ES2718624T3

ES2718624T3 - Inmunoabsorbente y columna de inmunoafinidad de nanocuerpos de aflatoxina y método de preparación y uso del mismo

Info

Publication number: ES2718624T3
Application number: ES14887513T
Authority: ES
Inventors: Peiwu Li; Qi Zhang; Yanru Wang; Zhaowei Zhang; Xiaoxia Ding
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2019-07-03
Anticipated expiration: 2034-08-27
Also published as: SG11201605383RA; EP3124973A4; CN103861569A; JP2016536353A; CN103861569B; US20160318998A1; JP6092486B2; DK3124973T3; EP3124973A1; WO2015143834A1; US9631010B2; EP3124973B1

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoabsorbente y columna de inmunoafinidad de nanocuerpos de aflatoxina y método de preparación y uso del mismo.

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a un inmunoabsorbente y a una columna de inmunoafinidad de anticuerpos de cadena pesada de aflatoxina, así como el método de preparación y uso de los mismos.

Antecedentes técnicos

Las aflatoxinas, metabolitos secundarios producidos por Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, son compuestos naturales tóxicos que pueden provocar diversos daños a los seres humanos y al ganado. Hasta el momento, se ha descubierto más de 20 variedades de aflatoxinas, entre las que se incluye aflatoxina B1 (AFB¹), aflatoxina B2 (AFB²), AFG, y M1 (AFM¹). Entre estos, AFB¹tiene la toxicidad más fuerte. La toxicidad de AFB¹es 10 veces la del cianuro de potasio y 68 veces la del arsénico. A principios de 1993, la AFB¹se categorizó como uno de los químicos carcinogénicos más potentes conocidos por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer de la Organización Mundial de la Salud, es decir, carcinógeno de clase I. China es más gravemente contaminada por la aflatoxina, que puede existir incluso en diversos productos alimentarios y agrícolas, especialmente en maíz, cacahuete y sus productos. Por lo tanto, es significante reforzar la detección, especialmente la rápida detección, de aflatoxina para controlar la información sobre la salud de diversos productos alimentarios y agrícolas, de modo que pueda garantizar la seguridad alimentaria en China.

Los métodos existentes para la detección de aflatoxina incluyen cromatografía de capa fina, análisis instrumental y análisis inmunológico. La cromatografía de capa fina es un método común para la detección de aflatoxina en una fase temprana, que no requiere instrumentos especiales y se puede llevar a cabo en un laboratorio promedio. Sin embargo, la cromatografía de capa fina requiere una gran dosificación de reactivo y un procedimiento complicado, se ve gravemente interferida por otros componentes y tiene una mala precisión, de este modo, prácticamente no puede cuantificar con exactitud. Además, la cromatografía de capa fina provoca un peligro de contaminación grave a los experimentos y el entorno circundante y, de este modo, no es adecuada por una detección en el sitio. El análisis instrumental incluye principalmente espectrofotometría de fluorescencia y cromatografía líquida de alto rendimiento, que tienen las ventajas de una alta sensibilidad y una precisión preferente. Sin embargo, los métodos anteriormente mencionados requieren un alto grado de purificación de la muestra de aflatoxina. La tecnología de pretratamiento de la muestra tradicional, tal como extracción de líquido-líquido, extracción de fase sólida y microextracción de fase sólida, tiene un procedimiento de pretratamiento complicado y menos especificidad. En este caso, el establecimiento de un pretratamiento de muestra rápido y eficaz se ha vuelto el primer problema y cuello de botella de la detección y el análisis de la aflatoxina. La columna de inmunoafinidad es un nuevo tipo de tecnología de pretratamiento de muestras eficaz, que implementa el enriquecimiento y la purificación de sustancia diana en muestras complejas basándose en la unión reversible de especificidades de antígeno y anticuerpo. La columna de inmunoafinidad combinada con análisis cromatográfico de fase líquida, dispositivo de rápida detección de fluorescencia y método ELISA pueden usarse ampliamente con la detección de aflatoxina en productos agrícolas y alimentos.

Actualmente, la columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina se prepara principalmente acoplando anticuerpo tradicional (anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal) con micropartículas de gel de sefarosa y gel de sílice. FEI MA ET: "Preparation of an Immunoaffinity Column with Amino-Silica Gel Microparticles and Its Application in Sample Cleanup for Aflatoxin Detection in Agri-Products, Molecules 2013, 18(2), 2222-2235" estableció una columna de inmunoafinidad para la extracción selectiva de aflatoxinas en productos agrícolas. Específicamente, la columna de inmunoafinidad se desarrolló acoplando covalentemente anticuerpo 1C11 monoclonal frente a aflatoxinas con respecto a micropartículas de gel de amino-sílice y, a continuación, empaquetando estas en un cartucho

Puesto que la actividad del anticuerpo tradicional se degenera rápidamente durante su uso, es un problema técnico que la columna de inmunoafinidad disponible en el mercado solo puede usarse repetidamente durante un número limitado de veces. LIU ET AL: "Research on panning methods of Single-Domain in Heavy-Chain Antibody Fragments for Aflatoxin B1 From Non-Immune Library" vol.30,no 6,Nov,2011, Journal of Food Science and Biotechnology" comparaba la eficacia de dos estrategias de eluciones en la bioselección de biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos(HCAbs) de cadena pesada de único dominio frente a hapteno molecular, Aflatoxina B1 (AFB1). De acuerdo con la descripción textual y los datos de este artículo, Solo demuestra que reconocer AFB1-BSA o AFB1-OVA pero no puede reconocer BAS u OVA, No puede demostrar que sus clones de fase son capaces de reconocer específicamente AFB1.

Hasta el momento, aún no existe ningún informe relacionado con inmunoabsorbente ni columna de afinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina.

Sumario de la invención

La presente divulgación tiene por objeto proporciona un inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina y una columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina, así como métodos de preparación y uso de los mismos.

Para alcanzar realizar el objetivo de la presente divulgación, se adopta la siguiente solución técnica. Se proporciona inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina, caracterizado por que el inmunoabsorbente contiene vehículo de fase sólida y anticuerpo VHH de aflatoxina acoplado con el vehículo de fase sólida, en donde el anticuerpo VHH de aflatoxina es anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15, la secuencia de aminoácidos del mismo como se ilustra en SEQ ID NO:7 secuencia codificante de la misma como se ilustra en SEQ IDNO:8.

Según la solución técnica anterior, tres regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 tienen respectivamente secuencias de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 como se ilustra en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácidos de CDR2 como se representa en la SEQ ID NO:2 y secuencia de aminoácidos de CDR3 como se ilustra en la SEQ ID NO:3; y las tres regiones determinantes de la complementariedad de las mismas tienen respectivamente secuencias codificantes que comprenden la secuencia codificante de CDR1 como se ilustra en SEQ ID NO:4, secuencia codificante de CDR2 como se representa en la SEQ ID NO:5 y secuencia codificante de CDR3 como se representa en la SEQ ID NO:6.

Según la solución técnica anterior, el vehículo de fase sólida son micropartículas de gel de sefarosa o gel de sílice.

Un método de preparación de dicho inmunoabsorbente de anticuerpo VHH de aflatoxina, caracterizado por que, cuando el vehículo de fase sólida son micropartículas de gel de sílice, el método comprende las etapas de: pesar 1-5 g de micropartículas de gel de sílice y lavar las micropartículas de gel de sílice con agua pura y tampón fosfato de pH 6 alternativamente; suspender las micropartículas de gel de sílice en 5-25 ml de tampón fosfato de pH 6 ya agitar hasta que todas las micropartículas de gel de sílice estén suspendidas, para permitir la suspensión de las micropartículas de gel de sílice; disolver 2-10 mg de anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 en 1-5 ml de tampón fosfato de pH 6 y añadir gota a gota la solución resultante en la suspensión de micropartículas de gel de sílice; pesar 70-350 mg de carbodiimida y añadir rápidamente la carbodiimida en la suspensión de micropartículas de gel de sílice y hacer reaccionar con agitación a 4 °C durante 18-22 h, para proporcionar inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina con micropartículas de gel de sílice como el vehículo de fase sólida; o

cuando el vehículo de fase sólida es gel de sefarosa, el método comprende las etapas de: pesar 0,3-1 g de sefarosa y lavar la sefarosa repetidamente con 1 mM de solución HCI; suspender la sefarosa en 5-15 ml de tampón de acoplamiento, añadir 0,6-2 ml de anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 en la misma y hacer reaccionar la solución resultante con agitación durante 1-2 h a temperatura ambiente para proporcionar la suspensión de gel de sefarosa; filtrar la solución de anticuerpo en solución de gel de sefarosa que no está acoplada con el gel de sefarosa y lavar el gel de sefarosa con tampón de acoplamiento; añadir 0,1 M de tampón Tris- HCI de pH 8,0 y hacer reaccionar a temperatura ambiente durante 2 h; y lavar el gel de sefarosa alternativamente con 0,1 M de tampón Tris-HCI de pH 8,0 y 0,1 M de tampón Tris-HCI de pH 4,0, para proporcionar inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina con gel de sefarosa como el vehículo de fase sólida; siendo el tampón de acoplamiento 0,1 M de NaCO3 y 0,5 M de NaCl de pH 8,3.

Se proporciona columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina con inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina.

Un método de preparación de columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina, que comprende las etapas de: cargar el inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina en un tubo de extracción de fase sólida, añadir 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 en la misma y dejar que la solución resultante se precipite de forma natural; lavar con 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 almacenar la carga resultante en 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 que contiene 0,02 % en peso de azida de sodio, obteniendo, de este modo, columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina.

Un método de purificación y concentración de aflatoxina B1 comprendida en una solución de extracción de una muestra que usa la columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina, comprendiendo el método:

en primer lugar, aclarar la columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina con agua purificada, a continuación, añadir la solución de extracción de una muestra;

aclarar con agua purificada en donde después del drenaje del líquido completamente,

eluir con metanol y

recoger el eluato, el eluato se purifica y la extracción concentrada de la muestra que puede usarse directamente para cargarla a una máquina para su detección.

La presente divulgación tiene los siguientes efectos beneficiosos.

(1) Una concentración de inhibición del 50 % (CI⁵⁰) de anticuerpo VHH de aflatoxina B12014AFB-G15 de acuerdo con la presente divulgación frente a aflatoxina B1 es 0,66 ng/ml y reactividad cruzada de la misma frente a aflatoxina B2, G1, G2 y M1 son respectivamente el 22,6 %, 10,95 %, 32,1 % y 26 %. Una capacidad de columna de la columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina preparada de acuerdo con la presente divulgación se encuentra en un intervalo de 500-600 ng y una recuperación estándar de carga de aflatoxina B1 de la misma se encuentra en un intervalo del 80-100 % en peso.

(2) La columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina de acuerdo con la presente divulgación tiene las ventajas de estabilidad deseable, termoestabilidad, resistencia ácida y alcalina y resistencia a reactivo orgánico. La columna de afinidad tiene una larga vida útil, puede usarse repetidamente durante múltiples veces y puede usarse para purificar y concentrar la solución para la extracción de una muestra antes de su detección.

(3) El anticuerpo VHH de aflatoxina de acuerdo con la presente divulgación se obtiene mediante ingeniería genética y tiene las ventajas de bajos costes y fácil preparación. En este caso, la columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina preparada con dicho anticuerpo VHH de aflatoxina es más ventajosa en comparación con una columna de afinidad de anticuerpos VHH convencional.

Descripción detallada de las realizaciones

Ejemplo 1: Establecimiento de biblioteca de genes de anticuerpo VHH de aflatoxina y preparación del anticuerpo VHH.

1. Se llevó a cabo inmunización animal.

Se adquirió una alpaca macho de dos años de edad y antígeno para la inmunización a aflatoxina B1 (AFB1-BSA, fabricado por Sigma company). Se emulsionaron 200 pg de antígeno de aflatoxina B1 con adyuvante incrompleto de Freund y la alpaca se inyectó con la emulsión resultante subcutáneamente en varios sitios. La alpaca se inmunizó cada tres semanas y se tomaron muestras de sangre de la vena desde el 7° día hasta el 10° día después de cada inmunización. Se midió un título del suero mediante un método ELISA indirecto. Se seleccionó una inmunización con el título más alto y se tomó una muestra de 10 ml de sangre, de la cual se extrajo ARN total.

2. Se estableció una librería de ADNc.

(1) Se extrajo ARN total. Se seleccionó una inmunización con el título más alto. Se tomó una muestra de 10 ml de sangre de la alpaca del 7° día hasta el 10° día después de la inmunización, de la cual se extrajo el ARN total. El ARN total en la muestra de sangre de la alpaca se extrajo con un sistema de aislamiento de ARN total de LeukoLOCK fabricado por Life Technology Company.

(2) Se llevó a cabo la síntesis de ADNc. Se llevó a cabo transcripción inversa realizada siguiendo una instrucción de transcriptasa inversa de Promega company, con el ARN total obtenido desde la parte superior (1) como molde y oligo (dT)15 como cebador, para sintetizar una primera cadena de ADNC y obtener una biblioteca de ADNc.

3. Se estableció una biblioteca de genes de anticuerpos VHH de aflatoxina.

(1) Se llevó a cabo amplificación de PCR para obtener genes de dominio variable de anticuerpos de cadena pesada de la alpaca, es decir, genes VHH, con ADNc sintetizado de acuerdo con la anterior sección 2 como molde y con R1 y F o R2 y F, como cebador. 2 pl de ADNc, 5 pl de tampón de 10XPCR, 2 pl de 50 mM de MgSO4, 1 pl de 10 mmol/l de dNTP, 1 pl de 10 pmol/l de cebador F, 1 pl de 10 pmol/l de cebador R1 (o R2), 0,1 pl de polimerasa de ADN y 37,9 pl de agua pura estéril se mezclaron con formación de vórtice uniformemente, para proporcionar 50 pl de solución mezclada. Después de una breve centrifugación de la solución mezclada resultante, se llevó a cabo reacción por amplificación de PCR en condiciones de reacción que incluyen desnaturalización a 94 °C durante 2 min y posterior desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s, extensión a 68 °C durante 1 min y 30 circulaciones y, a continuación, extensión a 68 °C durante 5 min.

R1 fue 5-CGGCGCACCTGCGGCCGC ATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3' (SEQ ID NO:11), R2 fue 5'-CG-GCGCACCTGCGGCCGC GTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3' (SEQ ID NO:13) y F fue 5'-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3' (SEQ ID NO:12), en la que las partes subrayadas de las secuencias de cebador fueron homólogas con el vector (his) pCANTAB 5E. Se llevaron a cabo 4 veces de reacción de amplificación de PCR, con R1 y F como el cebador y 6 veces de reacción de amplificación de PCR, con R2 y F como el cebador. Se separó producto de PCR resultante mediante 0,7 % electroforesis de gel de agarosa y se purificaron y recuperaron fragmentos de ADN de 450 pb con un kit.

(2) Se construyó vector (his) pCANTAB 5E. Se llevó a cabo amplificación de PCR de fragmentos de ADN desde Sfi I a Not I sobre plásmido de vector pCANTAB5E, con plásmido de vector pCANTAB5E como molde, p5E SfiI-F: 5'-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3' (Sfi I, (SEQ ID NO:9) como cebador corriente arriba y p5E N-P-H-R: 5' GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTTTTC-3' (SEQ ID NO:10) como cebador corriente abajo, para proporcionar fragmento p5E-his. Posteriormente, el fragmento p5E-his se digirió mediante enzima Sfi I, seguido por enzima PspoMI, para proporcionar p5E-his(Sfi I/PspoMI) con extremo cohesivo; y el plásmido de vector pCANTAB5E se digirió mediante enzima Sfi I, seguido por enzima Not I, para proporcionar p5E (Sfi I/Not I) con extremo cohesivo. El p5E-his (Sfi I/PspoMI) con extremo cohesivo y el p5E (Sfi I/Not I) con extremo cohesivo se ligaron, para proporcionar vector (his) pCANTAB 5E.

(3) El pCANTAB 5E (his) se trató mediante digestión de enzima doble. Se llevó a cabo la digestión de enzima Sfi I. Se preparó solución de reacción de acuerdo con el siguiente sistema: 30 ql del vector pCANTAB 5E (his), 1 ql de Sfi I, 10 ql de 10xM de tampón y la solución total se cargó con ddhbO hasta que un volumen del mismo alcanzó 100 ql. La solución de reacción se incubó en baño de agua a 50 °C durante 2 h y el producto resultante se recuperó mediante kit de purificación de ADN de gel de agarosa.

Se llevó a cabo la digestión de Not I. Se preparó solución de reacción de acuerdo con el siguiente sistema: 30 ql de producto recuperado de digestión de enzima única de Sfi I de pCANTAB 5 E (his), 1 ql de Not I, 10 ql de 10xH de tampón y la solución total se cargó con ddH²O hasta que un volumen del mismo alcanzó 100 ql. La solución de reacción se incubó en baño de agua a 37 °C durante 4 h y el producto resultante se recuperó mediante kit de purificación de ADN de gel de agarosa.

(4) Se ligó el gen VHH con vector pCANTAB 5 E (his) tratado mediante digestión de enzima doble. Se llevó a cabo una ligación de In-Fusion de acuerdo con el siguiente sistema: 120 ng de vector pCANTAB 5 E (his) tratado con digestión de enzima doble de Sfi ¡/Not, 40 ng de genes VHH, 2 ql de tampón de 5x de In-Fusion, 1 ql de enzima de In-Fusion y la solución total se cargó con ddH²O hasta que un volumen del mismo alcanzó 10 ql. La solución de reacción se incubó en baño de agua a 37 °C durante 15 min y, a continuación, en baño de agua a 50 °C durante 15 min. La solución resultante se colocó en helo inmediatamente después de los baños de agua y se mantuvo durante 5 min. En la solución resultante se añadieron 40 ql de tampón de TE. El producto resultante se recuperó mediante kit de purificación de ADN de gel de agarosa y se mantuvo a -20 para su uso posterior.

(5) Se llevó a cabo la electroporación de producto de ligación. En 50 ql de células de electroporación TG1 de E. coli se añadieron 5 ql de dicho producto de ligación. La mezcla resultante se mezcló uniformemente y se añadió en una cubeta de electroporación de hueco de 0,1 cm preenfriada (fabricada por Bio-RAD). La cubeta de electroporación se mantuvo en huelo durante 10 min y se puso, posteriormente en un electroporador para su electroporación. Las condiciones de electroporación incluían 1,8 kV, 200 w y 25 qF. Se añadió 1 ml de medio de fluido 2YT en la cubeta de electroporación inmediatamente después de la electroporación. Después de pipetear arriba y abajo, la mezcla resultante se transfirió en un tubo de agitación de 15 ml esterilizado y limpio. La mezcla se agitó lentamente a 37 °C durante 1 h para la revitalización de las bacterias. Se diluyeron en serie 2 ql de cultivo bacteriano y se cultivó en placas sobre placas LB con ampicilina. Las placas se colocaron boca abajo a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, la capacidad de biblioteca se calculó recontando el número de colonias bacterianas.

(6) Se lleva a cabo el rescate de la biblioteca de genes de anticuerpos VHH de aflatoxina. Se llevó a cabo 10 veces la electroporación anteriormente mencionada. El cultivo bacteriano revitalizado se transfectó en 200 ml de medio SB y se agitó a 250 rpm a 37 °C hasta que una DO⁶⁰⁰de la misma fue de 0,5. Se añadió 1 ml de 1x1012pfu de fago auxiliar M13KO7 en el cultivo de suspensión bacteriano. Después, el cultivo resultante se mantuvo en posición a 37 °C durante 1 h, se agitó adicionalmente durante 2 h. Se añadió kanamicina en el cultivo resultante hasta que una concentración de kanamicina era de 70 qg/ml. El cultivo resultante se agitó durante la noche. Al día siguiente, el cultivo de suspensión bacteriano resultante se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante resultante se transfirió en una botella de centrifugado estéril y se añadió con 1/4 de volumen de 5xPEG/NaCl, se mantuvo en posición sobre hielo durante 2 h y, a continuación se centrifugó a 12.000 rpm durante 20 min a 4 °C. El precipitado resultante se disolvió en 10 ml de solución de resuspensión estéril (tampón PBS que contenía 1 inhibidor de xproteinasa, 0,02 % de NaN3 y 0,5 % de BSA) para obtener la biblioteca de genes de anticuerpos de VHH de aflatoxina rescatada por el fago.

4. Selección de anticuerpo VHH de aflatoxina B1.

Se recubrieron placas ELISA respectivamente con AFB¹-BSA (1 qg/pocillo) y 3 % de solución BSA-PBS (usado como control negativo) y se mantuvieron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se descartó el tampón de recubrimiento. Las placas se lavaron con PBST 3 veces y se bloquearon con 3 % de polvo de leche desnatada durante 1 h. Las placas se lavaron con PBST 3 veces y se añadieron 50 ql de la librería de genes de anticuerpos VHH de aflatoxina en cada pocillo recubierto con AFB¹-BSA y, a continuación se incubaron a 37 °C durante 1 h. La placa se lavó con PBST 10 times y se añadieron 100 ql de 100 ng/ml de solución de AFB¹en cada pocillo. La placa se luyó agitando a temperatura ambiente (20 °C-30 °C) durante 30 min. El eluato se transfirió a los pocillos recubiertos con 3 % de solución de BSA-PBS. La placa se incubó la placa a 37 °C durante 1 h (para retirar la adsorción no específica). Después de la incubación, se tomó el sobrenadante para infectar 2 ml de cultivo bacteriano de TG1 que se cultivó en una fase logarítmica y la infección se mantuvo a 37 °C durante 20 min. Se tomaron respectivamente 1 ql y 10 ql del cultivo bacteriano infectado y se colocaron sobre placas de LB-ampicilina. Las placas de LB-ampicilina se mantuvieron en posición en un incubador a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, el título de fago en el eluato se determinó mediante recuento del número de colonias sobre las placas. El cultivo bacteriano TG1 infectado restante se transfirió en 6 ml de medio SB, en el que se añadieron 1,5 pl de 100 mg/ml de ampicilina, se agitó a 37 °C durante 1 h y se complementó con ampicilina para alcanzar una concentración final de 50 pg/ml; se agitó adicionalmente durante 1 h, se añadió 1 ml de auxiliar de fago M13KO7 (1 x1012pfu/ml), y se mantuvo en posición a 37 °C durante 30 min. El cultivo bacteriano se transfirió, a continuación, en 100 ml de medio SB, se añadieron 46 pl de ampicilina (100 mg/ml), se agitó adicionalmente durante 2 h, complementó con kanamicina para alcanzar una concentración final de 70 pg/ml y se agitó a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, se centrifugó el cultivo bacteriano a una velocidad de 10.000 rpm durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante de transfirió desde aquí y, a continuación se añadió 1/4 de solución de PEG/NaCl, se incubó sobre hielo durante 2 h y se centrifugó a una velocidad de 12.000 rpm durante 20 min a 4 °C. El sedimento se disolvió en 1 % de solución de BSA-PBS para obtener producto amplificado de la primera ronda de selección. El producto amplificado se mantuvo para su uso en la siguiente ronda. En posteriores rondas de selección, las concentraciones de antígeno de recubrimiento de AFB¹-BSA fueron respectivamente 0,5 pg/pocillo, 0,1 pg/pocillo y 0,05 pg/pocillo y los eluatos fueron respectivamente soluciones de AFB¹de 500 ng/ml, 100 ng/ml y 50 ng/ml.

5. Identificación de clones positivos

Después de 4 rondas de selección, se diluyeron en serie 2 pl de eluato y se tomaron para infectar cultivo bacteriano de TG1 que se ha cultivado en la fase logarítmica. El cultivo bacteriano de TG1 infectado se colocó sobre placas de LB-ampicilina. Las placas se colocaron boca abajo y se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, se recogieron al azar 30 clones y se añadió a cada uno 3 ml de medio de cultivo de SB-ampicilina y se agitaron para cultivarse a 37 °C durante 6-8 horas hasta que la DO⁶⁰⁰fue de aproximadamente 0,6. Se añadió al cultivo bacteriano 30 pl de fago auxiliar M13KO7 (1 x1012pfu/ml), se mantuvo en posición a 37 °C durante 30 min y, a continuación se agitó adicionalmente durante 2 h. El cultivo bacteriano se complementó con kanamicina para alcanzar una concentración final de 70 pg/ml y, a continuación se agitó para cultivarse durante la noche. Al día siguiente, el cultivo bacteriano se centrifugó a una velocidad de 10.000 rpm durante 15 min a 4 °C para obtener el sobrenadante del cultivo bacteriano.

Se preparó solución de AFB¹-BSA en solución de recubrimiento hasta que una concentración final alcanzó 0,2 pg/ml. La solución de AFB¹-BSA preparada se tomó para recubrir una placa ELISA de 96 pocillos, con 100 pl en cada pocillo. Mientras tanto, se tomó otra placa ELISA, con 32 pocillos de los mismos antes de recubrirse con un 3 % de BSA, a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, se descartó la solución y la placa se lavó con PBST 3 veces y se bloqueó con 3 % de polvo de leche desnatada-PBS durante 1 h. Se tomo solución madre estándar de AFB¹para preparar soluciones de trabajo respectivamente que tuvieran concentraciones de 100 ng/ml y 0 ng/ml con 10 % de metanol/PBS. Las soluciones de trabajo se añadieron respectivamente en pocillos recubiertos con antígeno de AFB¹-BSA. Se añadió en cada pocillo 50 pl del sobrenadante anteriormente mencionado del cultivo bacteriano. El ensayo con solución de trabajo de cada concentración se repitió 3 veces. 10 % de metanol/PBS y 50 pl del sobrenadante anteriormente mencionado del cultivo bacteriano se añadieron en cada pocillo recubierto con BSA como control y se mezcló uniformemente agitando suavemente la placa. La placa se colocó a 37 °C en el incubador para reaccionar durante 1 h. La placa se llevó con PBST 10 veces. Posteriormente, en cada pocillo se añadieron 100 pl de HRP/ANTI-M13, que se habían diluido con PBS en una proporción de 1:5000 y la placa se incubó a 37 °C durante 1 h. Le siguieron 6 lavados con PBST. Se añadieron 100 pl en cada pocillo de solución de sustrato de TMB recién preparada y la placa se incubó a 37 °C durante 15 min. Se añadieron 50 pl de 2 mol/l de H²SO⁴en cada pocillo para finalizar la reacción; y se midieron respectivamente los valores de DO⁴⁵⁰mediante un lector de microplacas. Los clones de fase positiva fueron aquellos que no adsorbieron BSA, pero adsorbían AFB¹-BSA y competían con la aflatoxina añadida. Se seleccionaron los pocillos que tenían tanto una adsorbancia como sensibilidad relativamente altas, obteniendo, de este modo, anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 con presentación de fagos.

La especificidad de anticuerpos de anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 medida mediante método ELISA competitivo indirecto se puede describir específicamente en términos de reactividad cruzada. El método es del siguiente modo. Cinco soluciones madre estándar distintas de AFB¹, AFB², AFG¹, AFG², y AFM¹se diluyeron respectivamente con un 10 % de metanol/PBS en gradiente con respecto a diez concentraciones de trabajo distintas, para determinar la especificidad del anticuerpo mediante método ELISA competitivo indirecto con las mismas condiciones. Se extrajeron sucesivamente las curvas ELISA competitivo de las cinco aflatoxinas y se calcularon las respectivas concentraciones de sustancia estándar de una relación de inhibición del 50 % representada por CI50. Se calcularon las reactividades cruzadas basándose en la siguiente fórmula: reactividad cruzada (%) = (AFB¹CI⁵⁰/ CI⁵⁰análogo) x100 %. En la fórmula, el análogo puede ser AFB², AFG¹, AFG²o AFM¹.50 % de concentración de inhibición de anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 frente a aflatoxina B1 obtenida fue de 0,66 ng/ml y las reactividades cruzadas de las mismas con respecto a aflatoxinas B2, G1, G2 y M1 fueron respectivamente del 22,6 %, 10,95 %, 32,1 % y 26 %. En este caso, el anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 fue un anticuerpo específico frente a aflatoxina B1. Los experimentos de tolerancia mostraron que la resistencia a disolventes orgánicos anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 se mejoró en un 35 % y la resistencia a elevada temperatura de la misma se mejoró en un 46 %, en comparación con anticuerpos de fuente murina convencionales y anticuerpos de fuente de conejo.

El cultivo bacteriano clonado seleccionado que contenía anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 se envió a Shanghai Sunny Biotechnology Co., Ltd. para su análisis secuencial, con cebador universal R1 para vector de fagos 5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 obtenido como se ilustra en SEQ ID No:7 y una secuencia codificante de la misma como se ilustra en SEQ ID No:8. Tres regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 tuvieron respectivamente secuencias de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 como se ilustra en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácidos de CDR2 como se representa en la SEQ ID NO:2 y secuencia de aminoácidos de CDR3 como se ilustra en la SEQ ID NO:3; y las tres regiones determinantes de la complementariedad de las mismas tuvieron respectivamente secuencias codificantes que comprenden la secuencia codificante de CDR1 como se ilustra en SEQ ID NO:4, secuencia codificante de CDR2 como se representa en la SEQ ID NO:5 y secuencia codificante de CDR3 como se representa en la SEQ ID NO:6.

6. Preparación y purificación de anticuerpo VHH de aflatoxina 2014AFB-G15.

(1) Se obtuvo cultivo bacteriano de TG1 capaz de secretar anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15. Se extrajeron plásmidos con un kit de miniextracción de ADN de Qiagen y se transformó en células competentes de HB2151. Las células compententes transformadas se cultivaron en placas sobre placas de LB-ampicilina.

(2) Se seleccionaron colonias de HB2151 que contenían plásmidos de anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 y se inocularon en un medio líquido de SB-ampicilina de 100 ml y se cultivaron a una velocidad de 250 rpm a 37 °C hasta que la DO⁶⁰⁰se encontraba en un intervalo de 0,5-0,8. Se añadieron 200 pl de 0,5 M de IPTG en el cultivo para su inducción durante la noche.

(3) El cultivo resultante después de la inducción se centrifugó a una velocidad de 10.000 rpm durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante se retiró cuidadosamente en un banco de operación estéril y se extrajo proteína soluble de suspensiones de células bacterianas mediante un método de choque osmótico, para obtener sobrenadante que contiene la proteína. El sobrenadante que contenía la proteína se filtró a través de una membrana de filtro de 0,22 pm y se dializó en tampón de equilibrado (que contenía 50 mM de fosfato, 300 mM de cloruro de sodio y 20 mM de imidazol; pH 7,4) al durante la noche.

(4) Se purificaron los anticuerpos mediante columna de níquel His60 (fabricada por Clontech Technology). En primer lugar, Se aclaró la columna de níquel con 10 volúmenes de tampón de equilibrado. El sobrenadante que contenía la proteína dializada en la anterior etapa (3) se cargó en la columna de níquel His60 (Clontech Technology) para la purificación de anticuerpos. Posteriormente, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de aclarado (que contenía 50 mM de fosfato, 300 mM de cloruro de sodio y 40 mM de imidazol; pH 7,4.). Por último, el anticuerpo 2014AFB-G15 se eluyó 10 volúmenes de columna de tampón de elución (que contenía 50 mM de fosfato, 300 mM de cloruro de sodio y 300 mM de imidazol; pH 7,4.). El eluato resultante se recogió y puso en una bolsa de diálisis, se dializó con 0,01 M de tampón fosfato de pH 7,4 durante de 2 a 3 días y, a continuación se concentró. El eluato concentrado se fraccionó y almacenó a -20 °C para su uso posterior.

Ejemplo 2: Preparación de inmunoabsorbente y columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina.

El inmunoabsorbente de acuerdo con el presente ejemplo contenía vehículo de fase sólida (micropartículas de gel de sílice) y anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 acoplado con el vehículo de fase sólida. El inmunoabsorbente se preparó específicamente de acuerdo con el siguiente método. Se pesó 1 g de micropartículas de gel de sílice de acrilamida y se pusieron en un matraz cónico y se lavaron alternativamente con agua pura y tampón fosfato de pH 6. Se midieron 5 ml de tampón fosfato de pH 6 para suspender las micropartículas y se obtuvo la suspensión de micropartículas. La suspensión de micropartículas se transfirió en una cubeta de agitación y se agitó con un agitador hasta que todas las micropartículas se suspendieron. Se disolvieron 2 mg de anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 en 1 ml de tampón fosfato de pH 6 y se añadieron gota a gota en la suspensión de micropartículas anteriormente obtenida. Se pesaron 70 mg de EDC y se añadieron rápidamente en la cubeta de agitación y se agitó a 4 °C durante 18-22 h, para proporcionar inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina.

La columna de inmunoafinidad de anticuerpos de VHH de aflatoxina se preparó de acuerdo con el siguiente método. Se cargaron 0,2 ml del inmunoabsorbente anteriormente obtenido en un tubo de extracción de fase sólida. Se añadieron 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 en el tubo de extracción de fase sólida para su precipitación natural. El precipitado resultante se lavó con 0,01 M de tampón fosfato de pH 6, y a continuación se mantuvo en 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 que contiene 0,02 % en peso de azida de sodio, para proporcionar una columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina. La columna de inmunoafinidad de anticuerpos de VHH de aflatoxina se mantuvo a 4 °C como reserva.

Ejemplo 3: Preparación de inmunoabsorbente y columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina.

El inmunoabsorbente de acuerdo con el presente ejemplo contenía vehículo de fase sólida (sefarosa) y anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 acoplado con el vehículo de fase sólida. El inmunoabsorbente se preparó

Claims

REIVINDICACIONES

1. Inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina, caracterizado por que el inmunoabsorbente contiene vehículo de fase sólida y anticuerpo VHH de aflatoxina acoplado con el vehículo de fase sólida, en donde el anticuerpo VHH de aflatoxina es anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15, siendo la secuencia de aminoácidos del mismo como se representa en la SEQ ID NO:7 y siendo la secuencia de aminoácidos del mismo como se ilustra en la SEQ ID NO:8.

2. El inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que tres regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 tienen respectivamente secuencias de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de CDR1 como se ilustra en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácidos de CDR2 como se representa en la SEQ ID NO:2 y secuencia de aminoácidos de CDR3 como se ilustra en la SEQ ID NO:3; y las tres regiones determinantes de la complementariedad de las mismas tienen respectivamente secuencias codificantes que comprenden la secuencia codificante de CDR1 como se ilustra en SEQ ID NO:4, secuencia codificante de CDR2 como se representa en la SEQ ID NO:5 y secuencia codificante de CDR3 como se representa en la SEQ ID NO:6.

3. El inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el vehículo de fase sólida son micropartículas de gel de sefarosa o gel de sílice.

4. Un método de preparación de inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que, cuando el vehículo de fase sólida son micropartículas de gel de sílice, el método comprende las etapas de: pesar 1-5 g de micropartículas de gel de sílice y lavar las micropartículas de gel de sílice con agua pura y tampón fosfato de pH 6 alternativamente; suspender las micropartículas de gel de sílice en 5-25 ml de tampón fosfato de pH 6 y agitar hasta que todas las micropartículas de gel de sílice estén suspendidas, para permitir la suspensión de las micropartículas de gel de sílice; disolver 2-10 mg de anticuerpo VHH de aflatoxina B1 2014AFB-G15 en 1-5 ml de tampón fosfato de pH 6 y añadir gota a gota la solución resultante en la suspensión de micropartículas de gel de sílice; pesar 70-350 mg de carbodiimida y añadir rápidamente la carbodiimida en la suspensión de micropartículas de gel de sílice y hacer reaccionar con agitación a 4 °C durante 18-22 h, para proporcionar inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina con micropartículas de gel de sílice como el vehículo de fase sólida; o

5. Columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina con inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina de acuerdo con la reivindicación 1.

6. Un método de preparación de columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina de la reivindicación 5, que comprende las etapas de: cargar el inmunoabsorbente de anticuerpos VHH de aflatoxina en un tubo de extracción de fase sólida, añadir 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 en la misma y dejar que la solución resultante se precipite de forma natural; lavar con 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 almacenar la carga resultante en 0,01 M de tampón fosfato de pH 6 que contiene 0,02 % en peso de azida de sodio, obteniendo, de este modo, columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina.

7. Un método de purificación y concentración de aflatoxina B1 comprendida en una solución de extracción de una muestra que usa la columna de inmunoafinidad de anticuerpos VHH de aflatoxina de acuerdo con la reivindicación 4, comprendiendo el método:

eluir con metanol y