ES2712779T3 - Nanopartículas para la administración dérmica y sistémica de fármacos - Google Patents

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Taher Nasser
Nour Karra
Amit Badihi
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Abstract

Una nanopartícula de ácido poli(láctico glicólico) (PLGA) que tiene un diámetro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, en la que dicha nanopartícula está asociada con al menos un agente seleccionado entre (i) un agente terapéutico hidrófilo que está conjugado o asociado en superficie de dicha nanopartícula, en la que el al menos un agente terapéutico hidrófilo está asociado con la nanopartícula a través de una o más fracciones conectoras, en la que el conector es una cisteína grasa que tiene una cadena de alquilo de al menos 10 átomos de carbono, y (ii) un agente terapéutico lipófilo que está contenido en dicha nanopartícula, en la que dicha nanopartícula está asociada adicionalmente con al menos un agente no activo, en la que el agente no activo es un alquil aminoácido, en el que la porción alquilo de dicho alquil aminoácido tiene entre 10 y 30 átomos de carbono y puede ser lineal o ramificada, saturada, semisaturada o insaturada.

Description

DESCRIPCION
Nanopartfculas para la administracion dermica y sistemica de farmacos
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en los terminos mas generales, a nanopartfculas basadas en un poUmero segun se define en la reivindicacion 1 para la administracion dermica o sistemica de compuestos terapeuticos.
Antecedentes de la invencion
La terapia dermica todavfa es un reto debido a la incapacidad para atravesar la piel y administrar unas cantidades suficientes de compuestos terapeuticos, tanto hidrofilos como lipofilos, en las capas profundas de la piel. La penetracion y la infiltracion de principios activos poco absorbidos puede mejorarse mediante la adicion de potenciadores espedficos a la formulacion, mediante el uso de sistemas de administracion coloidales, especialmente nanopartfculas. Los beneficios de las nanopartfculas en dichas aplicaciones han sido demostrados recientemente en varios campos cientfficos, pero se sabe poco sobre la potencial penetracion de las nanopartfculas a traves de las diferentes capas de la piel. Las nanopartfculas pueden ejercer efectos biologicos, simplemente en virtud de su tamano (100 nm o menos).
La encapsulacion usando sistemas nanoparticulados es una estrategia en creciente implementacion en el direccionamiento y la administracion de farmacos. Dichos sistemas se han propuesto para la administracion topica, para potenciar el transporte percutaneo en y a traves de la barrera cutanea. Sin embargo, el mecanismo mediante el cual dichas formulaciones particuladas facilitan el transporte en la piel sigue siendo ambiguo. Estos sistemas nanometricos presentan una gran area superficial, una propiedad que los hace muy prometedores como sistemas de administracion para la administracion dermica y transdermica. Su pequeno tamano de partfcula asegura un estrecho contacto con el estrato corneo, y la capacidad para controlar el diametro de partfcula puede modular la localizacion en las capas profundas de la piel [1].
En un estudio reciente, se uso una microscopfa de barrido de laser confocal (CLSM) para visualizar la distribucion de las nanopartfculas de poliestireno fluorescentes no biodegradables (diametros de 20 y de 200 nm) a traves de piel porcina. Las imagenes de la superficie revelaron que (i) las nanopartfculas de poliestireno se acumulaban preferentemente en las aberturas foliculares, (ii) esta distribucion aumentaba de una forma dependiente del tiempo, y (iii) la localizacion folicular estaba favorecida por el menor tamano de partfcula. Aparte de la captacion folicular, la localizacion de las nanopartfculas en los "surcos" de la piel era evidente a partir de las imagenes de la superficie. Sin embargo, las imagenes transversales revelaron que estas estructuras no foliculares no ofredan una ruta de penetracion alternativa para los vectores polimericos, cuyo transporte estaba claramente impedido por el estrato corneo [2].
Recientemente, las nanopartfculas lipfdicas han mostrado un gran potencial como vehnculos para la administracion topica de sustancias activas, debido principalmente al posible efecto de direccionamiento y de liberacion controlada en los diferentes estratos cutaneos. Se prepararon nanopartfculas lipfdicas cargadas con ketoprofeno y naproxeno mediante el uso de tecnicas de homogeneizacion a alta presion y aplicacion de ultrasonidos, y se caracterizaron por medio de una espectroscopfa de fotocorrelacion y una calorimetna diferencial de barrido. Se evaluo el comportamiento de la nanopartfcula en la piel humana, in vitro, para determinar la absorcion percutanea del farmaco (metodo de la celula de Franz) e in vivo para establecer la localizacion activa (tecnica de abrasion con esparadrapo) y las capacidades de liberacion controlada (modelo de eritema inducido por UVB). Los resultados demostraron que las partfculas eran capaces de reducir la penetracion del farmaco, aumentando simultaneamente la infiltracion y la acumulacion en la capa cornea. Se observo un prolongado efecto antiinflamatorio en el caso de las nanopartfculas cargadas con farmaco con respecto a la solucion de farmaco. Las pruebas tanto directas como indirectas corroboran los informes tempranos sobre la utilidad de las nanopartfculas lipfdicas como portadores para la administracion topica, estimulando nuevas y mas profundas investigaciones en el campo [3].
Tambien se han propuesto nanocapsulas polimericas como portadores de agentes activos para su aplicacion topica. Entre las muchas ventajas de dichos sistemas de administracion esta la capacidad de la cubierta polimerica de conseguir la liberacion sostenida del principio activo y aumentar los compuestos sensibles, dando asf como resultado un efecto terapeutico mejorado de las formulaciones dermatologicas. Actualmente, numerosos productos cosmeticos disponibles comercialmente han incorporado nanopartfculas para la encapsulacion de la vitamina A, de extracto de rosa y de aceite de germen de trigo [4].
Otra publicacion muy reciente de Wu et al. [5] muestra que las nanopartfculas de poliestireno y de poli(metacrilato de metilo) no eran capaces de pasar mas alla de las capas mas superficiales de la piel, es decir, el estrato corneo, a las 6 horas de su aplicacion topica; incluso las nanopartfculas de poliestireno tan pequenas como de 30 nm no eran capaces de penetrar mas alla del estrato corneo. Por otro lado, el compuesto hidrofobo encapsulado en el interior de las nanopartfculas era liberado y capaz de difundir a traves de las capas mas profundas de la piel.
El hecho de que las nanopartfculas esten retardadas en la superficie de la piel puede ser una ventaja, dado que el principio activo puede ser liberado lentamente a lo largo de un periodo prolongado y difundir a traves de la barrera cutanea, mientras que las propias nanopartfculas no seran translocadas sistemicamente. Por lo tanto, los autores [5] sugieren que es poco probable que la penetracion de las nanopartfculas a traves de la piel intacta induzca un efecto sistemico.
No obstante, las autoridades sanitarias estan muy atentas a los potenciales efectos negativos que puedan ser inducidos por las nanopartfculas no biodegradables en y a traves de la piel despues de una aplicacion topica. De hecho, desde noviembre de 2009, los estados miembros de la union europea han adoptado una unica normativa para los productos cosmeticos: esta era de hecho, la primera legislacion nacional en incorporar normas relativas al uso de nanomateriales en cualquier producto cosmetico [6]. Segun esta normativa, a cualquiera que desee contribuir con nuevos nanomateriales que contienen un producto se le requerira la distribucion de la informacion sobre seguridad a la Comision Europea antes de su entrada en el mercado. Debena acentuarse que estas preocupaciones son relativas al uso de nanopartfculas no biodegradables, mientras que no se espera que el uso de nanopartfculas que seran degradadas en la piel a lo largo de un periodo de tiempo razonable desencadene ningun efecto adverso, especialmente si los productos de degradacion son seguros.
En los anos 70 se sugirieron los polfmeros biodegradables como materiales de administracion de farmacos apropiados que evitan el requisito de la eliminacion del polfmero [7]. Los poliesteres alifaticos tales como poli(£-caprolactona) (PCL), poli(3-hidroxibutirato) (PHB), acido poliglicolico (PGA), acido polilactico (PLA) y sus copolfmeros con acido glicolico, es decir, poli(D,L-lactida-coglicolido) (PLGA) [8-11], han sido usados ampliamente para la formulacion de dispositivos de liberacion controlada. La razon por la cual el PLA y el PLGA se usan ampliamente en la preparacion de micro y de nanopartfculas se basa en el hecho de que no son toxicos, son bien tolerados en el cuerpo humano, son biodegradables y biocompatibles [12-13]. El PLA y el PGLA son polfmeros aprobados por la FDA para inyecciones subcutaneas e intramusculares.
El proceso de degradacion del PLGA, tambien conocido como erosion volumetrica, se produce por la escision autocatalftica de los enlaces ester a traves de una hidrolisis espontanea en oligomeros y monomeros de acido D,L-lactico y glicolico [14]. El acido lactico entra en el ciclo de los acidos tricarboxflicos y es metabolizado y eliminado en forma de CO2 y agua. El acido glicolico es excretado sin modificar en la orina, o entra en el ciclo de Krebs y tambien es eliminado en forma de CO2 y agua.
Recientemente se investigo la idoneidad de las nanopartfculas de acido polilactico biodegradables (PLA, PM de 30.000), cargadas con colorantes fluorescentes como portadores para la administracion transepidermica de farmacos, en explantes de piel humana usando una microscopfa de fluorescencia, una microscopfa de barrido del laser con focal y una citometna de flujo [15]. Los resultados mostraron que las partfculas de PLA penetraban en el 50 % de los folfculos pilosos del vello, alcanzando una profundidad maxima correspondiente a la entrada de la glandula sebacea en el 12-15 % de todos los folfculos observados. La acumulacion de partfculas en los conductos foliculares estaba acompanada por la liberacion del colorante en la epidermis viable y su retencion en las glandulas sebaceas durante hasta 24 h. Los estudios cineticos tanto in vitro como en explantes de piel revelaron que se produda una desestabilizacion de las partfculas y una significativa liberacion del colorante incorporado tras el contacto con disolventes organicos y la superficie de la piel. Segun los autores, estos resultados sugieren que las partfculas basadas en polfmeros de PLA pueden ser los portadores ideales para un direccionamiento al folfculo piloso y a la glandula sebacea.
Referencias
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[19] Publicacion PCT n°WO 2010/091187
[20] Publicacion PCT n° WO 2004/084871
[21] Solicitud de patente de Estados Unidos n° US 2010/0247668
[22] Publicacion PCT n°. WO 2010/059253
El documento JP2010150151 desvela composiciones basadas en nanopartfculas que comprenden PLGA y acido hialuronico (= agente terapeutico activo) y un portador, que estan adaptadas para su aplicacion transdermica.
El documento JP2006321763A desvela nanopartfculas (nanocapsula; vease el resumen) basadas en polfmeros de PLGA-PEG, teniendo el PLGA un PM de 15.000-25.000 Da, siendo el tamano de las partfculas de 300 nm o menos hasta de 50 nm.
El documento JP2005213170A se refiere a composiciones cosmeticas basadas en nanopartfculas de PLGA, PLGA que tiene un PM de 15.000-25.000 Da, siendo el tamano de las partfculas de entre 50 y 250 nm (parrafos 1, 9, 13, 39-40) que contienen en las partfculas vitaminas liposolubles.
El documento US 7.807.188 desvela composiciones basadas en nanopartfculas de PLGA con un PM de 13.000 Da (ej. comparativo 3, 4).
El documento CN 101926775A desvela nanopartfculas de PLGA-PEG con un tamano de aproximadamente 290 nm, siendo el PM del PLGA de 8.000-500.000 da.
El documento JP2008024658A desvela nanopartfculas basadas en PLGA con un PM de 20.000 (PLGA 7520) y que tienen un tamano de 254 nm.
El documento US 2002/130430A1 desvela en los ejemplos 1,3, 4 nanopartfculas basadas en PLGA con un PM de 3.000 (5050d12a / tabla 2), una partfcula menor de 500 nm (tabla 4, entrada ms12; tabla 6, todas las ms21-22, 24­ 25) que contienen insulina o citocromo C.
Sumario de la invencion
La presente invencion se basa en una nueva metodologfa para la construccion de vehnculos terapeuticos, que por sf mismos o junto con varios agentes terapeuticos activos, tienen la capacidad de penetrar en la piel e inducir un efecto terapeutico. Cuando los vehnculos estan asociados con agentes activos, son capaces de administrar unas cantidades suficientes de los agentes, tanto hidrofilos como lipofilos, en las capas profundas de la piel, para inducir asf un efecto topico o sistemico. Aunque la invencion puede ser utilizada principalmente para la administracion de agentes terapeuticos a traves de la piel o de otras barreras tisulares, tambien puede ser utilizada para la administracion de agentes terapeuticos a traves de otras numerosas vfas de administracion, por ejemplo, oral, i.v., i.m, s.c., oftalmica, etc., como se divulga adicionalmente en el presente documento. Los vehnculos de la invencion son capaces de atravesar las membranas biologicas, proporcionando la capacidad de administrar simultaneamente mas de un agente en un sitio deseado, en particular agentes tanto hidrofobos como hidrofilos, y lo mas importante, son capaces de administrar las macromoleculas cuya administracion esta de otro modo impedida o no es posible. Como puede apreciarse, los sistemas de administracion nanoparticulados conocidos, tales como los liposomas y las nanoemulsiones, estan limitados en su capacidad, principalmente debido a que dichos sistemas no pueden incorporar unas concentraciones significativas de macromoleculas hidrofilas y/o potenciar su penetracion y tiempo de residencia prolongado en las capas superiores de la piel.
Los vehnculos de nanopartfcula de la invencion poseen un largo periodo de validez fisicoqmmica a lo largo de largos periodos de conservacion, en forma de polvos liofilizados que pueden mantener sus propiedades iniciales tras su reconstitucion con la adicion de agua purificada o esteril antes de su uso.
La invencion divulgada en el presente documento se basa en una nanopartfcula que puede usarse per se (es decir, sin agentes activos adicionales, en la que el efecto terapeutico esta representado por la propia partfcula), o puede ser modificada para que porte uno o mas agentes terapeuticos. La nanopartfcula de la invencion es capaz, por sf misma o comprendiendo agentes terapeuticos adicionales, de penetrar en una barrera tisular, por ejemplo, la piel, hasta al menos las 10 capas superficiales de la epidermis, hasta una profundidad de al menos 4-20 pm (micrometros). Las nanopartfculas se biodegradan en la capa de la piel en la que penetran, y por lo tanto, ademas del efecto que puedan ejercer mediante el agente terapeutico asociado, principalmente un efecto hidratante o humectante, proporcionan un tratamiento de la piel seca en el tejido penetrable por el acido lactico y el acido glicolico o unicamente el acido lactico durante un periodo de al menos 24 horas, 72 horas, e incluso durante un periodo de semanas.
El ambito de proteccion de la invencion es segun se define en las reivindicaciones.
Por lo tanto, en un primer aspecto de la invencion se proporciona una nanopartfcula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA) que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, en la que dicha nanopartfcula esta asociada con al menos un agente seleccionado entre un agente terapeutico hidrofilo conjugado o asociado en superficie de dicha nanopartfcula, y un agente terapeutico lipofilo contenido en dicha nanopartfcula
En algunas realizaciones, la invencion proporciona una nanopartfcula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA) que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, estando la nanopartfcula asociada en superficie con al menos un agente terapeutico hidrofilo.
En algunas realizaciones adicionales, la invencion proporciona una nanopartfcula de PLGA que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, conteniendo la nanopartfcula en la misma al menos un agente terapeutico lipofilo; a saber, la nanopartfcula puede atrapar o encapsular el agente terapeutico lipofilo.
Como comprendena una persona experta en la materia, el agente terapeutico puede estar asociado en superficie de la nanopartfcula o puede estar contenido en dicha nanopartfcula, como se explicara adicionalmente a continuacion. En algunas realizaciones, el agente terapeutico no esta contenido en las nanopartfculas, a saber, el nucleo o la matriz de las nanopartfculas esta esencialmente exento de dichos agentes terapeuticos.
En algunas realizaciones, el PLGA tiene un peso molecular promedio de entre 2.000 y 10.000 Da. En otras realizaciones, el PLGA tiene un peso molecular promedio de entre 2.000 y 7.000 Da. En otras realizaciones, el PLGA tiene un peso molecular promedio de entre 2.000 y 5.000 Da. Todavfa en algunas realizaciones adicionales, el PLGA tiene un peso molecular promedio de entre 4.000 y 20.000 Da, o de entre 4.000 y 10.000 Da, o de entre 4.000 y 5.000 Da. En otras realizaciones mas, el PLGA tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2.000, de aproximadamente 4.500, de aproximadamente 5.000, de aproximadamente 7.000 o de aproximadamente 10.000 Da. Segun se usa en el presente documento, la "nanopartteula" de la invencion es un portador particulado, una nanocapsula (NC) o una nanoesfera (NS), que es biocompatible y lo suficientemente resistente a una destruccion qmmica y/o ffsica, de forma que una cantidad suficiente de las nanopartfculas permanece sustancialmente intacta despues de la administracion en el cuerpo humano o animal y durante un tiempo suficiente para que sea capaz de alcanzar el tejido objetivo deseado (organo). Generalmente, las nanopartfculas tienen una forma esferica, que tiene un diametro promedio de hasta 500 nm. Cuando la forma de la partfcula no es esferica, el diametro se refiere a la mayor dimension de la partfcula.
En algunas realizaciones, el diametro promedio es de entre aproximadamente 10 y 50 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de al menos aproximadamente 50 nm.
En algunas realizaciones, el diametro promedio es de entre aproximadamente 100 y 200 nm. En otras realizaciones, el diametro promedio es de entre aproximadamente 200 y 300 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de entre aproximadamente 300 y 400 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de entre aproximadamente 400 y 500 nm.
En otras realizaciones, el diametro promedio es de entre aproximadamente 50 y 500 nm. En otras realizaciones, el diametro promedio es de entre aproximadamente 50 y 400 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de entre aproximadamente 50 y 300 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de entre aproximadamente 50 y 200 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de entre aproximadamente 50 y 100 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de entre aproximadamente 50 y 75 nm. En algunas realizaciones adicionales, el diametro promedio es de entre aproximadamente 50 y 60 nm.
Cada una de las nanopartfculas puede tener sustancialmente la misma forma y/o tamano. En algunas realizaciones, las nanopartfculas tienen una distribucion de los diametros tal que no mas de entre el 0,01 por ciento y el 10 por ciento de las partfculas tiene un diametro mayor del 10 por ciento por encima o por debajo del diametro promedio indicado anteriormente, y en algunas realizaciones, de forma que no mas del 0,1, del 0,2, del 0,4, del 0,6, del 0,8, del 1, del 2, del 3, del 4, del 5, del 6, del 7, del 8 o del 9 por ciento de las nanopartfculas tienen un diametro mayor del 10 por ciento por encima o por debajo de los diametros promedios indicados anteriormente.
El polfmero de PLGA es un copolfmero de acido polilactico (PLA) y de acido poliglicolico (PGA), seleccionandose el copolfmero, en algunas realizaciones, entre un copolfmero en bloque, un copolfmero aleatorio y un copolfmero injertado. En algunas realizaciones, el copolfmero es un copolfmero aleatorio.
En algunas realizaciones, las nanopartfculas son del PLGA recogido en el Generally Recognized as Safe (GRAS) en las secciones 201 (s) y 409 del Federal Food, Drug, and Cosmetic Act, y estan aprobadas para su uso en sistemas microparticulados.
En algunas realizaciones, el peso molecular promedio de cada uno del PLA y del PGA, independientemente entre sf, segun estan presentes en el copolfmero, es de entre 2.000 y 20.000 Da. En algunas realizaciones, el monomero de PLA esta presente en el PLGA en unas cantidades en exceso. En otras realizaciones, la proporcion molar entre el PLA y el PgA se selecciona entre 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45 y 50:50. En algunas realizaciones, la proporcion molar entre el PLA y el PGA es de 50:50 (1:1).
En algunas realizaciones, la nanopartfcula esta formada por un copolfmero aleatorio de PLA y PGA equimolares, en la que el copolfmero tiene un peso molecular de al menos 4.500 Da, y esta en forma de una nanopartfcula que tiene un diametro promedio de entre 100 y 200 nm.
Las nanopartfculas de la invencion, o aquellas utilizadas segun la invencion, que por sf mismas tienen un efecto terapeutico (sin un agente activo adicional) se usan principalmente para fines de humectacion/hidratacion en los casos de un exceso de sequedad en la piel que acompanan a afecciones medicas tales como: dermatitis atopica y de contacto, psoriasis, eccema, trastornos tiroideos, ictiosis, esclerodermia, enfermedad de Sjorgen y otras.
Las nanopartfculas segun la invencion pueden usarse como tales para inducir al menos un efecto, por ejemplo, un efecto terapeutico, o pueden estar asociadas con al menos un agente, por ejemplo, un agente terapeutico, que es capaz de inducir, de potenciar, de detener o de disminuir al menos un efecto, a modo de tratamiento o de prevencion de afecciones o de enfermedades no deseadas en un sujeto. El al menos un agente (la sustancia, la molecula, el elemento, el compuesto, la entidad, o una combinacion de los mismos) puede seleccionarse entre agentes terapeuticos, es decir, agentes capaces de inducir o de modular un efecto terapeutico cuando son administrados en una cantidad terapeuticamente eficaz, y agentes no terapeuticos, es decir, que por sf mismos no inducen ni modulan un efecto terapeutico, pero que dotan a las nanopartfculas con una caractenstica seleccionada, como se divulgara adicionalmente a continuacion en el presente documento.
El al menos un agente terapeutico puede seleccionarse entre vitaminas, protemas, antioxidantes, peptidos, polipeptidos, lfpidos, carbohidratos, hormonas, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, vacunas y otros agentes profilacticos, agentes diagnosticos, agentes de contraste, acidos nucleicos, agentes nutraceuticos, moleculas pequenas (de un peso molecular de menos de aproximadamente 1.000 Da o de menos de aproximadamente 500 Da), electrolitos, farmacos, agentes inmunologicos, y cualquier combinacion de cualquiera de los mencionados anteriormente.
En algunas realizaciones, el al menos un agente es una macromolecula (con un peso molecular por encima de 1.000 Da), cuya administracion a traves de las capas de la piel no es posible de otro modo. Dichas macromoleculas pueden ser lipofilas.
En algunas realizaciones, el al menos un agente terapeutico se selecciona entre calcitonina, ciclosporina, insulina, dexametasona, palmitato de dexametasona, cortisona, prednisona y otros.
Para ciertas aplicaciones, el al menos un agente terapeutico se selecciona segun su peso molecular. Por lo tanto, el al menos un agente terapeutico puede seleccionarse para que tenga un peso molecular mayor de 1.000 Da. En otras realizaciones, el agente se selecciona para que tenga un peso molecular de no mas de 300 Da. En algunas realizaciones adicionales, el agente se selecciona para que tenga un peso molecular de entre 500 y 1.000 Da.
En algunas realizaciones, las nanopartfculas de la invencion pueden estar adicionalmente asociadas con un agente no activo. El agente no activo (agente no terapeutico) puede seleccionarse para modular al menos una caractenstica de la nanopartfcula, dicha caractenstica puede ser, por ejemplo, una o mas del tamano, la polaridad, la hidrofobicidad/hidrofilia, la carga electrica, la reactividad, la estabilidad qmmica, la velocidad de eliminacion, la distribucion, el direccionamiento y otras.
En algunas realizaciones, el agente no activo es sustancialmente una cadena carbonada lineal que tiene al menos 5 atomos de carbono, y puede tener o no uno o mas heteroatomos en la cadena carbonada lineal.
En algunas realizaciones, el agente no activo se selecciona entre polietilenglicoles (PEG) con unas longitudes de cadena variables, acidos grasos, aminoacidos, moleculas alifaticas o no alifaticas, tioles alifaticos, aminas alifaticas y otros. Los agentes pueden estar cargados o no.
En algunas realizaciones, el agente no activo es un aminoacido graso (un alquil aminoacido). En la invencion segun se reivindica, la porcion de alquilo de dicho alquil aminoacido tiene entre 10 y 30 atomos de carbono y puede ser lineal o ramificada, saturada, semisaturada o insaturada. En algunas realizaciones adicionales, la porcion de aminoacido de dicho alquil aminoacido puede seleccionarse entre los aminoacidos naturales o no naturales, y/o entre los aminoacidos alfa- y/o beta-.
En algunas realizaciones, la nanopartfcula puede no estar PEGilada, es decir, el agente no activo es diferente del PEG.
Por lo tanto, dependiendo de diversos parametros (que pueden ser terapeuticos o no terapeuticos) asociados con el al menos un agente, por ejemplo, terapeutico o no activo (siendo los parametros, por ejemplo, la solubilidad, el peso molecular, la polaridad, la hidrofobicidad/hidrofilia, la carga electrica, la reactividad, la estabilidad qmmica, la actividad biologica, y otros), el agente puede estar contenido (encapsulado) en dicha nanopartfcula, incluido en la matriz polimerica que forma la nanopartfcula y/o asociado qmmica o ffsicamente con la superficie (la totalidad de la superficie o una porcion de la misma) de la nanopartfcula. Para la aplicacion elegida, la nanopartfcula puede estar por lo tanto en forma de un nucleo/una cubierta (denominada en lo sucesivo en el presente documento tambien como nanocapsula), que tiene una cubierta polimerica y un nucleo que puede estar vacfo de un material activo o contener al menos un agente.
Alternativamente, las nanopartfculas tienen una composicion sustancialmente uniforme que no presenta una estructura caractenstica de nucleo/cubierta. Estas nanopartfculas se denominan en el presente documento nanoesferas (NS). En algunas realizaciones, la parte interna (el nucleo o la matriz interna) de las nanopartfculas esta desprovista del al menos un agente hidrofilo, pero puede contener un agente lipofilo dispersado o disuelto en el nucleo o en la matriz, a saber, el al menos un agente hidrofilo puede residir en, o estar asociado con, la superficie de las nanopartfculas.
En otras realizaciones, las nanopartfculas consisten esencialmente en PLGA.
Cuando se emplean las nanocapsulas (NC), el al menos un agente (activo) lipofilo puede estar contenido en el nucleo de las nanopartfculas (cavidad), por ejemplo, en una matriz oleosa, rodeado por una cubierta de PLGA del copolfmero.
En algunas realizaciones, al menos un agente terapeutico esta asociado en superficie de la nanopartfcula y se asocia al menos un agente terapeutico diferente para que este contenido en el nucleo de dicha nanopartfcula o en una matriz de dicha nanopartfcula.
En algunas realizaciones, las nanopartfculas son nanocapsulas que contienen al menos un agente hidrofobo (estando el agente contenido en un nucleo oleoso, y por lo tanto es lipofilo). Dependiendo de la aplicacion prevista en particular, el nucleo oleoso puede seleccionarse entre cualquier disolvente organico o medio oleoso (un material individual o una mezcla), dichos materiales pueden seleccionarse, de una forma no limitante, entre acido octanoico, acido oleico, tributirato de glicerilo, trigliceridos de cadena larga (tal como de soja), y otros.
Alternativamente pueden emplearse unas estructuras relativamente uniformes, por ejemplo, nanoesferas, en las que el al menos un agente puede estar incluido en la matriz de las nanopartfculas, por ejemplo, homogeneamente, dando como resultado una nanopartfcula en la que la concentracion del agente activo en la nanopartfcula es uniforme.
En algunas realizaciones, la modificacion de la superficie de las nanopartfculas (tanto de las nanocapsulas como de las nanoesferas) puede ser necesaria para potenciar la eficacia de las nanopartfculas en la administracion de un agente terapeutico. Por ejemplo, la carga superficial de las nanopartfculas puede ser modificada para conseguir una modificacion en la biodegradacion y en la eliminacion de las nanopartfculas. La porosidad del elemento polimerico de la partfcula (tanto del nucleo de la nanocapsula como de la matriz uniforme de la nanoesfera) tambien puede ser optimizada para conseguir una liberacion prolongada y controlada del agente terapeutico.
En otra manifestacion de la invencion, las nanopartfculas son modificadas para permitir la asociacion de las mismas con al menos un agente (terapeutico o no terapeutico, o de direccionamiento); la asociacion puede ser una asociacion qmmica, tal como un enlace covalente, un enlace electrostatico, una interaccion ionica, una interaccion dipolo-dipolo, una interaccion hidrofila, una interaccion de van der Waals, un puente de hidrogeno, o una asociacion ffsica de al menos una porcion del agente con la nanopartfcula. La asociacion ffsica puede ser tal que al menos una porcion del al menos un agente (o de una fraccion conectora asociada con el mismo) esta atrapada, incluida, adsorbida o anclada en el elemento de la nanopartfcula o en la superficie. En el presente documento, la asociacion ffsica se denomina en general "anclaje fisico".
Una nanopartfcula puede estar asociada con uno o mas de una diversidad de agentes, tanto terapeuticos como no terapeuticos. Por ejemplo, cuando se usan dos o mas agentes, pueden ser similares o diferentes. La utilizacion de una pluralidad de agentes en una nanopartfcula en particular puede permitir el direccionamiento a multiples objetivos biologicos o puede aumentar la afinidad por un objetivo en particular. Ademas, la nanopartfcula puede contener dos agentes, cada uno de los cuales tiene una solubilidad diferente - uno es hidrofobo (por ejemplo, en el nucleo) y el otro es hidrofilo (por ejemplo, en la cubierta o en la prolongacion exterior de la partfcula).
Puede seleccionarse la asociacion entre cada una de las nanopartfculas y los diversos agentes, basandose en la aplicacion prevista, para que sea labil, a saber, que experimente una disociacion en unas condiciones espedficas, o no labil. Normalmente, cuando el al menos un agente es un agente terapeutico, esta asociado en superficie de las nanopartfculas bien a traves de un(os) enlace(s) labil(es) o bien a traves de una o mas fracciones conectoras.
En algunas realizaciones, el al menos un agente es un agente terapeutico cuya asociacion con las nanopartfculas es a traves de una o mas fracciones conectoras, siendo la fraccion conectora bifuncional, a saber, que tiene una primera porcion (por ejemplo, hidrofoba) que es capaz de asociarse (de interaccionar) con la superficie de las nanopartfculas, y una segunda porcion (por ejemplo, hidrofila) que es capaz de asociarse con el agente terapeutico. La nanopartfcula asociada con una pluralidad de dichas fracciones conectoras se denomina en el presente documento como una "nanopartteula modificada", a saber, una nanopartfcula, segun se define, en la que al menos una parte de su superficie esta asociada con fracciones conectoras que son capaces de experimentar una asociacion con al menos un agente. No es necesario que la totalidad de la pluralidad de conectores que interactua con la superficie de las nanopartfculas este asociada con los agentes terapeuticos. Algunos pueden estar asociados con otros agentes no terapeuticos; otros pueden tener grupos terminales desnudos (no asociados con ningun agente). En algunas realizaciones, los conectores estan asociados con uno o mas agentes terapeuticos diferentes. La asociacion entre el conector y la superficie de la nanopartfcula se selecciona normalmente entre un enlace covalente, un enlace electrostatico, un puente de hidrogeno y un anclaje ffsico (no covalente) de al menos una porcion del conector en la superficie de la nanopartfcula. La asociacion entre el conector y el al menos un agente terapeutico se selecciona entre un enlace covalente, un enlace electrostatico y un puente de hidrogeno.
En algunas realizaciones, la fraccion conectora esta asociada con uno o ambos de (a) el al menos un agente terapeutico y (b) la superficie de la nanopartfcula a traves de un enlace covalente. En otras realizaciones, la asociacion entre el conector y la superficie de la nanopartfcula es a traves de un anclaje (por ejemplo, en la superficie de la nanopartfcula, y puede penetrar en el nucleo solido/oleoso de la nanopartfcula) de al menos una porcion del conector en la superficie de la nanopartfcula, con otra porcion del conector expuesta y que se extiende alejandose de la superficie de la nanopartfcula.
En algunas realizaciones adicionales, el conector esta unido covalentemente a dicho al menos un agente terapeutico. En algunas realizaciones, una o ambas de (a) la asociacion del conector con el agente terapeutico y (b) la asociacion del conector con la superficie de la nanopartfcula, es labil.
En algunas realizaciones, en la nanopartfcula que tiene ancladas (no covalentemente) en su superficie una pluralidad de fracciones conectoras, cada una de dicha pluralidad de fracciones conectoras esta unida covalentemente a al menos un agente; tanto el anclaje a la superficie como el enlace covalente son labiles.
La asociacion del conector y cualquiera de las nanopartfculas y el agente puede ser labil, a saber, el conector puede ser un conector facilmente escindible, que es susceptible de disociarse en unas condiciones que se encuentran in vivo. Por ejemplo, cuando las nanopartfculas de la invencion se emplean como sistemas de administracion de farmacos para aplicaciones cutaneas, topicas o sistemicas, despues de pasar en y a traves de, una o mas capas de la piel, el producto terapeutico puede ser liberado desde el conector o las nanopartfculas portadoras. Las asociaciones facilmente escindibles pueden ser tales que son escindidas por una enzima con una actividad espedfica o mediante una hidrolisis. Para las aplicaciones cutaneas, la asociacion entre el conector y el producto terapeutico, o entre las nanopartfculas y el conector, puede seleccionarse para que sea escindible por una enzima presente en una o mas capas del tejido cutaneo.
En algunas realizaciones, la fraccion conectora contiene un grupo acido carboxflico (para formar esteres) o un grupo tiol (para formar un puente de disulfuro).
En otras realizaciones, la fraccion conectora se selecciona segun la semivida de la asociacion escindible, a saber, la cantidad del producto terapeutico que se disocia del conector. En algunas realizaciones, la asociacion del conector con el producto terapeutico tiene una semivida de entre 1 minuto y 48 horas. En algunas realizaciones, la semivida es menor de 24 horas.
En algunas realizaciones adicionales, la fraccion conectora comprende un grupo funcional seleccionado entre -S-, -NH-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -C(=O)NH-, -C(=S)NH-, -OC(=O)NH-, -NH(=O)NH-, -S(=O)NH-, -S(=O)2NH- y otros.
En algunas realizaciones, el conector se selecciona entre polietilenglicoles (PEG) de unas longitudes de cadena variable. Los conectores de PEG tambien pueden ser empleados junto con otros conectores con el fin de eludir el sistema inmunitario y esquivar el ataque de las enzimas degradativas.
En algunas realizaciones, la fraccion conectora es un aminoacido graso (alquil aminoacidos), en el que la porcion alquilo tiene entre 10 y 30 atomos de carbono y puede ser lineal o ramificada, saturada, semisaturada o insaturada. La porcion de aminoacido puede seleccionarse entre los aminoacidos naturales o no naturales, y/o entre los aminoacidos alfa- y/o beta-. El grupo aminoacido del conector puede ser derivable un aminoacido seleccionado, sin limitacion, entre aminoacidos alfa y beta. En la invencion segun se reivindica, el conector es una cistema grasa que tiene una cadena de alquilo de al menos 10 atomos de carbono.
En algunas realizaciones adicionales, el conector es la oleilcisteinamida de la formula I:
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En algunas realizaciones, la fraccion conectora es un compuesto tiolado, y por lo tanto la nanopartfcula modificada es una nanopartfcula tiolada capaz de asociarse, por ejemplo, con macromoleculas (peso molecular mayor de 1.000 Dalton), con moleculas hidrofilas y con electrolitos. La asociacion entre la nanopartfcula tiolada y el agente puede ser a traves de un grupo activo del agente, dicho grupo puede ser un grupo funcional maleimida.
La presente invencion tambien proporciona una nanopartfcula polimerica que tiene en su superficie una pluralidad de agentes terapeuticos, estando cada agente asociado (unido) a dicha nanopartfcula a traves de una fraccion conectora, siendo las nanopartfculas de un material polimerico seleccionado entre acido polilactico (PLA), poli(lactoco-glicolido) (PLG), acido poli(lactico glicolico) (PLGA), poli(lactida), acido poliglicolico (PGA), poli(caprolactona poli(hidroxibutirato) y/o copolfmeros de los mismos. En algunas realizaciones, dicho material polimerico se selecciona entre PLA, PGA y PLGA. En algunas realizaciones adicionales, las nanopartfculas polimericas son de PLGA.
En algunas realizaciones, la fraccion conectora es oleilcisteinamida. En otras realizaciones, la nanopartfcula tiene las caractensticas ffsicas divulgadas anteriormente en el presente documento. En algunas realizaciones, la nanopartfcula es una nanopartfcula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA) que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de hasta 20.000 Da.
Las nanopartfculas de la invencion pueden usarse en la preparacion de composiciones farmaceuticas para uso medico. En algunas realizaciones, las composiciones se usan en procedimientos de tratamientos terapeuticos, a saber, en el tratamiento y/o la prevencion de trastornos cutaneos, de enfermedades oculares y de cualquier otra enfermedad que pueda ser tratable mediante las composiciones de la invencion.
La concentracion de las nanopartfculas en una composicion farmaceutica puede seleccionarse de forma que la cantidad sera suficiente para administrar una cantidad eficaz deseada de un agente terapeutico al sujeto, y segun el modo de administracion en particular seleccionado. Como se sabe, la "cantidad eficaz" para los fines del presente documento, puede ser determinada mediante consideraciones tales como las conocidas en la materia. La cantidad debe ser eficaz para conseguir el efecto terapeutico deseado, dependiendo, entre otros, del tipo y la gravedad de la enfermedad que se va a tartar y del regimen de tratamiento. La cantidad eficaz se determina normalmente en los ensayos clmicos apropiadamente disenados (estudios del intervalo de dosificacion) y la persona versada en la materia sabra como llevar a cabo apropiadamente dichos ensayos con objeto de determinar la cantidad eficaz. Como se sabe de forma general, la cantidad eficaz depende de una diversidad de factores que incluyen la afinidad del ligando por el receptor, su perfil de distribucion en el cuerpo, diversos parametros farmacologicos tales como la semivida en el cuerpo, los efectos secundarios no deseados, si los hubiera, y factores tales como la edad y el genero, y otros.
La composicion farmaceutica de la invencion puede comprender diversos tipos o tamanos de nanopartfcula, con unas propiedades de dispersion iguales o diferentes, utilizando unos materiales de dispersion iguales o diferentes. Las nanopartfculas tambien pueden usarse como sistemas de administracion de farmacos o bioactivos para el transporte de una amplia variedad de agentes terapeuticos por via topica, oral, mediante inhalacion, nasal o parenteral, en el sistema circulatorio despues de la administracion. Los sistemas de administracion de nanopartfculas de la invencion facilitan la administracion dirigida de farmacos y aplicaciones de liberacion controlada, potencian la biodisponibilidad del farmaco en el sitio de accion debido tambien a una disminucion en la eliminacion, reducen la frecuencia de dosificacion y minimizan los efectos secundarios.
En los terminos mas generales, el sistema de administracion de la invencion comprende:
(i) una nanoparffcula polimerica segun se divulga en el presente documento; y
(ii) al menos un agente asociado con dicha nanoparffcula, estando dicho al menos un agente opcionalmente asociado con dicha superficie a traves de una fraccion conectora.
En algunas realizaciones, el conector tiene una primera porcion anclada ffsicamente (no asociada covalentemente) a dicha superficie, y una segunda porcion asociada con dicho al menos un agente. En algunas realizaciones, la primera porcion anclada ffsicamente a dicha superficie es hidrofoba, y la segunda porcion asociada con dicho al menos un agente es hidrofila.
El sistema de administracion de la invencion es capaz de administrar el agente terapeutico a una velocidad tal que permite la liberacion controlada del agente durante al menos aproximadamente 12 horas, o en algunas realizaciones, al menos aproximadamente 24 horas, o en otras realizaciones, durante un periodo de 10-20 dfas. Como tal, el sistema de administracion puede usarse para una diversidad de aplicaciones tales como, sin limitacion, la administracion de farmacos, la terapia genica, el diagnostico medico, y para productos terapeuticos medicos para, por ejemplo, patologfas cutaneas, cancer, enfermedades transportadas por patogenos, enfermedades relacionadas con las hormonas, subproductos de reaccion asociados con el trasplante de organos, y otro crecimiento anormal de celulas o de tejidos.
Los sistemas de administracion normalmente se administran en forma de composiciones farmaceuticas, que comprenden el sistema y un portador farmaceuticamente aceptable. El portador farmaceuticamente aceptable puede seleccionarse entre vehmulos, adyuvantes, excipientes, y diluyentes, que estan facilmente disponibles para el publico. El portador farmaceuticamente aceptable se selecciona para que sea qmmicamente inerte con el sistema de administracion de la invencion o con cualquier componente del mismo, y aquel que no tenga unos efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.
La invencion proporciona composiciones formuladas para una diversidad de aplicaciones. En algunas realizaciones se proporcionan composiciones adaptadas para su administracion transdermica, por ejemplo, para la administracion de un producto terapeutico en el sistema circulatorio de un sujeto. En algunas realizaciones adicionales se proporcionan composiciones para su administracion topica. La composicion topica se emplea normalmente para la administracion de un agente terapeutico a traves del estrato corneo. En algunas realizaciones adicionales se proporcionan composiciones adaptadas para la administracion oral de un agente terapeutico. Adicionalmente se proporcionan composiciones adaptadas para la administracion oftalmica de un agente terapeutico. Las composiciones oftalmicas pueden ser administradas en forma de gotas oculares o a traves de una inyeccion en el ojo.
En algunas realizaciones, se proporciona una composicion oftalmica que comprende al menos una nanoparffcula segun la invencion, estando dicha nanoparffcula asociada con una macromolecula terapeutica, siendo la asociacion opcionalmente a traves de al menos un conector. En algunas realizaciones, la composicion esta en una forma adecuada para su inyeccion interocular o en forma de gotas oculares.
La eleccion del portador estara determinada en parte por el agente terapeutico en particular, asf como por el procedimiento en particular usado para administrar la composicion o el sistema de administracion. Consecuentemente, la composicion farmaceutica o el sistema de administracion de la presente invencion puede estar formulado para las vfas de administracion oral, enteral, bucal, nasal, topica, transepitelial, rectal, vaginal, en aerosol, transmucosa, epidermica, transdermica, dermica, oftalmica, pulmonar, subcutanea, intradermica y/o parenteral. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica o el sistema de administracion es administrado por via transdermica, topica, subcutanea y/o parenteral.
El sistema de administracion puede ser administrado en una solucion acuosa o lipfdica biocompatible. Esta solucion puede estar comprendida por, pero no se limita a, una solucion salina, agua o un medio organico farmaceuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la composicion de la invencion esta esencialmente exenta de agua.
La administracion de la formulacion del sistema de administracion puede llevarse a cabo en una unica dosis o en dosis repetidas una o varias veces despues de un determinado intervalo de tiempo. La dosis apropiada puede variar segun parametros tales como la dosis terapeuticamente eficaz segun este dictado por, y dependa directamente de, el individuo que se va a tratar, el modo de administracion, las caracteffsticas unicas del agente terapeutico y el efecto terapeutico en particular que se va a conseguir. Las dosis apropiadas pueden ser establecidas por la persona experta en la materia.
La composicion farmaceutica de la presente invencion puede seleccionarse para el tratamiento, la prevencion o el diagnostico de cualquier patologfa o afeccion. El termino "tratamiento" o cualquier variacion lingufstica del mismo, segun se usa en el presente documento, se refiere a la administracion de una cantidad terapeutica de la composicion o del sistema de la presente invencion que es eficaz para mejorar los smtomas indeseados asociados con una enfermedad, para prevenir la manifestacion de dichos smtomas antes de que se produzcan, para ralentizar la progresion de la enfermedad, para ralentizar el deterioro de los smtomas, para potenciar la aparicion del periodo de remision, para ralentizar el dano irreversible causado en la fase cronica progresiva de la enfermedad, para retrasar la aparicion de dicha fase progresiva, para reducir la gravedad de, o curar, la enfermedad, para mejorar el mdice de supervivencia o para inducir una recuperacion mas rapida o para prevenir la aparicion de la enfermedad, o una combinacion de dos o mas de los anteriores
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden ser particularmente ventajosas para aquellos tejidos protegidos por barreras tisicas. Dichas barreras pueden ser la piel, una barrera sangumea (por ejemplo, la hematotimica, la hematoencefalica, la alveolocapilar, la hematotesticular, etc), la membrana externa de un organo y otras. Cuando la barrera es la piel, las patologfas cutaneas que pueden tratarse con las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen, pero no se limitan a, trastornos o enfermedades antifungicas, acne, psoriasis, vitiligo, un queloide, una quemadura, una cicatriz, xerosis, ictoiosis, queratosis, queratodermia, dermatitis, pruritos, un eccema, cancer cutaneo y un callo.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden usarse para la prevencion o el tratamiento de cualquier afeccion dermatologica. En algunas realizaciones, la afeccion dermatologica se selecciona entre enfermedades dermatologicas tales como dermatitis, eccema, dermatitis de contacto, dermatitis alergica de contacto, dermatitis irritante de contacto, dermatitis atopica, eccema del lactante, prurigo de Besnier, dermatitis alergica, eccema flexural, neurodermatitis diseminada, dermatitis seborreica, dermatitis seborreica del lactante, dermatitis seborreica del adulto, psoriasis, neurodermatitis, sarna, dermatitis sistemica, dermatitis herpetiforme, dermatitis perioral, eccema discoideo, dermatitis numular, eccema del ama de casa, dishidrosis ponfolice, erupciones pustulares recalcitrantes de las palmas y las plantas, psoriasis de Barber o pustular, dermatitis exfoliativa generalizada, dermatitis por estasis, eccema varicoso, eccema dishidrotico, liquen simple cronico (dermatitis por rascado localizado; neurodermatitis), liquen plano, infeccion fungica, candida intertrigo, tina de la cabeza, manchas blancas, panau, dermatofitosis, pie de atleta, moniliasis, candidiasis; infeccion por dermatofito, dermatitis vesicular, dermatitis cronica, dermatitis espongiotica, dermatitis venata, liquen de Vidal, dermatitis por eccema asteatosico, eccema por autosensibilizacion, o una combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones adicionales, las composiciones de la invencion pueden usarse para la prevencion o el tratamiento de papulas, acne vulgar, marcas de nacimiento, pecas, tatuajes, cicatrices, quemaduras, quemaduras solares, arrugas, lmeas de expresion, patas de gallo, manchas de cafe con leche, tumores cutaneos benignos, que en una realizacion es una queratosis seborreica, dermatosis papulosa nigra, papilomas cutaneos, hiperplasia sebacea, siringomas, xantelasma, o una combinacion de los mismos; neoplasias cutaneas benignas, verrugas vmcas, candidiasis del panal, foliculitis, forunculos, granos, antrax, infecciones fungicas de la piel, hipomelanosis en gotas, perdida de cabello, impetigo, melasma, molusco contagioso, rosacea, sarna, zoster, erisipelas, eritrasma, herpes zoster, virus de la varicela-zoster, varicela, canceres cutaneos (tales como carcinoma epidermoide, carcinoma de celulas basales, melanoma maligno), neoplasias premalignas (tales como lunares congenitos, queratosis actinica), urticaria, ronchas, vitiligo, ictiosis, acantosis pigmentaria, penfigoide vesicular, helomas y callos, caspa, piel seca, eritema nodular, dermopatia de Graves, purpura de Henoch-Schonlein, queratosis pilosa, liquen mtido, liquen plano, liquen esclerotico, mastocitosis, molusco contagioso, pitiriasis rosada, pitiriasis roja pilosa, pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda, o enfermedad de Mucha-Habermann, epidermolisis ampollosa, queratosis seborreica, smdrome de Stevens-Johnson, penfigo, o una combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones adicionales, las composiciones de la invencion pueden usarse para la prevencion o el tratamiento de picaduras de insectos o de pruritos.
En algunas realizaciones adicionales, las composiciones de la presente invencion pueden usarse para la prevencion o el tratamiento de afecciones dermatologicas que estan asociadas con el area ocular, tales como siringoma, xantelasma, impetigo, dermatitis atopica, dermatitis de contacto, o una combinacion de las mismas; el cuero cabelludo, las unas, tales como una infeccion por bacterias, hongos, levaduras y virus, paroniquia o psoriasis; el area de la boca, tales como liquen plano oral, herpes labial (gingivoestomatitis herpetica), leucoplasia oral, candidiasis oral, o una combinacion de las mismas; o una combinacion de las mismas.
Como se sabe, la piel humana esta formada por numerosas capas que pueden ser divididas en tres grupos de capas principales: el estrato corneo, que esta localizado en la superficie externa de la piel, la epidermis y la dermis. Aunque el estrato corneo es una capa llena de celulas de queratina en una matriz extracelular rica en tipidos, que de hecho es la principal barrera frente a la administracion de farmacos en la piel, las capas de la epidermis y de la dermis son tejidos viables. La epidermis esta exenta de vasos sangumeos, pero la dermis contiene bucles capilares que pueden canalizar los productos terapeuticos para una distribucion sistemica transepitelial.
Aunque la administracion transdermica de farmacos parece ser la via de eleccion, unicamente un numero limitado de farmacos pueden ser administrados a traves de esta ruta. La incapacidad para administrar transdermicamente una mayor diversidad de farmacos depende fundamentalmente del requisito de un bajo peso molecular (farmacos con unos pesos moleculares no mayores de 500 Da), la lipofilia y pequenas dosis del farmaco. El sistema de administracion de la invencion supera claramente estos obstaculos. Como se ha mencionado anteriormente, el sistema de la invencion es capaz de contener agentes terapeuticos con una gran diversidad de pesos moleculares e hidrofilias. El sistema de administracion de la invencion permite al transporte del al menos un agente terapeutico a traves de al menos una de las capas de la piel, a traves de las capas del estrato corneo, de la epidermis y de la dermis. Sin desear quedar ligado a teona alguna, la capacidad del sistema de administracion para transportar el producto terapeutico a traves del estrato corneo depende de una serie de acontecimientos que incluyen la difusion del sistema intacto o del agente terapeutico disociado y/o de las nanopartfculas disociadas a traves de una capa de queratina hidratada y hacia las capas mas profundas de la piel.
Por lo tanto, la invencion tambien proporciona un sistema de administracion que comprende:
(i) una nanopartfcula de PLGA segun se define en el presente documento; y
(ii) al menos un agente terapeutico asociado con dicha nanopartfcula, estando dicho al menos un agente terapeutico opcionalmente asociado con dicha superficie a traves de una fraccion conectora que tiene, o como alternativa, esta contenida en, dicha nanopartfcula.
Adicionalmente se proporciona un sistema de administracion multifasico que comprende:
(i) una nanopartfcula polimerica segun se divulga en el presente documento;
(ii) una fraccion conectora asociada con la superficie de dichas nanopartfculas polimericas;
(iii) al menos un agente terapeutico asociado con dicha fraccion conectora; y
(iv) opcionalmente al menos un agente adicional que puede estar asociado con la nanopartfcula.
Con la capacidad del sistema de administracion de la invencion para disociarse en las condiciones biologicas, el sistema multifasico proporciona una o mas de las siguientes ventajas: (1) el sistema multifasico permite el transporte del agente terapeutico a traves de una barrera tisular mediante diversos mecanismos; (2) el agente terapeutico puede ser disociado del conector o de la nanopartfcula en los casos en los que el agente esta asociado directamente con la nanopartfcula, y por lo tanto es administrable en un tejido u organo objetivo en particular del cuerpo de un sujeto al que se le ha administrado el sistema de administracion; y (3) la nanopartfcula modificada, que comprende la nanopartfcula polimerica y la fraccion conectora (exenta del agente terapeutico), puede viajar adicionalmente a traves de tejidos de barrera adicionales, aumentando su hidratacion e induciendo unos efectos terapeuticos adicionales; y (4) cuando las nanopartfculas son nanocapsulas que contienen tambien un agente en el nucleo de la capsula, pueden permitir la administracion y la localizacion simultanea de una pluralidad de agentes terapeuticos. Consecuentemente, en el sistema de administracion de la invencion, cada componente puede estar disenado para que tenga una funcion individual prevista, que puede ser diferente de la funcion prevista de otro componente. Por ejemplo, el agente terapeutico puede estar disenado para dirigirse a un sitio espedfico, que puede ser diferente del sitio al que se dirige la fraccion conectora o la nanopartfcula desnuda, y superar o evitar por lo tanto una barrera biologica espedfica, que puede ser diferente de la barrera biologica que esta siendo superada o evitada por el sistema como un todo. Por ejemplo, cuando el al menos un agente es un anticuerpo unido a la nanopartfcula, puede unirse a los antfgenos espedficos de la superficie de las celulas de la epidermis o de la dermis, mientras que el agente del nucleo de la nanopartfcula puede ser liberado antes mediante una difusion simple. Adicionalmente, el agente incorporado puede ser liberado fundamentalmente desde las nanopartfculas, mientras que la nanopartfcula puede ser fragmentada o biodegradada mas lentamente y ser eliminada a traves de la dermis en forma de monomeros de PLA o de PGA.
La invencion tambien proporciona un procedimiento, segun se define en el conjunto de reivindicaciones, para la preparacion de un sistema de administracion segun la invencion, procedimiento que comprende:
- obtener una nanopartfcula, segun se define en el presente documento;
- hacer reaccionar dicha nanopartfcula con una fraccion conectora en unas condiciones que permitan la asociacion entre la superficie de la nanopartfcula y la fraccion conectora, para obtener asf una nanopartfcula modificada en superficie; y
- poner en contacto la nanopartfcula modificada en superficie con al menos un agente, por ejemplo, terapeutico o no terapeutico, para permitir la asociacion entre el grupo conector terminal; para obtener asf un sistema de administracion segun la presente invencion.
En algunas realizaciones, la fraccion conectora puede ser asociada con el agente terapeutico antes de ponerse en contacto con la nanopartfcula y el procedimiento puede comprender por lo tanto:
- obtener una nanopartfcula, as define en el presente documento;
- obtener una fraccion conectora asociada con un agente terapeutico; y
- hacer reaccionar el conector asociado con un agente terapeutico con dicha nanopartfcula para permitir la asociacion de al menos una porcion de dicho conector con la superficie de la nanopartfcula.
En algunas realizaciones, el sistema de administracion/sistema multifasico comprende nanopartfculas asociadas con oleil-cisteinamida, que esta anclada en la interfase de las nanopartfculas y por lo tanto puede ser facilmente aplicada a diversas mezclas polimericas de PLA y de PLGA de diferentes pesos moleculares, dando asf como resultado una amplia variedad de nanopartfculas tioladas.
El procedimiento de conexion no requiere, a priori, una modificacion qrnmica del polfmero formador de la partfcula.
Esto se consigue mediante el uso de un conector molecular, por ejemplo, oleilcisteinamida, que tiene una porcion lipofila que se ancla no covalentemente a la matriz polimerica de la partfcula o a la pared de la nanocapsula polimerica, y una segunda porcion que comprende un compuesto de tiol al que es posible unir, en una etapa posterior, el agente terapeutico deseado bien directamente o bien activado por un grupo maleimida. Esta metodologfa elimina la necesidad de ajustar para cada agente terapeutico diferente una composicion de nanopartfcula diferente, y permite un conector generico (con un compuesto terapeutico activo), que puede usarse para diferentes aplicaciones terapeuticas.
Ademas de emplear los procedimientos disponibles para la asociacion qmmica del agente terapeutico al conector, por ejemplo, una conjugacion mediada por carbodimida, la superficie de la nanopartfcula modificada con tiol puede usarse tambien, o como alternativa, para la quelacion y la administracion dermica de electrolitos vitales, por ejemplo, metales divalentes, tales como cobre, selenio, calcio, magnesio y cinc. Las nanopartfculas tioladas tambien pueden servir como un sistema de administracion para la quelacion de las cantidades en exceso no deseadas de metales, y reducir por lo tanto el efecto perjudicial mediado por las ROS (especies de oxfgeno reactivas) catalizadas por metales sobre la piel.
La invencion tambien proporciona una nanopartfcula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA), teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, estando dicha nanopartfcula asociada en superficie con al menos un agente (terapeutico o no terapeutico), y que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, siendo las nanopartfculas obtenibles mediante un procedimiento que comprende:
- obtener una nanopartfcula de PLGA que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da;
- hacer reaccionar dicha nanopartfcula con una fraccion conectora en unas condiciones que permitan la asociacion entre la superficie de la nanopartfcula y la fraccion conectora, para obtener asf una nanopartfcula modificada en superficie; y
- poner en contacto la nanopartfcula modificada en superficie con al menos un agente que se selecciona entre un agente terapeutico o no activo, para permitir la asociacion entre el grupo terminal del conector con dicho al menos un agente. Las nanopartfculas de PLGA obtenidas mediante dicho procedimiento son segun se define en el conjunto de reivindicaciones.
Tambien se proporciona un procedimiento, segun se define en el conjunto de reivindicaciones, para la preparacion de una nanopartfcula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA), teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, estando dicha nanopartfcula asociada en superficie con al menos un agente, y que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, procedimiento que comprende:
- obtener una nanopartfcula de PLGA que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da;
- hacer reaccionar dicha nanopartfcula con una fraccion conectora en unas condiciones que permitan la asociacion entre la superficie de la nanopartfcula y la fraccion conectora, para obtener asf una nanopartfcula modificada en superficie; y
- poner en contacto la nanopartfcula modificada en superficie con al menos un agente que se selecciona entre un agente terapeutico o no activo, para permitir la asociacion entre el grupo terminal del conector con dicho al menos un agente.
En algunas realizaciones, en los procedimientos y los productos producidos mediante los mismos, la fraccion conectora (por ejemplo, oleilcistema-amida) es asociada con el al menos un agente antes de la asociacion con la nanopartfcula. El al menos un agente normalmente es un agente terapeutico.
Adicionalmente se proporciona un procedimiento para la preparacion de una nanopartfcula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA), teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, estando dicha nanopartfcula asociada en superficie con al menos un agente, y que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, procedimiento que comprende:
- obtener una nanopartfcula de PLGA que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da;
- hacer reaccionar dicha nanopartfcula con al menos un agente que se selecciona entre un agente terapeutico o no terapeutico, para permitir la asociacion entre el al menos un agente y la superficie de dicha nanopartfcula.
Tambien se proporcionan nanopartfculas de acido polilactico (PLA) que tienen un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLA un peso molecular promedio de hasta 10.000 Da.
En algunas realizaciones, el PLA tiene un peso molecular promedio de entre 1.000 y 10.000 Da. En otras realizaciones, el PLA tiene un peso molecular promedio de entre 1.000 y 5.000 Da. En algunas realizaciones adicionales, el PLA tiene un peso molecular promedio de entre 1.000 y 3.000 Da. En otras realizaciones mas, el PLA tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 1.000, de aproximadamente 2.000, de aproximadamente 3.000, de aproximadamente 4.000 o de aproximadamente 5.000 Da.
Adicionalmente se proporcionan usos de la oleilcisteinamida en procedimientos para la preparacion de sistemas de administracion para la administracion de agentes a un sujeto, comprendiendo dichos procedimientos hacer reaccionar dicha oleilcisteinamida con un agente terapeutico que va a ser administrado a dicho sujeto.
Tambien se proporciona oleilcisteinamida para su uso en asociacion con al menos una nanopartfcula.
Adicionalmente se proporciona una macromolecula asociada qmmicamente (por ejemplo, a traves de un enlace covalente) con la oleilcisteinamida.
Tambien se proporciona una nanopartfcula de PLGA que tiene en su superficie una pluralidad de grupos tiol expuestos en la superficie, estando dichos grupos tiol activados para su asociacion con al menos un agente seleccionado entre un agente terapeutico y un agente no terapeutico, segun se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, dichos grupos tiol son de oleilcisteinamida.
Breve descripcion de los dibujos
Con objeto de comprender la invencion y de ver como puede llevarse a cabo en la practica, ahora se describiran las realizaciones, unicamente a modo de ejemplo no limitante, con referencia a los dibujos anexos, en los que:
las Figs. 1A-B son imagenes de CRIO-TEM de nanopartfculas de PLGA4500 de blanco en varias areas de la rejilla de carbono (Fig. 1A) y nanopartfculas de PLGA4500 de blanco en varias areas de la rejilla de carbono despues de un mes de conservacion a 4 °C (Fig. 1B). Las Figs. 2A-B son imagenes de CRIO-TEM de nanocapsulas de PLGA4500 cargadas con DHEA en varias areas de la rejilla de carbono (Fig. 2A) y de nanocapsulas de PLGA50000 cargadas con DHEA en varias areas de la rejilla de carbono (Fig. 2B).
la Fig. 3 es una coleccion de imagenes fluorescentes de varias abrasiones con esparadrapo consecutivas despues de una administracion topica durante 3 h de diferentes poblaciones de nanoesferas de NIR-PLGA (2,25 mg/cm2). El escaneo se llevo a cabo usando un sistema de imagen ODYSSEY® Infra Red.
las Figs. 4A-D es una representacion de las imagenes fluorescentes reconstruidas de espedmenes de piel completa, 2 h despues de la administracion topica de nanocapsulas o de nanoesferas con la incorporacion de DiD (4,5 mg/cm2). Fig. 4A- nanoesferas de PLGA4500 cargadas con DiD; Fig. 4B- nanoesferas de PLGA50000 cargadas con DiD; Fig. 4C- solucion de control del DiD; Fig. 4D- nanocapsulas de PLGA4500 cargadas con DiD. El escaneo del apilamiento Z se llevo a cabo usando un microscopio confocal Zeiss LSM 710.
las Figs. 5A-E es una representacion de las imagenes fluorescentes reconstruidas de espedmenes de piel completa, 2 h despues de la administracion topica de varias nanocapsulas o nanoesferas fluorescentes (3,75 mg/cm2). Fig. 5a - nanoesferas de PLGA4500 con la incorporacion de DiD y conjugadas con rodamina B; Fig.
5B- nanocapsulas de PLGA4500 con la incorporacion de DiD y conjugadas con rodamina B; Fig. 5C- nanoesferas de latex con rodamina B incorporada; Fig. 5D- dispersion acuosa de control de PLGA4500 conjugada con DiD y rodamina B; Fig. 5E- dispersion acuosa de control de PLGA4500 conjugada con DiD y rodamina B que contiene MCT. El escaneo del apilamiento Z se llevo a cabo usando un microscopio confocal Zeiss LSM 710.
las Figs. 6A-B muestran la intensidad de la fluorescencia acumulada del DiD (Fig. 6A) y de la rodamina B (Fig.
6B) en funcion de la profundidad de la piel despues de 2 horas de la administracion topica de varias formulaciones de RhdB-PLGA con la incorporacion de DiD (3,75 mg/cm2) usando secciones opticas en incrementos de 27 pm.
las Figs. 7A-D imagenes de CLSM de secciones verticales de piel de 8 pm de espesor 2 h despues de la administracion topica de NP (Fig. 7A) y de NC (Fig. 7B) de RhdB-PLGA con la incorporacion de DiD y de sus respectivos controles (Fig. 7C y Fig. 7D) (3,75 mg/cm2). Barra = 100 pm.
la Fig. 8 muestra la intensidad de la fluorescencia acumulada de la rodamina B en funcion de la profundidad de la piel despues de 2 horas de la administracion topica de varias formulaciones que incorporan rodamina B, incluyendo nanoesferas y nanocapsulas de PLGA, y nanoesferas de latex (3,75 mg/cm2) usando secciones opticas en incrementos de 27 pm.
las Figs. 9A-D distribucion de la [3H]DHEA (Fig. 9A y Fig. 9C) y del [3H]COE (Fig. 9B y Fig. 9D) en los compartimentos cutaneos viables de la epidermis (Fig. 9a y Fig. 9B) y de la dermis (Fig. 9C y Fig. 9D) con el tiempo despues de la incubacion de varios nanoportadores radioactivos y de sus respectivos controles. Fig. 9A y Fig. 9C: NC de [3H]DHEA cargadas positivamente (♦) y negativamente (■) y sus respectivos controles oleosos (0, □ ); Fig. 9B y Fig. 9D: NS de [3H]COE (▲), NC de [3H]COE (•) y sus respectivos controles (A, o). Diferencia significativa (valor de P < 0,05) de las NC de DHEA cargadas positivamente (*) y negativamente (**) en comparacion con sus respectivos controles
la Fig. 10 muestra las cantidades de [3H]DHEA registradas en los fluidos del compartimento receptor despues de la aplicacion topica de las NC de DHEA con carga positiva (♦) y negativa (■) y de sus respectivos controles oleosos (0, □). Los valores son la media ± DT. Diferencia significativa (valor de P < 0,05) de las NC de DHEA cargadas positivamente (*) y negativamente (**) en comparacion con sus respectivos controles.
las Figs. 11A-C son microfotograffas del microscopio de transmision electronica de inmunonanopartfculas de cetuximab (INP) despues de una incubacion durante 1 h, usando un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana conjugado con una partfcula de oro de 12 nm a diferentes aumentos.
las Figs. 12A-C son histogramas de citometna de flujo que muestran la union de las inmunonanopartfculas de cetuximab a celulas A549. Se representan las nanopartfculas con la superficie activada (Fig. 12A) y las inmunonanopartfculas de rituximab (emparejadas por isotipo) (Fig. 12B) a unas concentraciones crecientes (0,025/ |jg/ml, 0,05/ |jg/ml, 0,1 |jg/ml, 05 |jg/ml y 1 |jg/ml) (Fig. 12C).0,1 jg/ml, 0,5 |jg/ml y 1/ jg/ml equivalentes de INP de cetuximab en comparacion con 1 jg/ml equivalente de inmunonanopardculas de rituximab (histograma completo del fondo).
las Figs. 13A-E son imagenes fluorescentes reconstruidas de espedmenes de piel completa, 3 h despues de la administracion topica de varias formulaciones nanoparticuladas inmunologicas y de referencia (6 mg/cm2 eq a 0,12 mg de AcMc/cm2), despues de una tincion inmunohistoqmmica espedfica. El escaneo se llevo a cabo usando un microscopio confocal Olympus.
la Fig. 14 representa las intensidades fluorescentes individuales por cm2 calculadas por separado en hasta doce secciones consecutivas de ~ 35 jim, despues de la administracion topica de varias formulaciones nanoparticuladas inmunologicas y de referencia (6 mg/cm2 eq a 0,12 mg de AcMc/cm2), y una tincion inmunohistoqmmica espedfica.
la Fig. 15 representa las intensidades fluorescentes acumuladas por cm2 extrapoladas calculadas para hasta 385 jim, despues de la administracion topica de varias formulaciones nanoparticuladas inmunologicas y de referencia (6 mg/cm2 eq a 0,12 mg de AcMc/cm2), y una tincion inmunohistoqmmica espedfica.
la Fig. 16 representa los valores calculados del AUC de las intensidades fluorescentes acumuladas por cm2 calculadas para hasta 385 jm, despues de la administracion topica de varias formulaciones nanoparticuladas inmunologicas y de referencia (6 mg/cm2 eq a 0,12 mg de AcMc/cm2), y una tincion inmunohistoqmmica espedfica.
Descripcion detallada de la invencion
I. Administracion de acido lactico y glicolico a la piel
Se hace uso de los polfmeros de PLGA clmicamente bien aceptados, asf como de partfculas de PLA con un peso molecular espedfico, para la preparacion de las nanopartfculas de un determinado tamano de partfcula que son aplicadas en la piel, penetran en las capas superiores de la dermis y liberan, de una forma controlada en el tiempo, el acido lactico y el glicolico, o unicamente el acido lactico, que son factores humectantes naturales, permitiendo una hidratacion prolongada y sostenida de la piel sin que sea perjudicial.
Las nanopartfculas de PLGA, per se, vadas o cargadas con principios activos apropiados, se usan como los ingredientes activos de hidratacion prolongada, como resultado de su degradacion en la piel, que da lugar a la liberacion progresiva y continua del acido lactico y del glicolico. Incluso si las nanopartfculas penetran en la capa profunda de la epidermis o incluso en la dermis, no inducen ningun dano, segun se ha descrito previamente, dado que los productos de la hidrolisis del acido lactico y glicolico son eliminados o excretados de forma natural.
Debena enfatizarse que el PLGA (o el PLA), como los componentes activos de hidratacion de la composicion de la invencion, no son usados meramente como portadores para la administracion de otros componentes en la piel, aunque la invencion tambien incluye la posibilidad de que se usen otros componentes activos beneficiosos. Por lo tanto, segun la invencion, la composicion esta destinada a una aplicacion topica, es decir, contiene portadores para aplicaciones topicas, asf como para otras aplicaciones.
La nanopartfculas de la invencion normalmente tienen un tamano menor de 500 nm. Normalmente, las nanopartfculas tienen un tamano en el intervalo de entre 100 y 200 nm, o de entre 50 y 100 nm.
En algunas realizaciones, el peso molecular del PLGA y la proporcion entre el PLA y el PGA se ajustan de forma que las nanopartfculas tengan las siguientes propiedades:
(a) penetran en la piel hasta al menos las 10 capas superficiales de la epidermis;
(b) penetran hasta una profundidad de al menos 4-20 micrometres en la piel;
(c) se biodegradan en la capa de la piel en la que penetran (normalmente aproximadamente el 15 % en el estrato corneo);
(d) liberacion sostenida del acido lactico y del acido glicolico, o unicamente del acido lactico, durante un periodo mayor de 24 horas, preferentemente mayor de 72 horas, mas preferentemente de aproximadamente una semana.
Sin desear quedar ligado a teona alguna, parece haber una interrelacion entre el tamano de la partreula (que influye en la velocidad de penetracion y en la profundidad de penetracion), la proporcion entre el PLA y el PGA y el peso molecular del PLGA, de una forma tal que las propiedades anteriores pueden conseguirse mediante diversas combinaciones. Varios cambios en los parametros pueden neutralizarse entre sb
En algunas realizaciones, la proporcion de PLA:PGA es de 85:15; de 72:25; o de 50:50. En algunas realizaciones, la proporcion es de 50:50.
En otras realizaciones, el peso molecular del PLGA vana entre 2.000 y 10.000 Da. En algunas realizaciones, la proporcion es de entre 2.000 y 4.000.
En otras realizaciones, las partfculas de PLA pueden emplearse per se, en dichas realizaciones, el peso molecular del PLA esta en el intervalo de entre 4.000 y 20.000.
II. Estrategias de encapsulacion de compuestos insolubles en nanoparticulas - potencial de las nanoparticulas de PLGA cargadas con DHEA
En la presente invencion, las nanopartmulas pueden estar cargadas con materiales activos tales como vitaminas, peptidos, y otros, segun se ha divulgado anteriormente en el presente documento.
Los seres humanos tienen adrenales que secretan grandes cantidades de deshidroepiandrosterona (DHEA) y de sus derivados sulfatados (DHEAS). Una caractenstica notable de los niveles plasmaticos de la(s) DHEA(S) en los seres humanos es su gran disminucion con el envejecimiento. Los investigadores han postulado que esta disminucion relacionada con la edad en los niveles de la(s) DHEA(S) puede explicar algunos de los cambios degenerativos asociados con el envejecimiento. Se han identificado tres mecanismos de accion de la(s) DHEA(S). La DHEA y la(s) DHEA(S) son precursores de la testosterona y del estradiol. La(s) DHEA(S) es un neuroesteroide, que modula la excitabilidad neuronal a traves de interacciones espedficas con receptores de neurotransmisores, y la DHEA es un activador de los canales de potasio operados por calcio.
Los ensayos clmicos aleatorizados comparativos con placebo que inclrnan 280 individuos sanos (140 hombres y 140 mujeres) con mas de 60 anos y sobretratados con unas dosis (casi) fisiologicas de DHEA (50 mg/dfa) durante un ano han producido unos resultados muy positivos. Se evaluo el impacto del tratamiento de sustitucion de la DHEA sobre el estado de animo, el bienestar, las funciones cognitivas y sexuales, la masa osea, la composicion corporal, los factores de riesgo cardiovasculares, las funciones inmunitarias y la piel. De forma interesante, se observo una mejora en el estado de la piel, particularmente en las mujeres, en terminos de hidratacion, grosor epidemico, produccion de sebo y pigmentacion de la piel. Adicionalmente, no se observaron consecuencias perjudiciales durante el seguimiento de esta administracion de 50 mg/dfa de DHEA durante un ano.
Se sabe que la DHEA podna estar relacionada con el proceso de envejecimiento de la piel a traves de la regulacion y la degradacion de la protema de la matriz extracelular. Se ha demostrado que la DHEA puede aumentar la smtesis del procolageno e inhibir la degradacion del colageno mediante una reduccion en la smtesis de la metaloproteinasa de la matriz (MMP)-1 y un aumento en la produccion del inhibidor tisular de la metaloproteasa (TIMP-1) en fibroblastos dermicos cultivados. La DHEA (al 5 %) en etanol:aceite de oliva (1:2) se aplico topicamente en la piel de las nalgas de voluntarios 12 veces a lo largo de 4 semanas, y se averiguo que aumentaba significativamente la expresion del ARNm del procolageno alfa 1 (I) y de la protema tanto en la piel envejecida como en la joven. Por otro lado, la DHEA topica redujo significativamente la expresion basal del ARNm de la MMP-1 y de la protema, pero aumento la expresion de la protema TIMP-1 en la piel envejecida. Estos recientes resultados sugieren la posibilidad del uso de la DHEA como un agente antienvejecimiento cutaneo.
Tomando como base los resultados globales notificados, la DHEA exogena, administrada topicamente, puede promover la queratinizacion de la epidermis, mejorar la hidratacion de la piel mediante el aumento de la produccion endogena y de la secrecion de sebo, reforzando subsiguientemente el efecto de barrera de la piel, tratando la atrofia de la dermis mediante la inhibicion de la perdida de colageno y de tejido conectivo, y finalmente puede modular la pigmentacion de la piel. Estas propiedades hacen de la DHEA el principio activo de eleccion como un principio activo antienvejecimiento, siempre que la DHEA se disuelva adecuadamente en la formulacion topica, puede difundir desde la formulacion hacia la piel y estar totalmente biodisponible para la penetracion en la piel despues de una aplicacion dermica. De hecho, la DHEA muestra unas complejas limitaciones en la solubilidad en los disolventes cosmeticos y farmaceuticos habituales tales como agua, aceites polares y aceites vegetales. La DHEA es practicamente insoluble en agua (0,02 mg/ml) y es conocida por su tendencia a precipitar rapidamente en las formulaciones topicas habituales incluso a unas concentraciones menores del 0,5 %, produciendo numerosas formas cristalinas polimorfas que son difmiles de controlar, y muestra una velocidad de disolucion muy lenta. Adicionalmente, la DHEA muestra una baja solubilidad en las fases lipofilas con una solubilidad maxima del 1,77% en una cadena intermedia de trigliceridos. La forma de dosificacion topica mas aceptada es la emulsion o/a en la que la DHEA debe estar disuelta en la fase lipofila. Sin embargo, esta solucion es muy diffcil de conseguir dado que son necesarias unas concentraciones muy altas de la fase oleosa (mas del 70 %) para conseguir una concentracion de la DHEA que produzca una actividad de eficacia adecuada (aproximadamente del 0,5 % p/v). Los productos topicos con dichas elevadas concentraciones de la fase oleosa seran desagradables y tendran un mal aspecto, descartando su utilidad como productos cosmeticos.
No hay ninguna duda sobre que debena prevenirse el proceso de recristalizacion de la DHEA, dado que puede causar potencialmente unas variaciones significativas en la biodisponibilidad y en la eficacia terapeutica. Es necesario que los cristales del farmaco se redisuelvan en primer lugar en la piel antes de difundir y penetrar en las capas superficiales de la piel. Es improbable que dicho proceso se produzca con facilidad, y afectara significativamente a la actividad del producto. Ademas, el proceso de recristalizacion puede afectar a la estabilidad y al aspecto ffsico de la formulacion. Por lo tanto, hay una clara necesidad de preparar formulaciones topicas o/a agradables y convenientes en las que las nanoparticulas cargadas con DHEA puedan estar dispersadas en una concentracion adecuada precipitando fuera de la formulacion. Adicionalmente, el nanoportador con la DHEA incluida debena ser incorporado en una formulacion topica que pueda promover la penetracion del principio activo en las capas de la epidermis y de la dermis, donde su accion es mas necesaria.
III. ADMINISTRACION EN LA PIEL DE MACROMOLECULAS Y DE MINERALES UNIDOS A LA SUPERFICIE MEDIANTE EL USO DE NANOPARTfCULAS ACTIVADAS CON TIOL
Los productos disponibles comercialmente que utilizan una administracion transdermica han estado limitados fundamentalmente a farmacos lipofilos de bajo peso molecular (PM < 500 Da) [16], enfrentandose unos pesos moleculares mayores (PM > 500 Da) a unas dificultades en la penetracion [17]. Debido a la naturaleza impenetrable del estrato corneo frente a las macromoleculas, un potenciador de la penetracion adecuado debena mejorar sustancialmente el transporte de las macromoleculas a traves de la piel. Se han desarrollado varias tecnologfas para este fin, incluyendo el uso de microagujas, electroporacion, ondas de presion generadas por laser, hipertermia, sonoforesis de baja frecuencia, iontoforesis, potenciadores de la penetracion, o una combinacion de estos procedimientos. Muchas tecnicas para mejorar la penetracion se enfrentan a los retos inherentes, tales como el aumento de la escala y problemas de seguridad [17]. La presente invencion propone la administracion de macromoleculas, fundamentalmente hidrofilas, mediante un procedimiento no invasivo, usando una tecnica de union a la superficie de las macromoleculas a nanopartmulas tioladas.
NP tioladas - Estado de la tecnica
Se funcionalizaron nanopartmulas con una fraccion de maleimida, que despues se conjugaron con una protema tiolada. Alternativamente, las nanopartmulas pueden ser funcionalizadas con un grupo tiol, despues conjugadas con un residuo maleimfdico de la protema. Tradicionalmente, dichos sistemas de administracion se han usado fundamentalmente para la administracion dirigida de nanopartmulas cargadas con un farmaco, principalmente a tumores malignos, en los que la protema conjugada en la superficie se usa simplemente como una fraccion de direccionamiento que reconoce los epttopos espedficos de la enfermedad.
IV. EXPERIMENTAL
1. Preparacion de NP y NC de PLGA cargadas con DiD y/o de NP o NCS de PLGA conjugadas con rodamina B (ejemplo de referencia):
El PLGA se disolvio en acetona que contiene un 0,2 % p/v de Tween 80, a una concentracion del 0,6 % p/v. En el caso de la preparacion de las NC, tambien se anadio acido octanoico o MCT a una concentracion del 0,13 % p/v a la fase organica. Si se prepararon las NP cargadas con DiD, entonces tambien se anadio una almuota de la solucion en acetona de DiD a una concentracion de 1 mg/ml a la fase organica, dando como resultado una concentracion final de 15-30 pg/ml. Si se prepararon las NP o las NC de PLGA conjugadas con rodamina B, el PLGA marcado con rodamina B 0,03 % p/v se disolvio en acetona junto con un 0,57 % p/v de PLGA no marcado. La fase organica se anadio a la fase acuosa que contiene un 0,1 % p/v de Solutol® HS 15. La suspension se agito a 900 rpm durante 15 minutos y despues se concentro mediante una evaporacion hasta una concentracion final de polfmero de 30 mg/ml. Las composiciones de control acuosa y oleosa eran identicas a la formulacion descrita anteriormente, unicamente sin la presencia del polfmero.
2. Encapsulacion y evaluacion de las nanoparticulas solidas de PLGA con [3H]DHEA y [3H]COE Preparacion de NP de DHEA (ejemplo de referencia)
Las nanocapsulas de PLGA cargadas con DHEA se prepararon usando el metodo de deposicion interfacial [18]. La DHEA se solubilizo en acido octanoico / MCT / acido oleico y en acetona. Si se prepararon las NC cargadas positivamente con DHEA, se anadio el lfpido cationico, el DOTAP [1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano], a una concentracion del 0,1 % p/v a la fase organica. En el caso de la preparacion de NC de DHEA radioactivas, se insertaron 15 pCi de DHEA tritiada en el nucleo oleoso de las NC durante la preparacion de las NC junto con 1 mg de DHEA fria. En el caso de la preparacion de [3H]colesteril oleil eter ([3H]Co E), se disolvieron 80 y 127 pCi de [3H]COE en MCT para formar las NC, o simplemente se anadieron a la fase organica para la formacion de las NP, respectivamente. La fase organica se anadio gota a gota a la fase acuosa con agitacion a 900 rpm, y la formulacion se concentro mediante una evaporacion hasta una concentracion del polfmero del 8 mg/ml. Las formulaciones se filtraron a traves de una membrana de 0,8 pm y despues se diafiltraron 3 ml de las diferentes NC de [3H]DHEA con 30 ml de PBS (a un pH de 7,4) (Vivaspin 300.000 Mw CO, Vivascience, Stonehouse, Reino Unido) y se filtraron a traves de un filtro de 1,2 pm (p/0,8 pm Supor® Membrane, Pall corporation, Ann Arbor, Estados Unidos). La intensidad de la radioactividad para la totalidad de las formulaciones y sus respectivos controles se establecio de forma que la dosis finita aplicada estuviera en el intervalo de un total de 0,63-1,08 pCi/ml. Las composiciones de la fase organica y de la fase acuosa se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1: composiciones de la fase organica y de la fase acuosa
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Analisis del tamano de particula: las mediciones de la distribucion del diametro promedio y del tamano de partfcula se llevaron a cabo utilizando un ALV Noninvasive Back Scattering High Performance Particle Sizer (ALV-NIBS HPPS Langen, Alemania) a 25 °C y usando agua como diluyente.
Mediciones del potencial zeta: el potencial zeta de las NP se midio usando el Malvern zetasizer (Malvern, Reino Unido) diluyendo en agua de calidad HPLC.
Microscopia electronica de barrido (SEM) y de transmision (TEM): la evaluacion morfologica se llevo a cabo por medio de una TEM de barrido y de transmision (Philips Technai F20100 KV). Los espedmenes para la visualizacion mediante la TEM se preparan mezclando la muestra con acido fosfotungstico al 2 % (p/v) a un pH de 6,4 para la tincion negativa.
Microscopia electronica de crio-transmision (crio-TEM):
Se puso una gota de la fase acuosa en una pelfcula de polfmero perforado recubierta con carbono soportada en una rejilla de malla de Cu de 300 (Ted Pella Ltd), el exceso de lfquido se embotello y el especimen se vitrifico a traves de una inactivacion rapida en etano Kquido a -170 °C. El procedimiento se llevo a cabo automaticamente en el Vitrobot (FEI). Los espedmenes vitrificados se transfirieron a nitrogeno lfquido para su conservacion. Se sabe que un rapido enfriamiento conserva las estructuras presentes en la solucion a granel, y por lo tanto proporciona una informacion directa sobre la morfologfa y el estado de agregacion de los objetos en la solucion a granel sin secar. Las muestras se estudiaron usando un FEI Tecnai 12 G2 TEM, a 120 kV con un criosoporte Gatan mantenido a -180 °C, y las imagenes se registraron con una camara de CCD con un dispositivo de carga acoplada enfriado de barrido lento fabricada por Gatan. Las imagenes se registraron con el paquete informatico Digital Micrograph, en unas condiciones de bajas dosis, para minimizar el dano por la radiacion del haz de electrones.
3. Experimentos de difusion (ejemplo de referencia):
Se usaron celulas de difusion de Franz (Crown Glass, Sommerville, NJ, Estados Unidos) con un area de difusion eficaz de 1/0,2 cm2 y con un compartimento aceptor de 8 ml. El lfquido receptor era un tampon de fosfato, a un pH de 7,4.
A lo largo del experimento, el contenido de la camara receptora estaba en agitacion continua mediante un pequeno agitador magnetico. La temperatura de la piel se mantuvo a 32 °C mediante un sistema de circulacion de agua regulado a 37 °C. Se aplicaron unas dosis finitas del vetnculo y de las formulaciones (10-50 mg de polfmero por celda) sobre la capa cornea de la piel o una membrana de celulosa. La camara donante se abrio a la atmosfera. Se anoto el momento exacto de aplicacion y se considero el momento cero para cada celula. A las 4, 8, 12 y 24 h o 26 h, se recogio el lfquido receptor completo y se sustituyo por medio receptor reciente con la temperatura equilibrada. La determinacion de la concentracion del principio activo difundido se determino a partir de las alfcuotas. Al final del periodo de 24 o de 26 h, la superficie de la piel se lavo 5 veces con 100 ml de agua destilada o con etanol. Los ifquidos de lavado se agruparon y se ensayo la concentracion de principio activo de una parte alfcuota (1 ml).
Despues, las celulas se desarmaron y la dermis se separo de la epidermis por medio de una temperatura elevada, como se ha descrito anteriormente. El contenido en principio activo se determino por medio de una HPLC o de otras tecnicas analfticas validadas. Adicionalmente, se analizo la presencia de acido lactico o glicolico en el medio receptor.
4. Localizacion del sitio de las NP y las NC de PLGA cargadas con DiD y/o de las NP y las NCS de PLGA conjugadas con rodamina (ejemplo de referencia):
Se colocaron muestras extirpadas de piel de oreja humana o de piel de oreja porcina en celulas de difusion de Franz (PermeGear, Inc., Hellertown, PA), con un diametro del orificio de 5/11,28 mm, un volumen del receptor de 5/8 ml y un area de difusion eficaz de 0,2/1,0 cm2. El lfquido receptor era un tampon de fosfato, a un pH de 7,4. A lo largo del experimento, el contenido de la camara receptora estaba en agitacion continua mediante un pequeno agitador magnetico. La temperatura de la piel se mantuvo a 32 °C mediante un sistema de circulacion de agua regulado a 37 °C. Las soluciones y las diferentes formulaciones de NP y de NC cargadas con una sonda fluorescente de DiD atrapada con PLGA o PLGA libres unidos covalentemente a la rodamina B se aplicaron sobre la piel como se detalla a continuacion. Este protocolo se adopto para seguir la localizacion en la piel tanto de la sonda de DiD atrapada como del polfmero de rodamina B conjugado. Las diversas formulaciones se prepararon segun se describe en la anterior seccion experimental. La dosis aplicada para cada formulacion en las muestras de piel extirpada era de 125 |jl de una concentracion de polfmero de PLGA de 30 mg/ml con un contenido fluorescente atrapado inicial de DiD de 30 jg/ml.
Despues de un unico periodo de incubacion o en diferentes intervalos de tiempo, algunas de las muestras de la piel se diseccionaron para identificar el sitio de localizacion del nanoportador en las diversas capas de la piel mediante un microscopio confocal. El procedimiento fue como sigue, usando secciones histologicas. Los espedmenes de piel se fijaron usando formaldehndo al 4 % durante 30 minutos. Los tejidos fijados se colocaron en una incrustacion cubica de plastico adecuada en medio para la congelacion de tejidos (OCT, Tissue-Tek). Despues, las muestras de piel se ultracongelaron a -80 °C y se cortaron verticalmente en secciones de 10 pm de grosor, utilizando un criostato a -20 °C. Despues, los espedmenes tratados se conservaron en un refrigerador hasta el analisis con el microscopio confocal.
Ademas, algunos espedmenes de piel montada completa se mantuvieron intactos despues de la incubacion en las celdas de Franz a un intervalo de tiempo seleccionado de 2 h y se observaron inmediatamente con el microscopio confocal y adicionalmente se reconstruyeron usando las imagenes en 3D de las fotograffas de los apilamientos Z. La intensidad de la fluorescencia frente a la profundidad de la piel para los nanoportadores y los respectivos controles usando el perfil de lmea (se notifica la intensidad calculada para cada seccion y la intensidad acumulada del especimen completo). Los datos de las muestras se proporcionan en la Tabla 2.
Tabla 2: descripcion de la composicion de cada formulacion aplicada topicamente con la dosis equivalente espedfica
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5. Localizacion del sitio de las NC de [3H]DHEA y localizacion en la capa profunda de la piel (ejemplo de referencia):
Las formulaciones de las NC de [3H]DHEA se aplicaron sobre la piel usando el sistema de difusion celular de Franz. La localizacion de la [3H]DHEA en las diversas capas de la piel se determino mediante la tecnica de diseccion compartimental de la piel. Se monto piel de dermatoma de cerdo (600-800 pm de grosor) en celulas de difusion de Franz (Crown Glass, Sommerville, NJ, Estados Unidos) con un area de difusion eficaz de 1 cm2 y un compartimento aceptor de 8 ml (PBS, a un pH de 7,4). En diferentes intervalos de tiempo se llevo a cabo la diseccion compartimental de la piel para identificar el sitio de localizacion de los nanoportadores en la superficie de la piel, las capas superiores de corneocitos, la epidermis, la dermis y la celula receptora. En primer lugar, se recogio el resto de la formulacion despues de unos lavados sucesivos para permitir una recuperacion adecuada. Despues se elimino la superficie de la piel mediante las adecuadas abrasiones secuenciales con esparadrapo, contribuyendo la primera abrasion al compartimento del donante. El resto de la epidermis viable se separo de la dermis por medio de una temperatura elevada, y despues se disolvio qmmicamente mediante un lfquido de digestion disolvible. Finalmente tambien se recogieron los lfquidos receptores y se analizaron adicionalmente.
Ademas, en un intento de revelar cuantitativamente el destino biologico de las NC y de las NP en las diversas capas de la piel, bien se disolvieron 80 y 127 pCi de [3H]colesteril oleil eter ([3H]COE) en el nucleo oleoso de las NC o bien se atraparon en las nanomatrices de las NP, respectivamente. El trazador radioactivo, el [3H]colesteril oleil eter ([3H]COE) es muy lipofilo, con un log P por encima de 15 (> 15), y su localizacion en las capas de la piel refleja la localizacion bien del nucleo oleoso de la NC o bien de la nanomatriz de la NP, dado que la sonda no puede ser liberada de los nanoportadores en vista de su extremadamente alta lipofilia.
6. Sintesis y caracterizacion de la oleilcisteinamida Sintesis de la oleilcisteinamida
Bajo un flujo de nitrogeno el matraz se cargo mediante una jeringa con acido oleico (OA) (2,0 g, 7,1 mmol), 60 ml de tetrahidrofurano seco y trietilamina (0,5 ml, 7,1 mmol). Se inicio la agitacion y la solucion se enfrio hasta una temperatura interna de -15 °C usando un bano de alcohol isopropflico en hielo seco a entre -5 ° y -10 °C. Se anadio cloroformiato de etilo (0,87 ml, 6,1 mmol) y la solucion se agito durante 5 min. La adicion del cloroformiato de etilo dio como resultado un aumento en la temperatura interna hasta entre 8 y 10 °C y la precipitacion de un solido de color blanco. Despues de la precipitacion, la mezcla en agitacion continua, todavfa en el bano de alcohol isopropflico seco, se dejo alcanzar una temperatura interna de -14 °C. Se disolvio cistema (1,0 g, 8,26 mmol) en una solucion al 5 % de Na2CO3 (10 ml) introducida en el matraz mediante la aguja de una jeringa, se burbujeo vigorosamente a traves de la solucion durante 10 min con una agitacion manual: la temperatura interna se eleva abruptamente hasta 25 °C. Con el matraz todavfa en el bano de refrigeracion, la agitacion se continuo durante 30 min adicionales, y la mezcla de reaccion se conservo en el refrigerador a -15 °C durante una noche. La suspension se agito con tetrahidrofurano (100 ml) a la temperatura ambiente durante 5 min y las sales de amonio se eliminaron mediante una filtracion con succion a traves de un embudo de Buchner. Despues de aclarar los solidos con tetrahidrofurano (20 ml), el filtrado se paso a traves de un lecho de gel de s l^ice (25 g de Merck 60 de 230-400 de malla) en un embudo de filtracion de vidrio sinterizado de porosidad gruesa con la succion de un aspirador. El embudo se lavo adicionalmente con acetonitrilo (100 ml) y los filtrados combinados se evaporaron (rotavapor) para dar un lfquido viscoso.
La formacion de la oleilcisteinamida se confirmo mediante una RMN-H (Mercury VX 300, Varian, Inc., CA, Estados Unidos) y una CL-EM (Finnigan LCQDuo, ThermoQuest, NY, Estados Unidos).
RMN-1H (CDCk 5): 0,818, 0,848, 0,868, 0,871,0,889, 1,247, 1,255, 1,297, 1,391, 1,423, 1,452, 1,621, 1,642, 1,968, 1,989, 2,008, 2,174, 2,177, 2,268, 2,2932,320, 2,348, 3,005, 3,054, 4,881, 5,316, 5,325, 5,335, 5,343, 5,353, 5,369, 6,516, 6,540, 7,259 ppm.
CL-EM: pico a: 384,42.
El analisis de RMN confirma la formacion del conector de oleilcisteinamida, mientras que el espectro de la CL-EM corrobora claramente el peso molecular del producto, que es de 385,6 g/mol
7. Preparacion y caracterizacion de las nanopartfculas con la superficie activada y de la conjugacion de las macromoleculas:
Las nanopartfculas se prepararon usando el bien establecido metodo de deposicion interfacial [18]. La molecula conectora de oleilcisteinamida se disolvio en la fase organica que contiene el polfmero disuelto en un disolvente organico soluble en agua. Despues se anadio la fase organica gota a gota a la fase acuosa que contiene un tensioactivo. La suspension se evaporo a 37 °C a presion reducida hasta un volumen final de la suspension de nanopartfculas de 10 ml. Se hizo reaccionar una molecula separadora portadora de maleimida (LC-SMCC) con la macromolecula deseada a un pH de 8 para la subsiguiente conjugacion con la fraccion de tiol. Las NP activadas con tiol y la pertinente molecula portadora de maleimida se mezclaron despues y se dejaron reaccionar durante una noche en una atmosfera de nitrogeno. Al dfa siguiente se separaron las moleculas no unidas de las NP conjugadas usando un procedimiento de diafiltracion.
Tabla 3: composicion de la formulacion
Figure imgf000021_0001
Caracterizacion del tamano y del potencial zeta:
El tamano y el potencial zeta de las diversas NP se midieron en agua usando un DTS zetasizer (Malvern, Reino Unido).
Determinacion de la eficacia de conjugacion de las diversas macromoleculas a las NP:
La eficacia de conjugacion de las macromoleculas, tales como un AcMc, se determino usando el ensayo calorimetrico del acido bicincornnico (BCA) para la cuantificacion de protemas (Pierce, IL, Estados Unidos).
Debena apreciarse que el mismo procedimiento divulgado en el presente documento se ha usado para unir el acido hialuronico a las nanopartfculas.
8. Incorporacion de las nanopartfculas en una crema anhidra
Las ventajas de dispersar el producto final en una crema anhidra son enormes. Se preparan cantidades crecientes (0,1-10%) de polvos liofilizados de las NP y de las NP y se incorporan en una nueva crema que no comprende agua. Las cantidades relativas de los ingredientes de esta crema se detallan en la Tabla 4.
Tabla 4: cantidades relativas de los ingredientes
Figure imgf000022_0002
IV. Resultados preliminares
Formulacion y caracterizacion de la nanoparticula
Se prepararon nanopartfculas fluorescentes para facilitar la deteccion visual de las nanopartfculas. Se conjugo el PLA con la sonda fluorescente rodamina B. Las nanopartfculas se prepararon despues segun se describe en la anterior seccion experimental.
Los resultados muestran una formulacion homogenea de la nanopartfcula. Era posible ver las nanopartfculas debido al marcaje fluorescente con el fluoroforo rodamina a una excitacion/emision de 560/580 nm. Las nanopartfculas mostraban un diametro promedio de 52 nm y un valor del potencial Zeta de -37,3 mV.
Esta tecnica se uso para detectar e identificar la localizacion de las nanopartfculas con el tiempo en las diversas capas de la piel despues de una aplicacion topica.
Visualizacion mediante una crio-TEM de las NP de PLGA biodegradables un mes despues de la preparacion Las imagenes de crio-TEM de las nanopartfculas de PLGA4500 de blanco en diversas areas de la rejilla de carbono estan representadas en la Fig. 1A. Las nanopartfculas aparecen bastante homogeneas en su tamano y en su forma. Adicionalmente, las imagenes de la crio-TEM de las nanopartfculas de PLGA4500 de blanco en diversas areas de la rejilla de carbono despues de un mes de conservacion a 4 °C estan representadas en la Fig. 1B. Las nanopartfculas estan en diferentes fases de degradacion. Puede apreciarse que las nanopartfculas se degradan con el tiempo en un entorno acuoso.
Nanoparticulas de PLGA cargadas con DHEA (ejemplo de referencia)
Se encapsulo la DHEA en el nucleo oleoso de las nanocapulas de PLGA (4.500 o 50.000 Da). Las imagenes de la crio-TEM en diversas areas de la rejilla de carbono estan representadas en las Figs. 2A y 2B. Las nanopartfculas aparecen esfericas y nanometricas y no se observan cristales de DHEA.
Para la determinacion de la eficacia de encapsulacion y del contenido en sustancia activa, se incorporo [3H] DHEA en las NC de MCT. El contenido teorico inicial de DHEA para las NC cationicas y anionicas, despues de una diafiltracion con PBS (a un pH de 7,4), era del 0,49 y del 0,52 %, mientras que el contenido observado era del 0,18 y del 0,15% respectivamente. La eficacia de encapsulacion era por lo tanto del 36,5 y del 30,4% para las NC cargadas positivamente y negativamente, respectivamente (segun se muestra en la Tabla 5).
Tabla 5: contenido en DHEA y eficacia de carga en las NC de MCT
Figure imgf000022_0001
Penetracion cutanea de las nanoesferas con un marcaje fluorescente (ejemplo de referencia)
Para evaluar la penetracion en la piel de las NP, se prepararon nanoesferas que comprenden PLGA4500 o PLGA50000, mientras se marcaba covalentemente una cantidad del polfmero con el colorante de infrarrojo NIR-783. Las formulaciones fluorescentes fueron aplicadas topicamente sobre piel abdominal humana de un varon de 60 anos de edad, usando celulas de Franz (2,25 mg/cm2). Despues de 3 h, los espedmenes de piel se lavaron y se escanearon usando el ODYSSEY® Infra Red Imaging System (LI-COR Biosciences, NE, Estados Unidos). Las imagenes fluorescentes de varias abrasiones con esparadrapo consecutivas despues de la administracion topica se presentan en la Fig. 3. Sin quedar ligado a teona alguna, los resultados sugieren que el PLGA4500 penetra mas profundamente que el PLGA50000 en las capas de la piel. Esto puede ser atribuido a una biodegradacion mas rapida del PLGA4500 en comparacion con el PLGA50000
Penetracion cutanea de las nanocapsulas con un marcaje fluorescente (ejemplo de referencia)
Para evaluar la penetracion en la piel de las nanocapsulas (NC), en comparacion con las nanoesferas (NS), a las formulaciones se les incorporo la sonda fluorescente DiD. Con objeto de definir el destino biologico del nanoportador del PLGA, se prepararon NC recubiertas con PLGA cargadas con MCT con la sonda fluorescente DiD unidas covalentemente a la rodamina B. En ausencia de MCT, se formaron las NP. Tambien se investigaron nanoesferas de latex no degradables cargadas con rodamina B disponibles comercialmente.
Las formulaciones fluorescentes fueron aplicadas topicamente sobre piel abdominal humana de una mujer de 40 anos de edad, usando celulas de Franz (4,5 mg/cm2). Despues de 2 h, los espedmenes de piel se lavaron y se escanearon usando un microscopio de barrido por laser confocal Zeiss LSM710. Las imagenes fluorescentes reconstruidas de los espedmenes de piel completa estan representadas en las Figs. 4A-D. Los resultados indican claramente que todas las nanopartfculas cargadas con la DiD produjeron unos valores fluorescentes mas grandes en comparacion con la solucion de control de DiD. Ademas, las nanocapsulas de PLGA4500 mostraron una penetracion/retencion superior en la piel en comparacion con otros sistemas de administracion nanoparticulados.
Las formulaciones de los nanoportadores con marcaje doble y sus respectivos controles se aplicaron durante 2 horas sobre piel abdominal humana de una mujer de 50 anos de edad. Las imagenes fluorescentes reconstruidas de los espedmenes de piel completa estan representadas en las Figs. 5A-E. Las 3D de las NP y de las NC despues de 2 horas del tratamiento topico mostraron que se libero mas carga fluorescente desde las NC que desde las NP, aunque ambas alcanzaron la misma profundidad (cercana a los 200 pm), mientras que los respectivos controles permanecieron en las capas superficiales de la piel. Los resultados indican claramente que las nanopartfculas cargadas con la DiD penetran de la misma forma a la que se ha descrito previamente. Adicionalmente, la intensidad de la rodamina B, que originalmente procedfa de la conjugacion de la sonda fluorescente con el PLGA, era mucho mayor cuando los portadores nanoparticulados basados en el PLGA eran administrados topicamente en comparacion con sus respectivos tratamientos (Figs. 6A-B), como tambien se representaba en las imagenes de seccion transversal (Figs. 7A-D).
Finalmente, se registro una baja intensidad de la rodamina B despues de 2 horas de incubacion de las NS de latex no degradables de rodamina B sobre piel abdominal humana de una mujer de 30 anos de edad. Este resultado sugiere que el portador con una base no degradable tiene un mayor lfmite para liberar su carga cuando se compara con los sistemas degradables (Fig 8).
Localizacion del sitio de las NC de [3H]DHEA y localizacion en la capa profunda de la piel (ejemplo de referencia)
Los resultados notificados en las Figs. 9A-D muestran la dermatobiodistribucion ex vivo en los compartimentos de la piel de la [3H]DHEA despues de una aplicacion topica de NC de PLGA cargadas con [3H]DHEA cargadas negativamente y positivamente y sus respectivos controles en diferentes periodos de incubacion. Se recupero mas del 90 % con respecto a la cantidad inicial aplicada de la DHEA radiomarcada, de los diferentes controles oleosos, de la celula donante en cada intervalo de tiempo hasta las 24 h. Cuando se aplicaron las NC cargadas con la DHEA, de nuevo, la mayor parte del compuesto radioactivo se recogio en el compartimento del donante, con un promedio de mas del 90 % hasta las 6 horas, con el registro de una notable disminucion hasta aproximadamente el 80, el 65 y el 55 % a las 8, las 12 y las 24 horas, respectivamente. La distribucion de la [3H]DHEA en las capas superiores de las pieles en funcion de la profundidad SC despues de 10 abrasiones con esparadrapo (TS) secuenciales se representa en la Tabla 6. Cada par de TS se extrajo y se analizo mediante lfquido de centelleo, dando como resultado una secuencia de descripcion de cinco subcapas de la SC de cada especimen. Independientemente del tratamiento aplicado, puede apreciarse que los mayores niveles de [3H]DHEA fueron detectados en las capas A y B, que representan las capas mas externas de la SC, con una disminucion coordinada registrada en las capas internas C, D y E. La acumulacion con el tiempo del compuesto radioactivo en las diferentes capas SC se produjo cuando se aplicaron las cargadas con la [3H]DHEA cargadas negativamente y positivamente. Debena apreciarse que, independientemente de la formulacion, la concentracion de radioactividad en la SC era baja (de aproximadamente el 1-2%). Puede observarse claramente que 24 h despues de la aplicacion, la concentracion de radioactividad disminuyo progresivamente en las capas internas (Tabla 6) de la SC. Sin embargo, se registraron unas diferencias apreciables entre las NC cargadas con la DHEA y sus respectivos controles en los compartimentos de piel viables (epidermis y dermis). Los niveles de la [3H]DHEA alcanzaron una meseta del -3 % y del 5,5 % en la epidermis y en la dermis respectivamente, despues de 6 horas de incubacion de ambas de las NC de DHEA cargadas positivamente y negativamente (Figs. 9), mientras que los niveles de la [3H]DHEA obtenidos en la epidermis y en la dermis con los respectivos controles oleosos no alcanzaron el 1 % durante todos los periodos de tratamiento de hasta 24 h (Figs. 9) (P < 0,05).
Tabla 6: distribucion de la [3H]DHEA con el tiempo en las diferentes capas SC de piel porcina despues de la incubacion con diferentes formulaciones de nanocapsulas. Los valores son la media ± DT. N = 4
Figure imgf000024_0001
Se encontraron unos niveles crecientes de DHEA radioactiva con el tiempo en los lfquidos del compartimento receptor cuando se incubaron ambas NC cargadas con DHEA positivamente y negativamente, alcanzando un 0,5 %, un 2,5 % y un 14 % de la dosis inicial aplicada despues de 1 hora, de 8 y de 24 horas, respectivamente. Por otro lado, los respectivos controles oleosos mostraron unos niveles constantes de [3H]DHEA menores del 1 % de radioactividad en la mayona de los intervalos de tiempo. Aunque se observo un lapso temporal de 3 horas para las diferentes formulaciones, la aparicion de la [3H]DHEA en los lfquidos receptores despues de la aplicacion de las NC positivamente y negativamente era significativamente mayor que los respectivos controles oleosos. La cantidad total de DHEA en los lfquidos receptores (|jg/cm2), liberada a partir de los diferentes tratamientos, esta representada frente a la rafz cuadrada del tiempo (Fig. 10). El bajo valor de flujo lento de 0,063 (|jg/cm2/h05), calculado a partir de las pendientes de las graficas representadas, para los controles oleosos, se correlaciona con su limitado perfil de liberacion notificado. Entonces de nuevo, los significativamente mayores niveles de la [3H]DHEA registrados en los lfquidos receptores cuando se aplicaban topicamente las NC de DHEA negativamente y positivamente, subraya un flujo superior y una infiltracion percutanea superior del farmaco cuando esta cargado en una formulacion de nanoportadores. Debena enfatizarse que no se observa ninguna diferencia significativa entre las dos formulaciones de NC en todos los puntos temporales que indican que la naturaleza de la carga no contribrna a la mejora en la penetracion en la piel, sino mas bien el tipo de nanoestructura usada, es decir, nanocapsulas vesiculares.
Se incorporo el compuesto radiactivo muy lipofilo, el [3H]COE, en NS de PLGA y en NC que contienen MCT, en un intento de identificar el destino de nanoportador vacfo cuando se aplica topicamente. Despues de una diafiltracion con PBS (pH = 7,4), la eficacia de encapsulacion era del 45 % y del 70 % para las NS y las NC, respectivamente. Se prepararon controles acuosos y oleosos de [3H]COE, sin polfmero, para los experimentos ex vivo. De nuevo, se recogio mas del 90% de la cantidad inicial del COE tritiado desde el compartimento donante despues de cada periodo de incubacion, independientemente del tipo de formulacion (datos no mostrados). La Tabla 7 muestra la dermatobiodistribucion del [3H]COE en funcion de las capas SC despues de los diferentes tratamientos, segun se ha descrito previamente para la [3H]DHEA. Hasta 8 horas de incubacion de las NS y de las NC cargadas con el
[3H]COE, se extrajo menos del 1 % de la dosis aplicada a partir de las capas superiores de la piel. De forma interesante, se observo un notable aumento en las capas A y B de despues de 12 horas de incubacion de las NS y de las NC, de una forma similar a la observacion previa notificada cuando se aplicaron las NC de DHEA. Aunque no se registraron unas diferencias notables, asociadas a los periodos de incubacion, en los niveles de [3H]COE cuando se aplicaron topicamente los diferentes controles, la distribucion constante del [3H]COE en MCT era mayor en comparacion con la solucion en tensioactivo del [3H]COE (Tabla 7). Finalmente, se conto menos de un 0,5 % de radioactividad en los compartimentos viables (epidermis, dermis y lfquidos receptores) durante los periodos de incubacion, cuando se aplicaron ambas formulaciones de nanoportadores y sus respectivos controles (Figs. 9).
Parece que es necesario mas tiempo de incubacion para diferenciar entre las diversas formulaciones de COE.
Tabla 7: distribucion del [3H]COE con el tiempo en las diferentes capas SC de piel porcina despues de la incubacion con diferentes formulaciones de nanocapsulas. Los valores son la media ± DT. N = 3
Figure imgf000025_0001
NP con la superficie activada con tiol y NP conjugadas con un AcMc (ejemplo de referencia)
Las NP con la superficie activada con tiol se prepararon a partir de los siguientes polfmeros:
• PLGA con un PM de aproximadamente 48.000 Da,
• PEG-PLGA50.000 y PLGA4500,
• PEG-PLA100.000
Preparacion de inmunoNP conjugadas con varios AcMc (ejemplo de referencia)
Los siguientes AcMc se conjugaron con exito con la superficie de las NP tioladas con una elevada eficacia de conjugacion (vease la Tabla 8):
• Cetuximab
• Rituximab
• Herceptina
• Avastina
Tabla 8: propiedades de las INP con jugadas con los AcMc pertinentes
Figure imgf000026_0001
Evaluacion morfologica usando una TEM (ejemplo de referencia)
El acoplamiento del AcMc cetuximab con las INP fue confirmado cualitativamente mediante observaciones de TEM, usando anti-IgG humana de cabra marcada con oro de 12 nm (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, Estados Unidos). Cada mancha de oro negro observada en las Figs. 11A-C representa una molecula de AcMc unida a los sitios en las superficies de las INP que reaccionan con la IgG marcada con oro. Puede deducirse que el AcMc estaba conjugado con la superficie de las INP mediante el conector y que las condiciones de reaccion no afectan a la afinidad del AcMc por el anticuerpo secundario.
Determinacion de la capacidad de union in vitro en la Hnea celular A549 mediante una citometna de flujo Para la evaluacion de las propiedades de union usando una citometna de flujo, las celulas se desprendieron usando una solucion de EDTA al 0,05 %. Las celulas se resuspendieron en medio FACS (BSA al 1 %, azida de sodio al 0,02 % en PBS). Se usaron 200.000 celulas en 200 pl para cada tratamiento. Las celulas se centrifugaron a 1.200 rpm a 4 grados. Despues, las celulas se incubaron bien con el anticuerpo cetuximab nativo o bien con unas concentraciones equivalentes de inmunonanopartfculas de cetuximab sobre hielo, durante 1 h. Se usaron 0,005 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,025 pg/ml, 0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml y 0,5 pg/ml del anticuerpo cetuximab o de las INP equivalentes. El anticuerpo anti-CD-20, rituximab (Mabthera®) se uso como un control de isotipo emparejado irrelevante sin union. Las celulas tambien se incubaron con unas concentraciones equivalentes de n P con la superficie activada y de INP de rituximab como controles negativos, para excluir la union no especifica de las INP. Despues de una incubacion de 1 h, las celulas se centrifugaron y se lavaron dos veces con medio FACS. Despues, las celulas se incubaron durante cuarenta minutos a 4 °C en la oscuridad con un fragmento anti-IgG humana de cabra F(ab)'2 AffiniPure conjugado con FITC (Jackson Immunoresearch). Despues las celulas se centrifugaron y se lavaron dos veces con medio FACS. Las celulas se resuspendieron en medio FACS y se determino la fluorescencia mediante una citometna de flujo. Los resultados estan representados en las Figs. 12A-C. Los resultados indican claramente que las inmunonanopartfculas de cetuximab mostraban unas excelentes propiedades de union a todas las concentraciones de AcMc evaluadas. La union no especifica fue eliminada mediante la incubacion de las celulas tanto de las NP con la superficie activada de (NP portadoras de tiol) como de las inmunonanopartfculas de rituximab de isotipo emparejado.
Penetracion en la piel de las inmunopartfculas (ejemplo de referencia)
Para la evaluacion de la capacidad de las nanopartfculas para potenciar la penetracion de las macromoleculas en la piel, se prepararon INP conjugadas covalentemente con el AcMc cetuximab. Se administraron topicamente 6 mg/cm2 equivalentes a 0,12 mg de AcMc/cm2 en la piel abdominal humana de mujeres de 44 anos de edad, durante 3 h, frente a los pertinentes controles. Despues, los espedmenes de piel se lavaron y se inmunotineron con anti-IgG humana secundario de cabra marcado con Cy5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, Estados Unidos). Las imagenes fluorescentes reconstruidas se realizaron usando un microscopio confocal Olympus (Figs. 13A-E).
Las Figs. 14 y 15 tratan del mismo experimento. Puede apreciarse cualitativa y cuantitativamente) que las NP y las INP produdan los valores fluorescentes mas intensos, con un efecto mas pronunciado para las INP en comparacion con las NP. La Fig. 14 demuestra claramente la intensidad fluorescente cuantitativa mas notable por cm2 producida por las INP. A partir de la Fig. 15 y de la Fig. 16 puede observarse que las INP produdan la mayor intensidad acumulada por cm2, lo que indica claramente que las NP promueven la penetracion/retencion en la piel del AcMc.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una nanopartmula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA) que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, en la que dicha nanopartmula esta asociada con al menos un agente seleccionado entre
(i) un agente terapeutico hidrofilo que esta conjugado o asociado en superficie de dicha nanopartmula, en la que el al menos un agente terapeutico hidrofilo esta asociado con la nanopartmula a traves de una o mas fracciones conectoras, en la que el conector es una cistema grasa que tiene una cadena de alquilo de al menos 10 atomos de carbono, y
(ii) un agente terapeutico lipofilo que esta contenido en dicha nanopartmula, en la que dicha nanopartmula esta asociada adicionalmente con al menos un agente no activo, en la que el agente no activo es un alquil aminoacido, en el que la porcion alquilo de dicho alquil aminoacido tiene entre 10 y 30 atomos de carbono y puede ser lineal o ramificada, saturada, semisaturada o insaturada.
2. La nanopartmula segun la reivindicacion 1, en la que el PLGA tiene un peso molecular promedio de entre 2.000 y 10.000 Da, o de entre 2.000 y 7.000 Da, o de entre 2.000 y 5.000 Da, o de entre 4.000 y 20.000 Da, o de entre 4.000 y 10.000 Da, o de entre 4.000 y 5.000 Da.
3. La nanopartmula segun la reivindicacion 1, en la que el PLGA es un copolfmero aleatorio de PLA y de PGA equimolares, que tiene un peso molecular de al menos 4.500 Da, en la que la nanopartmula tiene un diametro promedio de entre 100 y 200 nm y esta opcionalmente en forma de una nanocapsula o de una nanoesfera.
4. La nanopartmula segun la reivindicacion 1 o 3, en la que el al menos un agente terapeutico es una macromolecula.
5. La nanopartmula segun la reivindicacion 1, que esta en forma de una nanocapsula.
6. La nanopartmula segun la reivindicacion 1, que esta en forma de una nanoesfera.
7. La nanopartmula segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la nanopartmula esta PEGilada con polietilenglicoles (PEG) o no esta PEGilada.
8. La nanopartmula segun la reivindicacion 1, en la que la nanopartmula contiene un agente hidrofobo en el nucleo de la nanopartmula, y un agente hidrofilo en la cubierta, que se extiende hacia fuera de la nanopartmula o que se asocia con el conector.
9. La nanopartmula segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el conector es oleilcisteinamida.
10. Una composicion que comprende al menos una nanopartmula segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, siendo dicha composicion opcionalmente una composicion farmaceutica.
11. La composicion segun la reivindicacion 10, que esta adaptada para administracion transdermica de un agente terapeutico, para administracion topica de un agente terapeutico a traves de las capas de la piel, para administracion de un agente terapeutico a traves del estrato corneo, para administracion de un agente terapeutico mediante inyeccion, para administracion oral de un agente terapeutico, para administracion oftalmica de un agente terapeutico, o para administracion oftalmica a traves de una inyeccion.
12. La composicion segun la reivindicacion 10 u 11, que esta esencialmente exenta de agua.
13. Una nanopartmula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA), teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, estando dicha nanopartmula conjugada en superficie con al menos un agente, siendo dicha conjugacion a traves de una fraccion conectora que es una cistema grasa que tiene una cadena de alquilo de al menos 10 atomos de carbono, teniendo la nanopartmula un diametro promedio de como mucho 500 nm, pudiendo ser obtenidas las nanopartmulas mediante un procedimiento que comprende:
- obtener una nanopartmula de PLGA que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da;
- hacer reaccionar dicha nanopartmula con la fraccion conectora en unas condiciones que permitan la asociacion entre la superficie de la nanopartmula y la fraccion conectora, para obtener asf una nanopartmula modificada en superficie; y
- poner en contacto la nanopartmula modificada en superficie con al menos un agente que se selecciona entre un agente terapeutico o no activo, para permitir la asociacion entre el grupo terminal del conector con dicho al menos un agente.
14. Un procedimiento de preparacion de una nanopartmula de acido poli(lactico glicolico) (PLGA), teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da, estando dicha nanopartmula asociada en superficie con al menos un agente, siendo dicha asociacion en superficie a traves de una fraccion conectora que es una cistema que tiene una cadena de alquilo de al menos 10 atomos de carbono, teniendo la nanopartmula un diametro promedio de como mucho 500 nm, comprendiendo el procedimiento:
- obtener una nanopartfcula de PLGA que tiene un diametro promedio de como mucho 500 nm, teniendo el PLGA un peso molecular promedio de entre 2.000 y 20.000 Da;
- hacer reaccionar dicha nanopartfcula con la fraccion conectora en unas condiciones que permitan la asociacion entre la superficie de la nanopartfcula y la fraccion conectora, para obtener asf una nanopartfcula modificada en superficie; y
- poner en contacto la nanopartfcula modificada en superficie con al menos un agente que se selecciona entre un agente terapeutico o no activo, para permitir la asociacion entre el grupo terminal del conector con dicho al menos un agente.
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