ES2699459T3 - Nanomatriz que imita endotelio - Google Patents

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Meenakshi Kushawaha
Brigitta Brott
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Abstract

Un péptido amfífilo, que comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célula y una secuencia de productor donador de óxido nítrico, en donde la secuencia de adhesión de primera célula es una secuencia de adhesión de célula endotelial que no se une a células del músculo liso y/o plaquetas, en donde la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP) y en donde la secuencia de productor donador de óxido nítrico comprende polilisina o policisteína.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanomatriz que imita endotelio
Antecedentes
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son el número uno de causas de muerte en los EE.UU. Se cobran aproximadamente un millón de vidas y más de 400 mil millones de dólares americanos cada año. La causa principal de las ECV es la obstrucción arterial por la deposición de colesterol en el revestimiento interno de la arteria. Esto se denomina ateroesclerosis (Silverthorn DU. 2004).
Para el tratamiento de aterosclerosis, se introdujo en 1970 una técnica no invasiva denominada angioplastia con balón, que proporcionada una alternativa atractiva al injerto de derivación las arterias coronarias. Usaba un catéter con balón colapsado que se inserta e infla en el sitio de la placa. Tras inflarlo, el balón comprime y rompe la placa, retirando el bloqueo. Esta técnica proporcionaba el alivio inmediato del paciente. Sin embargo, quedaba limitado por el problema de cierre abrupto de la arteria tras la retiración del catéter (Windecker S, y col. 2000). Estos problemas llevaron al diseño de nuevas soluciones biomédicas, tales como stents metálicos sin recubrimiento.
Para evitar el cierre abrupto de la arteria, se introdujeron en 1990 tubos metálicos expandibles con forma de celosía conocidos como stents metálicos sin recubrimiento (SMSR). Se inserta un catéter con una punta de balón con un stent colapsado con un catéter guía y un alambre guía. Cuando se infla el balón en el sitio de la placa, el stent se expande, se enclava en el lugar y forma un armazón que mantiene la arteria abierta. El uso de SMSR redujo la tasa de reestenosis en comparación con la angioplastia con balón. Mientras que resultaban exitosos en la prevención del retroceso elástico de la arteria, los SMSR tenían el problema de reestenosis (es decir, recierre de la arteria)(Sheiban 1, y col. 2002).
La Figura 1 muestra una representación esquemática de los principales mecanismos de la reestenosis, que incluyen retroceso elástico, remodelado arterial negativo y proliferación neointimal (Dobesh PP, y col. 2004). El SMSR elimina prácticamente el problema de retroceso elástico (Sheiban I, y col. 2002, Ozaki Y, y col. 1996) y remodelado arterial negativo (Sheiban I, y col. 2002). Sin embargo, el mecanismo principal de la reestenosis en SMSR es la hiperplasia neointimal (Violaris AG, y col. 1997). La hiperplasia neointimal es causada por la denudación endotelial debido a la penetración de riostras de stent en la pared del vaso. Puede imaginarse que la placa fracturada expone el contenido trombogénico de la pared del vaso al lumen, llevando a una cascada de adhesión, activación plaquetaria y trombosis. Además, la denudación endotelial da como resultada la pérdida de factores antitrombóticos. Las plaquetas activadas liberan factores que favorecen la proliferación y migración de las células del músculo liso. Mientras tanto, las células del músculo liso también cambian su morfología de contráctiles a sintéticas. Esto puede dar como resultado la migración de células del músculo liso y síntesis de matriz extracelular aumentada (m Ec ), lo que lleva a hiperplasia neointimal y reestenosis intrastent (Bauters C, y col. 1997). Por tanto, los SMSR permanecían limitado a las altas tasas de reestenosis intrastent. Por tanto, se necesitaban más avances en el diseño biomédico de SMSR, tales como la incorporación de suministro de fármaco localizado.
El mayor reto del suministro de fármaco a base de catéter es conseguir la localización de fármacos en el sitio del daño vascular para reducir la formación de hiperplasia neointimal. Por tanto, los sistemas de suministro de fármaco controlado se han aplicado a stents, dando como resultado el desarrollo de stents liberadores de fármacos (SLF). Los SLF pusieron disponibles en el mercado en los EE.UU. en 2003 (Ong AT, y col. 2005). Están recubiertos con agentes bioactivos únicos o múltiples, que se suministran en el torrente sanguíneo y tejidos circundantes después del implante. Estos stents están diseñados para liberar fármacos que interfieren con el proceso de la hiperplasia neointimal direccionando sus trayectorias bioquímicas. Se han investigado varias estrategias de suministro de fármacos tales como métodos de difusión controlada, disolución/degradación controlada y a base de intercambio iónico para los SLF (Acharya G, y col. 2006). Los SLF han mostrado reducir la reestenosis en comparación con los SMSR (de Man FH, y col. 2007). Se han implantado en más de 6 millones de pacientes desde 2004 a 2006 (Colombo A, y col. 2007).
El mercado de stents se comparte únicamente por dos stents liberadores de fármacos: (1) Cordis CYPHER™, stent liberador de sirolimus y (2) Boston Scientific TAXUS™, stent liberador de paclitaxel. La FDA aprobó el stent de Cypher en abril de 2003 y el stent de Taxus en marzo de 2004. Tanto el sirolimus como el paclitaxel funcionan inhibiendo el ciclo celular. El sirolimus es un fármaco inmunosupresor que promueve la activación de la quinasa, llevando a la inhibición de la fase de crecimiento celular. El Paclitaxel se une a los microtúbulos en células que se dividen y las hace juntarse, evitando, de este modo, la mitosis (Wessely R, y col. 2006). El uso de estos SLF ha mostrado reducir el riesogo de reestenosis en un 80 %, tal como se muestra por numerosos ensayos controlados al azar (Morice MC, y col. 2002; Moses JW, y col. 2003) y meta-análisis (Roiron C, y col. 2006). Sin embargo, no se ha observado una diferencia en la tasa de mortalidad entre SLF y SMSR (Roiron C, y col. 2006; Babapulle MN, y col. 2004). Esto puede atribuirse a la aparición de trombosis del stent tardía o coágulos sanguíneos, que es una causa emergente de preocupación en la primera generación de SLF (Camenzind E, y col. 2007; Webster MW, et al. 2007; Van Belle E, y col. 2007; Jaffe R, y col. 2007; Leon MB. 2007). Esta trombosis tardía parece estar relacionada con la terapia antiplaquetaria discontinua, (Zimarino M, y col. 2005) casos raros de hipersensibilidad local como reacción al fármaco y "uso no aprobado" de SLF (Win HK, y col. 2007). De acuerdo con los estándares de la FDA, los SLF solo se han aprobado para pacientes con estenosis coronaria previamente no tratada de menos de 30 mm de longitud y un diámetro de vaso de referencia dentro del intervalo de desde 2,50 mm a 3,70 mm (Win HK, y col. 2007; Melikian N, y col. 2006). Un estudio del Colegio Americano de Cardiología dio a conocer que el "uso no aprobado" es común y tiene una frecuencia aumentada con el tiempo (Rao SV, y col. 2006). Además, estudios han demostrado que el SLF causa un retardo significante en la cura arterial debido a la deposición de fibrina persistente y pobre endotelización cuando se compara con los sitios de implantación del SMSR (Finn A, y col. 2007). Los hallazgos angioscópicos muestran un recubrimiento neointimal incompleto de stents liberadores de sirolimus (Kotani J, y col. 2006). También, factores de riesgo del paciente como diabetes, fallo renal y complicaciones previas han contribuido a las incidencias de la trombosis tardía en los pacientes que han recibido SLF (Jaffe R, y col. 2007).
Estas preocupaciones han dado lugar a la idea de un stent idal que debe diseñarse para controlar y dirigir la reparación del vaso después de la cirugía sin provocar una respuesta inflamatoria indeseada ni llevar finalmente a una pared de vaso re-endotelializada.
Breve descripción de la invención
De conformidad con el fin de la presente invención, según se realiza y se describe en general en el presente documento, la presente invención se refiere a péptidos amfífilos tal como se define en las reivindicaciones para su uso en la producción de una nanomatriz que imita endotelio. La nanomatriz que imita endotelio desvelada puede usarse para recubrir dispositivos médicos tales como stents vasculares. Ventajas adicionales del método y composiciones desveladas se expondrán en parte en la siguiente descripción y, en parte, se entenderán a partir de la descripción o pueden aprenderse por la práctica del método y composiciones desveladas. Las ventajas del método y composiciones desveladas se realizarán y alcanzarán mediante los elementos y combinaciones particularmente señaladas en las reivindicaciones anexas. Se debe entender que tanto la anterior descripción general como la siguiente descripción detallada, son ejemplares y explicativas únicamente y no restrictivas de la invención como se reivindica.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen parte de esta especificación, ilustran varias realizaciones del método y composiciones desveladas y junto con la descripción, sirven para explicar los principios del método y composiciones desveladas.
La Figura 1 muestra mecanismos y líneas de tiempo de la reestenosis. La proliferación neointimal es la causa principal de la reestenosis en stents metálicos sin recubrimiento (SMSR). Véase Dobesh, P. P., y col. (2004). Pharmacotherapy, 24(11): 1554-77.
La Figura 2A muestra la estructura química de diaceniodiolatos. La Figura 2B muestra la formación de diaceniodiolatos mediante la reacción de una amina nucleófila (X-) con NO. La Figura 2C muestra la disociación de diaceniodiolatos sobre la protonación para liberar NO libre. La Figura 2D muestra la estructura de la Lisina. Tiene dos grupos amina colgantes para la unión de NO.
La figura 3 muestra la estructura moléculas de PA. YIGSR (SEQ ID NO:2) es un ligando adhesivo celular y KKKKK (SEQ ID NO:3) es un donador de NO.
La Figura 4 muestra imágenes TEM de nanofibras autoensambladas inducidas por evaporación. Se muestran PA-YIGSR (A), PA-KKKKK (B), PA-YK (C) y PA-YK-NO (D).
La Figura 5 muestra la unión inicial de HUVEC y AoSMC sobre nanomatriz de PA-YK (relación molar 9:1 de PA-YIGSR y PA-KKKKK). La unión celular se normaliza a la de la unión sobre el vidrio. Las HUVEC muestran una unión significativamente superior que las AoSMC después de 2 h (p>0,05). La barra de error representa la desviación media ± estándar para n=12.
La Figura 6 muestra la propagación inicial de HUVEC y AoSMC sobre recubrimientos de PA-YK. Las HUVEC muestran una propagación significativamente superior que las AoSMC después de 2 h (p>0,01). La barra de error representa la desviación media ± estándar para n=12.
La Figura 7 muestra imágenes fluorescentes de HUVEC y AoSMC sobre PA-YK después de 2 horas de uso de AM de calceína. La Figura 7A muestra que las HUVEC logran su morfología de propagación regular a las 2 horas. La Figura 7B muestra que las AoSMC permanecen con forma redondeada.
La Figura 8 muestra la unión plaquetaria sobre Colágeno, nanomatrices de PA-YK y PA-YK-NO después de la incubación con sangre de ser humano durante 15 minutos. La adhesión plaquetaria es significativamente menos sobre películas de PA-YK-NO en comparación con películas recubiertas con PA-YK o colágeno I. Los datos representan la media de las tres muestras. La barra de error representa la desviación media ± estándar. (*: p<0,05 en comparación con colágeno I; #: p < 0,05 en comparación con PA-YK).
La Figura 9 muestra la proliferación de HUVEC y AoSMC cultivadas sobre nanomatrices de A-YK y PA-YK-NO después de 48 horas, evaluadas cuantitativamente mediante tinción de PCNA. La PA-YK-NO aumenta la proliferación de HUVEC pero reduce la proliferación de AoSMC. Los resultados se expresan como el porcentaje de células positivas de PCNA. Los datos representan la media de cuatro muestras. La barra de error representa la desviación media ± estándar. (*, #: p < 0,05).
La Figura 10 muestra la liberación de NO a partir de películas de PA-YK-NO en HBS a un pH de 7,4, 37 °C. El 53 % de NO total liberado que mostraba perfil multifásico más de un mes. Los datos representan la media de cuatro muestras. La barra de error representa la desviación media ± estándar.
La Figura 11 muestra una representación esquemática de la técnica de recubrimiento de stent con nanomatriz. La Figura 12 muestra la imagen SEM de 0,1 % en peso de stent recubierto con PAYK después de su manipulación por el practicante. Cabe destacar la superficie de recubrimiento uniforme suave que permanece inalterada después de su manipulación (montaje sobre balón de angioplastia y expansión).
La Figura 13A muestra el inflamiento del balón para desplegar el stent en la arteria iliaca de conejo. La Figura 13B muestra la sección de histología de un 1 % en peso de stent recubierta con nanomatriz después de 4 semanas del implante. Pequeña hiperplasia neointimal y sin trombos encontrados sobre la superficie de los stents recubiertos con nanomatriz.
La Figura 14 muestra el espesor neointimal a las 2 semanas. Se observó una tendencia aparente hacia un espesor de NI inferior en los stents de alta dosis en comparación con el control. N=2 stents por grupo.
La Figura 15 muestra el espesor neointimal a las 4 semanas. NI fue superior que a las 2 semanas, pero la tendencia hacia un NI inferior en tanto grupos de baja dosis como de alta dosis pareció persistir, en comparación con los controles. N=2 stents por grupo.
La Figura 16 muestra las puntuaciones de inflamación a las 2 semanas. Las puntuaciones de inflamación promedio de todos los grupos de estudio fueron inferiores a 0,5. N=2 stents por grupo.
La Figura 17 muestra las puntuaciones de inflamación a las 4 semanas. Las puntuaciones de inflamación promedio de todos los grupos de estudio fueron inferiores a 0,5. N=2 stents por grupo.
La Figura 18 muestra las puntuaciones de trombo a las 4 semanas. La puntuación de trombo promedia fue inferior a 0,1 para todos los grupos de stent sin diferencia significativa entre los grupos. N=2 stents por grupo.
La Figura 19 muestra la fabricación de una nanomatriz biomimética híbrida liberadora de NO. La Figura 19A muestra péptidos amfífilos liberadores de NO de PA-YK-NO, de 8 nm de diámetro, están recubriendo nanofibras de ePCL, 300-500 nm de diámetro, para crear una nanomatriz híbrida, ePCL-PA-YK-NO. La Figura 19B muestra la presencia de ligandos YIGSR y liberación de NO promueve la adhesión, propagación y proliferación de células endoteliales, mientras que simultáneamente limita la adhesión, propagación y proliferación de células de músculo liso.
La Figura 20 muestra imágenes SEM de nanomatrices híbridas 5000x. (A) ePCL. (B) ePCL+PA-YK. (C) ePCL+PA-YK-NO.
La Figura 21 muestra imágenes TEM de nanomatrices híbridas 67000x que muestran el autoensamblaje exitoso. (A) ePCL. (B) ePCL+PA-YK. (C) ePCL+PA-YK, inclinado a 21°. (D) ePCL+PA-YK-NO. (E) ePCL+PA-YK-NO, inclinado a 21°.
La Figura 22 muestra que la adhesión de HUVEC aumenta con la concentración creciente de PA-YIGSR. ePCL-PA-YK75 (*) y ePCL-PA-YK90 (#) mostraron una adhesión de HUVEC significativamente aumentada cuando se comparó con ePCL-PA-YK50, ePCL-PA-YK25 y ePCL.
La Figura 23 muestra el perfil de liberación de NO durante más de 28 días.
La Figura 24 muestra la morfología de las HUVEC a las 2 horas sobre (A) ePCL (B) ePCL-PA-YK (C) ePCL-PA-YK-NO. Bara de escala = 20 pm.
La Figura 25 muestra la morfología de las AoSMC a las 2 horas sobre (A) ePCL (B) ePCL-PA-YK (C) ePCL-PA-YK-NO. Bara de escala = 20 pm.
La Figura 26 muestra la adhesión celular sobre nanomatriz híbrida a las 2 h. Las HUVEC mostraron una adhesión significativamente aumentada sobre (*) ePCL+PA-YK y (#) ePCL-PA-YK-NO cuando se compararon con ePCL. La Figura 27 muestra el porcentaje de células proliferantes sobre las nanomatrices híbridas. Las HUVEC mostraron una proliferación significativamente superior sobre ePCL+PA-YK-NO cuando se compararon con ePCL+PA-YK(*). Las AoSMCs mostraron una proliferación significativamente inferior sobre ePCL+PA-YK-NO cuando se compararon con ePCL+PA-YK(#).
Descripción detallada
El método y composiciones desveladas pueden entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones particulares y el Ejemplo incluido en el presente documento y a las Figuras y su descripción previa y la que sigue.
Se divulgan materiales, composiciones y componentes que se pueden utilizar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparación de, o son productos del método y composiciones divulgadas. Las publicaciones descritas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe interpretarse que nada en el presente documento constituya una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteponer dicha publicación por virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas en el presente documento pueden ser distintas de las fechas de publicación reales, que pueden requerir una confirmación independiente. La descripción de las referencias indica lo que afirman sus autores y el Solicitante se reserva el derecho a impugnar la precisión y pertinencia de los documentos citados.
A. Definiciones
La presente invención se puede entender más rápidamente con referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y los Ejemplos incluidos en la misma.
Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una", y "el/la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto estipule claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un péptido" incluye una pluralidad de tales péptidos, la referencia al "péptido" es una referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, y así sucesivamente.
"Opcional" o "de forma opcional" significa que el suceso, circunstancia o material posteriormente descrito, puede o no puede producirse o estar presente y que la descripción incluye casos en los que el suceso, circunstancia o material se produce o está presente y casos en los que no se produce o no está presente.
Los intervalos se pueden expresar como desde "aproximadamente" un valor particular y /o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización incluye desde el valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del precedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular constituye otra realización. Se entenderá adicionalmente que los parámetros de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro parámetro como independientemente del otro parámetro. Se entiende también que en el presente documento se divulga un número de valores y que cada valor se divulga también en el presente documento como "aproximadamente" este valor particular además del valor mismo. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", entonces se divulga también "aproximadamente 10". También se entiende que cuando se divulga un valor que es "inferior a o igual a " el valor, "superior a o igual al valor" y posibles intervalos entre los valores también se desvelan, tal como entiende apropiadamente el experto en la materia. Por ejemplo, si se desvela el valor "10" también se desvela el "inferior a o igual a 10" así como el "superior a o igual a 10". También se entiende que en toda la solicitud, los datos se proporcionan en una cantidad de distintos formatos y que estos datos, representan los parámetros y puntos de partida e intervalos para cualquier combinación de los puntos de datos. Por ejemplo, si un punto particular "10" y un punto de datos particular 15 se desvelan, se entiende que superior a, superior a o igual a, inferior a, inferior a o igual a e igual a 10 y 15 se consideran desvelados así como entre 10 y 15. Se entiende también que cada unidad entre dos unidades particulares se divulgan también. Por ejemplo, si se divulga 10 y 15, entonces 11, 12, 13 y 14 se divulgan también. A lo largo de la descripción y reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender" y variaciones de la palabra, tales como "que comprende" y "comprende", significa "incluyendo, pero sin limitación" y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, los componentes, números enteros o etapas.
Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere al manejo médico de un paciente con la intención de curar, recuperar, estabilizar, o prevenir una enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, tratamiento dirigido específicamente hacia la mejora de una enfermedad, afección patológica, o trastorno, y también incluye a tratamiento causal, es decir, tratamiento dirigido hacia la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, tratamiento designado para el alivio de los síntomas más que para la cura de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado; tratamiento preventivo, es decir, tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado; y tratamiento de soporte, es decir, tratamiento que se emplea para complementar otra terapia específica que está dirigida a la mejora de la enfermedad, afección patológica, o trastorno asociado. Se entiende adicionalmente y se contempla en el presente documento que un tratamiento no tiene que resultar en la completa ablación de una enfermedad o afección, sino que puede referirse a cualquier reducción en la presencia de una enfermedad o afección o síntomas del mismo de modo que se observa una mejora en el estado no tratado del sujeto con la enfermedad o afección. En consecuencia, tratamiento puede referirse a un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 %, de mejora en cualquier síntoma o causa subyacente en una enfermedad o afección. Por ejemplo, una composición o dispositivo que dé como resultado un 10 % de reducción en artio placas con respecto a la cantidad de bloqueo antes de la administración de dicha composición o dispositivo sería un tratamiento.
Como se usa en el presente documento, el término "prevenir" o "que previene" se refiere a evitar, prevenir, obviar, impedir, detener u obstaculizar algo de que ocurra, especialmente mediante una acción por avanzado. Se comprende que se usar reducir, inhibir o prevenir en el presente documento, a menos que se indique específicamente lo contrario, el uso de las otras dos palabras también se desvela expresamente.
Como se usa en el presente documento, los términos "administrar" y "administración" se refiere a cualquier método de provisión de una preparación farmacéutica a un sujeto. Tales métodos son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen, aunque no de forma limitativa, administración oral, administración transdérmica, administración por inhalación, administración nasal, administración tópica, administración intravaginal, administración oftálmica, administración intraaural, administración intracerebral, administración rectal y administración parenteral, incluido inyectable tal como administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular y administración subcutánea. La administración puede ser continua o intermitente. En diversos aspectos, una preparación se puede administrar terapéuticamente; es decir, administrar para tratar una enfermedad o afección existente. En estos diversos aspectos, una preparación se puede administrar profilácticamente; es decir, administrada para la prevención de una enfermedad o afección.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a una diana de administración. El sujeto de los métodos desvelados en el presente documento puede ser un vertebrado, tal como un mamífero, un pez, un ave, un reptil o un anfibio. Por tanto, el sujeto de los métodos desvelados en el presente documento puede ser un ser humano, un primate no humano, caballo, cerdo, conejo, perro, oveja, cabra, vaca, gato, conejillo de india o roedor. El término no indica una edad o género en particular. Por tanto, sujetos adultos y recién nacidos, así como fetos, sean macho o hembra, están destinados a estar cubiertos. Un paciente se refiere a un sujeto afligido por una enfermedad o trastorno. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios.
Como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para lograr un resultado deseado o para tener un efecto sobre síntomas indeseados, pero generalmente es insuficiente para causar efectos secundarios adversos. El nivel específico de dosis eficaz para cualquier paciente concreto dependerá de una diversidad de factores, incluyendo el trastorno que se esté tratando y la gravedad del trastorno; la composición específica empleada; la edad, del peso corporal, el estado de salud general, género y dieta del paciente; el tiempo de administración; la vía de administración; la tasa de excreción del compuesto empleado concreto; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o casuales con el compuesto específico empleado y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está bein dentro de las habilidades del experto en iniciar dosis de un compuesto a niveles inferiores que los requeridos para conseguir el efecto deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede dividirse en múltiples dosis para fines de administración. Por consiguiente, composiciones de dosis única pueden contener tales cantidades o submúltiplos de la misma para componer la dosis diaria. Cada médico puede ajustar la dosis en el caso de cualquier contraindicación. La dosificación puede variar, y se puede administrar en una o más administraciones de la dosis diariamente, durante uno o varios días. Se pueden encontrar en la bibliografía directrices para las dosis adecuadas de clases dadas de productos farmacéuticos. En un aspecto adicional, una preparación puede administrarse en una "cantidad diagnósticamente eficaz"; es decir, una cantidad eficaz para la diagnosis de una enfermedad o afección. En un aspecto adicional, una preparación puede administrarse en una "cantidad terapéuticamente eficaz"; es decir, una cantidad eficaz para el tratamiento de una enfermedad o afección. En un aspecto adicional, una preparación puede administrarse en una "cantidad profilácticamente eficaz"; es decir, una cantidad eficaz para la prevención de una enfermedad o afección.
Como se usa en el presente documento, la expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a soluciones acuosas o no acuosas estériles, dispersiones, suspensiones o emulsiones, así como polvos estériles para su reconstrucción en soluciones inyectables estériles o dispersiones justo antes de su uso. Ejemplos de transportadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos tales como parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro sódico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse por la inclusión de agentes, tales como monoestearato de aluminio y gelatina, que retardan la absorción. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Dependiendo de la relación de fármaco a polímero y la naturaleza del polímero particular puede controlarse la tasa de liberación del fármaco. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que con compatibles con tejidos corporales. Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Los transportadores inertes adecuados pueden incluir azúcares tales como lactosa. De forma deseable, al menos el 95 % en peso de las partículas del principio activo tiene un tamaño de partícula eficaz en el intervalo de 0,01 a 10 micrómetros.
Como se usa en el presente documento, la expresión "agente biológicamente activo" o "agente bioactivo" se refiere a un agente que es capaz de proporcionar un efecto biológico, fisiológico o terapéutico local o sistémica en el sistema biológico al que se aplica. Por ejemplo, el agente bioactivo puede actuar para controlar la infección o inflamación, mejorar el crecimiento celular y regeneración tisular, controlar el crecimiento de tumores, actuar como analgésico, promover la unión anti-celular y potenciar el crecimiento óseo, entre otras funciones. Otros agentes bioactivos adecuados pueden incluir agentes antivíricos, hormonas, anticuerpos o proteínas terapéuticas. Otros agentes bioactivos incluyen profármacos, que son agentes que no están biológicamente activos cuando se administran, pero, cuando se administran a un sujeto se convierten en agente bioactivos mediante el matabolismo u otro mecanismo. Adicionalmente, cualquiera de las composiciones de la invención puede contener combinaciones de dos o más agente bioactivos. Se entiende que un agente biológicamente activa puede usarse en conexión con la administración a diversos sujetos, por ejemplo, a seres humanos (es decir,administración médica) o a animales (es decir, administración veterinaria).
Como se usa en el presente documento, la expresión "agente farmacéuticamente activo" incluye un "fármaco" o una "vacuna" y significa una molécula, grupo de moléculas, complejo o sustancia administrada a un organismo para fines diagnósticos, terapéuticos, preventivos o fines veterinarios. La expresión incluye externa e internamente administrados, tópicos, localizados y sistémicos, humanos y animales farmacéuticos, tratamientos, remedios, nutracéuticos, cosmecéuticos, biológicos, dispositivos, diagnósticos y anticonceptivos, incluidas preparaciones útiles en el cribado clínico y veterinario, prevención, profilaxis, curación, mejora, detección, formación de imágenes, diagnosis, terapia, cirugía, control, cosmético, prótesis, forense y similares. Este término también puede usarse en referencia a terapéuticos o remedios agrícolas, laborales, militares, industriales y medioambientales que comprenden moléculas seleccionadas o secuencias de ácidos nucleicos seleccionados capaces de reconocer receptores celulares, receptores de membrana, receptores de hormona, receptores terapéuticos, microbios, virus o dianas seleccionas que comprenden o son capaces de entrar en contacto con plantas, animales y/o seres humanos. Este término también puede incluir específicamente ácidos nucleicos y compuestos que comprenden ácidos nucleicos que producen un efecto bioactivo, por ejemplo, ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Agentes farmacéuticamente activos incluyen las categorías y ejemplos específicos desvelados en el presente documento. No se pretende que la categoría esté limitada de por los ejemplos específicos. Los expertos en la técnica reconocerán numerosos otros compuestos que entran dentro de las categorías y que son útiles de acuerdo con la invención. Ejemplos incluyen un radiosensibilizador, la combinación de un radiosensibilizador y un quimioterapéutico, un esteroide, una xantina, un broncodilatador agonista beta-2, un agente antiinflamatorio, un agente analgésico, un antagonistas de calcio, un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina, un beta-bloqueante, un alfa-agonista centralmente activo, un alfa-1-antagonista, un agente anticolinérgico/antiespasmódico, un análogo de la vasopresina, un agente antiarrítmico, un agente antiparkinsoniano, un agente antianginoso/antihipertensivo, un agente anticoagulante, un agente antiplaquetario, un sedante, un agente ansiolítico, un agente peptídico, un agente biopolimérico, un agentes antineoplásico, un laxante, un agente antidiarreico, un agente antimicrobiano, un agente antifúngico, una vacuna, una proteína o un ácido nucleico. En un aspecto adicional, el agente farmacéuticamente activo adicional puede ser cumarina, albúmina, bromolidina, esteroides tales como betametasona, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona, budesonida, hidrocortisona y derivados de hidrocortisona farmacéuticamente aceptables; xantinas tales como teofilina y doxofilina; broncodilatadores agonistas beta-2 tales como salbutamol, fenterol, clenbuterol, bambuterol, salmeterol, fenoterol; agentes antiinflamatorios, incluyendo agentes antiinflamatorios antiasmáticos, agentes antiinflamatorios antiartríticos y agentes antiinflamatorios no esteroideos, ejemplos de los cuales incluyen, aunque no de forma limitativa a sulfidas, mesalamina, budesonida, salazopirina, diclofenaco, sales de diclofenaco farmacéuticamente aceptables, nimesulida, naproxeno, acetominofeno, ibuprofeno, ketoprofeno y piroxicam; agentes analgésicos tales como salicilatos; agentes de bloque de canal de calcio tales como nifepidino, amiodipino y nicardipino; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina tales como captoprilo, clorhidrato de benazeprilo, sodio de fosinoprilo, trandolaprilo, ramiprilo, lisinoprilo, enalaprilo, clorhidrato de quinaprilo y clorhidrato de moexiprilo; bloqueadores beta (es decir, agentes bloqueadores beta-adrenérgicos) tales como hidrocloruro de sotalol, maleato de timolol, clorhidrato de esmolol, carteolol, clorhidrato de propanolol, clorhidrato de betaxolol, sulfato de penbutolol, tartrato de metoprolol, succinato de metoprolol, clorhidrato de acebutolol, atenolol, pindolol y fumarato de bisoprolol; agonistas alfa-2 activos centralmente tales como clonidina; antagonistas alfa-1 tales como doxazosina y prazosina; agentes anticolinérgicos/antiespasmódicos tales como hidrocloruro de diciclomina, hidrobromuro de escopolamina, glicopirrolato, bromuro de clidinio, flavoxato y oxibutina; análogos de la vasopresina tales como vasopresina y desmopresina; agentes antiarrítmicos tales como quinidina, lidocaína, hidrocloruro de tocainida, hidrocloruro de mexiletina, digoxina, clorhidrato de verapamilo, hidrocloruro de propafenona, acetato de flecainida, hidrocloruro de procainimida, hidrocloruro de moricizina y fosfato de disopiramida; agentes antiparkinsonianos, tales como dopamina, L-Dopa/Carbidopa, selegilina, dihidroergocriptina, pergolida, lisurida, apomorfina y bromocriptina; agentes antianginosos y agentes antihipertensivos tales como mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida, propranolol, atenolol y verapamilo; agentes anticoagulantes y antiplaquetarios tales como coumadina, warfarina, ácido acetilsalicílico y ticlopidina; sedantes tales como benzodiazepinas y barbituratos; agentes ansiolíticos tales como lorazepam, bromazepam y diazepam; agentes peptídicos y biopoliméricos tales como calcitonina, leuprolida y otros agonistas de LHRH, hirudina, ciclosporina, insulina, somatostatina, protirelina, interferón, desmopresina, somatotropina, timopentina, pidotimod, eritropoyetina, interleucinas, melatonina, granulocito/macrófago-CSF y heparina; agentes antineoplásicos tales como etoposido, fosfato de etopósido, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, vincristina, doxorrubicina, cisplatino, hidroxiurea, leucovorina cálcica, tamoxifeno, flutamida, asparaginasa, altretamina, mitotano, e hidrocloruro de procarbazina; laxantes tales como concentrando de senna, casantranol, bisacodilo y picosulfato sódico; agentes antidiarréicos tales como hidrocloruro de difenoxina, clorhidrato de loperamida, furazolidona, hidrocloruro de defenoxilato y microorganismos; vacunas tales como vacunas bacterianas y virales; agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas y macrólidos, agentes antifúngicos tales como derivados imidazólicos y triazólicos; y ácidos nucleicos tales como secuencias de DNA que codifican proteínas biológicas, y oligonucleótidos antisentido. Se entiende que un agente farmacéuticamente activo puede usarse en conexión con la administración a diversos sujetos, por ejemplo, seres humanos (es decir, administración médica) o a animales (es decir, administración veterinaria).
Un residuo de una especie química, como se usa en la memoria descriptiva incluidas las reivindicaciones, se refiere a la fracción que es el producto resultante de la especie química en un esquema de reacción particular o posterior formulación o producto químico, independientemente de si la fracción se ha obtenido realmente de la especie química. Por tanto, un residuo de etilenglicol en un poliéster se refiere a una o más unidades de -OCH2 CH2 O en el poliéster, independientemente de si se usó etilenglicol para preparar el poliéster. De manera similar, un residuo de ácido sebáceo en un poliéster se refiere a una o más fracciones de -CO(CH2 )8 CO- en el poliéster, independientemente de si el residuo se obtiene reaccionando ácido sebáceo o un éster del mismo para obtener el poliéster.
Como se usa en el presente documento, el término "sustituido" se contempla que incluye todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un amplio aspecto, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes de compuestos orgánicos acíclicos y cíclicos, ramificados o no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos y aromáticos y no aromáticos. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, los descritos a continuación. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más y el mismo o diferente para los compuestos orgánicos adecuados. Para los fines de esta divulgación, los heteroátomos, tales como nitrógeno, puede tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyente permisible de compuestos orgánicos descritos en el presente documento que reúnan las valencias de los heteroátomos. Esta divulgación no pretende estar limitada de ninguna manera por los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. También, los términos "substitución" o "substituido con" incluyen la condición implícita de que cada sustitución está conforme con la valencia permitida del átomo sustituido y del sustituyente y de que la sustitución da como resultado un compuesto estable, por ejemplo, un compuesto que no sufre espontáneamente la transformación como por redistribución, ciclación, eliminación, etc.
Para definir varios términos, "A1," "A2," "A3," y "A4" se utilizan en el presente documento como símbolos genéricos para representar varios sustituyentes específicos. Estos símbolos pueden ser cualquier sustituyente, sin limitarse a los que se divulgan en el presente documento y cuando se define que son determinados sustituyentes en un caso, pueden, en otro caso, definirse como algún otro sustituyente.
El término "alquilo", como se usa en el presente documento es un grupo hidrocarburo saturado, ramificado o no ramificado, de 1 a 24 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, tbutilo, n-pentilo, isopentilo, s-pentilo, neopentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y similares. El grupo alquilo puede también estar sustituido o no sustituido. El grupo alquilo puede estar sustituido por uno o más grupos que incluyen, pero sin limitación, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, alcoxi, amino, éter, haluro, hidroxi, nitro, sililo, sulfo-oxo o tiol, como se describe en el presente documento. Un grupo "alquilo inferior" es un grupo alquilo que contiene de uno a seis átomos de carbono.
A lo largo de la memoria descriptiva "alquilo" se usa generalmente para referirse tanto a grupos alquilo no sustituidos como a grupos alquilo sustituidos; sin embargo, también se hace referencia específicamente en el presente documento a los grupos alquilo sustituidos mediante identificación de los sustituyentes específicos en el grupo alquilo. Por ejemplo, el término "alquilo halogenado" se refiere específicamente a un grupo alquilo que está sustituido por uno o más haluros, por ejemplo, flúor, cloro, bromo o yodo. El término "alcoxialquilo" se refiere específicamente a un grupo alquilo que está sustituido por uno o más grupos alcoxi, como se describe más adelante. El término "alquilamino" se refiere específicamente a un grupo alquilo que está sustituido por uno o más grupos amino, como se describe a continuación y similares. Cuando se utiliza "alquilo" en un caso y un término específico como "alquilalcohol" se usa en otro caso, no pretende implicar que el término "alquilo" no se refiere tampoco a los términos específicos tales como "alquilalcohol" y similares.
Esta práctica se usa también para otros grupos descritos en el presente documento. Es decir, mientras que un término tal como "cicloalquilo" se refiere a ambas fracciones cicloalquilo sustituidas y no sustituidas, las fracciones sustituidas pueden, además, ser específicamente identificadas en el presente documento; por ejemplo, un cicloalquilo sustituido particular se puede denominar, por ejemplo, "alquilcicloalquilo". De manera similar, un alcoxi sustituido se puede denominar específicamente, por ejemplo, un "alcoxi halogenado", un alquenilo sustituido particular puede ser, por ejemplo, un "alquenilalcohol", y similares. De nuevo, la práctica de usar un término general, tal como "cicloalquilo", y un término específico, tal como "alquilcicloalquilo", no pretende implicar que el término general no incluye tampoco el término específico.
La expresión "grupo de polialquileno" tal como se usa en el presente documento es un grupo que tiene dos o más grupos CH2 unidos entre sí. El grupo de polialquileno puede representarse por la fórmula -(CH2)a-, donde "a" es un número entero de 2 a 500.
Los términos "alcoxi" y "alcoxilo" como se usan en el presente documento para referirse a un grupo alquilo o cicloalquilo unido a través de un enlace éter; es decir, un grupo "alcoxi" se puede definir como -OA 1 donde A 1 es alquilo o cicloalquilo tal y como se ha definido anteriormente. "Alcoxi" también incluye polímeros de grupos alcoxi tal y como se acaban de describir; es decir, un alcoxi puede ser un poliéter tal como -OA 1 -OA 2 o- OA 1 -(OA 2 )a-OA 3 , donde "a" es un número entero de 1 a 200 y A 1 , A 2 , y A 3 son grupos alquilo y/o cicloalquilo.
El término "alquenilo" como se usa en el presente documento es un grupo hidrocarburo de 2 a 24 átomos de carbono con una fórmula estructural que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Las estructuras asimétricas tales como (A 1 A 2 )C=C(A 3 A 4 ) pretenden incluir los isómeros E y Z. Esto se puede suponer en las fórmulas estructurales en el presente documento en las que está presente un alqueno asimétrico o se puede indicar explícitamente por el símbolo de unión C=C. El grupo alquenilo se puede sustituir por uno o varios grupos incluyendo, pero sin limitación, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, aldehído, amino, ácido carboxílico, éster, éter, haluro, hidroxi, cetona, azida, nitro, sililo, sulfo-oxo o tiol, como se describe en el presente documento.
El término "alquinilo" como se usa en el presente documento es un grupo hidrocarburo de 2 a 24 átomos de carbono con una fórmula estructural que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono. El grupo alquinilo puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos que incluyen, pero sin limitación, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, aldehído, amino, ácido carboxílico, éster, éter, haluro, hidroxi, cetona, azida, nitro, sililo, sulfo-oxo o tiol, como se describe en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión "péptido amfífilo" se refiere a un compuesto peptídico que posee tanto una porción hidrófila (por ejemplo, una fracción de secuencia de péptidos hidrófilos) como una porción hidrófoba (por ejemplo, una fracción de hidrocarburo). Una propiedad típicamente asociada con un péptido amfífilo puede ser el autoensamblaje.
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia peptídica hidrófila" se refiere a una secuencia de residuo peptídico que tiene propiedades de hidrofilicidad con respecto a una fracción de hidrocarburo. Una secuencia peptídica hidrófila puede comprender una o más secuencias peptídicas funcionales (por ejemplo, secuencias peptídicas degradables, donadores de óxido nítrico y/o ligandos adhesivos celulares).
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de degradación" se refiere a una secuencia de residuos peptídicos que puede degradarse mediante enzimas o hidrólisis en condiciones biológicas.
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de adhesivo celular" se refiere a una secuencia de residuos peptídicos capaces de funcionar como ligandos adhesivos para las células. En un aspecto, debido a las características amfílicas de los péptidos amfífilos, las secuencias adhesivas celulares desveladas se exponen en la superficie exterior de un ensamblaje de nanofibras; por lo tanto, tal secuencia de adhesivo celular puede estar disponible para la interacción con una o más células. Un ejemplo es una "secuencia de adhesivo celular endotelial", que se refiere a una secuencia peptídica que apoya la adhesión celular endotelial, propagación, migración y/o crecimiento.
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de productor donador de óxido nítrico" se refiere a un residuo peptídico (por ejemplo, lisina (K) o cisteína (C)) o una secuencia de residuos peptídicos (por ejemplo, polilisina (KKKKK) o policisteína (CCCCC) capaces de unir inversamente gas de óxido nítrico o equivalente del mismo) como un complejo (por ejemplo, diazoniodiolatos). Por tanto, el péptido o secuencia puede servir como una reserva de gas de óxido nítrico y puede liberar selectivamente óxido nítrico con el tiempo. Se entiende que la expresión puede incluir otras donadores de óxido nítrico, por ejemplo, cualquier secuencia peptídica que contiene grupos cisteína o amina.
Como se usa en el presente documento, el término "autoensamblaje" se refiere a la característica de una pluralidad de moléculas de un compuesto en el que un sistema desordenado forma una estructura más organizado o patrón como consecuencia de interacciones específicas, locales entre las moléculas mismas, sin dirección externa. En un aspecto, los péptidos amfífilos pueden ser autoensamblantes. En un aspecto adicional, una pluralidad de moléculas de un compuesto puede autoensamblarse en nanofibras. En otro aspecto más, los péptidos amfífilos pueden autoensamblarse en nanofibras. Aún en un aspecto adicional, los péptidos amfífilos pueden autoensamblarse en nanofibras sin la necesidad de autoreticulación.
B. COMPOSICIONES
La compatibilidad biológica de implantes artificiales puede mejorarse mediante la imitación de sistemas naturales. Por consiguiente, un stent ideal debe tener propiedades similares al endotelio natural. Por tanto, en el presente documento se desvela una nanomatriz que imita el endotelio natural.
El endotelio natural consiste en células endoteliales incorporadas en una matriz extracelular viscoelástica (ECM). Además de proporcionar integridad estructural, la ECM también proporciona un entorno dinámico, funcional, que es crucial para la proliferación, diferenciación y migración celular (Ross JM. 1998). Este concepto ha inspirado el uso de ligandos adhesivos celulares derivados de ECM para armazones biomiméticos para controlar comportamientos celulares. El control de la cinética de degradación de armazones es otro factor importante debido a que la tasa de degradación afecta la producción de ECM in vitro y formación tisular in vivo (Alsberg E,y col. 2003; Bryant SJ, y col.
2002). La migración y proliferación celular dependen de la adhesión celular para muchos tipos distintos de células (Ross JM. 1998). La ECM natural consiste en muchas proteínas fibrilares nanoestructuradas autoensambladas. El endotelio también sirve para mantener el entorno no trombogénico del vaso sanguíneo liberando factores solubles como óxido nítrico (NO). Por lo tanto, la nanomatriz que imita el endotelio natural puede diseñarse para imitar esta complejidad química y biológica del ECM endotelial: 1) unidades de adhesión de células endoteliales para promover una fuerte retención y migración celular endotelial, 2) sitios degradables mediante acción célular para la migración de células endoteliales dentro de la nanomatriz para una fuerte endotelización, 3) estructura nanofibrosa autoensamblada similar a la ECM natural y 4) liberación de NO para promover el alojamiento de células progenitoras endoteliales satélite, junto con la inhibición de reestenosis y trombosis.
Tal como se divulga en el presente documento, puede producirse una nanomatriz que imita el endotelio natural a partir de péptidos amfífilos que comprenden un péptido hidrófilo y una cola hidrófoba, en donde el péptido hidrófilo comprende una o más unidades de adhesión de células endoteliales para promover la fuerte retención y migración de células endoteliales, sitios degradables mediante acción célular para la migración de células endoteliales dentro la nanomatriz para una fuerte endotelización y liberación de NO para promover el alojamiento de células progenitoras endoteliales satélite, junto con la inhibición de reestenosis y trombosis.
Por tanto, en el presente documento se proporciona un péptido amfífilo, que comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célula y una secuencia de un productor donador de óxido nítrico, en donde la secuencia de adhesión de primera célula es una secuencia de adhesión de célula endotelial que no se une a células del músculo liso y/o plaquetas.
Por tanto, la secuencia peptídica hidrófila puede comprender la fórmula:
DS—CA,
en donde — es un enlace covalente directo o indirecto, en donde "DS" es una secuencia de degradación; y en donde "CA" es una secuencia de adhesivo celular endotelial.
La secuencia peptídica hidrófila puede comprender la fórmula:
DS—KK,
en donde — es un enlace covalente directo o indirecto, en donde "DS" es una secuencia de degradación; y en donde "KK" es una secuencia de productor donador de óxido nítrico,
La secuencia peptídica hidrófila puede comprender la fórmula:
DS—CA—KK,
en donde --- es un enlace covalente directo o indirecto, en donde "DS" es una secuencia de degradación; en donde "CA" es una secuencia de adhesivo celular endotelial; y en donde "KK" es una secuencia de productor donador de óxido nítrico.
La secuencia peptídica hidrófila puede comprender la fórmula:
DS---KK---CA,
en donde — es un enlace covalente directo o indirecto, en donde "DS" es una secuencia de degradación; en donde "CA" es una secuencia de adhesivo celular endotelial; y en donde "KK" es una secuencia de productor donador de óxido nítrico.
Tal como se divulga en el presente documento, los péptidos amfífilos pueden usarse para formar una nanomatriz. Se entiende y se contempla en el presente documento que las nanomatrices del presente documento pueden comprender nanofibras recubiertas con amfífilos. Tal como se divulga en el presente documento, las nanofibras pueden comprender fibras de poliéster tales como, por ejemplo, fibras de policaprolactona. Por tanto, ee describen en este documento, por ejemplo, nanofibras de policaprolactona recubiertas con los péptidos amfífilos que se desvelan en el presente documento.
También se desvela en el presente documento una composición que comprende un primer y un segundo péptido amfífilo, cada uno independientemente que comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila del primer péptido amfífilo comprende una secuencia de degradación y una secuencia de adhesivo celular endotelial, y en donde la secuencia de péptido hidrófilo del segundo péptido amfífilo comprende una secuencia de degradación y una secuencia de productor donador de óxido nítrico,
Por tanto, la secuencia peptídica hidrófila del primer péptido amfífilo puede comprender la fórmula:
DS---CA,
en donde cada — es independientemente un enlace covalente directo o indirecto, en donde "DS" es una secuencia de degradación; y en donde "CA" es una secuencia de adhesivo celular endotelial; y la secuencia peptídica hidrófila del segundo péptido amfífilo puede comprender la fórmula:
DS---KK,
en donde "KK" es una secuencia de productor donador de óxido nítrico.
El primer y segundo péptidos amfífilos pueden estar presente en la composición desvelada en una relación de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 20:1, que incluye aproximadamente 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1,4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 o 1:20. Por tanto, el primer y segundo péptidos amfífilos pueden estar presente en la composición en una relación de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1.
Las composiciones que se desvelan en el presente documento pueden comprender adicionalmente uno o más péptidos amfífilos adicionales que comprenden una secuencia de degradación pero que no comprenden ni una secuencia de adhesivo celular endotelial ni una secuencia de productor donador de óxido nítrico. Estos uno o más péptidos amfífilos adicionales pueden comprender fracciones funcionales adicionales. Estos uno o más péptidos amfífilos adicionales pueden comprender secuencias no funcionales. El experto en la técnica puede usar estos péptidos amfífilos adicionales para controlar la concentración del primer y segundo péptidos amfífilos. Por ejemplo, en donde el primer y segundo péptidos amfífilos están presentes en la composición en una relación de aproximadamente 9:1, también pueden estar presentes en la composición con un tercer péptido amfífilo en una relación de, por ejemplo, aproximadamente 9:1:01, 9:1:0.2, 9:1:0.3,9:1:0.4,9:1:0.5, 9:1:0.6, 9:1:0.7,9:1:0.8, 9:1:0.9, 9:1:1, 9:1:2, 9:1:3, 9:1:4, 9:1:5, 9:1:6, 9:1:7, 9:1:8, 9:1:9, 9:1:10. Pueden seleccionarse muchas otras tales combinaciones y mezclas por el experto en la materia y someterse a ensayo para un rendimiento óptimo usando la habilidad habitual.
Las composiciones que se desvelan en el presente documento pueden comprender adicionalmente nanofibras de poliéster tales como una nanofibra de policaprolactona. Por tanto, por ejemplo, en el presente documento se desvelan nanofibras de policaprolactona recubiertas con un primer y segundo péptido amfífilo, en donde el primer péptido amfífilo es PA-YIGSR el segundo péptido amfífilo es PA-KKKKK; y en donde la relación del primer péptido amfífilo con respecto al segundo péptido amfífilo es 9:1.
1. Péptido amfífilo
Un péptido amfífilo (PA) es una estructura amfífila típicamente con una secuencia peptídica hidrófila corta conjugada con una única cola hidrófoba (Paramonov SE, y col. 2006). Dependiendo de su forma, carga y entorno estas moléculas pueden autoensamblarse en láminas, esferas, vástagos, discos o canales (Lowik D, y col. 2004). Los amfífilos con una forma cónica, de modo que el grupo líder hidrófilo es más voluminoso que la cola hidrófoba, son conocidos por formar micelas cilíndricas (Jun HW, y col. 2006). La naturaleza amfífila de los PA es la responsable de su autoensamblaje. En una solución neutra, los aminoácidos cargados negativamente en la estructura principal de los PA pueden ayudar a solubilizarla. Para inducir el autoensamblaje, las fuerzas repelentes debido a la presencia de cargas negativas pueden eliminarse. Esto puede lograrse disminuyendo el pH de la solución de PA o adición de iones divalentes (Hartgerink JD, y col. 2002; Hartgerink JD, y col. 2001; Jun HW, y col. 2005). En una estructura de nanofibras autoensamblada, los cuatro aminoácidos para cercanos al núcleo pueden formar enlaces de hidrógeno. La presencia o ausencia de estos enlaces de hidrógeno puede definir la orientación cilíndrica o esférica de la estructura autoensamblada (Paramonov SE, y col. 2006).
La amfifilicidad se encuentra ampliamente en sistemas biológicos naturales, tal como membranas celulares. Es la principal fuerza conductora responsable del autoensamblaje de biomoléculas en estructuras supramoleculares con orden jerárquico complejo. Este concepto indica el uso de PA para armazones biomiméticos (Curtis A, y col. 2001; Barnes CP, y col. 2007). Los PA que consisten en diversas secuencias bioactivas, como los ligandos adhesivos celulares o secuencias biodegradables, pueden autoensamblarse en condiciones fisiológicas para formar estructuras supramoleculares similares a las biomoléculas de origen natural. Recientemente, se han estudiado exhaustivamente para diversas aplicaciones biomédicas entre las que se incluye el crecimiento de vasos sanguíneos (Malkar NB, y col.
2003; Hosseinkhani H, y col. 2006; Rajangam K, y col. 2006) y reparación de tejido óseo (Hosseinkhani H, y col. 2007; Hosseinkhani H, y col. 2006; Sargeant TD, y col. 2008).
Los PA son patrones atractivos para armazones biomiméticos debido a la facilidad de incorporación de distintas fracciones de adhesión y degradación celular en su estructura principal (Jun HW, y col. 2006; Jun HW, y col. 2005). El péptido amfífilo desvelado en el presente documento pueden en algunos aspectos ser cualquier péptido modificado capaz de autoensamblarse en una nanomatriz. En algunos aspectos, el péptido amfífilo desvelado comprende un péptido hidrófilo y una cola hidrófoba. La longitud del péptido hidrófilo y cola hidrófoba puede seleccionarse de tal modo que el péptido amfífilo mantiene la capacidad de autoensamblaje en una nanomatriz. Por tanto, por ejemplo, la longitud de la cola hidrófoba puede aumentarse para acomodar una longitud aumentada en el péptido hidrófilo. El experto en la técnica utiliza la habilidad diaria para cribar la capacidad de un péptido amfífilo con un péptido hidrófilo seleccionado y una cola hidrófoba seleccionada de autoensamblarse en una nanomatriz.
2. Óxido nítrico (NO)
El NO liberado desde el endotelio se conoce por que bloquea una cantidad de sucesos clave en la cascada de reestenosis. El NO juega un papel clave en la regulación de la homeostasis de pared del vaso (Marin J, y col. 1997; Kuo PC, y col. 1995; Davies KM, y col. 2001). Se libera continuamente desde aminoácido de L-arginina en células endoteliales sanas mediante la sintasa de óxido nítrico, enzima. El NO liberado desde el endotelio estimula la ciclasa de guanililo soluble, aumentando las concentraciones de monofosfato de guanosina cíclico (GMP)(Kuo PC, y col.
1995). El aumento de niveles de GMP cíclico en células de músculo liso vasculares subyacentes al endotelia lleva a la activación de quinasas dependientes de GMP que disminuyen el calcio intracelular, dando como resultado la relajación de las células del músculo liso (CML). La relajación local de las CML en respuesta a una contracción repentina de un vaso sanguíneo es crítica para mantener el flujo sanguíneo laminar (Beckman JS. 1996). El NO liberado en el lumen del vaso sanguíneo aumenta los niveles de GMP cíclico en las plaquetas también. Disminuye la activación plaquetaria y la adhesión a la superficie del endotelio, haciendo que la pared vascular no sea trombogénica. El NO regula el entorno celular dentro del vaso sanguíneo inhibiendo la actividad de los factores de crecimiento liberados desde las plaquetas (Kuo PC, y col. 1995). Debido a su papel antitrombogénico, la incorporación de NO se espera que mejore las propiedades biológicas de las prótesis vasculares. Los polímeros liberadores de NO se han desarrollado exitosamente tales como cloruro de polivinilo, caucho de silicona, polimetacrilato y poliuretano para usos como recubrimientos no trombogénicos para dispositivos cardiovasculares (Reynolds MM, y col. 2004; Verma S, y col.
2005). Por ejemplo, se ha incorporado exitosamente NO en injertos vasculares en la forma de diacenodiolatos (una clase especial de compuesto capaz de liberar NO en la sangre)(Pulfer SK, y col. 1997). Estudios iniciales en conejos muestran que la liberación controlada de NO a partir de microesferas que contienen NO cargadas en stents canalizados limitó la reestenosis intrastent (Do Y, y col. 2004). En otro estudio de 28 días, el suministro de óxido nítrico a base de stent a partir de nitroprussiato de sodio se ha investigado en modelos porciones y ha mostrado reducir la proliferación neointimal (Hou D, y col. 2005). Además de las funciones mencionadas anteriormente, el NO también se conoce por su capacidad de promover el crecimiento celular endotelial, supervivencia y migración (Ziche M, y col.
1994; Kawasaki K, y col. 2003). El NO también juega un papel crítico en la neovascularización parcialmente al reclutamiento de células progenitoras endoteliales en circulación (Aicher A, y col. 2003). A este efecto, el suministro local de NO a partes de hidrogeles ha demostrado potenciar la tasa de reendotelización del vaso (Lipke EA, y col.
2005).
Las propiedades antitrombogénicas, homeostáticas y de pro-endotelización del NO lo convierten en un candidato atractivo como recubrimiento de fármaco terapéutico sobre stents. Sin embargo, la corta vida útil de solo unos pocos segundos in vivo hace que el NO no sea adecuado para la administración directa como fármaco sistémico (Miller M, y col. 2007). También, el gas de NO es complicado de manipular debido a la necesidad de la completa exclusión de oxígeno, que se necesita para evitar su oxidación. Por tanto, los transportadores de NO se usan para estabilizarlo hasta el momento de su liberación (Hanson SR, y col. 1995; Miller M, y col. 2007). En la actualidad, se usan clínicamente dos tipos de fármacos donadores de NO: (1) nitratos orgánicos y (2) nitroprussiato de sodio (Miller M, y col. 2007). La nitroglicerina es un nitrato orgánico clínicamente usado. Se usa en parches transdérmicos para el tratamiento de fallo cardíaco y angina crónica. La nitroglicerina contiene tres grupos nitroxi-éster (nitrito), que se someten a liberación mediada por enzimas. El principal factor limitante de este fármaco es el desarrollo de tolerancia después de un uso continuo prolongado. El nitroprussiato de sodio se usa en hospitales in situ para reducir la presión sanguínea en crisis hipersensibles. Contiene una molécula de hierro coordinada a cinco moléculas de cianuro y una molécula de NO. La molécula de NO se libera rápidamente durante la infusión, mientras que las moléculas de cianuro se liberan gradualmente. Estas moléculas de cianuro pueden alcanzar niveles tóxicos en algunos casos, presentando una limitación principal al uso de este fármaco (Gori T, y col. 2002).
En el presente documento se desvela una clase de compuesto liberador de NO denominado diacenodiolato, también conocido como NONOatos. La estructura química de estos compuestos puede deducirse a partir del nombre: diacen N=N, io: carga positiva normal, diolato: dos oxígenos negativos (Paramonov SE, y col. 2006; Saavedra J, y col. 2000). Lo que sigue es la estructura química de un diaceniodiolato:
Figure imgf000013_0001
Los diaceniodiolatos pueden formarse mediante la reacción de una amina nucleófila (X-) con un NO tal como se muestra en la siguiente reacción:
X- 2NO ^ X-[N(O)NO]-Entonces los diazoniodiolato de disocia sobre la protonación para liberar NO libre tal como se muestra en la siguiente reacción:
X-[N(O)NO]- ^ X- 2NO
Debido a sus propiedades aceptadoras de electrones, el NO puede reaccionar con aminas nucleófilas para formar diazoniodiolatos. Cuando se disuelve en un tampón, sangre o medio de cultivo celular, los diacenodiolatos se someten a protonación y disasociación para liberar NO (Saavedra J, y col. 2000; Keefer LK, y col. 1996; Hrabie JA, y col. 2002). La cinética de liberación puede controlarse mediante la estructura de las aminas nucleófilas. Los diacenodiolatos pueden sintetizarse mediante reacción directa con aminas con alta presión en la ausencia de aire.
Se conocen en la técnica otros compuestos de diacenodiolato liberadores de óxido. Por ejemplo, complejos donadores de NO a base de carbono y nitrógeno están disponibles en la técnica con vidas útiles e un pH fisiológico que varía desde unos pocos segundos a muchos días.
Los diaceniodiolatos más comunes se forman mediante la reacción de aminas secundarios y poliamina con óxido nítrico en medio básico. Estos son sólidos estables, capaces de generar 2 equivalentes de óxido nítrico y la amina de partida en tampones neutrales o acídicos. La vida útil de la generación de No varía desde unos pocos segundos a muchas horas dependiendo de la amina. La descomposición de NO es una reacción espontánea, de primer orden a un pH constante. Un ejemplo de un diaceniodiolato no derivatizado:
Figure imgf000014_0001
i. Diacenodiolato derivatizado de O
Los aniones de diaceniodiolato reaccionan con electrófilos para producir compuestos covalentes estables. Estos compuestos tienen la capacidad de actuar como profármacos, liberando óxido nítrico solo cuando se convierten metabólicamente con el anión de diaceniodiolato. Se han sintetizado varios compuestos de esta clase mediante reacción de haluros de alquilo o arilo, ésteres de sulfato, epóxidos, etc. con los diaceniodiolatos iónicos. Ejemplos de diaceniodiolatos derivatizados de O:
Figure imgf000014_0002
ii. Diaceniodiolatos a base de C
Los compuestos que contienen el grupo diaceniodiolato unido carbono se han conocido durante más de 100 años con nombres tales como "isonitraminas" y "nitrosohidroxilamina" aunque estos no son descripciones precisas de la unión tal como se muestra mediante numerosas determinaciones estructurales por rayos X. Mientras que la unión a un carbono obviamente presente muchas desventajas de flexibilidad para el diseño de nuevos donadores de NO, debe reconocerse que no todos estos materiales producen NO espontáneamente. El intervalo de reactividad de estos compuestos recorre la escala completa desde materiales que son tan estable que nunca se produe NO (raro) hasta los que se descomponen violentamente (también raro). Muchos producen también mezclas de NO y N2O en lugar de NO puro. Ejemplos de diaceniodiolatos a base de C:
Figure imgf000014_0003
iii. Diaceniodiolatos a base de polímero
Para modular el transcurso de tiempo de liberación de NO y también limitar la exposición de NO a sitios seleccionados del organismo, el grupo funcional de diaceniodiolato puede incorporarse en matrices poliméricas. Los polímeros liberadores de No varían desde películas, microesferas y geles hasta polvos y resinas moldeables. Los diaceniodiolatos poliméricos han mostrado mejorar la tromboresistividad en dispositivos intraarteriales y pueden servir como herramientas importantes en la investigación cardiovascular. Ejemplos de un diaceniodiolato a base polímero:
Figure imgf000015_0001
iv. Lisina
Preferentemente, la amina nucleófila se encuentra sobre la cadena lateral (grupo R) de un aminoácido (natural o artificial). Por ejemplo, la amina nucleófila puede encontrarse sobre la cadena lateral (grupo R) de lisina. Como se muestra a continuación, la lisina tiene dos grupos amina colgantes para la unión de NO.
Figure imgf000015_0002
------ C O C r
La liberación controlada de NO a partir de polímeros a base de lisina ha mostrado reducir la unión plaquetaria y proliferación de células de músculo liso, que son las causas principales de reestenosis (Jun H, y col. 2005; Bohl KS, y col. 2000; Jun HW, y col. 2005). Los residuos de lisina pueden tener grupos amina colgantes que reaccionan con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato [K[N(O)NO-]]n.
Por tanto, la secuencia de productor donador de óxido nítrico puede comprender uno o más residuos de lisina modificada con diaceniodiolato. Por tanto, la secuencia de donador productor de óxido nítrico puede comprender el péptido amino modificado con diaceniodiolato [K[N(O)NO-]]n, en donde "n" es de 1 a 20. En algunos aspectos, n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o superior. Por tanto, la secuencia de productor donador de óxido nítrico puede comprender el péptido modificado con diaceniodiolato [K[N(O)NO-]]5.
La secuencia de productor donador de óxido nítrico puede comprender uno o más residuos de lisina que comprenden grupos de amina colgante que reaccionan con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. Por tanto, la secuencia de productor donador de óxido nítrico puede comprender la secuencia de aminoácidos Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:3), en donde uno o más de los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato.
La secuencia de productor donador de óxido nítrico puede comprender uno o más residuos de cisteína que comprenden grupos de tiol colgante que reaccionan con NO para formar un péptido modificado. Por tanto, la secuencia de productor donador de óxido nítrico puede comprender la secuencia de aminoácidos Cys-Cys-Cys-Cys-Cys (SEQ ID NO: 17), en donde uno o más de los residuos de cisteína comprenden grupos de tiol colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato.
Se entiende que cada residuo de lisina puede ser un donador de dos moléculas de óxido nítrico. El número de residuos de lisina o resisudos de lisina modificada con diaceniodiolato puede, por lo tanto, seleccionarse basándose en la cantidad de NO deseado. Esto puede regularse adicionalmente por el experto seleccionando la cantidad o concentración de los péptidos amfífilos que comprenden estos residuos de lisina. Por ejemplo, en el presente documento se desvela una matriz que imita el endotelio que comprende un primer PA que comprende una secuencia de adhesión celular endotelial ("PA-YIGSR") y un segundo PA que comprende una secuencia de donador de NO ("PA-KKKKK") en una relación de 9:1, en donde PA-KKKKK comprende cinco residuos de lisina modificada con diaceniodiolato. El experto en la materia podría, por lo tanto, conseguir el mismo resultado aumentando el número de residuos de lisina modificada con diaceniodiolato en el segundo péptido amfífilo y simultáneamente aumentando la relación del primer PA con respecto al segundo PA (>9:1).
Por tanto, se entiende en el presente documento que la tasa y la duración de liberación de NO puede modularse aumentando o disminuyendo el número de lisinas en el segundo PA o alterando la ración del primer y segundo péptido amfífilo de modo que un aumento en el número de lisina o un aumento en la proporción del segundo amfífilo aumenta la tasa y/o duración de liberación de NO. Por tanto, por ejemplo, la tasa y/o duración de liberación de NO puede aumentarse cambiando el número de lisinas en el segundo amfífilo de PA-KKKKK a, por ejemplo, PA-KKKKKK, PA-KKKKKKK, PA-KKKKKKKK, PA-KKKKKKKKK o PA-KKKKKKKKKK. También, aumentando la relación del segundo amfífilo con respecto al primer amfífilo, la duración y/o tasa de liberación de NO puede aumentarse. Por tanto, la tasa y/o duración de liberación de NO se aumentará cambiando la relación de PA-YIGSR con respecto a PA-KKKKK de 9:1 a, por ejemplo, 9:2, 3:1, 9:4, 2:1, 9:5, 3:2, 9:7, 9:8, 1:1, 9:10, 9:11, 3:4, 3:5, 1:2, 3:7, 3:8, 1:3 o cualquier ración en medio.
De igual modo, la tasa y/o duración de liberación de NO puede disminuirse reduciendo la relación de PA-YIGSR con respecto PA-KKKKK o retirando lisinas de PA-KKKKK. Por tanto, la relación de A-YIGSR con respecto a PA-KKKKK de 10:1, 11:1, 12:1, 13:1 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1 o cualquier ración en medio disminuirá la tasa y/o duración de liberación de NO a una relación de 9:1. También, la disminución del número de lisinas de cinco en PA-KKKKK disminuirá la tasa y/o duración de liberación de NO (es decir, PA-KKKK, PA-KKK, PA-KK o PA-K).
3. Adhesión de CE
La retención de células endoteliales en el lumen de SLF es crítica para su rendimiento. La endotelización da como resultado un recubrimiento no trombogénico a la superficie del stent expuesta, la ausencia del cual deja las riostras de stent en contacto directo con la sangre que fluye y la formación final de trombo. La laminina es el componente principal de la glicoproteína no colágeno de membranas de base y es un mediador de la adhesión, migración, crecimiento y diferenciación celular (Beck K, y col. 1990). YIGSR (SEQ ID NO: 2) es una secuencia de adhesivo celular derivado de laminina, conocido por aumentar la unión, propagación y migración de células endoteliales (Hubbell JA, y col. 1991). La propagación celular a través de YIGSR (SEQ ID NO: 2) se media mediante un receptor asociado a membrana celular de 67-kDa (Massia SP, y col. 1993). El uso de YIGSR (SEQ ID NO: 2) para la modificación de superficies como tereftalato de polietileno y politetrafluoroetileno mostró potenciar selectivamente la adhesión de CE, propagación, migración (Massia SP, y col. 1991; Fittkau MH, y col. 2005) y promover la formación de colonias de CE.
La incorporación de la secuencia de YIGSR (SEQ ID NO: 2) en poliuretano mostró aumentar la adhesión celular endotelial y propagación (Jun H, y col. 2004). Se desarrollaron poliuretanos liberadores de NO incorporando diaceniodiolatos a base de lisina en el polímero (Jun HW, y col. 2005). Este polímero ha mostrado disminuir dramáticamente la adhesión plaquetaria e inhibir la proliferación de células de músculo liso, mientras que estimula la adhesión celular endotelial. Además, se ha observado que la incorporación de la secuencia de YIGSR (SEQ ID NO: 2) en la estructura principal del polímero liberador de NO potencia la proliferación celular endotelial mientras que al mismo tiempo inhibe la unión plaquetaria (Taite LJ, y col. 2008).
El péptido hidrófilo desvelado puede, por lo tanto, comprender una primera secuencia de adhesivo que une de forma selectiva células endoteliales y, por lo tanto, promueve la unión de células endoteliales a una nanomatriz que comprende los péptidos amfífilos desvelados. Por tanto, el péptido amfífilo desvelado puede comprender una primera secuencia de adhesivo que comprende una secuencia de adhesivo celular endotelial que se une a células endoteliales pero no se une sustancialmente a células de músculo liso y/o plaquetas. Por tanto, la secuencia de adhesivo celular endotelial del péptido hidrófilo desvelado puede comprender la secuencia de aminoácidos Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR; SEQ ID NO: 2).
El péptido hidrófilo del péptido amfífilo desvelado puede comprender adicionalmente una más secuencia de adhesivo celular adicional. En algunos aspectos, la una más secuencia de adhesivo celular adicional une células endoteliales y, por lo tanto, promueve la unión de células endoteliales a una nanomatriz que comprende los péptidos amfífilos desvelados. Por tanto, la una más secuencia de adhesivo celular adicional puede ser uno o más de Arg-Gly-Asp (SEQ ID NO:8), Arg-Gly-Asp-Ser (SEQ ID NO:9), Asp-Gly-Glu-Ala (SEQ ID NO:10), Val-Ala-Pro-Gly (SEQ ID NO:11), Arg-Glu-Asp-Val (SEQ ID NO:12), Asp-Gly-Glu-Ala (SEQ ID NO:13) y Lys-Arg-Ser-Arg (SEQ ID NO:14). Otras tales secuencias de adhesivo, incluidas secuencias de adhesivo celular endotelial (selectivas y no selectivas) son conocidas y pueden usarse en los péptidos amfífilos desvelados. El experto en la materia puede cribar péptidos amfífilos que comprenden secuencias de adhesivo celular candidato usando métodos in vitro habituales.
4. Secuencia de degradación
La secuencia de degradación puede comprender una secuencia de aminoácidos que se somete a degradación proteólica mediada por células.
La secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP). Las MMP son endopeptidasas dependientes de zinc que pertenecen a una familia más grande de proteasas conocidas como la superfamilia de metzincina.
Las agrupaciones más comúnmente usadas de MMP se basan parcialmente en la evaluación histórica de la especificidad de sustrato de la MMP y parcialmente en la localización celular de la MMP. Estos grupos son las colagenasas, las gelatinasas, las estromelisinas y las MMp tipo membrana (MT-MMP).
Las colagenasas son capaces de degradar de colágenos fibrilares de triple hélice en fragmentos distintivos 3/4 y 1/4. Estos colágenos son los componentes principales del hueso, cartílago y las MMP son las enzimas de los mamíferos únicamente capaces de degradarlos. Tradicionalmente, las colagenasas son MMP1, el MMP8, MMP13 e MMP18. Además, MMP14 también ha mostrado escindir colágeno fibrilar y más controversialmente hay evidencia de que MMP2 es capaz de colagenolisis.
Los sustratos principales de las geletinasas son colágeno tipo IV y gelatina, y estas enzimas se distinguen por la presencia de un dominio adicional insertado en el dominio catalítico. Esta región de unión a gelatina se posiciona inmediatamente antes del motivo de unión de zinc y forma una unidad de plagado separado que no altera la estructura del dominio catalítico. Las gelatinasas son MMP2 y MMP9.
Las estromelisinas muestran una amplia capacidad de escindir proteínas de matriz extracelular pero son incapaces de escindir los colágenos fibrilares de tripe hélice. Los tres miembros canónicos de este grupo son MMP3, MMP10 e MMP11.
Todas las seis MMP de tipo membrana (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP24 y MMP25) tiene un sitio de escisión de furina en el propéptido, que es un rasgo también compartido por la MMP11.
Ejemplos de sitios de escisión de MMP adicionales se conocen y describen, por ejemplo, en Handbook of proteolytic enzymes,, editado por Alan J. Barrett, Neil D. Rawlings, J. Fred Woessner, Academic Press.
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Por tanto, la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz 2 (MMP2). Por ejemplo, la secuencia de degradación puede comprenden la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (SEQ ID NO: 1:)
Incorporación de una secuencia específica de MMP, tal como una secuencia específica de MMP-2, en la estructura principal del PA puede asegurar que la nanomatriz se somete a degradación proteolítica mediada por células, permitiendo la migración celular a través de la nanomatriz y remodelado final con MEC natural (Jun HW, y col. 2005; Giannelli G, y col. 1997). Para la MMP2, esta escisión se espera entre los residuos de glicina y leucina (Jun HW, y col.
2005).
5. Cola hidrófoba
La cola hidrófoba puede comprender una fracción que tiene una cadena alquilo C4 o superior opcionalmente sustituida. Por tanto, la cola hidrófoba puede comprender una fracción que tiene una cadena alquilo de C6 a C28 o superior opcionalmente sustituida. Por tanto, la cola hidrófoba puede comprender una fracción que tiene una cadena alquilo de C10 a C25 o superior opcionalmente sustituida. Por tanto, la cola hidrófoba puede comprender una fracción que tiene una cadena alquilo C5, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28 o superior opcionalmente sustituida. Por tanto, la cola hidrófoba puede comprender una fracción que tiene una cadena alquilo C16 opcionalmente sustituida.
6. Realizaciones específicas
La secuencia peptídica hidrófila puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:2). Por tanto, la secuencia peptídica hidrófila puede comprenden la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:4).
La secuencia peptídica hidrófila puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:3), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reaccionan con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. Por tanto, la secuencia peptídica hidrófila puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:5), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato.
La secuencia peptídica hidrófila puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (SEQ ID NO:1), la secuencia de aminoácidos Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:2), y la secuencia de aminoácidos Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:3), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reaccionan con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. Por tanto, la secuencia peptídica hidrófila puede comprender la secuencia peptídica hidrófila que comprende la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:6), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. Por tanto, la secuencia peptídica hidrófila puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-IIe-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:7), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato.
7. Electrohilado
La técnica de electrohilado, también conocida dentro de la industria de formación de fibras como hilado electrostático, de líquido y/o soluciones capaces de formar fibras, es bien conocida y se ha descrito en una cantidad de patentes así como en la bibliografía general. Normalmente, el proceso de electrohilado implica generalmente la creación de un campo eléctrico en la superficie de un líquido. Las fibras producidas por este proceso se han usado en una amplia variedad de aplicaciones y se conocen, a partir de las patentes de EE.UU. n.° 4.043.331 y 4.878.908, para ser particularmente útil en la formación de estructuras no tejidas. Las fuerzas eléctricas resultantes crean un chorro de líquido que porta carga eléctrica. Por tanto, los chorros líquidos pueden atraerse a otros objetos eléctricamente cargados en un potencial eléctrico adecuado. Según el chorro de líquido se alarga y viaja, y se endurecerá y secará. El endurecimiento y secado del chorro alargado de líquido puede ser causado por el enfriamiento de líquido, es decir, cuando el líquido es normalmente un sólido a temperatura ambiente; evaporación del disolvente, por ejemplo, mediante deshidratación, (endurecimiento físicamente inducido); o mediante un mecanismo de curado (endurecimiento químicamente inducido). Las fibras producidas se recogen sobre un receptor ubicado, cargado de forma opuesta y se retira posteriormente de este según sea necesario o se aplica directamente a un área diana generalizada cargada de forma opuesta.
En un aspecto, el electrohilado (ES) en un proceso de atomización de fluido que aprovecha las interacciones entre un campo electrostático y el fluido. En un aspecto, el fluido puede ser un fluido conductor. Durante el electro hilado, las fibras con diámetro micrométrico o submicrométrico se extruden por medio de un potencial electrostático a partir de una solución de polímero (véase Patente de los EE.UU. 1.975.504 a Formhals). Cuando un campo electrostático externo se aplica a un fluido (por ejemplo, una solución de polímero semidiluida o una fusión de polímero), una gota cónica suspendida se encuentra en equilibrio con el campo eléctrico. La atomización electrostática se produce cuando el campo electrostático es lo suficientemente fuerte para superior la tensión de superficie del líquido. La gota líquida entonces se vuelve inestable y se eyecta un diminuto chorro desde la superficie de la gota. Según alcance una diana en tierra, el material puede recogerse como una red interconectada que contiene fibras relativamente finas, es decir, de pequeño diámetro. Las películas resultantes (o membranas) estas fibras de pequeño diámetro tiene un área de superficie muy grande con respecto a relaciones de volumen y pequeños tamaños de poro. Este proceso típicamente produce mallas o fieltros no tejidos compuestos de fibras redondas que son extremadamente plegables. Debido a su área de alta superficie y buenas características mecánicas, las mallas de electrohilado se han encontrado tradicionalmente en aplicaciones de filtración y refuerzo de compuestos. Por las mismas razones, los fieltros y mallas derivadas de polímeros biocompatibles tales como poli(ácido láctico) y su copolímero con ácido glicólico y otros poliésteres se están explorando como sustratos (armazones) para la asociación de células en la ingeniería de tejido (véase Kenawy y col., Biomaterials, 2003, 24 (6), 907 que describe la fabricación de una fibra mediante proceso de electrohilado a partir de un sistema de fase única que contiene etileno-alcohol vinílico, 70 % de propanol y 30 % de agua). Tal medio poroso plegable es particularmente adecuado para la ingeniería de prótesis cutáneas, vasculares y neuronales.
Los parámetros que pueden variarse en el proceso de ES son el campo eléctrico, la distancia entre el "Cono de Taylor" y la diana y la viscosidad de la solución de polímero (Fridrikh y col., G. C. Phys Rev Lett. 2003, 90(14), 144502). Debido a la complejidad del proceso de formación de fibras, se han realizado muy poco s intentos en alterar la geometría de las fibras de electrohilado. Recientemente, Reneker y compañeros han observado la formación de fibras ramificadas y tipo lazo en algunos sistemas de disolvente y han atribuido esto al colapso de una piel de polímero debido a la inestabilidad de deformación similar a lo que se observa en mangueras de jardín (véase Koombhongse y col., Polym. Sci.: Part B: Polym. Phys. 2001, 39, 2598-2606). Sin embargo, la formación de tales fibras no se puede conseguir de un modo predecible con las condiciones de funcionamiento de ES generalmente conocidas. Las patentes de Estados Unidos n.° 4.323.525 y 4.689.186 de Bornat, se dirigen a procesos para la producción de productos tubulares mediante hilado electrostático de un líquido que contiene un material formador de fibras.
El ES es un proceso mediante el cual las fibras con diámetros de tamaño micrométrico y submicrométrico se extrudan a partir de una solución de polímero por medio de un potencial electrostático (FIG. 5). En un proceso de ES típico, la solución de polímero se inyecta a través de una boquilla mientras que se somete a un campo DC de alto voltaje (por ejemplo, 5-30 kV). En tales condiciones, la solución de polímero estalla en un "Cono Taylor" debido a que la gota está siendo sometida a un fenómeno denominado "Inestabilidad de Raleigh", que lleva al latigazo del chorro de polímero. Según se propulsa el chorro, se facilita la formación de fibras mediante evaporación por disolvente y el estrechamiento del chorro. Los parámetros que pueden variarse para afectar la morfología de la fibra incluyen resistencia al campo eléctrico, la distancia entre el "Cono Taylor" y la diana y la viscosidad de la solución de polímero. Debido a la complejidad de la formación del "Cono Taylor", la mayoría de intentos para controlar la morfología de la fibra se ha centrado en el control de las propiedades de la solución de polímero. Esto puede lograrse o bien aumentando la concentración de polímero o el peso molecular o bien aumentando la volatilidad del disolvente orgánico; todo lo cual acelera la tasa en la que las fibras de polímero se solidifican durante el hilado. En general, aumentar la viscosidad y la volatilidad del disolvente da como resultado fibras más gruesas.
Una limitación de los enfoques convencionales es que no permiten alterar otras propiedades de las fibras tales como la relación de aspecto (fibras más redondas frente a más planas) y la porosidad de la fibra lo cual puede tener un gran impacto sobre las interacciones celulares aumentando el área de superficie, lo que puede ser una propiedad deseada en aplicaciones que contienen células e ingeniería de tejidos (IT).
Buenas propiedades mecánicas, alta área de superficie con respecto a relaciones de peso y flexibilidad han hecho que las fibras de electrohilado sean candidatas para una amplia gama de aplicaciones en el refuerzo de filtración y compuestos. Estas características, combinadas con propiedades de polímero específicas, también hacen que el electrohilado sea ideal para armazones de ingeniería de tejido así como dispositivos de suministro de fármacos. Los materiales de electrohilado típicamente poseen una alta relación de aspecto, lo que puede ser una propiedad deseada para diversas aplicaciones, por ejemplo, aplicaciones de ingeniería de tejidos (iT).
El diámetro de fibras se controla típicamente cambiando la resistencia del campo eléctrico (o bien cambiando el voltaje aplicado o la distancia de punta a diana), cambiando las tasas de evaporación (cambiando el entorno de hilado o usando disolvente de distinta volatilidad) o cambiando la concentración de polímero. El último método disfruta de una particular popularidad entre investigadores ya que la concentración de polímero es una variable fácil de controlar y puede tener efectos repetibles y drásticos sobre los diámetros de la fibra. Este método funciona cambiando tanto la cantidad de disolvente que debe evaporarse antes de que la fibra sólida se precipite desde la solución y cambiando la viscosidad de la solución y, de este modo, la formación del "Cono Taylor" y el diámetro del chorro final.
En métodos convencionales, la geometría y morfología de superficie de nanofibras de electrohilado han resultado complicadas de modificar. Las fibras de electrohilado típicas adoptando una sección transversal circular, aunque se han observado poros y morfologías de fibras planas en varios sistemas de polímero/disolvente, pero poca investigación han resultado exitosa en el control de estas morfologías. Las técnicas comunes usadas para modificar la forma de sección transversal de fibras han sido cohilar polímeros y retirar selectivamente determinadas fases de polímero. Los enfoques más recientes han resultado exitosos en la producción de morfologías de fibras huecas usando una segunda fase miscible e hileras coaxiales. Ambas técnicas implicar o bien pasos de procesamiento complicados o bien aparatos de electrohilado especializados para conseguir la forma deseada.
Uno de los parámetros más modulados en técnicas de electrohilado convencionales implica el cambio de concentración del polímero disuelto. Esto típicamente tiene el efecto de ser capaz de controlar el diámetro de fibra final cambiando cómo el proceso de formación de fibra y la escala de tiempo durante el electrohilado. Uno de los parámetros más importantes junto con la concentración de polímero es la viscosidad de la solución. La viscosidad juega un gran papel en la formación y estabilidad del "Cono Taylor".
Sin embargo, cambiar la concentración de la solución de polímero tiene dos límites. Las soluciones con baja concentración pueden hacer que la viscosidad no forme adecuadamente un "Cono Taylor". En técnicas convencionales, en lugar de extraer un único chorro electrificado de la hilera, el chorro se separa en múltiples gotas. Este proceso se denomina electronebulización y se ha utilizado en procesos tales como la aplicación de recubrimientos de superficie e impresión de inyección.
Los PA desvelados en el presente documento pueden recubrirse sobre una nanofibra electrohilada, tal como, por ejemplo, una nanofibra de poliéster (por ejemplo, una nanofibra de policaprolactona (ePCL) electrohilada). Los PA desvelados en el presente documento pueden recubrirse sobre una ePCL en uno de varios modos. Puede usarse un gradiente de presión en la forma de una jeringa. El disco de nanofibras de ePCL puede colocarse en el cilindro de una jeringa y la solución de PA puede empujarse a través de este. Esto puede repetirse desde el otro lado. Como alternativa, las nanofibras de ePCL pueden recubrirse con PA con una técnica rotacional. Las nanofibras de ePCL pueden montarse sobre un mandril y girarse, mientras que se sumergen parcialmente en una solución de PA.
Los polímeros adecuados para la formación de nanofibras incluyen aquellos adecuados para el electrohilado. Por ejemplo, un polímero puede ser un poliéster, poliamida, poliuretano, poliolefina o policarbonato. En un aspecto, un polímero puede ser un poliéster biodegradable amorfo. Se contempla que el polímero puede ser una cadena ramificada o lineal. Los copolímeros, incluidos los copolímeros en bloque y de injerto, también se contemplan. También pueden emplearse mezclas en los métodos y composiciones desveladas.
En un aspecto, polímeros adecuados incluyen poliésteres; polianhídridos; poliortoésteres; polifosfacenos; polifosfatos; polifosfoésteres; polidioxanonas; polifosfonatos; polihidroxialcanoatos; policarbonatos; polialquilcarbonatos; poliortocarbonatos; poliesteramidas; poliamidas; poliaminas; polipéptidos; poliuretanos; polieterésteres; polialquilenglicoles; óxido sde polialquileno; polipéptidos; polisacáridos; pirrolidonas de polivinilo y combinaciones de los mismos.
En un aspecto adicional, polímeros adecuados incluyen poli(lactido)-co-(polialquileno óxido); poli(lactido-co-glicolido)-co-(polialquileno óxido); poli(lactido-co-caprolactona)-b-(polialquileno óxido); and poli(lactido-co-glicolidococaprolactona)-b-(polialquileno óxido).
En un aspecto adicional, polímeros adecuados incluyen poli(lactido); poli(glicólido); poli(caprolactona); poli(valerolactona); poli(hidroxibutirato); poli(lactida-co-glicólido); poli(lactida-co-caprolactona); poli(lactida-covalerolactona); poli(glicolido-co-caprolactona); poli(glicolido-co-valerolactona); poli(lactida-co-glicólido-cocaprolactona); y poli(lactida-co-glicolido-co-valerolactona).
En un aspecto adicional, polímeros adecuados incluyen poli(lactido)-co-poli(vinipirrolidona); poli(lactido-copoli(vinilppirrolidona); poli(lactido-co-caprolactona)-b-poli(vinilpirrolidona); y poli(lactido-co-glicolido-cocaprolactona)-b-poli(vinilpirrolidona).
En un aspecto, las fibras de polímero pueden comprender cualquier polímero biocompatible conocido por los expertos en la técnica. En un aspecto adicional, las fibras de polímero comprende poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o poli(£-caprolactona) o un copolímero del mismo o una mezcla del mismo. En un aspecto adicional, el polímero de las fibras puede ser polietileno y/o poliuretano. En un aspecto adicional, el polímero puede ser poli(lactida-co-glicólido), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(glaxanona), poli(ortoésteres), poli(ácido pirólico) y poli(fosfacenos). Los polímeros adicionales que pueden usarse incluyen, aunque no de forma limitativa, polímeros y copolímeros de polialquileno, polímeros y copolímeros de fluorocarbono, polímeros y copolímeros de poliéster, polímeros y copolímeros de poliéter, polímero y copolímeros de silicona y polímeros y copolímeros de poliuretano. Otros polímeros que pueden usarse incluyen, aunque no de forma limitativa, polietilenos, polipropilenos, politetrafluoroetilenos, poli(tetrafluoroetileno-co-hexafluoropropenos), copolímeros de etileno-tetrafluoroetileno modificado, copolímeros de clorotrifluoroetileno etileno, fluoruros de polivinilideno, óxidos de polietileno, politereftalatos de etileno, siliconas, poliuretanos, amidas en bloque de poliéter y ésteres de poliéter. En un aspecto adicional, el polímero puede ser uno o más polímeros, por ejemplo, polipirrol, polianilina, politiofeno, poli(p-fenilenovinileno), poliparaleno o una mezcla de los mismos. En un aspecto adicional, el polímero puede ser poli (etileno-vinil acetato).
En un aspecto, el polímero es un polímero biocompatible. En un aspecto, el polímero es policaprolactona. En un aspecto adicional, se usa policaprolactona como el bloque hidrófobo de copolímero en bloque sintético amfífilo. En un aspecto, el polímero es un polímero degradable. Por “degradable", se entiende que el polímero se deshace bajo determinadas condiciones después de un período de tiempo. En un aspecto adicional, el polímero es un polímero "biodegradable", se deshace bajo condiciones fisiológicas después de un período de tiempo. En un aspecto adicional, el polímero no es degradable ni/o biodegradable. Por ejemplo, el polímero puede comprender uno o más enlaces hidrolizables. La presencia de enlaces hidrolizables puede facilitar la degradación de nanofibras en sistemas biológicos. En un aspecto adicional, el polímero no comprende uno o más enlaces hidrolizables.
8. Nanomatriz que imita MEC
En el presente documento se desvela una nanomatriz que imita endotelio, que comprende uno o más de los péptidos amfífilos desvelados en el presente documento ensamblados en nanofibras. Las nanofibras pueden comprender una mezcla de péptidos amfífilos que tienen las fórmulas DS—CA y DS—KK.
Los péptidos amfífilos DS—CA y DS—KK pueden estar presentes en las nanofibras en una relación de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 20:1, que incluye aproximadamente 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1,4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 o 1:20. Por tanto, las nanofibras pueden comprender una mezcla de péptidos amfífilos que tienen las fórmulas DS—CA y DS—KK. Los péptidos amfífilos DS—CA y DS—KK pueden estar presentes en las nanofibras en una relación de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1. Tal como se divulga en el presente documento, esta relación puede seleccionarse por el experto en la materia en parte sobre el número de residuos de lisina modificada por diaceniodiolato en el uno o más péptidos amfífilos y la liberación de NO deseada.
El péptido amfífilo DS—CA de la nanomatriz que imita endotelio desvelada puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:2). Por tanto, el péptido amfífilo Ds—CA de la nanomatriz que imita endotelio desvelada puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:4).
El péptido amfífilo DS—KK de la nanomatriz que imita endotelio desvelada puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (s Eq ID NO:1) y uno o más residuos de lisina que comprenden grupos amina colgante que pueden reaccionar con óxido nítrico para formar un péptido modificado por diacenodiolato. Por tanto, el péptido amfífilo DS-KK de la nanomatriz que imita endotelio desvelada puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:3), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reaccionan con óxido nítrico para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. Por tanto, el péptido amfífilo DS—KK de la nanomatriz que imita endotelio desvelada puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:5), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. En algunos aspectos, el péptido amfífilo DS—KK ha reaccionado con óxido nítrico para formar un péptido modificado por diaceniodiolato [K[N(O)NO' ]]n. En algunos aspectos, n puede ser de 1 a 20. En algunos aspectos, n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o superior. En algunos aspectos, el péptido amfífilo DS—KK ha reaccionado con óxido nítrico para formar un péptido modificado por diaceniodiolato [K[N(O)NO' ]]s .
Las nanofibras de la nanomatriz que imita endotelio desvelada puede comprender péptidos amfífilos que tienen la fórmula DS—CA—KK, DS—KK—CA, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los péptidos amfífilos DS—CA---KK y DS—KK—CA pueden comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (SEQ ID NO:1), la secuencia de aminoácidos Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:2), y la secuencia de aminoácidos Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:3), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reaccionan con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. Por ejemplo, el péptido amfífilo DS—CA—KK puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:6), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. El péptido amfífilo DS—KK—CA puede comprender la secuencia de aminoácidos Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (SEQ ID NO:7), en donde los residuos de lisina comprenden grupos de amina colgante que reacciona con NO para formar un péptido modificado con diaceniodiolato.
En algunos aspectos, el péptido amfífilo de la nanomatriz que imita endotelio desvelada ha reaccionado con óxido nítrico para formar un péptido modificado por diaceniodiolato [K[N(O)NO' ]]n. En algunos aspectos, n es de 1 a 20. En algunos aspectos, n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o superior. Por tanto, en algunos aspectos, el péptido amfífilo ha reaccionado con óxido nítrico para formar un péptido modificado por diaceniodiolato [K[N(O)NO-]] 5 .
En el presente documento se desvelan nanomatrices híbridas que comprenden nanofibras de policaprolactona electrohilada (ePCL) recubiertas con péptidos amfífilos (PA) liberadores de NO. El electrohilado ha creado recientemente mucha atención (Li WJ, y col. 2003; Choi JS, y col. 2008; Zhang YZ, y col. 2005; Matthews JA , y col.
2002; y Heydarkhan-Hagvall S, y col. 2008), debido a su capacidad de formar fibras de polímero uniformes con diámetros en los intervalos de nanoescala. Estas fibras son estructuralmente similares a proteínas de MEC nanofibrilares tales como el colágeno. Sin embargo, estas nanofibras están impedidas por su carencia de bioactividad, que es crucial para interactuar con las células y promover su adhesión y proliferación. Como se divulga en el presente documento, esta bioactividad puede dotarse con estas nanofibras de ePLC recubriéndolas con péptidos amfífilos (PA). Estos PA pueden portar sitios degradables mediados por enzimas y ligandos adhesivos de célula y pueden, por lo tanto, imitar el aspecto bioquímico del MEC. Este recubrimiento de PA en nanofibras de ePCL constituye la nanomatrix biomimética híbrida, tal como se muestra en la Figura 19. Los PA usados en el estudio consiste en sitio degradable de metaloproteasa de matriz 2 (MMP-2) Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (GTAGLIGQ). Las MMP se producen de forma constituyente por células sanas y, por lo tanto, la presencia de este sitio promueve el remodelado de la nanomatriz por las células (Jun y col. 2005; Massia SP y Hubbell JA: 1991; y Andukuri A, y col. 2009). Los PA también contienen secuencia Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) derivada de laminina, que se conoce por promover la adhesión celular endotelial y propagación, y una secuencia de polilisina (KKKKK) que actúa como donador de NO. La incorporación de residuos donadores de NO en el PA se espera que proporciona una liberación controlada de NO a partir de la nanomatriz híbrida en el torrente sanguíneo local, donde limitará la proliferación de células de músculo liso y adhesión plaquetaria, mientras que aumenta la re-endotelización.
9. Stents
En el presente documento también se desvela una composición que comprende un dispositivo médico recubierto con una nanomatriz que imita endotelio que se desvela en el presente documento. El dispositivo médico puede ser cualquier dispositivo conocido o identificado para su uso dentro del organismo de un sujeto. Preferentemente, el dispositivo médico es uno de los que se inserta en el sistema cardiovascular. El dispositivo médico puede comprender cualquier material adecuado para su uso como implante quirúrgico.
La mayoría de stents están fabricados con acero inoxidable de 316L. Ejemplos actuales incluyen el stent de Cordis Palmaz-Schatz, el stent de Cordis Crossflex, el stent de Guidant MultiLink y el Medtronic Bestent. Los inconvenientes de stents de acero incluyen la alta aparición de trombosis subaguda y reestenosis, complicaciones de sangrado, corrosión y redilatación del segmento del vaso con stent.
El oro se ha conocido durante mucho tiempo como un metal normalmente inerte, altamente visible, y biocompatible. Los stents híbridos chapados en oro muestran una buena visibilidad y flexibilidad, pero también son bastante caros. En la actualidad, Conichrome®, PhynoxTM y Elgiloy® son los nombres comerciales para la aleación cobalto-cromoníquel-molibdeno-hierro. Esta aleación de cobalto de cromo puede usarse para fabricar stents como el Schneider Wallstent.
El Tantalio, elemento n.° 73, es un metal brillante, flexible y altamente radiopaco. Aunque más frágil que el acero inoxidable, el tantalio muestra una alta ductilidad y resistencia a la corrosión. Ejemplos actuales de stents de tantalio incluyen el stent Wiktor por Medtronic y el Tantalum Cordis Stent.
Nitinol (del "Nickel Titanium Naval Ordinance Laboratory") es un ejemplo de una aleación biocompatible, super-elástica y con memoria de forma. Como aleación con memoria de forma que consiste en un 55 % de níquel y un 45 % de titanio, el nitinol tiene la capacidad de volver a una forma específica cuando se calienta a determinada temperatura después de su fase de transición. Las aleaciones con memoria de forma se someten a una fase de transición es su estructura de cristal cuando se enfrían de su forma de temperatura más fuerte, y más alta en la fase austenita a su forma de temperatura más débil, más baja en la fase martensítica. El nitinol también tiene un comportamiento de resorte, "tipo caucho" que le permite ser super-elástico y contorsionado a su temperatura austenita. El fuerte enlace intermetálico entre níquel y titanio tiene una tasa de reacción muy baja, incluso en paciente con sensibilidad aumentada al níquel. Este evita una fuerte respuesta inmunológica y disminuye la corrosión. Los presentes ejemplos incluyen stent de Radio de Nitinol auto-expansible de Boston Scientific. stent Symbiot de Boston Scientific, disponible en Europa, que comprende nitinol cubierto en ambos lados por capas de 16 micrómetros de espesor de ePTFE.
Los materiales para stents de polímero incluyen stents biodegradables con un pavimentado endoluminal polimérico y polímero con memoria de forma. La silicona fue el primer material orgánico escogido para los stents. La silicona es una polímero de condensación derivado de silicona alternante y átomos de oxígeno que induce bajas tasas de trauma tisular. Sin embargo, la silicona tiene poca biodurabilidad, resistencia a la tracción y al enrollamiento y relación de diámetro de interna a externa.
Los stents biliares de plástico puro que usan polietileno o poliuretano también se han usado en pacientes. Sin embargo, el polietileno induce sedimentos en un 20-30 % de los pacientes, promueve la adherencia de proteínas y formación de biopelícula y atrapa cristales biliales y partículas de comida. Por el contrario, el poliuretano tiene una buena resistencia a la tracción y enrollabiento y una buena biodurabilidad, pero también es uno de los materiales más reactivos disponibles.
Los stents biodegradables y bioabsobibles también son materiales viables para los stents. Aunque la biodegradación, bioabsorción y bioerosión se usan a menudo incorrectamente como sinónimos, tienen distintas definiciones. En la biodegradación, un agente biológico tal como una enzima o un microbio es el componente predominante en el proceso de degradación. Los implantes biodegradables son útiles normalmente para aplicaciones de corto plazo o temporales. La bioresorción y bioabsorción implican que los productos de degradación se retiran por la actividad celular, tal como fagocitosis, en un entorno biológico. Por el contrario, un polímero bioerosionable es un polímero insoluble en agua que se ha convertido en condiciones fisiológicas en material soluble en agua. Esto se produce independientemente del mecanismo físico implicado en el proceso de erosión. El prefijo "bio" en este caso se refiere a la erosión que se produce en condiciones fisiológicas, al contrario de la erosión por alta temperatura, fuertes ácidos o bases o el tiempo.
Debido al soporte estructural temporal del stent a vasos sanguíneos dañados, los polímeros biodegradables pueden verse como un material biocompatible, y fácilmente desechable, perfecto para sistemas de administración de fármacos. Algunos polímeros biodegradables, tales como poliésteres, poliotoésteres y polianhídridos, pueden ser capaces de modular el suministro local de fármacos y también degradarse "de forma segura" a través de mecanismos hidrolíticos y otros. Los sistemas de suministro de fármacos biodegradables requieren una degradación progresiva, permeabilidad y resistencia a la tracción moderada. En un stent, el soporte estructural debe estar acompañado por biocompatibilidad, hemocompatibilidad y buena hemodinámica. En la actualidad, los stents biodegradables normalmente inducen trombosis y daño vascular.
El stent bioabsorbible de Duke fue el primer stent biodegradable. Otros también han intentado incorporar polímeros naturales mediante la formación de colágeno tipo I a partir de tendones Aquiles bovinos purificados en un tupo sin perfiles ranurados que se reticuló químicamente para la estabilidad estructural. El colágeno es bastante hemocompatible puesto que porta una carga inherentemente negativa. Los productos de colágeno son biocompatibles durante su ciclo de vida y han demostrado disminuir la trombosis. También, los agentes anticoagulantes y fibrinolíticos pueden unirse directamente al colágeno, que ayuda en su capacidad para el suministro de fármacos. Cordis Corporation también ha desarrollado un prototipo de stent biodegradable fabricado a partir de una mezcla de polilactida y carbonato de trimetileno.
Algunos factores que aceleran la degradación del polímero incluyen proporcionar el producto con una estructura principal más hidrófila, grupos extremo más hidrófilos, menos cristalinidad, más porosidad y un tamaño en general más pequeño. Los grupos funcionales químicos más comunes usados son ésteres, anhídridos, ortoésteres y amidas. Una posibilidad polimérica final es polímeros con memoria de forma. Una vez se ha sintetizado el polímero, puede calentarse o enfriarse en un sinfín de formas. Cuando se introduce un estímulo adecuado, el polímero se transformará de su estado temporal a una forma memorizada, permanente. La mayoría de estos polímeros se crean a partir de segmentos adecuados, determinados principalmente mediante cribado de las calidades de los poliésteres alifáticos existentes, especialmente poli(éster)es, así como L,L-dilactida, diglicólido y p-dioxanona. Los macrodioles pueden sintetizarse basándose en estos monómeros ya aprobados.
Por tanto, el dispositivo médico desvelado en el presente documento, tal como un stent, puede comprender aleación de titanio. El dispositivo médico puede comprender cobalto-cromo. El dispositivo médico puede comprender níqueltitanio. El dispositivo médico puede comprender un polímero biodegradable.
En algunos aspectos, el dispositivo médico es una stent vascular. En algunos aspectos, el stent es un stent eluyente de fármacos. Por ejemplo, el stent puede ser un stent eluyente de sirolimus o un stent eluyente de paclitaxel.
El experto en la técnica puede apreciar dispositivo médicos adicionales para su uso en la nanomatriz que imita endotelio desvelada. Preferentemente, el dispositivo médico es uno administrado a un tejido u órgano del organismo que comprende normalmente un endotelio natural. Por ejemplo, en algunos aspectos, el dispositivo médico es un injerto vascular. En algunos aspectos, el dispositivo médico es un catéter. En algunos aspectos, el dispositivo médico es un marcapasos. En algunos aspectos, el dispositivo médico es una válvula cardíaca.
También se desvelan métodos de implante de los dispositivos médicos recubiertos desvelados en un sujeto. Por tanto, en un aspecto, el método comprende las etapas de proporcionar una composición que comprende un dispositivo médico (por ejemplo, stent, injerto vascular, catéter, marcapasos o válvula cardíaca) recubierto con una nanomatriz que imita endotelio e implantar el sustrato recubierto en un sujeto. En un aspecto adicional, se proporciona el recubrimiento de un dispositivo médico con una nanomatriz que imita endotelio. En un aspecto adicional, el método comprende la etapa de recubrir una nanomatriz que imita endotelio sobre un dispositivo médico antes de la implantación en un sujeto. En un aspecto adicional, un método comprende la etapa de recubrir una nanomatriz que imita endotelio sobre un dispositivo médico tras la implantación en un sujeto.
10. Métodos de tratamiento
Los péptidos amfífilos que se desvelan en el presente documento pueden usarse como parte de una nanomatriz para recubrir stents u otros dispositivos médicos tales como válvulas cardíacas. De manera similar, los péptidos amfífilos pueden usarse junto con injertos vasculares tales como injertos arteriales o venosos para evitar la reestenosis del injerto. Por tanto, en el presente documento se desvelan métodos de tratamiento de una enfermedad cardiovascular que comprende la administración a un sujeto con enfermedad cardiovascular los péptidos amfífilos que se desvelan en el presente documento.
Se entiende que los péptidos amfífilos que se desvelan en el presente documento pueden administrarse mediante la aplicación de un dispositivo médico tal como un stent vascular, injerto vascular, catéter, marcapasos y válvula cardíaca recubierta con los péptidos amfífilos. Se entiende adicionalmente que los péptidos amfífilos pueden usarse como parte de una nanomatriz tal como una nanofibra de policaprolactona en su uso sobre un dispositivo médico. Por tanto, por ejemplo, en el presente documento se desvelan métodos de tratamiento de ateroesclerosis mediante la administración a un sujeto de un stent que comprende una nanofibra tal como una nanofibra de poliéster (por ejemplo, nanofibras de policaprolactona) recubierta con uno o más péptidos amfífilos. Se entiende, que cualquiera de los péptidos amfífilos que se desvelan en el presente documento puede usarse con los métodos desvelados, tal como, por ejemplo, uno o más péptidos amfífilos en donde cada amfífilo comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célulay una secuencia de productor donador de óxido nítrico.
De manera similar, uno de los problemas con los tratamientos de la enfermedad cardiovascular es la prevención de la oclusión adicional si se usa un injerto. Específicamente, la oclusión del injerto. La permeabilidad del injerto se refiere a la capacidad de un injerto en permanecer abierto o no ocluido. Por tanto, en el presente documento se desvelan métodos de aumento de permeabilidad del injerto que comprende la administración a un sujeto de un injerto recubierto con uno o más de los péptidos amfífilos que se desvelan en el presente documento.
11. Péptidos
Tal como se describe en el presente documento existen numerosas variantes de los péptidos/proteínas funcionales que se conocen y que se contemplan en el presente documento. Las variantes y derivados de proteína son bien comprendidos por los expertos en la materia y pueden implicar modificaciones de secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, modificaciones de secuencias de aminoácidos típicamente entre en una o más de tres clases: variantes de sustitución, de inserción y de deleción. Las inserciones incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo así como inserciones intrasecuenciales de únicos o múltiples residuos de aminoácidos. Las inserciones normalmente será inserciones más pequeñas que las de las fusiones de extremos amino o carboxilo, por ejemplo, en el orden de uno a cuatro residuos. Los derivados de proteínas de fusión inmunogénicos, tales como les que se describen en los ejemplos, se realizan fusionando un polipéptido suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia diana mediante reticulación in vitro o mediante cultivo celular recombinante transformado con ADN que codifica la fusión. Las deleciones se caracterizan por la retiración de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de proteínas. Normalmente, no se elimina más de aproximadamente de 2 a 6 residuos en ningún sitio dentro de la molécula de proteína. Estas variantes normalmente se preparan mediante mutagénesis específica de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína, produciendo, de este modo, ADN que codifica la variante y, posteriormente, expresando el a Dn en cultivo celular recombinante. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitio predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis de cebador M13 y mutagénesis de PCR. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente residuos únicos, pero puede producirse en una cantidad de distintos emplazamientos a la vez; las inserciones serán normalmente en el orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos; y las deleciones se encontrarán en el intervalo de 1 a 30 residuos. Las deleciones o inserciones se realizan preferentemente en pares adyacentes, es decir, una deleción de 2 residuos o una inserción de 2 residuos. Sustituciones, deleciones, inserciones y cualquier combinación de los mismos puede combinarse para llevar a una construcción final. Las mutaciones no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarías que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Variantes de sustitución son las que se ha retirado al menos un residuo y se ha insertado un residuo distinto en su lugar. Tales sustituciones se realizan generalmente de acuerdo con la siguiente Tabla 2 y se refieren como sustituciones conservadoras.
Tabla 2: Sustituciones de aminoácidos de residuo original de sustituciones conservadoras ejemplares, distintas de las que se conocen en la técnica._____________________________________________________________________ Ala Ser
Arg Lys; Gln
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn, Lys
Glu Asp
Gly Pro
His Asn;Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
Los cambios sustanciales en la función o identidad inmunológica se realizan seleccionando sustituciones que son menos conservadoras que las de la Tabla 2, es decir, seleccionando residuos que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan las mayores cambios en las propiedades proteínicas serán en las que (a) un residuo hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, genilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) una que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina, en este caso, (e) aumentando el número de sitios para la sulfación y/o glicosilación.
Por ejemplo, la sustitución de un residuo de aminoácido con otro que es biológicamente y/o químicamente similar es conocida por los expertos en la técnica como sustitución conservadora. Por ejemplo, una sustitución conservadora sería reemplazar un residuo hidrófobo por otro o reemplazar un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gli, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Tales variaciones conservativamente sustituidas para cada secuencia explícitamente desvelada se incluyen dentro del mosaico de polipéptidos que se proporciona en el presente documento.
Puede emplearse mutagénesis de sustitución o deleción para insertar sitios para N-glicosilación (Asn-X-Thr/Ser) o O-glicosilación (ser o Thr). También pueden ser deseables las deleciones de cisteína y otros residuos lábiles. Las deleciones o sustituciones de sitios de proteólisis potenciales, por ejemplo, Arg, pueden conseguirse, por ejemplo, eliminando uno de los residuos básicos o sustituyendo uno por residuos de glutaminilo o histidilo.
Determinadas derivatizaciones post-translacionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidadas posttranslacionalmente a los residuos de glutamilo y asparilo correspondientes. Como alternativa, estos residuos se desamidan con condiciones suavemente ácidicas. Otras modificaiones post-translacionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de losgrupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos o-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, “Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pág. 79-86), acetilación de la amina de extremo N y, en algunos casos, amidación de los grupos carboxilo de extremo C.
Se entiende que un modo de definir las variantes y derivativos de las proteínas que se desvelan en el presente documento es mediante la definición de las variantes y derivados en términos de homología/identidad a secuencias conocidas específicas. Se desvelan específicamente variantes de estas y otras proteínas en el presente documento que tienen al menos, un 70 % o 75 % u 80 % u 85 % o 90 % o 95 % de homología con respecto a la secuencia indicada. Un experto en la materia comprenderá fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas. Por ejemplo, la homología puede calcularse después de alinear las dos secuencias de modo que la homología se encuentra en su nivel más alto.
Otro modo de calcular la homología puede realizarse mediante algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), por la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección.
Los mismos tipos de homología pueden obtenerse para ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos desvelados en Zuker, M. Science 244:48-52, 1989; Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989.
Se comprende que la descripción de mutaciones conservadores y homología puede combinarse juntas en cualquier combinación, tal como realizaciones que tienen al menos un 70 % de homología con respecto a una secuencia particular en donde las variantes son mutaciones conservadoras.
Puesto que la presente memoria descriptiva describe diversas proteínas y secuencias de proteínas se entiende que los ácidos que pueden codificar esos secuencias de proteínas también se desvelan. Esto incluiría todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de proteínas específica, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de proteínas particular así como todos los ácidos nucleicos, incluidos ácidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes desveladas y derivados de las secuencias de proteínas. Por tanto, mientras que cada secuencia de ácido nucleico particular puede que no esté por escrito en el presente documento, se entiende que cada una de las secuencias, de hecho, se desvela y describe en el presente documento mediante la secuencia de proteínas desvelada.
Se entiende que hay numerosos análogos de aminoácidos y de péptidos que pueden incorporarse en las composiciones desveladas. Por ejemplo, existen numerosos aminoácidos D o aminoácidos que tienen un sustituyente funcional distinto que los aminoácidos naturales. Se desvelan los estereoisómeros opuestos de péptidos de origen naturales, así como los estereoisómeros de análogos peptídicos. Estos aminoácidos pueden incorporarse fácilmente en cadenas de polipéptidos cargando moléculas de ARNt con el aminoácido de elección y modificando por ingeniería genética construcciones que utilizan, por ejemplo, codones ámbar, para insertar el aminoácido análogo en una cadena de péptido de una manera específica de sitio (Thorson y col., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill y col., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994).
Pueden producirse moléculas que se asemejan a polipéptidos, pero que no se conectan por medio de una unión peptídica natural. Por ejemplo, las uniones para aminoácidos o análogos de aminoácidos pueden incluir CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2--, -CH=CH--(cis y trans), -COCH2--,-CH(OH)CH2--, and --CHH2SO-(estas y otras pueden encontrarse en Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, ed., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), Vol. 1, Tema 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-CH 2NH--, CH2CH2--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (-CH H2--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH-- CH--, cis y trans); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH2--); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH2--); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2--); y Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH2--S--). Una unión no peptídica particularmente preferente es --CH2NH--. Se entiende que los análogos de péptidos pueden tener más de un átomo entre los átomos unidos, tales como b-alanina, ácido gaminobutírico y similares.
A menudo los análogos de aminoácidos y análogos de péptidos tienen propiedades potenciadas o deseables, tales como, producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas potenciadas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida y otras.
Pueden usarse aminoácidos D para generar péptidos más estables, debido a que los aminoácidos D no son reconocidos por peptidasas y demás. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Pueden usarse residuos de cisteína para ciclar o unir dos o más péptidos entre sí. Esto puede ser beneficioso para constreñir los péptidos en conformaciones particulares. (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem.
61:387 (1992)).
12. Ácidos nucleicos
Existe una variedad de moléculas que se desvela en el presente documento a base de ácido nucleico arc, que incluyen por ejemplo los ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, los péptidos amfífilos que se desvelan en el presente documento. Los ácidos nucleicos desvelados pueden realizarse de, por ejemplo, nucleótidos, análogos de nucleótido o sustitutos de nucleótidos. Ejemplos no limitantes de estas y otras moléculas se describen en el presente documento. Se comprende que, por ejemplo, cuando se expresa un vector en una célula, el ARNm expresado estará realizado típicamente con A, C, G y U. De igual modo, se entiende que, por ejemplo, se introduce una molécula antisentido en una célula o entorno celular a través de, por ejemplo, suministro exógeno, resulta ventajoso que la molécula antisentido puede realizarse de análogos de nucleótidos que reducen la degradación de la molécula antisentido en el entorno celular.
Un nucleótido es una molécula que contiene una fracción de base, una fracción de azúcar y una fracción de fosfato. Los nucleótidos pueden unirse juntos a través de sus fracciones de fosfato y residuos de azúcar creando un enlace de internucleósidos. El residuo base de un nucleótido puede ser adenin-9-il (A), citosin-1-il (C), guanin-9-il (G), uracil-1-il (U) y timin-1-il (T). El residuo de azúcar de un nucleótido es una ribosa a una desoxirribosa. El residuo fosfato de un nucleótido es fosfato pentavalente. Un ejemplo no limitante de un nucleótido sería un 3'-AMP (3'-adenosin monofosfato) o 5'-GMP (5'-guanosina monofosfato). Existen muchas variedades de estos tipos de moléculas disponibles en la técnica y disponibles en el presente documento.
Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene algún tipo de modificación en cualquiera de las fracciones base, azúcar o fosfato. Las modificaciones de nucleótidos se conocen bien en la técnica e incluirían por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina y 2-aminoadenina así como modificaciones en las fracciones azúcar o fosfato. Existen muchas variedades de estos tipos de moléculas disponibles en la técnica y disponibles en el presente documento.
Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que tienen propiedades funcionales similares a las de los nucleótidos, pero no contienen una fracción fosfato, tal como un ácido nucleico peptídico (PNA). Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que reconocerán ácidos nucleicos de una manera Watson-Crick o Hoogsteen, pero que están unidos entre sí a través de un residuo distinto de una fracción fosfato. Los sustitutos de nucleótidos son capaces de conformarse en una estructura de tipo doble hélice cuando interaccionan con el ácido nucleico diana apropiado. Existen muchas variedades de estos tipos de moléculas disponibles en la técnica y disponibles en el presente documento.
También existe posibilidad de unir otros tipos de moléculas (conjugados) a nucleótidos o análogos de nucleótidos para potenciar, por ejemplo, la captación celular. Los conjugados pueden unirse químicamente al nucleótido o análogos de nucleótidos. Tales conjugados incluyen pero sin limitación residuos lipídicos tales como una fracción de colesterol. (Letsinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556). Existen muchas variedades de estos tipos de moléculas disponibles en la técnica y disponibles en el presente documento.
Una interacción de Watson-Crick es al menos una interacción con la cara Watson-Crick de un nucleótido, análogo de nucleótido o sustituto de nucleótido. La cara Watson-Crick de un nucleótido, análogo de nucleótido o sustituto de nucleótido incluye las posiciones C2, N1 y C6 de un nucleótido basado en purina, análogo de nucleótido o sustitución de nucleótido y las posiciones C2, N3, C4 de un nucleótido, análogo de nucleótido o sustituto de nucleótido.
Una interacción de Hoogsteen es la interacción que tiene lugar en la cara Hoogsteen de un nucleótido o análogo de nucleótido, que se expone al surco mayor del dúplex de ADN. La cara Hoogsteen incluye la posición N7 y grupos reactivos (NH2 u O) en la posición C6 de nucleótidos purina.
Existe una variedad de secuencias relacionadas con las moléculas de proteínas implicadas en la señalización de trayectorias que se desvelan en el presente documento, todas las cuales se codifican mediante ácidos nucleicos o son ácidos nucleicos. Las secuencias para los análogos humanos de estos genes, así como otras análogos y alelos de estos genes y variantes de empalme y otros tipos de variantes, están disponibles en una variedad de bases de datos de proteínas y de genes, incluido el Genbank. Se puede acceder al Genbank en http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi. Los expertos en la técnica entenderán cómo resolver las discrepancias y diferencias de secuencias y ajustar las composiciones y métodos relacionados con una secuencia particular a otras secuencias relacionadas. Cebadores y/o sondas pueden diseñarse para cualquier secuencia dada según la información desvelada en el presente documento y conocida en la técnica.
C. MÉTODOS DE FABRICACIÓN DE NANOMATRIZ QUE IMITA MEC
También se desvela un método de fabricación de una nanomatriz que imita endotelio, que comprende la inducción del autoensamblaje de uno o más péptidos amfífilos desvelados en el presente documento en nanofibras. El autoensamblaje puede inducirse por, por ejemplo, el secado de una composición líquida que comprende el uno o más péptidos amfífilos sobre una superficie sólida. Otros métodos de inducción de autoensamblaje de péptidos amfífilos se conocen en la técnica y pueden usarse en los métodos desvelados. Por ejemplo, el ensamblaje puede inducirse mediante iones divalentes (cloruro cálcico) o pH.
El método desvelado puede comprender adicionalmente hacer reaccionar el uno o más péptidos amfífilos con óxido nítrico para formar un péptido modificado con diaceniodiolato. Por ejemplo, el péptido modificado con diaceniodiolato puede comprender la secuencia [K[N(O)NO' ]]n. En algunos aspectos, n es de 1 a 20. En algunos aspectos, n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o superior. Por tanto, el péptido modificado de diaceniodiolato puede comprender la secuencia [K[N(O)NO' ]]5.
C. MÉTODOS DE USO DE NANOMATRIZ QUE IMITA MEC
También se desvela un método que comprende el recubrimiento de un dispositivo médico con una nanomatriz que imita endotelio que se desvela en el presente documento. El método puede comprender la inducción del autoensamblaje de uno o más péptidos amfífilos desvelados en el presente documento en nanofibras sobre el dispositivo médico. Por ejemplo, el método puede comprender el secado de una composición líquida que comprende el uno o más péptidos amfífilos sobre el dispositivo médico.
El dispositivo médico puede ser cualquier dispositivo conocido o identificado para su uso dentro del organismo de un sujeto. Preferentemente, el dispositivo médico es uno de los que se inserta en el sistema cardiovascular.
El dispositivo médico puede comprender cualquier material adecuado para su uso como implante quirúrgico. Por ejemplo, el dispositivo médico puede comprender aleación de titanio. El dispositivo médico puede comprender cobaltocromo. El dispositivo médico puede comprender níquel-titanio. El dispositivo médico puede comprender un polímero biodegradable.
En algunos aspectos, el dispositivo médico es una stent vascular. Por ejemplo, el stent puede ser un stent metálico sin recubrimiento. En algunos aspectos, el stent es un stent eluyente de fármacos. Por ejemplo, el stent puede ser un stent eluyente de sirolimus o un stent eluyente de paclitaxel.
En algunos aspectos, el dispositivo médico es un injerto vascular. En algunos aspectos, el dispositivo médico es un catéter. En algunos aspectos, el dispositivo médico es un marcapasos. En algunos aspectos, el dispositivo médico es una válvula cardíaca.
También se contempla que las composiciones de nanomatriz que imita endotelio desveladas pueden comprender adicionalmente uno o más agente(s) biológicamente activo(s). Por ejemplo, en un aspecto, una nanomatriz que imita endotelio puede incluir una cantidad eficaz de uno o más agente(s) biológicamente activo(s).
También se contempla que las composiciones de nanomatriz que imita endotelio desveladas pueden comprender adicionalmente uno o más agente(s) farmacéuticamente activo(s). Por ejemplo, en un aspecto, una nanomatriz que imita endotelio puede incluir una cantidad eficaz de uno o más agente(s) farmacéuticamente activo(s).
E. MÉTODOS DE FABRICACIÓN DE LOS PÉPTIDOS HIDRÓFILOS
Las composiciones que se desvelan en el presente documento y las composiciones necesarias para realizar los métodos desvelados pueden fabricarse mediante el uso de cualquier método conocido por los expertos en la técnica para un reactivo o compuesto particular a menos que se indique lo contrario.
I. Síntesis de péptidos
Un método de producción de las proteínas desveladas, tales como de SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:11, es enlazar dos o más péptidos o polipéptidos juntos mediante técnicas de química de proteínas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos se pueden sintetizar químicamente usando equipamiento de laboratorio disponible actualmente usando química de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) o Boc (terc-butiloxicarbonoil). (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). El experto en la materia puede entender de forma sencilla que se puede sintetizar un péptido o polipéptido correspondiente a las proteínas desveladas, por ejemplo, mediante reacciones químicas convencionales. Por ejemplo, un péptido o polipéptido se puede sintetizar y no escindirse de su resina de síntesis mientras que el otro fragmento de un péptido o proteína se puede sintetizar y escindirse posteriormente de la resina, exponiendo de este modo un grupo terminal que está bloqueado funcionalmente en el otro fragmento. Mediante reacciones de condensación de péptidos, estos dos fragmentos se pueden unir covalentemente mediante un enlace peptídico en sus extremos carboxilo y amino, respectivamente, para formar un anticuerpo o fragmentan del mismo. (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. Y. (1992); Bodansky M y Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY. Como alternativa, el péptido o polipéptido se sintetiza independientemente in vivo como se describe en el presente documento. Una vez aislados, estos péptidos o polipéptidos independientes pueden unirse para formar un péptido o fragmento del mismo mediante reacciones de condensación de péptidos similares.
Por ejemplo, la ligación enzimática de segmentos peptídicos clonados o sintéticos permite que fragmentos peptídicos relativamente cortos se unan para producir fragmentos peptídicos de mayor tamaño, polipéptidos o dominios proteicos completos (Abrahmsen L y col., Biochemistry, 30:4151 (1991)). Como alternativa, la ligación química nativa de péptidos sintéticos se puede utilizar para construir sintéticamente grandes péptidos o polipéptidos a partir de fragmentos peptídicos más cortos. Este procedimiento consiste en una reacción química de dos etapas (Dawson y col. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). La primera etapa es la reacción quimioselectiva de un péptido-tioéster sintético desprotegido con otro segmento peptídico desprotegido que contiene un residuo Cys amino terminal para dar un intermedio ligado a tioéster como el producto covalente inicial. Sin un cambio en las condiciones de reacción, este intermediario se somete a reacción espontánea intramolecular rápida para formar un enlace peptídico nativo en el sitio de ligación (Baggiolini M et al (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I y col., J. Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I y col., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K y col., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).
Como alternativa, los segmentos peptídicos desprotegidos se unen químicamente donde el enlace formado entre los segmentos peptídicos como resultado de la ligación química es un enlace no natural (no peptídico) (Schnolzer, M y col. Science, 256:221 (1992)). Esta técnica se ha usado para sintetizar análogos de dominios proteicos así como grandes cantidades de proteínas relativamente puras con actividad biológica completa (deLisle Milton RC y col., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, Nueva York, págs. 257-267 (1992)).
2. Síntesis de ácido nucleico
Otro método de producción de las proteínas desveladas, tales como de SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:11, es producir un ácido nucleico que codifique las proteínas desveladas operativamente unidas a una secuencia de control de expresión. Tales ácidos nucleicos se pueden fabricar usando métodos de síntesis química convencionales o pueden producirse usando método enzimáticos o cualquier método conocido. Tales métodos pueden variar de una digestión enzimática convencional seguida de aislamiento de fragmentos de nucleótidos (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
1989) capítulos 5, 6) a métodos puramente sintéticos, por ejemplo, mediante el procedimiento de cianoetil fosforamidita usando un sistema Milligen o Beckman IPlus DNA synthesizer (por ejemplo, sintetizador automatizado modelo 8700 de Milligen-Biosearch, Burlington, MA o modelo ABI 380B). También están descritos métodos sintéticos útiles para preparar oligonucleótidos por Ikuta y col., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (métodos de fosfotriéster y fosfitotriéster) y Narang y col., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (método de fosfotriéster). Se pueden preparar moléculas de ácido nucleico de proteínas usando procedimientos conocidos tales como los descritos por Nielsen y col., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994).
F. MÉTODOS DE FABRICACIÓN DE PÉPTIDOS AMFÍFILOS
También se desvela en el presente documento un método para fabricar un péptido amfífilo, que comprende las etapas de: a) proporcionar un péptido hidrófilo que comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesivo celular endotelial y una secuencia de productor donador de óxido nítrico; y b) alquilar el extremo N del péptido hidrófilo con una fracción hidrófoba. En un aspecto adicional, la alquilación puede comprender la amidación con un ácido carboxílico hidrófobo. El ácido carboxílico hidrófobo puede ser un ácido graso. El ácido graso puede ser ácido palmítico.
Se contempla que puede prepararse un amfífilo desvelado mediante la unión de una fracción hidrófoba mediante técnicas sintéticas convencionales. Por ejemplo, puede unirse un residuo hidrófobo en el extremo N del péptido hidrófilo. Es decir, los compuestos electrófilos hidrófobos (por ejemplo, haluro de alquilo, compuesto carboxílico) pueden hacerse reaccionar con la función amina presente en el extremo N para proporcionar un enlace covalente (por ejemplo, amina secundaria o terciaria, amida).
En ejemplos adicionales, puede unirse un residuo hidrófobo en el extremo C del péptido hidrófilo. Es decir, los compuestos nucleófilos hidrófobos (por ejemplo, alcohol, amina, tiol) pueden hacerse reaccionar con la función carboxílica presente en el extremo C para proporciona un enlace covalente (por ejemplo, éster, amida, tioésteres). Se contempla adicionalmente que la función carboxílica presente en el extremo C puede derivatizarse o reducirse antes de la reacción. Por ejemplo, la función carboxílica puede reducirse para formar un alcohol y posteriormente hacerse reaccionar con uno o más compuestos electrófilos hidrófobos (por ejemplo, haluro de alquilo, compuesto carboxílico) para proporcionar un enlace covalente (por ejemplo, éter, éster).
Como se entenderá fácilmente por los expertos en la técnica, las secuencias peptídicas pueden comprender residuos de péptidos que tienen uno o más grupos colgantes. Los grupos colgantes, en varios aspectos, pueden comprender unas o más fracciones nucleóefilas (por ejemplo, amina, hidroxilo, tiol) o una o más fracciones electrófilas (por ejemplo, función carboxílica). Tales fracciones pueden hacerse reaccionar se un modo análogo al que se desvela anteriormente con respecto al extremo N y extremo C de un péptido hidrófilo desvelado.
G. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se han incluido para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo se elaboran y se evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en el presente documento se realizan y evalúan y están previstos para que sean puramente ejemplares y no están previstos para limitar la divulgación. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones. Salvo que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la temperatura está en °C o es una temperatura ambiente, y la presión está en o cerca de la atmosférica.
1. Ejemplo 1:
i. Materiales y métodos
a. Síntesis de péptido amfífilo
Dos treceavos de péptidos de aminoácidos que consistían en secuencias sensibles a MMP-2 (GTAGLIGQ; SEQ ID NO:1)con secuencia de adhesivo celular YIGSR (SEQ ID NO:2) ("PA-YIGSR") o secuencia donadora de NO KKKKK (SEQ ID NO:3) ("PA-KKKKK") se sintetizaron usando química de Fmoc sobre un sintetizador de péptidos Apex 396 de Advanced Chemtech. Se obtuvo la alquilación haciendo reaccionar el extremo N de los péptidos con 2 equivalentes de ácido palmítico, 2 equivalentes de o-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluroniohexafluorofosfato (HBTU), y 4 equivalentes de diisopropiletilamina (DiEA) en dimetilformmida (DMF) durante 12 h a temperatura ambiente. Después de repetir la reacción de alquilacion, se llevó a cabo la escisión y desprotección de los PA usando una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA), agua desionizada (DI), triisopropilsilano y anisol en una relación de 90:1:1:1 durante 3 horas a temperatura ambiente. La solución se concentró usando un evaporador giratorio. Los PA se precipitaron en éter frío, se recogieron y se secaron al vacío. El PA crudo se disolvió en agua SI a una concentración del 2 % en peso. Los PA se analizaron mediante matriz asistida por láser de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas.
b. Formación de imágenes de microscopía electrónica de transmisión (MET)
Para cada muestra de MET, se vertieron 5 pl de cada 0,1 % en peso de solución acuosa de PA sobre una rejilla de cobre de formvar recubierta (400 de malla). La rejilla se secó durante la noche. Antes de la formación de imágenes, las muestras secadas se tiñeron negativamente con 10 pl de ácido fosfotungsténico (PTA) al 20 % durante 30 s. Las muestras se sometieron a formación de imágenes (42000x, 52000x) sobre un microscopio de MET T12 de FEI Tecnai a 60 kV de voltaje de aceleración.
c. Autoensamblaje de péptidos amfífilos en nanofibras
Se preparó 0,1 % de soluciones de reserva para PA-YIGSR y PA-KKKKK en agua DI (pH 7,4) y se mezcló en una relación molar de 9:1 ("PA-YK"). Se colocaron 50 pl de solución de PA-YK por pocillo en cámaras de cultivo celular de flexiPERM de silicona de 12 pocillos unidas a cubreobjetos de vidrio. Las cámaras de colocaron en campanas extractoras de vapores químicos durante 24 horas para inducir el autoensamblaje mediante evaporación por disolvente. Las cámaras de secaron adicionalmente durante otras 48 horas en un incubador a 37 °C.
d. Mantenimiento de células
Se cultivaron células madre de la vena del cordón umbilical (HUVEC) en medio de crecimiento endotelial (EGM) medio completo (0,1 % de Gentamicina/Amfotericina B). Este medio de cultivo se usó en todos los experimentos de HUVEC. Las células se pasaron mediante tripsinización (0,05 % de tripsina/EDTA) y se subcultivaron a una densidad de 2500­ 5000 células/cm2. Se cultivaron células de músculo liso aórticas humanas (AoSMCs) en medio basal de células de músculo liso (SmBM) Kit SingleQuot® de medio de cultivo completo (0,1 % de Gentamicina/Amfotericina B). Este medio de cultivo se usó en todos los experimentos de AoSMC. Las células se pasaron mediante tripsinización (0,05 % de tripsina/EDTA) y se subcultivaron a una densidad de 3500 células/cm2. Todos los cultivos de células se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 95 % de humedad relativa y 5 % de CO2 ). Todas las células y medios se adquirieron de Lonza Inc. (Walkersville, MD).
e. Unión y propagación inicial de HUVEC y AoSMC sobre nanomatriz de PA-YK
Se prepararon cámaras de cultivo recubiertas con nanomatriz de PA-YK tal como se divulga en el presente documento. Para la unión de células inicial, se cultivaron HUVEC y AoSMC sobre una cámara de cultivo recubierta con nanomatriz de PA-YK en densidades de 30.000 células/cm2 y 15.000 células/cm2, respectivamente. Después de 2 horas de incubación, las células se tiñeron con calceína AM verde fluorescente y tinte homodímero-1 de etidio rojo fluorescente usando el kit de citotoxicidad/viabilidad LIVE/DEAD (Sondas moleculares, Eugene, OR). El número de células unidas por campo de visión (20 x) se determinó usando microscopía fluorescente (Nikon Eclipse E2000), y ponderando cinco campos aleatorios por muestra. Se analizó la propagación celular individual mediante software de procesamiento de imágenes (NIS-elements AR 2.30).
f. Adhesión plaquetaria sobre nanomatriz de PA-YK y PA-YK-NO
se preparó solución de PA-YK y PA-YK-NO tal como se describe en el presente documento y se fundió en películas echando gotas de 150 pl de la solución sobre cubreobjetos de vidrio circulares de 13 mm. Se preparó una solución de 2,5 mg/ml de colágeno I en 3 % de ácido acético glaciar y se fundió en películas del mismo modo para servir como la superficie de control. Se recogió sangre entera de un voluntario sano en tubos de heparina de b D Vacutainer® (BD, NJ) y se mezcló con 10uM de mepacrina para marcar fluorescentemente las plaquetas. Antes del experimento, películas de PA-YK, PA-YK-NO y colágenos se aclararon con PBS. Posteriormente, películas de colágeno I, PA-YK, y PA-YK-NO se incubaron separadamente con sangre marcada con mepacrina a 37 °C durante 15 minutos y a continuación se clararon con PBS. El número plaquetas adherentes por campo de visión (40x) se determinó usando un microscopio fluorescente (Nikon Eclipse E2000) y ponderando cinco campos aleatorios por muestra.
g. Preparación de NO limpiado
En primer lugar, la solución de NO puede limpiarse. El lavado es un proceso mediante el cual se pasa gas a través de una gran área de superficie de un líquido para retirar las impurezas indeseadas desde el flujo de gas. En este caso, el óxido nítrico disponible en el mercado se pasa a través de una solución alcalina que disuelve las especies de óxido de nitrógeno superior no deseadas. El aparato que se muestra en la Figura 4 se desgasifició en primer lugar con argón. Se limpió NO a través de una solución de NaOH de 5 M y se recogió en un vaso de reacción que contenía solución de PA-IK.
h. Síntesis de nanomatriz liberadora de NO (PA-YK-NO)
Se sintetizó "PA-YK-NO" haciendo reaccionar PA-YK con NO limpiado con gas de argón. 0,1 % en peso de solución acuosa de PA-YK se hizo reaccionar con solución de NO limpiada a temperatura ambiente con gas argón en un matraz de fondo redondo de 100 ml durante la noche. La solución de PA-YK resultante se fundió en películas echando gotas de 130 pl sobre portaobjetos de vidrio de 13 mm. Las películas se secaron en una campana extractara de humos químicos durante las primeras 24 horas y a 37 °C durante las siguientes 48 horas. Para determinar el perfil de liberación de NO, cada película de PA-YK-NO se incubó en 500 pl de HBS en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Corning Inc., Corning, NY). Se recogió el HBS, se congeló (-20 °C) y se sustituyó por HBS fresco en distintos puntos de tiempo durante 1 mes. A continuación se confirmó y cuantificó la liberación de NO a partir de la nanomatriz de PA-YK-NO usando el ensayo de Greiss, que contenía sulfanilamida y diclorhidrato de N-1-naftiletilendiamina (Promega, WI) para medir el contenido de nitrito, que es el producto de degradación principal de NO.56. Al final del día 5 cada muestra recogida se mezcló con 100 pldel reactivo de Griess. Después de incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente, las muestras se leyeron a 540 nm usando un lector de microplacas de absorbancia (EL x 800, BIO-TEK Instrument, VT).
i. Evaluación de proliferación de HUVEC y AoSMC sobre nanomatriz de PA-YK-NO
Se prepararon películas de PA-YK-NO y PA-YK tal como se describe en el presente documento y se esterilizaron con UV durante 4 horas. La proliferación de HUVEC y AoSMC se evaluó mediante tinción de antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). El PCNA es una proteína de no histona de 36 kDa que se encuentra en el núcleo que juega un papel en la iniciación de la proliferación celular. Su prominente presencia en el nucleolo durante la fase S tardía del ciclo celular lo convierte en un marcado ideal para la proliferación celular. Se cultivaron HUVEC y AoSMC en densidades de 30.000 células/cm2y 15.000 células/cm2, respectivamente. Las células se cultivaron en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 95 % de humedad relativa y 5 % de CO2 ). Después de 48 h de incubación, las células se fijaron en un 10 % de solución de formalina tamponada neutral (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se aclararon con PBS. Las células, a continuación, se permeabilizaron mediante su incubación en metanol de grado histológico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), seguido por aclarado con PBS. Se usó una solución de peróxido de hidrógeno al 3 % para bloquear peroxidasas endógenas. Después de aclarar con PBS, a continuación las células se incubaron con solución salina tamponada con tris, seguida por la incubación con anticuerpo primario anti-PCNA lgG de ratón (Dako Corp., Carpinteria, CA) se diluyeron 1:100 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 3 % de FBS. Después de aspirar el anticuerpo primario y aclarar con PBS, las células se incubaron con HRP lgG de anti-ratón (Dako Corp., Carpinteria, CA) se diluyeron 1:100 en PBS con 3 % de FBS, seguidas por la incubación con cromogén de aminoetilcarbazol (Dako Corp., Carpinteria, CA). El cromogén genera un precipitado rojo que representa las células proliferantes. A continuación, las células se aclararon con PBS y se contratiñeron con hematoxilina de Mayer. El exceso de hemotoxilina se lavó mediante aclarado de las muestras con 37 mM de hidróxido de aminio 2-3 veces. Se determinó el porcentaje de células proliferante por cambio de visión (20 X) mediante el recuento de células proliferantes y células no proliferantes de hemotoxilina de tinción azul usando microscopía de fase de contraste (Nikon Eclipse E2000) después de ponderar cinco campos por muestra.
j. Análisis estadístico
Todos los datos se compararon con ensayos ANOVA unidireccional usando software SPSS. Un vapor P menor de 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
ii. Resultados
a. Autoensamblaje de péptidos amfífilos en nanofibras
PA-YIGSR y PA-KKKKK se sintetizaron exitosamente y se confirmaron sus pesos moleculares mediante espectrometría de masas MALDI-Tof. Se sintetizó un péptido amfífilo híbrido de PA-YIGSR y PA-KKKK ("PA-YK") mezclando soluciones al 0,1 % en peso de PA-YIGSR y PA-KKKKK en una relación molar de 9:1. El autoensamblaje de los PA en las nanofibras se indujo mediante la evaporación del disolvente tal como se ha descrito anteriormente. El PA-YK-NO liberador de NO se sintetizó haciendo reaccionar adicionalmente PA-YK con NO con argón. Las imágenes MET (Figura 4) demuestran un autoensamblaje exitoso de los PA en nanofibras mediante evaporación por disolvente. Las nanofibras obtenidas fueron similares en dimensión a las anteriormente informadas en estudios de autoensamblaje usando cambio iónico o de pH divalente.
b. Evaluación de unión y propagación de células inicial
Se cultivaron tanto HUVEC como AoSMC separadamente sobre la nanomatriz de PA-YK y se evaluó la unión de células para determinar si las células endoteliales reconocen el ligando adhesivo de YIGSR en la nanomatriz. La unión inicial de las HUVEC se encontró que era ligeramente superior que en comparación con las AoSMC (Figura 5). Se confirmó mediante evaluación de la propagación de HUVEc y AoSMC sobre la nanomatriz de PA-YK después de 2 horas (Figura 6 y 7). Después de 2 horas, se encontró que las HUVEC se propagaban tres veces más que las AoSMC. Los resultados indican que las HUVEC pueden reconocer el YIGSR incorporado en el PA-YK, significando que la nanomatriz de PA-YK promueve la unión y propagación de HUVEC.
c. Evaluación de unión de plaquetas y sobre nanomatriz de PA-YK
Se evaluó la unión plaquetaria sobre la nanomatriz de PA-YK-NO y PA-YK usando sangre entera marcada con mepacrina. La adhesión plaquetaria fue de aproximadamente 50 veces inferior sobre nanomatrices de PA-YK en comparación con el control positivo, Colágeno I. Además, la exposición de sangre a nanomatrices de PA-YK-NO liberadoras de NO dio como resultado prácticamente la no unión de plaquetas. (Figura 8)
d. Liberación de NO a partir de nanomatriz de PA-YK-NO
El perfil de liberación de NO a partir de la nanomatriz de PA-YK-NO durante un período de más de un mes se muestra en la Figura 10. La mayoría del NO se liberó en las primeras 24 horas, seguido por una liberación lenta sostenida durante un período de más de dos semanas, seguido por otra explosión de liberación dando como resultado en una recuperación de aproximadamente del 53 % de NO. El valor del l00 % de NO (8,6 pmoles) se calcula asumiendo que cada residuo de lisina en PA-YK reacciona con dos moléculas de NO.
e. Evaluación de proliferación de HUVEC y AoSMC sobre nanomatriz de PA-YK-NO
Para examinar el efecto del NO sobre HUVEC y AoSMC, las células se cultivaron sobre cámaras de cultivo recubiertas con nanomatriz de PA-YK-NO. La proliferaicón de células se evaluó usando tinción de PCNA después de 48 horas de incubación. También se realizaron experimentos de proliferación paralela sobre nanomatriz de PA-YK como un control. Tal como se muestra en la Figura 9, el porcentaje de HUVEC positivas de PCNA ((66,8±1,94)%) sobre PA-YK-NO se encontró que era significativamente superior en comparación con PA-YK ((50,29±3,4)%). Por el contrario, el porcentaje de AoSMC positivas de PCNA sobre PA-YK-NO ((16,4±2,8)%) fue significativamente inferior que el de PA-YK ((34,8±1,9)%).
2. Ejemplo 2: Evaluación in vivo de nanomatriz autoensamblada que imita endotelio nativo
Se implantaron stents recubiertos de nanomatriz autoensamblada en arterias iliacas de conejo y se evaluaron mediante histomorfometría para la evidencia de estenosis y trombosis.
i. Materiales y métodos
a. Recubrimiento y caracterización de stent
Para un recubrimiento uniforme con la solución de PA, se montó un stent de acero inoxidable disponible en el mercado sobre un mandril (alambre de acero inoxidable - 0,018 pulgadas de diámetro) unido a un motor giratorio a una velocidad de 15 rpm. El stent giratorio se sumergió en una solución de PA contenida en un depósito con la parte superior abierta tal como se muestra en la Figura 11. El depósito con la parte superior abierta facilita el autoensamblaje inducido por evaporación de los PA en la nanomatriz sobre la superficie del stent. La rotación del stent asegura el recubrimiento uniforme de las nanofibras de PA por todas las superficies externas e internas del stent. Los tapones en ambos extremos de los stent evitan que el stent se deslice sobre el mandril. El stent se giró durante 12 horas en la solución de PA y a continuación se dejó secar durante otras 24 horas. La Figura 12 muestra la imagen SEM de 0,1 % en peso de stent recubierto con PAYk después de su manipulación por el practicante. Cabe destacar la superficie de recubrimiento uniforme suave que permanece inalterada después de su manipulación (montaje sobre balón de angioplastia y expansión). Este resultado indica que la nanomatriz de PA puede recubrirse uniformemente sobre stent y permanecer estable durante el proceso de manipulación.
b. Grupos de estudio para evaluación in vivo
Se usaron conejos blancos macho de Nueva Zelanda para este estudio. Se usó un conejo por grupo con dos stents implantados por conejo. Se evaluaron 2 recubrimientos de nanomatriz distintos y 1 stent de acero inoxidable metálico sin recubrimiento. Cada tipo de stent se evaluó a las 2 semanas y a las 4 semanas del siguiente modo: Control (stent metálico sin recubrimiento) 2 semanas, 4 semanas; Baja dosis (recubierto con 0,1 % en peso de PAYKNO) 2 semanas, 4 semanas; y Alta dosis (recubierto con 1 % en peso de PAYKNO) 2 semanas, 4 semanas. Para los dos puntos de tiempo de dos semanas, todos los stents se implantaron antes de un daño de balón. Todos los conejos se alojaron durante al menos dos días antes de la cirugía. El protocolo de cirugía fue aprobado por el Comité Institucional del cuidado y uso de los animales (IACUC) en la Universidad de Alabama en Birmingham y se describe a continuación. c. Implantación de stent
El día del procedimiento, los conejos se anestesiaron con ketamina/xilacina 35/5 mg/kg. Se insertó un tubo endotraqueal y se conectó a un respirador operado con un volumen tidal de 400 ml a una velocidad de 16 respiraciones por minuto. La anestesia se mantuvo con isoflurano al 2 %. El ritmo cardíaco y la saturación de oxígeno en sangre se controló usando un oxímetro de pulso colocado sobre la lengua del animal. La presión en sangre se controló continuamente usando un brazalete sobre la pata trasera. El conejo se aseguró a la mesa en posición dorsal recostada. Se proporcionaron 81 mg/día de aspirina por boca diariamente, empezando el día antes del procedimiento, hasta el momento de la eutanasia.
Se expuso la arteria carótida derecha y se obtuvo acceso vascular. Se insertó una funda francesa 6 en la arteria carótida y se administró por vía intravenosa heparina (150 unidad/kg). Con una guía fluoroscópica, un catéter guía coronario JR4 Francés 6 se avanzó sobre un alambre guía coronario de 0,014" para descender la aorta. Se llevó a cabo la angiografía usando aproximadamente 8 cc de contraste de diaztroato de Meglumina inyectado a través del catéter. El valor basal del arteriograma se registró digitalmente. Después de la angiografía, un stent montado sobre un balón de suministro se avanzó sobre el alambre guía en una arteria ilíaca. El stent se desplegó para que fuera ligeramente más grande de tamaño, con una relación de stent con respecto a arteria de 1,1 a 1. Se desplegó un segundo stent de un modo similar a la otra arteria ilíaca. Después de la implantación del stent, se retiró el catéter, el alambre guía y el armazón arterial. La ligó la arteria carótida. La herida se suturó y cerró. A continuación, el animal se dejó recuperar bajo observación. Se administró Buprenex (0,05 mg/kg) intramuscularmente cada 12 horas, empezando el día de finalización del procedimiento.
Se controló diariamente a los animales por cualquier pérdida significante de apetito/pero (más del 20 % de pérdida de peso corporal) y falta de circulación sanguínea en las patas traseras.
d. Extracción de stent
2 semanas y 4 semanas después de la implantación del stent se practicó la eutanasia y las arterias ilíacas con stent se fijaron con perfusión a presión con formalina. Los stents se retiraron y colocaron en formalina tamponada al 10 % para estudios histológicos.
e. Procesamiento tisular
Todos los stents fijados se deshidrataron e incorporaron en resina de metilmetacrilato. Tras completar la polimerización, las áreas de interés se llevaron más cerca a la superficie con una molienda preliminar. El lado opuesto del bloque se
montó sobre un lado usando Technovit 4000 (Exakt Technologies, Inc., Oklahoma City, OK). Se cortan secciones (aproximadamente 100 micrómetros de espesor) de cada espécimen usando la sierra de diamante Exakt (Exakt Technologies, Inc., Oklahoma City, OK), que es algo similar a una sierra de banda grande que utiliza una banda de corte recubierta con diamante con un sistema de enfriamiento y enjuague de agua. Se molieron las secciones a aproximadamente 20-30 pm con el sistema de molienda de Exakt (Exakt Technologies, Inc., Oklahoma City, OK), lo que produce superficies paralelas de presión y se suavizó usando gravilla creciente de papel de lija. Después la superficie del espécimen a estudiar se alcanzó, se pulió con papel lija de 4000 gravilla para crear una superficie lo más suave posible. Las secciones se realizaron al 25 %, 50 % y 75 % de las regiones del stent. Todas las secciones se tiñeron con tinte Fuchsin azúl/básico de metileno.
Los estudios histológicos incluían daño, formación de trombo, inflamación y presencia de neointima. Los segmentos de stent se analizaron y evaluaron por daño arterial, usando la puntuación de daño de Schawartz. También se evaluaron la inflamación y el trombo alrededor de cada riostra, con una escala de calificación. El espesor neointimal en cada riostra se midió en micrómetros. Se realizaron mediciones morfométricas guiadas por ordenador usando imágenes digitales y software de análisis de imágenes de Bioquant (Bioquant Image Analysis Corp, Nashville, TN). Se realizó planimetría computarizada.
ii. Resultados
La Figura 13A muestra que el inflamiento del balón desplegó exitosamente stents en la arteria iliaca de conejo. Tal como se muestra en la Figura 13B, los stents se desplegaron en general completamente y se produjo un daño tisular subyacente mínimo. Los vasos sanguíneos estuvieron intactos y patentes. No se notó ninguna descamación ni pelado del recubrimiento de nanomatriz. Se encontró una mínima inflamación alrededor de las riostras de stent. De forma destacable, había una muy pequeña hiperplasia neointimal y sin trombos encontrados sobre la superficie de los stents recubiertos con nanomatriz.
Las puntuaciones de daños se asignaron a cada riostra de stent de 0 a tres del siguiente modo: 0 = sin daños; 1 = rotura en la membrana elástica interna; 2 = perforación del medio; y 3 = perforación de la membrana elástica externa a la adventicia.
La puntuación de daño promedia para cada segmento se calcó dividiendo la suma de puntuaciones de daño por el número total de riostra en la sección examinada. Con la excepción de los stents de control en el grupo de 4 semanas (puntuación de daño promedia ~0,02), no se observó ninguna evidencia de daño en ningún stent.
El espesor neointimal (EN) se midió en micrómetros. A las 2 semanas como se muestra en la figura 14, pareció haber una tendencia aparente hacia un espesor de NI inferior en los stents de alta dosis en comparación con el control. A las 4 semanas el EN como se muestra en la figura 15, fue superior que a las 2 semanas, pero la tendencia hacia un NI inferior en tanto grupos de baja dosis como de alta dosis pareció persistir, en comparación con los controles. Se evaluó la inflamación alrededor de cada riostra usando la siguiente escala de puntuación: 0 = sin células inflamatorias alrededor de la riostra; 1 = ligero, no circunferencial infiltrado limfohistocítico alrededor de la riostra; 2 = localizado, de moderado a denso de agregado celular alrededor de la riostra no circunferencialmente; y 3 = infiltración celular limfohistiocítica densa circunferencial de la riostra.
Las puntuaciones de inflamación promedio de todos los grupos de estudio fueron inferiores a 0,5 sin diferencias significantes en ninguna de los grupos de stent de 2 semanas o 4 semanas. También, se encontró que las puntuaciones de inflamación eran similares para tanto los grupos de 2 semanas como de 4 semanas tal como se muestra en la Figura 16 y 17.
Las puntuaciones de trombo alrededor de cada riostra se puntuaron de cero a tres. A las 2 semanas se encontró un trombo mínimo o no se encontro trombo en todos los stents. A las 4 semanas la puntuación de trombo promedia fue inferior a 0,1 para todos los grupos de stent sin diferencia significativa entre los grupos. Uno de los dos stents de alta dosis no monstró trombo a las 4 semanas como se muestra en la figura 18.
iii. Conclusiones
En su conjunto, todos los animales sobrevivieron y hubo daño tisular mínimo asociado con el despliegue del stent en todos los grupos. El recubrimiento de stent parece ser estables puede no se notó ninguna descamación ni pelado del recubrimiento de nanomatriz. Hubo inflamación mínima y casi no se observó trombo en tanto los puntos de tiempo de 2 semanas como de 4 semanas. Una comparación del espesor neointimal por todos los grupos no mostró diferencias apreciables entre cualquier grupo, aunque hubo una sugerencia de una tendencia descendente en los grupos de stent de alta dosis y baja dosis en comparación con los grupos de stent de control no recubiertos. Se observaron las células endoteliales sobre las secciones de histología incluidos los stents de alta dosis. La ausencia de deposición de fibrina y no trombo consiguiente alrededor de las riostras puede deberse a la presencia de alineación celular endotelial sobre la superficies.
3. Ejemplo 3: Una nanomatriz biomimética híbrida mediante combinación de nanofibras PCL de electrohilado y péptidos amfífilos (PA) que imitan endotelio
i. Materiales y métodos
a. Síntesis de nanofibras de PCL
Sedimentos de PCL (Sigma Aldrich, St. Louis, MO; Mn = 80.000) se disolvieron en un sistema de disolvente de 1:1 (v/v) de cloroformo: metanol para obtener una solución de polímero viscoso al 22,5 % en peso y se transfirió a una jeringa tapada con una aguja con punta roma de 25-G. La jeringa se colocó en una bomba de jeringa (KD Scientific, Holliston, MA) que se había establecido a un caudal de 1 ml/h. La punta de la aguja se conectó a una fuente de alto voltaje (Gamma High-Voltage Research, Ormond Beach, FL) a través de la cual se aplicó un voltaje de 21 kV a la punta de la aguja. Las nanofibras de PCL de electrohilado (ePCL) resultantes se depositaron sobre un recolector de aluminio triturado que se colocó a 28 cm de la punta de la agua. Los colectores con láminas de ePCL sobre ellas se almacenaron a continuación en un desecador al vacío durante 2-3 días para retirar cualquier disolvente residual. La morfología de las nanofibras de ePCL se caracterizó usando microscopia electrónica de barrido (SEM). Las nanofibras de recubrieron por metalizado por bombardeo con oro/paladio y se observó su morfología con un Philips SEM 510 a un voltaje de aceleración de 20 kV. Se analizaron las imágenes SEM usando un analizador de imagen (Image-proplus, Media Cybernetics Co., Silver Spring, MD, USA) para la medición de los diámetros de fibras.
b. Síntesis de péptidos amfífilos
Los péptidos pueden sintetizarse usando química de Fmoc en un sintetizador de péptidos Aapptech Apex 396, tal como se ha descrito anteriormente (Jun y col. 2005). Se sintetizaron dos treceavos de péptidos de aminoácidos que consistían en secuencias sensibles a MMP-2 (GTAGLIGQ) con una secuencia de adhesivo de células YIGSR o residuo donador de NO KKKKK. Estos péptidos de alquilaron para enlazarse a una cadena de palmitilo de 16 carbonos, creando, de este modo, un amfífilo. Por lo tanto, dos PA distintos, C16-GTAGLIGQ-YIGSR (PA-YIGSR) y C16-GTAGLIGQ-KKKKK (PA-KKKKK) se sintetizaron.
c. Mantenimiento de células
Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se cultivaron en un medio basal de endotelio (EBM) complementado con medio de crecimiento endotelial (EGM) (2 % de FBS, 0,1 % de hEGF, 0,1 % de hidrocortisona, 0,1 % de gentamicina A, 0,4 % de extracto de cerebro bovino). Este medio de cultivo se usó en todos los experimentos de HUVEC. Las células se pasaron mediante tripsinización (0,05 % de tripsina/EDTA) y se subcultivaron a una densidad de 2500-5000 células/cm2. Se cultivaron células de músculo liso aórticas humanas (AoSMC) en medio basal de células de músculo liso (SmBM) complementado con medio de crecimiento celular de músculo liso SmGM-2) Kit SingleQuot® (5 % de FBS, 0,1 % de insulina, 0,2 % de hFGF-B, 0,1 % de gentamicina A, 0,1 % de hEGF). Este medio de cultivo se usó en todos los experimentos de AoSMC. Las células se pasaron mediante tripsinización (0,05 % de tripsina/EDTA) y se subcultivaron a una densidad de 3500 células/cm2. Todos los cultivos de células se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 95 % de humedad relativa y 5 % de CO2 ). Todas las células y medios se adquirieron de Lonza Inc. (Walkersville, MD).
d. Optimización de relación de PA-YIGSR y PA-KKKKK
Se cultivaron HUVEC a una densidad de 30.000 células/cm2 sobre distintas relaciones molares de PA-YIGSR y PA-KKKKK recubriendo ePCL, designados como ePCL-YK 90 (90 % de PA YIGSR, 10 % de PA KKKKK), ePCL-YK 75 (75 % de PA YIGSR, 25 % de PA KKKKK), ePCL-YK 50 (50 % de PA YIGSR, 50 % de PA KKKKK) y ePCL-YK 25 (25 % de PA YIGSR, 75 % de PA KKKKK). ePCL no recubiertas se usaron como control. Después de un período de incubación de 2 horas, se aspiró el medio; las células se tripsinizaron usando 400 pl de 0,25 % de tripsina clara durante 30 minutos. Las células tripsinizadas se recogieron en diluciones de 1:1 con PBS en tubos eppendorf de 1,5 ml y se almacenaron a -80 °C. Por lo tanto, las muestras recogidas se sometieron a ensayo de ADN de Picogreen para evaluar el contenido de ADN que es proporcional al número celular.
Las células se permeabilizaron mediante ciclos de congelación-descongelación repetidos. Después, se añadió tinte de PicoGreen a la muestra de célula. El tinte de PicoGreen se une a ADN bicatenario en células y permite su cuantificación. Volúmenes conocidos de ADNds de timo de ternera se usaron como estándares. La fluorescencia se midió en el lector de fluorescencia de microplacas (Synergy HT, Bio-Tek Instruments, VT). La cantidad de ADN se correlacionó con el número celular mediante un valor empírico de 8 pg de ADN por célula.
e. Preparación y caracterización de nanomatriz híbrida liberadora de NO
Se sintetizaron los PA liberadores de NO haciendo reaccionar soluciones de PA durante la noche con NO puro a elevada presión. Se obtuvo NO puro mediante el proceso de lavado. Se pasó gas de NO disponible en el mercado a través de 5 M de hidróxido potásico para retirar impurezas tales como especies de óxido superior. Antes del lavado de NO, el aparato de desgasificó pasando argón a través del sistema.
Se escogió una relación 9:1 de PA-YIGSR y PA-KKKKK como la mejor relación. En lo sucesivo en este documento, esta mezcla se denomina como PA-YK. Por lo tanto, el PA-YK se hizo reaccionar con NO para obtener PA liberadores de NO, que se denominaron PA-YK-NO. El autoensamblaje de PA-YK y PA-YK-NO se caracterizó mediante microscopía de electrones de transmisión. Esto se realizó para asegurar que la reacción de NO no interfiere con el proceso de autoensamblaje. PA-YK-NO se recubrieron sobre discos de ePCL de 16 mm de diámetro para obtener la nanomatriz híbrida liberadora de NO, denominada ePCL-YK-NO. Esto puede llevarse a cabo tal como sigue.
Usando una taladradora Humboldt (Fisher Scientific), se cortaron lámina de ePCL en discos de 16 mm de diámetro. Estos discos se esterilizaron con concentraciones descendentes de etanol. Estos discos se recubrieron con 200 pl de 0,1 % en peso de PA. Estos armazones se colocaron a continuación sobre un agitador durante 24 horas y, a continuación, los PA se dejaron autoensamblarse sobre nanofibras de ePCL, mediante evaporación por disolvente secándolas en una campana extractora de químicos durante 48 horas. El autoensamblaje exitoso de los PA sobre nanofibras de ePCL se confirmó mediante MET. La PCL se electrohiló sobre rejillas MET hexagonales de 600 de malla y se desecó en un desecador al vacío durante 48 horas. A continuación, se recubrieron con 5 pl de 0,1 % en peso de PA. Las rejillas se dejaron secar a continuación durante la noche en una campana extractora de químicos. Estas rejillas a continuación se tiñeron con un 2 % de PTA durante 30 segundos. Las rejillas a continuación se sometieron a formación de imágenes usando un microscopio TI T12 de FEI Tecnai a 60 kV de voltaje de aceleración. También, para asegurar que los PA no interfieren con las redes de ePCL, se sometieron a formación de imágenes ePCL recubiertos con PA usando SEM.
Para estudios de liberación de NO, los armazones de ePCL de 16 mm se recubrieron con 200 |jl 1 % en peso de PA-YK-NO. Estos discos se colocaron a continuación en un agitador durante 24 horas, seguidos por 48 horas en una campana extractora de químicos para permitir el autoensablaje de PA sobre nanofibras de ePCL. Estos armazones se incubaron, a continuación en 40o j l de solución salina tamponada con HEPES (HBS) en una placa de cultivo tisular de 48 pocillos. Las muestras se recogieron en los puntos de tiempo de 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 24 h, 48 h, 4 días, 6 días, 10 días, 14 días, 21 días y 28 días. Como control, se recubrieron armazones de ePCL con PA-YIGSR-NO. Se obtuvo PA-YIGSR-NO haciendo reaccionar PA-YIGSR con NO puro. Esto se refiere para la unión no específica de NO a PA. Después de recoger las muestras, se midió el contenido de nitrito usando ensayo Greiss (Promega), que usa sulfanilamida y diclorhidrato de N-1-naftiletilendiamina. Nitrito es el producto de degradación principal de NO. Se trataron 50 j l de muestra con 50 j l de sulfanilamida y 50 j l de diclorhidrato de N-1-naftiletilendiamina. Después de la incubación durante 15 minutos, se levó la absorbancia a 540 nm usando un lector de microplacas (EL x 800, BIO-TEK Instrument, VT). La diferencia en contenido de nitrito entre PCL-PA-YK-NO y ePCL-PA-YIGSR-NO se refiere al NO liberado desde los residuos de lisina de PA-KKKKK. Esto se graficó como medición de NO liberado frente a tiempo. f. Evaluación de comportamientos celulares sobre nanomatriz híbrida
se cultivaron HUVEC y AoSMC sobre una cámara de cultivo recubierta con nanomatriz de ePCL-PA-YK-NO y ePCL-PA-YK en densidades de 30.000 células/cm2 y 15.000 células/cm2, respectivamente. Después de 2 horas de incubación, las células se tiñeron morfológicamente con el kit de citotoxicidad/viabilidad LIVE/DEAD (Sondas moleculares, Eugene, OR). Se analizó la adhesión celular inicial cultivando HUVEC y AoSMC sobre 3 sustratos distintos: ePCL-PA-YK-NO; ePCL-PA-YK y ePCL. Se cultivaron HUVEC a 30.000 céclulas/cm2 y se cultivaron AoSMC a 15.000 células/cm2 sobre los sustratos que se mantuvieron en los pocillos de una placa de cultivo tisular de 48 pocillos. Después de un período de incubación de 2 horas, se aspiró el medio; las células se tripsinizaron usando 400 j l de 0,25 % de tripsina clara durante 30 minutos. Las células tripsinizadas se recogieron en diluciones de 1:1 con PBS en tubos eppendorf de 1,5 ml y se almacenaron a -80 °C. Por lo tanto, las muestras recogidas se sometieron a ensayo de ADN de Picogreen para evaluar el contenido de ADN que es proporcional al número celular.
Para evaluar el efecto del NO sobre la proliferación celular, se recubrió PA-YK-NO y PA-YK al 0,1 % en peso sobre discos de ePCL de 16 mm. Se cultivaron HUVEC y AoSMC en densidades de 30.000 células/cm2 y 15.000 células/cm2, respectivamente. La proliferación de HUVEC y AoSMC se evaluó mediante tinción de antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). Después de 48 h de incubación, las células se fijaron en un 10 % de formalina, permeabilizaron en metanol y bloquearon usando un 3 % de solución de peróxido de hidrógeno. A continuación, las células se incubaron con solución salina tamponada con tris, seguida por la incubación con anticuerpo primario anti-PCNA lgG de ratón (Dako Corp., Carpinteria, CA) se diluyeron 1:100 en PBS con 3 % de FBS, Después, las células se incubaron con HRP lgG de anti-ratón (Dako Corp., Carpinteria, CA) se diluyeron 1:100 en PBS con 3 % de FBS, seguidas por la incubación con cromogén de aminoetilcarbazol (Dako Corp., Carpinteria, CA). Las células se contratiñeron con hematoxilina de Mayer y se aclararon con 37 mM de hidróxido de amonio. Se determinó el porcentaje de células proliferante por cambio de visión (20 X) mediante el recuento de células proliferantes y células no proliferantes azules usando microscopía de fase de contraste. Para las cuantificaciones celulares, se sometieron a formación de imágenes cinco campos al azar y se ponderó para cada pocillo. Además, se sometieron a ensayo cuatro muestra para cada condición realizando los experimentos. Los resultados que se muestran en los gráficos ilustran un promedio de sobre 120 imágenes a partir de 3 experimentos independientes (n=12).
g. Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces independientes. Todos los datos se compararon con ensayos ANOVA para evaluar la significancia estadística unidireccional usando software SPSS. Dentro del análisis ANOVA, se llevó a cabo el ensayo de comparaciones múltiples de Tukey para encontrar diferencias significantes entre pares. Un vapor de p< 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
ii. Resultados y discusión
En el presente documento se desvelan nanomatrices biomiméticas diseñadas para reconstituir las propiedades de endotelio nativo sobre la superficie de implante cardiovascular. Las nanofibras de ePCL, conocidas por poseer las características deseadas para aplicaciones biomédicas, se fabricaron exitosamente. Como muestra la imagen SEM en la Figura 20a, las fibras de ePCL tienen morfologías relativamente uniformes, poseen diámetros de nanoescala de entre 200 nm - 700 nm y están libreas de perlas. La naturaleza aleatoria, entrelazada que es típica de todas las nanofibras de ePCL también resulta claramente evidente a partir de la imagen. Adicionalmente, la mayoría de fibras tenía diámetros medidos para que se encontraran dentro del intervalo de 300 nm - 400 nm, lo que es similar a las agrupaciones de fibras de colágeno que se encuentran en MEC nativo (Elsdale T y Bard J: 1972). Este aspecto de topografía nanofibrosa que imita MEC se favorece por las células. Sin embargo, este rasgo morfológicamente atractivo se niega por la carencia de bioactividad en ePCL. Esta falta de sitios de reconocimiento celular sobre ePCL evita que el armazón interactúe activamente con las células y, por lo tanto, es incapaz de integrarse eficazmente con los tejidos huésped. Por tanto, También se divulga en el presente documento, estas nanofibras de ePCL están dotadas de bioactividad.
Esta bioactividad se introdujo a las nanofibras de ePCl mediante del uso de PA. Dos PA distintos, C16-GTAGLIGQ-YIGSR (PA-YIGSR) y C16-GTAGLIGQ-KKKKK (PA-KKKKK) se sintetizaron exitosamente. Los PA contenían secuencias sensibles a MMP-2 degradables mediadas por enzimas (GTAGLIGQ), junto con YIGSR o un grupo de polilisina (KKKKK) para formar residuos donadores de NO. Los PA-YK también se diseñaron mezclando distintas relaciones molares de PA-YIGSR y PA-KKKKK. Por tanto, las densidades de los ligandos adhesivos celulares y NO pueden ajustarse variando las relaciones de PA-YIGSR y PA-KKKKK. Estos PA-YK se recubrieron sobre ePCL para crear una nanomatriz híbrida (ePCL-PA-YK), que, a continuación, se caracterizó mediante SEM (Figura 20b). Resulta claro que el recubrimiento con PA-YK no afecta la morfología de nanofibras de ePCL. ePCL-PA-YK también se caracterizó mediante MET (Figura 21a). A partir de la imagen MET, se observó una nanofibra de ePCL central (aproximadamente 300 nm de diámetro) y se recubrió sobre cualquier lado con PA (7-8 nm de diámetro). Debido a la falta de profundidad en la formación de imágenes MET, se confirmó el recubrimiento uniforme inclinando la etapa del microscopio de electrones en el eje transversal para obtener una imagen (Figura 21b). Esta imagen es similar a la imagen no inclinada y, por lo tanto, puede inferirse razonablemente que el recubrimiento de PA sobre nanofibras de ePCL es uniforme. Para determinar la composición de matriz óptima, se cultivaron células endoteliales sobre diversas relaciones de ePCL-PA-YK y se encontró que la adhesión celular era significativamente superior con una concentración de PA-YIGSR en aumento (Figura 22). Por tanto, ePCL-PA-YK90 (9:1 mol/mol), en lo sucesito denominado como ePCL-PA-YK, se usó para todos los estudios adicionales.
PA-YK se hizo reaccionar con NO para obtener PA-YK-NO. A continuación, se recubrió sobre ePCL para fabricar ePCL-PA-YK-NO, que es la nanomatriz híbrida biomimética liberadora de NO. ePCL-YK-NO se caracterizó mediante SEM (Figura 19c), y se confirmó que PA-YK-NO no afecta a la morfología de las nanofibras de ePCL. Para confirmar el recubrimiento uniforme, a continuación, ePCL-PA-YK-NO se sometió a formación de imágenes mediante MET (Figura 21c). El recubrimiento uniforme de PA-YK-NO es visible sobre cualquier lado de las nanofibras de ePCL y se confirmó, de nuevo, mediante formación de imágenes después de inclinar la etapa en el eje transversal (Figura 21d).
El perfil de liberación de NO a partir de la nanomatriz híbrida de ePCL-PA-YK-NO se evaluó usando el ensayo de Greiss. Se observó una liberación de NO exitosa durante más de 28 días. Se produjo una liberación de explosión inicial en las primeras 48 horas, seguido por una liberación lenta sostenida durante un período de 4 semanas que resultó en un 48 % de recuperación de NO (Figura 23). La liberación de explosión inicial puede explicarse como la liberación de NO de la superficie de la matriz nanofibrosa de ePCL-PA-YK-NO, que puede ser fácilmente accesible para el suministro local. Esto resulta especialmente importante para limitar la proliferación de células de músculo liso, que es uno de los eventos clave en la reestenosis, empieza tan pronto como un día después del daño (Weintraub WS: 2007). Por lo tanto, la liberación de explosión de 48 horas de NO es crítico para detener la hiperplasia neointimal. La liberación sostenida posterior puede atribuirse a NO liberado de la masa de la matriz nanofibrosa híbrida mediante una combinación de difusión y degradación enzimática. Con el tiempo, debido a la presencia de sitios degradables de MMP-2, ePCL-PA-YK-NO se degrada lentamente y se cree que ayuda en la liberación sostenida de NO desde la masa de la matriz. La presencia de sitios degradables mediados por enzimas también se espera que cree una gradiente de concentración de NO en la nanomatriz híbrida. A partir del estudio, puede observarse que se liberaron 3,8 pmoles de NO durante el periodo de 4 semanas a partir de un disco de ePCL-PA-YK-NO que tenía 16 mm de diámetro. Esta cantidad es comparable al NO cumulativo liberado mediante células endoteliales a una tasa de 1x10'10mol cirr2 min'1 (Vaughn MW, y col. 1998). La liberación sostenida lenta durante un período más largo se requiere para mantener el estado no proliferativo de células de músculo liso, naturaleza antitrombogénica de la pared del vaso y promover la endotelización durante el período de recuperación, que lleva normalmente varias semanas. Otro rasgo de la nanomatriz híbrida es que la cantidad de NO liberado puede ajustarse fácilmente en aplicaciones futuras cambiando el número de fracciones de lisina en PA-KKKKK. Por tanto, aumentar el número de lisina extendiendo el número de lisina en PA-KKKKK (po ejemplo, PA-KKKKKKK) o aumentando la proporción de PA-KKKKK en PA-YK (por ejemplo, una relación de PA-YIGs R con respecto a PA-k Kk KK de 9:2, 3:1, 9:4, 2:1, 9:5, 3:2, 9:7, 9:8, 1:1, 3:4) puede aumentar la tasa de liberación de NO y aumentar la duración de liberación de NO.
Se estudió la adhesión celular inicial cultivando HUVECs y AoSMC sobre ePCL-PA-YK-NO y ePCL-PA-YK. ePCL no recubiertas se usaron como control. Estas células se sometieron a formación de imágenes morfológicamente y puede observarse que ePCL-PA-YK-NO y ePCL-PA-YK mejoran la adhesión y propagación de HUVEC cuando se comparó con ePCL (Figura 24), mientras que ePCL-PA-YK-NO y ePCL-PA-YK no apoyan la propagación de AoSMC (Figura 25). A partir de la Figura 26a, puede observarse que ePCL-PA-YK-NO (15576±2414) y ePCL-PA-YK (16685±808) muestran una adhesión de HUVEC significativamente superior cuando se comparan con ePCL no recubiertas (12490±639). A partir de la figura 26b, es evidente que ePCL-PA-YK-NO (9123±1344) y ePCL-PA-YK (9404±1259) muestran una adhesión similar que ePCL (9310±561) y, por lo tanto, no apoya la adhesión de AoSMC. Estos resultados claramente muestran que las nanomatrices híbridas (ePCL-PA-YK-NO y ePCL-PA-YK) promueven la adhesión y propagación celular endotelial, mientras que no apoyan simultáneamente la adhesión y propagación de células del músculo liso. Esto se debe a que los PA dotan a las nanofibras de ePCL son bioactividad específica celular en la forma de fracción de adhesivo celular de YIGSR derivado de laminina.
Para el efecto de NO sobre la proliferación de HUVEC y AoSMC se estudió usando el ensayo Greiss después de 48 horas de incubación. Tal como se muestra en la Figura 27, el porcentaje de HUVEC positivas de PCNA sobre la nanomatriz de ePCL-PA-YK-NO (70±2 %) se encontró que era significativamente superior en comparación con la nanomatriz de ePCL-PA-YK (57 ± 3 %). Sin embargo, el porcentaje de AoSMC positivas de PCNA sobre ePCL-PA-YK-NO (41±3%)) fue significativamente inferior que sobre ePCL-PA-YK (58±4 %). Estos resultados indican que la nanomatriz de ePCL-PA-YK-NO potencia el crecimiento celular endotelial pero limita el crecimiento de célula de músculo liso. La potenciación de endotelización, mientras que evita el crecimiento de músculo liso, es una etapa crucial hacia la mejora de la permeabilidad del injerto evitando hiperplasia intimal y reestenosis.
Por lo tanto, esta nanomatriz híbrida tiene un gran potencial para su uso como implantes cardiovasculares biomiméticos. Los implantes cardiovasculares convencionales están limitados a proporcionar apoyo estructural y son incapaces de integrarse eficazmente con el tejido huésped debido a su incapacidad de imitar estrechamente el endotelio nativo. Adicionalmente, se caracterizan por una falta de re-endotelización, reestenosis y trombosis. Tal como se divulga en el presente documento, se desarrollaron armazones biomiméticos híbridos que consiste en nanofibras de PCL y PA electrohiladas. ePCL proporciona la resistencia mecánica y estructura topográfica que es deseable para un injerto cardiovascular que se expone a fuerzas pulsativas regulares. Las nanofibras de PA consisten en una fracción de YIGSR de adhesivo celular endotelial, que se espera que reclute y promueva la adhesión de células endoteliales frente al flujo de tensiones. El NO liberado de la nanomatriz híbrida la proliferación de células de músculo liso y dota a la nanomatriz con una naturaleza antitrombótica, mientras que simultáneamente promueve la proliferación celular endotelial. Los sitios degradables mediados por enzimas presentes en los PA se esperan que causen una degradación dirigida por células lenta de la matriz y esto ayuda a la liberación sostenida de NO. Por lo tanto, como ejemplos de las aplicaciones para esta nanomatriz híbrida, la nanomatriz se puede usar en dispositivos cardiovasculares implantables, tales como injertos vasculares y válvulas cardíacas.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido amfífilo, que comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célula y una secuencia de productor donador de óxido nítrico, en donde la secuencia de adhesión de primera célula es una secuencia de adhesión de célula endotelial que no se une a células del músculo liso y/o plaquetas, en donde la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP) y en donde la secuencia de productor donador de óxido nítrico comprende polilisina o policisteína.
2. El péptido amfífilo de la reivindicación 1, en donde la secuencia de péptido hidrófilo comprende una de las siguientes fórmulas:
DS—CA, DS—KK, DS—CA—KK, o DS---KK---CA,
en donde — es un enlace covalente directo o indirecto,
en donde "DS" es una secuencia de degradación; y
en donde "CA" es una secuencia de adhesión de célula endotelial; y
en donde "KK" es una secuencia de productor donador de óxido nítrico;
y/o en donde la secuencia de degradación comprende una secuencia que se somete a degradación proteolítica mediada por células.
3. El péptido amfífilo de la reivindicación 2, en donde la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP), preferentemente un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz 2 (MMP2).
4. Una composición que comprende un primer y un segundo péptido amfífilo, cada uno independientemente que comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila del primer péptido amfífilo comprende una secuencia de degradación y una secuencia de adhesión de célula endotelial, y en donde la secuencia de péptido hidrófilo del segundo péptido amfífilo comprende una secuencia de degradación y una secuencia de productor donador de óxido nítrico y en donde la secuencia de productor donador de óxido nítrico comprende polilisina o policisteína.
5. La composición de la reivindicación 4, en donde la secuencia peptídica hidrófila del primer péptido amfífilo comprende la fórmula:
DS---CA,
en donde cada — es independientemente un enlace covalente directo o indirecto,
en donde "DS" es una secuencia de degradación; y
en donde "CA" es una secuencia de adhesión de célula endotelial;
y en donde la secuencia peptídica hidrófila del segundo péptido amfífilo comprende la fórmula:
DS---KK,
en donde "KK" es una secuencia de productor donador de óxido nítrico.
6. El péptido amfífilo de la reivindicación 1 o la composición de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente nanofibras, en donde el péptido amfífilo está recubriendo la nanofibra o en donde el primer y segundo péptidos amfífilos están recubriendo la nanofibra, en donde opcionalmente las nanofibras comprenden un poliéster, preferentemente una policaprolactona; y/o en donde opcionalmente las nanofibras están fabricadas mediante electrohilado.
7. Una nanomatriz que imita endotelio, que comprende uno o más de los péptidos amfífilos ensamblados en nanofibras, en donde los péptidos amfífilos comprende cada uno una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célulay una secuencia de productor donador de óxido nítrico, en donde la secuencia de adhesión de primera célula es una secuencia de adhesión de célula endotelial que no se une a células del músculo liso y/o plaquetas, en donde la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP) y en donde la secuencia de productor donador de óxido nítrico comprende polilisina o policisteína.
8. La nanomatriz que imita endotelio de la reivindicación 7, en donde las nanofibras comprenden una mezcla de péptidos amfífilos que tienen las fórmulas DS—CA y DS—KK, en donde los péptidos amfífilos DS—CA y DS—KK están presentes en las nanofibras en una relación de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1; y/o en donde las nanofibras comprenden adicionalmente policaprolactona.
9. Una composición que comprende un dispositivo médico recubierto con una nanomatriz que imita endotelio, que comprende uno o más de los péptidos amfífilos ensamblados en nanofibras, en donde los péptidos amfífilos comprende cada uno una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célula y una secuencia de productor donador de óxido nítrico, en donde la secuencia de adhesión de primera célula es una secuencia de adhesión de célula endotelial que no se une a células del músculo liso y/o plaquetas, en donde la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP) y en donde la secuencia de productor donador de óxido nítrico comprende polilisina o policisteína.
10. La composición de la reivindicación 9, en donde el dispositivo médico es un stent vascular, injerto vascular, catéter, marcapasos o válvula cardíaca, o en donde las nanofibras comprenden nanofibras de policaprolactona recubiertas con los amfífilos que forman la nanomatriz.
11. Uno o más péptidos amfífilos para su uso para tratar un sujeto con enfermedad cardiovascular en donde los péptidos amfífilos cada uno comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célula y una secuencia de productor donador de óxido nítrico, en donde la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP) y en donde la secuencia de productor donador de óxido nítrico comprende polilisina o policisteína.
12. Uno o más péptidos amfífilos para su uso en la mejora de la permeabilidad del injerto, en donde uno o más péptidos amfífilos son para la administración a un receptor un injerto en donde los péptidos amfífilos cada uno comprende una secuencia peptídica hidrófila y una cola hidrófoba, en donde la secuencia peptídica hidrófila comprende una secuencia de degradación y una o más de una secuencia de adhesión de primera célula y una secuencia de productor donador de óxido nítrico, en donde la secuencia de degradación comprende un sitio de escisión específico de metaloproteasa de matriz (MMP) y en donde la secuencia de productor donadorde óxido nítrico comprende polilisina o policisteína.
13. El uno o más péptidos amfífilos para su uso de la reivindicación 11 o 12, en donde los péptidos amfífilos están recubriendo una nanofibra de poliéster, preferentemente una nanofibra de policarbolactona.
14. El uno o más péptidos amfífilos para su uso de la reivindicación 11, en el que la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis; o en donde los péptidos amfífilos son para la administración al sujeto a través de un dispositivo médico, en donde opcionalmente el dispositivo médico es un stent vascular, injerto vascular, catéter, marcapasos o válvula cardíaca.
15. El uno o más péptidos amfífilos para su uso de la reivindicación 12, en donde el injerto es una arteria, vena, stent vascular, catéter, marcapasos o válvula cardíaca.
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