ES2779073T3 - Proceso para la formación de pocillos de biosensor - Google Patents

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Anne Aguirre
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Abstract

Un biochip que comprende: un sustrato; y una pluralidad de sitios diferenciados formados sobre el sustrato que tienen una densidad mayor que quinientos pocillos por milímetro cuadrado, en donde cada sitio diferenciado incluye: paredes laterales dispuestas sobre el sustrato para formar un pocillo, en donde el pocillo está formado al depositar sobre el sustrato un material que tiene grupos óxidos reactivos y grabar el pocillo en el material, y en donde las paredes laterales tienen una superficie superior plana dura para que se forme una membrana encima, en donde la membrana abarca todo el pocillo y lo sella; y un electrodo dispuesto en el fondo del pocillo; en donde los electrodos dispuestos en el fondo de los pocillos están organizados en una pluralidad de grupos de electrodos, en donde cada grupo de electrodos comparte un contraelectrodo común, y en donde las superficies de las paredes laterales son hidrófobas de tal manera que las superficies facilitan la formación de una membrana hidrófoba en o adyacente al pocillo.

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso para la formación de pocilios de biosensor
Referencia cruzada
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los EE. UU. n.° 61/894.661, titulada "Methods for Forming Lipid Bilayers on Biochips", presentada el 23 de octubre de 2013.
Antecedentes
Los biochips se pueden usar para diversos tipos de detección y percepción moleculares, incluida la secuenciación de moléculas de ácido nucleico. La secuenciación de ácido nucleico es un proceso que se puede usar para proporcionar información de secuencia para una muestra de ácido nucleico. Dicha información de secuencia puede ser útil para diagnosticar y/o tratar a un sujeto. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de un sujeto se puede usar para identificar, diagnosticar y posiblemente desarrollar tratamientos para enfermedades genéticas. Como ejemplo adicional, la investigación con patógenos puede conducir a un tratamiento para enfermedades contagiosas.
Existen métodos disponibles que se pueden usar para secuenciar un ácido nucleico. Sin embargo, dichos métodos son costosos y pueden no proporcionar la información de secuencia dentro de un período de tiempo y con una precisión que puede ser necesaria para diagnosticar y/o tratar a un sujeto.
Compendio
Se pueden usar nanoporos para detectar diversas moléculas que incluyen, pero no se limitan a, polímeros de secuenciación tales como moléculas de ácido nucleico. En la presente memoria descriptiva se reconoce la necesidad de biochips y métodos para producir biochips mejorados (p. ej., que comprendan nanoporos). En algunos casos, las técnicas de procesamiento semiconductoras convencionales son ineficaces para producir un dispositivo de silicio para su uso como un biochip. Por ejemplo, se proporcionan métodos que pueden producir un biochip que soporta (p. ej., se puede poner en funcionamiento durante o después del contacto con) entornos altamente corrosivos tales como disoluciones acuosas, p. ej., que comprenden iones. En otro aspecto, los métodos descritos en la presente memoria descriptiva crean una superficie de biochip que conduce a la formación de membranas orgánicas (p. ej., bicapas lipídicas). En otro aspecto, los métodos proporcionan electrodos electroquímicos necesarios para llevar a cabo mediciones eléctricas de flujos de corriente iónica en el biochip.
Entre otras cosas, los biochips producidos según los métodos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar para la identificación de moléculas de ácido nucleico y secuenciación de polímeros (p. ej., ácido nucleico). En algunas instancias, el polímero se pasa a través del nanoporo y varias subunidades del polímero (p. ej., las bases adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y/o uracilo (U) del ácido nucleico) afectan la corriente que fluye a través del nanoporo. Según se describe en la presente memoria descriptiva, las diversas subunidades se pueden identificar al medir la corriente en una pluralidad de voltajes aplicados a través del nanoporo y/o membrana. En algunos casos, la polimerización de nucleótidos identificados libera y/o presenta moléculas de identificador al nanoporo que se pueden identificar al medir la corriente en una pluralidad de voltajes aplicados a través del nanoporo y/o membrana.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para formar una bicapa lipídica para su uso en un dispositivo de percepción con nanoporo, que comprende: (a) proporcionar un chip que comprende un trayecto de flujo de fluido en comunicación continua con una pluralidad de electrodos de percepción; (b) hacer fluir una disolución lipídica por el trayecto de flujo de fluido; y (c) hacer fluir al menos una burbuja por el trayecto de flujo de fluido, para formar de este modo una bicapa lipídica adyacente a los electrodos de percepción, en donde la burbuja abarca la pluralidad de electrodos de percepción, y en donde la burbuja está adyacente a los electrodos de percepción durante al menos aproximadamente 1 segundo. En algunas realizaciones, la burbuja está adyacente a los electrodos de percepción durante entre aproximadamente 1 ms a aproximadamente 5 minutos.
En algunas realizaciones, la burbuja está adyacente a los electrodos de percepción durante al menos aproximadamente 30 segundos. En algunas realizaciones, la burbuja está adyacente a los electrodos de percepción durante como máximo aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, se forma una bicapa lipídica sobre al menos 50 % de los electrodos de percepción. En algunas realizaciones, se forma una bicapa lipídica sobre al menos 70 % de los electrodos de percepción.
En algunas realizaciones, el método comprende, además, insertar un nanoporo en las bicapas lipídicas adyacente a cada uno de los electrodos de percepción. En algunas realizaciones, el chip comprende pocillos, y en donde los electrodos de percepción están en los pocillos.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para formar una bicapa lipídica para su uso en un dispositivo de percepción con nanoporo, que comprende: (a) proporcionar un chip que comprende un trayecto de flujo de fluido en comunicación continua con una pluralidad de electrodos de percepción; (b) hacer fluir al menos una burbuja por el trayecto de flujo de fluido y adyacente a dicha pluralidad de electrodos de percepción, de manera que la burbuja abarque la pluralidad de electrodos de percepción; y (c) poner en contacto la periferia de la burbuja con un lípido, en donde el lípido se dispersa debajo de la burbuja y por el trayecto de flujo de fluido y forma de este modo una bicapa lipídica adyacente a los electrodos de percepción.
En algunas realizaciones, la burbuja se pone en contacto con el lípido durante al menos aproximadamente 30 segundos. En algunas realizaciones, la burbuja se pone en contacto con el lípido durante entre aproximadamente 5 ms a aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, se forma una bicapa lipídica sobre al menos 70 % de los electrodos de percepción. En algunas realizaciones, el método comprende, además, insertar un nanoporo en las bicapas lipídicas adyacente a cada uno de los electrodos de percepción. En algunas realizaciones, el nanoporo es porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA, por sus siglas en inglés), alfa-hemolisina, cualquier proteína que tiene al menos 70 % de homología con respecto a al menos una de porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA) o alfa-hemolisina, o cualquier combinación de estas.
En algunas realizaciones, insertar el nanoporo comprende aplicar un estímulo eléctrico a través de dicho electrodo para facilitar la inserción de dicho nanoporo en dicha bicapa lipídica. En algunas realizaciones, dicha bicapa lipídica exhibe una resistencia mayor que aproximadamente 1 GQ.
En algunas realizaciones, dicha bicapa lipídica y dicha proteína nanoporo juntas exhiben una resistencia de aproximadamente 1 GQ o menor. En algunas realizaciones, dicho lípido comprende un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, dicha burbuja es una burbuja de vapor. En algunas realizaciones, el chip comprende pocillos, y en donde los electrodos de percepción están en los pocillos.
En algunas realizaciones, dicho lípido se selecciona del grupo que consiste en difitanoil-fosfatidilcolina (DPhPC), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3fosfocolina, 1,2-Di-O-fitanil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DoPhPC), palmitoiloleoil-fosfatidil-colina (POPC), dioleoil-fosfatidil-metiléster (DOPME), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, esfingomielina, 1,2-di-O-fitanil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-lactosil; GM1 Gangliósido, Lisofosfatidilcolina (LPC, por sus siglas en inglés) o cualquier combinación de estos.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema de percepción con nanoporo, que comprende: (a) un chip que comprende un trayecto de flujo de fluido en comunicación continua con una pluralidad de electrodos de percepción, en donde cada uno de dichos electrodos de percepción está configurado para detectar una corriente iónica después de un evento de incorporación de ácido nucleico; y (b) un sistema de control acoplado a dicho chip, dicho sistema de control está programado para: (i) hacer fluir una disolución lipídica por el trayecto de flujo de fluido; (ii) hacer fluir al menos una burbuja por el trayecto de flujo de fluido y adyacente a los electrodos de percepción durante un período de tiempo de al menos aproximadamente 1 segundo, en donde la burbuja abarca la pluralidad de electrodos de percepción, y en donde el flujo de la burbuja por el trayecto de flujo de fluido forma una bicapa lipídica adyacente a los electrodos de percepción. En algunas realizaciones, la burbuja está adyacente a los electrodos de percepción durante un período de tiempo de entre aproximadamente 5 ms a aproximadamente 5 minutos.
En algunas realizaciones, el chip comprende pocillos, y en donde los electrodos de percepción están en los pocillos. En algunas realizaciones, el sistema de control es externo con respecto a dicho chip. En algunas realizaciones, el sistema de control comprende un procesador de ordenador. En algunas realizaciones, el método comprende, además, un sistema de flujo de fluido acoplado funcionalmente a dicho sistema de control y dicho chip, en donde dicho sistema de flujo de fluido está configurado para dirigir el flujo de dicha disolución lipídica y dicha burbuja.
En la presente memoria descriptiva se describe un biochip que comprende un sustrato y una pluralidad de sitios diferenciados formados sobre el sustrato que tienen una densidad mayor que quinientos pocillos por milímetro cuadrado, en donde cada sitio diferenciado incluye paredes laterales dispuestas sobre el sustrato para formar un pocillo y un electrodo dispuesto en el fondo del pocillo. En una realización, los pocillos se forman de tal manera que se reduce la diafonía entre los pocillos. En algunas realizaciones, el electrodo dispuesto en el fondo del pocillo deriva la mayor parte de su señal de un nanoporo o una membrana más cercana al electrodo. En algunas realizaciones, los electrodos dispuestos en el fondo de los pocillos se organizan en una pluralidad de grupos de electrodos. En algunas realizaciones, cada grupo de electrodos comparte un contraelectrodo común. En algunas realizaciones, el electrodo dispuesto en el fondo del pocillo tiene un contraelectrodo dedicado. En algunas realizaciones, las superficies de las paredes laterales están silanizadas de tal manera que las superficies faciliten la formación de una membrana en o adyacente al pocillo. En una realización adicional, las superficies de las paredes laterales son hidrófobas de tal manera que las superficies faciliten la formación de una membrana hidrófoba en o adyacente al pocillo. En una realización adicional, facilitar la formación de una membrana en o adyacente al pocillo comprende facilitar la adherencia de la membrana a las superficies silanizadas. En algunas realizaciones, las superficies de las paredes laterales se silanizan al cubrir las paredes laterales con una capa de moléculas de alcoxisilano organofuncionales. En una realización adicional, la capa de moléculas tiene una molécula de espesor.
Los aspectos y ventajas adicionales de la presente descripción se volverán evidentes sin inconvenientes para los expertos en esta técnica a partir de la siguiente descripción detallada, en donde solo se muestran y describen realizaciones ilustrativas de la presente descripción. Como se observará, la presente descripción puede tener otras y diferentes realizaciones, y sus diversos detalles pueden sufrir modificaciones en diversos sentidos obvios, todos sin apartarse de la descripción. Por consiguiente, los dibujos y la descripción deben tomarse como de naturaleza ilustrativa y no como restrictivos.
Breve descripción de los dibujos
Las nuevas características de la invención se establecen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor compresión de las características y ventajas de la presente invención mediante referencia a la siguiente descripción detallada que establece realizaciones ilustrativas, en las que se usan los principios de la invención, y los dibujos que se acompañan, de los cuales:
la figura 1 muestra un electrosensor basado en poros;
la figura 2 muestra un biochip de nanoporos;
la figura 3 muestra una matriz de electrodos donde el contenedor se duplica como un contraelectrodo;
la figura 4 muestra una matriz de electrodos con un contraelectrodo común;
la figura 5 muestra una matriz de electrodos donde tiras de sensores comparten un contraelectrodo común; la figura 6 muestra y matriz de electrodos donde cada electrodo tiene un contraelectrodo independiente; la figura 7 muestra un ejemplo de una fila de pocillos de sensor que comparten una reserva de electrolitos; la figura 8 muestra un ejemplo de un sustrato semiconductor;
la figura 9 muestra una capa de dióxido de silicio depositada sobre un sustrato semiconductor;
la figura 10 muestra un material fotorresistente depositado sobre una capa de dióxido de silicio;
la figura 11 muestra un área del material fotorresistente que se expone a radiación para definir el área de un pocillo;
la figura 12 muestra una porción del dióxido de silicio que se va a retirar mediante un procedimiento de grabado en seco;
la figura 13 muestra dióxido de silicio adicional que se va a retirar mediante un procedimiento de grabado húmedo para crear un pocillo;
la figura 14 muestra el depósito de una capa de adhesión de titanio;
la figura 15 muestra el depósito de una capa protectora de nitruro de titanio con capa protectora de platino o alternativamente con el platino que sirve como el electrodo;
la figura 16 muestra el depósito de un material de electrodo de plata;
la figura 17 muestra la separación vertical del material fotorresistente y los materiales dispuestos sobre él; la figura 18 muestra la silanización del dióxido de silicio;
la figura 19 muestra la carga del pocillo con un gel;
la figura 20 muestra la creación de una membrana con un nanoporo sobre el pocillo;
la figura 21 muestra un biochip donde el electrodo de plata sobresale por las paredes laterales del pocilio; la figura 22 muestra una burbuja grande sostenida adyacente a una pluralidad de electrodos;
la figura 23 muestra un ejemplo de un método para formar una capa lipídica sobre los electrodos en uno o más canales de flujo del chip del sensor cebado;
la figura 24 muestra un ejemplo de un chip de sensor semiconductor;
la figura 25 muestra un ejemplo de una configuración de celda de flujo;
la figura 26 muestra un ejemplo de un chip envasado; y
la figura 27 muestra un ejemplo de formación y estallido de bicapa automatizados con una bomba.
La figura 28 es un diagrama de flujo para una configuración de chip automático. Esta prueba confirmaría que la mayoría de las celdas en el chip son aceptables. Si una cantidad insuficiente de celdas (según lo determina el operador) pasa la prueba, entonces todo el chip fallará.
La figura 29 es un diagrama de flujo para una bomba automática para la formación de la bicapa.
La figura 30 es una ilustración del flujo de diversas disoluciones y/o burbujas sobre los pocillos de un chip de sensor. La dirección del flujo se indica mediante la flecha rellena en la esquina inferior derecha del diagrama. En esta figura, el primer rectángulo que representa la disolución iónica (3001; rectángulo con patrón divot) ya ha fluido sobre los pocillos (3010), la disolución lipídica (3015; rectángulo con trama) está sobre el chip (y en esta representación cubre todos los pocillos) y el segundo y tercer rectángulos que representan la disolución iónica, así como la burbuja (3005; rectángulo sin relleno) todavía no han fluido sobre el chip. El tamaño de los rectángulos no es representativo de la cantidad de fluido ni del tamaño de la burbuja. La secuencia disolución iónica-burbuja-disolución iónica se puede repetir varias veces para aumentar la cobertura de la bicapa, disminuir la cobertura de lo que no es bicapa, p. ej., pilas multicapa de lípidos sobre los pocillos y/o reestablecer la bicapa después de una prueba de estallido. La bicapa lipídica se formará en la interfaz (3020) de los pocillos (se muestra) o electrodos sustancialmente planos (no se muestra) una vez que se lleve a cabo el método descrito en la presente memoria descriptiva.
Descripción detallada
Aunque se han mostrado y descrito diversas realizaciones de la invención en la presente memoria descriptiva, será obvio para los expertos en la técnica que dichas realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo solamente. Se les pueden ocurrir numerosas variaciones, cambios y sustituciones a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Se entenderá que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria descriptiva.
El término "nanoporo", según se usa en la presente memoria descriptiva, generalmente se refiere a un poro, canal o pasaje formado o de cualquier otra manera proporcionado en una membrana. Una membrana puede ser una membrana orgánica, tal como una bicapa lipídica, o una membrana sintética, tal como una membrana formada con un material polimérico. La membrana puede ser un material polimérico. El nanoporo se puede disponer adyacente o en proximidad a un circuito de percepción o un electrodo acoplado a un circuito de percepción, tal como, por ejemplo, un semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS, por sus siglas en inglés) o circuito de transistor de efecto de campo (FET, por sus siglas en inglés). En algunos ejemplos, un nanoporo tiene un ancho o diámetro característico en el orden de 0,1 nanómetros (nm) a aproximadamente 1000 nm. Algunos nanoporos son proteínas. Alfa hemolisina es un ejemplo de un nanoporo proteico.
El término "polimerasa", según se usa en la presente memoria descriptiva, generalmente se refiere a cualquier enzima capaz de catalizar una reacción de polimerización. Los ejemplos de polimerasas incluyen, sin limitación, una polimerasa o una ligasa de ácido nucleico. Una polimerasa puede ser una enzima de polimerización.
El término "ácido nucleico", según se usa en la presente memoria descriptiva, generalmente se refiere a una molécula que comprende una o más subunidades de ácido nucleico. Un ácido nucleico puede incluir una o más subunidades seleccionadas de adenosina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U), o variantes de estas. Un nucleótido puede incluir A, C, G, T o U, o variantes de estos. Un nucleótido puede incluir cualquier subunidad que se puede incorporar en una hebra de ácido nucleico creciente. Dicha subunidad puede ser A, C, G, T, o U, o cualquier otra subunidad que es específica para una o más A, C, G, T o U complementarias, o complementaria a una purina (es decir, A o G, o variante de esta) o una pirimidina (es decir, C, T o U, o variante de esta). Una subunidad puede permitir resolver bases de ácido nucleico individuales o grupos de bases (p. ej., AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TG, AC, CA, o contrapartes de uracilo de estas). En algunos ejemplos, un ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), o derivados de estos. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario.
Un "polinucleótido" u "oligonucleótido" es un polímero u oligómero que comprende uno o más nucleótidos según se definen en la presente memoria descriptiva. Un polinucleótido u oligonucleótido puede comprender un polinucleótido u oligonucleótido de ADN, un polinucleótido u oligonucleótido de a Rn , o una o más secciones de polinucleótido u oligonucleótido de ADN y/o polinucleótido u oligonucleótido de ARN.
Según se usa en la presente memoria descriptiva, un "nucleótido" o "base" puede ser un nucleótido primario o un análogo nucleotídico. Un nucleótido primario es mono-fosfato de desoxiadenosina (dAMP, por sus siglas en inglés), mono-fosfato de desoxicitidina (dCMP, por sus siglas en inglés), mono-fosfato de desoxiguanosina (dGMP, por sus siglas en inglés), mono-fosfato de desoxitimidina (dTMP, por sus siglas en inglés), monofosfato de adenosina (AMP, por sus siglas en inglés), mono-fosfato de citidina (CMP, por sus siglas en inglés), mono-fosfato de guanosina (GMP, por sus siglas en inglés) o mono-fosfato de uridina (UMP, por sus siglas en inglés). Un análogo nucleotídico es un análogo o mímico de un nucleótido primario que tiene modificación en la nucleobase primaria (A, C, G, T y U), la estructura desoxirribosa/ribosa, el grupo fosfato del nucleótido primario, o cualquier combinación de estos. Por ejemplo, un análogo nucleotídico puede tener una base modificada, ya sea que existe naturalmente o hecha por el hombre. Los ejemplos de bases modificadas incluyen, sin limitación, nucleobases metiladas, bases purina modificadas (p. ej., hipoxantina, xantina, 7-metilguanina, isodG), bases pirimidina modificadas (p. ej., 5,6-dihidrouracilo y 5-metilcitosina, isodC), bases universales (p. ej., 3-nitropirrol y 5-nitroindol), mímicos de base sin unión (p. ej., 4-metilbecimidazol y 2,4-diflurotolueno o benceno) y sin base (nucleótido abásico donde el análogo nucleotídico no tiene una base). Los ejemplos de análogos nucleotídicos que tienen estructura de desoxirribosa (p. ej., didesoxinucleósidos tales como didesoxiguanosina, didesoxiadenosina, didesoxitimidina y didesoxicitidina) y/o fosfato modificada (denominadas juntas la estructura de esqueleto) incluyen, sin limitación, nucleótidos de glicol, morfolinos y nucleótidos bloqueados.
El término "% de homología" se usa de manera intercambiable en la presente memoria descriptiva con el término "% de identidad" en la presente memoria descriptiva y se refiere al nivel de identidad de secuencia de ácido nucleico o aminoácidos entre la secuencia de ácido nucleico que codifica uno cualquiera de los polipéptidos de la invención o la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención, cuando se alinean mediante el uso de un programa de alineación de secuencias.
Por ejemplo, según se usa en la presente memoria descriptiva, 80 % de homología significa lo mismo que 80 % de identidad de secuencia, determinada mediante un algoritmo definido y, por consiguiente, un homólogo de una secuencia dada tiene más de 80 % de identidad de secuencia a lo largo de una longitud de la secuencia dada. Los niveles ilustrativos de identidad de secuencia incluyen, pero no se limitan a, 80, 85, 90, 95, 98 % o más identidad de secuencia con respecto a una secuencia dada, p. ej., la secuencia codificante de uno cualquiera de los polipéptidos de la invención, según se describen en la presente memoria descriptiva. Los programas informáticos ilustrativos que se pueden usar para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas BLAST, p. ej., BLASTN, BLASTX y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, disponibles públicamente en Internet. Véase también, Altschul, et al., 1990 y Altschul, et al., 1997.
Las búsquedas de secuencias típicamente se llevan a cabo mediante el uso del programa BLASTN cuando se evalúa una secuencia de ácido nucleico dada con respecto a secuencias de ácido nucleico en las secuencias de ADN de GenBank y otras bases de datos públicas. El programa BLASTX se prefiere para buscar secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura con respecto a secuencias de aminoácidos en las secuencias de proteínas de GenBank y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTN como BLASTX se ejecutan con el uso de parámetros predeterminados de una penalización de espacio abierto de 11,0, y una penalización de espacio extendido de 1,0 y usan la matriz BLOSUM-62 (véase p. ej., Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997.)
Una alineación preferida de secuencias seleccionadas para determinar el "% de identidad" entre dos o más secuencias, se lleva a cabo al usar, por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en versión MacVector 13.0.7, operado con parámetros predeterminados, incluida una penalización por espacio abierto de 10,0, una penalización por espacio extendido de 0,1 y una matriz de similitud BLOSUm 30.
Biochips y secuenciación de ácido nucleico
Los sensores basados en poros (p. ej., biochips) se pueden usar para la electrointerrogación de moléculas simples. Un sensor basado en poros de la presente descripción puede incluir un nanoporo formado en una membrana que se dispone adyacente o próxima a un electrodo de percepción. El sensor puede incluir un contraelectrodo. La membrana incluye un lado trans (es decir, el lado orientado hacia el electrodo de percepción) y un lado cis (es decir, lado orientado hacia el contraelectrodo).
Ahora se hará referencia a las figuras, en donde los numerales similares hacen referencia a partes similares de principio a fin. Se apreciará que las figuras y características en ellas no están necesariamente dibujadas a escala.
Con referencia a la figura 1, una medición eléctrica típica puede operar en una molécula a prueba que está asociada estrechamente a un poro (p. ej., la unión puede ser química, mecánica, eléctrica o electroquímica). El sistema puede aplicar un estímulo (voltaje o corriente) a través de complejo molécula/poro y medir la respuesta. Para aislar la medición al complejo poro/molécula, los dos lados del poro están generalmente separados mediante un material altamente aislante (p. ej., una bicapa lipídica).
Los volúmenes encerrados en los lados opuestos de la barrera aislante se denominan el pocillo cis y el pocillo trans con la definición general de que la especie de interés (p. ej., la molécula de ácido nucleico o molécula identificadora) pasa de cis a trans durante la detección. El pocillo trans es generalmente el lado de la membrana aislante proximal a y eléctricamente conectado con los electrodos del chip.
La figura 2 muestra un ejemplo de un biochip (o sensor) de nanoporos que tiene control de temperatura, como se puede preparar según los métodos descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2011/0193570, que se incorpora en su totalidad en la presente memoria descriptiva por referencia. Con referencia a la figura 2, el detector de nanoporos comprende un electrodo superior 201 en contacto con una disolución conductora (p. ej., disolución salina) 207. Un electrodo conductor inferior 202 está cerca, adyacente o próximo a un nanoporo 206, que se inserta en una membrana 205. La membrana 205 se puede disponer sobre un pocillo 210, o directamente sobre un electrodo, donde el sensor 202 forma parte de la superficie del pocillo. En algunas instancias, el electrodo conductor inferior 202 está integrado en un semiconductor 203 en el que se integra un sistema de circuitos eléctricos en un sustrato semiconductor 204. Una superficie del semiconductor 203 se puede tratar para que sea hidrófoba. Una molécula que se detecta va a través del poro en el nanoporo 206. El sensor de chip semiconductor se coloca en un envase 208 y este, a su vez, está en los alrededores de un elemento de control de temperatura 209. El elemento de control de temperatura 209 puede ser un dispositivo de calentamiento y/o enfriamiento termoeléctrico (p. ej., dispositivo Peltier). Múltiples detectores de nanoporo pueden formar una matriz de nanoporos.
En algunas realizaciones, el biochip comprende un contraelectrodo capaz de formar un circuito eléctrico con el electrodo en el pocillo. En algunos casos, la pluralidad de electrodos en la pluralidad de pocillos comparte un contraelectrodo común. La figura 3 muestra una matriz de electrodos que tiene un contraelectrodo común donde el perímetro de contención de líquido (p. ej., contenedor) actúa como un contraelectrodo (p. ej., es conductor y forma un circuito). Otra realización de un contraelectrodo se muestra en la figura 4, donde el contraelectrodo es una placa (p. ej., hecha con un metal conductor) por encima de los nanoporos. Como se muestra en la figura 5 y la figura 6, la pluralidad de electrodos en la pluralidad de pocillos se puede organizar en grupos que comparten un contraelectrodo común. En algunos casos, (p. ej., la figura 6), la pluralidad de electrodos en la pluralidad de pocillos tiene cada uno un contraelectrodo dedicado. En algunos casos, tener una pluralidad de contraelectrodos puede permitir que un electrodo de percepción individual, o solo unos pocos electrodos de percepción, se emparejen con un contraelectrodo simple y, por lo tanto, mejorar posiblemente la respuesta eléctrica y el rendimiento de los pares de percepción-contraelectrodos
En algunos casos, una pluralidad de pocillos (incluido cualquier subconjunto de la cantidad total de pocillos) comprende una reserva de electrolitos común. Según se muestra en la figura 7, los pocillos 701 se pueden separar en filas mediante paredes 702 de manera que la fila de pocillos comparte una reserva de electrolitos común por encima de los pocillos. Separar el biochip en secciones según se describe en la presente puede permitir analizar múltiples muestras en un único biochip (p. ej., al colocar diferentes muestras en secciones diferentes del chip).
Un sensor de nanoporo puede incluir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 nanoporos (p. ej., hemolisina o acuaporina, etc. o combinaciones de estos) adyacentes a un electrodo (p. ej., el electrodo conductor inferior 202). Un sensor de nanoporos puede incluir un electrodo superior (p. ej., el electrodo superior 201) que es para uso exclusivo del sensor de nanoporos (y no para otros sensores), o como alternativa, se puede proporcionar un electrodo superior para su uso por múltiples sensores de nanoporos.
Procesamiento del biochip
Controlar las características de superficie, el volumen de la cavidad del pocillo y la composición y volumen del electrodo pueden ser grandes desafíos en el desarrollo de un semiconductor ampliable basado en una matriz plana de micropocillos con el fin de percibir nanoporos. En algunas instancias, la plataforma de percepción de matriz semiconductora basada en nanoporos ideal cumpliría los siguientes objetivos: (1) características de superficie de chip que soportan una membrana aislante plana, (2) características de superficie diferenciadas que resultan en una superficie de membrana plana bien definida y bien controlada, (3) gran volumen de electrolitos en pocillos trans, (4) gran volumen de electrodos, (5) baja diafonía eléctrica entre electrodos del sensor adyacentes en la matriz, (6) alta densidad de celdas para lograr tamaños de matriz muy grandes, y (7) mediciones estables de duración muy larga en las que los parámetros clave (voltaje, resistencia, etc.) permanecen casi constantes.
Por ejemplo, cumplir los objetivos (1) y (2) puede ser difícil dado que, en particular, puede ser necesario garantizar que se forme una barrera altamente aislante (resistiva) con áreas de membrana y volúmenes de pocillos trans bien controlados.
En el caso de que se forma una membrana de bicapa lipídica, el diseño y el procesamiento del chip se pueden adaptar para crear superficies hidrófobas (o lipófilas) y superficies hidrófilas (o lipófobas). El control cuidadoso de la superficie del chip permite definir áreas hidrófilas e hidrófobas bien definidas. A su vez, se puede controlar con esto la estructura y las características de las membranas de bicapa lipídica formadas. El objetivo (3) puede ser importante para garantizar que los iones electrolíticos de los pocillos trans sean suficientemente abundantes para que no afectan los resultados durante la duración de una medición típica. Esto podría producirse al agotar uno o el otro de los iones completamente o desplazar la concentración relativa de los diversos iones hasta un grado tal que cambien los resultados de la medición sustancialmente (es decir, a través de desplazamiento en el gradiente de concentración y que resultan en el potencial Nernst). El objetivo (4) puede ser importante en el caso de un electrodo sacrificial que se consume o convierte como parte de la reacción electroquímica que respalda la medición (p. ej., plata que se convierte en reacción de oxidación de cloruro de plata). Tener un volumen de electrodos alto puede ser importante para: (i) aumentar el tiempo en que una medición se puede llevar a cabo de manera continua sin mediciones de "recarga" intercaladas que pueden alterar el experimento completamente o resultan en espacios en los datos medidos y (ii) reducir los posibles desplazamientos electroquímicos causados por la carga en concentraciones relativas de las concentraciones del electrodo oxidados y reducidos. En algunos casos, el agotamiento completo del material del electrodo (plata) fija un límite superior teórico en la duración de la medición continua práctica. Desafortunadamente, varios de estos objetivos pueden generar conflictos cuando se alcanza un objetivo a expensas de otro. Por ejemplo, grabar una cavidad profunda en la superficie de silicio y cargarla completamente con plata puede lograr una membrana plana en la superficie metal/silicio, para lograr así los objetivos (1), (2) y (4), sin embargo, no deja ningún volumen restante disponible para los electrolitos del pocillo trans. De manera similar, minimizar la diafonía eléctrica (objetivo 5) se puede lograr al separar celdas adyacentes alejándolas; sin embargo, esto se logra a expensas de cumplir el objetivo (6).
En diversos aspectos, los biochips y métodos para producir biochips descritos en la presente memoria descriptiva pueden cumplir los objetivos (1) a (6) de un modo que es capaz de secuenciar moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, el desarrollo de una estructura de cavidad vertical de pocillo profundo para soportar el electrolito y el material de electrodo puede cumplir los objetivos (3) y (4); un grabado híbrido húmedo/seco puede aumentar las dimensiones laterales y, por lo tanto, el volumen del pocillo trans puede cumplir los objetivos (1), (2), (3) y (4); la silanización selectiva de las superficies de óxido puede cumplir los objetivos (1) y (2); el uso de un gel se puede usar para equilibrar los objetivos (3) y (4), mientras simultáneamente se cumplen los objetivos (1) y (2); la implementación de contraelectrodo distribuido puede cumplir simultáneamente los objetivos (5) y (6); el uso de reposición (recarga) del electrodo puede cumplir el objetivo (7); el uso de electrodos no sacrificiales (cuando sea viable) puede cumplir el objetivo (7); la galvanoplastia puede aumentar el material del electrodo para cumplir el objetivo (4); o cualquier combinación de estos. Características del biochip
En un aspecto, un biochip comprende (a) un sustrato semiconductor; (b) una capa de dióxido de silicio dispuesta sobre el sustrato, en donde se forma un pocillo en el dióxido de silicio; (c) un material resistente a la corrosión que recubre el interior del pocillo; (d) un material de electrodo en el pocillo que carga alguna fracción de dicho pocillo, que incluye cargar completamente el pocillo de óxido para que sea coplanaria con la superficie del óxido; y (e) una capa de alcoxisilano organofuncional que recubre el dióxido de silicio. En algunas realizaciones, el biochip comprende, además, una membrana que aísla un primer fluido en el pocillo de un segundo fluido fuera del pocillo. La presente invención también abarca los biochips producidos mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria descriptiva y el uso de cualquiera de los biochips descritos en la presente memoria descriptiva o biochips producidos mediante los métodos descritos en la presente memoria descriptiva para secuenciar polímeros que incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico.
En algunos casos, el material del electrodo no se agota durante el funcionamiento del biochip. En un aspecto, un biochip comprende una pluralidad de pocillos que tienen una membrana dispuesta sobre el pocillo y un electrodo en el pocilio que es capaz de detectar cambios en el flujo de iones a través de un poro en la membrana en respuesta a entidades que pasan a través del poro, en donde el electrodo no se agota durante la detección. En algunas realizaciones, el electrodo es sustancialmente plano con la superficie del biochip, es decir, el pocillo se carga completamente con metal.
El electrodo (p. ej., material de plata o platino) puede tener cualquier masa o volumen adecuado. En algunos casos, el volumen del electrodo es aproximadamente 0,1 femto-litro (fL), aproximadamente 0,5 fL, aproximadamente 1 fL, aproximadamente 5 fL o aproximadamente 10 fL. En algunas instancias, el volumen del electrodo es al menos aproximadamente 0,1 femto-litro (fL), al menos aproximadamente 0,5 fL, al menos aproximadamente 1 fL, al menos aproximadamente 5 fL o al menos aproximadamente 10 fL. En algunas realizaciones, el volumen del electrodo es como máximo aproximadamente 0,1 femto-litro (fL), como máximo aproximadamente 0,5 fL, como máximo aproximadamente 1 fL, como máximo aproximadamente 5 fL o como máximo aproximadamente 10 fL.
El electrodo puede estar hecho con cualquier material adecuado, incluidas mezclas y aleaciones de materiales. Algunos ejemplos incluyen platino, plata o cualquier combinación de estos. En algunos casos, el material del electrodo no se consume durante el funcionamiento del electrodo. El electrodo puede comprender un material que tiene al menos dos estados de oxidación y/o un material que es capaz de aceptar y donar electrones.
Chip con pocillo estrechamente empacados, profundos
Tener una densidad alta de sensores de nanoporos en el biochip puede ser deseable para tener un dispositivo pequeño y/o percibir o secuenciar una gran cantidad de moléculas con un dispositivo de biochip pequeño. La superficie comprende cualquier densidad adecuada de sitios diferenciados (p. ej., una densidad adecuada para secuenciar una muestra de ácido nucleico en una cantidad dado de tiempo o por un costo dado). En una realización, la superficie tiene una densidad de sitios diferenciados mayor o igual que aproximadamente 500 sitios por 1 mm2. En algunas realizaciones, la superficie tiene una densidad de sitios diferenciados de aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1000, aproximadamente 2000, aproximadamente 3000, aproximadamente 4000, aproximadamente 5000, aproximadamente 6000, aproximadamente 7000, aproximadamente 8000, aproximadamente 9000, aproximadamente 10.000, aproximadamente 20.000, aproximadamente 40.000, aproximadamente 60.000, aproximadamente 80.000, aproximadamente 100.000, o aproximadamente 500.000 sitios por 1 mm2. En algunas realizaciones, la superficie tiene una densidad de sitios diferenciados de al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 2000, al menos aproximadamente 3000, al menos aproximadamente 4000, al menos aproximadamente 5000, al menos aproximadamente 6000, al menos aproximadamente 7000, al menos aproximadamente 8000, al menos aproximadamente 9000, al menos aproximadamente 10000, al menos aproximadamente 20.000, al menos aproximadamente 40.000, al menos aproximadamente 60.000, al menos aproximadamente 80.000, al menos aproximadamente 100.000 o al menos aproximadamente 500.000 sitios por 1 mm2.
Un biochip con una alta densidad de sitios diferenciados generalmente resulta en un pocillo con un área pequeña. En algunas instancias, el pocillo es adecuadamente profundo (p. ej., de manera que el pocillo tengo un volumen adecuadamente grande). En algunas instancias, el pocillo es sustancialmente coplanario con la superficie del chip (es decir, el pocillo se carga completamente con metal). En un aspecto, el volumen del pocillo es adecuadamente grande de manera que la concentración de iones no se agote completamente en el pocillo antes de recargar el electrodo. En un aspecto, el electrodo puede ser un electrodo sacrificial (p. ej., un electrodo cuyo volumen disminuye y/o aumenta durante la detección, tal como plata) y el volumen del pocillo es adecuadamente grande de manera que el electrodo no se agote completamente antes de recargar el electrodo. En algunas realizaciones, el pocillo contiene un volumen suficientemente grande de material de electrodo tal como plata. En estos aspectos, entre otros, el volumen del pocillo puede limitar el tiempo en el que el electrodo es capaz de detectar una corriente (es decir, antes de que un ion se agote y/o el material de electrodo se agote).
En algunas realizaciones, los pocillos tienen un volumen adecuadamente grande de manera que el electrodo puede detectar el flujo de iones (p. ej., corriente) durante aproximadamente 50 ps, aproximadamente 100 ps, aproximadamente 150 ps, aproximadamente 200 ps, aproximadamente 250 ps, aproximadamente 300 ps, aproximadamente 350 ps, aproximadamente 400 ps, aproximadamente 450 ps, aproximadamente 500 ps, aproximadamente 550 ps, aproximadamente 600 ps, aproximadamente 650 ps, aproximadamente 700 ps, aproximadamente 750 ps, aproximadamente 800 ps, aproximadamente 850 ps, aproximadamente 900 ps, aproximadamente 950 ps, aproximadamente 1 ms, aproximadamente 5 ms, aproximadamente 10 ms, aproximadamente 50 ms, aproximadamente 100 ms, aproximadamente 500 ms, aproximadamente 1 s, aproximadamente 5 s, aproximadamente 10 s, aproximadamente 50 s, aproximadamente 100 s, aproximadamente 500 s, aproximadamente 1000 s o aproximadamente 5000 s. En algunas realizaciones, los pocilios tienen un volumen adecuadamente grande de manera que el electrodo puede detectar el flujo de iones (p. ej., corriente) durante al menos aproximadamente 50 ps, al menos aproximadamente 100 ps, al menos aproximadamente 150 ps, al menos aproximadamente 200 ps, al menos aproximadamente 250 ps, al menos aproximadamente 300 ps, al menos aproximadamente 350 ps, al menos aproximadamente 400 ps, al menos aproximadamente 450 ps, al menos aproximadamente 500 ps, al menos aproximadamente 550 ps, al menos aproximadamente 600 ps, al menos aproximadamente 650 ps, al menos aproximadamente 700 ps, al menos aproximadamente 750 ps, al menos aproximadamente 800 ps, al menos aproximadamente 850 ps, al menos aproximadamente 900 ps, al menos aproximadamente 950 ps, al menos aproximadamente 1 ms, al menos aproximadamente 5 ms, al menos aproximadamente 10 ms, al menos aproximadamente 50 ms, al menos aproximadamente 100 ms, al menos aproximadamente 500 ms, al menos aproximadamente 1 s, al menos aproximadamente 5 s, al menos aproximadamente 10 s, al menos aproximadamente 50 s, al menos aproximadamente 100 s, al menos aproximadamente 500 s, al menos aproximadamente 1000 s o al menos aproximadamente 5000 s.
Al equilibrar el voltaje potencial aplicado a través del electrodo y recargar o redistribuir así los iones a ambos lados del poro bicapa, la vida útil de recolección de datos del poro se puede extender significativamente hasta 10, 20 o 48 horas o más. Un ejemplo sería en un sistema de nanoporos con 300mM de disolución iónica de KCI a pH 7,5, para aplicar 120 mV a través de un poro bicapa durante 30 segundos y después reducir el voltaje hasta -120 mV durante 40 segundos. El ciclo se repite en este modo de cambio de CC lento y la distribución de carga iónica del lado CIS y TRANS del poro bicapa permanece equilibrado, así como la composición de Ag y AgCI presente en uno o más electrodos de plata que también permanece en equilibrio. El resultado es un detector de poros para recolección de datos de larga vida. El nivel o magnitud de los voltajes positivos y negativos y el tiempo pasado en polaridad o - se pueden variar para adaptarlos a las concentraciones de disolución salina o iónica y el tipo de poro que se está usando.
El tiempo de detección puede depender al menos en parte de la magnitud del voltaje aplicado a través del nanoporo y/o membrana (p. ej., con magnitudes de voltaje más altas que resultan en una corriente de iones más alta, más rápido es el agotamiento de los electrodos y, por lo tanto, los períodos de detección son relativamente más cortos). En algunas realizaciones, la diferencia de voltaje a través de la membrana es de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 1 V, positivo o negativo, p. ej., aproximadamente 40 mV, aproximadamente 60 mV, aproximadamente 80 mV, aproximadamente 100 mV, aproximadamente 120 mV, aproximadamente 140 mV, aproximadamente 160 mV, aproximadamente 180 mV, aproximadamente 200 mV, aproximadamente 300 mV, aproximadamente 400 mV, o aproximadamente 500 mV. En algunas realizaciones, la diferencia de voltaje a través de la membrana es de como máximo aproximadamente 40 mV, como máximo aproximadamente 60 mV, como máximo aproximadamente 80 mV, como máximo aproximadamente 100 mV, como máximo aproximadamente 120 mV, como máximo aproximadamente 140 mV, como máximo aproximadamente 160 mV, como máximo aproximadamente 180 mV, como máximo aproximadamente 200 mV, como máximo aproximadamente 300 mV, como máximo aproximadamente 400 mV o como máximo aproximadamente 500 mV. En algunas realizaciones, la diferencia de voltaje a través de la membrana es de al menos aproximadamente 0 mV a aproximadamente 1 V, positivo o negativo, p. ej., al menos aproximadamente 40 mV, al menos a aproximadamente 60 mV, al menos aproximadamente 80 mV, al menos aproximadamente 100 mV, al menos aproximadamente 120 mV, al menos aproximadamente 140 mV, al menos aproximadamente 160 mV, al menos aproximadamente 180 mV, al menos aproximadamente 200 mV, al menos aproximadamente 300 mV, al menos aproximadamente 400 mV o al menos aproximadamente 500 mV. El voltaje puede ser constante o variable (p. ej., variar en cualquier forma de onda periódica).
En algunas situaciones, el electrodo tiene una vida útil de al menos aproximadamente 1 minuto ("min"), 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas o 12 horas con un potencial aplicado de al menos aproximadamente 0 mV a aproximadamente 1 V, positivo o negativo, p. ej., aproximadamente 40 mV, aproximadamente 60 mV, aproximadamente 80 mV, aproximadamente 100 mV, aproximadamente 120 mV, aproximadamente 140 mV, aproximadamente 160 mV, aproximadamente 180 mV, aproximadamente 200 mV, aproximadamente 300 mV, aproximadamente 400 mV o aproximadamente 500 mV. En algunos ejemplos, el electrodo tiene una vida útil de al menos aproximadamente 15 min con un potencial aplicado de aproximadamente 80 mV.
La vida útil del electrodo se puede evaluar en función del agotamiento (p. ej., la velocidad de agotamiento) del electrodo durante el uso. En algunos casos, el material de electrodo se agota en como máximo a aproximadamente 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,1 % o 0,01 % dentro de un período de tiempo que es menor o igual que aproximadamente 60 minutos, 30 minutos, 20 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos o 1 minuto durante el uso del electrodo. En algunas realizaciones, el material de electrodo no se agota dentro de un período de tiempo que es menor o igual que aproximadamente 60 minutos, 30 minutos, 20 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos o 1 minuto durante el uso del electrodo.
Los pocilios pueden tener cualquier profundidad adecuada. En algunos casos, la profundidad del pocilio se mide desde la superficial del biochip y/o fondo de la membrana hasta la parte superior del electrodo y/o fondo del electrodo. En algunos casos, la profundidad del pocillo es aproximadamente igual al espesor de una capa de óxido (p. ej., 203 en la figura 2). En algunas realizaciones, los pocillos tienen una profundidad de aproximadamente 0,5 micrómetros (pm), aproximadamente 1 pm, aproximadamente 1,5 pm, aproximadamente 2 pm, aproximadamente 2,5 pm, aproximadamente 3 pm, aproximadamente 3,5 pm, aproximadamente 4 pm, aproximadamente 4,5 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 6 pm, aproximadamente 7 pm, aproximadamente 8 pm, aproximadamente 9 pm, aproximadamente 10 pm o aproximadamente 20 pm. En algunas realizaciones, los pocillos tienen una profundidad de al menos aproximadamente 0,5 micrómetros (pm), al menos aproximadamente 1 pm, al menos aproximadamente 1,5 pm, al menos aproximadamente 2 pm, al menos aproximadamente 2,5 pm, al menos aproximadamente 3 pm, al menos aproximadamente 3,5 pm, al menos aproximadamente 4 pm, al menos aproximadamente 4,5 pm, al menos aproximadamente 5 pm, al menos aproximadamente 6 pm, al menos aproximadamente 7 pm, al menos aproximadamente 8 pm, al menos aproximadamente 9 pm, al menos aproximadamente 10 pm o al menos aproximadamente 20 pm.
En un aspecto, un biochip comprende una pluralidad de pocillos que tienen una membrana dispuesta sobre el pocillo y un electrodo en el pocillo que es capaz de detectar cambios en el flujo de iones a través de un poro en la membrana en respuesta a entidades que pasan a través del poro. El biochip puede comprender al menos 500 pocillos por milímetro cuadrado y los pocillos pueden tener un volumen adecuadamente grande de manera que el electrodo pueda detectar al menos 100 entidades sin recargar el electrodo.
En algunas realizaciones, las entidades son moléculas identificadoras detectadas durante eventos de incorporación de nucleótidos. En algunas instancias, un polímero pasa a través del poro y las entidades son subunidades del polímero. En algunos casos, el polímero es un ácido nucleico y las subunidades del polímero son nucleobases.
El biochip puede detectar cualquier cantidad adecuada de entidades sin recargar el electrodo. En algunos casos, se detectan aproximadamente 10, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 5000, aproximadamente 10.000, aproximadamente 50.000, aproximadamente 100.000, aproximadamente 500.000, aproximadamente 1.000.000, aproximadamente 5.000. 000 o aproximadamente 10.000.000 entidades. En algunos casos, se detectan al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 5000, al menos aproximadamente 10.000, al menos aproximadamente 50.000, al menos aproximadamente 100.000, al menos aproximadamente 500.000, al menos aproximadamente 1.000.000, al menos aproximadamente 5.000. 000 o al menos aproximadamente 10.000.000 entidades.
Chip con pocillos estrechamente empacados y diafonía mínima
En un aspecto, los pocillos están estrechamente empacados y tienen una baja cantidad de diafonía (p. ej., los electrodos derivan todos o su mayoría de su señal del nanoporo y/o la membrana más cercana al electrodo). En un aspecto, un biochip comprende una pluralidad de pocillos que tienen una membrana dispuesta sobre el pocillo y un electrodo en el pocillo que detecta una señal en respuesta al flujo de iones, en donde el biochip comprende al menos 500 pocillos por milímetro cuadrado y los electrodos están eléctricamente aislados entre sí. El biochip puede comprender cualquier cantidad adecuada de pocillos por área, según se describe en la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, un electrodo detecta aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,5 %, o aproximadamente 99,9 % de su señal del flujo de iones a través de un nanoporo en la membrana. En algunas instancias, el electrodo detecta al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 99 %, al menos aproximadamente 99,5 % o al menos aproximadamente 99,9 % de su señal del flujo de iones a través de un nanoporo en la membrana. En algunos casos, un electrodo detecta no más de 20 %, no más de 10 %, no más de 5 %, no más de 1 %, no más de 0,5 %, o no más de 0,1 %, de su señal a partir del flujo de iones a través de nanoporos en pocillos adyacentes.
Métodos para producir biochips
Ciertos métodos se pueden usar para producir biochips de alta calidad que, entre otras cosas, son capaces de resistir disoluciones corrosivas y formar una membrana sobre el biochip que tiene una alta resistividad. En un aspecto, un método para preparar un biochip comprende proporcionar un sustrato semiconductor y formar una pluralidad de pocillos que contienen electrodos capaces de llevar a cabo mediciones eléctricas sobre o adyacentes al sustrato donde el método comprende, además, (a) tratar el sustrato para resistir disoluciones corrosivas; y (b) preparar el sustrato para la formación de una membrana que sella el pocillo con una alta resistividad.
La membrana puede tener cualquier resistividad alta adecuada. En algunos casos, la resistividad es aproximadamente 10 mega-ohmios (MQ), aproximadamente 50 MQ, aproximadamente 100 MQ, aproximadamente 500 MQ, aproximadamente 1 giga-ohmio (GQ), aproximadamente 5 GQ o aproximadamente 10 GQ. En algunos casos, la resistividad es al menos aproximadamente 10 mega-ohmios (Mq ), al menos aproximadamente 50 MQ, al menos aproximadamente 100 MQ, al menos aproximadamente 500 MQ, al menos aproximadamente 1 giga-ohmio (GQ), al menos aproximadamente 5 GQ o al menos aproximadamente 10 GQ.
En algunas realizaciones, el sustrato semiconductor comprende silicio. En algunas instancias, la membrana es una bicapa lipídica. Los electrodos pueden ser capaces de medir flujos de corriente iónica a través de un nanoporo integrado en la membrana.
El dispositivo puede resistir cualquier disolución corrosiva adecuada. En algunos casos, las disoluciones corrosivas son acuosas (incluyen agua) y comprenden iones (p. ej., Na+, Cl-). En algunos casos, el biochip puede funcionar después del contacto durante muchas semanas con NaCl 1 M.
En un aspecto, un método para preparar un biochip comprende: (a) depositar un material que tiene grupos óxidos reactivos sobre un sustrato semiconductor; (b) grabar pocillos en el dióxido de silicio; (c) formar electrodos metálicos en los pocillos; (d) retirar metal de todas las áreas del sustrato, excepto de los pocillos; y (e) recubrir el sustrato con una capa adecuada para la adhesión de una membrana. En algunos casos, el sustrato semiconductor comprende silicio. El método puede preparar el biochip para su uso en la secuenciación de ácido nucleico al usar un nanoporo.
En algunas realizaciones, el material en (a) es dióxido de silicio. El material puede presentar una superficie plana, dura que exhibe una cobertura uniforme de grupos óxidos reactivos (-OH) a una disolución en contacto con su superficie. Estos grupos óxidos pueden ser los puntos de acoplamiento para el posterior proceso de silanización (e). Alternativamente, se puede depositar un material de superficie lipofílica e hidrófoba que imita las características de grabado del óxido de silicio.
En algunas realizaciones, una capa de pasivación se deposita sobre el sustrato semiconductor en (a), que puede o no tener grupos óxidos reactivos. La capa de pasivación puede comprender nitruro de silicio (Si3N4) o polimida. En algunas instancias, se usa una operación fotolitográfica para definir regiones donde las membranas se forman sobre la capa de pasivación.
La figura 8 a la figura 20 muestran un ejemplo de operaciones que pueden generar biochips. Todas las figuras no están necesariamente dibujadas a escala.
Con referencia a la figura 8, el método para producir un biochip puede comenzar con un sustrato semiconductor. El semiconductor (p. ej., silicio) puede tener cualquier cantidad de capas dispuestas sobre él, que incluyen, pero no se limitan a, una capa conductora tal como un metal. La capa conductora es aluminio en algunas instancias. En algunos casos, el sustrato tiene una capa protectora (p. ej., nitruro de titanio). Las capas se pueden depositar con la ayuda de diversas técnicas de depósito, tales como, por ejemplo, depósito de vapor químico (CVD, por sus siglas en inglés), depósito de capa atómica (ALD, por sus siglas en inglés), CVD mejorado con plasma (PECVD, por sus siglas en inglés), ALD mejorado con plasma (PEALD, por sus siglas en inglés), CVD orgánico metálico (MOCVD, por sus siglas en inglés), cVd con alambre caliente (HWCVD, por sus siglas en inglés), CVD iniciado (ícVd , por sus siglas en inglés), CVD modificado (MCVD, por sus siglas en inglés), depósito axial de vapor (VAD, por sus siglas en inglés), depósito de vapor externo (OVD, por sus siglas en inglés) y depósito de vapor físico (p. ej., depósito por pulverización iónica, depósito evaporativo).
En algunos casos, una capa de óxido se deposita sobre el sustrato semiconductor como se muestra en la figura 9. En algunas instancias, la capa de óxido comprende dióxido de silicio. El dióxido de silicio se puede depositar al usar ortosilicato de tetraetilo (TEOS, por sus siglas en inglés), plasma de alta densidad (HDP, por sus siglas en inglés) o cualquier combinación de estos.
En algunas instancias, el dióxido de silicio se deposita mediante el uso de una técnica a temperatura baja. En algunos casos, el proceso es depósito de vapor químico a baja temperatura de óxido de silicio. La temperatura es generalmente lo suficientemente baja para que el metal preexistente sobre el chip no se dañe. La temperatura de depósito puede ser de aproximadamente 50 °C, aproximadamente 100 °C, aproximadamente 150 °C, aproximadamente 200 °C, aproximadamente 250 °C, aproximadamente 300 °C, aproximadamente 350 °C y similares. En algunas realizaciones, la temperatura de depósito es menor que aproximadamente 50 °C, menor que aproximadamente 100 °C, menor que aproximadamente 150 °C, menor que aproximadamente 200 °C, menor que aproximadamente 250 °C, menor que aproximadamente 300 °C, menor que aproximadamente 350 °C y similares. El depósito se puede llevar a cabo con cualquier presión adecuada. En algunas instancias, el proceso de depósito usa energía de plasma RF.
En algunos casos, el óxido no se deposita mediante un procedimiento de óxido formado térmicamente (p. ej., que puede usar temperaturas cercanas o que superan los 1000 °C).
El dióxido de silicio se puede depositar hasta un espesor adecuado para la formación de pocillos que comprenden electrodos y un volumen de electrolitos capaz de secuenciar al menos 100, al menos 1000, al menos 10.000, al menos 100.000, o al menos 1.000.000 de nucleobases de una molécula de ácido nucleico sin recargar los electrodos.
El dióxido de silicio se puede depositar hasta cualquier espesor adecuado. En algunas realizaciones, el dióxido de silicio tiene un espesor de aproximadamente 0,5 micrómetros (pm), aproximadamente 1 pm, aproximadamente 1,5 pm, aproximadamente 2 pm, aproximadamente 2,5 pm, aproximadamente 3 pm, aproximadamente 3,5 pm, aproximadamente 4 pm, aproximadamente 4,5 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 6 pm, aproximadamente 7 pm, aproximadamente 8 pm, aproximadamente 9 pm, aproximadamente 10 pm o aproximadamente 20 pm. En algunas realizaciones, el dióxido de silicio tiene un espesor de al menos aproximadamente 0,5 micrómetros (pm), al menos aproximadamente 1 pm, al menos aproximadamente 1,5 pm, al menos aproximadamente 2 pm, al menos aproximadamente 2,5 pm, al menos aproximadamente 3 pm, al menos aproximadamente 3,5 pm, al menos aproximadamente 4 pm, al menos aproximadamente 4,5 pm, al menos aproximadamente 5 pm, al menos aproximadamente 6 pm, al menos aproximadamente 7 pm, al menos aproximadamente 8 pm, al menos aproximadamente 9 pm, al menos aproximadamente 10 pm o al menos aproximadamente 20 pm.
Grabado de pocillos
Los pocillos se pueden crear en un sustrato de dióxido de silicio al usar diversas técnicas de fabricación. Dichas técnicas pueden incluir técnicas de fabricación de semiconductores. En algunos casos, los pocillos se crean al usar técnicas fotolitográficas tales como las usadas en la industria de los semiconductores. Por ejemplo, un material fotorresistente (p. ej., un material que cambia de propiedades cuando se expone a radiación electromagnética) se puede aplicar sobre el dióxido de silicio (p. ej., mediante recubrimiento giratoria de una oblea) hasta cualquier espesor adecuado como se muestra en la figura 10. El sustrato que incluye el material fotorresistente después se expone a una fuente de radiación electromagnética. Se puede usar una máscara para proteger de la radiación a porciones del material fotorresistente para definir el área de los pocillos. El material fotorresistente puede ser un material resistente negativo o un material resistente positivo (p. ej., el área del pocillo se puede exponer a radiación electromagnética o las áreas que no conforman un pocillo se pueden exponer a radiación electromagnética según se define mediante la máscara). En la figura 11, el área suprayacente a la ubicación en la que se van a crear los pocillos se expone a radiación electromagnética para definir un patrón que corresponde a la ubicación y distribución de los pocillos en la capa de dióxido de silicio. El material fotorresistente se puede exponer a radiación electromagnética a través de una máscara que define un patrón que corresponde a los pocillos. A continuación, la porción expuesta del material fotorresistente se retira, tal como, p. ej., con la ayuda de una operación de lavado (p. ej., disol. al 2 % de TMAH (tetra metil amonio hidróxido) u otra disolución conocida para los expertos en la técnica). La porción que se retira de la máscara después se puede exponer a un grabador químico para grabar el sustrato y transferir los patrones de pocillos a la capa de dióxido de silicio. El grabador puede incluir un ácido, tal como, por ejemplo, ácido sulfúrico (H2SO4). La capa de dióxido de silicio se puede grabar de manera anisotrópica, aunque en algunos casos el grabado puede ser isotrópico. Por ejemplo, con referencia a la figura 13, se puede grabar un área no exactamente correspondiente al área de un pocillo final (p. ej., el pocillo se puede grabar debajo del material fotorresistente).
Se pueden usar diversos procedimientos de grabado para grabar el dióxido de silicio en el área donde se va a formar el pocillo. Como se muestra en la figura 12 y la figura 13, el grabado puede ser un grabado isotrópico (es decir, la velocidad de grabado a lo largo de una dirección es igual a la velocidad de grabado a lo largo de una dirección ortogonal), o un grabado anisotrópico (es decir, la velocidad de grabado a lo largo de una dirección es menor que la velocidad de grabado a lo largo de una dirección ortogonal), o variantes de estas.
En algunos casos, un grabado anisotrópico retira la mayoría del volumen del pocillo. Cualquier porcentaje adecuado del volumen del pocillo se puede retirar, incluso aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 %. En algunos casos, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % del material se retira en un grabado anisotrópico. En algunos casos, como máximo aproximadamente 60 %, como máximo aproximadamente 70 %, como máximo aproximadamente 80 %, como máximo aproximadamente 90 %, como máximo aproximadamente 95 % del material se retira en un grabado anisotrópico. En algunas realizaciones, el grabado anisotrópico no retira el material de dióxido de silicio hasta el sustrato semiconductor. Un grabado anisotrópico retira el material de dióxido de silicio hasta el sustrato semiconductor en algunas instancias.
En algunos casos, los pocillos se graban al usar una operación fotolitográfica para definir los pocillos, con un grabado híbrido seco-húmedo posterior. La operación fotolitográfica puede comprender recubrir el dióxido de silicio con un material fotorresistente y exponer el material fotorresistente a radiación electromagnética a través de una máscara (o retícula) que tiene un patrón que define los pocillos. En algunas instancias, el grabado híbrido seco-húmedo comprende: (a) grabar en seco para retirar el volumen de dióxido de silicio en las regiones de pocillo definidas en el material fotorresistente mediante la operación fotolitográfica; (b) limpiar el biochip; y (c) grabar en húmedo para retirar el dióxido de silicio restante del sustrato en las regiones de pocillo.
El biochip se puede limpiar con la ayuda de una química de grabado con plasma, o exposición a un agente oxidante, tal como, por ejemplo, H2O2, O2 o O3. La limpieza puede comprender retirar polímero residual, retirar material que puede bloquear el grabado en húmedo o una combinación de estos. En algunas instancias, la limpieza es limpieza con plasma. La operación de limpieza puede proceder durante cualquier período de tiempo adecuado (p. ej., 15 a 20 segundos). En un ejemplo, la limpieza se puede llevar a cabo durante 20 segundos con una máquina Applied Materials eMAx-CT con los ajustes de 100 mT, 200 W, 20 G, 2002.
El grabado en seco puede ser un grabado anisotrópico que graba verticalmente (p. ej., hacia el sustrato semiconductor), pero no lateralmente (p. ej., paralelo al sustrato semiconductor). En algunas instancias, el grabado en seco comprende grabar con un grabador basado en flúor tal como CF4, CHF3, C2F6, C3 F6, o cualquier combinación de estos. En una instancia, el grabado se lleva a cabo durante 400 segundos con una máquina Applied Materials eMAx-CT que tiene los ajustes de 100 mT, 1000 W, 20 G y 50 CF4.
El grabado en húmedo puede ser un grabado isotrópico que retira el material en todas las direcciones. En algunas instancias, el grabado en húmedo rebaja el material fotorresistente. Rebajar el material fotorresistente puede facilitar la retirada del material fotorresistente en una operación posterior (p. ej., "separación vertical" del material fotorresistente). En una realización, el grabado en húmedo es un grabado con óxido tamponado (BOE, por sus siglas en inglés). En algunos casos, los grabados con óxido tamponados se llevan a cabo a temperatura ambiente con una base de ácido fluorhídrico que se puede tamponar (p. ej., con fluoruro de amonio) para reducir la velocidad de grabado. La velocidad de grabado puede depender de la película que se está grabando y de concentraciones específicas de HF y/o NH4F. El tiempo de grabado necesario para retirar completamente una capa de óxido típicamente se determina empíricamente. En un ejemplo, el grabado se lleva a cabo a 22 °C con 15:1 BOE (grabado con óxido tamponado).
La capa de dióxido de silicio se puede grabar en una capa de material subyacente. Por ejemplo, con referencia a la figura 13, la capa de dióxido de silicio se graba hasta la capa de nitruro de titanio.
En un aspecto, un método para preparar un biochip comprende grabar pocillos en una capa de dióxido de silicio recubierta sobre un sustrato semiconductor al usar (a) una operación fotolitográfica para definir los pocillos; (b) un grabado en seco para retirar el volumen del dióxido de silicio en las regiones de pocillo definidas mediante la operación fotolitográfica; y (c) grabar en húmedo para retirar el dióxido de silicio restante del sustrato en las regiones de pocillo. En algunos casos, el método comprende, además, retirar polímero residual, retirar material que puede bloquear el grabado en húmedo o una combinación de estos. El método puede incluir una operación de limpieza con plasma.
Como se muestra en la figura 13, el material fotorresistente no se retira del dióxido de silicio después de la operación fotolitográfica o el grabado híbrido seco-húmedo en algunos casos. Dejar el material fotorresistente se puede usar para dirigir el metal solo hacia los pocillos y no sobre la superficie superior del dióxido de silicio en operaciones posteriores. En algunos casos, el sustrato semiconductor se recubre con un metal (p. ej., aluminio en la figura 13) y el grabado en húmedo no retira componentes que protegen el metal de la corrosión (p. ej., nitruro de titanio (TiN) en la figura 13). En algunos casos, sin embargo, la capa fotorresistente se puede retirar, con una química en húmedo tal como SPM (mezcla de sulfúrico/peróxido) o un disolvente orgánico. En otras realizaciones, la capa fotorresistente se puede retirar con un plasma de oxígeno.
Metalización del electrodo
Los biochips descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar para detectar moléculas y/o secuenciar moléculas de ácido nucleico con la ayuda de un nanoporo y detección eléctrica. La detección eléctrica se puede llevar a cabo con ayuda de un electrodo en el pocillo y un contraelectrodo ubicado fuera del pocillo. En la presente memoria descriptiva se proporcionan métodos para crear electrodos, tales como electrodos metálicos. El electrodo puede consumirse de manera reversible durante la detección, no consumirse durante la detección o no consumirse de manera apreciable durante la detección.
Un ejemplo de un electrodo que puede consumirse de manera reversible durante la detección molecular es la plata. Un ejemplo de un electrodo que puede no consumirse apreciablemente de manera reversible durante la detección molecular es el platino.
Un electrodo se puede formar adyacente a un sustrato con la ayuda de diversas técnicas de depósito. Por ejemplo, un electrodo se puede formar con la ayuda de galvanoplastia. Como ejemplo adicional, se puede formar un electrodo con la ayuda de una técnicas de depósito por, tales como, por ejemplo, depósito de vapor químico (CVD), depósito de capa atómica (ALD), CVD mejorado con plasma (PECv D), ALD mejorado con plasma (PEALD), CVD orgánico metálico (Mo Cv D), CVD con alambre caliente (HWCVD), CVD iniciado (iCVD), CVD modificado (MCVD), depósito axial de vapor (VAD), depósito de vapor externo (OVD) y depósito de vapor físico (p. ej., depósito por pulverización iónica, depósito evaporativo).
En un aspecto, un método para preparar un biochip comprende (a) proporcionar un sustrato semiconductor recubierto con una capa de dióxido de silicio, donde se graba un pocillo en el dióxido de silicio (p. ej., como se muestra en la figura 13); (b) depositar una capa protectora sobre la superficie del pocillo (p. ej., nitruro de titanio o platino como se muestra en la figura 15); y (c) depositar el material de electrodo sobre la superficie del pocillo (p. ej., plata como se muestra en la figura 16). El método puede comprender, además, depositar una película de material de adhesión sobre la superficie del pocillo para proporcionar la adhesión y conductividad eléctrica de una capa de metal a una capa debajo de la capa de metal. El material de adhesión puede comprender titanio, tántalo, nitruro de titanio (TiN), cromo, o cualquier combinación de estos. Con referencia a la figura 14, se deposita un material de adhesión que comprende titanio adyacente a la capa de nitruro de titanio, tal como, por ejemplo, mediante galvanoplastia o depósito por vapor (p. ej., depósito por vapor químico). En algunos casos, una única capa de metal reemplaza dos o más capas (p. ej., una única capa de metal es la capa de adhesión y la capa protectora).
En algunos casos, la capa protectora comprende un metal resistente a la corrosión (p. ej., platino, oro). Sin limitación, la capa protectora puede (i) proporcionar conectividad eléctrica a un conductor subyacente (p. ej., a aluminio en la figura 14, o nitruro de titanio), (ii) proteger la conductor subyacente del ataque con una disolución reactiva (p. ej., una disolución corrosiva tal como cloruro de sodio en agua), (iii) proporcionar una fuente de electrones y/o disipador de manera que el material del electrodo no se consuma en reacciones de oxidación-reducción (p. ej., el platino puede actuar como la fuente y/o el disipador cuando el electrodo comprende plata), o (iv) cualquier combinación de estos.
Las diversas capas de metal (p. ej., capa de adhesión, capa de protectora material del electrodo, etc.) se pueden depositar mediante cualquier técnica adecuada, tal como pulverización iónica, depósito, galvanoplastia o una combinación de estos. En algunas instancias, el material del electrodo se deposita mediante pulverización iónica, tal como, por ejemplo, pulverización iónica por magnetrón.
Los electrodos son capaces de hacer cualquier medición adecuada, según sea necesaria para el funcionamiento del biochip. En algunos casos, el material del electrodo hace mediciones eléctricas de analitos en los pocillos. Los analitos pueden comprender ácidos nucleicos, aminoácidos, proteínas, moléculas identificadoras o cualquier combinación de estos. Las mediciones eléctricas pueden ser reacciones de reducción-oxidación reversibles. En algunas realizaciones, se deposita un volumen suficiente del material de electrodo en el pocillo para proporcionar la detección de reacciones de reducción-oxidación que implican analitos en los pocillos.
Procedimiento de separación vertical
Se pueden depositar una o más capas de metal sobre el material fotorresistente después de la metalización del electrodo como se muestra en la figura 16. En algunas instancias, el metal depositado sobre el material fotorresistente se retira del biochip mientras el metal depositado en los pocillos permanece en los pocillos. Dejar el material fotorresistente después de la creación de los pocillos (p. ej., como se muestra en la figura 13) puede ser ventajoso para lograr la remoción del metal solamente de la superficie del biochip y no de los pocillos.
En algunas situaciones, después de la formación de un pocillo y un electrodo, el material fotorresistente se puede omitir y se puede retirar metal fuera del pocillo con electrodo con la ayuda de un pulido químico mecánico y el posterior grabado en húmedo o grabado con ion reactivo (RIE, por sus siglas en inglés), si se desea. En un ejemplo, se usa CMP para retirar la pila de metal del electrodo sobre la superficie del chip, mientras permanece en el pocillo (proceso damasceno). En otro ejemplo, el material fotorresistente y cualquier capa suprayacente se retiran mediante el uso de acetona u otro disolvente resistente (proceso de separación vertical).
Silanización de la superficie del biochip
Después de la formación de un pocillo y electrodo dentro del pocillo, la capa de dióxido de silicio se puede tratar para hacer que la capa de dióxido de silicio sea adecuada para formar una membrana en o adyacente al pocillo. En algunos casos, se forma una membrana hidrófoba, tal como, por ejemplo, una bicapa (p. ej., bicapa lipídica), sobre el pocillo. La membrana puede aislar el pocillo grabado de un líquido suprayacente, tal como, por ejemplo, con una resistividad de al menos aproximadamente 10 gigaohmios. Según se describe en la presente memoria descriptiva, la silanización de la superficie de dióxido de silicio (p. ej., para hacer que la superficie sea hidrófoba) hace que la superficie sea adecuada para la formación de una membrana.
Un método para estabilizar una membrana en una interfaz semiconductora comprende silanizar una superficie semiconductora de tal manera que una membrana sea capaz de adherirse a la superficie silanizada y separar un primer fluido (p. ej., en el lado cis de la membrana) de un segundo fluido (p. ej., en el lado trans de la membrana) con una resistividad de, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 gigaohmios.
Un método para preparar un biochip puede comprender: (a) proporcionar un biochip empacado o precursor de biochip que tiene una superficie que comprende dióxido de silicio y/o metal (p. ej., como se muestra en la figura 17); y (b) silanizar la superficie (p. ej., como se muestra en la figura 18) al usar, por ejemplo, una molécula de alcoxisilano organofuncional. En algunos casos, la molécula de alcoxisilano organofuncional es dimetilcloro-octodecil-silano, dimetilmetoxi-octodecil-silano, metildicloro-octodecil-silano, tricloro-octodecilsilano, trimetil-octodecil-silano, trietil-octodecil-silano o cualquier combinación de estos.
La molécula de alcoxisilano organofuncional puede cubrir las superficies de dióxido de silicio (como se muestra en la figura 18). La capa de silano puede ser tener un espesor de una molécula (Figura 18).
Después de la silanización, el método puede comprender, además, retirar silano residual del sustrato con un protocolo de enjuague. Un protocolo de enjuague ilustrativo es un enjuague de 5 segundos con decano, acetona, etanol, agua y etanol con posterior secado con aire y calentamiento a 97 °C durante 30 minutos. El protocolo de enjuague también se puede usar para limpiar el chip antes de la aplicación de la capa de silano. La figura 21 muestra que la plata y el metal protector debajo pueden pulverizarse iónicamente sobre las paredes laterales de los pocillos y, por lo tanto, la silanización puede no descender por el pocillo. En algunas instancias, tres cuartos o más de las paredes laterales de los pocillos se cubren con plata y la capa protectora debajo.
Formación de bicapas
En la presente memoria descriptiva se describen métodos para crear bicapas lipídicas y nanoporos sobre una matriz de electrodos (p. ej., individualmente controlados) para componer un chip sensor con nanoporo semiconductor. El chip se puede usar para determinar una secuencia de polímero, tal como una secuencia de ácido nucleico o la presencia de cualquier molécula identificada.
Las técnicas para formar bicapas lipídicas sobre una matriz de electrodos sobre un chip sensor semiconductor se describen en la presente memoria descriptiva. En una realización, se insertan líquidos que contienen moléculas lipídicas en la superficie del chip. Los líquidos se pueden separar mediante burbujas. Las moléculas lipídicas se pueden distribuir sobre la superficie y las burbujas diluyen los lípidos para formar espontáneamente una bicapa lipídica sobre cada uno de los electrodos. Se pueden aplicar estímulos eléctricos adicionales a los electrodos para facilitar la formación de la bicapa. Se pueden aplicar adicionalmente disoluciones que contienen proteína de nanoporo encima de los lípidos depositados. Muchas burbujas se pueden hacer rodar a través del chip para facilitar la inserción del nanoporo en las bicapas. Estas técnicas pueden aplicarse con o sin celdas de flujo. En algunos casos, se puede aplicar un estímulo adicional para inducir la creación de una bicapa o poro. Dicho estímulo puede incluir presión, sonicación y/o impulsos de sonido. Un estímulo puede incluir cualquier combinación de tampones (intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), disoluciones iónicas (p. ej., NaCl, KCl; aproximadamente 75 mM a aproximadamente 1 M), burbujas, sustancias químicas (p. ej., hexano, decano, tridecano, etc.), movimiento físico, estímulo eléctrico o impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación e/o impulsos de sonido al chip sensor.
Como se muestra en la figura 22, la burbuja 2205 puede ser grande y mantenerse adyacente a una pluralidad de pocillos 2210, cada pocillo 2210 contiene un electrodo. La burbuja puede desplazar lípido de la región adyacente a los electrodos para producir (a) bicapa(s) lipídica(s) que cubre(n) el(los) electrodo(s). En algunos casos, el borde de la burbuja se pone en contacto con una disolución lipídica 2215 y parte de la disolución lipídica se dispersa debajo 2220 de la burbuja 2205 para formar (a) bicapa(s) lipídica(s) que cubre(n) los pocillos 2210 y el(los) electrodo(s). La burbuja puede ser una burbuja de gas (o de vapor). La burbuja puede incluir un único gas o una combinación de gases, tales como, p. ej., aire, oxígeno, nitrógeno, argón, helio, hidrógeno o dióxido de carbono. La figura 30 también proporciona otra ilustración de los métodos de formación de bicapa como se proporcionan en la presente memoria descriptiva.
La burbuja puede cubrir y/o estar adyacente a cualquier cantidad adecuada de electrodos. En algunos casos, la burbuja está adyacente a aproximadamente 100, aproximadamente 1000, aproximadamente 10.000, aproximadamente 100.000, aproximadamente 1.000.000 o aproximadamente 10.000.000 electrodos. En algunas instancias, la burbuja está adyacente a al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 10.000, al menos aproximadamente 100.000, al menos aproximadamente 1.000.000 o al menos aproximadamente 10.000.000 electrodos.
La burbuja puede permanecer adyacente a los electrodos durante cualquier período de tiempo adecuado (p. ej., suficientemente largo para formar bicapas lipídicas). En algunas instancias, la burbuja se mantiene adyacente a los electrodos durante entre aproximadamente 10 ms a aproximadamente 10 minutos, p. ej., 0,5 segundo (s), aproximadamente 1 s, aproximadamente 3 s, aproximadamente 5 s, aproximadamente 10 s, aproximadamente 20 s, aproximadamente 30 s, aproximadamente 45 s, aproximadamente 60 s, aproximadamente 1,5 minutos (min), aproximadamente 2 min, aproximadamente 3 min, aproximadamente 4 min, aproximadamente 5 min o aproximadamente 10 min. En algunos casos, la burbuja se mantiene adyacente a los electrodos durante al menos aproximadamente 0,5 segundo (s), al menos aproximadamente 1 s, al menos aproximadamente 3 s, al menos aproximadamente 5 s, al menos aproximadamente 10 s, al menos aproximadamente 20 s, al menos aproximadamente 30 s, al menos aproximadamente 45 s, al menos aproximadamente 60 s, al menos aproximadamente 1,5 minutos (min), al menos aproximadamente 2 min, al menos aproximadamente 3 min, al menos aproximadamente 4 min, al menos aproximadamente 5 min, o al menos aproximadamente 10 min. En algunos casos, la burbuja se mantiene adyacente a los electrodos durante como máximo aproximadamente 0,5 segundo (s), como máximo aproximadamente 1 s, como máximo aproximadamente 3 s, como máximo aproximadamente 5 s, como máximo aproximadamente 10 s, como máximo aproximadamente 20 s, como máximo aproximadamente 30 s, como máximo aproximadamente 45 s, como máximo aproximadamente 60 s, como máximo aproximadamente 1,5 minutos (min), como máximo aproximadamente 2 min, como máximo aproximadamente 3 min, como máximo aproximadamente 4 min, como máximo aproximadamente 5 min, o como máximo aproximadamente 10 min. En algunos casos, la burbuja se mantiene adyacente a los electrodos durante entre aproximadamente 1 s y aproximadamente 10 min, entre aproximadamente 10 s y aproximadamente 5 min, o entre aproximadamente 30 s y aproximadamente 3 min.
En un aspecto, un método para formar una bicapa lipídica para su uso en un dispositivo de percepción con nanoporo comprende proporcionar un chip cebado que comprende un trayecto de flujo de fluido en comunicación continua con una pluralidad de electrodos de percepción, y hacer fluir una disolución lipídica por el trayecto de flujo de fluido, y hacer fluir una burbuja por el trayecto de flujo de fluido, para formar de este modo una bicapa lipídica adyacente a cada uno de los electrodos de percepción. Según se usa en la presente memoria descriptiva, un chip cebado es un chip que ha tenido un flujo inicial de KCI o una disolución iónica sobre el chip y que ha cargado todos los pocillos o canales. La figura 7 muestra un ejemplo de un dispositivo que tiene dos trayectos de flujo de fluido y la figura 24 muestra un ejemplo de un dispositivo que tiene 5 trayectos de flujo de fluido. En algunas realizaciones, la burbuja abarca la pluralidad de electrodos de percepción y está adyacente a los electrodos de percepción durante al menos aproximadamente 1 segundo. La burbuja puede estar adyacente a los electrodos de percepción o pocillos que contienen electrodos de percepción durante al menos entre aproximadamente 10 ms a aproximadamente 10 minutos, p. ej., 5 segundos, al menos aproximadamente 10 segundos, al menos aproximadamente 30 segundos y/o como máximo aproximadamente 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos o 10 minutos. En algunos casos, un nanoporo se inserta en las bicapas lipídicas adyacentes a cada uno de los electrodos de percepción.
En un aspecto, un método para formar una bicapa lipídica para su uso en un dispositivo de percepción con nanoporo comprende proporcionar un chip cebado que comprende un trayecto de flujo de fluido en comunicación continua con una pluralidad de electrodos de percepción, hacer fluir una burbuja por el trayecto de flujo de fluido, donde la burbuja abarca la pluralidad de electrodos de percepción y poner en contacto la periferia de la burbuja con un lípido. El lípido se puede dispersar debajo de la burbuja y por el trayecto de flujo de fluido (p. ej., para formar así una bicapa lipídica adyacente a cada uno de los electrodos de percepción). En algunos casos, el método comprende, además, insertar un nanoporo en las bicapas lipídicas adyacente a cada uno de los electrodos de percepción.
La burbuja puede ponerse en contacto con el lípido durante cualquier período de tiempo adecuado (p. ej., suficientemente largo para formar bicapas lipídicas). En algunos casos, la burbuja se pone en contacto con el lípido durante aproximadamente 0,5 segundo (s), aproximadamente 1 s, aproximadamente 3 s, aproximadamente 5 s, aproximadamente 10 s, aproximadamente 20 s, aproximadamente 30 s, aproximadamente 45 s, aproximadamente 60 s, aproximadamente 1,5 minutos (min), aproximadamente 2 min, aproximadamente 3 min, aproximadamente 4 min, aproximadamente 5 min o aproximadamente 10 min. En algunos casos, se pone en contacto con el lípido durante al menos aproximadamente 0,5 segundo (s), al menos aproximadamente 1 s, al menos aproximadamente 3 s, al menos aproximadamente 5 s, al menos aproximadamente 10 s, al menos aproximadamente 20 s, al menos aproximadamente 30 s, al menos aproximadamente 45 s, al menos aproximadamente 60 s, al menos aproximadamente 1,5 minutos (min), al menos aproximadamente 2 min, al menos aproximadamente 3 min, al menos aproximadamente 4 min, al menos aproximadamente 5 min, o al menos aproximadamente 10 min. En algunos casos, la burbuja se pone en contacto con el lípido durante como máximo aproximadamente 0,5 segundo (s), como máximo aproximadamente 1 s, como máximo aproximadamente 3 s, como máximo aproximadamente 5 s, como máximo aproximadamente 10 s, como máximo aproximadamente 20 s, como máximo aproximadamente 30 s, como máximo aproximadamente 45 s, como máximo aproximadamente 60 s, como máximo aproximadamente 1,5 minutos (min), como máximo aproximadamente 2 min, como máximo aproximadamente 3 min, como máximo aproximadamente 4 min, como máximo aproximadamente 5 min, o como máximo aproximadamente 10 min. En algunas instancias, la burbuja se pone en contacto con el lípido durante entre aproximadamente 1 s y aproximadamente 10 min, entre aproximadamente 10 s y aproximadamente 5 min, o entre aproximadamente 30 s y aproximadamente 3 min.
El método puede formar una bicapa lipídica sobre cualquier proporción de los electrodos. En algunos casos, se forma una bicapa lipídica sobre al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 % o al menos aproximadamente 90 % de los electrodos de percepción. En algunos ejemplos, se forma una bicapa lipídica sobre aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de los electrodos de percepción.
Las bicapas pueden proporcionar resistencia eléctrica entre una disolución en el lado cis de la bicapa lipídica y una disolución en el lado trans de la bicapa. En algunos casos, la resistencia es aproximadamente 100 mega-ohmios (MQ), aproximadamente 500 Mq, aproximadamente 1 giga-ohmio (GQ), aproximadamente 10 GQ o aproximadamente 100 GQ. En algunos casos, la resistencia es al menos aproximadamente 100 megaohmios (MQ), al menos aproximadamente 500 MQ, al menos aproximadamente 1 giga-ohmio (GQ), al menos aproximadamente 10 GQ o al menos aproximadamente 100 GQ. En algunas realizaciones, la resistencia es aproximadamente 1 tera-ohmio (TQ).
Insertar el nanoporo puede comprender aplicar un estímulo eléctrico (p. ej., impulso de voltaje o impulso de corriente) a través del electrodo para facilitar la inserción del nanoporo en la bicapa lipídica. Como una alternativa, o adicionalmente, se puede insertar un nanoporo al aplicar uno o más estímulos distintos, tales como, por ejemplo, un impulso de presión o cualquier combinación de tampones (intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), disoluciones iónicas (p. ej., NaCl, KCl; aproximadamente 75 mM a aproximadamente 1 M), burbujas, sustancias químicas (p. ej., hexano, decano, tridecano, etc.), movimiento físico, estímulo eléctrico o impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación e/o impulsos de sonido al chip sensor. El nanoporo puede ser cualquier nanoporo (p. ej., un nanoporo proteico). En algunas realizaciones, el nanoporo es porina A de Mycobacterium smegmatis(MspA), alfa-hemolisina, cualquier proteína que tiene al menos 70 % de homología con respecto a al menos una de porina A de smegmatis (MspA) o alfa-hemolisina, o cualquier combinación de estas.
En algunas instancias, la resistencia a través de la bicapa se reduce después de la inserción de un nanoporo. Las bicapas después de la inserción del nanoporo pueden proporcionar una resistencia eléctrica entre una disolución en el lado cis de la bicapa lipídica y una disolución en el lado trans de la bicapa. En algunos casos, la resistencia después de la inserción del nanoporo es aproximadamente 1 mega-ohmios (MQ), aproximadamente 10 MQ, aproximadamente 100 MQ, aproximadamente 500 MQ, aproximadamente 1 gigaohmio (GQ). En algunos casos, la resistencia después de la inserción del nanoporo es como máximo aproximadamente 1 mega-ohmios (MQ), como máximo aproximadamente 10 MQ, como máximo aproximadamente 100 MQ, como máximo aproximadamente 100 MQ, como máximo aproximadamente 500 MQ, como máximo aproximadamente 1 giga-ohmio (GQ).
El lípido puede ser cualquier lípido adecuado o una mezcla de lípidos. En algunos casos, el lípido se disuelve en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, el lípido se selecciona del grupo que consiste en difitanoilfosfatidilcolina (DPhPC), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina, Lisofosfatidilholina (LPC), 1,2-Di-O-fitanil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DoPhPC), palmitoil-oleoil-fosfatidil-colina (POPC), dioleoil-fosfatidil-metiléster (DOPME), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, esfingomielina, 1,2-di-O-fitanil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-lactosil; GM1 Gangliósido o cualquier combinación de estos.
En un aspecto, un método para formar una bicapa lipídica para su uso en un sensor de nanoporo comprende dirigir una disolución de tampón en el canal de flujo que comprende un electrodo (o pocillo que contiene un electrodo) que tiene una capa de material encima. La disolución de tampón puede ser eléctricamente conductora, y la capa de material puede comprender uno o más lípidos. A continuación, la disolución de tampón se puede poner en contacto con la capa de material, y se puede aplicar uno o más voltajes a los electrodos para estimular la formación de la bicapa. Posteriormente, se puede medir una corriente a través de los electrodos para determinar si al menos una porción de la capa de material ha cubierto y sellado los electrodos y/o ha formado una bicapa sobre todo o una porción del electrodo. El voltaje aplicado puede ser suficiente para romper el sello de la bicapa sobre el electrodo y causar el flujo de corriente de cortocircuito. En función de una determinación de si al menos la porción de la capa de material ha cubierto y sellado los electrodos y/o ha formado una bicapa sobre todo o una porción del electrodo, se puede aplicar un estímulo simultáneamente a todos los electrodos, grupos de electrodos o electrodos individuales para inducir al menos la porción de la capa de material para formar la bicapa lipídica adyacente al electrodo.
En algunas realizaciones, el estímulo comprende al menos uno de un flujo de líquido sobre la superficie de la matriz de electrodos, el flujo secuencial de uno o más líquidos diferentes sobre la superficie de la matriz, el flujo secuencial de cualquier combinación de uno o más líquidos diferentes y burbujas sobre la superficie de la matriz, un impulso eléctrico, impulso de sonicación, impulso de presión o impulso de sonido. En algunas realizaciones, el estímulo comprende cualquier combinación de tampones (intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), disoluciones iónicas (p. ej., NaCl, KCl; aproximadamente 75 mM a aproximadamente 1 M), burbujas, sustancias químicas (p. ej., hexano, decano, tridecano, etc.), movimiento físico, estímulo eléctrico o impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación e/o impulsos de sonido. En algunos casos, la capa de material comprende al menos dos tipos de lípidos. En algunos ejemplos, el estímulo comprende el flujo secuencial de uno o más líquidos y burbujas sobre la superficie de la matriz.
En un aspecto, se describe un método automatizado para crear una bicapa lipídica encima de cada uno de múltiples electrodos que componen una matriz de electrodos controlados individualmente y un método para insertar un único poro en cada bicapa encima de cada electrodo en una matriz de electrodos controlados individualmente en un sensor semiconductor. Al aplicar un estímulo externo adecuado (p. ej., estímulo eléctrico, estímulo de presión, sonicación o sonido) a una capa lipídica en estrecha proximidad con un electrodo en una superficie esencialmente plana, se puede inducir la formación de una bicapa sobre el electrodo en una matriz de electrodos. Además, al aplicar un estímulo externo adecuado (p. ej., incluido estímulo eléctrico, estímulo por presión, sonicación o sonido) a un electrodo individual al chip sensor entero que tiene bicapas lipídicas sobre uno o más electrodos y que están cubiertos con una disolución que contiene proteínas de nanoporo, se puede inducir la inserción de un poro en la bicapa. El resultado es que la bicapa se crea automáticamente, sin intervención manual, sobre múltiples electrodos en una matriz de electrodos controlados individualmente en respuesta a un estímulo y de manera determinista. En algunos casos, se puede insertar un único nanoporo en múltiples electrodos/bicapas en respuesta a un estímulo y de manera determinista y, por lo tanto, crear una matriz altamente paralela de sensores de nanoporo eléctricos controlados individualmente. Estas matrices de sensores de nanoporo controlados individualmente se pueden crear en una superficie semiconductora esencialmente plana y que dentro del material semiconductor se crea una porción o todo el sistema de circuitos necesario para operar y controlar los electrodos individuales.
Además de las estrategias indicadas anteriormente para crear bicapas y poros, la presente descripción proporcionar métodos para crear bicapas y poros sobre matrices de sensores eléctricos/de nanoporo controlados individualmente que son rentables y relativamente sencillos e incluyen 1) activar lípidos o mezclas de lípido-proteína porina que ya están en el sensor (preaplicados) y provocar la creación espontánea de la bicapa o la creación de la bicapa-poro, 2) activar lípidos o mezclas de lípido-proteína porina que ya están en el sensor (preaplicados) y crear directamente bicapas y/o poros a través de estimulación eléctrica en los electrodos o estimulación del sistema para crear bicapas y/o poros 3) activar lípidos o mezclas de lípidoproteína porina que ya están en el sensor (preaplicados) y crear directamente bicapas y/o poros a través de la puesta en contacto de una burbuja o una hacer pasar una burbuja a través de la superficie de un chip sensor, 4) activar lípidos o mezclas de lípido-proteína porina que ya están en el sensor (preaplicados) y distribuir, y diluir la mezcla sobre la superficie de una matriz de sensor al usar una burbuja que prepara la superficie para la estimulación eléctrica posterior en los electrodos o estimulación del sistema para crear bicapas y o poros, 5) usar una burbuja para aplicar, distribuir y diluir una mezcla lipídica sobre la superficie de una matriz de sensor para que se creen bicapas sobre múltiples electrodos independientes en una matriz, 6) usar una burbuja para aplicar, distribuir y diluir una mezcla lipídica y preparar la superficie para la estimulación eléctrica posterior en los electrodos o la estimulación del sistema para crear bicapas sobre múltiples electrodos, 7) usar una burbuja para aplicar, distribuir y diluir una mezcla de proteína purina sobre la superficie de una matriz de sensor preparada con una mezcla lipídica para que los poros se inserten sobre múltiples electrodos independientes en una matriz, 8) usar una burbuja para aplicar, distribuir y diluir una mezcla de proteína purina y preparar la superficie para la estimulación eléctrica posterior en los electrodos o la estimulación del sistema para crear un único poro sobre múltiples electrodos en una matriz, 9) usar un estímulo eléctrico para crear una bicapa sobre la superficie de un electrodo que no requiere la generación ni aplicación de una burbuja sobre la superficie de un electrodo, 10) usar sonicación o estímulo de presión aplicado a uno o más electrodos, o al chip sensor entero, para crear una bicapa y/o poro sobre la superficie de un electrodo o múltiples electrodos, 11) aumentar la densidad de electrodos en una matriz semiconductora de electrodos para la percepción eléctrica por nanoporo que es compatible con los métodos para establecer bicapas y poros descritos anteriormente, 12) usar un ajuste en el que ninguna celda de flujo o un chip sensor único abierto que contiene una matriz de múltiples sensores de electrodo-nanoporo puede admitir los métodos indicados anteriormente o en otra parte en la presente memoria descriptiva, o una celda de flujo única en un chip sensor único que contiene una matriz de múltiples sensores electrodo-nanoporo puede admitir los métodos indicados anteriormente o en otra parte en la presente memoria descriptiva, o múltiples celdas de flujo en un chip sensor único que contiene una matriz de múltiples sensores electrodo-nanoporo puede admitir los métodos indicados anteriormente o en otra parte en la presente memoria descriptiva, 13) variar una presión del líquido o burbuja para mejorar la creación satisfactoria de la bicapa o poro y 14) variar una temperatura del chip sensor y el líquido para mejorar la creación de la bicapa o poro.
La presente descripción proporciona diversas estrategias para crear una bicapa lipídica y para insertar un poro en la bicapa. En una realización, se presenta un chip semiconductor con múltiples electrodos. Se aplica una disolución lipídica líquida a la superficie preparada silanizada del chip. La disolución lipídica líquida puede ser una disolución de un disolvente orgánico, p. ej., decano, hexano, tridecano, etc., y moléculas lipídicas, tales como difitanoilfosfatidilcolina (DPhPC) y/o cualquiera de los lípidos indicados anteriormente. La disolución se puede aplicar sobre la superficie mediante fluido, vertido, pulverización y/o escurrimiento. La disolución se seca sobre la superficie. La disolución puede secarse sustancialmente o completamente de manera que solo quede la forma en polvo de las moléculas de DPhPC. Como una alternativa, la disolución se puede secar hasta un estado pegajoso. Como tal, la superficie del chip se puede funcionalizar mediante las moléculas lipídicas preaplicadas en forma de polvo o forma de disolución pegajosa. El chip se sella y se puede manipular y enviar.
El chip semiconductor puede contener una cubierta y la cubierta puede permitir que el usuario bombee hacia adentro y bombee hacia afuera (o de cualquier otra manera dirija el movimiento del) líquido a través del chip. En algunos ejemplos, el usuario aplica un líquido tampón (o disolución), tal como agua con sal, en el chip para activar las moléculas lipídicas, que pueden estar en un estado seco o sustancialmente seco. Después de que las moléculas lipídicas hacen contacto con la disolución tampón, las moléculas lipídicas se hidratan. La presión del líquido tampón que ingresa puede facilitar la formación de una bicapa lipídica encima de cada superficie de electrodo. La formación de la bicapa lipídica puede ser espontánea.
En algunas situaciones, el chip semiconductor puede no contener una cubierta y el usuario aplica un líquido tampón (o disolución), tal como agua con sal, sobre la superficie del chip al usar una pipeta u otro dispositivo (o instrumento) de transferencia y/o movimiento de fluido para activar las moléculas lipídicas. Después de que las moléculas lipídicas hacen contacto con la disolución tampón, las moléculas lipídicas se hidratan. La presión del líquido tampón que ingresa puede facilitar la formación de una bicapa lipídica encima de cada superficie de electrodo.
En situaciones en las que el chip semiconductor contiene una cubierta, después de que se aplica el líquido tampón en el chip, se puede bombear una burbuja hacia dentro y detrás de la burbuja hay más disolución tampón que frente a la burbuja. La burbuja se desplaza a través del chip y alisa/diluye la mezcla lipídica predepositada nuevamente hidratada y provoca que las moléculas lipídicas se desplacen a través de la superficie. Después de que la burbuja fluye, se puede formar una bicapa lipídica encima de cada superficie de electrodo.
En algunos casos, después de que se aplica la burbuja y se desplaza a través del chip, se aplica una señal eléctrica al (a los) electrodo(s) y el estímulo eléctrico puede provocar que la(s) bicapa(s) se forme sobre el electrodo(s). El estímulo eléctrico con un potencial de voltaje puede alterar la interfaz entre la superficie del electrodo y el material lipídico alrededor de los electrodos para provocar la formación abrupta, rápida de bicapas.
En algunas realizaciones, la disolución lipídica líquida puede contener, además, proteínas de poro, tales como porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA) o alfa-hemolisina. La disolución que contiene moléculas lipídicas y proteínas de poro se seca. La superficie del chip se prepara con moléculas de silano para hacer que la superficie se vuelva hidrófoba. Las moléculas lipídicas y las proteínas de poro se depositan en forma de polvo o en un estado pegajoso. El usuario puede activar el chip al aplicar una disolución tampón al chip. Las moléculas lipídicas y proteínas de poro se hidratan. Una capa lipídica con nanoporo insertado se puede formar encima de cada superficie de electrodo. La capa lipídica se puede formar espontáneamente.
En algunos casos, después de que el líquido tampón se aplica al chip, se bombea una burbuja hacia dentro. Puede haber más disolución tampón detrás de la burbuja que frente a la burbuja. La burbuja puede desplazarse a través del chip y alisar y diluir la mezcla de lípido y poro predepositada nuevamente hidratada y provocar que las moléculas de lípido y/o poro se desplacen a través de la superficie. Después de que la burbuja fluye, se puede formar una bicapa lipídica encima de cada superficie de electrodo de la manera descrita anteriormente o en otra parte en la presente memoria descriptiva, y se pueden insertar proteínas de poro en la bicapa para formar nanoporos.
Como una alternativa, o adicionalmente, después de que se aplica la burbuja y se desplaza a través del chip, se puede aplicar una señal eléctrica al electrodo y el estímulo eléctrico puede provocar que se forme una bicapa sobre el electrodo y se inserte un nanoporo en la bicapa. El estímulo eléctrico con un potencial de voltaje puede alterar la superficie del electrodo y afecta al material lipídico alrededor de los electrodos para provocar la formación abrupta, rápida de bicapas y nanoporos en las bicapas.
En otra realización, el chip semiconductor está solamente silanizado y no tiene ninguna molécula preaplicada, tales como moléculas lipídicas o proteínas de poro, que funcionalizan la superficie del chip. La superficie del chip se enjuaga inicialmente al usar agua con sal, es decir, se ceba. A continuación, una alícuota de lípido en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, decano, se inserta sobre el chip. Después sigue una burbuja para untar el material lipídico y distribuir y diluir el material lipídico sobre la superficie del chip. Se crean bicapas lipídicas sobre múltiples electrodos a través del contacto y distribución de la burbuja. Las bicapas lipídicas se pueden formar espontáneamente.
En otra realización relacionada, las bicapas lipídicas pueden no crearse espontáneamente después de la burbuja. Una estimulación eléctrica posterior y/u otros estímulos se aplican a los electrodos. Se cree que los impulsos eléctricos y/u otros estímulos ayudan a crear una bicapa simple al destruir multicapas y estimular la formación de bicapas simples sobre el electrodo. El impulso eléctrico provoca que las bicapas se formen o destruyan sobre los electrodos.
En todavía otra realización relacionada, se hace fluir KCL a través del chip y el chip se humedece, es decir, se ceba. A continuación, se aplica una pequeña cantidad de disolución lipídica al chip y se hace fluir a través del chip seguida inmediatamente por una burbuja que diluye y distribuye el lípido a través del chip. Después, se hace fluir agua con sal a través del chip. A continuación, se inserta una disolución de proteína de poro en el chip. Otra burbuja le sigue para untar y diluir la mezcla de proteína de poro sobre la superficie del chip, de manera que los poros se inserten sobre los múltiples electrodos independientes en una matriz a través de una forma de contacto o presión de la burbuja.
En todavía otra realización relacionada, después de que se insertan la disolución de proteína de poro y la segunda burbuja, se aplica una estimulación eléctrica posterior a los electrodos para crear nanoporos en las bicapas lipídicas sobre los múltiples electrodos en una matriz.
En otra realización, una alícuota de lípido en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, decano, se inserta sobre el chip cargado o cubierto con una disolución iónica (tal como agua con sal). Una estimulación eléctrica posterior se aplica a los electrodos. El impulso eléctrico provoca que las bicapas se formen sobre los electrodos. En esta realización, no se inserta ninguna burbuja para facilitar la formación de la bicapa. El lípido se distribuye bien alrededor de los electrodos sobre la superficie del chip. Un voltaje aplicado sobre los electrodos provoca la alteración del material lipídico en el borde de los electrodos e induce la formación de una bicapa lipídica.
El chip sensor de nanoporo semiconductor puede contener uno o más canales a través de los cuales puede fluir un líquido, disolución o reactivos. En algunas realizaciones, cada canal tiene dos bandas, una a cada lado del canal. Los electrodos pueden estar en la superficie inferior del canal. Los electrodos pueden estar, además, en la superficie de pared lateral del canal (sobre las bandas). La densidad de electrodos para cada canal se puede aumentar al crear electrodos en las superficies inferiores y de pares lateral.
Se puede usar una o más celdas de flujo en el chip semiconductor. Cada celda de flujo se puede usar para insertar disoluciones o burbujas para uno de los canales en el chip. Una celda de flujo es un trayecto por el que pueden pasar líquidos, burbujas y reactivos. Los canales en el chip que actúan como una celda de flujo entera o porciones pueden ser independientes, de manera que el chip puede procesar múltiples muestras diferentes independiente y simultáneamente.
En algunas realizaciones, no hay ningún canal ni celda de flujo en el chip. El chip se preaplica con disolución lipídica líquida o disolución de mezcla lípido-poro líquida. La disolución se puede secar hasta una forma en polvo o un estado pegajoso. Se aplica una disolución tampón líquida al chip para activar el lípido o la mezcla de lípido-poro. Se aplica una señal eléctrica al electrodo y el estímulo eléctrico puede provocar que se forme la bicapa sobre el electrodo. El estímulo eléctrico con un potencial de voltaje puede alterar la superficie del electrodo y afecta al material lipídico alrededor de los electrodos para provocar la formación abrupta, rápida de bicapas. Además, si hay proteína de poro activada presente, el estímulo eléctrico puede facilitar, adicionalmente, la inserción de moléculas de poro en las bicapas lipídicas.
En algunas realizaciones, la presión del líquido o burbuja se puede variar para mejorar la creación de la bicapa o nanoporo. En algunas realizaciones, la temperatura del chip y el líquido se puede variar para mejorar la creación de la bicapa o poro. Por ejemplo, se puede aplicar una temperatura ligeramente más baja que la ambiente cuando se forma la bicapa; se puede aplicar una temperatura ligeramente más alta que la ambiente cuando se inserta el nanoporo en la bicapa lipídica.
Un chip puede tener uno de los cuatro lados del chip sellado que se deja abierto y accesible. El lado opuesto también puede tener un único orificio con el cual se puede poner en contacto y conectar un tubo. Si el chip se ubica o dispone de cualquier otra manera para que quede vertical con el orificio y tubo en la parte inferior y el extremo abierto del chip en la parte superior, se pueden agregar el líquido tampón y reactivos a través de la parte superior y después se pueden liberar burbujas, a una velocidad controlada, desde la parte inferior y desplazarlas hacia arriba por la cavidad sellada y fluir a través del chip. Este sistema puede no tener series de burbujas que separan las fracciones líquidas que se desplazan a través del chip. Alisa cualesquiera sustancias que se agregan a través de la parte superior abierta del chip empacado y desgasta la superficie del chip en su interior. En cambio, se pueden insertar líquidos y reactivos a través del tubo simple en la parte inferior del aparato y esto puede ser ventajoso cuando se requieren adiciones en serie automatizadas en el tiempo de reactivos.
En algunas situaciones, los chips sensores se pueden acoplar a, o colocar en, un aparato que puede automatizar la aplicación de cualquier combinación de líquidos, reactivos, burbujas, impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación, e/o impulsos de sonido al chip sensor o líquido, reactivo o burbuja en el chip sensor, para provocar la creación automatizada de bicapas, la creación de poros, el mantenimiento de bicapas y poros, incluida su recreación, captura y lectura de las moléculas biológicas aplicadas al chip sensor de nanoporo, y para proporcionar detalles en tiempo real y/o de extremo del estados de todos los sensores y todas las características del rendimiento del instrumento. El aparato puede admitir cualquier nivel de intervención manual del operador o permitir la creación de pruebas a medida. El aparato puede aplicar diferentes señales y/o reactivos o actuar sobre la muestra o chip en respuesta al resultado de una señal de prueba anterior o adición de reactivo que permite que el aparato funcione completa o sustancialmente de manera automática. Dicho sistema puede permitir la ejecución de experimentos de evolución temporal sin operador o permitir la renovación del sistema de nanoporos para refuncionalizar la superficie del chip sensor para continuar con la prueba.
La aplicación de un estímulo para inducir la creación de bicapas o la creación de poros puede incluir también la aplicación de cualquier combinación de tampones (intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), disoluciones iónicas (p. ej., NaCl, KCl; aproximadamente 75 mM a aproximadamente 1 M), burbujas, sustancias químicas (p. ej., hexano, decano, tridecano, etc.), movimiento físico, estímulo eléctrico o impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación e/o impulsos de sonido al chip sensor para estimular el(los) evento(s) de creación de bicapa/poro deseado(s) o de cualquier otra manera predeterminado(s).
Un chip semiconductor puede no contener una cubierta y el usuario puede aplicar cualesquiera y todos los tampones, reactivos y burbujas manualmente a través del uso de una pipeta u otro instrumento. Esta aplicación manual de estas técnicas se puede acoplar con cualquier estímulo aplicado señalado en la presente memoria descriptiva para inducir la formación de bicapas y/o poros deseada.
Los sistemas de celda de flujo o burbuja simple de la presente descripción también pueden ayudar en gran medida a la inserción de poros al aplicar la disolución de proteína de poro uniformemente alrededor de la superficie del chip sensor y provocar la inserción espontánea del chip, o configurar la superficie de manera que un estímulo de cualquier combinación de tampones (intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), disoluciones iónicas (p. ej., NaCl, KCl; aproximadamente 75 mM a aproximadamente 1 M), burbujas, sustancias químicas (p. ej., hexano, decano, tridecano, etc.), movimiento físico, estímulo eléctrico o impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación e/o impulsos de sonido al chip sensor pueda estimular la inserción rápida de poros en las bicapas. Un sistema de celda de flujo o burbuja simple también puede ayudar a hidratar una mezcla de lípido-poro-proteína seca que puede formar bicapas o poros espontáneos después de alisarse o mezclarse en un tampón adecuado con o sin burbujas.
La figura 23 ilustra un método de muestra para formar una capa lipídica sobre los electrodos en uno o más canales de flujo de un chip del sensor cebado. El chip sensor puede ser un chip plano que comprende múltiples electrodos integrados en, y/o esencialmente planos con respecto a, una superficie no conductora o semiconductora sobre la cual se ubican en la superficie de los canales de flujo. El método comprende, en una primera operación 2301, hacer fluir una disolución lipídica que comprende al menos un tipo de lípido a través de cada uno de los canales de flujo. A continuación, en una segunda operación 2302, los lípidos se depositan sobre la superficie de y/o adyacentes a electrodos. En una tercera operación 2303, los lípidos depositados se alisan y diluyen con una burbuja de seguimiento en cada uno de los canales de flujo. Después, en una cuarta operación 2304, cada uno de los canales de flujo se vuelve a cargar con una disolución tampón. La disolución de tampón puede ser eléctricamente conductora. En una quinta operación 2305, se miden corrientes a través de los electrodos para determinar su una bicapa lipídica se ha formado con propiedad sobre cada uno de los electrodos. A continuación, en una sexta operación, opcional 2306, si las bicapas lipídicas no se han formado adecuadamente sobre ninguno, todos o sustancialmente todos los electrodos, se aplica un estímulo (p. ej., un estímulo eléctrico) para inducir que los lípidos en las superficies formen bicapas lipídicas sobre los electrodos. En algunas instancias, sin embargo, no se aplica voltaje para crear bicapas.
En algunas realizaciones, la disolución lipídica comprende al menos dos tipos de lípidos. La disolución lipídica puede comprender, además, al menos un tipo de proteínas de poro. Las proteínas de poro pueden comprender porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA) o alfa-hemolisina. Una disolución no lipídica que contiene proteínas de poro se puede dirigir sobre los lípidos depositados en cada uno de los canales de flujo. Las proteínas de poro y los lípidos depositados después se pueden diluir con una burbuja en cada uno de los canales de flujo. A continuación, se puede dirigir una disolución de proteína de poro, una burbuja de aire (o gas) adicional y una disolución líquida adicional a través del canal de flujo. La disolución de proteína de poro y la disolución líquida se pueden separar mediante la burbuja de aire. A continuación, se puede aplicar un estímulo eléctrico a través de al menos algunos de los electrodos para facilitar una inserción de la proteína de poro en la bicapa lipídica. Las operaciones de hacer fluir disoluciones y burbujas se pueden repetir en cualquier orden y combinación deseado para lograr la formación de la bicapa lipídica e inserción del nanoporo en la bicapa. En algunas ejemplos, el lípido son difitanoilfosfatidilcolina (DPhPC), palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), dioleoil-fosfatidil-metiléster (DOPME), Lisofosfatidilholina (LPC), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3fosfocolina, 1,2-Di-O-fitanil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DoPhPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, 1,2-di-O-fitanil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-lactosil; GM1 Gangliósido o esfingomielina. La disolución lipídica líquida puede contener, además, un disolvente orgánico, tal como decano.
En alguna realización, la disolución tampón puede contener disolución iónica, tal como disolución de cloruro de sodio o cloruro de potasio. La disolución tampón puede contener, además, cianuro ferroso o ácido ascórbico, glutamato de sodio, glutamato de potasio, cloruro de tetrametilamonio, cloruro de tetraetilamonio, cloruro de amonio, etc. También puede contener trehalosa, sacarosa o cualquier otro azúcar. El tampón también puede contener divalentes tales como cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de estroncio, cloruro de manganeso, etc. En algunas realizaciones, la presión de las burbujas y/o fluido se ajusta sustancialmente en o ligeramente por encima o por debajo de la presión atmosférica para mejorar la formación de la bicapa o la inserción del nanoporo.
La figura 24 ilustra un chip sensor semiconductor de muestra, según una realización de la presente descripción. El chip sensor 2400 comprende múltiples canales de flujo 2410. Cada canal de flujo tiene múltiples electrodos 2420 integrados en, y planos o sustancialmente planos con respecto a, una superficie no conductora o semiconductora sobre la cual se ubican en la superficie de los canales de flujo 2410. La superficie del canal de flujo distinta de los electrodos es hidrófoba. Las superficies del canal de flujo distintas de los electrodos pueden ser hidrófobas, hidrófilas, o cualquier combinación de estas. Se pueden tratar paredes diferentes para que tengan características diferentes. Los canales de flujo 2410 se separan mediante bandas guía 2440 a lo largo de los canales de flujo. El ancho del canal puede ser suficientemente ancho para alojar dos o más filas de electrodos. Los electrodos se pueden fabricar sobre la superficie inferior de los canales de flujo, así como las paredes laterales de las bandas guía, como se muestra en la figura 24. En algunas realizaciones, el lado superior de los canales de flujo se sella.
En otro aspecto, un método para formar una bicapa lipídica sobre los electrodos en uno o más canales de flujo de un chip sensor cebado, es decir, un chip por el que ha fluido disolución tampón sobre el chip, comprende: (a) hacer fluir una disolución lipídica que comprende al menos un tipo de lípidos a través de cada uno de los canales de flujo; (b) depositar los lípidos sobre la superficie del chip; (c) alisar y diluir los lípidos depositados con una burbuja de seguimiento o adicional en cada uno de los canales de flujo; (d) hacer fluir adicionalmente disolución tampón a través de cada uno de los canales de flujo, la disolución tampón es eléctricamente conductora; (e) medir corrientes a través de los electrodos para determinar si se formó una bicapa lipídica sobre cada uno de los electrodos; y (f) si las bicapas lipídicas no se formaron sobre ninguno de los electrodos, aplicar, opcionalmente, un estímulo a al menos uno de los electrodos para inducir que los lípidos sobre las superficies formen bicapas lipídicas sobre los electrodos. El estímulo puede comprender al menos uno de un impulso eléctrico, impulso de sonicación, impulso de presión e impulso de sonido o cualquier combinación de tampones (intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), disoluciones iónicas (p. ej., NaCl, KCl; aproximadamente 75 mM a aproximadamente 1 M), burbujas, sustancias químicas (p. ej., hexano, decano, tridecano, etc.), movimiento físico, estímulo eléctrico o impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación e/o impulsos de sonido al chip sensor.
En algunas realizaciones, la disolución lipídica comprende al menos dos tipos de lípidos. En algunas realizaciones, la disolución lipídica comprende, además, al menos un tipo de proteína de poro.
En algunas realizaciones, después de (c): una disolución no lipídica que contiene proteínas de poro se dirige sobre los lípidos depositados en cada uno de los canales de flujo. Las proteínas de poro y los lípidos depositados después se pueden diluir con una segunda burbuja en cada uno de los canales de flujo. Las operaciones indicadas anteriormente se pueden repetir al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, o más veces en cualquier orden o combinación.
En algunos casos, se puede dirigir una disolución de proteína de poro, una burbuja de aire adicional y una disolución líquida adicional a través del canal de flujo. La disolución de proteína de poro y la disolución líquida se pueden separar mediante la burbuja de aire. A continuación, un estímulo, por ejemplo, cualquier combinación de tampones (intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), disoluciones iónicas (p. ej., NaCl, KCl; aproximadamente 75 mM a aproximadamente 1 M), burbujas, sustancias químicas (p. ej., hexano, decano, tridecano, etc.), movimiento físico, estímulo eléctrico o impulsos de estímulo eléctrico, presión o impulsos de presión, temperatura o impulsos de temperatura, impulsos de sonicación e/o impulsos de sonido al chip sensor, se puede aplicar a través de al menos algunos, todos o sustancialmente todos los electrodos para facilitar la inserción de la proteína de poro en la bicapa lipídica.
En algunas realizaciones, el lípido es difitanoilfosfatidilcolina (DPhPC), palmitoil-oleoil-fosfatidil-colina (POPC), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3fosfocolina, 1,2-Di-O-fitanil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DoPhPC), dioleoilfosfatidil-metiléster (DOPME), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), Lisofosfatidilholina (lPc ), fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, 1,2-di-O-fitanil-snglicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350]; 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-550]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000]; 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-lactosil; GM1 Gangliósido o esfingomielina.
En algunos casos, al menos parte de las disoluciones lipídicas líquidas contienen un disolvente orgánico (p. ej., decano). Las proteínas de poro, en algunos ejemplos, pueden comprender porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA) o alfa-hemolisina. En algunos casos, la disolución tampón contiene una disolución iónica que contiene uno o más iones (p. ej., cloruro de sodio o cloruro de potasio). En algunas instancias, al menos parte de la disolución tampón contiene cianuro ferroso o ácido ascórbico. En algunas instancias, la disolución tampón puede contener, además, glutamato de sodio, glutamato de potasio, cloruro de tetrametilamonio, cloruro de tetraetilamonio, cloruro de amonio, ferrocianuro, cianuro férrico, acetato de potasio, etc. En algunas instancias, la disolución tampón también puede contener trehalosa, sacarosa o cualquier otro azúcar. En algunas instancias, la disolución tampón también puede contener divalentes tales como cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de estroncio, cloruro de manganeso, etc.
En algunas realizaciones, la presión de las burbujas y/o fluido está sustancialmente en o ligeramente por encima de la presión atmosférica. Las burbujas pueden tener una presión que es mayor que atmosférica, tal como a una presión que es una magnitud de 101 kPa a 1013 kPa.
La superficie de los electrodos metálicos es hidrófila. En la instancia cuando los electrodos pueden no ser metálicos; tal como silicio conductor, se puede aplicar un voltaje potencial, o voltaje potencial variable, a los electrodos durante el proceso de silanización para evitar que el silano se adhiera y haga reacción con los electrodos no metálicos. Se pueden usar voltajes de ± 10mV hasta ±2V y concentraciones que difieren de tampón iónico inferior con la mezcla de silano. También se puede retirar cualquier silano que hizo reacción o residual de electrodos metálicos o no metálicos al ciclar voltajes en los electrodos y "quemar" el silano después del depósito. Para los electrodos no metálicos, después de quemar una etapa de silano hidrófobo, se puede agregar una etapa de silano hidrófilo y solo el espacio sobre el electrodo estará abierto para hacer reacción con el silano. El resultado es una superficie de electrodo que no es hidrófobo ni lipófila, y debería ser hidrófila.
En algunas instancias, la superficie del canal de flujo distinta de los electrodos es hidrófoba. En algunas realizaciones, las superficies del canal de flujo (distintas de los electrodos) pueden ser hidrófobas, hidrófilas, o cualquier combinación de estas. Se pueden tratar superficies diferentes (paredes o piso del canal) para que tengan características diferentes.
En algunas realizaciones, antes de (a), la superficie del canal de flujo distinta de los electrodos se puede volver hidrófoba al silanizar, tratar químicamente o al usar o diseñar materiales específicos, la superficie del canal de flujo distinta de los electrodos; se puede formar una pluralidad de canales de flujo sobre una superficie del chip; los electrodos se pueden fabricar sobre una superficie de cada uno de los canales de flujo; los canales de flujo se pueden separar al construir bandas guía a lo largo de los canales de flujo; los electrodos se pueden fabricar en una superficie lateral de cada una de las bandas guía; y/o el lado superior de cada uno de los canales de flujo se puede sellar.
En algunas situaciones, se puede crear un chip que tiene una bicapa al hacer fluir una disolución iónica a través del chip. El flujo puede ser una "serie" de alícuotas de disolución lipídica y disolución iónica intercaladas (p. ej., alternando disolución lipídica y disolución iónica). El flujo puede ir a través de tuberías de suministro y a través del chip. En algunos ejemplos, una serie puede tener al menos o aproximadamente 0,1 uL, 1 uL, 2 uL, 3 uL, 4 uL o 5 uL de lípido y después al menos o aproximadamente 0,1 uL, 1 uL, 2 uL, 3 uL, 4 uL o 5 uL de disolución iónica, y se puede repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. La serie de disoluciones se puede bombear hacia delante y atrás a través de la superficie del biochip aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. La cobertura y/o sello después se puede verificar eléctricamente. En algunas realizaciones, la serie de disolución(es) lipídica e/o iónica puede ser de entre aproximadamente 0,1 uL a aproximadamente 1000 uL.
En algunos casos, después de la serie de disoluciones sigue una operación de ensamblaje. La operación de ensamblaje puede implicar hacer fluir una burbuja a través del chip. En algunas instancias, se pueden usar métodos eléctricos para verificar la cobertura de las celdas (incluidos electrodos) y/o la resistencia a fujas o sello en cada electrodo.
En algunos casos, la operación de ensamblaje se repite hasta que se obtuvieron al menos parte o todos los siguientes resultados de prueba: (1) al menos aproximadamente 100, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o más electrodos están cubiertos; (2) al menos aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 membranas (p. ej., capas lipídicas) estallan con un voltaje aplicado menor que -1 V; (3) de las capas lipídicas que estallaron en (2), al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más estallaron con entre aproximadamente -300 mV a -700 mV; (4) la cantidad de electrodos con una resistencia a sello menor que aproximadamente 50 Giga-ohmios es menor que 30, 20, 15 o 10; y (5) si la cantidad de celdas que exhiben cualquier corriente de fuga registrada supera 50, entonces la mediana de la resistencia a sello es mayor que 150 Giga-ohmios. En algunos casos, la operación de ensamblaje se repite hasta que se obtuvieron al menos parte o todos los siguientes resultados de prueba: (1) al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, p. ej., 100 % de los electrodos están cubiertos; (2) al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, p. ej., 100 % de las membranas (p. ej., capas lipídicas) estallan con un voltaje aplicado menor que ±1 V; (3) de las capas lipídicas que estallaron en (2), al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o más, p. ej., 100 %, estallaron con entre aproximadamente ±300 mV a ±700 mV; y (4) una cantidad mínima de celdas tienen más de 10GOhmios (p. ej., al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %).
Si algunos o todos estos criterios se satisfacen, entonces una burbuja de cualquier tamaño entre aproximadamente 10 microlitros (uL) a aproximadamente 1000uL se puede hacer fluir a través del chip, seguida por una cantidad de tampón (p. ej., aproximadamente 10uL a aproximadamente 10mL) y se puede llevar a cabo una prueba final de (1), (4) y (5). Si se pasa, entonces el programa pasa al protocolo de inserción de poro. El programa se puede implementar con la ayuda de un sistema informático (p. ej., mediante la ejecución de un procesador).
En algunos casos, el protocolo de inserción de poro incluye aplicar al menos o aproximadamente 0,1 uL, 1 uL, 2 uL, 3 uL, 4 uL, 5 uL o hasta aproximadamente 1 mL de disolución de proteína de poro al chip y aplicar un estímulo, p. ej., electroporación, para insertar los poros en la bicapa. Al final de la operación de electroporación, se puede verificar el chip para determinar el rendimiento de poros y si los criterios se satisfacen, se aplica la muestra y los reactivos de prueba.
El tiempo total para la creación de la bicapa y la inserción del poro puede ser cualquier valor adecuado. En algunos casos, el tiempo total es aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 1 hora o aproximadamente 2 horas. En algunos casos, el tiempo total es menor que aproximadamente 1 minuto, menor que aproximadamente 5 minutos, menor que aproximadamente 10 minutos, menor que aproximadamente 20 minutos, menor que aproximadamente 30 minutos, menor que aproximadamente 45 minutos, menor que aproximadamente 1 hora o menor que aproximadamente 2 horas. En algunas instancias, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, o aproximadamente 90 % del tiempo total es para la formación de la bicapa. Cualquier proporción del tiempo total se puede dividir entre la formación de la bicapa y la inserción del poro. En algunos casos, se forma la bicapa y se inserta el nanoporo simultáneamente. En algunas instancias, el tiempo total para la bicapa y la inserción del poro es, en promedio, 15 minutos para la creación de la bicapa y 20 minutos para la inserción del poro para un total de 35 minutos.
Se puede cubrir cualquier cantidad de pocillos mediante una membrana (p. ej., bicapa lipídica) con poro insertado (p. ej., rendimiento de poros). En algunos casos, el rendimiento de poros es aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % y similares. En algunos casos, el rendimiento de poros es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % y similares.
En algunas realizaciones, los parámetros aplicados al chip de electrodo y a un ajuste de prueba son KCl 1M o 300mM NaCl, pH 7,5 (intervalo de pH entre aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,5), velocidades de flujo de fluido corriente (p. ej., entre aproximadamente 1 uL/seg a aproximadamente 1000 uL/seg), presión atmosférica a nivel del mar y temperatura ambiente.
Uso de un gel para soportar la membrana
En un aspecto, un método para formar un biochip o sensor comprende recubrir un sustrato con una capa adecuada para la adhesión de una membrana (p. ej., una bicapa lipídica que comprende un nanoporo). El sustrato se puede silanizar con una molécula de alcoxisilano organofuncional. La figura 18 muestra un biochip donde una membrana se puede disponer sobre la superficie silanizada.
En algunos casos, es difícil formar la membrana y/o es inestable al menos en parte debido a que la membrana está soportada sobre el dióxido de silicio silanizado, pero no está soportada sobre el pocillo. Se reconoce y describe en la presente memoria descriptiva que cargar el pocillo con un gel puede soportar la membrana sobre el área del pocillo y facilitar así la formación de la membrana y/o la estabilización de la membrana. En algunas realizaciones, la porción vacía de un pocillo se carga con un gel como se muestra en la figura 19. El gel puede proporcionar soporte mecánico para una membrana dispuesta sobre el pocillo. En otras realizaciones, la membrana se puede estabilizar químicamente a través del uso de tampones que comprenden trehalosa, u otros azúcares.
En un aspecto, un método para preparar un biochip comprende: (a) depositar un gel en el pocillo que está próximo a un electrodo y circuito de percepción; y (b) formar una membrana sobre el pocillo, en donde la membrana está al menos parcialmente soportada por el gel.
En diversas realizaciones, el gel es no reactivo, reticulado, comprende un electrolito líquido, o cualquier combinación de estos. Los geles pueden incluir, pero no se limitan a, geles reactivos estándares tales como agarosa y matrices de gel patentadas disponibles comercialmente. Los ejemplos son colágenos, lamanina, hidrogeles, QGel y geles HydroMax.
Inserción de un nanoporo
En algunas instancias, se inserta un nanoporo en la membrana (p. ej., mediante electroporación). El nanoporo se puede insertar mediante una señal de estímulo tal como estímulo eléctrico, estímulo de presión, estímulo de flujo de líquido, estímulo de burbuja de gas, sonicación, sonido, vibración o cualquier combinación de estos. El nanoporo puede ser un nanoporo proteico tal como un nanoporo de alfa-hemolisina o Mycobacterium smegmatis (MspA) o un nanoporo que tiene al menos aproximadamente 70 % de homología con respecto a alfa-hemolisina o MspA.
En algunas realizaciones, insertar el nanoporo comprende aplicar un estímulo (p. ej., impulso de electroporación) a través de dicho electrodo para facilitar la inserción de dicho nanoporo. En algunos casos, a esto le sigue un segundo impulso de detección eléctri
dicha bicapa lipídica. El uso de un impulso de electroporación con un impulso de detección posterior se puede repetir rápidamente y/o muchas veces y con el uso de niveles de voltaje que varían secuencialmente para el impulso de electroporación hasta que se inserta un poro y se logra la detección. En una realización, el impulso de electroporación inicial es de aproximadamente 50 mV (positivo o negativo) repetido una a diez veces, donde cada lote posterior de impulso(s) de electroporación se aumenta con respecto al impulso de electroporación previo en aproximadamente 1 mV hasta un máximo de aproximadamente ±700 mV, es decir, una escala de voltaje creciente. El impulso de detección es de 160 mV entre cada impulso de electroporación. Por lo tanto, por ejemplo, el proceso de insertar un nanoporo en una bicapa lipídica sería la aplicación de un impulso de electroporación de 50 mV y la aplicación de un impulso de detección cinco veces, la aplicación de un impulso de electroporación de 51 mV y la aplicación de un impulso de detección cinco veces, etc. El proceso se repite hasta que se inserta un nanoporo, en cuyo caso el electrodo se apaga, o hasta que el electrodo/pocillo se rechaza o se determina que ha fallado.
En algunos casos, una enzima, p. ej., polimerasa (p. ej., ADN polimerasa) u otra enzima (p. ej., transcriptasa inversa), se acopla y/o se ubica próxima al nanoporo. La polimerasa/enzima se puede acoplar al nanoporo antes o después de que el nanoporo se incorpora en la membrana. En algunas instancias, el nanoporo y polimerasa/enzima son una proteína de fusión (es decir, cadena polipeptídica simple). Se entenderá que, aunque se ejemplifica una polimerasa en toda la memoria descriptiva, se podría usar cualquier enzima adecuada.
La polimerasa se puede acoplar al nanoporo de cualquier manera adecuada. En algunos casos, la polimerasa se acopla al monómero de proteína hemolisina y después se ensambla el heptámero de nanoporo completo (p. ej., en una relación de un monómero con una polimerasa acoplada para 6 monómeros de hemolisina sin una polimerasa acoplada). El heptámero de nanoporo después se puede insertar en la membrana.
Otro método para acoplar una polimerasa a un nanoporo implica acoplado una molécula enlazadora a un monómero de hemolisina o mutar un monómero de hemolisina para tener un sitio de acoplamiento y después ensamblar el heptámero de nanoporo completo (p. ej., en una relación de un monómero con enlazador y/o sitio de acoplamiento para 6 monómeros de hemolisina sin ningún enlazador y/o sitio de acoplamiento). Se entenderá que la combinación de monómero con un enlazador y/o sitio de acoplamiento (H+) a monómeros de hemolisina sin enlazador y/o sitio de acoplamiento (H-) puede hacerse para lograr el nanoporo heptamérico de hemolisina con cualquier relación de las subunidades, p. ej., (H+)2(H-)5, (H+)3(H-)4, (H+)4(H-)3, etc. A continuación, se puede acoplar una polimerasa al sitio de acoplamiento o enlazador de acoplamiento (p. ej., a granel, antes de insertarla en la membrana). La polimerasa también se puede acoplar al sitio de acoplamiento o enlazador de acoplamiento después de que se forma el nanoporo (p. ej., heptámero) en la membrana. En algunos casos, se inserta una pluralidad de pares nanoporo-polimerasa en una pluralidad de membranas (p. ej., dispuestas sobre los pocillos y/o electrodos) del biochip. En algunas instancias, el acoplamiento de la polimerasa al complejo de nanoporo se produce en el biochip encima de cada electrodo. La polimerasa se puede acoplar al nanoporo con cualquier química adecuada (p. ej., unión covalente y/o enlazador). En algunos casos, la polimerasa se acopla al nanoporo con grapas moleculares. En algunas instancias, las grapas moleculares comprenden tres secuencias de aminoácidos (denotadas enlazadores A, B y C). El enlazador A puede extenderse desde un monómero de hemolisina, el Enlazador B puede extenderse desde la polimerasa y el Enlazador C después puede unir los Enlazadores A y B (p. ej., al envolver aproximadamente ambos Enlazadores A y B) y, por lo tanto, la polimerasa con el nanoporo. El enlazador C también se puede construir como parte del Enlazador A o el Enlazador B, y reducir, por lo tanto, la cantidad de moléculas enlazadoras. Los enlazadores también pueden ser biotina y estreptavidina.
En algunas instancias, la polimerasa se enlaza al nanoporo mediante el uso de química Solulink™. Solulink™ puede ser una reacción entre HyNic (ácido 6-hidrazino-nicotínico, una hidrazina aromática) y 4FB (4-formilbenzoato, un aldehído aromático). En algunas instancias, la polimerasa se enlaza al nanoporo mediante el uso de química Click (comercializada por LifeTechnologies, por ejemplo). En algunos casos, se introducen mutaciones por dedos de zinc en la molécula de hemolisina y después se usa una molécula (p. ej., una molécula de ADN intermediario) para unir la polimerasa a los sitios de dedos de zinc en la hemolisina.
Métodos para detectar la formación de bicapas
Después de un intento de crear bicapas en el después sensor descrito anteriormente, se puede aplicar un estímulo para determinar si se ha establecido una bicapa o si los electrodos están simplemente cubiertos con una capa que no es bicapa. Un modo de hacerlo es aplicar un estímulo de CA no disruptivo a los electrodos cubiertos con una capa y observar las respuestas de corriente capacitiva que indican que el electrodo está cubierto con una bicapa lipídica capacitiva delgada (u otra capa delgada).
Si se detectan lecturas capacitivas adecuadas para las condiciones de sal, voltaje y diámetro de electrodo, se puede inferir que se ha creado una bicapa sobre el electrodo y el operador está listo para comenzar la etapa de inserción de poro.
Alternativamente, se puede aplicar una aplicación disruptiva de impulsos de voltaje creciente secuencialmente a cada electrodo de la matriz y se registra el voltaje con el que la capa sobre el electrodo se rompe. Si los voltajes observados a través de una cantidad aceptable de electrodos corresponden a los voltajes de ruptura de bicapa anticipados para las condiciones de sal, voltaje y diámetro de electrodo, entonces se hace fluir una única burbuja a través del chip para recomponer las bicapas y el operador está listo para comenzar la etapa de inserción de poro.
Sistemas para formar pocillos y dispositivos con nanoporos
Otro aspecto de la descripción proporciona sistemas para formar dispositivos de nanoporos, incluidos pocillos. Dichos sistemas se pueden usar para formar membranas (p. ej., bicapas lipídicas) adyacentes a los pocillo o electrodos, e insertar nanoporos en las membranas.
El sistema puede incluir un sistema de depósito, un sistema de bombeo en comunicación continua con el sistema de depósito y un sistema informático (o controlador) que tiene un procesador de ordenador (también "procesador" en la presente memoria descriptiva) para ejecutar código legible por máquina que implementa un método para formar los pocillos. El código puede implementar cualquiera de los métodos proporcionados en la presente memoria descriptiva. El sistema de bombeo se puede configurar para purgar o evacuar el sistema de depósito. En algunos casos, el sistema de depósito se excluye.
El sistema de depósito puede incluir uno o más espacios de reacción para formar capas de material de los pocilios. En algunas situaciones, el sistema de depósito es un sistema de depósito rodillo a rodillo con una o más cámaras de reacción interconectadas, que se pueden aislar fluidamente entre sí (p. ej., con la ayuda de purga o bombeo en ubicaciones entremedio de las cámaras).
Uno o más sistemas de depósito se pueden usar para formar un pocillo. Un sistema de depósito se puede configurar para usarse con diversos tipos de técnicas de depósito, tales como, por ejemplo, depósito de vapor químico (CVD), depósito de capa atómica (ALD), CVD mejorado con plasma (PECVD), ALD mejorado con plasma (PEALD), CVD orgánico metálico (Mo Cv D), CVD con alambre caliente (HWCVD), CVD iniciado (iCVD), CVD modificado (MCVD), depósito axial de vapor (VAD), depósito de vapor externo (OVD) y depósito de vapor físico (p. ej., depósito por pulverización iónica, depósito evaporativo). Un sistema de depósito se puede configurar para permitir la formación capa a capa al usar diversas técnicas de fabricación semiconductoras, tales como fotolitografía.
El sistema de bombeo puede incluir una o más bombas de vacío, tales como una o más de una bomba turbomolecular ("turbo"), una bomba de difusión, bomba de iones, bomba criogénica ("crio") y una bomba mecánica. Una bomba puede incluir una o más bombas de respaldo. Por ejemplo, una bomba de turbo puede estar respaldada por una bomba mecánica.
En algunas situaciones, una matriz que comprende uno o más pocillos se forma en un sustrato con la ayuda de un sistema de depósito. El depósito se puede regular con la ayuda de un controlador. En algunas realizaciones, el controlador se configura para regular uno o más parámetros de procesamiento, tales como temperatura del sustrato, velocidades de flujo del precursor, velocidad de crecimiento, velocidad de flujo de gas portador y presión de cámara de depósito. El controlador incluye un procesador configurado para ayudar a ejecutar código ejecutable por máquina que se configura para implementar los métodos proporcionados en la presente memoria descriptiva. El código ejecutable por máquina se almacena en un medio de almacenamiento físico, tal como una memoria flash, un disco duro u otro medio de almacenamiento físico configurado para almacenar código ejecutable por ordenador.
Un controlador se puede acoplar a diversos componentes del sistema. Por ejemplo, el controlador puede estar en comunicación con el uno o más sistemas de depósito y/o sistema de flujo de fluido (p. ej., sistemas de bombeo). El controlador puede estar en comunicación con el sistema de bombeo, que puede permitir que el controlador regular una presión del recinto.
Un controlador se puede programar o de cualquier otra manera configurar para regular uno o más parámetros de procesamiento, tales como temperatura del sustrato, velocidades de flujo del precursor, velocidad de crecimiento, velocidad de flujo de gas portador, velocidad de flujo del precursor y presión de cámara de depósito. El controlador, en algunos casos, está en comunicación con una válvula o una pluralidad de válvulas de una cámara de depósito, que ayuda a terminar (o regular) el flujo de un precursor en la cámara de depósito. El controlador incluye un procesador configurado para ayudar a ejecutar código ejecutable por máquina que se configura para implementar los métodos proporcionados en la presente memoria descriptiva. El código ejecutable por máquina se almacena en un medio de almacenamiento físico, tal como una memoria flash, un disco duro u otro medio de almacenamiento físico configurado para almacenar código ejecutable por ordenador. El controlador también se puede usar para regular la formación de la membrana y/o poro, tal como el flujo de una disolución lipídica en un trayecto de flujo de fluido, el flujo de una o más burbujas en el trayecto de flujo de fluido, y la aplicación de uno o más estímulos (p. ej., estímulo eléctrico).
Los aspectos de los sistemas y métodos proporcionados en la presente memoria descriptiva se pueden incorporar en programación. Diversos aspectos de la tecnología se pueden tomar como "productos" o "artículos de fabricación" típicamente en forma de código ejecutable por máquina (o procesador) y/o datos asociados que se transportan o incorporan en un tipo de medio legible por máquina. Se puede almacenar código ejecutable por máquina en una unidad de almacenamiento electrónico, tal como una memoria (p. ej., memoria de solo lectura, memoria de acceso aleatorio, memoria flash) o un disco duro. Los medios de tipo para "almacenamiento" pueden incluir cualquiera o toda la memoria tangible de los ordenadores, procesadores o similares, o módulos asociados de estos, tales como diversas memorias semiconductoras, unidades de cinta, unidad de disco y similares, que pueden proporcionar almacenamiento no transitorio en cualquier momento para la programación del programa informático. Todo o porciones del programa informático pueden comunicarse algunas veces a través de Internet o diversas otras redes de telecomunicación. Dichas comunicaciones, por ejemplo, pueden permitir cargar el programa informático de un ordenador o procesador a otro, por ejemplo, a partir de un servidor de gestión u ordenador huésped en la plataforma informática de un servidor de aplicación. Por lo tanto, otro tipo de medios que pueden llevar los elementos de programa informático incluyen ondas ópticas, eléctricas y electromagnéticas, tales como las usadas a través de interfaces físicas entre dispositivos locales, a través de redes cableadas y terrestres ópticas y sobre diversos enlaces aéreos. Los elementos físicos que llevan dichas ondas, tales como enlaces cableados o inalámbricos, enlaces ópticos o similares, también se pueden considerar como medios que llevan el programa informático. Según se usan en la presente memoria descriptiva, a menos que se restrinjan a medios de "almacenamiento" tangibles, no transitorios, los términos "medio legible" por ordenador o máquina se refieren a cualquier medio que participa en proporcionar instrucciones a un procesador para ejecución.
Por consiguiente, un medio legible por máquina, tal como código ejecutable por ordenador, puede tomar muchas formas que incluyen, pero no se limitan a, un medio de almacenamiento tangible, un medio de onda portadora o medio de transmisión física. Los medios de almacenamiento no volátiles incluyen, por ejemplo, discos ópticos o magnéticos, tales como cualquiera de los dispositivos de almacenamiento de cualquier ordenador(es) o similares, tales como los que pueden usarse para implementar las bases de datos, etc. que se muestran en los dibujos. Los medios de almacenamiento volátiles incluyen memoria dinámica, tal como memoria principal de dicha plataforma informática. Los medios de transmisión tangibles incluyen cables coaxiales; cables de cobre y fibras ópticas, incluidos los cables que comprenden un bus dentro de un sistema informático. Los medios de transmisión de onda portadora pueden tener forma de señales eléctricas o electromagnéticas, u ondas acústicas o de luz tales como las generadas durante comunicaciones de datos por radio frecuencia (RF) e infrarrojo (IR). Las formas comunes de medios legibles por ordenador, por lo tanto, incluye, por ejemplo: un disquete, un disco flexible, disco duro, cinta magnética, cualquier otro medio magnético, un CD-ROM, DVD o DVD-ROM, cualquier otro medio óptico, cinta de papel de tarjetas perforadas, cualquier otro medio de almacenamiento físico con patrones de orificios, una RAM, una ROM, una PROM y EPROM, una FLASH-EPROM, cualquier otro chip o cartucho de memoria, una onda portadora que transporta datos o instrucciones, cables o enlaces que transportan dicha onda portadora, o cualquier otro medio a partir del cual un ordenador puede leer código y/o datos de programación. Muchas de estas formas de medios legibles por computadora pueden participar en llevar una o más secuencias de una o más instrucciones a un procesador para la ejecución.
Los métodos para formar bicapas lipídicas, insertar nanoporos en bicapas lipídicas y secuenciar moléculas de ácido nucleico se pueden encontrar en la publicación de patente PCT n.° WO2011/097028, que se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad. En algunos casos, se forma la membrana con la ayuda de una burbuja y se inserta el nanoporo en la membrana con la ayuda de un estímulo eléctrico.
En la presente memoria descriptiva se describen usos de los biochips y/o biochips producidos mediante los métodos descritos en la presente memoria descriptiva. Los biochips se pueden usar para determinar la presencia de bases de ácido nucleico metiladas en una secuencia de bases de ácido nucleico.
Los biochips descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar para determinar el efecto de fármacos o cualquier molécula hecha por el hombre o de origen natural sobre la estabilidad o rendimiento de proteínas transmembrana o proteínas unidas a la membrana. El detector se puede armar al crear una matriz (p. ej., mayor que 2) de electrodos individualmente tratables sobre los cuales se crean membranas de celdas artificiales o naturales, o cualquier capa aislante, según se describe en la presente memoria descriptiva. En estas membranas, capas o capas aislantes se puede insertar cualquier cantidad de proteínas transmembrana preseleccionadas o desconocidos mediante el uso de los métodos descritos en la presente memoria descriptiva. Se puede insertar cualquier proteína transmembrana en la bicapa lipídica (o cualquier capa aislante) y se pueden percibir o detectar eléctricamente los efectos de sustancias químicas, fármacos y cualquier molécula biológica o hecha por el hombre sobre la estabilidad o rendimiento de estas proteínas transmembrana, por ejemplo, al detectar la alteración de la membrana después de la aplicación de un fármaco específico. Cualquier proteína transmembrana cuya presencia se puede detectar iónica o eléctricamente proporciona incluso más información en el ensayo descrito anteriormente dado que los cambios en la respuesta de las moléculas al estímulo eléctrico se pueden correlacionar con la aplicación de fármacos o cambios específicos en el entorno impreso sobre la bicapa/poro.
Los biochips descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar para determinar el efecto de fármacos o cualesquiera moléculas hechas por el hombre o de origen natural sobre la estabilidad o rendimiento de diferentes membranas colocadas sobre diferentes porciones del sensor de matriz. Al usar los canales definidos en los dibujos de esta solicitud, se pueden dirigir diferentes materiales de bicapa lipídica o capas aislantes a diferentes áreas del chip de matriz, y se puede presentar una pluralidad de diferentes membranas lipídicas o capas aislantes a una disolución de prueba, cada tipo de membrana/capa presente en una ubicación conocida. Se puede detectar capacidad de los fármacos para influir sobre los tipos de membrana/capa o cualquier molécula hecha por el hombre o de origen natural para afectar a las diferentes membranas.
Los biochips descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar para detectar la presencia de, capturar, clasificar y descartar proteínas específicas o biomoléculas específicas en una disolución desconocida.
Los biochips y métodos para hacer y usar los biochips descritos en la presente memoria descriptiva pueden usar una disolución de electrolitos. En algunos casos, los iones en la disolución de electrolitos fluyen a través del nanoporo y se detectan mediante el electrodo. En casos donde el electrodo es un electrodo sacrificial (es decir, se agota durante la detección, p. ej., plata) el electrodo puede durar relativamente más tiempo cuando el electrolito comprende algunas sales en lugar de otras. En algunas realizaciones, el electrolito no comprende ion de potasio (p. ej., porque el ion de potasio da como resultado una vida del electrodo relativamente más corta). En algunas realizaciones, el electrolito comprende cloruro de litio, cloruro de tetrametilamonio, cloruro de trietilamonio, cloruro de amonio, cloruro de sodio, glutamato de potasio, glutamato de sodio o cualquier combinación de estos (p. ej., porque las sales indicadas dan como resultado una vida del electrodo relativamente más corta).
Los biochips de la descripción pueden llevar a cabo mediciones de percepción con la ayuda de percepción resistiva, inductiva o capacitiva. En algunos casos, un biochip comprende un electrodo que puede percibir una capacitancia de una membrana adyacente al electrodo después de la interacción de la membrana o un nanoporo en la membrana con una especie adyacente o próxima a la membrana o el nanoporo. Dichas mediciones se pueden hacer con la ayuda de una forma de onda de corriente alterna aplicada (CA) o una forma de onda de corriente continua (CC).
Ejemplos
Los ejemplos a continuación son ilustrativos de diversas realizaciones de la presente descripción y no son limitantes.
Ejemplo 1. Formar bicapas e insertar poros
Formar bicapas e insertar poros en la celda de flujo mediante el uso de una configuración de jeringa manual y una configuración de bomba de jeringa automatizada da como resultado un alto rendimiento de bicapa y poro de hemolisina simple. Las bicapas se forman en ambas configuraciones al hacer fluir disolución 1M o 0,3M de KCl y burbujas de airea a través de una superficie de chip cubierta con lípidos y aplicar estímulos eléctricos. Dos métodos de aplicación de hemolisina dan como resultado un alto rendimiento de poro simple. Un método implica las siguientes operaciones: (1) premezclar hemolisina con lípido en decano, (2) hacer fluir la mezcla de hemolisina-lípido sobre la superficie del chip e incubar durante unos pocos minutos, (3) formar bicapas y (4) aplicar un estímulo eléctrico para electroporar poros en bicapas. El segundo método implica las siguientes operaciones: (1) hacer fluir KCI sobre la superficie del chip, (2) hacer fluir lípido en decano sobre la superficie del chip, (3) formar bicapas, (4) hacer fluir hemolisina a través de la superficie del chip, o hemolisina y mezcla de reacción a través de la superficie del chip, (5) aplicar un estímulo eléctrico para electroporar poros en bicapas, y (6) hacer fluir KCI a través de la superficie del chip para retirar la hemolisina libre. Después del método se puede proceder a la mezcla de reactivos o simplemente dejar que se mezclen la hemolisina y el reactivo sobre el chip antes de comenzar a tomar lecturas. Durante la operación de electroporación en ambos métodos de aplicación, el chip se puede calentar para crear bicapas más fluidas para facilitar la inserción de la hemolisina. La temperatura se reduce hasta temperatura ambiente o más baja durante o después de la operación de electroporación para aumentar la longevidad de la vida del poro.
Ejemplo 2. Configuración de la celda de flujo
Con referencia a la figura 25 y la figura 26, la celda de flujo se ensambla sobre el empaque de chip al colocar directamente una junta sobre la parte superior del chip semiconductor. El espesor de la junta varía de 50 um a 500 um. La junta puede estar compuesta por plástico con adhesivos sensibles a la presión en uno o ambos lados, membrana de silicona o elastómero flexible, tal como EPDM. La junta puede tener cualquier forma. Una parte superior de plástico rígida (p. ej., hecha con PMMA) se posiciona encima de la junta (p. ej., hecha con PMMA laminado con PSA) y se puede sellar a la junta a través del adhesivo sensible a la presión o mediante un mecanismo de sujeción que aplicación una fuerza de compresión a la junta. La parte superior tiene un único o múltiples puertos de entrada y salida usados para hacer fluir reactivos y aire a través de la celda de flujo.
En algunas instancias, el tamaño total de la junta es de 4 mm por 4 mm cuadrados. En algunos casos, el volumen de la celda de flujo es de aproximadamente 1,5 ul para la configuración de junta con un espesor de 500 um. Aproximadamente 15 a 20 electrodos se cubren debajo de la junta en algunas realizaciones.
Ejemplo 3. Protocolo de formación de bicapa
1. Humedecer la superficie del chip al hacer fluir 300mM KCI sobre el chip/a través de los canales.
2. Hacer fluir 20uL 7,5mg/ml de DPhPC en decano y posteriormente 120uL 300mM de KCI, 20mM de HEPES, pH 7,5 ("KCI").
3. Aplicar una serie de impulsos eléctricos negativos que varían de ±250mV a ±1V con una desactivación de 4. Lavar el chip con 2x (20uL KCI, 20uL burbuja), después con 120uL de KCl.
5. Repetir la Etapa 3.
6. Repetir las operaciones 4 y 5 hasta que al menos 30 % de las celdas se desactiven entre magnitud de 300 mV e impulsos de 700 mV (p. ej., aproximadamente 4 a 8 veces).
7. Recoger celdas con 2x (20uL KCl, 20uL burbuja) y 120uL KCl.
La Etapa 6 es una prueba destructiva para someter a prueba bicapas lipídicas simples, frente a configuraciones multilaminares, multipila o distinta de bicapa. Se alcanza un rendimiento óptimo con las configuraciones de bicapa simple.
Las burbujas usadas en las etapas 4 y 6, indicadas anteriormente, variaron de aproximadamente 2 uL a aproximadamente 300 uL. La velocidad de flujo (de líquidos y burbujas) varío de aproximadamente 1 uL/seg a aproximadamente 250 uL/seg, con una velocidad de flujo preferida de aproximadamente 10 uL/seg.
Esto se llevó a cabo manualmente. A continuación, se describe un método automatizado en el Ejemplo 6. Ejemplo 4. Protocolo de inserción de poros
Método 1: mezclar la hemolisina con el lípido en el inicio del experimento
1. Después de formar las bicapas, colocar calentadores de mano encima de las celdas de flujo.
2. Electroporar poros en bicapas con una serie de impulsos eléctricos negativos que varían de -50mV a -600V con una desactivación de 10pA.
La placa a continuación se lava con 300mM de KCl para retirar el exceso de hemolisina.
Método 2: hacer fluir hemolisina sobre bicapas y posteriormente una electroporación con lavado primero: 1. Después de formar las bicapas, hacer fluir 20ul de 100ug/ml hemolisina en 0,3M KCl en 20mM HEPES, pH 7,5 ("KCl") y glicerol al 5 % a través de la celda de flujo.
2. Lavar con 20ul de burbuja y 80uL de 0,3M KCl, pH 7,5. Retirar por lavado el exceso de hemolisina con 300mM KCl, pH 7,5.
3. Electroporar poros en bicapas con la temperatura fijada a más cálida que la temperatura ambiente.
Método 3: Formación de bicapa con electroporación de hemolisina
1. Es el mismo que el Método 2 excepto que sin la etapa de lavado (Etapa 2).
Ejemplo 5. Formación y estallido de bicapa automatizados con bomba
La figura 27 muestra el voltaje con el que la bicapa estalla con respecto a la ubicación de la celda en condiciones repetidas de generación y lavado de la bicapa. Un protocolo automatizado de burbuja y lavado con KCI permite la formación constante de bicapas. La Tabla 1 muestra el rendimiento de formación y estallido de bicapa en diversas condiciones (p. ej., con hemolisina y lípido o sin hemolisina).
Tabla 1. Formación estallido de bica a
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% de cobertura = cantidad de celdas que se cubren con el lípido en el inicio: no necesariamente una bicapa.
% de estallido = cantidad de electrodos que se acortaron la última vez que las celdas se estallaron.
Ejemplo 6: Formación de bicapa completamente automatizada.
Este ejemplo proporciona un resumen del protocolo de creación de bicapa automatizado para un chip. Este protocolo se puede separar en dos secciones: inicio, verificación y preparación del chip para la formación de la bicapa, y dilución la formación de bicapa actual en el chip.
Inicio
El protocolo de inicio tiene tres etapas principales: una verificación en seco, una verificación de corto y, opcionalmente, acondicionamiento. La verificación en seco consiste en aplicar voltajes a cada electrodo para verificar que ninguno suministre lecturas de datos anómalas. Esto se hace típicamente al aplicar un impulso de voltaje y contar las celdas que leen corriente. Si cualquiera proporciona una señal de corriente, el electrodo se considera como fallado. Si demasiadas celdas están falladas, el procedimiento termina. La siguiente etapa es una verificación de corto. Se hace fluir la disolución de sal/tampón deseada sobre el chip y se aplica un voltaje a cada electrodo para verificar que todos suministren una lectura de cortocircuito. Esto se hace típicamente al aplicar un impulso de voltaje y contar las celdas que proporcionan una lectura en banda. Si no hay suficientes celdas buenas (es decir, que proporcionan la lectura en banda), el procedimiento termina. La última etapa en el protocolo de inicio es el acondicionamiento opcional. Esta etapa se usa para electrodos faradaicos y ejercita a los electrodos para hacer que estén en un estado ideal para la electroquímica. Esto se hace típicamente al aplicar una serie de impulsos de voltaje y/o rampas a las celdas. Dilución
El protocolo de dilución tiene cuatro etapas principales: la adición de lípido, una prueba de fuga, un estallido de bicapa y una recuperación de bicapa. Después del protocolo de inicio, el chip está cubierto con la disolución de sal deseada y los electrodos están en buen estado para el resto del experimento. La primera etapa es agrega lípido al sistema. Se hace fluir un pequeño volumen de mezcla de lípido/disolvente orgánico sobre el chip, posteriormente más disolución de sal. A continuación, ingresamos a un bucle de eventos que termina cuando el protocolo de dilución considera que el chip tiene suficiente cobertura y estallidos de bicapa. La primera parte del bucle es una prueba de fugas. La prueba aplica una escalera de voltaje creciente y evalúa a las celdas en dos aspectos: si están cubiertas o no con material lipídico y si lo están, cuál es la resistencia al sello de dicha cobertura. Si no hay suficientes celdas cubiertas y que tienen una alta resistencia al sello, se hace fluir una burbuja de aire de volumen más grande sobre el chip. Se ha demostrado que esto aumenta la cobertura a través del chip. Después de esta burbuja de aire se procede a otra prueba de fuga. Este ciclo se repetirá hasta que se mida una cobertura y resistencia al sello adecuada o hasta que demasiadas pruebas fallen consecutivamente, lo que provoca el fin del procedimiento. Típicamente, pasará después de la primera vez y el procedimiento pasará al código de estallido de bicapa. El código de estallido de bicapa aplica ondas cuadradas de voltaje creciente, hasta ±1V. Esta es una prueba destructiva que hará estallar las bicapas, pero las celdas cubiertas sin una bicapa no estallarán. Típicamente, no se observó suficiente estallido en la primera ronda, de modo que se hizo fluir una burbuja sobre el chip. Sin ánimo de estar ceñidos a la teoría, se cree que esta burbuja redistribuye el material lipídico, reforma las bicapas sobre celdas que estallaron y también diluye el material lipídico sobre las celdas que no lo hicieron. Después de las rondas de pruebas de fuga, estallidos de bicapa y burbujas, se alcanzará un umbral de celdas estalladas, que indica que las bicapas se han formado sobre el volumen de las celdas. Después de que el chip se considera completo, el chip está listo para la inserción de nanoporos.
Implementación informática
El(los) protocolo(s) indicados anteriormente se pueden automatizar y/o implementar en un sistema informático. El método implementado por ordenador para producir una bicapa lipídica sobre el biochip comprende:
un dispositivo de dispensación de fluido para seleccionar un fluido de una pluralidad de reservorios de fluido y para dispensar cada fluido sobre un biochip que comprende a pluralidad de pocillo, en donde cada fluido se dispensa en un orden preseleccionado;
una pluralidad de reservorios de fluido, cada reservorio contiene un fluido seleccionado de un tampón, un líquido lipídico, un líquido de lavado,
un sistema de generación de burbujas, en donde las burbujas se proporcionan en momentos predeterminados;
una aspiradora o sistema de remoción alimentado por gravedad para retirar fluidos de la pluralidad de pocillos del biochip;
un biochip que comprende una pluralidad de electrodos, dichos electrodos están configurados para detectar y/o determinar una secuencia de polímero; y
un sistema de control para controlar el procesamiento del ciclaje de fluido y burbuja para formar la bicapa lipídica sobre el biochip.
El sistema de generación de burbujas puede ser una abertura al aire de manera que se genere una burbuja al extraer aire a partir de un puerto de válvula que está expuesto al aire, o al extraer gas de un puerto de válvula acoplado a un suministro de gas, e impulsarlo a través del sistema.
Aunque se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invención en la presente memoria descriptiva, será obvio para los expertos en la técnica que dichas realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo solamente. Se les ocurrirán ahora numerosas variaciones, cambios y sustituciones a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Se entenderá que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria descriptiva al poner en práctica la invención. Se entenderá que las siguientes reivindicaciones definen el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones están cubiertos por estas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un biochip que comprende:
un sustrato; y
una pluralidad de sitios diferenciados formados sobre el sustrato que tienen una densidad mayor que quinientos pocillos por milímetro cuadrado, en donde cada sitio diferenciado incluye:
paredes laterales dispuestas sobre el sustrato para formar un pocillo, en donde el pocillo está formado al depositar sobre el sustrato un material que tiene grupos óxidos reactivos y grabar el pocillo en el material, y en donde las paredes laterales tienen una superficie superior plana dura para que se forme una membrana encima, en donde la membrana abarca todo el pocillo y lo sella; y
un electrodo dispuesto en el fondo del pocillo;
en donde los electrodos dispuestos en el fondo de los pocillos están organizados en una pluralidad de grupos de electrodos, en donde cada grupo de electrodos comparte un contraelectrodo común, y en donde las superficies de las paredes laterales son hidrófobas de tal manera que las superficies facilitan la formación de una membrana hidrófoba en o adyacente al pocillo.
2. El biochip de la reivindicación 1, en donde los pocillos están formados de tal manera que la diafonía entre pocillos se reduce, incluyendo aislar eléctricamente los electrodos entre sí para reducir una señal desde un nanoporo o membrana formada encima de un pocillo para establecer diafonía con un electrodo dispuesto en el fondo de un pocillo diferente.
3. El biochip de la reivindicación 1, en donde el electrodo dispuesto en el fondo del pocillo deriva la mayor parte de su señal de un nanoporo o una membrana más cercana al electrodo.
4. El biochip de la reivindicación 1, en donde el electrodo dispuesto en el fondo del pocillo tiene un contraelectrodo dedicado.
5. El biochip de la reivindicación 1, en donde las superficies de las paredes laterales están silanizadas de tal manera que las superficies facilitan la formación de una membrana en o adyacente al pocillo.
6. El biochip de la reivindicación 5, en donde facilitar la formación de una membrana en o adyacente al pocillo comprende:
facilitar la adherencia de la membrana a las superficies silanizadas.
7. El biochip de la reivindicación 1, en donde las superficies de las paredes laterales están silanizadas al cubrir las paredes laterales con una capa de moléculas de alcoxisilano organofuncionales.
8. El biochip de la reivindicación 7, en donde la capa de moléculas tiene una molécula de espesor.
9. El biochip de la reivindicación 1, en donde el sustrato es un sustrato semiconductor que tiene una capa de dióxido de silicio dispuesta sobre el sustrato, en donde el pocillo está formado en el dióxido de silicio.
10. El biochip de la reivindicación 1, en donde la membrana comprende un nanoporo, y en donde el electrodo es capaz de detectar cambios en el flujo de iones a través del nanoporo en respuesta a entidades que pasan a través del nanoporo, en donde los pocillos tienen un volumen grande adecuado de manera que el electrodo puede detectar al menos 100 entidades sin recargar el electrodo, y en donde el electrodo detecta al menos 80 % de su señal del flujo de iones a través del nanoporo.
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Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4107269B2 (ja) * 2004-02-23 2008-06-25 ソニー株式会社 固体撮像装置
US9322062B2 (en) 2013-10-23 2016-04-26 Genia Technologies, Inc. Process for biosensor well formation
US10908143B2 (en) * 2013-11-27 2021-02-02 Hitachi, Ltd. Current measuring device, current measuring method, and current measuring kit
WO2016004029A1 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Systems and methods of preparing stabilized lipid assemblies
CN104792845A (zh) * 2014-08-07 2015-07-22 中国科学院微电子研究所 传感装置
ES2774802T3 (es) 2014-10-31 2020-07-22 Genia Tech Inc Variantes de hemolisina alfa con características alteradas
USD815752S1 (en) * 2014-11-28 2018-04-17 Randox Laboratories Ltd. Biochip well
US10036739B2 (en) 2015-01-27 2018-07-31 Genia Technologies, Inc. Adjustable bilayer capacitance structure for biomedical devices
CA2974456A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Polymerase variants
DE102015106032B4 (de) 2015-04-20 2018-10-31 Gabriel Krajewski Vorrichtung und Verfahren zur manuellen Handhabung einer Palette
US10526588B2 (en) 2015-05-14 2020-01-07 Roche Sequencing Solutions, Inc. Polymerase variants and uses thereof
US10920312B2 (en) 2015-08-31 2021-02-16 Roche Sequencing Solutions, Inc. Electrochemical cell with increased current density
US10809243B2 (en) 2015-08-31 2020-10-20 Roche Sequencing Solutions, Inc. Small aperture large electrode cell
EP3353194B1 (en) 2015-09-22 2023-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Ompg variants
EP3353317A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 H. Hoffnabb-La Roche Ag Alpha-hemolysin variants
JP2018533010A (ja) * 2015-10-21 2018-11-08 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ナノポアベースのｄｎａ配列決定のための脂質二重層形成を支援するための撥水性層としてのフルオロポリマーの使用
US20200216887A1 (en) * 2016-01-21 2020-07-09 Genia Technologies, Inc. Nanopore sequencing complexes
US10371664B2 (en) 2016-01-21 2019-08-06 Roche Molecular Systems, Inc. Use of titanium nitride as a counter electrode
US10590480B2 (en) 2016-02-29 2020-03-17 Roche Sequencing Solutions, Inc. Polymerase variants
EP3423575B1 (en) 2016-02-29 2021-06-16 Genia Technologies, Inc. Exonuclease deficient polymerases
JP6690005B2 (ja) 2016-02-29 2020-04-28 ジェニア・テクノロジーズ・インコーポレイテッド ナノポアシーケンシングのためのポリメラーゼ−鋳型複合体
EP3929283A1 (en) 2016-02-29 2021-12-29 Genia Technologies, Inc. Polymerase variants
US10465240B2 (en) * 2016-03-30 2019-11-05 Roche Sequencing Solutions, Inc. Electrical enhancement of bilayer formation
US10155979B2 (en) 2016-03-30 2018-12-18 Roche Molecular Systems, Inc. Non-destructive bilayer monitoring using measurement of bilayer response to electrical stimulus
US10233486B2 (en) 2016-03-30 2019-03-19 Roche Sequencing Solutions, Inc. Method for inline bilayer capacitance monitoring
US10351908B2 (en) 2016-04-21 2019-07-16 Roche Sequencing Solutions, Inc. Alpha-hemolysin variants and uses thereof
US10509006B2 (en) * 2016-06-20 2019-12-17 Axbio Inc. Devices and methods for measuring the properties of macromolecules
US10577653B2 (en) 2016-06-27 2020-03-03 Roche Sequencing Solutions, Inc. Counteracting osmotic imbalance in a sequencing cell
CN109416354B (zh) * 2016-06-27 2020-07-10 豪夫迈·罗氏有限公司 用于双层形成的渗透不平衡方法
EP3478706B1 (en) 2016-06-30 2022-02-09 F. Hoffmann-La Roche AG Long lifetime alpha-hemolysin nanopores
CN110114458A (zh) 2016-09-22 2019-08-09 豪夫迈·罗氏有限公司 Pol6聚合酶变体
JP2018048950A (ja) * 2016-09-23 2018-03-29 株式会社東芝 分析チップ
EP3583420B1 (en) 2017-02-14 2023-08-16 Axbio Inc. Apparatus and methods for continuous diagnostics of macromolecules
US10739299B2 (en) 2017-03-14 2020-08-11 Roche Sequencing Solutions, Inc. Nanopore well structures and methods
WO2018195222A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 Electronic Biosciences, Inc. Nanopore/nanowell electrode enabled exonuclease sequencing
DE102017130198A1 (de) 2017-12-15 2019-06-19 IMMS Institut für Mikroelektronik- und Mechatronik-Systeme gemeinnützige GmbH (IMMS GmbH) Analyseanordnung zur Durchführung biologischer und/oder chemischer Analysen von Substanzen sowie Verfahren zu seiner Herstellung
CN108226249B (zh) * 2018-01-09 2021-02-26 深圳市梅丽纳米孔科技有限公司 一次性纳米孔生物传感器及其制作方法
AU2019221625A1 (en) * 2018-02-16 2020-08-13 Diagast In vitro diagnosis device comprising beads and uses thereof
CN111094976B (zh) * 2018-02-16 2022-05-13 伊鲁米纳公司 用于测序的设备
JP6825173B2 (ja) * 2018-03-15 2021-02-03 アイポア株式会社 分析素子
CN108709921B (zh) * 2018-04-02 2021-08-03 华东理工大学 一种利用多通道纳米孔道-膜检测系统的检测方法
US20210172928A1 (en) 2018-05-03 2021-06-10 The Trustees Of Wheaton College Improved membranes for nanopore sensing applications
WO2019226689A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Axbio Inc. Methods, systems, and compositions for nucleic acid sequencing
US20210381041A1 (en) 2018-05-28 2021-12-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. Enzymatic Enrichment of DNA-Pore-Polymerase Complexes
JP2019219244A (ja) * 2018-06-19 2019-12-26 ソニーセミコンダクタソリューションズ株式会社 電位測定装置及び電位測定装置の製造方法
JP7324835B2 (ja) 2018-08-28 2023-08-10 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ルテニウム含有電極を備えるナノポアシーケンシングデバイス
CN112639466A (zh) * 2018-09-14 2021-04-09 应用材料公司 形成纳米孔的方法及生成的结构
CN113260449B (zh) * 2018-12-11 2023-09-29 豪夫迈·罗氏有限公司 用于膜中自限性蛋白质孔插入的系统和方法
CA3124023A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag 3' protected nucleotides
EP3711848B1 (en) * 2019-03-20 2023-12-20 Matthias Wilm Method for preparation of a bioactive lipid membrane and a functionalized lipid bi-layer membrane prepared with said method
EP4052035A1 (en) 2019-10-31 2022-09-07 The Trustees of Wheaton College Design and characterization of multilayered structures for support of lipid bilayers
CN111123428B (zh) * 2019-12-24 2022-03-08 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种零模波导孔孔壁的修饰方法及零模波导孔结构
CN111123429B (zh) * 2019-12-24 2022-03-08 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 涂覆有锚定物质的零模波导孔的制备方法及波导孔结构
US11305288B2 (en) * 2020-01-28 2022-04-19 Plexium, Inc. Assay devices for combinatorial libraries
WO2021184374A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Genesense Technology Inc High throughput analytical system for molecule detection and sensing
EP4143568A1 (en) * 2020-05-01 2023-03-08 F. Hoffmann-La Roche AG Systems and methods for using trapped charge for bilayer formation and pore insertion in a nanopore array
CN113061531B (zh) * 2021-06-03 2021-08-20 成都齐碳科技有限公司 芯片结构、芯片组件、成膜方法、纳米孔测序装置及应用
CN113337860B (zh) * 2021-08-02 2021-11-09 华芯半导体研究院(北京)有限公司 在芯片晶圆表面进行电镀的方法及其应用
US20230112203A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-13 Illumina, Inc. Isolation of cells in a nanopore sensor array
WO2023123292A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 深圳华大生命科学研究院 纳米孔生物传感器的制备方法及测序方法
WO2023213766A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods that reduce prussian blue formation during nanopore sequencing

Family Cites Families (214)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2656508A (en) 1949-08-27 1953-10-20 Wallace H Coulter Means for counting particles suspended in a fluid
US4121192A (en) 1974-01-31 1978-10-17 Gte Sylvania Incorporated System and method for determining position and velocity of an intruder from an array of sensors
US4859945A (en) 1988-05-03 1989-08-22 Elscint Ltd. Optimized signal to noise ratio
US5198543A (en) 1989-03-24 1993-03-30 Consejo Superior Investigaciones Cientificas PHI29 DNA polymerase
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
JPH04236295A (ja) 1991-01-18 1992-08-25 Sharp Corp 強誘電性液晶組成物及び液晶素子
GB9208733D0 (en) 1992-04-22 1992-06-10 Medical Res Council Dna sequencing method
ATE143730T1 (de) 1992-04-22 1996-10-15 Ecole Polytech Lipidmembranen fur biosensoranwendungen
GB9315847D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
US5457342A (en) 1994-03-30 1995-10-10 Herbst, Ii; Gerhardt G. Integrated circuit cooling apparatus
FR2722294B1 (fr) 1994-07-07 1996-10-04 Lyon Ecole Centrale Procede d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques presentes dans un milieu liquide conducteur et capteurs biochimiques d'affinite utilises pour la mise en oeuvre de ce procede
JP2986381B2 (ja) 1994-08-16 1999-12-06 インターナショナル・ビジネス・マシーンズ・コーポレイション 電子チップ温度制御装置及び方法
US5912155A (en) 1994-09-30 1999-06-15 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
US6014213A (en) 1994-12-12 2000-01-11 Visible Genetics Inc. High dynamic range apparatus for separation and detection of polynucleotide fragments
US6362002B1 (en) 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US20120160687A1 (en) 1995-03-17 2012-06-28 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5795782A (en) 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5780231A (en) 1995-11-17 1998-07-14 Lynx Therapeutics, Inc. DNA extension and analysis with rolling primers
US6261797B1 (en) 1996-01-29 2001-07-17 Stratagene Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques
AU733782B2 (en) 1996-06-06 2001-05-24 Lynx Therapeutics, Inc. Sequencing by ligation of encoded adaptors
US5981733A (en) 1996-09-16 1999-11-09 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Apparatus for the chemical synthesis of molecular arrays
US6699719B2 (en) 1996-11-29 2004-03-02 Proteomic Systems, Inc. Biosensor arrays and methods
JPH10187253A (ja) 1996-12-27 1998-07-14 Ando Electric Co Ltd 光半導体素子の温度制御装置
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
US5876936A (en) 1997-01-15 1999-03-02 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators
US5804386A (en) 1997-01-15 1998-09-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Sets of labeled energy transfer fluorescent primers and their use in multi component analysis
EP0983364B1 (en) 1997-03-12 2002-06-12 PE Corporation (NY) Dna polymerases having improved labeled nucleotide incorporation properties
US6002263A (en) 1997-06-06 1999-12-14 Cascade Microtech, Inc. Probe station having inner and outer shielding
AU8586298A (en) 1997-07-25 1999-02-16 University Of Massachusetts Designed protein pores as components for biosensors
SE9703958D0 (sv) 1997-10-29 1997-10-29 Pacesetter Ab Method and device for determination of concentration
EP0921196A1 (en) 1997-12-02 1999-06-09 Roche Diagnostics GmbH Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction
DE19810879A1 (de) 1998-03-13 1999-09-16 Roche Diagnostics Gmbh Polymerasenchimären
AU3199699A (en) 1998-03-23 1999-10-18 Invitrogen Corporation Modified nucleotides and methods useful for nucleic acid sequencing
US6485703B1 (en) 1998-07-31 2002-11-26 The Texas A&M University System Compositions and methods for analyte detection
US6210896B1 (en) 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
US6217731B1 (en) 1998-10-21 2001-04-17 Spectrumedix Corporation Method and apparatus for monitoring and displaying the status of a parallel capillary electrophoresis device
US6267872B1 (en) 1998-11-06 2001-07-31 The Regents Of The University Of California Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same
WO2000036410A1 (en) 1998-12-11 2000-06-22 Symyx Technologies, Inc. Sensor array-based system and method for rapid materials characterization
US6232075B1 (en) 1998-12-14 2001-05-15 Li-Cor, Inc. Heterogeneous assay for pyrophosphate detection
US6082115A (en) 1998-12-18 2000-07-04 National Semiconductor Corporation Temperature regulator circuit and precision voltage reference for integrated circuit
NO986133D0 (no) 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
US20030054360A1 (en) 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6399335B1 (en) 1999-11-16 2002-06-04 Advanced Research And Technology Institute, Inc. γ-phosphoester nucleoside triphosphates
US6383749B2 (en) 1999-12-02 2002-05-07 Clontech Laboratories, Inc. Methods of labeling nucleic acids for use in array based hybridization assays
AU2001241474A1 (en) 2000-02-11 2001-08-20 The Texas A And M University System Biosensor compositions and methods of use
US6616895B2 (en) 2000-03-23 2003-09-09 Advanced Research Corporation Solid state membrane channel device for the measurement and characterization of atomic and molecular sized samples
US6413792B1 (en) 2000-04-24 2002-07-02 Eagle Research Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US6936702B2 (en) 2000-06-07 2005-08-30 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
EP1307469B1 (en) 2000-08-03 2008-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo¬3,4-d pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses
US7153672B1 (en) 2000-08-30 2006-12-26 University Of Rochester Method of performing reverse transcription reaction using reverse transcriptase encoded by non-LTR retrotransposable element
US20060057565A1 (en) 2000-09-11 2006-03-16 Jingyue Ju Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
EP1322785A4 (en) 2000-09-11 2005-11-09 Univ Columbia COMBINATION FLUORESCENCE ENERGY TRANSFER INDICATORS AND USES THEREOF
US6627748B1 (en) 2000-09-11 2003-09-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and their applications for multiplex genetic analyses
EP1337541B1 (en) 2000-10-06 2007-03-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
US7348183B2 (en) * 2000-10-16 2008-03-25 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Self-contained microelectrochemical bioassay platforms and methods
US20030027140A1 (en) 2001-03-30 2003-02-06 Jingyue Ju High-fidelity DNA sequencing using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
DE10120083A1 (de) * 2001-04-17 2003-01-30 Nmi Univ Tuebingen Meßelektrodenpaar, Biosensor mit einem solchen Meßelektrodenpaar und Verfahren zur Herstellung
US6800933B1 (en) 2001-04-23 2004-10-05 Advanced Micro Devices, Inc. Integrated circuit cooling device
US6686997B1 (en) 2001-08-27 2004-02-03 Raytheon Company Apparatus and a method for pulse detection and characterization
EP1421213B1 (en) 2001-08-29 2010-02-17 Amersham Biosciences Corp. Labeled nucleoside polyphosphates
US7727722B2 (en) 2001-08-29 2010-06-01 General Electric Company Ligation amplification
US7052839B2 (en) 2001-08-29 2006-05-30 Amersham Biosciences Corp Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use
US7256019B2 (en) 2001-08-29 2007-08-14 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Terminal phosphate blocked nucleoside polyphosphates
US7223541B2 (en) 2001-08-29 2007-05-29 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use
US7033762B2 (en) 2001-08-29 2006-04-25 Amersham Biosciences Corp Single nucleotide amplification and detection by polymerase
JP2005508630A (ja) 2001-09-14 2005-04-07 インヴィトロジェン コーポレーション Ｄｎａポリメラーゼとその変異体
JP4117249B2 (ja) 2001-10-15 2008-07-16 バイオセプト インコーポレイテッド マイクロウェルバイオチップ
WO2003035824A1 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Bar-Ilan University Interactive transparent individual cells biochip processor
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
JP4968498B2 (ja) 2002-01-23 2012-07-04 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発
US20030166282A1 (en) 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
US6952651B2 (en) 2002-06-17 2005-10-04 Intel Corporation Methods and apparatus for nucleic acid sequencing by signal stretching and data integration
US7948041B2 (en) 2005-05-19 2011-05-24 Nanomix, Inc. Sensor having a thin-film inhibition layer
US7074597B2 (en) 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
DE10238843B8 (de) 2002-08-20 2008-01-03 Infineon Technologies Ag Halbleiterbauelement
JP2005537115A (ja) 2002-08-27 2005-12-08 ユニバーシティ オブ フロリダ 発作警告及び発作予測のための多次元時系列処理の最適化
US7355216B2 (en) 2002-12-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of California Fluidic nanotubes and devices
US20050032081A1 (en) 2002-12-13 2005-02-10 Jingyue Ju Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
WO2004071155A2 (en) 2003-02-05 2004-08-26 Amersham Biosciences Corp Solid phase sequencing
WO2004072238A2 (en) 2003-02-05 2004-08-26 Amersham Biosciences Corp Terminal-phosphate-labeled nucleotides with new linkers
CA2517216A1 (en) 2003-02-28 2004-10-07 Brown University Nanopores, methods for using same, methods for making same and methods for characterizing biomolecules using same
US7745116B2 (en) 2003-04-08 2010-06-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
GB0308851D0 (en) 2003-04-16 2003-05-21 Lingvitae As Method
US7521225B2 (en) 2003-06-13 2009-04-21 North Carolina State University Nanotube structures having a surfactant bilayer inner wall coating
US8233959B2 (en) 2003-08-22 2012-07-31 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing analyte sensor data
US20050079598A1 (en) 2003-10-08 2005-04-14 Davis Randall W. Apparatus and method for identification of biomolecules, in particular nucleic acid sequences, proteins, and antigens and antibodies
US6880345B1 (en) 2003-11-04 2005-04-19 Intel Corporation Cooling system for an electronic component
JP4497903B2 (ja) * 2003-12-02 2010-07-07 財団法人大阪産業振興機構 タンパク質チップおよびそれを用いたバイオセンサー
US7019346B2 (en) 2003-12-23 2006-03-28 Intel Corporation Capacitor having an anodic metal oxide substrate
US20050186576A1 (en) 2004-02-19 2005-08-25 Intel Corporation Polymer sequencing using selectively labeled monomers and data integration
JP4107269B2 (ja) 2004-02-23 2008-06-25 ソニー株式会社 固体撮像装置
WO2005084367A2 (en) 2004-03-03 2005-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
US7279337B2 (en) 2004-03-10 2007-10-09 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for sequencing polymers through tunneling conductance variation detection
US7238485B2 (en) 2004-03-23 2007-07-03 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
US20050221351A1 (en) 2004-04-06 2005-10-06 Affymetrix, Inc. Methods and devices for microarray image analysis
US20050239134A1 (en) 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
JP2006004079A (ja) 2004-06-16 2006-01-05 Sony Corp 記憶装置
US6880346B1 (en) 2004-07-08 2005-04-19 Giga-Byte Technology Co., Ltd. Two stage radiation thermoelectric cooling apparatus
AT501510B1 (de) 2004-07-19 2009-05-15 Univ Wien Tech Dezentrale fehlertolerante taktgenerierung in vlsi chips
US7622934B2 (en) 2004-07-23 2009-11-24 Electronic Bio Sciences, Llc Method and apparatus for sensing a time varying current passing through an ion channel
US7972858B2 (en) 2004-08-13 2011-07-05 President And Fellows Of Harvard College Ultra high-throughput opti-nanopore DNA readout platform
GB0422733D0 (en) 2004-10-13 2004-11-17 Lingvitae As Method
US20060105461A1 (en) 2004-10-22 2006-05-18 May Tom-Moy Nanopore analysis system
WO2007084103A2 (en) 2004-12-21 2007-07-26 The Texas A & M University System High temperature ion channels and pores
GB0505971D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Isis Innovation Delivery of molecules to a lipid bilayer
US7215032B2 (en) 2005-06-14 2007-05-08 Cubic Wafer, Inc. Triaxial through-chip connection
WO2007002204A2 (en) 2005-06-21 2007-01-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compostions
US7645866B2 (en) 2005-06-28 2010-01-12 Life Technologies Corporation Methods of producing and sequencing modified polynucleotides
JP4524652B2 (ja) 2005-07-06 2010-08-18 ソニー株式会社 Ａｄ変換装置並びに半導体装置
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US20070190542A1 (en) 2005-10-03 2007-08-16 Ling Xinsheng S Hybridization assisted nanopore sequencing
US7397232B2 (en) 2005-10-21 2008-07-08 The University Of Akron Coulter counter having a plurality of channels
GB2446084B (en) 2005-10-31 2011-03-02 Univ Columbia Synthesis of four color 3-o-allyl modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
US8796432B2 (en) 2005-10-31 2014-08-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-DNTP-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
CA2630544A1 (en) 2005-11-21 2007-05-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex digital immuno-sensing using a library of photocleavable mass tags
EP1960550B1 (en) 2005-12-12 2010-09-15 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Probe for nucleic acid sequencing and methods of use
ATE518010T1 (de) 2005-12-22 2011-08-15 Pacific Biosciences California Aktive oberflächengekoppelte polymerasen
EP3056575B1 (en) 2005-12-22 2017-10-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerases for nucleotide analogue incorporation
JP4735833B2 (ja) * 2006-01-13 2011-07-27 セイコーエプソン株式会社 バイオチップ及びバイオセンサ
US8002712B2 (en) 2006-01-26 2011-08-23 Meka Vikas V Breath and breath condensate analysis system and associated methods
US7368668B2 (en) 2006-02-03 2008-05-06 Freescale Semiconductor Inc. Ground shields for semiconductors
JP2009156572A (ja) 2006-04-06 2009-07-16 National Institutes Of Natural Sciences イオンチャンネルタンパク質バイオセンサー
US20070298511A1 (en) 2006-04-27 2007-12-27 The Texas A&M University System Nanopore sensor system
US7777505B2 (en) * 2006-05-05 2010-08-17 University Of Utah Research Foundation Nanopore platforms for ion channel recordings and single molecule detection and analysis
US7446017B2 (en) 2006-05-31 2008-11-04 Freescale Semiconductor, Inc. Methods and apparatus for RF shielding in vertically-integrated semiconductor devices
CN101495656B (zh) 2006-06-07 2017-02-08 纽约哥伦比亚大学理事会 采用带修饰的核苷酸通过纳米通道进行dna序列测定
BRPI0603825A (pt) 2006-09-19 2008-05-06 Syngenta Protecao De Cultivos composição reguladora de crescimento de brotos em plantações de fumo, método de controle de crescimento de brotos em plantações de fumo e uso de uma quantidade eficaz de flumetralin, pelo menos um solvente e pelo menos um tensoativo
US9434990B2 (en) * 2012-04-02 2016-09-06 Lux Bio Group, Inc. Apparatus and method for molecular separation, purification, and sensing
US8343746B2 (en) 2006-10-23 2013-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
WO2008069973A2 (en) 2006-12-01 2008-06-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
EP2092322B1 (en) 2006-12-14 2016-02-17 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8003319B2 (en) 2007-02-02 2011-08-23 International Business Machines Corporation Systems and methods for controlling position of charged polymer inside nanopore
WO2008102121A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Oxford Nanopore Technologies Limited Formation of lipid bilayers
CA2684801C (en) 2007-04-04 2017-10-10 The Regents Of The University Of California Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
US9121843B2 (en) 2007-05-08 2015-09-01 Trustees Of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
AU2008265691B2 (en) 2007-06-19 2014-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag High throughput nucleic acid sequencing by expansion
US20090073293A1 (en) 2007-06-27 2009-03-19 Yoel Yaffe CMOS image sensors with increased dynamic range and methods of operating the same
JP4929090B2 (ja) 2007-07-26 2012-05-09 パナソニック株式会社 固体撮像装置およびその駆動方法
EP2201136B1 (en) 2007-10-01 2017-12-06 Nabsys 2.0 LLC Nanopore sequencing by hybridization of probes to form ternary complexes and variable range alignment
US8273532B2 (en) 2007-10-02 2012-09-25 President And Fellows Of Harvard College Capture, recapture, and trapping of molecules with a nanopore
EP3431615A3 (en) 2007-10-19 2019-02-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators cleavable label modified nucleotide terminators
EP4310194A2 (en) 2007-10-19 2024-01-24 The Trustees of Columbia University in the City of New York Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
CA2740973A1 (en) 2007-10-23 2009-04-30 Stratos Genomics Inc. High throughput nucleic acid sequencing by spacing
GB0724736D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
US7899996B1 (en) * 2007-12-31 2011-03-01 Emc Corporation Full track read for adaptive pre-fetching of data
US20110165652A1 (en) 2008-01-14 2011-07-07 Life Technologies Corporation Compositions, methods and systems for single molecule sequencing
US7989928B2 (en) 2008-02-05 2011-08-02 Advanced Semiconductor Engineering Inc. Semiconductor device packages with electromagnetic interference shielding
US8022511B2 (en) 2008-02-05 2011-09-20 Advanced Semiconductor Engineering, Inc. Semiconductor device packages with electromagnetic interference shielding
US8252911B2 (en) 2008-02-12 2012-08-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for use in analytical reactions
US8652781B2 (en) 2008-02-12 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Cognate sampling kinetics
US8530164B2 (en) 2008-09-05 2013-09-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method for sequencing using branching fraction of incorporatable nucleotides
US20090215050A1 (en) 2008-02-22 2009-08-27 Robert Delmar Jenison Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides
US7973146B2 (en) 2008-03-26 2011-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Engineered fluorescent dye labeled nucleotide analogs for DNA sequencing
EP2274446B1 (en) 2008-03-31 2015-09-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Two slow-step polymerase enzyme systems and methods
US8999676B2 (en) 2008-03-31 2015-04-07 Pacific Biosciences Of California, Inc. Recombinant polymerases for improved single molecule sequencing
US8420366B2 (en) 2008-03-31 2013-04-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing
ATE530497T1 (de) 2008-03-31 2011-11-15 Sony Deutschland Gmbh Verfahren zur herstellung einer membran mit konischer pore
AU2009251883B2 (en) 2008-03-31 2014-09-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing
US9127259B2 (en) 2008-03-31 2015-09-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Enzymes resistant to photodamage
US8058414B2 (en) 2008-04-29 2011-11-15 Life Technologies Corporation Unnatural polymerase substrates that can sustain enzymatic synthesis of double stranded nucleic acids from a nucleic acid template and methods of use
US8940142B2 (en) 2008-05-05 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Functionalized nanopipette biosensor
US20100122907A1 (en) 2008-05-06 2010-05-20 Government of the United States of America, Single molecule mass or size spectrometry in solution using a solitary nanopore
US7906371B2 (en) 2008-05-28 2011-03-15 Stats Chippac, Ltd. Semiconductor device and method of forming holes in substrate to interconnect top shield and ground shield
US20100025238A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 Medtronic Minimed, Inc. Analyte sensor apparatuses having improved electrode configurations and methods for making and using them
US8921046B2 (en) 2008-09-19 2014-12-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleic acid sequence analysis
US8481264B2 (en) 2008-09-19 2013-07-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Immobilized nucleic acid complexes for sequence analysis
US8063469B2 (en) 2008-09-30 2011-11-22 Infineon Technologies Ag On-chip radio frequency shield with interconnect metallization
WO2013154750A1 (en) * 2012-04-10 2013-10-17 The Trustees Of Columbia Unversity In The City Of New York Systems and methods for biological ion channel interfaces
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
CA2741996A1 (en) 2008-10-29 2010-05-14 Trustees Of Boston University Sequence preserved dna conversion
US8486630B2 (en) 2008-11-07 2013-07-16 Industrial Technology Research Institute Methods for accurate sequence data and modified base position determination
US20100148126A1 (en) 2008-11-26 2010-06-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Genomic sequencing using modified protein pores and ionic liquids
US9156037B2 (en) 2009-01-15 2015-10-13 Children's Medical Center Corporation Microfluidic device and uses thereof
GB0905140D0 (en) 2009-03-25 2009-05-06 Isis Innovation Method
WO2010111605A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Nabsys, Inc. Devices and methods for analyzing biomolecules and probes bound thereto
US8986928B2 (en) 2009-04-10 2015-03-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
US8926904B2 (en) * 2009-05-12 2015-01-06 Daniel Wai-Cheong So Method and apparatus for the analysis and identification of molecules
WO2011038241A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
CA2808576A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Quantapore, Inc. Ultrafast sequencing of biological polymers using a labeled nanopore
WO2011047271A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Microchips, Inc. Multi-channel potentiostat for biosensor arrays
BR112012013074B1 (pt) 2009-12-01 2018-09-18 Oxford Nanopore Technologies Limited instrumento de análise e módulo para realizar análise bioquímica, e, método para operar um instrumento de análise para realizar análise bioquímica
US8324914B2 (en) 2010-02-08 2012-12-04 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for characterizing a molecule
US20120052188A1 (en) 2010-02-08 2012-03-01 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for assembling a lipid bilayer on a substantially planar solid surface
US20110192723A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore
EP2843405B8 (en) 2010-02-08 2023-10-04 Roche Sequencing Solutions, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore
US20110287414A1 (en) 2010-02-08 2011-11-24 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for identifying a portion of a molecule
US9605307B2 (en) 2010-02-08 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
JP5159808B2 (ja) * 2010-02-09 2013-03-13 日本電信電話株式会社 脂質二分子膜基板
CA3116307C (en) 2010-02-23 2023-10-17 University Of Washington Artificial mycolic acid membranes
US8652779B2 (en) 2010-04-09 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using charge blockade labels
DE102010022929B4 (de) 2010-06-07 2013-07-18 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht sowie Mikrostruktur und Messanordnung
US9280596B2 (en) * 2010-07-01 2016-03-08 Salesforce.Com, Inc. Method and system for scoring articles in an on-demand services environment
WO2012009578A2 (en) 2010-07-14 2012-01-19 The Curators Of The University Of Missouri Nanopore-facilitated single molecule detection of nucleic acids
WO2012083249A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using modified nucleotides and nanopore detection
WO2012088341A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Genia Technologies, Inc. Nanopore-based single dna molecule characterization, identification and isolation using speed bumps
US8962242B2 (en) 2011-01-24 2015-02-24 Genia Technologies, Inc. System for detecting electrical properties of a molecular complex
US9110478B2 (en) 2011-01-27 2015-08-18 Genia Technologies, Inc. Temperature regulation of measurement arrays
WO2012121756A1 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Quantapore, Inc. Apparatus and methods for performing optical nanopore detection or sequencing
US20130087467A1 (en) * 2011-06-24 2013-04-11 Hongjun Yang High-performance analytical instrument and method
US20140371091A1 (en) * 2011-10-25 2014-12-18 Arizona Board of Regents, a body corporate of the state of Arizona, acting for and on behalf of Programmable Arrays
JP5770615B2 (ja) * 2011-12-08 2015-08-26 日本電信電話株式会社 脂質二分子膜基板の製造方法
CA2861457A1 (en) 2012-01-20 2013-07-25 Genia Technologies, Inc. Nanopore based molecular detection and sequencing
US8541849B2 (en) 2012-02-14 2013-09-24 Genia Technologies, Inc. Noise shielding techniques for ultra low current measurements in biochemical applications
US9850534B2 (en) 2012-02-16 2017-12-26 Genia Technologies, Inc. Methods for creating bilayers for use with nanopore sensors
US8986629B2 (en) 2012-02-27 2015-03-24 Genia Technologies, Inc. Sensor circuit for controlling, detecting, and measuring a molecular complex
US10029915B2 (en) 2012-04-04 2018-07-24 International Business Machines Corporation Functionally switchable self-assembled coating compound for controlling translocation of molecule through nanopores
EP2836604B1 (en) 2012-04-09 2021-09-15 The Trustees of Columbia University in the City of New York Method of preparation of nanopore and uses thereof
EP2861768A4 (en) 2012-06-15 2016-03-02 Genia Technologies Inc CHIP SETUP AND HIGH ACCURACY NUCLEIC ACID SEQUENCING
ES2779699T3 (es) 2012-06-20 2020-08-18 Univ Columbia Secuenciación de ácidos nucleicos mediante detección en nanoporos de moléculas de etiqueta
JP6343621B2 (ja) 2012-11-29 2018-06-13 ヘルムート・フィッシャー・ゲーエムベーハー・インスティテュート・フューア・エレクトロニク・ウント・メステクニク 蛍光ｘ線分析を実施するための方法及びデバイス
US9322062B2 (en) 2013-10-23 2016-04-26 Genia Technologies, Inc. Process for biosensor well formation

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