JP4117249B2

JP4117249B2 - マイクロウェルバイオチップ

Info

Publication number: JP4117249B2
Application number: JP2003536713A
Authority: JP
Inventors: ティシンバーグパベル; ロイクロフトパット; ハンナファルコヴィッツ−ジェラッシーユーディット; ハーンスーンカップ
Original assignee: バイオセプトインコーポレイテッド
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2022-10-15
Also published as: WO2003034026A2; DE60227094D1; EP1444500A2; JP2005506530A; EP1444500A4; AU2002340198A1; EP1444500B1; WO2003034026A3; US20040191891A1; US7217520B2; ATE398284T1

Description

本出願は、２００１年１０月１５日に出願した米国仮特許出願第６０／３２９，６３２号に基づく優先権を主張するものであり、その開示を参照することによって本明細書に組み込むものとする。本発明は、生物学的アッセイを実施するためのデバイス、そのデバイスの作製法、およびそのデバイスを使ったアッセイ法に関する。

高速大量処理スクリーニングとは、多くの別個の試験を同時平行して行う方法を示すのに使用される用語である。現在、最も広く認められている技術では、９６ウェルのマイクロタイタープレートが使用される。このようなマイクロタイタープレートは、アッセイの処理量を高める簡便な方法を提供するため、研究および臨床検査の実践で何十年間にもわたって使用されてきた。このようなマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレートは、一般にはポリスチレン製であり、６から９６の別個のウェルを有しており、それらウェルの中で、マトリクス状のサンプルを手動または自動操作装置で試薬と混合し、撹拌し、インキュベートしたりすることができる。マイクロタイタープレートのきわだった利点は、多数のサンプルを迅速かつ同時に定量することができることだけでなく、多くの異なるアッセイ条件を採用できるという点にある。アッセイによる定量的結果を得るために、通常光線で各ウェルをスキャンし、各ウェルから分光学的情報を得る。

アッセイは、サンドイッチ免疫アッセイの場合のように、それぞれ個々のウェルの表面上においても行うことができる。ＥＬＩＳＡまたは細胞培養などの様々な用途に適合するように設計された、種々の表面修飾ポリスチレンマイクロタイタープレートは異なる製造業者から購入することができる。マイクロタイタープレートとサンプルを処理する種々の自動装置も購入することができる。

マイクロタイタープレートは、アッセイの処理量を高める能力を備えているために、例えばプレートのウェル表面上での選択的固定または強化された固定を伴うアッセイなどの多くのアッセイに使用されてきた。例えば、特異的高感度検出用の微量定量ウェルにおいて、特定のオリゴヌクレオチド配列を固定化する方法が記載されている（例えば、特許文献１参照）。また、マイクロタイタープレートなどのポリスチレン支持体の表面に合成核酸分子を非共有結合によって固定化し、ハイブリダイゼーションおよびその他の核酸アッセイを迅速かつ高い費用効率で実施することを可能にする方法が記載されている（例えば、特許文献２参照）。また、同様のアッセイ目的のための、マイクロタイタープレートのウェルなどの適当な表面に核酸を共有結合によって固定化する組成物および方法が記載されている（例えば、特許文献３、４、５参照）。また、アッセイを目的として、負に帯電したＤＮＡおよびＲＮＡなどの高分子をマイクロタイタープレートのプラスチックに結合する方法が記載されている（例えば、特許文献６参照）。

例えば、多孔質構造体などの透過性材料を、マイクロタイタープレートの底面に使用することによって、マイクロタイタープレートのウェル内での洗浄能力および液体交換能力を高める方法についても記載されている（例えば、特許文献７、８、９、１０参照）。マイクロタイタープレートの下方に真空マニホールドを使用することによって、そのウェルからの液体の排出を制御しかつ迅速に行うことが可能であることが記載されており、そのようなマイクロタイタープレートは、各ウェルの底面に円形膜を含んでいる（特許文献１１参照）。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（商標）プレートのような膜底面を有する９６ウェルプレートを販売している。

マイクロタイタープレートの各ウェルの容積を低減することによってマイクロタイタープレートのウェル密度が高められ、その結果として、非常に高速大量処理の分析が可能となるであろう。そして、恐らく、バイオチップについても同様のことが可能となろう。例えば各ウェルが僅か５マイクロリットルのマイクロウェルを組み入れたデバイスが記載されており（特許文献１２参照）、マイクロタイタープレートに９６００個ものウェルを組み入れることが可能であろうことを示唆している。一部の市販のプレートは現在１５３６個のウェルを有しており、各ウェルの実用容積は約１μｌ〜１０μｌである。このようなマイクロウェル分析システムとともに使用される可能性のある液体の取り扱いおよび制御の一例が記載されている（特許文献１３参照）。例えば、各ウェル内の細胞の反応を測定するための高密度マイクロウェルを備えた基板を、薬剤のスクリーニングに使用することが記載されている（特許文献１４参照）。また、分離膜シートを使用することが示されている（特許文献１５参照）。

さらに近年では、より高い処理量を可能とし、かつ必要とされる試薬量の低減を可能にするために、１マイクロタイタープレート当たり９６ウェルよりも高密度のプレート、例えば１マイクロタイタープレート当たり３８４ウェル以上のプレートが、商業的に開発されている。しかし、従来のマイクロタイタープレートアッセイにおいて、このような高密度化を進めることについては、以下の３つの重要な問題がある。すなわち、１）高密度マイクロタイタープレートの作製に付随するコストの増大、２）ウェル体積の微小化による液体取り扱いの困難性、および３）アッセイの定量結果を光学的に正確に得ることの困難性、といった問題である。したがって、これら難問を解決するための、特に高精度の定量を可能にするという問題を解決するための追求が続いている。

米国特許第５，７４１，６３８号米国特許第５，６１０，２８７号米国特許第５，６６７，９７６号米国特許第５，７１２，３８３号米国特許第５，７４７，２４４号米国特許第６，１８０，７６９号米国特許第４，４９３，８１５号米国特許第５，３２６，５３３号米国特許第５，６７９，３１０号米国特許第６，１４６，８５４号米国特許第５，１０６，４９６号米国特許第６，０２７，６９５号米国特許第６，２２５，０６１号米国特許第６，２３５，５２０号米国特許第４，７３４，１９２号米国特許第６，１７４，６８３号国際公開第００／６５０９７号パンフレット米国特許第６，０８３，７６３号

本発明は、生物学的材料を固定するのにヒドロゲルポリマー、好ましくはポリイソシアネート官能性ヒドロゲルポリマーを利用したマルチウェル／マイクロウェルアッセイプレートを提供する。多数のウェルを備えた固相プレートであって、各ウェルにおいて支持材料を誘導化してプローブとしての機能を果たす生物学的材料を提供するような固相プレートを形成し、このような生物学的材料を、プレートの所定の位置に配置させた各ウェルの特定の表面上に配置することによって、単純でかつ多用途のフォーマットでの高速大量処理アッセイの可能性を付与する。また、このようなプレートの作製法およびこのようなプレートを使用するアッセイ法も提供する。

１つのさらに詳細な態様において、本発明は、溶液を保持し、アッセイの一部として、上記溶液と固定化した生物学的材料とを反応させるデバイスを提供する。このデバイスは、一群のウェルが固相プレートを完全に貫通するように形成され、前記ウェルの壁が実質的に液体不浸透性であるプレートと、前記ウェルのそれぞれの底部を閉じる、平均孔径１μｍ以下の微孔質材料と、複数の前記ウェルの各々の前記微孔質底面の上部表面に結合しているポリマーの少なくとも１つの実質的に半球のポリマースポットを含み、このスポットは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含むイソシアネート官能性プレポリマーから形成された架橋ヒドロゲルポリマーを含み、前記ヒドロゲルが、前記ウェルに供給される水溶液によって接触可能となるように前記ポリマーの上または内部に固定されている生物学的材料を有し、前記の実質的に半球形のポリマーのスポットが、インキュベーションおよび／またはハイブリダイゼーションの後に、排出を行うことができる十分な部分を残した状態で、各ウェルの底部表面の一部分のみを覆う。

別のさらに詳細な態様において、本発明は、生物学的アッセイを実施する方法を提供する。この方法は、プレートの形態をしたデバイスの複数のウェルにテスト溶液を導入する工程であって、このプレートが一群のウェルを有し、微孔質材料が前記ウェルの各々の底面を閉じており、少なくとも１つのポリマーのスポットが前記複数のウェルの各々の微孔質底面の上部表面に結合しており、このスポットが前記複数のウェルの各々の微孔質底部の上面に結合しており、前記スポットが、前記ポリマーの上または内部に固定されている生物学的材料を有する架橋したヒドロゲルポリマーを含み、前記ウェルが排出を行うことができる十分な部分を残した状態で、各ウェルの底部表面の一部のみを覆うポリマースポットを含み、前記一群のウェルが規則的なアレイを形成するように配置され、前記複数のウェルの少なくとも一部が異なる生物学的材料を含み、前記微孔質材料が０．３〜１μｍの平均孔径を有し、前記微孔質とは、前記微孔質材料の下面に真空が適用されるまで前記ウェルに供給される水溶液がウェルに残留するようなものである工程と、ハイブリダイゼーションおよび／または結合を行った後に、前記デバイスに真空を適用して前記ウェルから前記溶液を除去する工程と、各ウェルのアッセイの結果を光学的に検出する工程と、を含む。

さらに別のさらに詳細な態様において、本発明は、固定化した生物学的材料を保持し、かつアッセイの一部として上記固定化した生物学的材料をテスト溶液に暴露するデバイスを作製する方法を提供する。上記方法は、平坦なプレートを提供する工程であって、このプレートにプレートを完全に貫通する一群の孔が形成され、この孔が規則的なパターンで配置されている工程と、前記プレートの下面に微孔質材料からなる疎水性膜のシートを結合させて各孔の底部を閉じ、それによって複数のマイクロウェルを作成する工程と、前記ウェルに供給される溶液が前記膜を通して拡散するのを防ぐための防壁を形成するような方法で、前記各孔の周囲を囲む領域において前記膜のシートを前記プレートの下面に結合させる工程と、前記ウェルの底面の表面積の微小部分のみを覆い、ウェルの壁と接触しない半球形のスポットを重合し、そのようなスポットを形成するような方法で、少なくとも複数の前記ウェルの各々のほぼ中心において、膜の上部表面へ、少なくとも１つの微小滴の、イソシアネート官能性ヒドロゲル材料のプレポリマーポリマーを適用し、それによって前記膜の下面に真空を適用することで各ウェルの底面の疎水性膜を通して水溶液の排出が達成される工程を含む。

本発明は固相（solid）プレートを含んでおり、該プレートには複数の穴が形成され、次いでその下面に微孔質膜材料が貼り合わされて、そこにウェルが完成される。微孔質膜を貼り合わせる前に、プレートは、その厚みを貫通する、好ましくは断面が円形の穴を備えた状態で形成されるか、またはプレートにドリルまたは機械加工によって、前述のような穴が形成される。貼り合わせ法によって、連続した側壁を有し、底部には微孔質膜を有する複数の独立したウェルが形成される。こうして得られるデバイスはマルチウェルバイオチップと呼ばれるが、試作バイオチップ１１のサンプルを図１に示す。

前述のバイオチップはプレート１３を含んでおり、該プレート１３は、ガラス、溶融（fused）シリカ、ステンレススチール、ならびにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリカーボネートなどのポリマーを含めて、化学実験室で通常使われている好適な材料であれば、いかなる材料からも作製できる。プレート１３は、初めは平坦な固相プレートであってよく、次いでその平坦なプレートに、ドリルによる穴あけまたは化学的溶解またはその他の好適な機械加工によって、プレートを貫通する穴１５を規則的なパターンで形成してもよい。しかし、所望の穴パターンを備えたプレートは、ポリカーボネートなどの好適なポリマーを使って、例えば射出成形などによって成形することが好ましい。このようなプレートの厚さは通常約２ｍｍを超えることはない。

好ましくは円形断面を有する穴１５は、円筒形であっても円錐形であっても良く、穴１５によってアッセイのためのウェル（底部が閉鎖された場合）が提供される。穴１５の直径は、所望されるウェルの寸法およびプレート自体の利用可能な表面積の結果として決まる。各ウェルの容量は、そのウェルの高さ（すなわちプレートの厚さ）および有効径から判断される。例えば、厚さ１ｍｍの標準的実験用スライドガラスの寸法を有するプレートに、すなわち１インチ×３インチ（２．５４ｃｍ×７．６２ｃｍ）寸法のプレートに３８４穴のマイクロウェルバイオチップを所望する場合、各穴の直径は約１．３ｍｍとなり、各ウェルに対して最大約１μｌの容積（または充填）が可能となり、したがって有効実用容積は約０．５μｌとなる。このような大きさの容積の使用によって、研究者はアッセイから信頼できる結果を得ることができる。３８４穴のマイクロウェルバイオチップを使用する場合、標準的なパターンは例えば１列につき２４個のウェルを１６列配したパターンとなる。

プレートは容易に機械加工することができ、それによってこのような規則的な穴のパターンを得ることができるが、このようなプレートは、硬質の熱可塑性材料などの高分子材料から、単純に射出成形よって、またはその他同等の固相基板を加工するための成形プロセスによって成形することが好ましくかつ経済的であると考えられている。プレートの色は適度な範囲内で変えることもできるが、所望のターゲットがアッセイによって突き止められているか否かを判定するのに光学的検出システムを使用する場合には、プレート、その周囲のウェル表面も、暗色の材料、好ましくは黒または暗灰色の材料で形成することが好ましい場合がある。ウェルそれ自体からの潜在的な干渉をさらに低減するために、プレートの外観は光沢のない黒色であることがより好ましい。例えば、黒色のポリカーボネート、黒色のポリエチレンおよび黒色のＤｅｌｒｉｎ（商標）プラスチックなどは、特に、蛍光アッセイが用いられる場合に好ましい。その他の許容できるプレート材料としては、業界で３−Ｄリソグラフィー材料と呼ばれている、灰色かつ透明なポリカーボネートおよびポリマーが挙げられる。光学的走査の過程におけるバックグラウンド「ノイズ」を低減するために、いかなる色のプレートも、例えば吹き付けなどによって塗装することで、後述する微孔質膜の貼り合わせの前に光沢のない黒色に仕上げることが可能ある。しかし、前述したような所望の仕上げを施した適切なポリマーから、例えば成形などによって独自に形成することが好ましい。

テスト溶液は通常水溶液であるという仮定のもとに、好ましくはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエステル、ポリエステルスルホンなどの疎水性材料で形成されている微孔質膜１７を使って、各ウェルの底部を閉じる。膜１７の疎水性によって、各ウェルに堆積した溶液は、インキュベーションおよび／またはハイブリダイゼーション反応を生じるのに十分な時間にわたってウェル内に残留し、ウェルからウェルへと横方向に広がることがない。反応を生じるのに十分な時間が経過した後、プレートの下面に真空が適用されて、水溶液は疎水性微孔質膜１７を通って効果的に排出される。

プレート１１の下面に対する膜１７の貼り合わせまたは接着は、好適な方法であればいかなる方法であっても達成することができ、例えば接着剤によってまたは超音波圧接などのヒートシールによって達成することができる。好ましくは、膜１７はプレートの下面に融着によって貼り合わされ、最も好ましくは超音波圧接によって貼り合わされる。このような技術を使うことによって、膜１７と穴あきプレート１１の下面との間では、超音波エネルギーが均一に加えられた状態で圧力が保持される。その結果、高分子膜１７は、各穴１３を囲む領域においてプレートの固相下面に融着し、各穴１３は膜が提供する微孔質の疎水性底部表面によってウェルに変換される。各穴に整合する領域では、隣接する固相プレート材が存在しないため、膜は超音波エネルギーの影響を受けない状態にある。膜が疎水性であるために、隣接するウェルの下方の膜自体の平面内における吸い上げはごく僅かとなろう。また融着により接着することによって、上記のような吸い上げや膜内での横方向の拡散に対して実際的な障壁が築かれる。

適用した水溶液が、ウェルの底部を形成している多孔質膜を最終的に容易に通過できるようするために、分析しようとする溶液に少量の湿潤剤または界面活性剤を含ませることが好ましい。膜の下面に真空を適用したとき、このような界面活性剤の存在によって、例えば、呼び寸法０．３から１．０μｍの範囲の孔を有する微孔質疎水性高分子膜中を溶液が流れ易くなる。平均径約０．５μｍの孔は、真空の非存在下で水溶液を拡散させずにおくには十分小さい寸法であると考えられ、また一方で、予想されるターゲット分子よりは十分大きいために、未結合の分子が膜上または膜内で捕捉されるのを避けることができる。

穴を含むプレートの下面に膜が貼り合わされると、各ウェルは、好適なマイクロスポッティング装置を使用する少なくとも１つの特定プローブの関与でいつでも「プリント」される態勢になる。例えば、厚さ１ｍｍ、縦×横が約２．５ｃｍ×約７．５ｃｍの平坦なプレートに直径約１．３ｍｍの３８４ウェルの規則正しいパターンが付与されている場合、ロボット式ディスペンサーまたはマイクロスポッター（当業界で知られているような）を使用して、各ウェルの多孔質底部表面のほぼ中心に重合ヒドロゲル材の微小液滴またはスポットを適用することができる。先述のように、プレートの下面に超音波を利用して融着される微孔質膜１７は、約０．３から１．０μｍの範囲の孔を有するポリプロピレンまたはＰＴＦＥ膜とすることができ、直径約２００μｍの中実ピンを使ってサンプルに対してプリンティングを実施することができる。一般に、２００〜７００μｍの範囲の中実ピンおよび同様の内径を有する中空ガラスピンが好適であると考えられている。このようなピンは、先ず、個々のポリマー、例えばイソシアネート官能性ＰＥＧベースのプレポリマーなどの混合物中に浸漬させて、混合物の液滴が中実ピンの先端に付着するようにする。ピンの寸法はウェルの直径より実質的に小さいため、ピンは容易にウェルの中心領域に収まり、中心に位置したヒドロゲル材のスポットは膜の上面に残り、スポットはウェルの側壁と接触していない。このようなスポットを、インクジェット付着や圧電付着などの非接触プリンティング法を使って付着させることもできる。

好ましいヒドロゲルは、反応性イソシアネートでキャップしたＰＥＧまたはＰＰＧプレポリマーである。このようなプレポリマーはＨＹＰＯＬの商品名で販売されており、これを使ってプローブとして使用できる捕捉剤を結合する方法が記載されており（例えば、特許文献１６、１７参照）、その開示を参照によって本明細書に組み込むものとする。プローブとして使用するのに好適な生物学的材料であればいずれの材料であっても使用できよう。生物学的材料は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体およびホルモンなどのタンパク質、または生細胞であっても良い。例えばステロイド、ステロイドホルモン、ビタミン、鎮痛薬などの少量の化学化合物（small chemical compound）など、医薬品として有用な非ペプチド分子もプローブとして使用することができる。

膜１７の疎水性によってヒドロゲルの広がりが防止され、その結果ヒドロゲルは実質的な半球形を保持することになり、例えばウェルの底部表面の５０％未満といった小部分のみを覆う大きさとなって、水溶液がアッセイのためにウェルに供給された後に、この水溶液の排出を最終的に行える十分な表面積が残されることになる。結合／ハイブリダイゼーションが行われる（所望のターゲットが存在する場合に行われる）時間が経過した後、引き続いて膜の下面に真空を適用すると、溶液の排出が容易に促進される。この排出は、アッセイの対象となる溶液に少量の界面活性剤を含ませることによって、または結合／ハイブリダイゼーション時間が経過した後に少量の界面活性剤を添加することによって容易になる。

概して言えば、前述の特性を備えたマイクロウェルバイオチップ１１は、標準的なマイクロタイタープレートシステムに比べて幾つかの利点を有している。膜底部の画定された部分にヒドロゲルを戦略的に配置することと組み合わせて、多孔質底部を配置することによって、信頼性のある定量的結果を得ることを可能にしながら、試薬溶液の必要容量が低減される。例えば、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートに通常使用される約１〜１０μｌであった試薬溶液の必要容量が、本発明のチップでは約０．５〜１μｌとなる。また、液体の移送が簡便に行われるようになり、その結果は、例えば標準的な蛍光バイオチップスキャナーによって光学的に容易に読み取り可能である。３次元網目構造のヒドロゲルの優れた結合性と安定性によって、多数のプローブを各ウェルに固定化することが可能であり、それによって、所望のレベルのプローブ結合を達成するために必要とされるウェルの表面積が低減される。さらに、デバイスは非常に理解しやすく容易に製造されるように設計されているため、製造コストの低減が可能であり、また小型であることによって保管や輸送も容易に行うことができる。本明細書で後述するプロトタイプは、標準的なスライドハンドリング装置と互換性があり、同時にマイクロタイタープレート用に開発された従来のディスペンシング・ハンドリング装置とも互換性がある。

以下の実施例は、本発明の様々な特徴を具体化するマイクロウェルバイオチップデバイスのサンプルの好ましい実施形態と、アッセイにおけるそのデバイスの使用法を説明するものである。ここでの記載は、本発明を実施する上で現在発明者等が考えている最良の形態を述べるが、これら実施例は、添付の請求の範囲で当然明確にされる本発明の範囲を限定しようとするものでないことを理解されたい。

（マイクロウェルバイオチップの作製）
マイクロウェルバイオチップのサンプル１１を、通常の（２．５４×７．６２ｃｍ）顕微鏡用スライドと類似の寸法および形状となるように都合よく設計した。標準的マイクロタイタープレートの構成（例えば、４．５ｍｍピッチ）を用いて、厚さ約１ｍｍの黒色ポリカーボネートプレート１３に、直径１．３ｍｍの孔１５を６０個開けた。光走査の過程でのバックグラウンドをより少なくするために、プレートに（貼り合わせ前に）吹付け塗装し、つや消し黒色仕上げを施した。

スプレー式接着剤を上記プレートに塗布し、孔径０．４５μｍのポリプロピレン膜１７（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）をプレートの所定の位置に圧着することによって上記膜をプレートの下面に貼り合わせ、マルチウェルチップのサンプルを作製した。しかし、超音波圧接が好ましいことを理解されたい。膜１７は平滑な疎水性表面を呈しており、したがって良好なスポット形態（モルホロジー）が確保された。この微孔質膜は、水性サンプルが、例えば１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤を少量含有している場合であっても、結合／ハイブリダイゼーションの間、そのウェルに水性サンプル保持し、さらには、真空が適用されると膜を通して迅速な排出を可能とし、未結合の分子をため込むことがない。上記ウェル内のヒドロゲルセルは、例えば約２０インチ（約５０ｃｍ）Ｈｇ（〜０．６バール）の真空を用いても物理的に崩壊することがなく、またその後のウェルの洗浄によって崩壊することもない。

（マイクロウェルタンパク質バイオチップでのプリンティングおよびハイブリダイジング
プリンティングのためのタンパク質生成）
抗トランスフェリン抗体のＨｙｐｏｌ（ＨａｍｐｓｈｉｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）混合液と、非特異的ＩｇＧのＨｙｐｏｌ溶液（ブランク対照）をプリントし、Ｃｙ３で標識したトランスフェリンでテストした。Ｈｙｐｏｌは、本用途に好適であると考えられるイソシアネートでキャップしたＰＥＧプレポリマーである。両サンプルとも、３．３重量％Ｈｙｐｏｌ溶液（１：３：３＝プレポリマー：アセトニトリル：ＮＭＰ）として調製したもので、５％トレハロース（タンパク質保存性糖（protein preservative suger））、１００ｍｇ／ｍｌＩｇＧ（タンパク質フィラー）、０．５％グリセリン（湿潤剤）および０．８ｍｇ／ｍｌ抗トランスフェリン抗体（陽性）または１ｍｇ／ｍｌウシＩｇＧ（陰性）のいずれかを含んでいた。

（プリンティング）
Ｃａｒｔｅｓｉａｎアレイプリンティングシステム（ＣａｒｔｅｓｉａｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）および内径３００ミクロンのガラスキャピラリーピン（ＨｕｍａｇｅｎＦｅｒｔｉｌｉｔｙＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）を用いてプリンティングを行った。直径およそ３１０ミクロンのヒドロゲルスポットをプリントした。抗トランスフェリン抗体でのプリントには３本のピンを使用し、ブランクでのプリントには１本のピンを使用した。各ピンでスポットまたはヒドロゲルセル１０個ずつを作製した（ウェル１つにつき１スポット）。プリント終了後、湿度および温度を制御した硬化チャンバー内で相対湿度９０％、温度２０℃で２時間にわたってチップを硬化した。

（ハイブリダイゼーションおよび洗浄）
プリントしたスポットを含む全てのウェルにＣｙ３で標識したトランスフェリン１．５μｌを充填した後、底に純水を入れることによって高湿度に保たれた密閉した箱内に、バイオチップを２時間置いた。いずれのウェルにおいても、膜を通した濡れは認められなかった。次いで、バイオチップを、その下面の圧力を約２０インチ（約５０ｃｍ）Ｈｇにまで下げる真空ステーションに置き、１０％ＴｒｉｔｏｎＰＢＳ溶液で洗浄した。ほとんどのウェルにおいて、洗浄液は５分足らずのうちに抜き取った。

（画像の取得）
マイクロウェルバイオチップの蛍光を測定するために、ＣＣＤカメラを用いて電荷結合素子スキャナーを組み立てた。チップの現行の寸法では、従来のマイクロアレイレーザースキャナーで走査することも可能であるが、ＣＣＤカメラの方がチップの焦点深さ、厚さおよび幅の点でより融通性がある。採用した本発明の実施形態では、その真上にＣＣＤカメラを設置した状態の可動式載物台の上にチップを載置する。ハロゲン電球によって供給される励起光はダイクロイックミラーを貫通し、放出光がＣＣＤによって集められる。ダイクロイックミラーをセットし、Ｃｙ３蛍光色素範囲のデータを集める。その他の各種ダイクロイックミラーに代えてカメラにセットすることもでき、その結果広範囲の色素からの選択、例えばフルオレセインＣｙ５などの選択が可能になる。載物台は、手で動かすか、またはカメラのソフトウェアの異なる走査座標のプログラミングを通して動かすことができる。焦点、カメラの感度およびカメラの露光量は必要に応じて変える。カメラと載物台とが互いに直交するように適切に位置決めをすることによって、ウェルの壁が光路を妨げることなく、マイクロウェルバイオチップ１１のウェルの中を直接走査することが可能である。

（トランスフェリン抗体アッセイによるマイクロウェルバイオチップのレーザースキャニング）
実施例２のバイオチップを、ＰａｃｋａｒｄＢｉｏｃｈｉｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（商標）などのレーザースキャナーでも走査した。このスキャナーでも、抗トランスフェリン抗体を用いてプリントした各ウェルに関しては、高レーザーパワーでシグナルを傍受したがブランクのウェルに関してはシグナルの傍受はなかった。

要約すると、小型化を図った本デバイスの新規設計によって、マイクロタイタープレートで現在行われているアッセイに匹敵するアッセイを実施することが可能なマイクロチップサイズのデバイスが提供される。より詳細には、マイクロチップ上でアレイをなしている実質的に全てのスポットを、同じテスト溶液に暴露することが必要とされる場合とは全く異なり、別個のウェルまたは別個のウェル群に異なるテスト溶液を適用することができため、使用時に大いに融通がきくことになる。このような小型化は、マイクロウェルの底部に疎水性微孔質膜を存在させることと、上記膜上の所望の位置に正確に配置した、生物学的捕捉剤を固定化してプローブとして使うことができる特別のヒドロゲルポリマーとを組み合わせることという、独自の組合せによって可能になる。その結果、それぞれのウェルで行うアッセイではほんの少量のテスト水溶液しか必要にならず、一方、排液、洗浄および画像取得はアレイ全体を１つのユニットとして実施することができる。

本発明を、現在発明者等が知りうる発明を実施するための最良の形態を構成する特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、本明細書に添付の請求の範囲に記載の発明の範囲を逸脱しないかぎり、当業者には明らかであろう様々な変更および修正を加えることができることを理解すべきである。例えば、当然のことながら、所望の数のウェルをこのようなマルチウェルチップに組み込むことができ、通常その数は、業界で利用できる自動装置および規格統一によって左右されるにすぎない。ほとんどの例では、ただ１つのヒドロゲルのスポットが各ウェルの微孔質膜上に配置されるが、例えば特許文献１８に記載されるような複合的な環境の場合は、排液を達成し得る実質的な面積が各ウェルに残っている限り、多数のスポットを使用することができよう。本明細書で先に触れた参考文献に開示されるような種々のプレポリマーヒドロゲルを使用することもできる。光学的画像の検出は蛍光リポーターシステムなどによって実施されるのが好ましいが、その他のリポーターシステム、放射性リポーターであっても使用することができる。本明細書で先に触れた全ての米国特許の開示を、特に参照によって本明細書に組み込むものとする。

請求の範囲の個々の要点については、添付の請求の範囲に記載されている。

本発明の各種特徴を実施したマイクロウェルバイオチップを示す斜視図である。図１のバイオチップを示す拡大断面図である。

Claims

溶液を保持し、前記溶液を、アッセイの一部として固定化した生物学的材料と反応させるための生物学的アッセイデバイスであって、前記デバイスが、
一群のウェルが形成された固相プレートであって、前記一群のウェルはプレートを完全に貫通しており、前記ウェルの壁は実質的に液体不浸透性であるプレートと、
前記各ウェルの底部を閉じる、平均孔径が１μｍ以下である微孔質材料と、
複数の前記ウェルの各々の微孔質底部の上面に結合している少なくとも１つの、実質的に半球形のポリマーのスポットであって、前記スポットが、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含むイソシアネート官能性プレポリマーから形成された架橋ヒドロゲルポリマーを含み、前記ヒドロゲルが、前記ウェルに供給される水溶液によって接触可能となるように前記ポリマーの上または内部に固定されている生物学的材料を有し、前記の実質的に半球形のポリマーのスポットが、インキュベーションおよび／またはハイブリダイゼーションの後に、排出を行うことができる十分な部分を残した状態で、各ウェルの底部表面の一部分のみを覆うポリマーのスポットと
を含むことを特徴とするデバイス。
前記微孔質材料はシートの形態であり、このシートは前記プレートの下面に融着され、前記ウェルの各々に整合する領域を除き、シート全体にわたってその材料を不透過性にすることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
前記一群のウェルが規則的なアレイを形成するように配置され、かつ、前記複数のウェルの少なくとも一部が異なる生物学的材料を含み、かつ、前記生物学的材料が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または生細胞を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のデバイス。
前記微孔質材料が、疎水性である、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレンまたはポリエステルスルホンから形成される高分子膜を含み、前記微孔質とは、前記微孔質材料の下面に真空が適用されるまで前記ウェルに供給される水溶液がウェルに残留するようなものであり、前記プレートが、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンまたはそれらの組合せから形成され、かつ、２ｍｍを超えない均一な厚さを有し、前記微孔質材料が、前記プレートの下面に融着され、前記ウェルと整合する領域を除きその材料全域を不浸透性にさせることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
アッセイの一部としてテスト溶液に暴露される固定化した生物学的材料を保持するためのデバイスを作製する方法であって、前記方法が、
一群の孔が形成された平坦なプレートであって、前記孔は前記プレートを完全に貫通し、かつ、規則的なパターンで配置されているプレートを提供する工程、
前記プレートの下面に、平均孔径が１μｍ以下である微孔質材料の疎水性膜のシートを結合させて各孔の底部を閉じ、それによって複数のマイクロウェルを作製する工程、
前記ウェルに供給される溶液が前記膜を通して拡散することを防ぐための防壁を形成するような方法で、各孔の周囲を囲む領域において前記膜のシートを前記プレートの下面に結合させる工程、および
前記ウェルの底部表面積の微小部分のみを覆い、ウェルの壁と接触しない半球形のスポットを重合し、そのようなスポットを形成するような方法で、少なくとも複数の前記ウェルの各々のほぼ中心において、膜の上部表面へ、少なくとも１つの微小滴の、イソシアネート官能性ヒドロゲル材料のプレポリマーを適用し、それによって前記膜の下面に真空を適用することで各ウェルの底部の疎水性膜を通して水溶液の排出が達成できる工程
を含むことを特徴とする方法。
生物学的材料を、重合性微小液滴の一部として固定化するように、前記液滴と結合させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
前記プレートの下面への前記微孔質材料の疎水性膜のシートの結合が、前記各孔を囲む領域において前記プレートの下面に高分子膜のシートを超音波圧接することによって、前記プレートに高分子膜のシートを融着させることによって実施され、前記スポットが、各ウェルの底部表面積の５０％未満を覆い、イソシアネート官能性ヒドロゲルと、前記ウェルに供給される溶液に暴露されるような方法で前記ヒドロゲルに結合された生物学的材料との混合物を含むことを特徴とする請求項５または６に記載の方法。
生物学的アッセイを実施する方法であって、前記方法が、
ａ）一群のウェルを有するプレートの形態をしたデバイスの複数のウェルにテスト溶液を導入するステップであって、微孔質材料が各ウェルの底部を閉じており、少なくとも１つのポリマーのスポットが前記複数のウェルの各々の微孔質底部の上面に結合しており、前記スポットが、前記ポリマーの上または内部に固定されている生物学的材料を有する架橋ヒドロゲルポリマーを含み、前記ウェルが排出を行うことができる十分な部分を残した状態で、各ウェルの底部表面の一部のみを覆うポリマースポットを含み、前記一群のウェルが規則的なアレイを形成するように配置され、前記複数のウェルの少なくとも一部が異なる生物学的材料を含み、前記微孔質材料が０．３〜１μｍの平均孔径を有し、前記微孔質とは、前記微孔質材料の下面に真空が適用されるまで前記ウェルに供給される水溶液がウェルに残留するようなものであるステップ、
ｂ）ハイブリダイゼーションおよび／または結合を行った後に、前記デバイスに真空を適用して前記ウェルから前記溶液を除去するステップ、
ｃ）前記各ウェルに光学的に活性な試薬を塗布するステップ、
ｄ）前記各ウェルからのアッセイの結果を光学的に検出するステップ
を含むことを特徴とする方法。