam) Seed Extract], comercializado por DSM, Bodyfensine® [INCI: Acetyl Dipeptide-3 Aminohexanoate], Matmarine™ [INCI: Pseudoalteromonas Ferment Extract], comercializado por Lipotec/Lubrizol, Dermaclarine [INCI: Hydrolyzed Egg Protein (and) Protease] comercializado por Aqua Bio Technology, Linumine [INCI: Linum Usitatissimum (Linseed) Seed Extract], comercializado por Lucas Meyer, Granactive Acne [INCI: Oryza Sativa (Rice) Bran Extract, Boswellia Serrata Extract, Honey Extract, Oligopeptide-10], comercializado por Evonik, Sepicontrol A5 [INCI: Capryloyl Glycine, Sarcosine, Cinnamonium Zeylanicum Bark Extract], comercializado por Seppic, Sympeptide 380 [INCI: Myristoyl Hexapeptide-23] comercializado por Symrise, o Sebaryl [INCI: Niacinamide, Yeast Extract, Aesculus ippocastanum (Horse Chestnunt) Seed Extract, Ammonium Glycyrrhizate, Panthenol, Propylene Glycol, Zinc Gluconate, Caffeine, Biotin], comercializado por Laboratoires Serobiologiques/Cognis/BASF, entre otros.

La composición puede comprender además un agente adicional anti-arrugas y/o anti-envejecimiento seleccionado, por ejemplo y no restringido a, del grupo formado por los extractos o extractos hidrolizados de Vitis vinifera, Rosa canina, Curcuma longa, Theobroma cacao, Ginkgo biloba, Leontopodium alpinum o Dunaliella salina entre otros, Matrixyl® [INCI: Palmitoyl Pentapeptide-4], Matrixyl® 3000® [INCI: Palmitoyl Tetrapeptide-7, Palmitoyl Oligopeptide], Matrixyl® Synthe'6™ [INCI: Glycerin, Water, Hydroxypropyl Cyclodextrin, Palmitoyl Tripeptide-38], Essenskin™ [INCI: calcium hydroxymethionine], Renovage [INCI: teprenone], Resistem™ [INCI: Globularia Cordifolia Ferment], Beautifeye [INCI: Albizia Julibrissin Bark Extract, Darutoside], Meiritage [INCI: Astragalus Membranaceus Root Extract, Atractyloides Macrocephala Root Extract, Bupleurum Falcatum Root Extract], Senestem [INCI: Plantago Lanceolata Leaf Extract], Beautifeye™ [INCI: ALbizia Julibrissin Bark Extract], Venuceane [INCI: Thermus Thermophillus Ferment] o Dermaxyl® [INCI: Palmitoyl Oligopeptide] comercializado por Sederma/Croda, Vialox® [INCI: Pentapeptide-3], Syn®-Ake® [INCI: Dipeptide Diaminobutyroyl Benzylamide Diacetate], Syn®-Coll [INCI: Palmitoyl Tripeptide-5], Fitaluronato [INCI: Locust Bean (Ceratonia siliqua) Gum], Regu-Scence [INCI: Asparagus Officinalis Stem Extract, Sodium Benzoate, Potassium Sorbate, Gluconolactone, Calcium Gluconate], Syn-TC [INCI: Tetradecyl Aminobutyroyl valylaminobutyric Urea Trifluoroacetate, Palmitoyl Tripeptide-5, Palmitoyl Dipeptide-5 Diaminobutyroyl Hydroxythreonine] o Preregen® [INCI: Glycine soja (Soybean) Protein, Oxido Reductases] comercializado por Pentapharm/DSM, Myoxinol™ [In C i: Hydrolyzed Hibiscus esculentus Extract], Syniorage™ [INCI: Acetyl Tetrapeptide-11], Dermican™ [INCl: Acetyl Tetrapeptide-9], Shadownyl [INCI: Algae Extract, Hexylene Glycol, Caprylyl Glycol, Xanthan Gum] o DN AGE™ LS [INCI: Cassia alata leaf Extract] comercializado por Laboratoires Sérobiologiques/Cognis/BASF, Algisum C® [INCI: Methylsilanol Mannuronate], Exage [INCI: lmidazolylethyl Diaminopropanamide] o Hydroxyprolisilane CN® [INCI: Methylsilanol Hydroxyproline Aspartate] comercializado por Exsymol, Argireline® [INCI: Acetyl Hexapeptide-8], SNAP-7 [INCI: Acetyl Heptapeptide-4], SNAP-8 [INCI: Acetyl Octapeptide-3], Serilesine® [INCI: Hexapeptide-10], Leuphasyl® [INCI: Pentapeptide-18], Inyline® [INCI: Acetyl Hexapeptide-30], Aldenine® [INCI: Hydrolized Wheat Protein, Hydrolized Soy Protein, Tripeptide-1], Preventhelia® [INCI: Diaminopropionoyl Tripeptide-33], Decorinyl® [INCI: Tripeptide-10 Citrulline], Decorinol® [INCI: Tripeptide-9 Citrulline], Trylagen® [INCI: Pseudoalteromonas Ferment Extract, Hydrolyzed Wheat Protein, Hydrolyzed Soy Protein, Tripeptide-10 Citrulline, Tripeptide-1], Eyeseryl® [INCI: Acetyl Tetrapeptide-5], Péptido AC29 [lNCI: Acetyl Tripeptide-30 Citrulline], Relistase® [INCI: Acetylarginyltriptophyl Diphenyl glycine], Thermostressine® [INCI: Acetyl Tetrapeptide-22], Lipochroman™ [INCI: Dimethy methoxy Chromanol], Chromabright® [INCI: Dimethylmethoxy Chromanyl Palmitate], Antarcticine® [INCI: Pseudoalteromonas Ferment Extract], dGlyage™ [INCI: Lysine HCl, Lecithin, Tripeptide-9 Citrulline], Vilastene™ [INCI: Lysine HCl, Lecithin, Tripeptide-10 Citrulline], Hyadisine™ [INCI: Pseudoalteromonas Ferment Extract], Hyanify™ [INCI: Saccharide Isomerate], Diffuporine™ [INCI: Acetyl Hexapeptide-37], Silusyne™ [INCI: Soybean (Glycine Soja) Oil, Sorbitan Sesquioleate, Isohexadecane, Sodium Hyaluronate, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolized Soy Protein, Acetyl Hexapeptide-39], Adifyline™ [INCI: Acetyl Hexapeptide-38], Uplevity™ [INCI: Acetyl Tetrapeptide-2], Juveleven™ [INCI: Acetyl Hexapeptide-51 Amide] o Telangyn™ [INCI: Acetyl Tetrapeptide-40] comercializado por Lipotec/Lubrizol, Kollaren® [INCI: Tripeptide-1, Dextran] comercializado por Institut Europeen de Biologie Cellulaire, Collaxyl® IS [INCI: Hexapeptide-9], Laminixyl IS™ [INCI: Heptapeptide], Orsirtine™ GL [INCI: Oryza sativa (Rice) Extract], D'Orientine™ IS [INCl: Phoenix dactylifera (Date) Seed Extract], Phytoquintescine™ [INCI: Einkorn (Triticum monococcum) Extract], Péptido Q10 [INCI: Pentapeptide-34 Trifluoroacetate], Telosense [INCI: Hydrolyzed Yeast Protein, Hydrolyzed Soy Protein] o Quintescine™ IS [INCI: Dipeptide-4] comercializado por Vincience/ISP/Ashland, BONT-L-Peptide [INCI: Palmitoyl Hexapeptide-19] comercializado por Infinitec Activos, Deepaline™ PVB [INCI: Palmitoyl hydrolyzed Wheat Protein] o Sepilift® DPHP [INCI: Dipalmitoyl Hydroxyproline] comercializado por Seppic, Gatuline® Expression [INCI: Acmella oleracea Extract], Gatuline® In-Tense [INCI: Spilanthes acmella Flower Extract] o Gatuline® Age Defense 2 [INCI: Juglans regia (Walnut) Seed Extract] comercializado por Gattefossé, Thalassine™ [INCI: Algae Extract] comercializado por Biotechmarine, ChroNOline™ [INCI: Caprooyl Tetrapeptide-3] o Thimulen-4 [INCI: Acetyl Tetrapeptide-2] comercializado por Atrium/Unipex Innovations, EquiStat [INCI: Pyrus malus Fruit Extract, Glycine soja Seed Extract] o Juvenesce [INCI: Ethoxydiglicol and Caprylic Triglycerid, Retinol, Ursolic Acid, Phytonadione, Ilomastat], Epigenist™ [INCI: Voandzeia Subterranea Seed Extract], lOX-AGE™ [INCI: Cichorium Intybus (Chicory) Leaf Extract] comercializado por Coletica/Engelhard/BASF, Ameliox [INCI: Carnosine, Tocopherol, Silybum marianum Fruit Extract], Phytocelltec Symphytum [INCI: Isomalt, Symphytum Officinale Root Cell Culture, Lecithin, Sodium Benzoate], Polvo de Algas de Nieve [INCI: Chlamydocapsa Extract, Maltodextrin, Lecithin], Dermcom [INCI: Acacia Senegal Gum, Crocus Chyrsanthus Bulb Extract], Anagain [INCI: Pisum Sativum (Pea), Sprout Extract] o PhytoCellTec Malus Domestica [INCI: Malus domestica Fruit Cell Culture] comercializado por Mibelle Biochemistry, Bioxilift [INCI: Pimpinella anisum Extract], Vitagenyl [INCI: Prunus Persica (Peach) Leaf Extract] o SMS Anti-Wrinkle® [INCI: Annona squamosa Seed Extract] comercializado por Silab, Symvital Agerepair [INCI: Zingiber Officinale (Ginger) Root Extract] comercializado por Symrise, Citrustem [INCI: Xanthan Gum, Sodium Benzoate, Gluconolactone, Calcium Gluconate] Melavoid [INCI: Boerhavia Diffusa Root Extract], Darkout [INCI: Hypoxis Rooperi Rhizome Extract, Caesalpinia Spinosa Gum] o Linefill [INCI: Dimethyl Isosorbide, Sesamum Indicum (Sesame) Seed Extract] comercializado por Provital, Adipofill'in [INCI: Ornithine, Phospholipids, Glycolipids], Elix-IR [INCI: Polygonum Aviculare Extract] o Progeline [INCI: Trifluoroacetyl Tripeptide-2] comercializado por Lucas Meyer, Amiperfect [INCI: Gaultheria Procumbens (Wintergreen) Leaf Extract] o Repulpami ER [INCI: Adansonia Digitata Pulp Extract, Hibiscus Sabdariffa Flower Extract] comercializado por Alban Muller, Celloxyl [INCI: Uapaca Bojeri Leaf Extract] o Resistress [INCI: Sophora Japonica Flower Extract] comercializado por Solabia, Actiporine 8G [INCI: Jania Rubens Extract] o EPS Seafill [INCI: Plankton Extract], Lakesis [INCI: Pistacia Lentiscus (Mastic) Gum] comercializado por Codif, Novhyal Biotech G [INCI: Disodium Acetyl Glucosamine Phosphate] o Rubixyl [INCI: Hexapeptide-47] comercializado por Induchem, antagonistas del canal de Ca2+ tales como y no restringido a, alverina, sales de manganeso o magnesio, determinadas aminas secundarias o terciarias, retinol y sus derivados, idebenona y sus derivados, Coenzima Q10 y sus derivados, ácido boswélico y sus derivados, GHK y sus derivados y/o sales, carnosina y sus derivados, enzimas de reparación del ADN tales como y no restringido a, fotoliasa o T4 endonucleasa V, o agonistas del canal de cloro entre otros, y/o mezclas de los mismos.

La composición puede comprender además un agente anti-inflamatorio y/o analgésico seleccionado, por ejemplo y no restringido a, del grupo formado por extracto de madecassoside, extracto de equinácea, aceite de semilla de amaranto, aceite de madera de sándalo, extracto de hoja de melocotonero, extracto de Aloe vera, Arnica montana, Artemisia vulgaris, Asarum maximum, Caléndula officinalis, Capsicum, Centipeda cunninghamii, Chamomilla recutita, Crinum asiaticum, Hamamelis virginiana, Harpagophytum procumbens, Hypericum perforatum, Lilium candidum, Malva sylvestris, Melaleuca alternifolia, Origanum majorana, Origanum vulgare, Prunus laurocerasus, Rosmarinus officialis, Salix alba, Silybum marianum, Tanacetum parthenium, Thymus vulgaris, Uncaria guianensis o Vaccinum myrtillus, ácidos grasos omega-3 y omega-6, Neutrazen™ [INCI: Water, Butylene Glycol, Dextran, Palmitoyl Tripeptide-8] comercializado por Atrium Innovations/Unipex Group, Delisens™ [INCI propuesto: Acetyl Hexapeptide-46] comercializado por Lipotec/Lubrizol, Meliprene® [INCI: Dextran, Acetyl Heptapeptide-1] comercializado por Institut Européen de Biologie Cellulaire/Unipex Group, Skinasensyl™ [INCI: Acetyl Tetrapeptide-15] o Anasensyl™ [INCI: Mannitol, Ammonium Glycyrrhizate, Caffeine, Hippocastanum (Horse Chestnut) Extract], Shawdonyl [INCI: Algae Extract, Hexylene Glycol, Caprylyl Glycol, Xanthan Gum] comercializado por Laboratoires Serobiologiques/Cognis/BASF, MAXnolia [INCI: Magnolia Officinalis Bark Extract, Vitis Vinifera/Vitis Vinifera (Grape) Seed Extract, Tocopherol], CM-Naringenina-Chalcona [INCI: Tetrasodium Tetracarboxymethyl Naringenin chalcone] comercializado por Mibelle, Unisooth [INCI: Propyl Gallate, Gallyl Glucoside, Epigallocathechin Galletyl Glucoside] comercializado por Induchem, Calmosensine™ [INCI: Acetyl Dipeptide-1] comercializado por Sederma/Croda, coenzima Q10 o alquil gliceril éteres.

La composición puede comprender además un agente adicional de firmeza y/o redensificante y/o reestructurante seleccionado, por ejemplo y no restringido a, del grupo formado por extractos de Malpighia punicitolia, Cynara scolymus, Gossypium herbaceum, Aloe Barbadensis, Panicum miliaceum, Morus nigra, Sesamum indicum, Glycine soja, Triticum vulgare, HSC Reafirmante Pronalen® [INCI: Triticum Vulgare, Silybum Marianum, Glycine Soy, Equisetum Arvense, Alchemilla Vulgaris, Medicago Sativa, Raphanus Sativus], Lipout [INCI: Plankton Extract] o Reafirmante Polyplant® [INCI: Coneflower, Asiatic Centella, Fucus, Fenugreek] comercializado por Provital, Lanablue® [INCI: Sorbitol, Algae Extract] comercializado por Atrium Biotechnologies/Unipex Innovations, Pepha®-Nutrix [INCI: Natural Nutrition Factor] comercializado por Pentapharm/DSM, extractos de planta que contienen isoflavonas, Biopéptido ELTM [INCI: Palmitoyl Oligopeptide], Biopéptido CLTM [INCI: Palmitoyl Oligopeptide], Vexel® [INCI: Water (Aqua), Propylene Glycol, Lecithin, Caffeine, Palmitoyl Carnitine], Matrixyl® [INCI: Palmitoyl Pentapeptide-3], Matrixyl® 3000 [INCI: Palmitoyl Tetrapeptide-3, Palmitoyl Oligopeptide] o Bio-BustylTM [INCI: Glyceryl Polymethacrylate, Rahnella Soy Protein Ferment, Water (Aqua), Propylene Glycol, Glycerin, PEG-8, Palmitoyl Oligopeptide] comercializado por Sederma/Croda, Dermosaccharides® HC [INCI: Glycerin, Water (Aqua), Glycosaminoglycans, Glycogen], Aglycal® [INCI: Mannitol, Cyclodextrin, Glycogen, Aratostaphylos Uva Ursi Leaf Extract], Cytokinol® LS [INCI: Hydrolyzed Casein, Hydrolyzed Yeast Protein, Lysine HCl] o Firmiderm® LS9120 [INCI: Terminalia Catappa Leaf Extract, Sambucus Negra Flower Extract, PVP, Tannic Acid] comercializado por Laboratoires Serobiologiques/Cognis/BASF, Liftline® [INCI: Hydrolyzed Wheat Protein], Raffermine® [INCI: Hydrolyzed Soy Flour] o Ridulisse C® [Hydrolyzed Soy Protein] comercializado por Silab, Serilesine® [INCI: Hexapeptide-10], Decorinyl™ [INCI: Tripeptide-10 Citrulline], Trylagen® [INCI: Pseudoalteromonas Ferment Extract, Hydrolyzed Wheat Protein, Hydrolyzed Soy Protein, Tripeptide-10 Citrulline, Tripeptide-1], Silusyne™ [INCI: Soybean (Glycine Soja) Oil, Sorbitan Sesquioleate, Isohexadecane, Sodium Hyaluronate, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolized Soy Protein, Acety1Hexapeptide-39] o Adifyline™[INCI: Acetyl Hexapeptide-38] comercializado por Lipotec/Lubrizol, Ursolisome® [INCI: Lecithin, Ursolic Acid, Atelocollagen, Xanthan Gum, Sodium Chondroitin Sulfate], Eperulina [INCI: Maltodextrin, Eperua Falcata Bark Extract] o Collalift® [INCI: Hydrolyzed Malt Extract] comercializado por Coletica/Engelhard/BASF, Syn®-Coll [INCI: Palmitoyl Tripeptide-5] comercializado por Pentapharm/DSM, Hydriame® [INCI: Water (Aqua), Glycosaminoglycans, Sclerotium Gum] comercializado por Atrium Biotechnologies/Unipex Innovations, Esfingoquina Np [INCI: Caprooyl Phytosphingosine] comercializado por Evonik, complejo Body3 [INCI: Bentonite, Butyrospermum Parkii (Shea) Nut Extract, Persea Gratissima (Avocado) Fruit Extract] comercializado por Lucas Meyer, Prosynergen DF [INCI: Lactobacillus/Ulkenia Amoeboidea Ferment Extract Filtrate] comercializado por Lonza o IP2000 [INCI: Dextran, Trifluoroacetyl Tripeptide-2] comercializado por Institut Europeen de Biologie Cellulaire/Unipex Innovations, entre otros.

La composición puede comprender además un agente que reduce el contenido de triglicéridos de los adipocitos, un agente que retrasa la diferenciación de los adipocitos, un agente anti-celulitis, un agente lipolítico, un agente venotónico, un agente que inhibe la expresión de PGC-1a o un agente que inhibe la actividad de PPARy. Dichos agentes pueden seleccionarse, por ejemplo y no restringidos a extractos o extractos hidrolizados de Alchemilla vulgaris, Angelica sinensis, Armeniacea sp., Arnica montana L, Atractylodis platicodon, bambú, Betula alba, Bupleurum chinensis, Calendula officinalis, cangzhu, Cecropia obtusifolia, Celosia cristata, Centella asiatica, Chenopodium quinoa, Chrysanthellum indicum, Cimifuga racemosa, Citrus aurantium amara, Cnicus benedictus, Coffea arabica, Cola nipida, Coleus barbatus, Coleus blumei, Coleus esquirolii, Coleus forskohlii, Coleus scutellaroides, Coleus sp., Coleus xanthantus, Commiphora myrrha, Crithmum maritimum, Cuminum cyminum, Dioscorea colettii, Dioscorea villosa, Eugenia caryophyllus, Filipendula ulmaria L, Foeniculum vulgare, Fucus vesiculosus, Gelidium Cartilagineum, Ginkgo biloba, ginkgo biloba, Glycine max, Glycyrrhiza glabra, Hedera helix (extracto de hiedra), Hibiscus sabdariffa, Hordeum vulgare, Humulus lupulus, Hyperycum perforatum, Ilex paraguariensis, Kigelia africana, Laminaria digitata, Lupinus perennis, Nelumbium speciosum, Orthosiphon stamincus benth, Panax ginseng, Paullinia cupana, Peumus boldus, Phyllacantha fibrosa, Piper methysticum, Piper nigrum, Prunella vulgaris, Prunus amygdalus dulcis, Rosmarinus officinalis, Rubus idaeus, Ruscus aculeatus (extracto de rusco), Salvia officinalis L, Sambucus nigra, Serenoa repens, Smilax aristolochiaefolia, Spirulina platensis algae, Taraxacum erythrospermum, Taraxacum officinale, té verde, Ulmus rubra, Uncaria tomentosa, Verbena officinalis, Vitex agnus-castus, Dysmorphococcus globosus, entre otros, alverina, citrato de alverina, dihidromiricetina, coenzima A, lipasa, cerulenina, rutina, glaucina, esculina, visnadina, cafeína, teofilina, teobromina, aminofilina, xantina, carnitina, forscolina, escina, ruscogenina, hederina, yoduro de trietanolamina, agentes inductores de la síntesis de AMPc, Lanachrys® [INCI: Chrysanthellum Indicum Extract] comercializado por Atrium/Unipex, Slim-Excess™ [INCI: Water, Butylene Glycol, Sodium Chloride, Hydrolyzed Carrageenan, Xanthan Guiri], Sveltine™ [INCI: Water, Butylene Glycol, Carnitine, Lecithin, Caffeine, Carbomer, Salicylic Acid, Atelocollagen, Centella Asiatica Extract, Esculin, Sodium Chondroitin Sulfate], Peru Liana [INCI: Uncaria Tomentosa Extract] o Flavenger™ [INCI: Caprylic/Capric Triglyceride, Silica Dimethyl Silylate, Glyceryl Oleate, Quercetin Caprylate] comercializado por BASF, Scopariane [INCI: Sphacelaria Scoparia], Phyco R75 [INCI: Laminaria Digitata], Pheoslim [INCI: Phyllacantha Fibrosa Extract], Cera de trigo sarraceno [INCI: Polygonum fagopyrum] o Areaumat Samphira [INCI: Crithmum Maritimum Extract], Actiporina 8.G [Glycerine, Aqua, Jania rubens Extract] comercializado por Codif, Factor Adelgazante Karkade™ [INCI: Hibiscus Sabdariffa] comercializado por Cosmetochem, Liposuctionina [INCI propuesto: Acetyl Hexapeptide] comercializado por Infinitec Activos, Xantalgosil C® [INCI: Acefylline Methylsilanol Mannuronate], Theophyllisilane C® [INCI: Methylsilanol Carboxymethyl Theophylline Alginate], Glutrapeptide® [INCI: Pyroglutamyl amidoethyl Indole] o Cafeisilano C [INCI: Siloxanetriol Alginate, Caffeine, Butylene Glycol] comercializado por Exsymol, Timiline® INCI: Polyglucuronic acid] comercializado por Greentech, Visnadina [INCI: Visnadina] o Flavonoides Diméricos de Ginkgo Biloba Fitosoma [INCI: Phospholipids, Ginkgo Biloba Leaf Extract] comercializado por Indena, Slimfit® LS 9509 [INCI: Cecropia Obtusifolia Bark Extract] comercializado por Laboratoires Serobiologiques/Cognis/BASF, Silusyne™ [INCI: Soybean (Glycine Soja) Oil, Sorbitan Sesquioleate, Isohexadecane, Sodium Hyaluronate, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolized Soy Protein, Acety1Hexapeptide-39] o Liporeductyl® [INCI: Water, Glycerin, Lecithin, Caffeine, Butcherbroom (Ruscus Aculeatus) Root Extract, Maltodextrin, Silica, Tea-Hydroiodide, Propylene Glycol, Ivy (Hedera Helix) Extract, Carnitine, Escin, Tripeptide-1, Xanthan Gum, Carrageenan (Chondrus Crispus), Disodium EDTA] comercializado por Lipotec/Lubrizol, Complejo Iso-Slim [INCI: Soy Isoflavones, Caffeine, Carnitine, Spirulina Platensis Extract, Polysorbate 80, Alcohol, Phenoxyethanol, Aqua], Happybelle-PE [INCI: Lecithin, Vitex Agnus Castus Extract, Glycerin, Ascorbyl Tetraisopalmitate, Tocopherol, Caprylic/Capric Triglyceride, Cyclodextrin, Alcohol, Water] o AmaraShape [INCI: Lecithin, Caffeine, Citrus Aurantium Amara Extract, Pentylene Glycol, Alcohol, Water] comercializado por Mibelle Biochemistry, Regu®-Slim [INCI: Maltodextrin, Caffeine, Paullinia Cupana Seed Extract, Carnitine, Microcrystalline Cellulose, Cysteic Acid, Pantheine Sulfonate] o Regu®-Shape [INCI: Isomerized Linoleic Acid, Lecithin, Glycerin, Polysorbate 80] comercializado por Pentapharm/DSM, Provislim™ [INCI: Propanediol, Water (Aqua), Fisetin, Raspberry Ketone], Miricelina [INCI: Dihydromyricetin], Drenalip [INCI: Ruscus Aculeatus Root Extract, Citrus Medica Limonum Peel Extract, Solidago Virgaurea Extract, Astragalus Membranaceus Root Extract] o Lipout™ [INCI: Plankton Extract] comercializado por Provital, Actisculpt [INCI: Commiphora Myrrha Extract, Coleus Forskohlii Root Extract] comercializado por Givaudan, ^{Perfeline® [INCI: Water, Carnitine, Caffeine, Ruscus Aculeatus Extract] o CellActive® Shape} [iNcI: ^Chlorella Vulgaris/Lupinus Albus Protein Ferment, Coleus Forskohlii, Caffeine] comercializado por Rahn, ProContour™ [INCI: Water, Alcohol, Lecithin, Caffeine, Carnitine, Centella Asiatica Leaf Extract, Potassium Phosphate, Coleus Forskohlii Root Extract] comercializado por Rovi Cosmetics, Unislim™ [INCI: Ilex Paraguariensis (Leaf) Extract, Water, Butylene Glycol, Coffea Arabica (Coffee) Seed Extract (Bean), PEG-60 Almond Glycerides, Glycerin, Cetyl Hydroxyethylcellulose], Redulite™ [INCI: Glycerin, Aqua, Ethoxydiglycol, Sambucus Nigra, Sodium Polyacrylate], Pleurimincyl™ [INCI: Caffeine, Bupleurum Chinensis extract], Phytotal™ SL [INCI: Glycerin, Verbena Officinalis Extract, Butylene Glycol, Sambucus Nigra Flower Extract, Eugenia Caryophyllus (Clove) Flower Extract, Lecithin], Phytosonic™ [INCI: Aqua, Euglena Gracilis Extract, Caffeine, Glaucium Flavum Leaf Extract], Ovaliss™ [INCI: Glycerin, Aqua, Coco-glucoside, Caprylyl Glycol, Alcohol, Glaucine], Lipocare™ [INCI: Caffeine, Coenzym A, Bupleurum Chinensis extract], Cyclolipase™ [INCI: Glyceryl Polymethacrylate, Water, Caffeine, Lipase, Adenosine Phosphate], Coaxel™ [INCI: Caffeine, Coenzyme A, Carnitine, Water, Glycerin], Bodyfit™ [INCI: Glycerin, Aqua (Water), Coco-Glucoside, Caprylyl Glycol, Alcohol, Glaucine], Intenslim™ [iNci: Globularia Cordifolia Callus Culture Extract, Zingiber Zerumbet Extract, Caffeine] o Vexel [INCI: Aqua, Propylene glycol, Lecithin, Caffeine, Palmitoyl carnitine] comercializado por Sederma/Croda, Voluform [INCI: Palmitoyl isoleucine], Adipoless [INCI: Butylene Glycol, Chenopodium Quinoa Seed Extract] comercializado por Seppic, Slimactive® [INCI: Peumus Boldus Leaf Extract], Remoduline® [INCI: Citrus Aurantium Amara Flower Extract], Pro-Sveltyl [INCI: Nelumbium Speciosum Extract], Biosculptine® [INCI: Hydrolyzed Celosia Cristata Flower/Seed Extract, Hydrolyzed Prunella Vulgaris Extract], Affiness® [INCI: Hydrolyzed Coriandrum Sativum Fruit Extract, Citrus Aurantium Dulcis (Orange) Fruit Extract] o Stemsvelt [INCI: Water, Butylene Glycol, Silybum marinum extract] comercializado por Silab, Delipidol [INCI: Tyrosyl Punicate], Guaraslim® [INCI: Butylene Glycol, Water, Caffeine, Paullinia Cupana Seed Extract, Ptychopetalum Olacoides Bark Extract] o Caobromine®[INCI: Theobroma Cocoa Shell Extract] comercializado por Solabia, Abdoliance [INCI: Sucrose palmitate, Polysorbate 20, Glyceryl Linolenate, Paullinia Cupana Seed Extract, Maltodextrin, Prunus Amygdalus Dulcis (Sweet Almond) Oil, Lecithin, Water, Citrus Aurantium Amara (Bitter Orange) Peel Extract, Phenoxyethanol, Tocopherol], Betafrolina [INCI: Tephrosia Purpurea Seed Extract] o PRO-DG [INCI: Water, Plankton extract] comercializado por Soliance, UCPeptide™ V [iNci: Water, Butylene Glycol, Pentapeptide] o ATPeptide™ IS [INCI: Tripeptide-3] comercializado por Vincience/ISP entre otros, o mezclas de los mismos.

La composición puede comprender al menos un extracto adicional con propiedades anti-edema y mejorar la permeabilidad vascular/microcirculación, por ejemplo, elegido de Legactif [INCI: Ruscus Aculeatus Root Extract, Citrus Limon (Lemon) Peel Extract, Solidago Virgaurea (Goldenrod) Extract comercializado por Provital, Legance™ [INCI: Zingiber Zerumbet Extract] y Eyeliss [INCI: Hesperidin Methyl Chalcone, Dipeptide-2, Palmitoyl Tetrapeptide-7] comercializado por Sederma/Croda, Silidine® [INCI: Prophyridium Cruentum Exsudate] comercializado por Greentech, Biophytex [INCI: Escin, Ruscus Aculeatus Root Extract, Ammonium Glycyrrhizate, Centella Asiatica Extract, Hydrolyzed Yeast Protein, Calendula Officinalis Flower Extract] comercializado por L. Sérobiologiques/BASF, Cytobiol Lumin-Eye [INCI: Niacinamide, Franxius Excelsior Bark Extract, Silanetriol Potassium Citrate] comercializado por Gattefossé, Regu®-Age [INCI: Hydrolyzed Rice Protein, Oxido Reductases, Glycine Soja (Soyben) Protein] comercializado por DSM.

La composición puede comprender al menos un extracto adicional con actividad despigmentante tales como, por ejemplo y en un sentido no limitante, extractos de Achillea millefolium, Aloe vera, Azadirachta indica, Osmunda japónica, Artocarpus incisus, Bidens pilosa, Broussonetia papyrifera, Chlorella vulgaris, Cimicifuga racemosa, Emblica officinalis, Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza uralensis, Ilex purpurea, Ligusticum lucidum, Ligusticum wallichii, Mitracarpus scaber, Morinda citrifolia, Morus alba, Morus bombycis, Naringi crenulata, Prunus domesticus, Pseudostellariae radix, Rumex crispus, Rumex occidentalis, Sapindus mukurossi, Saxífraga sarmentosa, Scutellaria galericulata, Sedum sarmentosum Bunge, Stellaria medica, Triticum Vulgare, Uva ursi o Withania somnifera, entre otros, y/o al menos un compuesto, extracto o producto sintético derivado de un proceso de biofermentación con actividad despigmentante tal como, por ejemplo y en un sentido no limitante, Actiwhite™ LS9808 [INCI: Aqua, Glycerin, Sucrose Dilaurate, Polysorbate 20, Pisum sativum (Pea) extract], Dermawhite® NF LS9410 [INCI: Mannitol, Arginine HCl, Phenylalanine, Disodium EDTA, Sodium Citrate, Kojic Acid, Citric Acid, Yeast Extract] o Radianskin™ [INCI: Hydroxyphenoxy Propionic Acid] comercializado por Laboratoires Serobiologiques/BASF, Lumiskin™ [INCI: Caprylic/Capric Triglyceride, Diacetyl-Boldine], Melaclear™ [INCI: Glycerin, Aqua, Dithiaoctanediol, Gluconic acid, Sutilains, Beta-carotene] o Etioline™ [INCI: Glycerin, Butylene Glycol, Arctostaphylos uva ursi Leaf Extract, Mitracarpus scaber Extract], O.D.A. White™ [INCI: Octadecenedioic Acid], Wonderlight™ [INCI: Humulus Lupulus (Hops) Strobile] comercializado por Sederma, Sepiwhite™ MSH [INCI: Undecylenoyl Phenylalanine] o Seashine [INCI: Algae Extract, Undaria Pinnatifida Extract] comercializado por Seppic, Achromaxyl [INCI: Aqua, Brassica napus extract] comercializado por Vincience, Gigawhite™ [INCI: Aqua, Glycerin, Malva sylvestris (Mallow) Extract, Mentha piperita Leaf Extract, Prímula veris Extract, Alchemilla vulgaris Extract, Veronica officinalis Extract, Melissa officinalis Leaf Extract, Achillea millefolium Extract], Melawhite® [INCI: Leukocyte Extract, AHA] (extracto de leucocitos, alfa hidroxi ácidos), Melfade®-J [INCI: Aqua, Arctostaphylos uva-ursi Leaf Extract, Glycerin, Magnesium Ascorbyl Phosphate] o Regu®-Fade [INCI: Resveratrol] comercializado por Pentapharm/DSM, Albatin® [INCI: Amino ethyl phosphoric Acid, Butylene Glycol, Aqua] comercializado por Exsymol, TyrostatTM-11 [INCI: Aqua, Glycerin, Rumex occidentalis Extract] o Melanostatine®-5 [INCI: Dextran, Nonapeptide-1] comercializado por Atrium/Lucas Meyer, 13-White [INCI: Oligopeptide-68] comercializado por Unipex, Darkout™ [INCI: Hypoxis Rooperi Rhyzome Extract, Caesalpina Spinosa Gum] comercializado por Provital, Vivillume™ [INCI: Strelitzia Nicolai Seed Aril Extract] comercializado por Lonza, Superox-C™ [INCI: Terminalia Ferdinandiana Fruit Extract] comercializado por Lucas Meyer, arbutina y sus isómeros, ácido kójico y derivados del mismo, vitamina C y derivados de la misma tales como, por ejemplo y en un sentido no limitante, ácido 6-O-palmitoilascórbico, ácido dipalmitoilascórbico, sal de magnesio de ácido ascórbico-2-fosfato (MAP), sal de sodio de ácido ascórbico-2-fosfato (NAP), ascorbil glucósido o ascorbil tetraisopalmitato (VCIP) entre otros, retinol y derivados del mismo incluyendo tretinoína e isotretinoína, idebenona, ácido hidroxibenzoico y derivados del mismo, flavonoides, extracto de soja, extracto de limón, extracto de naranja, extracto de ginkgo, extracto de pepino, extracto de geranio, extracto de gayuba, extracto de algarroba, extracto de canela, extracto de mejorana, extracto de romero, extracto de clavel, extracto soluble de orozuz, extracto de hoja de zarzamora, niacinamida, liquiritina, resorcinol y derivados del mismo, hidroquinona, a-tocoferol, Y-tocoferol, ácido azelaico, resveratrol, sales de mercurio, ácido linoleico, ácido a-lipoico, ácido dihidrolipoico, alfa hidroxi ácidos, beta hidroxi ácidos, ácido elágico, ácido ferúlico, ácido cinámico, ácido oleanólico, aloesina y derivados de los mismos y/o inhibidores de serina proteasa tales como, por ejemplo y en un sentido no limitante, triptasa, tripsina o inhibidores de PAR-2, entre otros.

La composición puede comprender un agente adicional para estimular la síntesis de macromoléculas dérmicas o epidérmicas seleccionadas, por ejemplo y no restringido a, del grupo formado por agentes que estimulan la síntesis de colágeno, agentes que estimulan la síntesis de elastina, agentes que estimulan la síntesis de decorina, agentes que estimulan la síntesis de laminina, agentes que estimulan la síntesis de chaperona, agentes que estimulan la síntesis de sirtuina, agentes que activan la sirtuina, agentes que modulan la síntesis de acuaporina, agentes que estimulan la síntesis de fibronectina, agentes que inhiben la degradación de colágeno, agentes que inhiben la degradación de elastina, agentes que inhiben serina proteasas tales como calicreínas, elastasa de leucocitos o catepsina G, agentes que estimulan la proliferación de fibroblastos, agentes que estimulan la proliferación de adipocitos, agentes que aceleran o retrasan la diferenciación de adipocitos y agentes que reparan el ADN y/o agentes protectores del ADN, tales como y no restringido a extractos de Centella asiatica, Saccharomyces cerivisiae, Solanum tuberosum, Rosmarinus officinalis, Vaccinium angustifolium, extracto del alga Macrocystis pyrifera, Padina pavonica, extracto de soja, malta, lino, salvia, clavel rojo, kakkon, plantas de altramuz blanco, extracto de avellana, extracto de maíz, extracto de levadura, extractos de brote de haya, extracto de semilla de leguminosas, extracto de hormona de planta tal como giberelinas, auxinas o citoquininas, entre otros, o extracto de zooplancton salino, el producto de fermentación de la leche con Lactobacillus bulgaricus, asiaticósidos y sus derivados, vitamina C y sus derivados, ácido cinámico y sus derivados, Matrixyl® [INCI: Palmitoyl Pentapeptide-3], Matrixyl® 3000 [INCI: Palmitoyl Tetrapeptide-3, Palmitoyl Oligopeptide] o Biopeptide CLTM [INCI: Glyceryl Polymethacrylate, Propylene Glycol, Palmitoyl Oligopeptide] comercializado por Sederma/Croda, Antarcticine® [INCI: Pseudoalteromonas Ferment Extract], Decorinyl® [INCI: Tripeptide-10 Citrulline], Serilesine® [INCI: Hexapeptide-10], Lipeptide [INCI: Hydrolized Vegetable Protein], Aldenine® [INCI: Hydrolized Wheat Protein, Hydrolized Soy Protein, Tripeptide-1], Relistase™ [INCI: Acetylarginyltriptophyl Diphenyl glycine], Thermostressine™ [INCI: Acetyl Tetrapeptide-22], Péptido AC29 [INCI: Acetyl Tripeptide-30 Citrulline], Diffuporine™ [INCI: Acetyl Hexapeptide-37], Silusyne™ [INCI: Soybean (Glycine Soja) Oil, Sorbitan Sesquioleate, Isohexadecane, Sodium Hyaluronate, Lauryldimonium Hydroxypropy1Hydrolized Soy Protein, Acetyl Hexapeptide-39] o Adifyline™[INCI: Acetyl Hexapeptide-38] comercializado por Lipotec/Lubrizol, Drieline® PF [INCI: Yeast Betaglucan] comercializado por Alban Muller, Phytovityl C® [INCI: Aqua, Zea Mays Extract] comercializado por ^{Solabia, Collalift® [INCI: Hydrolyzed Malt Extract] comercializado por Coletica/Engelhard/BASF, Phytocohesine} PsPtm [INCI: Sodium Beta-Sitosterol Sulfate] comercializado por Vincience/ISP/Ashland, Neodermyl® [INCI: Methyl Glucoside Phosphate Proline Lysine Copper Complex], minerales tales como calcio, entre otros, retinoides y sus derivados, isoflavonoides, carotenoides, en particular licopeno, pseudodipéptidos, retinoides y sus derivados tales como retinol o palmitato de retinilo, entre otros, o heparinoides, entre otros.

También se desvela en el presente documento el uso del extracto de fermento como se describe en el presente documento en la preparación de una composición cosmética para el tratamiento y/o cuidado cosmético de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. El tratamiento y/o cuidado cosmético son como se describe en el presente documento.

En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona el uso del extracto de fermento de la invención para el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas, en el que el extracto de fermento está presente en una composición como se describe en el presente documento. De esta manera el cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente eficaz del extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum para el tratamiento y/o cuidado cosmético de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas. La composición cosmética puede ser como se describe en el presente documento. El tratamiento y/o cuidado cosmético son como se describe en el presente documento.

En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento cosmético no terapéutico de tratamiento y/o cuidado de la piel que comprende la administración de una cantidad cosméticamente eficaz del extracto de fermento en la piel. El tratamiento y/o cuidado cosmético son como se describe en el presente documento. En una realización, la administración es tópica. En una realización, la administración es transdérmica. En una realización, la aplicación tópica o transdérmica se lleva a cabo por iontoforesis, sonoforesis, electroporación, presión mecánica, gradiente de presión osmótica, cura oclusiva, microinyecciones, por inyecciones sin aguja mediante presión, por parches microeléctricos, máscaras faciales o cualquier combinación de éstos. En este aspecto de la invención, el extracto de fermento puede estar presente en una composición cosmética, por ejemplo las composiciones cosméticas descritas en el presente documento. De esta manera la invención proporciona un procedimiento cosmético no terapéutico de tratamiento y/o cuidado de la piel que comprende la administración de una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente eficaz del extracto de fermento en la piel.

La frecuencia de la aplicación o administración de la cantidad cosméticamente eficaz del extracto de fermento puede variar ampliamente, dependiendo de las necesidades de cada sujeto, sugiriendo un intervalo de aplicación o administración de una vez al mes a 10 veces al día, de una vez a la semana a 4 veces al día, de tres veces a la semana a tres veces al día, o una vez o dos veces al día.

También se desvela en el presente documento un procedimiento de estimulación de la síntesis de colágeno o elastina que comprende la administración de una cantidad cosméticamente eficaz del extracto de fermento en las células de fibroblastos dérmicos humanos (piel).

DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

La cepa de la especie Eupenicillium crustaceum se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino 9, 46980 Paterna, Valencia, España) en las condiciones del Tratado de Budapest. El depósito se hizo el 20 de marzo, 2014 y el número de depósito fue CECT-20901.

Excepto en los Ejemplos, o donde se indique explícitamente otra cosa, todas las cantidades numéricas en esta descripción que especifican cantidades de materiales, condiciones de reacción, pesos moleculares, número de átomos de carbono y similares deben entenderse como aproximadas, es decir, sujetas a una variabilidad de ± 5 %, ± 3 %, ± 1 %, ± 0,1 %, o ± 0,01 % sobre el valor indicado. Debe entenderse que los límites superior e inferior de cantidad, intervalo y proporción mostrados en el presente documento pueden combinarse independientemente. De manera similar, los intervalos y cantidades para cada elemento de la tecnología descrita en el presente documento pueden usarse junto con intervalos o cantidades para cualquiera de los demás elementos.

La invención se ilustrará a continuación por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación del extracto de fermento producido por la cepa del Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901.

A) Procedimiento de cultivo de la cepa del Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901.

La cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901 se cultiva en un fermentados a 25 °C y a un pH de 7,5, en un medio de cultivo que contiene agua, 5 g/l de manitol como fuente de carbono, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de peptona de soja como fuentes de carbono y nitrógeno y 30 g/l de sales marinas. El medio de cultivo se inocula con un 5 % en volumen de pre-cultivo en crecimiento. La fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 1 semana, tiempo durante el cual el cultivo se alimenta con un suministro de aire suficiente y se agita a velocidades de agitación de entre 150 y 350 rpm.

B) Aislamiento del extracto de fermento producido por la cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901.

Las células de Eupenicillium crustaceum se separan del caldo de fermentación producido por la etapa A), por centrifugación continua a aproximadamente 10.000 g. El caldo del sobrenadante se desecha y las células de Eupenicillium crustaceum se resuspenden con tampón ringer % (cloruro de sodio 2,25 g/l, cloruro de potasio 0,105 g/l, cloruro de calcio hexahidrato 0,12 g/l e hidrógeno carbonato de sodio 0,05 g/l). Después de esto, las células se rompen usando una prensa French, con 2 ciclos de operación a 40 KPsi. A continuación, el caldo roto se extrae con isopropanol (con una proporción de volumen de isopropanol:caldo roto de 4,7:1,0) en un recipiente agitado durante 3 h. Después, se lleva a cabo la purificación del extracto por rotaevaporación del extracto a una temperatura de 40-50 °C. Se obtiene el peso seco de una muestra del extracto secando el extracto (líquido) a 110 °C hasta que se consigue un peso constante. Específicamente, se secaron 2 ml del extracto a 110 °C hasta que se consigue un peso constante. El peso constante del extracto seco se usó para calcular la concentración en peso seco del extracto (peso seco de la muestra dividido por el peso de la muestra). Esto proporciona un valor de 10 % (P/P). En los ejemplos, a no ser que se especifique otra cosa, el extracto de fermento se usa en forma líquida (es decir, no secado) y, cuando se hace referencia el peso del extracto, esto es el peso seco equivalente del extracto. El extracto líquido se mantiene a una temperatura de -20 °C hasta su uso adicional.

Ejemplo 2: Caracterización físico-química del extracto de fermento producido por la cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901.

Para la caracterización físico-química del extracto de fermento, se llevan a cabo análisis de aminoácidos libres y péptidos, análisis de carbohidratos (procedimiento fenol-sulfúrico) y análisis del contenido de lípidos para tres lotes diferentes del extracto de la cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901. El Lote 1 se obtiene de acuerdo con el ejemplo 1. Los Lotes 2 y 3 se obtienen según el protocolo descrito en el Ejemplo 1, siendo la única diferencia el uso de centrifugación discontinua equivalente a las condiciones de centrifugación continua descritas en el Ejemplo 1.

Análisis de aminoácidos libres y péptidos

Se usa el mismo procedimiento para el análisis de aminoácidos libres y péptidos, con la diferencia de que, para los aminoácidos libres, no se realiza la hidrólisis (parte i), mientras que para los péptidos sí se realiza.

i. Hidrólisis

Los tres lotes del extracto de fermento de la cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901 tienen los pesos secos siguientes: el Lote 1 tiene una concentración en peso seco del 10 % (P/P); el Lote 2 tiene una concentración en peso seco del 18,4 % (P/P); el Lote 3 tiene una concentración en peso seco del 19,9 % (P/P).

Para cada lote, se ponen 25 mg del extracto en un tubo de hidrólisis limpio de 10 ml. Se añade 1 ml de 6N HCl 0,5 % fenol y la mezcla se calienta hasta 110 °C durante 24 horas. Después de esto, la muestra hidrolizada se liofiliza y se resuelve en 3 ml de HCl 20 mM.

ii. Derivatización de aminoácidos.

Se usa el ACCQ-TAG Chemistry Package, basado en reactivos AccQ-Fluor (por WATERS Cromatografia, SA) para analizar los aminoácidos. Precalentar un bloque calefactor hasta 55 °C. Tapar el Vial 2A ligeramente antes de abrir para asegurar que todo el Polvo de Reactivo AccQ Fluor está en la parte inferior del vial. Aclarar una micropipeta limpia tomando y desechando 1 ml de Diluyente de Reactivo AccQ-Fluor del Vial 2B. Transferir 1 ml de Diluyente de Reactivo AccQ-Fluor del Vial 2B al Polvo de Reactivo AccQ-Fluor en el Vial 2A. Tapar el vial 2A ligeramente y agitar con vórtex durante 10 segundos. El Reactivo AccQ-Fluor reconstituido puede almacenarse a temperatura ambiente en un desecador durante hasta una semana. Después de esto, deben derivatizarse los estándares de calibración (que contienen entre 2-100 pmol/jl de cada aminoácido, excepto cisteína que está a 1-50 pmol/jl). Añadir 10 |jl del estándar de calibración a la parte inferior de un tubo de muestra limpio y añadir 70 j l de Tampón Borato AccQ.Fluor al tubo de muestra y agitar con vórtex brevemente. Después de esto, añadir 20 j l del Reactivo AccQ.Fluor reconstituido al tubo de muestra y agitar con vórtex durante varios segundos. Incubar la mezcla durante 1 minuto a temperatura ambiente y calentar el vial durante 10 minutos a 55 °C.

Se sigue el mismo procedimiento con la muestra (sustituir el estándar de calibración por la muestra hidrolizada). La columna usada para el análisis es una Columna AccQ-Fluor (por WATERS) y los eluyentes son A) AccQ-Fluor Eluyente A y B) agua/acetonitrilo (40:60). El gradiente de elución empieza a 0 % de B y en 0,2 minutos se aumenta hasta 2 % de B. Después, en el minuto 15, la concentración de B se eleva hasta 7 % y, en el minuto 19, hasta 10 % de B. La concentración de B continúa incrementándose y, en el minuto 32, la concentración de B es 33 %. Después, la concentración permanece estable durante 1 minuto y, después de esto, la concentración de B se aumenta hasta 100 % en un minuto. El 100 % de B se mantiene constante durante tres minutos con el fin de lavar la columna y finalmente la concentración se baja de nuevo hasta 0 % con el fin de empezar de nuevo. El flujo es constante durante todo el análisis (1 ml/min) y la detección se hace en un Detector de Fluorescencia (Aex = 250 nm; Aem = 395 nm). El volumen de inyección es 10 pl y la temperatura del horno es 37 °C.

La concentración de aminoácidos libres (muestra no hidrolizada) y péptidos (concentración total a partir de la que puede deducirse la concentración de aminoácidos libres) se calcula tomando como base los patrones de calibración.

Análisis de carbohidratos (procedimiento fenol-sulfúrico)

Se disuelven diferentes patrones de glucosa en agua a diferentes concentraciones (entre 20 y 500 pg/ml). Separadamente, se disuelven 500 mg de fenol en 10 ml de agua con el fin de preparar una solución de fenol al 5 %. Cada lote del extracto de fermento de la cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901, se prepara a 10 mg/ml en agua. Después, a 100 pl de esta solución (o uno de los patrones), se añaden 100 pl de la solución de Fenol al 5 %. La solución resultante se mezcla y se añaden 500 pl de ácido sulfúrico. Después de mezclar, la solución de reacción se incuba a 40 °C durante 30 minutos. Después de esto, la reacción se mantiene a temperatura ambiente durante 15-20 minutos y se lee la absorbancia a 490 nm. Con la base de la calibración realizada con los patrones de glucosa, se calcula la concentración de carbohidratos de la muestra.

Análisis del contenido de lípidos (ensayo de extracción con hexano)

Se disuelven 5 g de cada uno de los Lotes 1,2 y 3 en 10 ml de hexano. Esta solución se somete a ultrasonidos durante 10 minutos y se mezcla en un vórtex durante 5 minutos. Después de esto, la solución se centrifuga a 4.000 rpm durante 10 minutos con el fin de separar el sólido. La fase líquida se recupera y el sólido se lava dos veces con 5 ml de hexano con el fin de extraer todos los lípidos y se desecha. Las fases orgánicas se mezclan y se evaporan a través de un flujo de nitrógeno. Después de esto, el sólido obtenido de la extracción se seca toda la noche en un liofilizador y se pesa. La concentración de lípidos de la muestra se calcula como el porcentaje de sólido pesado extraído de la muestra total pesada.

Análisis del contenido de lípidos (ensayo dicromato)

Este procedimiento es una alternativa al ensayo de extracción con hexano anterior y es útil cuando hay pequeñas cantidades de muestra. Se disuelven 30 mg de cada uno de los Lotes 1, 2 y 3 en 2,5 ml de hexano. Esta solución se somete a ultrasonidos durante 10 minutos y se mezcla en un vórtex durante 5 minutos. Después de esto, la solución se centrifuga a 4.000 rpm durante 10 minutos con el fin de separar el sólido. La fase líquida se recupera y el sólido se lava dos veces con 5 ml de hexano con el fin de extraer todos los lípidos y se desecha. Las fases orgánicas se mezclan y se evaporan a través de un flujo de nitrógeno. Después de esto, se añaden 3 ml de una solución reactiva (2,5 g de K2Cr2O7 se disuelven en 1 l de H2SO436 N) y se calienta hasta 100 °C durante 45 minutos, mezclando tres veces a diferentes tiempos. La muestra se enfría hasta temperatura ambiente y una alícuota de 0,2 ml se diluye en 2,5 ml de agua. Después de esto, se lee la absorbancia a 350 nm y se resta de un blanco (el mismo tratamiento pero sin muestra). La diferencia es proporcional a la cantidad de lípidos. Se usa una muestra estándar con el fin de calcular los lípidos en las muestras en las que se desconoce el contenido de lípidos comparando la diferencia de absorbancia.

Los resultados de los análisis de aminoácidos libres y péptidos, análisis de carbohidratos y análisis del contenido de lípidos realizados para los tres lotes diferentes de la cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901 se presentan en la Tabla 1. Los resultados del análisis de lípidos para el Lote 1 se obtuvieron usando el ensayo de extracción con hexano y aquellos para los Lotes 2 y 3 se obtuvieron usando el ensayo dicromato.

Tabla 1 - Porcentajes relativos en peso de aminoácidos libres, péptidos, carbohidratos y lípidos.

Caracterización por HPLC

El extracto de fermento de la cepa de Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT-20901 obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 se diluye a 1 mg/ml con agua/2-propanol (1:4, v/v) y se analiza por HPLC con una columna de exclusión por tamaño TSKgel G2000SWXL usando las siguientes condiciones: la columna es una TSKgel G2000SWXL (7,8mm DI x 30,0 cm de longitud, tamaño de partícula 5 mm, tamaño de poro 125 A). El eluyente es tampón fosfato 0,1 M pH 6,7 Na2SO40,1 M y la elución se mantiene isocrática usando un flujo de 1 ml/min. El detector es un UV (A=220 nm), la inyección es 25 j l y la temperatura del horno es 37 °C.

El extracto de fermento muestra picos a 12 y 12,3 min, con una distribución gaussiana que tiene un tiempo de residencia entre 10 y 20 minutos. El 73,5 % del área total está localizado entre 11 y 16 minutos y el 65 % del área total está localizado entre 11 y 14 minutos. Usando diferentes patrones con diferentes pesos moleculares (tiroglobulina, 670.000 Da; albúmina, 66.000 Da; ribonucleasa, 13.700 Da y ácido aminobenzoico, 122 Da) se calcula el peso molecular a partir de los tiempos de retención. Los picos del extracto de fermento (12 y 12,3 minutos) tienen un peso molecular entre 325,9 Da y 229,2 Da, con una distribución gaussiana que tiene un intervalo entre 3.400 Da y 122 Da (éste es el peso mínimo de los patrones) cuando se calcula usando los patrones. El 73,5 % del área bajo la distribución Gaussiana tiene un peso molecular entre 1.053,9 y 122 Da cuando se calcula con los patrones.

Ejemplo 3: Estudio in vitro de la síntesis de colágeno tipo I en fibroblastos dérmicos humanos por el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA).

El colágeno tipo I es el tipo principal de colágeno presente en la piel y es responsable de la resistencia y resiliencia de la piel. El colágeno se degenera y se lisa con la edad. Los fibroblastos son los principales productores celulares de colágeno. Así, la cuantificación in vitro de la inducción de la síntesis de colágeno como resultado del tratamiento de fibroblastos dérmicos humanos (HDFa) con un activo cosmético candidato proporciona una indicación de si el candidato será eficaz o no como un agente anti-envejecimiento de la piel. Si el candidato induce la síntesis de colágeno esto es un indicador de que el candidato será efectivo como un agente anti-envejecimiento de la piel.

La inducción de colágeno por los productos cosméticos se evalúa por un Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA).

Se tratan Fibroblastos Dérmicos Humanos con tripsina y se siembran 5x104 células/pocillo en placas de 48 pocillos. Después de 24 h (horas) de incubación a 37 °C en aire humidificado al 5 % de CO2, se añade medio fresco con diluciones escalares del extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1, a 20-0,1 jg/ml. Cada concentración se ensaya en triplicado. Se siembran células no tratadas como controles en placas de 48 pocillos en 6 pocillos. Las células se incuban durante 48h adicionales a 37 °C en aire humidificado al 5 % de CO2. Después, el medio de los pocillos se recoge de manera que puede analizarse por ELISA. Se prepara una curva patrón con colágeno tipo I de piel de ternera (Sigma) empezando a partir de una solución madre de 1 mg/ml. Las diluciones de la curva patrón y los sobrenadantes recogidos de los tratamientos del cultivo celular se transfieren a placas de 96 pocillos. El colágeno de las muestras y de las diluciones de la curva patrón recubre las paredes de las placas de 96 pocillos, que se mantienen a 4 °C en una atmósfera humidificada toda la noche. Después, los pocillos de las placas se lavan tres veces con PBS-Tween-20 al 0,05 % (v:v) (Sigma) y se bloquean durante 1 h con 3 % de Albúmina de suero bovino (BSA) (p:v) (Sigma). Después del bloqueo, los pocillos de las placas se incuban con anticuerpo anti-colágeno tipo I (Sigma) durante 2 h. Después de esta incubación, se añade el anticuerpo secundario IgG-HRP (Molecular Probes). En este momento, los pocillos de las placas se incuban con sustrato fosfatasa (OPD, Sigma) durante 30 minutos con agitación. La reacción se para por la adición de H2SO43 M y se lee la absorbancia a 490 nm en un lector de placas de microtitulación TECAN GENios. La concentración de colágeno se determina usando una regresión lineal de la curva patrón de colágeno tipo I. Los resultados del aumento de la síntesis de colágeno frente a las células no tratadas (control) se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 - La media del porcentaje de colágeno tipo I respecto al control para 3 ensayos.

Colágeno

l (%) Los resultados muestran que el extracto de la invención estimula la síntesis de colágeno Tipo I en células de fibroblastos humanos.

Ejemplo 4: Ensayo in vitro para actividad colagenasa

El colágeno es la proteína más abundante en el tejido conectivo de la piel. Forma una estructura semejante a una malla que ayuda como soporte de nuevas células cuando éstas crecen a la vez que proporciona la flexibilidad necesaria. Existe una síntesis de colágeno y degradación de colágeno continuas en la piel y el equilibrio entre estos procesos determina tanto la resistencia a la tracción como la elasticidad de la piel. La degradación de colágeno se aumenta con la edad. La colagenasa es una metaloproteinasa que escinde el colágeno en fragmentos. Por lo tanto, los activos cosméticos que puedan inhibir la actividad colagenasa pueden ser efectivos para la mejora de la resistencia de la piel y para actuar como un agente anti-envejecimiento de la piel.

La actividad colagenasa se mide con el Kit de Ensayo EnzChek Gelatinasa/Colagenasa (Molecular Probes). El extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 se obtiene de acuerdo el ejemplo 1 y se prepara en soluciones de concentraciones de 10 y 0 (control) mg/ml de extracto en tampón de reacción. Estas soluciones se añaden a una microplaca negra de 96 pocillos. Cada concentración se prueba por duplicado. A continuación, se añaden 20 |jl de 1mg/ml DQ Gelatina a cada pocillo y 100 |jl de colagenasa. La placa se incuba a temperatura ambiente, protegida de la luz, durante un periodo de 2 horas y se mide la fluorescencia a múltiples puntos de tiempo. La fluorescencia se lee a Aexc= 495 nm y Aem= 515 nm en un lector de placas de microtitulación Tecan GENios.

La Tabla 3 muestra los resultados que se presentan como la media del porcentaje de fluorescencia respecto al control para un mínimo de 2 ensayos.

Tabla 3

Productos probados ntr je de fluorescencia to al control (%)

Extracto obtenido de acuerdo con el

(Control) ^{0 100 %}

Extracto obtenido de acuerdo con el

mg

81,7 %

Los resultados muestran que el extracto de la invención puede inhibir la actividad colagenasa.

Ejemplo 5: Evaluación de la inducción de elastina en fibroblastos dérmicos humanos

La elastina es una proteína del tejido conectivo que es elástica y ayuda a mantener la piel flexible pero firme, proporcionando una reacción de recuperación si se tira de la piel. Los fibroblastos son los principales productores celulares de elastina. Por esta razón, la cuantificación in vitro de la inducción de la elastina por activos cosméticos en fibroblastos dérmicos humanos proporciona información acerca de los efectos anti-envejecimiento potenciales que los activos cosméticos podrían tener en la piel. Si el activo cosmético induce la síntesis de colágeno esto es un indicador de que el activo cosmético será efectivo como un agente anti-envejecimiento de la piel.

La inducción de elastina por activos cosméticos se evalúa por el Ensayo de Elastina Fastin (Tebu-Bio).

Se tratan Fibroblastos Dérmicos Humanos con tripsina y se siembran 3x105 células/pocillo en matraces de cultivo. Después de incubar a 37 °C en aire humidificado al 5 % de CO2 durante 72 horas, se añade medio fresco con el extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, a concentraciones de 1, 0,1 y 0,01 jg/ml. Se siembran células no tratadas como controles negativos para la síntesis de elastina. Cada concentración se prueba por duplicado. Las células se incuban durante 48 h adicionales a 37 °C en aire humidificado al 5 % de CO2. Después, la elastina se extrae de las células. Para hacer esto, el medio celular se retira y las células se lavan dos veces con PBS (Sigma) y se añade Solución de Disociación Celular (Sigma). La suspensión celular se transfiere a tubos de microcentrífuga y se añade Ácido Oxálico 1 M y se incuba durante 1 h a 100 °C. Una vez la elastina se solubiliza, se preparan estándares usando a-elastina proporcionada en el kit de ensayo. A partir de este punto, las muestras y los estándares se procesan conjuntamente siguiendo las instrucciones del kit para el aislamiento y marcaje de la elastina. Finalmente, el marcaje se extrae con el Reactivo de Disociación de Marcaje proporcionado con el kit y se mide la absorbancia a 540 nm en un lector de placas de microtitulación TECAN GENios.

En la Tabla 4, se muestra la media del porcentaje de inducción de elastina respecto al control negativo para un mínimo de 3 ensayos.

Tabla 4

Productos probados ncentración Aumento en la síntesis de elastina (%)

Extracto obtenido de acuerdo con el

(Control) ^{0 0 %}

Extracto obtenido de acuerdo con el 1 jg/m l 51,6 %

Extracto obtenido de acuerdo con el 0,1 jg/m l 37,4 %

Extracto obtenido de acuerdo con el

0,01 jg/m l

20,6 %

Los resultados muestran que el extracto de la invención estimula la síntesis de elastina en células de fibroblastos dérmicos humanos.

Ejemplo 6: Ensayo in vitro para actividad elastasa

La elasticidad de la piel es una propiedad mecánica que se ve afectada por la elastina, una proteína de la dermis que, junto con el colágeno y glucosaminoglucanos, compone el tejido conectivo. El metabolismo de las proteínas del tejido conectivo disminuye durante el proceso del envejecimiento y hay una presencia incluso mayor de enzimas, principalmente elastasas y colagenasas, que son responsables de la degradación de la elastina y del colágeno. Así, una manera posible de prevenir la pérdida resultante de elasticidad en la piel es usar ingredientes activos que son capaces de inhibir la actividad de las enzimas elastasas.

La actividad elastasa se mide con el kit de Ensayo Elastasa EnzChek (Molecular Probes).

El extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, se obtiene de acuerdo con el Ejemplo 1 y se prepara en soluciones de concentraciones de 10, 5, 2, 1 y 0 (control) mg/ml de extracto en tampón de reacción. Las soluciones se añaden a una microplaca negra de 96 pocillos. Cada concentración se pruebo por duplicado. Se añaden 50 |jl de solución de trabajo de elastina (1 mg/ml) a cada pocillo junto con 100 |jl de enzima diluida. La microplaca se incuba a temperatura ambiente, protegida de la luz, durante un periodo de 4 horas y se mide la fluorescencia a múltiples puntos de tiempo. La fluorescencia se lee a Aexc= 490 nm y Aem= 535 nm en un lector de placas de microtitulación TECAN GENios.

En la Tabla 5 se muestra la media del porcentaje de fluorescencia respecto al control para un mínimo de 2 ensayos.

Tabla 5

Productos probados entr de fluorescencia o al control (%)

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 (Contr 0 100

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 mg/ 55,9

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 mg/ 70,5

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 mg/ 85,2

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1

mg/

88,2

Los resultados muestran que el extracto de la invención puede inhibir la actividad elastasa.

Ejemplo 7: Evaluación in vitro de la formación de productos finales de glicación avanzada

La glicación es la reacción no enzimática entre una proteína y un azúcar reductor, tal como glucosa. La reacción forma lo que se conocen como productos finales de glicación avanzada (AGE). La glicación altera la estructura y función de la proteína dando lugar a la disfunción de la proteína. En la piel, la glicación del colágeno tipo I se cree que está ligada al desarrollo de la opacidad de la piel y la disminución de la elasticidad de la piel. La glicación se aumenta con la edad. Así, los principios activos cosméticos que son capaces de inhibir la formación de AGE pueden tener un efecto en la mejora de la elasticidad y la luminosidad de la piel. Dichos principios activos cosméticos serían agentes anti­ envejecimiento de la piel eficaces.

Se incuban glucosa a 0,2 M y colágeno al 0,6 % (v:v) en presencia del extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1, a concentraciones de colágeno de 100, 1 y 0 (control basal) jg/ml. Cada concentración se ensaya en duplicado. Todas las soluciones se incuban a 60 °C, se muestrean a los 0 y 3 días y se mide la formación de AGE.

La formación de AGE entre glucosa y colágeno tipo I se evalúa con el kit de ELISA Competitivo de Producto Final de Glicación Avanzada OxiSelect™ (Cell Biolabs). Las muestras o los patrones de AGE-BSA se añaden a la placa ELISA con conjugado AGE preabsorbido. Después de una breve incubación, se añade el anticuerpo policlonal anti-AGE, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP (peroxidasa de rábano picante, por sus siglas en inglés). Después de incubar con el anticuerpo secundario, los pocillos de las placas se incuban con la Solución de Sustrato y la reacción se para por la adición de Solución de Parada. La absorbancia se mide a 450 nm en un lector de placas de microtitulación TECAN GENios.

La Tabla 6 muestra la media del porcentaje de AGE respecto al control para 3 ensayos.

Tabla 6

Productos probados entr AGE respecto al control (%)

Extracto obtenido según el ejemplo 0 100 %

Extracto obtenido según el eje 0 pg/ 70,3 %

Extracto obtenido según el eje

pg/

80,6 %

Los resultados muestran que a una concentración de 1 pg/ml, el extracto de la invención inhibe la producción de AGE (la cantidad de AGE producida es el 80,6 % de la cantidad producida cuando no está presente el extracto). El aumento de la cantidad de extracto hasta 100 pg/ml da como resultado inhibición aumentada de la producción de AGE, cayendo la cantidad de AGE producida hasta el 70,3 % de la producida cuando no está presente el extracto.

Ejemplo 8: Ensayo in vitro para permeabilidad vascular

Aunque los ojos hinchados y las bolsas bajo los ojos están causadas por varios factores contribuyentes, se cree que el exceso de retención de fluidos o edema en el área bajo los ojos es una de las causas principales. El fluido puede acumularse por varias razones, incluyendo pobre circulación linfática y permeabilidad capilar aumentada. Por lo tanto, los activos cosméticos que disminuyen la permeabilidad vascular, reduciendo así la cantidad de fluido que se acumula en el compartimento intersticial, podrían ser buenos candidatos para el tratamiento cosmético de ojos hinchados y bolsas bajo los ojos.

Se tratan células endoteliales de la vena umbilical humana con tripsina y se siembran 5 x104 células/pocillo en insertos que contienen poros simétricos de 1,0 pm en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Después de incubar a 37 °C en aire humidificado al 5 % de CO2 durante 72 horas, se forma la monocapa endotelial y ocluye los poros de la membrana. En este punto, se añade medio fresco con el extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1, a concentraciones de 5, 1 y 0,2 pg/ml. Se usan células no tratadas como controles para la permeabilidad vascular. Cada concentración se prueba por triplicado. Todas las células se incuban durante 24 horas a 37 °C y 5 % de CO2.

Después del tratamiento, se añade FITC-Dextrano en la parte superior de las células, permitiendo que permee a través de la monocapa celular. El grado de permeabilidad se determina midiendo la fluorescencia de la solución de los pocillos de la placa a Aexc= 485 nm y Aem= 535 nm en un lector de placas de microtitulación TECAN GENios después de 20 minutos.

La Tabla 7 muestra la media del porcentaje de inhibición de la permeabilidad vascular respecto al control para un mínimo de 3 ensayos.

Tabla 7

Productos probados Concentr ición de la

idad vascular (%)

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 (Cont 0 0 %

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 pg/ 14 %

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 pg/ 20,8 %

Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1

2 pg/

18,7 %

Los resultados muestran que el extracto de la invención sirvió para inhibir la permeabilidad vascular ya que la cantidad de FITC-Dextrano que permeó a través de la monocapa celular fue hasta un 20,8 % menor cuando está presente el extracto comparado con cuando no está presente el extracto.

Ejemplo 9: Ensayo in vitro para influencia en la degradación de bilirrubina

Recientemente, se ha considerado que la bilirrubina es un factor en la presencia de ojeras. Es muy conocido que la microcirculación alrededor de los ojos es uno de los factores más importantes en la formación de ojeras. La extravasación de los vasos sanguíneos en edemas alrededor de los ojos da como resultado la acumulación de bilirrubina y esto produce círculos oscuros con colores que pueden variar de amarillo a azul. De esta manera un principio activo cosmético que pueda estimular la degradación de bilirrubina alrededor de los ojos podría ser un buen agente cosmético para ayudar a reducir las ojeras.

El ensayo se lleva a cabo en viales protegidos de la luz con el fin de evitar la oxidación de la bilirrubina. Se añade 1 ml de solución de bilirrubina al 0,1 % en agua/2-propanol (1:1, v/v) a un matraz volumétrico de 10 ml. Después de esto, se añaden 4 ml del extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1, en una solución en agua/2-propanol (1:1, v/v) a 25 mg/ml y el matraz se llena con agua/2-propanol (1:1, v/v) para completar los 10 ml. En estas condiciones, la concentración final del extracto de la cepa de Eupenicillium crustaceum es el 1 %. Al mismo tiempo, se prepara un control negativo sin la solución de 25 mg/ml del extracto de Eupenicillium crustaceum añadiendo 1ml de solución de Bilirrubina al 0,1 % y el volumen de agua/2-propanol (1:1, v/v) necesario para completar los 10ml del matraz volumétrico. Una vez se han preparado ambas soluciones, se transfieren a viales de vidrio protegidos de la luz y se mantienen con agitación constante a temperatura ambiente. La concentración de bilirrubina se sigue por HPLC a diferentes tiempos.

El área de la Bilirrubina Conjugada en el tiempo cero se normaliza hasta 100 % con el fin de comparar los tres replicados. Después de 24 horas, la solución del extracto de Eupenicillium crustaceum al 1 % es capaz de reducir la concentración de Bilirrubina un 19,36 %. En la Tabla 8 se muestra el área normalizada de Bilirrubina a diferentes tiempos.

Tabla 8

Los resultados muestran que después de 24 horas, en la muestra que contiene el extracto de la invención, la cantidad de bilirrubina presente es el 80,64 % de la de la muestra control. Así, se consigue una reducción de bilirrubina de un 19,36 %, respecto a la degradación normal.

Ejemplo 10: Preparación de una composición cosmética que comprende el extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901

Se prepara una composición cosmética, cuyos ingredientes se muestran en la tabla 9 siguiente. En un recipiente apropiado, se disuelven los ingredientes de la Fase A y se añade el ingrediente de la Fase A1 poco a poco, con agitación hasta que se consigue una dispersión total. Entonces, se añade el ingrediente de la Fase A2 y la mezcla de ingredientes resultante se agitó constantemente hasta que se disolvieron y se calentó hasta 70-75 °C.

En otro recipiente, se funden los ingredientes de la fase B a 70-75 °C y se añadió a la mezcla de ingredientes de las fases A, A1 y A2 poco a poco con agitación con turbina.

Después, a 40 °C, los ingredientes de la Fase C se añaden poco a poco y se agita.

Posteriormente, se añaden los componentes de la Fase D poco a poco, agitando hasta la dispersión total y se añade el componente de la Fase E poco a poco con agitación hasta la dispersión total. El pH se ajustó hasta 6,0-6,5 por la adición de hidróxido de sodio (c.s. cantidad suficiente para ajustar hasta este pH) con agitación (Fase F), obteniendo una composición cosmética con las proporciones mostradas en la tabla 9. La composición es una crema adecuada para administración tópica.

Tabla 9

Ejemplo 11: Estudio in vivo con la composición del Ejemplo 10, ensayando la eficacia del extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 para el tratamiento de arrugas de pata de gallo en voluntarias femeninas.

Este estudio se lleva a cabo durante 14 días haciendo las mediciones inicialmente a tiempo = cero y después de 14 días. Se incluyen 20 voluntarias y son mujeres caucásicas con entre 40 y 54 años de edad. Los sujetos se aplican la crema del Ejemplo 10 que contiene extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 en el contorno de un ojo (izquierdo o derecho) y una crema placebo en el contorno del otro ojo. Las cremas se aplican dos veces al día (por la mañana y la noche). Los sujetos sirven como su propia referencia y los resultados obtenidos a diferentes tiempos se comparan con los obtenidos en el tiempo inicial cero. Además, los resultados obtenidos con la crema activa se comparan con los obtenidos con la crema placebo.

La efectividad del producto se evalúa por la valoración de parámetros de rugosidad (Ra, Rz, Rt) de arrugas de pata de gallo (periorbitales) mediante un sistema de proyección de franjas:

Ra (rugosidad promedio): promedio aritmético de valores de altura absolutos

Rz (relieve medio): distancia entre el punto más alto y más bajo (5 picos y 5 valles)

Rt (rugosidad total): distancia entre el pico más alto y el valle más bajo (encontrada a lo largo de la longitud de evaluación)

Tabla 10 - Variaciones en porcentaje respecto al tiempo inicial de parámetros de rugosidad a los 14 días.

Los resultados mostrados en la Tabla 10 demuestran que, durante un periodo de tratamiento de 14 días de una crema que contiene extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 es efectiva para reducir la rugosidad de la piel debida a arrugar periorbitales. Esto es, el tamaño de las arrugas se reduce y la piel arrugada se hace más lisa.

Ejemplo 12: Preparación de una composición cosmética que comprende el extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901

Se prepara una composición cosmética, cuyos ingredientes se muestran en la Tabla 11 siguiente. En un recipiente apropiado, se disuelven los ingredientes de la fase A y se añade el ingrediente de la fase A1 poco a poco, con agitación hasta que se consigue una dispersión total. Entonces, se añade el ingrediente de la fase A2 y esta mezcla de ingredientes se agita constantemente hasta que se disuelven y se calentó hasta 70-75 °C.

En otro recipiente, se funden los ingredientes de la fase B a 70-75 °C y la mezcla resultante se añade a la mezcla de ingredientes de las fases A, A1 y A2, poco a poco, con agitación con turbina.

Después, a 40 °C, los ingredientes de la fase C se añaden poco a poco y se agita.

Después de esto, se añaden los componentes de la fase D poco a poco, agitando hasta la dispersión total y se añade el componente de la fase E poco a poco y agitando hasta la dispersión total. El pH se ajustó hasta 6,0-6,5 por la adición de hidróxido de sodio (c.s. cantidad suficiente para ajustar hasta este pH) con agitación (fase F), obteniendo una composición cosmética con las proporciones mostradas en la Tabla 11. La composición cosmética es una crema adecuada para uso tópico.

Tabla 11

(continuación)

Ejemplo 13: Estudio in vivo con la composición del Ejemplo 12, ensayando la eficacia del extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 para el tratamiento de ojeras en voluntarias femeninas con piel de tipo caucásico.

El estudio se lleva a cabo durante 28 días con mediciones hechas al tiempo inicial cero y después de 28 días. Se incluyen 21 voluntarias y son mujeres caucásicas con entre 22 y 65 años de edad. Los sujetos se aplican la crema del Ejemplo 12 que contiene extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 en el contorno de un ojo (izquierdo o derecho) y una crema placebo en el contorno del otro ojo. Las cremas se aplican dos veces al día (por la mañana y la noche). Los sujetos sirven como su propia referencia y los resultados obtenidos a diferentes tiempos se comparan con los obtenidos en el tiempo inicial cero. Además, los resultados obtenidos con la crema activa se comparan con los obtenidos con la crema placebo.

La eficacia del producto se evalúa por fotografías digitales en luz con polarización cruzada de las ojeras usadas para el análisis del componente vascular, resultados en la Tabla 12.

Tabla 12 Variaciones en porcentaje respecto al tiempo inicial de intensidad del componente vascular de la ojera a los 28 días.

Los resultados mostrados en la Tabla 12 demuestran que, durante un periodo de tratamiento de 28 días de una crema que contiene extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 es efectiva para reducir la oscuridad (es decir, aclarado del color) de la piel en las ojeras.

Ejemplo 14: Preparación de una composición cosmética que comprende el extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901

Se prepara una composición cosmética, cuyos ingredientes se muestran en la tabla xx siguiente. En un recipiente apropiado, se disuelven los componentes de la fase A y se añade el componente de la fase A1 poco a poco, con agitación hasta que se consigue una dispersión total. Entonces, se añade el componente de la fase A2 y esta mezcla de ingredientes se agita constantemente hasta que se disuelven y se calentó hasta 70-75 °C.

En otro recipiente, se funden los componentes de la fase B a 70-75 °C y la mezcla se añade a la mezcla de los componentes de las fases A, A1 y A2 poco a poco con agitación con turbina.

Después, a 40 °C, los ingredientes de la fase C se añaden poco a poco, con agitación. Posteriormente, se añaden los componentes de la fase D poco a poco, con agitación hasta la dispersión total y se añade el componente de la fase E poco a poco y con agitación hasta la dispersión total. El pH se ajustó hasta 6,0-6,5 por la adición de hidróxido de sodio (c.s cantidad suficiente para ajustar hasta este pH) con agitación (fase F), obteniendo una composición cosmética con las proporciones mostradas en la Tabla 13. La composición es una crema adecuada para aplicación tópica.

Tabla 13

(continuación)

Ejemplo 15: Estudio in vivo con la composición del Ejemplo 14, ensayando la eficacia para el tratamiento de bolsas de los ojos en voluntarias femeninas.

El estudio se lleva a cabo durante 28 días con mediciones en el tiempo inicial cero, después de 14 días y después de 28 días. Se incluyen 20 voluntarias y son mujeres caucásicas con entre 41 y 66 años de edad. Los sujetos se aplican la crema del Ejemplo 14 que contiene extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 en el contorno de un ojo (izquierdo o derecho) y crema placebo en el contorno del otro ojo. La crema se aplica dos veces al día (por la mañana y la noche). Los sujetos sirven como su propia referencia y los resultados obtenidos a diferentes tiempos se comparan con los obtenidos en el tiempo inicial. Además, los resultados obtenidos con la crema activa se comparan con los obtenidos con la crema placebo.

La efectividad del producto se evalúa por la evaluación del volumen de la bolsa de los ojos mediante un sistema de proyección de franjas; los resultados se presentan en la Tabla 14.

Tabla 14 - Variaciones en porcentaje respecto al tiempo inicial cero de volumen de bolsas de los ojos a los 14 y 28 días.

Los resultados mostrados en la Tabla 14 demuestran que, durante periodos de tratamiento de 14 y 28 días de una crema que contiene extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 es eficaz para reducir el volumen de las bolsas de los ojos.

Ejemplo 16: Ensayo in vitro para melanogénesis en melanocitos epidérmicos humanos

La melanogénesis es un proceso que se produce en las células de melanocitos en la piel y que da como resultado la síntesis de melanina, el pigmento determinante del color de la piel. La cuantificación de melanina In vitro inducida por principios activos cosméticos proporciona información acerca de su efecto blanqueante potencial.

Se tratan melanocitos humanos con tripsina y se siembran en placas a una densidad de 2x105 células/pocillo en placas de 6 pocillos. Después de una incubación de toda la noche a 37 °C, 5 % de CO2, se lleva a cabo un primer tratamiento con el extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1, a 10, 5, 1 y 0,2 pg/ml. Se usan células no tratadas como controles. Cada concentración se prueba por duplicado. El tratamiento se repite en los días 3, 6, 8 y 10. Finalmente, las células se incuban a 37 °C, 5 % CO2 durante 72 horas adicionales después del último tratamiento.

Después de la incubación final, las células se despegan para el recuento celular y la medición de melanina. Las suspensiones celulares se centrifugan a 3.000 rpm durante 15 min y el sedimento se disuelve en 1 ml de NaOH 1 N con DMSO al 10 % (v:v). Las células se lisan durante 2 h a 80 °C y se centrifugan a 12.000 rpm durante 10 min. La concentración de melanina se determina por la medición de absorbancia a 450 nm es un lector de placas TECAN GENios y los valores se normalizan respecto al número de células por pocillo. La concentración de melanina se determina en picogramos por célula (pg/célula) a partir de una curva estándar representada con melanina sintética a concentraciones conocidas.

En la Tabla 15 se muestra la media del porcentaje de melanina respecto al control para 3 ensayos.

Tabla 15

Productos probados ncentraci e melanina (pg/célula)

Extracto obtenido según el ejemplo 0 100 %

Extracto obtenido según el eje 10 pg/ml 38,7 %

Extracto obtenido según el eje 5 pg/ml 45,7 %

Extracto obtenido según el eje 1 pg/ml 53,7 %

Extracto obtenido según el eje

0,2 pg/ml

55,3 %

Los resultados mostrados en la Tabla 15 demuestran que el extracto de la invención es efectivo para inhibir la melanogénesis (síntesis de melanina) en melanocitos epidérmicos humanos.

Ejemplo 17: Ensayo in vitro para actividad tirosinasa

La melanogénesis es un proceso que ocurre en las células de melanocitos y da como resultado la síntesis de melanina que es el pigmento determinante del color de la piel. La enzima clave en la melanogénesis es tirosinasa. La tirosinasa inicia una cascada de reacciones que convierten la tirosina en melanina. Así, los principios activos cosméticos que son capaces de inhibir la actividad tirosinasa tienen potencial como un agente blanqueante de la piel.

La actividad tirosinasa se mide con el Kit de Ensayo de Tirosinasa HumanLike (Feldan). Se añaden 200 pl/pocillo de Mezcla de Reacción a los pocillos de una microplaca y se añaden muestras de 10 pl del extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1, a 100, 10 y 1 pg/ml. Cada concentración se ensaya en duplicado. Finalmente, se cargan 2 pl de enzima. Los pocillos sin enzima se usan como blancos. La absorbancia se lee a A = 490 nm en un lector de placas de microtitulación TECAN GENios (Genios, Tecan).

En la Tabla 16 se muestra la media del porcentaje de absorbancia respecto al control para 3 ensayos.

Tabla 16

Productos probados entr aje de absorbancia cto al control (%)

Extracto obtenido de acuerdo con el

(Control) ^{0 100 %}

Extracto obtenido de acuerdo con el 0 pg/ 63,73 %

Extracto obtenido de acuerdo con el pg/ 75,69 %

Extracto obtenido de acuerdo con el

pg/

66,40 %

Los resultados mostrados en la Tabla 16 demuestran que el extracto de la invención es eficaz para inhibir la actividad tirosinasa.

Ejemplo 18: Estudio del perfil de la expresión génica de melanocitos epidérmicos humanos

Se tratan melanocitos humanos con tripsina y se siembran en placas a una densidad de 2x105 células/pocillo en placas de 6 pocillos. Después de una incubación toda la noche a 37 °C, 5 % de CO2, se lleva a cabo el primer tratamiento con el extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1, a 10 |jg/ml. Se usan células no tratadas como controles. Cada concentración se ensaya en 10 pocillos. El tratamiento se repite en los días 3, 6, 8 y 10. Finalmente, las células se incuban a 37 °C, 5 % CO2 durante 72 horas adicionales después del último tratamiento.

Después de la última incubación, las células se lisan directamente en los pocillos y el ARN se extrae y se purifica de cada réplica y cada condición mediante el kit RNeasyPlus Mini (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las células lisadas se homogeneizan y las ARNasas se inactivan. El ADN genómico se retira de las muestras usando columnas de centrifugado gDNA Eliminator. Después, las muestras se pasan a través de columnas de unión a ARN especiales y después de varios lavados con microcentrifugación para eliminar contaminantes e impurezas, el ARN purificado se eluye con 50 j l de agua ultrapura.

La pureza, integridad y concentración del ARN obtenido se evalúan mediante espectrofotometría (Nanodrop) y con un bioanalizador (Agilent Bioanalyzer). Se seleccionan cuatro muestras control y cuatro muestras tratadas según los resultados de pureza e integridad.

Después, se lleva a cabo el marcaje y las muestras se hibridan en una micromatriz de expresión de genes humanos (ASurePrint G3, Agilent).

Los valores normalizados obtenidos con el tratamiento se comparan con los valores normalizados obtenidos con el control negativo para obtener genes con expresión diferencial. A continuación, se lleva a cabo un análisis paramétrico de los datos mediante el software Bioconductor. Los valores obtenidos se evalúan mediante GSEA (Análisis de Enriquecimiento en Grupos de Genes) para agrupar conjuntamente los genes con expresión diferencial en términos de Ontología Génica y Rutas Biológicas.

Los resultados de LogFc obtenidos para genes seleccionados implicados en la melanogénesis se muestran en la tabla siguiente. LogFC es el logaritmo (base 2) de las veces de cambio (FC). FC se usa en el análisis de los datos de la expresión génica en micromatriz para medir el cambio en el nivel de expresión de un gen. Las veces de cambio se define como una medida que describe cuánto cambia una cantidad entre dos condiciones experimentales en comparación, o como la proporción de intensidades entre dos condiciones experimentales en comparación. En este sentido, los genes con valores negativos de LogFC están regulados negativamente al control mientras los genes con valores positivos para LogFC están regulados positivamente respecto al control.

Tabla 17 - Valores LogFC de los genes seleccionados que codifican enzimas implicadas en diferentes reacciones en la síntesis de melanina.

Genes seleccionados que codifican enzimas implicadas en la síntesis de melanina Símbolo Nombre logFC

TYR tirosinasa -0,42

TYRP1 proteína relacionada con tirosinasa 1 -0,14

DCT dopacromo tautomerasa -0,98

Tabla 18 - Valores LogFC de los genes seleccionados que codifican receptores, ligandos y otras proteínas implicadas en el control regulador de las enzimas implicadas en la síntesis de melanina.

Genes seleccionados implicados en la regulación de la melanogénesis Símbolo Nombre logFC

ARRB2 arrestina, beta 2 -0,11

PRKCA proteína quinasa C, alfa -0,56

CAMK2G proteína quinasa II gamma dependiente de calcio/calmodulina -0,21 CREB3L2 proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc 2 semejante a 3 -0,21 CREB3L4 proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc 4 semejante a 3 -0,40

CREBBP proteína de unión a CREB -0,22

EP300 proteína de unión a E1A p300 -0,20

(continuación)

Genes seleccionados implicados en la regulación de la melanogénesis Símbolo Nombre logFC

DKK1 homólogo de dickkopf 1 (Xenopus laevis) 3,26

DVL2 dishevelled, homólogo dsh 2 (Drosophila) -0,47

DVL3 dishevelled, homólogo dsh 3 (Drosophila) -0,25

EDNRB receptor de endotelina tipo B -1,11

FZD10 receptor de la familia frizzled 10 -0,62

FZD8 receptor de la familia frizzled 8 -0,60

TCF7L1 ^{factor de transcripción 1 semejante a 7 (específico de células T,}

_{ca¡a HMG)} -0,32

Tabla 19 - Valores LogFC de los genes seleccionados implicados en la organización o biogénesis melanosomal

Genes seleccionados implicados en la organización o biogénesis melanosomal. Símbolo Nombre logFC

MLANA melan-A -0,69

GPNMB glucoproteína (transmembrana) nmb -0,98

PMEL proteína premelanosoma -0,56

Los resultados mostrados en la Tabla 18 demuestran que el extracto de la invención es capaz de regular positivamente o regular negativamente genes que dan como resultado la inhibición de la melanogénesis. Los resultados mostrados en la Tabla 19 y Tabla 17 demuestran que el extracto de la invención es capaz de regular a la baja genes implicados directamente en la biogénesis melanosomal y genes que codifican enzimas implicadas en la síntesis de melanina. Por todos estos efectos en la regulación génica, el extracto de la invención sirvió para inhibir el proceso de melanogénesis dando como resultado el efecto blanqueante obtenido.

Ejemplo 19: Preparación de una composición cosmética del extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901

En un recipiente apropiado, se disuelven los ingredientes de la Fase A y se añade la Fase A1 poco a poco y se agita hasta que se consigue una dispersión total. Entonces, se añade la Fase A2 y esta mezcla de ingredientes se agitó constantemente hasta que se disolvieron y se calienta hasta 70-75 °C.

En otro recipiente, se funden los ingredientes de la fase B a 70-75 °C y se añade a la mezcla de ingredientes de las fases A, A1 y A2 poco a poco con agitación con turbina.

Después, a 40 °C, los ingredientes de la Fase C se añaden poco a poco y se agita.

Posteriormente, se añaden los componentes de la Fase D poco a poco, agitando hasta la dispersión total y se añade el componente de la Fase E poco a poco y se agita hasta la dispersión total. El pH se ajusta hasta 6,0-6,5 por la adición de hidróxido de sodio (c.s. cantidad suficiente para ajustar hasta este pH) con agitación (Fase F), obteniendo una composición cosmética con las proporciones mostradas en la Tabla 20.

Tabla 20

INGREDIENTE (nombre INCI) peso FASE WATER (AQUA) 78,1000 A PENTYLENE GLYCOL 3,0000 A BENZYL ALCOHOL 0,4000 A CARBOMER 0,5000 A1 POTASSIUM CETYL PHOSPHATE 0,5000 A2 ETHYLHEXYL COCOATE 2,5000 B GLYCERAL STEARATE 2,0500 B CETEARYL ALCOHOL 2,0500 B (continuación)

INGREDIENTE (nombre INCI) peso FASE POTASSIUM PALMITOYL HYDROLYZAED WHEAT PROTEIN 0,9000 B C12-15 ALKYL BENZOATE 5,0000 B DIMETHICONE 1,0000 B PHENOXYETHANOL 0,4000 B TOCOPHERYL ACETATE 0,5000 B BUTYLENE GLYCOL 1,8582 C WATER (AQUA) 0,1374 C Extracto de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito

CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 ^{0,0044 C} WATER (AQUA) 0,4700 D SODIUM ACRYLATES/BEHENETH-25 METACRYLATE CROSSPOLYMER 0,2750 D HYDROGENATED POLYDECENE 0,2250 D LAURYL GLUCOSIDE 0,0300 D FRAGRANCR (PARFUM) 0,1000 E SODIUM HYDROXIDE, WATER (AQUA) 0,000 F 100,000

Ejemplo 20: Estudio in vivo con la composición del Ejemplo 19, ensayando la eficacia del extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 para el tratamiento de manchas de la edad y efecto de aclaración de la piel en voluntarios con tipo de piel asiática.

El estudio se llevó a cabo durante 56 días con mediciones en el tiempo inicial y después de 8 semanas de tratamiento. Un panel de 22 voluntarias femeninas asiáticas entre 38 y 53 años de edad se aplicó la crema del Ejemplo 19 en la mitad de la cara y crema placebo en la otra mitad de la cara, dos veces al día (por la mañana y la noche). Los sujetos sirvieron como su propia referencia y los resultados obtenidos a diferentes tiempos se compararon con los obtenidos en el tiempo inicial. Además, los resultados obtenidos con la crema activa se compararon con los obtenidos con la crema placebo.

La efectividad del producto se evaluó mediante:

- Mediciones del color de la piel por reflexión espectral de luz, parámetros L*, b* e ITA° (n=22), los resultados se presentan en la Tabla 21

L*: Parámetro de luminancia (de oscuro a claro; aclarado o luminosidad de la piel)

b*: Parámetro de crominancia (de azul a amarillo; amarillez de la piel)

ITA° (Ángulo de Tipología Individual): [Arco Tangente ((L*-50)/b*)] x 180 / 3,14159

Tabla 21 - Variaciones en porcentaje frente al tiempo inicial de regiones Hiperpigmentadas y No hiperpigmentadas y contraste entre ambas regiones después de 8 semanas de tratamiento.

L* b* ITA°

Crema Crema Crema Crema Crema Crema placebo activa placebo activa placebo activa Hiperpigmentada 1,57 % 2,48 % -0,26 % -3,28 % 8,20 % 15,30 %

No hiperpigmentada 1,41 % 2,07 % -2,22 % -0,15 % 6,35 % 6,98 % Contraste -1,00 % -3,95 % 24,32 % -34,58 % 1,79 % -12,68 %

Cada parámetro (L*, b* e ITA) se mide para cada voluntaria a diferentes tiempos (valor base y 8 semanas). Posteriormente, se calcula la media para cada parámetro y el % incluido en la Tabla 21 es [(media a las 8 semanas -media a las 0 semanas)/media a las 0 semanas] (%). El contraste de la piel es el valor de un parámetro en región no hiperpigmentada menos el valor de un parámetro en región hiperpigmentada, es decir, el contraste es un parámetro relacionado con la homogeneidad del color de la piel, si al final del tratamiento el color de la piel es más homogéneo o no. Por lo tanto, un valor negativo de contraste indica una mejora de la homogeneidad del color de la piel. El contraste se calcula para cada voluntaria y el parámetro como sigue usando L* como un ejemplo: L* contraste = L* no hiperpigmentada - L* hiperpigmentada. El valor de contraste medio se calcula y se usa para calcular la evolución del contraste durante el tratamiento: % contraste = [(media a las 8 semanas - media a las 0 semanas)/media a las 0 semanas]. Este % se incluye en la Tabla 21 bajo el encabezamiento contraste.

Los resultados mostrados en la Tabla 21 demuestran que, durante un periodo de tratamiento de 8 semanas de una crema que contiene el extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 es eficaz para aumentar el aclarado de la piel (L* e ITA°) y reducir la amarillez de la piel (b*) en una región hiperpigmentada de la piel (manchas de la edad). Además, el contraste entre región hiperpigmentada y no hiperpigmentada disminuye mostrando un efecto blanqueante de las manchas de la edad.

Los resultados del análisis de la intensidad de la melanina en región hiperpigmentada por Microscopía Confocal de Reflectancia (n=2), se muestran en la Tabla 22.

Tabla 22 - Variaciones en porcentaje frente al tiempo inicial de la intensidad de melanina después de 8 semanas de tratamiento.

Los resultados mostrados en la Tabla 22 demuestran que, durante un periodo de tratamiento de 8 semanas de una crema que contiene el extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901 es efectivo para reducir la intensidad de melanina en región hiperpigmentada de la piel (manchas de la edad).

Ejemplo 21: Preparación de una microemulsión que comprende el extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901.

En un recipiente apropiado, se mezclaron Docusato de Sodio USP [INCI: DIETHYLHEXYL SODIUM SULFOSUCCINATE] y ácido isoesteárico [INCI: ISOSTEARIC ACID] (fase A).

En otro recipiente, se disolvió una mezcla del extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1, junto con agua [INCI:WATER (AQUA)] y BUTILENGLICOL 1,3 [INCI: BUTYLENE GLYCOL], en etanol [INCI: ALCOHOL] (fase B). Lentamente, la fase B se añadió a la fase A con agitación. Véase la Tabla 23.

Tabla 23

INGREDIENTE % en peso

A DIETHYLHEXYL SODIUM SULFOSUCCINATE 13,50

A ISOSTEARIC ACID 76,50

B AQUA 0,36

B BUTYLENE GLICOL 6,577

B ^{Extracto de fermento de la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum con número}

_{de depósito CECT20901, obtenido de acuerdo con el ejemplo 1} 0,063

B ALCOHOL 3,00

Ejemplo 22: Preparación de una composición de nanopartículas lipídicas que comprende la microemulsión del Ejemplo 21.

Se añadieron Agua [INCI: WATER (AQUA)], Amigel® [INCI: SCLEROTIUM GUM], ZemeaTM [INCI: PROPANEDIOL], Ácido Hialurónico [INCI: SODIUM HYALURONATE] y Fenoxietanol [INCI: PHENOXYETHANOL] (ingredientes de la fase A) en este orden a un recipiente apropiado y se agitó hasta que se consiguió la homogeneidad.

La mezcla que comprende la microemulsión del ejemplo XX, aceite de soja refinado IP Ph. Eur. [INCI: GLYCINE SOJA (SOYBEAN) OIL], Arlacel 83 [INCI: SORBITAN SESQUIOLEATE] y Massocare HD [INCI: ISOHEXADECANE] (ingredientes de la fase B) se añadió a otro recipiente.

Después, la mezcla de los ingredientes de la fase B se añadió a la mezcla de los ingredientes de la fase A con agitación con turbina hasta que se formó una emulsión.

La mezcla se homogeneizó con un Microfluidizer®, un sistema de homogeneización con alta presión.

Finalmente, se añadió SENSOMER CT-400 [INCI: CASSIA HYDROXYPROPYLTRIMONIUM CHLORIDE] lentamente con agitación (fase C). Véase la tabla 24.

Tabla 24

INGREDIENTE % EN PESO

A WATER (AQUA) c.s.100

A SCLEROTIUM GUM 0,50

A PROPANEDIOL 5,00

A PHENOXYETHANOL 2,6

A SODIUM HYALURONATE 0,01

B Microemulsión del ejemplo 21 8,00

B GLYCINE SOJA (SOYBEAN) OIL 12,00

B SORBITAN SESQUIOLEATE 4,30

B ISOHEXADECANE 5,50

C WATER (AQUA) 2,00

C CASSIA HYDROXYPROPYLTRIMONIUM CHLORIDE 0,50

Ejemplo 23: Ensayo in vitro para la inhibición de melanogénesis en epidermis pigmentada humana reconstruida

La hiperpigmentación es un trastorno provocado por la producción exagerada de melanina. Los factores tales como exposición solar excesiva, envejecimiento, cambios hormonales, inflamación, alergias, entre otros, pueden provocar un desequilibrio en la producción y el proceso de distribución de la melanina, dando como resultado manchas en la piel. Los lentigos solares (también conocidos como lentigo senil, manchas solares, hepáticas o de la edad) son máculas circunscritas pigmentadas y se encuentran típicamente en áreas del cuerpo expuestas a UV. El mecanismo molecular propuesto para la aparición de lentigos solares implica la estimulación de rutas de señalización epidérmicas que incluyen la ruta Wnt. WNT-1 es un activador de la ruta de señalización Wnt implicado en lentigos solares.

Epidermis Pigmentada Humana Reconstruida (EPHR), día de edad 10, fototipo IV (SkinEthic laboratorios) se retiró de la solución nutriente de agarosa en la placa multipocillo inmediatamente después de la llegada y se colocó en una placa de 6 pocillos en los cuales cada pocillo se había cargado previamente con SkinEthic Growth Medium (SkinEthic laboratories). Después de la incubación de toda la noche a 37 °C, 5 % de CO2, se lleva a cabo un primer tratamiento con WNT-1 recombinante humano (Peprotech) a 200 ng/ml o con extracto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 a 200 o 100 |jg/ml con WNT-1. El medio de cada pocillo se aspira y se añade medio fresco (que contiene bien el WNT-1 recombinante humano o el extracto y el WNT-1 recombinante humano). Cada ensayo tiene pocillos control (condiciones basales) en los que la EPHR se trata con medio de crecimiento solo. El tratamiento se repite cada día hasta el día 6, es decir, durante cinco días, cuando los modelos de tejido se embeben en Cryo-M-Bed (Bright).

Después de los 5 días de tratamiento, los modelos de tejido se fijan en paraformaldehído al 4 % (Sigma) durante 3 horas a 4 °C y se lavó 4 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma). Después, las muestras se someten a un gradiente de sacarosa de 0,6 Molar a 2,3 Molar con incubaciones de 3 horas a temperatura ambiente. Después de la última incubación, los modelos de tejido se embeben en Cryo-M-Bed. Se cortan secciones de 10 jm con un cryostat (Leica) y la melanina en las secciones se tiñe usando un kit Fontana-Masson Stain (Abcam).

Las secciones de tejido se incuban con solución de plata amoniacal precalentada a 58-60 °C durante 0-60 minutos. Una vez que las secciones de tejido se vuelven de color amarillento/marrón, se enjuagan en varios cambios de agua destilada. Después, las secciones de tejido se incuban en Solución de Cloruro de Oro durante 30 segundos y se enjuagan de nuevo. Las secciones de tejido se incuban en solución de tiosulfato de sodio durante 1-2 minutos en agua corriente del grifo, seguido de dos cambios de agua destilada. Las secciones se incuban en solución Nuclear Fast Red durante 5 minutos y se enjuagan durante 2 minutos en agua corriente del grifo, seguido de dos cambios de agua destilada. Finalmente, las secciones se deshidratan en 3 cambios de alcohol absoluto, se aclaran y se montan en Neo-Mount® (Merck).

Las secciones se observan usando un microscopio óptico Zeiss y las imágenes se capturan usando el software Zen. A partir de cada imagen, se cuantifica la cantidad de área teñida.

La Tabla 25 muestra las veces de inducción del contenido de melanina, con respecto a las condiciones basales, para un mínimo de 3 ensayos.

Tabla 25

Productos probados ión de extracto ^{Veces inducción (Media ±}

_SEM) Condiciones basales 0 1 ± 0,03 WNT-1 (200 ng/ml) 0 1,88 ± 0,27 Extracto obtenido de acuerdo con el eje

0 pg/ _{1 (200 ng/ml)} 0,90 ± 0,12 Extracto obtenido de acuerdo con el eje

_{1 (200 ng/ml)}

0 pg/

1,10 ± 0,10

Los resultados muestran que el extracto de la invención induce una disminución significativa en el contenido de melanina en modelos de piel humana hiperpigmentada en las concentraciones probadas.

Ejemplo 24: Ensayo in vitro para análisis de expresión génica

El objeto de este estudio es investigar la efectividad de despigmentación del extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1 evaluando la expresión de genes de la ruta de la melanogénesis en melanocitos oscuramente pigmentados usando un sistema de matrices de RT-qPCR.

Melanocitos Epidérmicos Humanos de un donante oscuramente pigmentado neonatal (HEMn-DP) (Life Technologies) se tripsinizan y se colocan en placa a una densidad de 3x105 células/pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos en Medio 254 suplementado con Suplemento-2 de Crecimiento de Melanocito Humano (HMGS-2 (sin PMA)) (Life Technologies). Después de la incubación durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2, se lleva a cabo un primer tratamiento bien con extracto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 a 1 pg/ml o con medio solo (condiciones basales). El medio de cada pocillo se aspira y después se añade medio fresco (que contiene bien extracto o medio solo). El tratamiento se repite los días 3, 6, 8 y 10. Finalmente, las células se incuban a 37 °C, 5 % de CO2 durante 72 horas adicionales después del último tratamiento.

Después de la incubación final, las células se lisan directamente en los pocillos siguiendo el protocolo descrito en el mini kit Aurum Total RNa (BioRad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células lisadas se homogenizan y las RNasas se inactivan. Después, las muestras se pasan a través de columnas de unión de ARN especiales y, después de varios lavados de microcentrifugación para eliminar contaminantes e impurezas, el ARN purificado se eluye con 80 pl de solución de elución. La cuantificación y el análisis de la pureza de las muestras de ARN se realizan después de la elución de ARN con un biofotómetro (Eppendorf).

0,4 pg de ARN de alta calidad se retrotranscriben con iScript advanced (BioRad) en un volumen final de 20 pl. La mezcla de reacción completa se incuba en un termociclador (Eppendorf) a 42 °C durante 30 minutos, la reacción se detiene a 85 °C durante 5 minutos. El ADN complementario se amplifica por qPCR en un termociclador de PCR a tiempo real (BioRad) usando la súper mezcla SsoAdvanced Universal Inhibitor-Tolerant SYBRgreen (BioRad) en el panel de 96 pocillos de melanogénesis humana para su uso con SYBR® Green (BioRad). SYBR Green se une a las moléculas de ADN bicatenario y emite fluorescencia que se cuantifica y es proporcional a la cantidad del producto en la reacción de PCR. Las condiciones de ciclación en el instrumento BioRad CFX96 son 95 °C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 segundos, hibridación y alargamiento a 60 °C durante 30 segundos. Se usan GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), TBP (proteína de unión a la caja TATA) y HRPT1 (hipoxantina fosforribosiltransferasa 1) como controles endógenos. El cambio en número de veces relativo a la expresión de los genes de muestra y los genes de referencia se calcula usando el procedimiento de expresión normalizada (AA(Ct)) con valores umbral por defecto usando el Software CFX Manager (BioRad).

La Tabla 26 muestra los niveles relativos de expresión de los diversos genes indicados con respecto a las condiciones basales durante un mínimo de 3 ensayos.

Tabla 26

Símbolo Nombre del gen Niveles relativos (%) DCT Dopacromo tautomerasa -7,35

MLANA Melan-A -17,86

TYR Tirosinasa -27,87

TYRP1 Proteína relacionada con tirosinasa 1 -5,07

DKK1 Homólogo Dickkopf 1 385,02

Los resultados muestran que el extracto de la invención induce una disminución significativa de la expresión de los genes de la melanogénesis en los melanocitos humanos a la concentración probada y un aumento significativo del gen DKK1. El gen DKK1 codifica un inhibidor de la fagocitosis que también es un inhibidor de la proliferación de melanocitos a través de la ruta WNT.

Ejemplo 25: Ensayo in vitro para la cuantificación de tirosinasa por ELISA

La enzima clave en la melanogénesis es la tirosinasa, que inicia una cascada de reacciones que convierten la tirosina en el biopolímero melanina. Esta enzima cataliza dos reacciones diferentes: la hidroxilación de compuestos monofenólicos a o-difenoles; y la oxidación de los o-difenoles a o-quinonas. La enzima convierte tirosina en 3,4-dihidroxifenilalanina (L-dopa) y oxida la L-dopa para formar dopaquinona. La L-dopa juega una parte prominente en la biosíntesis de melanina.

Melanocitos Epidérmicos Humanos de un donante oscuramente pigmentado neonatal (HEMn-DP) (Life Technologies) se tripsinizan y se colocan en placa a una densidad de 5x103 células/pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos en Medio 254 suplementado con Suplemento-2 de Crecimiento de Melanocito Humano (HMGS-2 (sin PMA)) (Life Technologies). Después de la incubación durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2, se lleva a cabo un primer tratamiento con extracto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 a 50 o 10 pg/ml o con medio solo (condiciones basales). El medio de cada pocillo se aspira y después se añade medio fresco (que contiene bien extracto a 50 o 10 pg/ml o medio solo). El tratamiento se repite los días 3, 6, 8 y 10. Después de 13 días de cultivo, se realiza una cuantificación de enzimas usando un kit ELISA Tyrosinase Cell-Based (Abnova) en las células cultivadas. En primer lugar, las células se enjuagan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces y se fijan con formaldehído al 4 % durante 20 minutos. Después las células se lavan 3 veces con Tampón de Lavado y se añade Tampón de Inactivación y se incuba durante 20 minutos. Las placas se lavan de nuevo y se bloquean durante 1 h con Tampón de Bloqueo. Después de bloquear, las placas de pocillos se incuban con anticuerpo anti-tirosinasa o anticuerpo anti-GAPDH durante 16 horas. Se usa un total de 6 pocillos para cada condición, tres de ellos se incuban con el anticuerpo anti-tirosinasa y los otros tres con el anticuerpo anti-GAPDH. Después de esta incubación, se añade el anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo conjugada a HRP para los pocillos incubados con anticuerpo anti-tirosinasa o anti-IgG de ratón conjugada a HRP para los pocillos incubados con anticuerpo anti-GAPDH) a los pocillos correspondientes y se incubaron durante 1,5 horas. Después las placas de pocillos se incuban con solución TMB one-Step durante 30 minutos en oscuridad con agitación suave. La reacción se detiene añadiendo la solución de parada a cada pocillo. La absorbancia a 450 nm se lee en un lector de microplacas (Clariostar, BMG Labtech). La señal de GAPDH se usa para la normalización de los valores de tirosinasa.

La Tabla 27 muestra el porcentaje medio de inhibición del nivel de expresión de tirosinasa con respecto a las condiciones basales durante un mínimo de 3 ensayos.

Tabla 27

Los resultados muestran que el extracto de la invención induce una reducción significativa de los niveles de proteína tirosinasa en cultivos de melanocitos a las concentraciones probadas.

Ejemplo 26: Ensayo in vitro para fagocitosis basada en microesferas

La pigmentación de la piel se determina por la transferencia de pigmentos de melanina desde los melanocitos a los queratinocitos vecinos y por su patrón de distribución en capas epidérmicas suprabasales, así como por la cantidad y el tipo de melanina sintetizada en los melanocitos. Los pigmentos de melanina se sintetizan y se almacenan en los orgánulos unidos a membrana especializados denominados melanosomas. Los melanosomas se transportan desde el cuerpo celular a la periferia en los melanocitos y se transfieren desde las dendritas de los melanocitos en los queratinocitos adyacentes. Después de la transferencia, os melanosomas se transportan hacia el núcleo para formar una caperuza de melanina que actúa como pantalla solar interna en los queratinocitos.

Los sobrenadantes de los cultivos de melanocitos se obtienen de Melanocitos Epidérmicos Humanos de un donante oscuramente pigmentado neonatal (HEMn-DP) (Life Technologies) se tripsinizan y se colocan en placa a una densidad de 3x105 células/pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos en Medio 254 (Life Technologies) suplementado con Suplemento-2 de Crecimiento de Melanocito Humano (HMGS-2 (sin PMA)) (Life Technologies). Después de 24 h, el medio se retira y las células se incuban con el extracto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1 a 1 pg/ml o con medio solo (control de sobrenadante) durante 13 días a 37 °C en una incubadora de CO2. El tratamiento se repite los días 3, 6, 8 y 10. El día 13 los sobrenadantes se recogen y se usan para el tratamiento de Queratinocitos Epidérmicos Humanos.

Queratinocitos Epidérmicos Humanos (KEHa) (Life Technologies) se tripsinizan y se siembran 3x105 células/pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos con cubreobjetos pre-recubiertos con matriz de recubrimiento en medio Epilife suplementado con suplemento de crecimiento definido de Epilife (EDGS) (Life Technologies). Después de 24 h de incubación a 37 °C en aire humidificado con CO2 al 5 %, se añade medio fresco que contiene 100 ng/ml de DKK1 (R&D Systems) o el sobrenadante de los melanocitos tratados. Cada placa tiene pocillos control tratados con medio solo (condiciones basales). Las placas se incuban durante 30 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %. Después del tratamiento el medio se retira y las células se incuban con FluoSpheres® microesferas fluorescentes rojas modificadas con carboxilato (diámetro 0,5 |jm, Life Technologies) a 3x108 ml durante 4 horas. Las microesferas se recubren previamente con albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma) de forma extensiva para retirar las microesferas no internalizadas y se fija en paraformaldehído (Sigma) al 3,7 % (V/V) durante 10 minutos. Las células se lavan con PBS y se incuban en acetona fría durante 3 minutos. Las muestras se bloquean con BSA al 1 % (P/V) en PBS durante 30 minutos. Para visualizar el contorno celular, las células se marcan con faloidina Alexa Fluor® 488 (Life Technologies) durante 20 minutos en oscuridad. Los núcleos de las células se tiñen y se montaron cubreobjetos con reactivo Antifade ProLong Gold con DAPI (Life Technologies). Las células se observan usando un microscopio de fluorescencia Zeiss y las imágenes se capturan usando el software Zen para la cuantificación.

Para el análisis cuantitativo de la captación de microesferas, el número de microesferas y los núcleos presentes en seis campos microscópicos tomados aleatoriamente en tres experimentos diferentes se cuentan para cada condición. El número de microesferas de cada imagen se normaliza con el número de núcleos en cada imagen.

La Tabla 28 muestra las veces inducción medias de la fagocitosis con respecto a las condiciones basales para un mínimo de 3 ensayos.

Tabla 28

Productos probados oncentración Veces inducción (Media ± SEM) Condiciones basales 0 1 ± 0,15

DKK1 sintético

100 ng/ml 0,23 ± 0,06

Control de sobrenadante 0 1 ± 0,13 Extracto obtenido de acuerdo con el ejemplo 1

1 jg/m l

0,31 ± 0,06

Los resultados muestran que el extracto de la invención induce inhibición significativa de la captación de microesferas o la fagocitosis de los queratinocitos a la concentración probada.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum, en el que el extracto de fermento comprende del 31 al 79 % en peso de péptidos, del 1 al 8 % en peso de aminoácidos libres, del 10 al 27 % en peso de carbohidratos y del 15 al 40 % en peso de lípidos.

2. Un extracto de fermento de acuerdo con la reivindicación 1, que se puede obtener fermentando una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum en un medio de cultivo acuoso y aislando un producto de fermento.

3. Un extracto de fermento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene un peso molecular menor de 3.400 Da.

4. Un extracto de fermento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa de la especie Eupenicillium crustaceum es una cepa con número de depósito CECT 20901.

5. Uso de un extracto de fermento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico es la despigmentación de o el blanqueamiento o la aclaración del color de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas; la despigmentación de o el blanqueamiento o la aclaración del color de manchas de la edad; la despigmentación de o el blanqueamiento o la aclaración del color de la piel de las ojeras; el mantenimiento o mejora de la luminosidad de la piel; el alivio o la prevención de los síntomas del envejecimiento de la piel; tratamiento de las arrugas de la piel, tales como arrugas periorbitales; tratamiento de ojeras; tratamiento de ojo hinchado; tratamiento de bolsas de los ojos; el alisado de o reducción de arrugas de la piel; la reducción del volumen de un ojo hinchado o de bolsas de los ojos; el mantenimiento o mejora de la elasticidad de la piel; el mantenimiento o mejora de la resistencia, firmeza o resistencia a la tracción de la piel.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el extracto de fermento promueve la producción de colágeno, promueve la producción de elastina, inhibe la actividad colagenasa, inhibe la actividad elastasa, inhibe la producción de AGE, inhibe la permeabilidad vascular, inhibe la formación de melanina, inhibe la actividad tirosinasa y/o promueve la degradación de bilirrubina en la piel.

8. Una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente eficaz de un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un excipiente, adyuvante y/o ingrediente cosméticamente aceptable.

9. Una composición cosmética de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el extracto de fermento se incorpora en un sistema de administración o sistema de liberación sostenida cosméticamente aceptables seleccionados del grupo formado por liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas y nanopartículas lipídicas sólidas, vehículos lipídicos nanoestructurados, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas de tensioactivo-fosfolípido, miliesferas, microesferas y nanoesferas, lipoesferas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, microemulsiones y nanoemulsiones o se adsorbe en un polímero orgánico sólido o soporte mineral sólido seleccionado del grupo formado por talco, bentonita, sílice, almidón o maltodextrina.

10. Una composición cosmética de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9, en la que esta composición se presenta en una formulación seleccionada del grupo formado por múltiples emulsiones, soluciones, cristales líquidos, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones acuosas o grasas, geles acuosos o grasos, cremas, soluciones, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, máscaras faciales, lacas, sueros cosméticos, películas de polisacáridos, ungüentos, mousses, pomadas, pastas, polvos, barras, lápices, pulverizadores o aerosoles.

11. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que dicho excipiente, adyuvante y/o ingrediente se selecciona del grupo formado por agentes que disminuyen la producción de sebo, agentes anti-seborreicos, agentes matificantes, agentes anti-acné, agentes que estimulan la síntesis de macromoléculas dérmicas o epidérmicas y/o capaces de inhibir o prevenir su degradación, agentes que estimulan la síntesis de colágeno, agentes que estimulan la síntesis de elastina, agentes que estimulan la síntesis de decorina, agentes que estimulan la síntesis de laminina, agentes que estimulan la síntesis de defensina, agentes que estimulan la síntesis de chaperona, agentes que estimulan la síntesis de AMPc, agentes que modulan AQP-3, agentes que modulan la síntesis de acuaporina, proteínas de la familia acuaporina, agentes que estimulan la síntesis de ácido hialurónico, agentes que estimulan la síntesis de glucosaminoglucano, agentes que estimulan la síntesis de fibronectina, agentes que estimulan la síntesis de sirtuína, proteínas de choque térmico, agentes que estimulan la síntesis de proteínas de choque térmico, agentes que inhiben la exocitosis neuronal, otros agentes anticolinérgicos, agentes que inhiben la contracción muscular, agentes anti-envejecimiento, agentes anti-arrugas, agentes antitranspirantes, agentes anti-inflamatorios y/o analgésicos, agentes anti-prurito, agentes calmantes, agentes anestésicos, inhibidores de la agregación del receptor de acetilcolina, agentes que inhiben la acetilcolinesterasa, agentes relajantes de la piel, agentes que estimulan o inhiben la síntesis de melanina, agentes blanqueantes o despigmentantes, agentes propigmentantes, agentes auto-bronceadores, agentes que inhiben la NO-sintasa, agentes que inhiben la 5a-reductasa, agentes que inhiben la lisil- y/o prolil hidroxilasa, antioxidantes, secuestradores de radicales libres y/o agentes frente a la contaminación atmosférica, secuestradores de especies de carbonilo reactivas, agentes anti-glicación, agentes antihistamínicos, agentes antivirales, agentes antiparasitarios, emulsionantes, emolientes, disolventes orgánicos, propelentes líquidos, acondicionadores de la piel, humectantes, sustancias que retienen la humedad, alfa hidroxi ácidos, beta hidroxi ácidos, hidratantes, enzimas hidrolíticas epidérmicas, vitaminas, aminoácidos, proteínas, pigmentos o colorantes, tintes, biopolímeros, polímeros gelificantes, espesantes, tensioactivos, agentes suavizantes, emulsionantes, agentes de unión, conservantes, agentes capaces de reducir o tratar las bolsas bajo los ojos, agentes exfoliantes, agentes queratolíticos, agentes descamantes, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, agentes fungistáticos, agentes bactericidas, agentes bacteriostáticos, agentes que estimulan la síntesis de lípidos y componentes del estrato córneo, ceramidas, ácidos grasos, agentes que inhiben la degradación del colágeno, agentes que inhiben metaloproteinasas de la matriz, agentes que inhiben la degradación de elastina, agentes que inhiben serina proteasas, agentes que estimulan la proliferación de fibroblastos, agentes que estimulan la proliferación de queratinocitos, agentes que estimulan la proliferación de adipocitos, agentes que estimulan la proliferación de melanocitos, agentes que estimulan la diferenciación de queratinocitos, agentes que estimulan o retrasan la diferenciación de adipocitos, agentes antihiperqueratosis, agentes comedolíticos, agentes anti­ psoriasis, agentes reparadores del ADN, agentes protectores del ADN, agentes protectores de las células madre, estabilizadores, agentes para el tratamiento y/o cuidado de piel sensible, agentes de firmeza, agentes anti-estrías, agentes de unión, agentes lipolíticos o agentes que estimulan la lipolisis, agentes adipogénicos, agentes que modulan la expresión de PGC-1a, agentes que modulan la actividad de PPARy, agentes que aumentan o reducen el contenido de triglicéridos de los adipocitos, agentes anti-celulitis, agentes que inhiben la actividad de PAR-2, agentes que estimulan la cicatrización, agentes cicatrizantes coadyuvantes, agentes que estimulan la reepitelización, agentes de reepitelización coadyuvantes, factores de crecimiento citocina, agentes que actúan en la circulación y/o microcirculación capilar, agentes que estimulan la angiogénesis, agentes que inhiben la permeabilidad vascular, agentes venotónicos, agentes que actúan en el metabolismo celular, agentes que mejoran la unión dérmicaepidérmica, agentes que inducen el crecimiento del pelo, agentes que inhiben o retardan el crecimiento del pelo, agentes que retardan la caída del pelo, conservantes, perfumes, absorbentes del olor y/o desodorantes que enmascaran el olor corporal, agentes quelantes, extractos de plantas, aceites esenciales, extractos marinos, agentes obtenidos de un proceso biotecnológico, sales minerales, extractos celulares, pantallas solares y agentes fotoprotectores orgánicos o minerales activos frente a rayos ultravioleta A y/o B y/o infrarrojos A, o mezclas de los mismos.

12. Un procedimiento para el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico de la piel que comprende la administración tópica a un individuo de una cantidad eficaz de un extracto de fermento de una cepa de la especie Eupenicillium crustaceum según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el tratamiento y/o cuidado cosmético no terapéutico es la despigmentación de o el blanqueamiento o la aclaración del color de la piel, las membranas mucosas, el pelo y/o las uñas; la despigmentación de o el blanqueamiento o la aclaración del color de manchas de la edad; la despigmentación de o el blanqueamiento o la aclaración del color de la piel de las ojeras; el mantenimiento o mejora de la luminosidad de la piel; el alivio o la prevención de los síntomas del envejecimiento de la piel; tratamiento de las arrugas de la piel, tales como arrugas periorbitales; tratamiento de ojeras; tratamiento de ojo hinchado; tratamiento de bolsas de los ojos; el alisado de o reducción de arrugas de la piel; la reducción del volumen de un ojo hinchado o de bolsas de los ojos; el mantenimiento o mejora de la elasticidad de la piel; el mantenimiento o mejora de la resistencia, firmeza o resistencia a la tracción de la piel.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que comprende la administración tópica a un individuo de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

15. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el individuo es caucásico o asiático y/o en el que el individuo tiene una edad superior a 20 años.