JP2022506716A - 抵抗性高血圧に対する併用療法 - Google Patents

Abstract

M心房性ナトリウム利尿ペプチド（MANP）および利尿剤（例えば、フロセミド）を併用して高血圧（抵抗性高血圧を含む）を治療するための材料および方法を本明細書に記載する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年11月9日出願の米国仮出願第62／758,009号からの優先権の利益を主張する。先願の開示内容は、本願の開示内容の一部とみなされる（参照により本願の開示内容に組み入れられる）。

連邦政府の支援を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）から授与されたHL136340に基づく政府支援によってなされたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。

技術分野
本明細書は、高血圧を治療するための材料および方法に関し、より詳細には、M心房性ナトリウム利尿ペプチド（MANP）および利尿剤（例えば、フロセミド）を組み合わせて使用して、抵抗性高血圧を有する哺乳動物を治療するための方法に関する。

背景
高血圧症（hypertension: HT）は、高血圧（high blood pressure）としても知られており、動脈内の血圧が持続的に上昇する長期にわたる内科的疾患である。高血圧は、降圧薬による治療に対して徐々に抵抗性を増していく。抵抗性高血圧（RH）患者は、(1)利尿剤、および典型的には、(2)アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬またはアンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)、および(3)カルシウムチャネル拮抗薬(CCB)を含む、異なる種類に属する3種の降圧薬を用いた併用治療にもかかわらず、血圧が上昇したままとなる。また、4種以上の薬剤により血圧がコントロールされている患者もRHと考えられる。現在、米国ではRH治療用に承認されている医薬品もしくは機器はない。

概要
本明細書は、少なくとも部分的には、MANPおよび利尿剤の組み合わせが、フロセミド（Fs）誘導性のアルドステロン刺激を抑制しつつ、強力な血圧（BP）降下作用を有するとの発見に基づく。この発見は、RHが、MANPとおよびフロセミド（Fs）などの利尿剤との併用によって効果的に治療できることを示した。

第1の態様において、本明細書は、哺乳動物を治療する方法を特徴とし、この方法には、哺乳動物へのMANPおよび利尿剤の投与を含めることができる。哺乳動物は、高血圧（例えば、RH）を有すると確認されたものでありうる。MANPは、配列番号3に記載のアミノ酸配列、または配列番号5～14のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有するものとすることができる。利尿剤は、フロセミドとすることができる。哺乳動物は、ヒトとすることができる。MANPは、静脈内に（例えば、約10pmol／kg／分～約100nmol／kg／分の用量で）投与することができる。MANPは、皮下に（例えば、約0.1ng/kg～約10mg/kgの用量で）投与することができる。MANPは、静脈内に投与された後、皮下に投与することができる。例えば、MANPは、約10pmol/kg/分～約100nmol/kg/分の用量で静脈内に投与し、その後、約0.1ng/kg～約100mg/kgの用量で皮下に投与することができる。利尿剤は、経口、静脈内、または皮下に投与することができる。MANPおよび利尿剤は、同一組成物の中で同時に投与することができる。MANPおよび利尿剤は、皮下に投与することができる。本方法は、MANPおよび利尿剤を哺乳動物に投与することで構成されうる。MANPおよび利尿剤は、MANPおよび利尿剤をすべての有効成分とする組成物として投与することができる。

別の態様において、本明細書は、哺乳動物において、利尿剤の１以上の有益な効果を増強し、利尿剤の１以上の有害な作用を低減するための方法を特徴とし、この方法は、哺乳動物に利尿剤およびMANPを投与することを含む。哺乳動物は、高血圧（例えば、RH）を有すると確認されたものでありうる。MANPは、配列番号3に記載のアミノ酸配列、または配列番号5～14のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有するものとすることができる。利尿剤は、フロセミドとすることができる。哺乳動物は、ヒトとすることができる。MANPおよび利尿剤は静脈内に投与することができる（例えば、この場合MANPは約10pmol／kg／分～約100nmol／kg／分の用量で投与される）。MANPおよび利尿剤は、皮下に投与することができる（例えば、この場合MANPが、約1μg／kg～約10μg／kgの用量で投与される）。MANPおよび利尿剤は、静脈内に投与され、その後、皮下に投与することができる。MANPは、静脈内に約10pmol／kg／分～約100nmol／kg／分の用量で投与し、その後、皮下に約1μg／kg～約10μg／kgの用量で投与することができる。１以上の有益な効果は、哺乳動物の血圧の低下を含み、１以上の有害な作用は、アルドステロンの活性化を含みうる。本方法は、利尿剤およびMANPをすべての有効成分とする組成物を投与することからなるとすることができる。MANPおよび利尿剤は、MANPおよび利尿剤をすべての有効成分とする組成物として投与することができる。

特に指定のない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明に関わる技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いて本発明を実施することができるが、適当な方法および材料は以下に記載する。本明細書に記載のあらゆる刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体がそのまま組み入れられる。矛盾のある場合、定義を含めて、本明細書に従うものとする。また、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

本発明の１以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。

図1は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP；配列番号1）の配列および概略の構造、ならびにMANP（配列番号3）の配列および概略の構造を示す図である。 図2A-2Cは、60分の時間をかけて、溶媒、100pmol/kg/分MANP、300pmol/kg/分MANP、または600pmol/kg/分MANPを投与したラットの平均動脈圧（MAP）（図2A）；溶媒、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、または10mg/kg Fsを投与したラットのMAP（図2B）、および溶媒、300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、600pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、または600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsを投与したラットのMAP（FIG.2C）をプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。データは平均値±SDとして表される。*p<0.05 対溶媒、^# p<0.05 対Fs10。 図2A-2Cは、60分の時間をかけて、溶媒、100pmol/kg/分MANP、300pmol/kg/分MANP、または600pmol/kg/分MANPを投与したラットの平均動脈圧（MAP）（図2A）；溶媒、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、または10mg/kg Fsを投与したラットのMAP（図2B）、および溶媒、300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、600pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、または600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsを投与したラットのMAP（FIG.2C）をプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。データは平均値±SDとして表される。*p<0.05 対溶媒、^# p<0.05 対Fs10。 図2A-2Cは、60分の時間をかけて、溶媒、100pmol/kg/分MANP、300pmol/kg/分MANP、または600pmol/kg/分MANPを投与したラットの平均動脈圧（MAP）（図2A）；溶媒、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、または10mg/kg Fsを投与したラットのMAP（図2B）、および溶媒、300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、600pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、または600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsを投与したラットのMAP（FIG.2C）をプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。データは平均値±SDとして表される。*p<0.05 対溶媒、^# p<0.05 対Fs10。 図3A-3Cは、60分の時間をかけて、溶媒、100pmol/kg/分MANP、300pmol/kg/分MANP、または600pmol/kg/分MANPを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3A）；溶媒、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、または10mg/kg Fsを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3B）、および溶媒、300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、600 pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、または600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3C）をプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。データは平均値±SDとして表される。*p<0.05 対溶媒、@ p<0.05 対MANP100。 図3A-3Cは、60分の時間をかけて、溶媒、100pmol/kg/分MANP、300pmol/kg/分MANP、または600pmol/kg/分MANPを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3A）；溶媒、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、または10mg/kg Fsを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3B）、および溶媒、300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、600 pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、または600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3C）をプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。データは平均値±SDとして表される。*p<0.05 対溶媒、@ p<0.05 対MANP100。 図3A-3Cは、60分の時間をかけて、溶媒、100pmol/kg/分MANP、300pmol/kg/分MANP、または600pmol/kg/分MANPを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3A）；溶媒、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、または10mg/kg Fsを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3B）、および溶媒、300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、600 pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、または600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsを投与したラットの血漿cGMPレベル（図3C）をプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。データは平均値±SDとして表される。*p<0.05 対溶媒、@ p<0.05 対MANP100。 図4は、60分間、溶媒、100pmol/kg/分MANP、300pmol/kg/分MANP、600pmol/kg/分MANP、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、10mg/kg Fs、300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、600pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、または600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsを投与したラットの血漿アルドステロン濃度をプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。データは平均値±SDとして表される。$ p<0.05 対Fs5、# p<0.05 対Fs10。 図5は、60分間、溶媒、100、300、もしくは600pmol/kg/分MANP、1、5、もしくは10mg/kg Fs、または300pmol/kg/分MANP＋5mg/kg Fs、300pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fs、もしくは600pmol/kg/分MANP＋10mg/kg Fsをラットに投与した後の、MAPの変化をcGMPレベルの変化に対してプロットしたグラフである。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。 図6A-6Cは、MANP（配列番号3）で刺激された、微粒子グアニル酸シクラーゼA（pGC-A）受容体を過剰発現するヒト胎児由来腎臓293（HEK293）細胞（図6A）、初代ヒト大動脈内皮細胞（HAEC）（図6B）、および初代ヒト大動脈平滑筋細胞（HASMC）（図6C）において生成するcGMPのレベルをプロットしたグラフである。標記された値は平均値±SEMである。* p< 0.05 対 対照。 図7A-7Cは、MANPまたは溶媒（対照）の注入（図7A）、Fsまたは溶媒（対照）のボーラス注入（図7B）、ならびにMANP注入およびFsボーラス注入の併用、または溶媒注入および溶媒ボーラス注入の併用（図7C）の、ベースライン（BL）、15分のリードイン、ならびにその15、30、45および60分後のラットのBPをプロットしたグラフである。表示された値は平均値±SEMである。# p< 0.05 MANP300 対溶媒；* p<0.05 MANP600 対溶媒；§ p<0.05 Fs1 対溶媒；@ p<0.05 Fs5 対溶媒；& p<0.05 Fs10 対溶媒；￡ p<0.05 MANP300+Fs5 対溶媒；(R) p<0.05 MANP300+Fs10 対溶媒；(C) p<0.05 MANP600+Fs10 対溶媒。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。 図8は、60分の、溶媒注入（対照）後、MANP注入後、Fsボーラス注入後、またはMANP注入およびFsボーラス注入の併用後のラットのBPをプロットしたグラフである。プロットされた値は平均値±SEMである。* p<0.05 対溶媒；＼ p<0.05 対MANP100；(R) p<0.05 MANP300 対MANP300+Fs10；# p<0.05 対MANP600；§ p<0.05 対Fs1；@ p<0.05 対Fs5；& p<0.05 対Fs10。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。 図9A-9Cは、MANPまたは溶媒（対照）の注入（図9A）、Fsまたは溶媒（対照）のボーラス注入（図9B）、ならびにMANP注入およびFsボーラス注入、または溶媒注入および溶媒ボーラス注入（対照）の併用（図9C）の、BL、30および60分後のラットの血漿cGMPをプロットしたグラフである。プロットされた値は平均値±SEMである。* p<0.05 対溶媒。MANPは配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するものとした。 図10は、MANP（配列番号3）、Fs、MANP＋Fsの組み合わせ、または溶媒を投与してから60分後のラットの尿中cGMP排泄量をプロットしたグラフである。プロットされた値は平均値±SEMである。* p<0.05 対溶媒（対照）。 図11は、MANP（配列番号3）、Fs、MANP＋Fsの組み合わせ、または溶媒を投与してから60分後のラットのアルドステロンレベルをプロットしたグラフである。表示された値は平均値±SEMである。* p<0.05 対溶媒（対照）；@ p<0.05 対Fs5；& p<0.05 対Fs10。 図12は、MANP（配列番号3）、Fs、MANP＋Fsの組み合わせ、または溶媒を投与した後のラットの血漿ANPと血漿cGMPとの間の正の相関関係を示すグラフである。ピアソンの相関係数（r）＝0.7479、p＜0.01。 図13は、MANP（配列番号3）、Fs、MANP+Fsの組み合わせ、または溶媒を投与した後のラットの血漿cGMPと平均動脈血圧との間の負の相関関係をプロットしたグラフである。ピアソンの相関係数（r）＝-0.6510、p<0.01。 図14A-14Cは、MANP（配列番号3）、Fs、MANP＋Fsの組み合わせ、または溶媒を投与してから60分後の、GFR（図14A）、尿中ナトリウム排泄量（図14B）および尿流量（図14C）をプロットしたグラフである。表示された値は平均値±SEMである。* p<0.05 対溶媒（対照）；＼ p<0.05 対MANP100；(R) p<0.05 対MANP300；@ p<0.05 対MANP600；# p<0.05 対Fs1；& p<0.05 対MANP300+Fs5。

詳細な説明
本明細書は、RHを含む高血圧を、MANPおよび利尿剤（例えば、Fs）を併用して治療するための材料および方法を提供する。例えば、本明細書は、投与後にその哺乳動物のBPが低下するように、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、またはブタ）にMANPおよび利尿剤を投与することを含む方法を提供する。一部の事例では、投与後の哺乳動物において、アルドステロンは上昇しない。一部の場合には、哺乳動物は高血圧（例えば、RT）であると確認することができる。

一般に「ウォーターピル」として知られる利尿剤は、腎臓が体内から余分な水分および塩分を排出するのを助け、それによって血管内の水分レベルを下げて血圧を低下させる薬である。利尿剤は、多くの場合、高血圧を呈する患者に処方される最初のタイプの薬剤である。高血圧患者を治療するために使用することができる利尿剤には、サイアザイド系利尿剤[例、クロルタリドン（Hygroton）、クロロチアジド（Diuril）、ヒドロクロロチアジド（Esidrix、Hydrodiuril、またはMicrozide）、インダパミド（Lozol）、およびメトラゾン（Mykrox、Zaroxolyn）]などがあり、その他に、アミロライド（ミダモール）、ブメタニド（ブメックス）、フロセミド（ラシックス）、スピロノラクトン（アルダクトン）、およびトリアムテレン（ディレニウム）などがあるが、これらに限定されない。フロセミド（本明細書では「Fs」と略す）は、他の降圧薬の有効性を高めることができるが、Fsはまた、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系を活性化する。

ナトリウム利尿ポリペプチドは、ナトリウムの尿中への排泄を増加させるナトリウム利尿を引き起こしうるポリペプチドである。ナトリウム利尿ポリペプチドは、脳、心臓、腎臓、および／または血管組織によって産生されうる。ヒトのナトリウム利尿ポリペプチドファミリーには、心臓ホルモンである心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、B型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、C型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）、およびウロジラチン（URO）がある。ナトリウム利尿ポリペプチドは、特徴がよく知られている2つのグアニル酸シクラーゼ受容体（ANP、BNP、およびUROに対するNPR-A、CNPに対するNPR-B）、およびセカンドメッセンジャーである環状3´,5´-グアノシン一リン酸（cGMP）を介して機能する（Kuhn (2003) Circ. Res. 93:700-709; Tawaragi et al. (1991) Biochem. Biophys. Res.Commun. 175:645-651；およびKomatsu et al. (1991) Endocrinol. 129:1104-1106)。ナトリウム利尿ポリペプチドは、例えば、血漿cGMPレベルの増加、尿中cGMP排泄の増加、正味の腎cGMP生成の増加、尿流量の増加、尿中ナトリウム排泄の増加、尿中カリウム排泄の増加、ヘマトクリットの増加、血漿BNP免疫反応性の増加、腎血流量の増加、血漿ANP免疫反応性の増加、腎血管抵抗の減少、ナトリウムの近位および遠位分画再吸収の減少、平均動脈圧の減少、肺毛細血管楔入圧の減少、右心房圧の減少、肺動脈圧の減少、血漿レニン活性の減少、血漿アンジオテンシンII濃度の減少、血漿アルドステロン濃度の減少、腎灌流圧の減少、および／または全身血管抵抗の減少などに有効となりうる。

MANPは、血圧および血管抵抗を有意に低下させることができるpGC-A/cGMP活性化物質である。本明細書に記載の方法は、部分的に、哺乳動物をMANPで治療することを含むことができる。図1に示すように、MANPは、28アミノ酸の成熟ヒトANP配列（SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；配列番号1）に加えて12アミノ酸のカルボキシ末端（RITAREDKQGWA；配列番号2）を含むアミノ酸配列を有する、ANPベースのペプチドである。MANPの全長配列は、SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA（配列番号3）である。MANPをコードする代表的な核酸配列は、5′-agcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccggtaccggataacagccagggaggacaagcagggctgggcctag-3′（配列番号4）である。

本明細書で使用される「MANP」は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号3に記載される配列のバリアントとすることができる。したがって、一部の場合には、本明細書に記載の方法に使用されるMANPは、配列番号3に記載のアミノ酸配列全体を含むことができる。一部の場合には、MANPは、配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むことができるが、ただし、そのアミノ酸配列は、1個、または1個から10個の間（例えば、10個、1個から9個の間、2個から9個の間、1個から8個の間、2個から8個の間、1個から7個の間、1個から6個の間、1個から5個の間、1個から4個の間、1個から3個の間、2個、または1個）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む。例えば、MANPは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の単一アミノ酸残基の付加、欠失、または置換を有する、配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むことができる。一部の事例では、MANPは、配列番号3のC末端部分（例えば、配列番号3の最後の12個のアミノ酸）の中に、１以上の付加、欠失、および／または置換を有することができる。このようなポリペプチドの例としては、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、スレオニンが欠失している前記ポリペプチド（SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRIAREDKQGWA；配列番号5）、トリプトファンがチロシンで置換されている前記ポリペプチド（SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGYA；配列番号6）、リジンとグルタミンの間にセリンが付加されている前記ポリペプチド（SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKSQGWA；配列番号7）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別の例において、MANPは、配列番号8（SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQ）に記載されるように、配列番号3の最後の3つの残基（すなわち、配列番号3のグリシン、トリプトファン、およびアラニン残基）を欠くことができる。いくつかの例において、MANPは、配列番号3のN末端部分（例えば、配列番号3の最初の6つのアミノ酸）の中に、１以上の付加、欠失、および／または置換を有することができる。このようなポリペプチドの例としては、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ウロジラチンからの4つのアミノ酸がN末端に付加された前記ポリペプチド（TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQ SGLGCNSFRYRITAREDKQGWA；配列番号9）、3位および4位のアルギニン残基がリジン残基に置換された前記ポリペプチド（SLKKSSCFGGRMD RIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA；配列番号10）、6位においてDアイソフォームのセリンに置換された前記ポリペプチド（SLRRSSCFGGRM DRIGAQSGLGCNSFRYRITA REDKQGWA；配列番号11）、4位においてDアイソフォームのアルギニンに置換され、5位のセリンが欠失した前記ポリペプチド（SLRRSCFGGRMDRIGAQSGL GCNSFRYRITAREDKQGWA；配列番号12）、1位、5位、6位のセリン残基がスレオニン残基に置換された前記ポリペプチド（TLRRTTCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFR YRITAREDKQGWA；配列番号13）、2位のロイシンがトリプトファンに置換された前記ポリペプチド（SWRRSSCFGGRMDR IGAQSGLGCNSFRY RITAREDKQGWA；配列番号14）、またはそれらの任意の組み合わせがあるが、それらに限定されない。

配列番号3に記載された任意のアミノ酸残基を欠失させることができるが、また、任意のアミノ酸残基（例えば、20種の通常のアミノ酸残基のいずれか、またはオルニチンもしくはシトルリンなどの他のタイプのアミノ酸）を、配列番号3に記載された配列に付加することができる。一部の場合には、MANPは、ε-アミノヘキサン酸；ヒドロキシル化アミノ酸、例えば3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、（5R）-5-ヒドロキシ-L-リジン、アロヒドロキシリジン、および5-ヒドロキシ-L-ノルバリンなど；ならびに／または、グリコシル化アミノ酸、例えば、単糖（例、D-グルコース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-グルコサミン、D-ガラクトサミン）もしくは単糖類の組み合わせを含むアミノ酸など、といった１以上の化学構造を含むことができる。

配列番号3に記載の代表的なMANP配列に対して、１以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するMANP（本明細書では「バリアント」MANPとも称される）は、任意の適当な方法で作製することができる。一部の場合には、（a）置換領域におけるペプチド骨格の構造、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（c）側鎖の大部分、を維持することに及ぼす影響において大きな差異のない置換を選択することによって、アミノ酸置換を行うことができる。例えば、天然に存在する残基は、側鎖の特性に基づいてグループ分けすることができる：(1)疎水性アミノ酸（ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）；(2)中性親水性アミノ酸（システイン、セリン、およびスレオニン）；(3)酸性アミノ酸（アスパラギン酸、およびグルタミン酸）；(4）塩基性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）；（5）鎖の方向性に影響を与えるアミノ酸（グリシン、およびプロリン）；ならびに（6）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン）。これらのグループ内で行われる置換は、保存的置換とみなすことができる。有用な保存的置換の非限定的な例としては、アラニンに代えてバリンへの置換、アルギニンに代えてリジン、アスパラギンに代えてグルタミン、アスパラギン酸に代えてグルタミン酸、システインに代えてセリン、グルタミンに代えてアスパラギン、グルタミン酸に代えてアスパラギン酸、グリシンに代えてプロリン、ヒスチジンに代えてアルギニン、イソロイシンに代えてロイシン、ロイシンに代えてイソロイシン、リジンに代えてアルギニン、メチオニンに代えてロイシン、フェニルアラニンに代えてロイシン、プロリンに代えてグリシン、セリンに代えてスレオニン、スレオニンに代えてセリン、トリプトファンに代えてチロシン、チロシンに代えてフェニルアラニン、および／またはバリンに代えてロイシンへの置換を含めることができるが、これらに限定されない。

本明細書に記載の方法において有用である、MANP内の任意の位置で行うことができる保存的置換のさらに他の例を表1に記載する。

いくつかの実施形態において、MANPは、１以上の非保存的置換を含むことができる。非保存的置換は、典型的には、上記のクラスのうち1つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを要する。このような作製は、大量の前記化合物を提供するために、または前記化合物の他の実施形態を提供するために望ましい可能性がある。アミノ酸変化が機能的なポリペプチドをもたらすかどうかは、例えば、本明細書に記載される方法を用いてポリペプチドバリアントの特異的活性をアッセイすることによって、容易に判定することができる。

いくつかの実施形態において、MANPは、例えば、35～45アミノ酸残基（例えば、35～40、40～45、35～37、36～38、37～39、38～40、39～41、40～42、41～43、42～44、または43～45アミノ酸残基）の長さを有することができる。いくつかの実施形態において、ナトリウム利尿ポリペプチドは、配列番号3に記載されるようなアミノ酸配列を含むことができるが、特定の数のアミノ酸置換を有する。例えば、ナトリウム利尿ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を有するが、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのアミノ酸置換を有することができる。そのようなアミノ酸配列の例としては、ポリペプチドのN-末端領域内の１以上のL-アミノ酸に代えてD-アミノ酸置換を有するMANP（例えば、配列番号11に記載されるように6位にD-セリン残基を有する、または配列番号12に記載されるように4位にD-アルギニンを有するMANP）が挙げられるが、それに限定されない。

いくつかの実施形態において、MANPは、配列番号3に記載の基準配列と少なくとも90％（例えば、少なくとも90％、少なくとも92.5％、少なくとも95％、少なくとも97.5％、または100％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。配列同一性の割合は、アラインしたアミノ酸配列の中で一致した位置の数を求め、一致した位置の数をアラインしたアミノ酸の総数で除し、100を掛けることで算出される。一致した位置とは、アラインされたアミノ酸配列中の同じ位置に同一のアミノ酸が存在する位置を意味する。配列同一性の割合は、任意の核酸配列についても決定することができる。

特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列識別番号で参照される配列との間のパーセント配列同一性は、以下のようにして決定される。まず、BLASTNバージョン2.0.14およびBLASTPバージョン2.0.14を含むBLASTZのスタンドアロン版からBLAST 2 Sequences（Bl2seq）プログラムを用いて、核酸またはアミノ酸配列を、特定の配列識別番号に記載された配列と比較する。このスタンドアロン版のBLASTZは、fr.com/blastまたはncbi.nlm.nih.govからオンラインで入手することができる。Bl2seqプログラムの使用方法を説明する使用説明書は、BLASTZに付属のreadmeファイルにある。Bl2seqは、BLASTNまたはBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して、2つの配列の比較を実行する。BLASTNは核酸配列の比較に使用され、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。2つの核酸配列を比較する場合、オプションは以下のように設定する：-iには、比較する第1の核酸配列を含むファイル（例、C:＼seq1.txt）；-jには、比較する第2の核酸配列を含むファイル（例、C:＼seq2.txt）；-pには blastn；-o には任意の望ましいファイル名（例、C:＼output.txt）；-qには-1；-rには 2を設定し、その他のオプションはすべてデフォルトの設定のままとする。例えば，以下のコマンドを使用して、2つの配列間の比較を含む出力ファイルを作成することができる；C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastn -o c:＼output.txt -q -1 -r 2。2つのアミノ酸配列を比較する場合、Bl2seqのオプションは以下のように設定する：-i には比較する第1のアミノ酸配列を含むファイル（例、C:＼seq1.txt）；-j には比較する第2のアミノ酸配列を含むファイル（例、C:＼seq2.txt）；-pにはblastp；-oには任意の望ましいファイル名（例、C:＼output.txt）を設定し、その他のオプションはすべてデフォルト設定のままとする。例えば、以下のコマンドを使用して、2つのアミノ酸配列の比較を含む出力ファイルを作成することができる：C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt。比較した2つの配列に相同性がある場合、指定された出力ファイルは相同性のある領域をアラインされた配列として提示する。比較した2つの配列に相同性がない場合は、指定された出力ファイルにはアラインされた配列は表示されない。

アラインメントが完了したら、両配列において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が現れる位置の数をカウントすることにより、マッチ数を決定する。パーセント配列同一性は、マッチ数を、特定の配列（例えば、配列番号3）に記載された配列の長さ、またはある連結された長さ（例えば、特定の配列に記載された配列からの、連続する20個のヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で除し、その後、得られた値に100を乗じることによって決定される。例えば、配列番号3に記載された配列とアライメントしたときに37個のマッチがあるアミノ酸配列は、配列番号3に記載された配列に対して92.5パーセント同一である（すなわち、37÷40×100＝92.5）。パーセント配列同一性の値は少数第1位に丸められることに特に言及しておく。例えば、75.11、75.12、75.13、および75.14は切り捨てられて75.1となり、75.15、75.16、75.17、75.18、および75.19は切り上げられて75.2となる。また、長さの値は常に整数であることにも言及しておく。

単離されたMANPは、固相合成を含む任意の適当な方法で製造することが可能であり、手動技術または自動技術を使用して（例えば、Applied BioSystems（Foster City, CA）のPeptide Synthesizer、またはBiosearch Inc.（San Rafael, CA）の自動ペプチドシンセサイザーを使用して）作製することができる。システイン残基間のジスルフィド結合は、例えば米国特許第4,757,048号で教示されているように、KCNを用いて直鎖状ポリペプチドを穏やかに酸化することによって、導入することができる。また、ナトリウム利尿ポリペプチドは、組換えにより作製することができるが、市販品を購入することもできる。

本明細書に記載のMANPは、典型的には、システイン残基間のジスルフィド結合に起因して環状である（図1を参照されたい）。いくつかの実施形態において、システイン残基上のスルフヒドリル基は、別の基（例えば、-CH₂CH₂-）で置換することができる。スルフヒドリル基を-CH₂-基で置換するために、例えば、システイン残基をα-アミノ酪酸で置換することができる。このような環状アナログポリペプチドは、例えば、Lebl and Hruby ((1984) Tetrahedron Lett. 25:2067-2068)の方法に従って、あるいは米国特許第4,161,521号に開示されている手順を用いて作製することができる。

さらに、セリンもしくはスレオニンのOHをアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル基と反応させることによって、エステルブリッジが形成され、-CH₂CO₂CH₂-の構造を有するブリッジを得ることができる。同様に，リジンの側鎖をアスパラギン酸もしくはグルタミン酸と反応させることによってアミドが得られ、-CH₂C(O)NH(CH)₄-の構造を有するブリッジを得ることもできる。これらのブリッジを合成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Schiller et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 127:558、およびSchiller et al. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25:171を参照されたい）。例えば、本発明のポリペプチドのエステルを調製する一つの方法は、Merrifield合成法を使用する場合、樹脂に応じて塩基性または酸性の条件下で、望ましいアルコールの存在下で、完成したポリペプチドを樹脂から切断することである。ポリペプチドのC末端は、そこで樹脂から切り離されると、遊離酸を分離することなく、直接エステル化することができる。ポリペプチドのアミドは、カルボン酸基または前駆体をアミドに変換する技術（例えば、当技術分野で既知の技術）を用いて調製することもできる。C末端カルボキシル基においてアミドを形成するための一つの方法としては、適当なアミンを用いて固体支持体からポリペプチドを切断すること、またはアルコールの存在下で切断してエステルを得て、続いて望ましいアミンによりアミノリシスすることなどが挙げられる。他のブリッジ形成アミノ酸残基および反応は、例えば、米国特許第4,935,492号に記載されている。アミノ酸残基を連結する非ペプチド結合を含むペプチドアナログの調製も当技術分野で知られている。例えば、Spatola et al. (1986) Life Sci. 38:1243; Spatola (1983) Vega Data 1(3); Morley (1980) Trends Pharm. Sci. 463-468; Hudson et al. (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177; Spatola, in Chemistry and Biochemistry of Amino Acid Peptides and Proteins, B. Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Hann (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:307; Almquist et al. (1980) J. Med. Chem. 23:1392; Jennings-White et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533; European Patent Application EP 45665; Holladay et al. (1983) Tetrahedron Lett. 24:4401; およびHruby (1982) Life Sci. 31:189を参照されたい。

ポリペプチドのアミノ基のN-アシル誘導体は、最終的な縮合にN-アシル保護されたアミノ酸を利用するか、または保護されたペプチドもしくは保護されていないペプチドをアシル化することによって調製することができる。O-アシル誘導体は、例えば、遊離のヒドロキシペプチドもしくはペプチド樹脂をアシル化することによって調製することができる。いずれのアシル化も、ハロゲン化アシル、無水物、アシルイミダゾールなどの標準的なアシル化試薬を用いて行うことができる。必要に応じて、N-アシル化およびO-アシル化の両方を一緒に行ってもよい。

一部の場合には、MANPはペグ化、アセチル化、またはその両方を行うことができる。一部の場合には、ポリペプチドは、短い両親媒性オリゴマーなどのオリゴマーと共有結合することができ、こうしたオリゴマーは、投与を可能にするか、または結合したポリペプチドの薬物動態特性もしくは薬力学的特性を改善するものである。オリゴマーは、水溶性ポリエチレングリコール（PEG）および／または脂溶性アルキル（短鎖、中鎖、または長鎖脂肪酸ポリマー、例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、カプリン酸、またはステリン酸などであるが、これらに限定されない）を含むことができる。脂肪酸分子は、遊離のアミノ末端または任意のリジン側鎖（ε-アミノ基）に結合することができるが、この結合のためのリジン残基は、ペプチドのC末端またはN末端のどちらに配置されていてもよい。PEGもしくは他の適当なポリマーとの結合、またはアルブミンもしくは他の適当なポリペプチドとの融合は、未修飾のナトリウム利尿ポリペプチドと比較して、半減期が延長された修飾ナトリウム利尿ペプチドをもたらしうる。特定のメカニズムにとらわれることなく、血清半減期の延長は、修飾ナトリウム利尿剤ポリペプチドのタンパク質分解、免疫認識、または細胞スカベンジングの減少に起因すると考えられる。PEGとの結合（「PEG化」とも称される）または他のポリマーとの結合によってポリペプチドを修飾する方法は当技術分野で知られており、米国特許第6,884,780号；PCT公開番号WO 2004/047871；Cataliotti et al. ((2007) Trends Cardiovasc. Med. 17:10-14；Veronese and Mero (2008) BioDrugs 22:315-329；Miller et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:267-274；およびVeronese and Pasut (2005) Drug Discov. Today 10:1451-1458に記載の方法が挙げられ、これらはすべて、参照によりその全体がそのまま本明細書に組み入れられる。アルブミンとの融合によってポリペプチドを修飾する方法も当技術分野で知られており、米国特許公開第20040086976号、およびWang et al. (2004) Pharm. Res. 21:2105-2111に記載される方法があり、これらはいずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

一部の場合には、MANPを免疫グロブリン分子（例えば、IgG1分子）のFcドメインに融合させて、Fc受容体を介して、上皮細胞バリアを越える融合ポリペプチドの能動輸送が生じるようすることができる。一部の場合には、ポリペプチドは環状ポリペプチドとすることができる。環状ポリペプチドは、システイン残基を結合させることによって得られるが、システイン残基上のスルフヒドリル基を、例えば-CH₂-CH₂-などの別の基で置換することも想定される。例えば、スルフヒドリル基を-CH₂-基で置換するために、システイン残基を類似のα-アミノ酪酸で置換することができる。これらの環状アナログペプチドは、例えば、LeblおよびHrubyの方法（Tetrahedron Lett.、25:2067-2068、1984年）に従って、または米国特許第4,161,521号に開示された手順を用いて、作製することができる。

MANPのカルボキシル基の塩は、ポリペプチドを、1当量以上の望ましい塩基、例えば、金属水酸化物塩基（例えば、水酸化ナトリウム）、金属炭酸塩もしくは重炭酸塩である塩基（例えば、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム）、またはアミン塩基（例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミンなど）と接触させることによって調製することができる。ポリペプチドの酸付加塩は、ポリペプチドを1当量以上の無機酸または有機酸（例えば、塩酸）と接触させることによって調製することができる。

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化もしくはグリコシル化）の有無にかかわらず、2つ以上のサブユニットアミノ酸からなる化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合または他の結合、例えばエステル結合もしくはエーテル結合など、によって連結されていてもよい。「アミノ酸」という用語は、D／L光学異性体を含めて、天然アミノ酸、および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。

ポリペプチドに関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、そのポリペプチドが（1）天然に存在するタンパク質に付随しない、（2）同じ起源からの他のタンパク質を含まない（例えば、ヒトのタンパク質を含まない）、（3）異なる種の細胞によって発現される、または（4）天然に存在しないことを意味する。単離されたポリペプチドは、例えば、合成DNAもしくはRNAを含めた、DNAもしくはRNAによってコードされ、またはそれらの何らかの組み合わせによってコードされていてもよい。

ポリペプチドに関して本明細書で使用される「実質的に純粋」という用語は、そのポリペプチドが、本来関連している他のポリペプチド、脂質、炭水化物、および核酸を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、その自然環境から取り出されて、少なくとも60％の純度を有する任意のポリペプチドとすることができる。実質的に純粋なポリペプチドは、少なくとも約65、70、75、80、85、90、95、もしくは99パーセントの純度、または約65～75、75～80、80～85、85～90、90～95、もしくは95～99パーセントの純度とすることができる。典型的には、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドを生じる。いくつかの実施形態において、実質的に純粋なポリペプチドは、化学合成されたポリペプチドとすることができる。

任意の方法を用いて、実質的に純粋なポリペプチドを得ることができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーおよびHPLCなどの一般的なポリペプチド精製技術、ならびにポリペプチド合成技術を用いることができる。さらに、実質的に純粋なポリペプチドを得るための起源として、任意の材料を使用することができる。例えば、野生型およびトランスジェニック動物の組織を、起源となる材料として用いることができる。それに加えて、特定のポリペプチドを過剰発現するように操作された組織培養細胞を使用して、実質的に純粋なポリペプチドを得ることができる。さらに、ポリペプチドがアフィニティーマトリックス上に捕捉されるのを可能にするアミノ酸配列が含まれるように、ポリペプチドを操作することができる。例えば、ポリペプチドの精製を助けるために、c-myc、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、またはFlag（商標名）タグ（Kodak）などのタグを使用することができる。このようなタグは、カルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかの位置、またはその間の位置を含めて、ポリペプチド内のどの位置にでも挿入することができる。他に使用できる融合物には、アルカリホスファターゼなど、ポリペプチドの検出を助ける酵素などがある。

MANP（例えば、配列番号3に関して保存的および／または非保存的置換を有するバリアントMANP）、ならびに配列番号3またはバリアントMANPの断片（例えば、配列番号3～14のいずれかの断片）は、数多くのアッセイのいずれかを用いて、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。例えば、MANPの活性は、培養細胞（例えば、培養心臓線維芽細胞、大動脈内皮細胞、または糸球体細胞）におけるcGMP産生に及ぼすMANPの影響を調べることにより、in vitroで評価することができる。細胞をMANP（例えば、10^-10～10^-4 MのMANP）に暴露し、サンプルをアッセイして、cGMP生成に及ぼすポリペプチドの影響を評価することができる。cGMP生成は、例えば、競合RIA cGMPキット（Perkin-Elmer, Boston, MA）を用いて検出および測定することができる。

MANPの活性は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、またはウシ）に投与した後、血漿cGMP濃度、尿中cGMP排泄、正味の腎cGMP生成量、糸球体濾過率、血圧、心拍数、血行動態機能（例えば、心拍出量、肺動脈楔入圧、全身血管抵抗など）、および腎機能（例えば、腎血流量、尿量、およびナトリウム排泄率など）といったファクターに及ぼす影響を調べることにより、in vivoで評価することができる。一部の場合には、このようなパラメータは、哺乳動物において高血圧を誘発した後に評価することができる。

本明細書で使用される「核酸」という用語は、cDNA、ゲノムDNA、および合成（例えば、化学合成）DNAを含めて、RNAおよびDNAの両者を包含する。核酸は、二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよい。さらに、核酸は、環状であっても直鎖状であってもよい。

核酸に関連して本明細書で使用される「単離された」という用語は、天然に存在する核酸が、それが由来する元の生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接している両側の配列（5'末端の1つ、および3'末端の1つ）と、直接隣接していない、前記核酸を意味する。例えば、単離された核酸は、特に制限されず、任意の長さの組換えDNAとすることができるが、天然に存在するゲノムにおいてその組換えDNA分子のすぐ脇に通常存在する核酸配列の1つが除去されているか、または存在しないことを条件とする。したがって、単離された核酸には、他の配列から独立した別の分子として存在する組換えDNA（例えば、PCRもしくは制限酵素処理によって作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片）、ならびに、ベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、単離された核酸には、ハイブリッド核酸配列または融合核酸配列の一部をなしている組換えDNA分子を含めることができる。

核酸に関連して本明細書で使用される「単離された」という用語には、任意の天然に存在しない核酸も含まれるが、これは、天然に存在しない核酸配列が自然界に見いだされず、天然に存在するゲノムの中で直接隣接する配列を持たないためである。例えば、人工核酸のような天然に存在しない核酸は、単離された核酸とみなされる。人工核酸は、一般的な分子クローニングまたは化学的な核酸合成技術を用いて作製することができる。単離された天然に存在しない核酸は、他の配列から独立しているか、またはベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれている可能性がある。さらに、天然に存在しない核酸には、ハイブリッド核酸配列または融合核酸配列の一部をなしている核酸分子を含めることができる。

当業者には明白であろうが、例えば、cDNAもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムDNA制限酵素消化物を含有するゲルスライスの中の、数百から数百万個の他の核酸分子の中に存在する核酸は、単離された核酸とみなされない。

一部の場合には、単離された核酸分子は、少なくとも約12塩基の長さ（例えば 少なくとも約13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、120、130、140、150、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基の長さ）であり、ハイブリダイゼーション条件下で、MANP（例えば、配列番号3に記載の配列を有するMANP、またはそのバリアント）をコードする配列を有する核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション条件は、中程度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とすることができる。

本明細書の目的において、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、25mM KPO₄（pH 7.4）、5X SSC、5X デンハルト溶液、50μg/mL変性・超音波処理済みサケ精子DNA、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、1-15 ng/mLプローブ（約5x10⁷ cpm/μg）を含有するハイブリダイゼーション溶液中で約42℃にてハイブリダイゼーションを行い、2X SSCおよび0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する洗浄溶液を用いて約50℃で洗浄を行うことを指す。

高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、25mM KPO₄（pH 7.4）、5X SSC、5X デンハルト溶液、50μg/mL変性・超音波処理済みサケ精子DNA、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、1-15 ng/mLプローブ（約5x10⁷ cpm/μg）を含有するハイブリダイゼーション溶液で約42℃にてハイブリダイゼーションを行い、0.2X SSCおよび0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する洗浄溶液を用いて約65℃で洗浄を行うことを指す。

MANPをコードする単離された核酸分子は、標準的な技術を用いて製造することが可能であり、こうした技術には、一般的な分子クローニングおよび化学的な核酸合成技術などがあるがこれらに限定されない。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて、本明細書に記載のナトリウム利尿ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、単離された核酸を得ることができる。PCRとは、標的核酸を酵素的に増幅する手順または技術を指す。典型的には、目的とする領域の末端からの配列情報またはそれより先の配列情報を用いて、テンプレートの逆ストランドに対して順に同一であるオリゴヌクレオチドプライマーをデザインする。PCRは、全ゲノムDNAもしくは全細胞RNAからの配列を含めて、DNAおよびRNAからの特定の配列を増幅するために使用することができる。プライマーの長さは通常14～40ヌクレオチドであるが、10ヌクレオチドから数百ヌクレオチドに及ぶこともある。一般的なPCR技術は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, DieffenbachおよびDveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。テンプレートの起源としてRNAを使用する場合、逆転写酵素を使用して相補的DNA（cDNA）鎖を合成することができる。また、リガーゼ連鎖反応、SDA法（strand displacement amplification）、自家持続配列複製法、またはNASBA法（nucleic acid sequence-based amplification、核酸配列ベース増幅）を用いて、単離された核酸を得ることもできる。例えば、Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1；Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878：およびWeiss (1991) Science 254:1292を参照されたい。

MANPをコードする単離された核酸はまた、単一の核酸分子として（例えば、ホスホロアミダイト技術を使用する3'から5'方向の自動DNA合成を用いて）、または一連のオリゴヌクレオチドとして、化学的に合成することができる。例えば、求める配列を含む１以上のペアの長いオリゴヌクレオチド（例えば、100ヌクレオチド超）を合成することができ、各ペアは、オリゴヌクレオチドペアをアニーリングしたときに二本鎖が形成されるような相補性を有する短いセグメント（例えば、約15ヌクレオチド）を含んでいる。DNAポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドを伸長させると、オリゴヌクレオチド対ごとに1本の二本鎖核酸分子が得られ、これをベクターにライゲーションすることができる。

さらに、MANPをコードする単離された核酸は、変異誘発によって得ることができる。例えば、PCRによるオリゴヌクレオチド指定変異誘発および部位特異的変異誘発などの標準的な技術を用いて、基準配列を変異させることができる。Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Ausubelら編、1992を参照されたい。ナトリウム利尿ポリペプチドバリアントの非限定的な例が本明細書で提供される。

また、本明細書に記載されているような核酸を含むベクターも提供される。「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり、その中に別のDNAセグメントが挿入されて、挿入されたセグメントの複製を引き起こすようにすることができる。「発現ベクター」とは、１以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」とは、別のDNA配列の転写および／または翻訳を制御および調節するDNA配列である。

発現ベクターにおいて、核酸（例えば、ナトリウム利尿ポリペプチドをコードする核酸）は、１以上の発現制御配列に機能しうるように連結することができる。本明細書で使用される「機能しうるように連結された」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が挙げられる。プロモーターとは、典型的には転写開始点（一般にRNAポリメラーゼIIの開始部位付近）の上流100～500ヌクレオチド以内にある、DNA分子の領域からなる発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始点をプロモーターの下流1～50塩基の間に配置する必要がある。エンハンサーは、時間、場所、レベルに関して発現特異性をもたらす。プロモーターとは異なり、エンハンサーは転写部位からさまざまな距離にあっても機能することができる。また、エンハンサーは転写開始部位の下流に位置することもある。RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次にそれを、そのコード配列がコードするタンパク質に翻訳することができるならば、そのコード配列は「機能的に連結」されており、細胞内で発現制御配列の「制御下」にある。したがって、発現ベクターは、抗体ならびに他の多価分子の製造に有用となりうる。

適当な発現ベクターには、プラスミド、ならびに、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来するウイルスベクターがあるが、これらに限定されない。多数のベクターおよび発現系が、Novagen社（Madison, WI）、Clontech社（Palo Alto, CA）、Stratagene社（La Jolla, CA）、およびInvitrogen/Life Technologies社（Carlsbad, CA）などから販売されている。

発現ベクターは、発現された核酸配列のその後の操作（例えば、精製もしくは局在化）を容易にするようにデザインされた、タグ配列を含めることができる。緑色蛍光タンパク質（GFP）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、ポリヒスチジン、c-myc、ヘマグルチニン、またはFlag（商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）配列などのタグ配列は、通常、コードされたポリペプチドとの融合物として発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端など、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。

ベクターを含有する宿主細胞も提供される。「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクター（例えば、MANPをコードするベクター）を導入することができる、原核細胞および真核細胞を含むものとする。本明細書で使用される「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、数多くの技術のうちの1つによる核酸分子（例えば、ベクター）の細胞への導入を包含する。特定の技術に限らないが、これらの技術の多くは当技術分野で確立されている。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするための適当な方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)に見出すことができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルスを介した核酸導入などを用いて、細胞内に核酸を導入することができる。さらに、ネイキッドDNAは、他に記載されているように、in vivoで細胞に直接送達することができる（米国特許第5,580,859号および第5,589,466号）。宿主細胞は、コードされたポリペプチドを発現することができるが、本明細書に記載の単離された核酸分子を含む細胞は、ポリペプチドを発現する必要はないことが注目される。宿主細胞に形質転換された、単離された核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピソームの状態で維持されうる。したがって、宿主細胞は、本明細書に記載の単離された核酸分子を含む構築物により、安定的または一過性にトランスフェクトすることができる。

in vivoまたはin vitroで細胞に単離された核酸分子を導入するために、任意の適当な方法を使用することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルスを介した核酸導入は、単離された核酸分子を細胞に導入するために使用することができる方法である。また、ネイキッドDNAは、他に記載されているように、in vivoで細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第5,580,859号および第5,589,466号、ならびにそれらの継続）。さらに、単離された核酸分子は、トランスジェニック動物を作製することによって細胞に導入することができる。

MANPをコードする単離された核酸分子を含む細胞を同定するために、任意の適当な方法を使用することができる。そのような方法には、PCR、ならびにノーザン分析およびサザン分析のような核酸ハイブリダイゼーション技術が含まれる。一部の場合には、免疫組織化学および生化学技術を用いて、細胞が特定の単離された核酸分子を含むかどうかを、その核酸分子がコードするポリペプチドの発現を検出することによって判定することができる。

本明細書に記載の単離されたMANP、MANPをコードする核酸、および利尿剤は、高血圧（例えば、RH）などの疾患を有すると確認された哺乳動物を治療するために使用することができる。したがって、１以上の利尿剤および１以上のMANP、または１以上のMANPをコードする核酸を、哺乳動物（例えば、高血圧、RH、および／または心腎臓疾患を有するか、またはそのリスクがある哺乳動物）に投与するための組成物に、組み入れることができる。任意の適当な方法を使用して、組成物を調剤し、その後投与することができる。投与量は典型的には、投与される薬剤に対する哺乳動物の反応性に依存し、治療過程は数日から数ヶ月もしくはそれ以上、または適切な反応が得られるまで継続する。当業者は、最適な投与量、投与方法、および反復回数を慣用的な手順で決定する。最適な投与量は、それぞれの薬剤（例えば、MANPおよびFs）の相対的な効力に応じて変化しうるが、一般的には、in vitroおよび/またはin vivoの動物モデルにおいて有効であると判明するEC₅₀に基づいて推定することができる。本明細書に記載の１以上のMANP、および１以上の利尿剤を含有する組成物は、一日1回もしくは複数回、週1回もしくは複数回、月1回もしくは複数回、またはさらに少ない頻度で投与することができるが、一定期間（例えば、数時間、数日、または数週間）の間、連続して投与されてもよい。例えば、MANP、またはMANPを含有する組成物は、少なくとも約0.01ng MANP/kg体重から約100mg MANP/kg体重の用量で患者に投与することができる。一部の場合には、MANP、またはMANPを含有する組成物は、1日から30日まで、またはそれより長い期間、点滴として投与することができる（例えば、約1pmol MANP/kg/分から約500nmol MANP/kg/分の用量で）。

１以上のMANP、または１以上のMANPをコードする核酸、および１以上の利尿剤は、取り込み、分布、および/または吸収を助けるために、相互に、および/または、他の分子、分子構造、または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体もしくは細胞標的分子、または経口製剤、局所製剤もしくは他の製剤などとともに、混和し、カプセル化し、コンジュゲートし、またはその他の方法で結び付けることができる。

いくつかの実施形態において、組成物は、MANP（またはMANPをコードする核酸）、利尿剤、またはその両者を、製薬上許容されるキャリアと組み合わせて含有することができる。製薬上許容されるキャリアには、例えば、製薬上許容される溶媒、懸濁化剤、または他の任意の薬理学上不活性なビヒクルがあり、これはポリペプチドおよび／または他の化合物を対象に送達するためのものである。製薬上許容されるキャリアは、液体または固体とすることができ、１以上の治療用化合物および所定の医薬組成物の他の任意の成分と組み合わせたときに、望ましい体積、粘稠度、および他の適切な輸送特性および化学的特性を提供するように、計画された投与方法を考慮して選択することができる。有用な製薬上許容されるキャリアとしては、水、生理食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、乳糖もしくはグルコースおよび他の糖類、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプン、またはデンプングリコール酸ナトリウム）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などが挙げられるが、これらに限定されない。

MANPもしくは核酸、および利尿剤は、同一組成物の中に存在することができるが、同時にまたは異なる時点で投与され、同一経路または別々の経路で投与される、別々の組成物中に存在していてもよい。本明細書に記載のMANPおよび利尿剤を含有する医薬組成物は、局所治療が望ましいのか全身的な治療が望ましいのかに応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、例えば、経口もしくは非経口（例えば、皮下、くも膜下、脳室内（intraventricular）、筋肉内、もしくは腹腔内注射、または静脈内（i.v.）点滴による）で行うことができる。投与は迅速に（例えば、注射により）行ってもよく、また、一定期間にわたって（例えば、ゆっくりとした点滴または徐放性製剤の投与により）行ってもよい。

非経口投与、くも膜下投与、または脳室内投与のための組成物および製剤には、滅菌水溶液（例えば、滅菌生理食塩水）が含まれるが、これは、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加物（例えば、浸透促進剤、キャリア化合物、および他の製薬上許容されるキャリア）も含有することができる。経口投与用の組成物および製剤には、例えば、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性溶媒中の懸濁化剤もしくは液剤、カプセル剤、サシェ、または錠剤などがある。このような組成物は、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤を組み入れることもできる。

医薬組成物には、溶液、エマルション、水性懸濁液、リポソーム含有製剤などがあるが、これらに限定されない。これらの組成物は、例えば、あらかじめ作製された液体、自己乳化性固体、および自己乳化性半固体などの様々な成分から作製することができる。乳剤は、製剤化が容易で、可溶化、吸収およびバイオアベイラビリティについて効果があるため、治療用組成物の経口投与に特に有用である。リポソームは、薬物送達の観点から、その特異性、およびリポソームが提供する作用の持続期間に起因して、特に有用となりうる。

組成物は、対象に投与すると、当該化合物（例えば、MANPまたは利尿剤）のために、生物学的に活性のある代謝物もしくはその残基を（直接的または間接的に）提供することができる、任意の製薬上許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または任意の他の化合物を含有することができる。したがって、例えば、本明細書は、MANPおよび利尿剤の製薬上許容される塩、プロドラッグおよびそのようなプロドラッグの製薬上許容される塩、ならびに他の生物学的均等物を提供する。プロドラッグとは、不活性型として調製され、内因性酵素または他の化学物質および／もしくは条件の作用により、体内またはその細胞内で、活性型（すなわち、薬物）に変換される治療薬である。「製薬上許容される塩」という用語は、本明細書に記載の方法に有用なMANPおよび利尿剤の生理学的および薬学的に許容される塩（すなわち、望ましくない毒性作用を付与することなく、親化合物の望ましい生物学的活性を保持する塩）を意味する。製薬上許容される塩の例としては、陽イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはスペルミンなどのポリアミン）と形成される塩；無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、または硝酸）と形成される酸付加塩；有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、シュウ酸、パルミチン酸、またはフマル酸）と形成される塩；および、元素の陰イオン（例えば、臭素、ヨウ素、または塩素）と形成される塩などがあるが、これらに限定されない。

組成物は、従来から医薬組成物に含まれている他の補助成分を追加して含有することができる。したがって、組成物はまた、相互に影響しない薬学的に活性のある物質、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬もしくは抗炎症剤、または組成物のさまざまな剤形を物理的に調剤するのに有用な追加の材料、例えば、色素、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、不透明化剤、増粘剤、および安定化剤などを含有することができる。さらに、組成物は、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、香料、浸透促進剤、および芳香物質などの、補助剤と混合することもできる。しかしながら、添加する場合、これらの物質は、組成物中の他の成分の生物学的活性に不当に干渉すべきではない。

一部の場合には、MANPは、徐放性製剤として製剤することができる。例えば、MANPもしくは利尿剤を、徐放性製剤に製剤することができる。一部の事例において、本明細書に記載された１以上のMANPを含有するように、コーティング、エンベロープ、または保護材料を調合することができる。このようなコーティング、エンベロープ、および保護材料は、ステント、カテーテル、および腹膜透析チューブなどの留置装置をコーティングするために使用することができる。一部の場合には、ポリペプチドは、ポリマー物質、リポソーム、マイクロエマルジョン、マイクロ粒子、ナノ粒子、またはワックスに組み入れることができる。

本明細書に記載されている医薬製剤は、便利な単位剤形としてもよく、製薬業界で知られている従来の技術を含む任意の適当な方法に従って調製することができる。そうした技術には、有効成分を望ましい医薬用キャリアと結びつけるステップが含まれる。典型的には、有効成分を液体キャリアもしくは微粉化した固体キャリア、またはその両者と、均一かつ密接に連結させ、その後、必要に応じて製品を成形することによって、製剤を調製することができる。滅菌方法が製剤に含まれる１以上の分子の有効性を妨げないことを条件として、必要に応じて製剤を滅菌することができる。

いくつかの実施形態において、MANPおよび／またはFsなどの利尿剤は、注射、デポ－ポリマー（depot polymer）、薬剤パッチ、ポンプ、またはマイクロ粒子／ナノ粒子による皮下投与用に製剤することができる。非限定的な例として、PCT公開番号WO2008／061355は、ハイドロゲルチューブでの送達用にポリペプチドを製剤するための材料および方法を開示している。ポリペプチドは、本明細書に記載された方法に使用するのに適した量の、製薬上許容され、ポリペプチドと相互に影響しない、１以上の添加剤と混合することができる。例えば、ポリペプチドは、微晶質セルロース、コロイド状二酸化ケイ素、乳糖、デンプン、ソルビトール、シクロデキストリン、およびこれらの組み合わせなどの、１以上の添加剤と組み合わせることができるが、これらに限定されない。添加剤は、ポリペプチドのためのビヒクル、キャリア、または溶媒として機能する、固体、半固体、または液体の材料とすることができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドをハイドロゲルチューブに挿入する前に、１以上の添加剤を用いて圧縮、成形し、または押し出すことができる。このような製剤は、望ましい放出特性、改善された安定性、および／または他の望ましい特性を有する医薬組成物をもたらすことができる。

医薬組成物は、流動促進剤、溶解剤、界面活性剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、および／または滑沢剤などの、補助剤または添加剤を含んでいてもよい。例えば、溶解剤は、投与製剤からのポリペプチドの溶解速度を増加させることができるものであって、例えば、有機酸および／または有機酸の塩（例えば、クエン酸とクエン酸ナトリウム）を含むことができる。このような製剤に有用な添加剤の他の例としては、合成、半合成、修飾型および天然のポリマー（例えば、乳糖、グルコース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、PEG、シクロデキストリン、アルコキシ修飾シクロデキストリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、微晶質セルロース、アルブミン、デキストラン、マルチトール、キシリトール、カオリン、およびメチルセルロースなど）が挙げられる。また、ポリペプチドは、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または鉱油、ステアリン酸カルシウム、水素添加植物油、安息香酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシンカーボワックス、ラウリル硫酸マグネシウム、またはモノステアリン酸グリセリル）、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、または保存剤（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル）と混合することもできる。

医薬組成物に添加することができる他の薬剤は、MANPまたは利尿剤の、溶解および治療上有効な血漿中濃度プロファイルの確立に関わる、微小環境のpHを変化させることができる。このような薬剤には、無機酸および水酸化マグネシウムの塩がある。他に使用することができる薬剤には、界面活性剤およびその他の可溶化物質がある。

有用な希釈剤としては、例えば、微晶質セルロース、乳糖、スクロース、フルクトース、グルコース、もしくは他の糖類、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、セルロース、エチルセルロース、セルロース誘導体、カオリン、マンニトール、ラクチトール、マルチトール、キシリトール、ソルビトール、もしくは他の糖アルコール、乾燥デンプン、サッカリド、デキストリン、マルトデキストリンもしくは他の多糖類、イノシトール、またはそれらの組み合わせなどがある。一部の場合には、水溶性の希釈剤が特に有用でありうる。

流動促進剤は、加工時に組成物成分の流動および圧縮性を改善するために使用することができる。有用な流動促進剤としては、例えば、コロイド状二酸化ケイ素（コロイド状シリカ、ヒュームド・シリカ、軽質無水ケイ酸、無水ケイ酸、およびヒュームド・二酸化ケイ素とも呼ばれる）が挙げられる。

本明細書に記載の医薬組成物に使用するのに適した界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ポリエチレン、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、安息香酸ベンジル、セトリミド、セチルアルコール、ドキュセートナトリウム、モノオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、パルミトステアリン酸グリセリン、レシチン、中鎖トリグリセリド、モノエタノールアミン、オレイン酸、ポロキサマー、ポリビニルアルコール、およびソルビタン脂肪酸エステルなどがあるが、これらに限定されない。

適当な崩壊剤としては、例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、クロスカルメロース、微晶質セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ペクチン、メタクリル酸カリウム-ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、チルアミド（thylamide）、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、デンプン誘導体、デキストリン、βシクロデキストリン、デキストリン誘導体、酸化マグネシウム、クレー、ベントナイト、およびこれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの実施形態において、MANPおよび／または利尿剤をハイドロゲルデリバリーシステムに組み込むことができる。例えば、MANPは、ポリペプチドを長時間にわたって連続して持続的に放出することができるキセロゲル-ハイドロゲル系を介して患者に皮下投与するために製剤することができる。例えば、米国特許第5,226,325号、およびPCT公開番号WO 2004/071736を参照されたい。

ハイドロゲルチューブの調製に有用な、重合可能な液体材料には、さまざまな重合可能な親水性化合物、およびエチレン性不飽和化合物が含まれる。例えば、PCT公開番号WO2008/061355に記載されている化合物を参照されたい。このような親水性モノマーの混合物は、典型的に重合反応に使用される。モノマーの種類および割合は、水和時に、想定される用途または使用のために望ましい特性（例えば、平衡含水率（EWC）値および／または孔径）を有するポリマー（例えば、架橋された均一なポリマー）が得られるように選択される。

一部の場合には、親水性モノマー混合物の重合により、程度に差はあれ水性媒体に溶解する、均一な親水性コポリマーを得ることができる。このような場合、共重合可能なポリエチレン性不飽和架橋剤を少量（例えば、約3％まで）モノマー混合物に含有させて、水不溶性であり水膨潤性でもある均一な架橋コポリマーを得ることができる。メタクリル酸ヒドロキシエチル（HEMA）のわずかに架橋されたホモポリマーは、約38％のEWC値を有する。HEMAとアクリルアミドとの架橋コポリマーは38w/v％を上回るEWC値を示すのに対し、HEMAとN-（2-ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（HPMA）との架橋コポリマーは38％未満のEWC値を有する。したがって、ポリペプチドの有用な、もしくは有効な、溶出速度に応じて、コポリマーハイドロゲルをカスタマイズして、ポリペプチドを求める速度で溶出させることができる。典型的には、コポリマーは、約15～約70重量％のHEMA単位、および約85～30重量％の第2のエチレン性モノマーを含有し、これにより、約20～約75％の範囲のEWC値を有する。いくつかの実施形態において、コポリマーの混合物は、少量のポリエチレン製不飽和架橋剤［例えば、エチレングリコールジメタクリレート（EDMA）またはトリメチロールプロパントリメタクリレート（TMPTMA）］をさらに含有することができる。

いくつかの実施形態において、対象でのMANPの徐放性送達のための医薬組成物は、（a）ポリペプチド（このポリペプチドは少なくとも1つの塩基性官能基を有する）およびヘキサヒドロキシシクロヘキサンから誘導されるポリアニオン（このポリアニオンは負電荷を持つ少なくとも2つの官能基を有する）の複合体；ならびに（b）生分解性の水不溶性ポリマーを含む製薬上許容されるキャリアを含むことができる。このような組成物は、例えば、PCT公開番号WO2006／017852に記載されており、例えば、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、点滴剤、エアロゾル、クリーム、半固体、ペースト、カプセル、錠剤、固体インプラント、または微粒子の形で調製することができる。本明細書で使用される「徐放性送達」という用語は、投与後の一定期間（例えば、数日から数週間または数ヶ月）にわたって、in vivoで薬剤を継続的に送達することを意味する。MANPの持続的な徐放性送達は、例えば、ポリペプチドの治療効果が長期間にわたって継続すること（例えば、症状が長期間にわたって継続的に軽減すること）によって実証することができる。また、ポリペプチドの持続的な送達は、in vivoでのポリペプチドの存在を経時的に検出することによっても実証することができる。本発明の組成物は、初期に突発的送達が低く抑えられた状態で提供された後、長期間（例えば、数日から数ヶ月）にわたってin vivoでポリペプチドを安定して徐放することができる。

このような実施形態において、ポリペプチドおよびポリアニオンを適切に組み合わせることで、物理的および化学的に安定した複合体が形成されうる。この複合体は、ポリペプチドおよびポリアニオンの水性製剤を組み合わせて生成される沈殿物の形をとることができる。必要に応じて、１以上の製薬上許容される添加剤を複合体に組み入れることができる。このような添加剤は、ポリペプチドおよび／または複合体の安定化剤として機能しうる。適当な添加剤の非限定的な例としては、重硫酸ナトリウム、p-アミノ安息香酸、チオ尿素、グリシン、メチオニン、マンニトール、スクロース、およびPEGが挙げられる。

ポリペプチドおよびポリアニオン間の安定した複合体は、生分解性の水不溶性ポリマーを含む製薬上許容されるキャリアに、必要に応じて１以上の添加剤とともに組み入れることができる。「生分解性水不溶性ポリマー」という用語は、in vivoで使用可能な生体適合性および／または生分解性の合成ポリマーおよび天然ポリマーを意味する。また、この用語は、37℃の水または体液に不溶性であるか、または不溶性となるポリマーも含むものとする。ポリマーは、当技術分野で知られている技術を用いて（例えば、モノマーおよびオリゴマーを除去するために）精製することができる。例えば、米国特許第4,728,721号を参照されたい。有用なポリマーの例としては、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリヒドロキシ酪酸、ポリシュウ酸アルキレン、ポリ無水物、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリアセタール、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリコハク酸アルキレン、およびポリオルトエステル、ならびにそのコポリマー、ブロックコポリマー、分岐コポリマー、ターポリマー、およびそれらの組み合わせがあるが、これに限定されない。

生分解性水不溶性ポリマーには、エンドキャップされたポリマー、エンドキャップされないポリマー、またはエンドキャップされたポリマーおよびエンドキャップされないポリマーの混合物も含めることができる。キャップされないポリマーは、遊離のカルボキシル末端基を有するのに対し、エンドキャップされたポリマーは、一般に、キャップされたカルボキシル末端基を有すると定義される。

ポリマーについて適切な分子量を決定する際に考慮すべき要素としては、望ましいポリマーの分解速度、機械的強度、およびポリマーの溶媒への溶解速度などが挙げられる。ポリマーの有用な分子量は、例えば、約2,000ダルトンから約150,000ダルトンであり、使用するポリマーの選択に応じて、1.1から2.8の多分散性を有することができる。

製薬上許容されるキャリアは、環境応答特性（例えば、温度感受性、pH感受性、電気感温性）を有するキャリアであって、注射可能な溶液または懸濁液、粒子、フィルム、ペレット、シリンダー、ディスク、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノスフェア、微粒子、オブラート、ミセル、リポソーム、または薬物送達に有用な他の任意のポリマー構造の形をとるキャリアとすることができる。

さまざまな製薬上許容されるポリマーキャリアを形成する方法には、当技術分野で知られている方法がある。例えば、米国特許第6,410,044号、第5,698,213号、第6,312,679号、第5,410,016号、第5,529,914号、第5,501,863号、第4,938,763号、第5,278,201号、および第5,278,202号、ならびにPCT公開番号WO 93/16687を参照されたい。

ポリペプチド／ポリアニオン複合体をポリマーマトリックス中に分散させて固体インプラントを形成すると、対象に注入または移植することができる組成物を作製することができる。このようなインプラントは、例えば、押出成形、圧縮成形、および射出成形などの従来のポリマー溶融加工技術を用いて調製することができる。こうしたインプラントの調製は、無菌状態で行うことができ、あるいは、（例えば、ガンマ線照射または電子ビーム滅菌を用いた）照射による最終滅菌によって行うこともできる。

いくつかの実施形態において、異なる生物学的環境への送達に適した、または特定の機能を発揮するのに適した特性を有する、さまざまな生体適合性および／または生分解性ポリマーを用いて、ポリペプチド／ポリアニオン複合体をポリマーキャリアに封入することによって、マイクロスフェアの形をとる組成物を作製することができる。ポリペプチドの溶解速度、すなわち送達速度は、カプセル化技術、ポリマー組成、ポリマーの架橋、ポリマーの厚み、ポリマーの溶解度、ならびにポリペプチド／ポリアニオン複合体のサイズおよび溶解度などの要因によって決定される。

このようなマイクロスフェアを調製するために、カプセル化されるべきポリペプチド／ポリアニオン複合体を、有機溶媒中のポリマー溶液に懸濁して、ポリマー溶液によってポリペプチド／ポリアニオン複合体が完全にコーティングされるようにすることができる。この懸濁液を、次に噴霧乾燥、噴霧凝固、エマルション、または溶媒蒸発エマルションなどのマイクロカプセル化技術に供することができる。例えば、懸濁した複合体または微粒子を有機溶媒中のポリマーとともに、乳化剤を含有する、より大容量の水溶液に移し、有機溶媒がポリマーから蒸発または拡散して、固化したポリマーによりポリペプチド／ポリアニオン複合体が封入されるようにすることができる。

カプセル化ポリペプチド／ポリアニオン複合体を調製するのに有用な乳化剤としては、例えば、ポロキサマーおよびポリビニルアルコールなどがある。このような方法に有用な有機溶媒としては、ポリマーの特性によるが、酢酸、アセトン、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、および他の毒性のない溶媒が挙げられる。典型的には、ポリマーを可溶化し、最終的に無毒である溶媒が選ばれる。

いくつかの実施形態において、MANPはデポ剤に製剤することができ、これは、定常的に高い曝露レベルを提供することが可能であって、しかも高い曝露レベルに速やかに到達することができる（ラグフェーズがないか短い）。例えば、米国公開第2010／0266704号を参照されたい。デポ剤は、MANPまたはその製薬上許容される塩（例えば、無機酸、ポリマー酸、または有機酸との酸付加塩）を含有することができる。酸付加塩は、付加される酸当量が1当量であるか2当量であるかに応じて、1価または2価の塩として存在しうる。

米国公開第2010／0266704号に記載されているように、デポ剤は、ラクチド：グリコリドコモノマー（L：G）のモル比が85：15から65：35である2つの異なる直鎖状の乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）ポリマーを含有することができるが、このポリマーの少なくとも1つは低い固有粘度を有する。このような製剤は、長期間にわたって持続するポリペプチドの高い血漿レベルを提供することができる。適当なポリマーの例としては、Boehringer Ingelheim Pharma GmBH & Co.KG（Ingelheim, Germany）、Absorbable Polymers International（Pelham, AL）、およびAlkermes, Inc.（Cambridge, MA）から、それぞれRESOMER（登録商標）、LACTEL（登録商標）、およびMEDISORB（登録商標）の商品名で販売されている、直鎖状のポリ（D，L-ラクチド）およびポリ（D，L-ラクチド-コ-グリコリド）が挙げられる。

皮下投与用の高曝露デポ剤は、短時間（例えば、皮下注射後1日、2日、3日、4日、5日、6日、もしくは7日）のうちに治療効果のある血漿中濃度が得られるような、即効性、または少なくともきわめて迅速な作用を示し、約1ヶ月以上にわたって恒常的に高い曝露レベルを示すことができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデポ剤は、2つの異なるPLGAポリマーを含有することができるが、これらのポリマーは、％重量比として95：5～50：50（例えば、85：15～50：50、80：20～60：40、90：10、85：15、80：20、75：25、70：30、65：35、60：40、55：45、または50：50）の割合で混合またはブレンドされたものである。いくつかの実施形態において、より高い固有粘度を有するポリマーは、より低い固有粘度を有するポリマーよりも高い重量％を有しうる。いくつかの実施形態において、より高い固有粘度を有するポリマーは、エステル末端基を有しうる。デポ剤は、好ましいPK特性が維持されるのであれば、他の直鎖状もしくは星型PLGAポリマー、またはポリ（D，L-ラクチド-コ-グリコリド）（PLG）もしくはポリ乳酸（PLA）ポリマーなどの、追加のポリマーを含有することができる。

デポ剤のポリペプチド含有量（ローディング）は、1％～30％（例えば、10％～25％、より好ましくは15％～20％）の範囲内とすることができる。ローディングは、PLGA製剤の総質量に対するポリペプチドの重量比として定義される。

デポ組成物は、無菌的に製造してもよく、非無菌的に製造して、（例えば、ガンマ線照射を用いて）最終滅菌してもよい。最終滅菌により、可能な限り最高の無菌性が保証された製品を得ることができる。

デポ組成物は、ポリペプチドの放出挙動を調節することができる１以上の医薬品添加剤も含有することができる。そのような添加剤は、組成物中に約0.1％から約50％の量で存在しうる。適当な添加剤には、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリン、PEG、界面活性剤、例えばポロキサマー（ポリ（オキシエチレン-ブロック-オキシプロピレン）としても知られている）、ポリ（オキシエチレン）ソルビタン脂肪酸エステル（商品名TWEEN（登録商標）として販売されている）、ソルビタン脂肪酸エステルなど、レシチン、無機塩類、例えば炭酸亜鉛、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムなど、プロタミン、およびポリリジンなどのアミン残基を有する天然または合成ポリマーなどがあるが、これらに限定されない。

デポ組成物は、組成、分子量、および/またはポリマー構造において異なるポリマーの混合物またはブレンドを含有することができる。ポリマーブレンドとは、本明細書において、1つのインプラントまたは微粒子中の、2つの異なる直鎖状ポリマーの固溶体または懸濁液として定義される。デポ剤の混合物とは、本明細書において、各デポ剤の中に１以上のPLGAを含有する、異なる組成の2つのデポ様インプラントまたは微粒子または半固形製剤の混合物として定義される。2つのPLGAがポリマーブレンドとして存在するデポ医薬組成物は、特に有用となる可能性がある。

デポ医薬組成物は、インプラント、半固体（ゲル）、溶液、微粒子、または注入されるとその場で固化する懸濁液の形をとることができる。次項は、ポリマー微粒子に焦点を合わせているが、その説明はインプラント、半固体、および液体にも適用可能である。

微粒子は、数サブミクロンから数ミリメートルの直径を有することができる（例えば、約0.01ミクロンから約2ミリメートル、約0.1ミクロンから約500ミクロン、約10から約200ミクロン、約10から約130ミクロン、または約10から約90ミクロン）。

いくつかの実施形態において、微粒子を凝集防止剤と混合するか、または凝集防止剤でコーティングすることができる。適当な凝集防止剤としては、例えば、マンニトール、グルコース、デキストロース、スクロース、塩化ナトリウム、ならびにポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびPEGなどの水溶性ポリマーが挙げられる。

微粒子は、コアセルベーションすなわち相分離、噴霧乾燥、または油中水（Water-in-Oil（W/O））型、水中油中水（Water-in-Oil-in-Water（W/O/W））型、もしくは水中油中固体（Solid-in-Oil-in-Water（S/O/W））型のエマルション／サスペンション法に続いて溶媒抽出もしくは溶媒蒸発を行うなどの、当技術分野で知られているプロセスを用いて製造することができる。エマルション／サスペンション法は特に有用であり、以下のステップを含むことができる：
(i）内部の有機相を調製するステップであって、
(a）１以上のポリマーを適当な有機溶媒（例えば、酢酸エチル、アセトン、THF、アセトニトリル、または塩化メチレン、クロロホルム、もしくはヘキサフルオロイソプロパノールなどのハロゲン化炭化水素）または溶媒混合物中に溶解し、必要に応じて適当な添加物を溶解／分散させること；
(b）ステップ（a）で得られたポリマー溶液中に、ポリペプチドを溶解／懸濁／乳化させること；
を含む前記ステップ；
(ii）１以上の安定化剤（例えば、ポリ（ビニルアルコール）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、またはゼラチン）、および必要に応じて緩衝塩を含有する、外側の水相を調製するステップ；
(iii）内部有機相を外部水相と混合してエマルションを形成するステップ；および
(iv）溶媒蒸発または溶媒抽出によって微粒子を硬化させ、その微粒子を（例えば、水で）洗浄して、回収し、（例えば、凍結乾燥または真空下で乾燥させることにより）微粒子を乾燥させて、（例えば、140μmを通過して）微粒子をふるいにかけるステップ。

乾燥した微粒子組成物は、バルクで、または最終容器に分注した後に、ガンマ線照射によって最終滅菌することができる。いくつかの実施形態において、バルク滅菌した微粒子を適当な溶媒に再懸濁し、ダブルチャンバーシリンジなどの適当なデバイスに分注して、その後凍結乾燥することができる。

いくつかの実施形態において、微粒子デポ組成物は、再構成を容易にするために溶媒を含むことができる。さらに、投与前に、適当な注射用溶媒（例えば マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、デキストロース、スクロース、もしくはグリセリンなどの１以上の医薬品添加剤、および／または、ポロキサマー、ポリ（オキシエチレン）ソルビタン脂肪酸エステル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、ポリ（ビニルピロリドン）、もしくはモノステアリン酸アルミニウムなどの１以上の非イオン性界面活性剤を含有する水性溶媒）中に微粒子を懸濁することができる。

本明細書はまた、心血管疾患（例えば、高血圧、抵抗性高血圧、または心筋梗塞）を有する哺乳動物を治療するための方法を提供する。この方法は、本明細書に記載のMANPおよび利尿剤を（例えば、経口、非経口、または経口および非経口法の組み合わせで）投与することを含みうる。治療は、疾患に関連する１以上の症状、または疾患の１以上の根本的原因に好影響を与えるか、または緩和することができる。例えば、治療は、哺乳動物の血圧を低下させることができる。

哺乳動物に、MANPもしくは核酸および利尿剤を投与するか、またはMANPおよび利尿剤を含有する１以上の組成物を投与する前に、哺乳動物を評価して、高血圧（例えば、RH）などの心血管疾患を治療する必要性があるかどうかを判定することができる。哺乳動物がそのような治療を必要としていると確認した後、その哺乳動物は、本明細書に記載の組成物によって治療することができる。例えば、MANPを含有する組成物は、望ましい結果を達成する（例えば、哺乳動物の血圧を低下させる、または哺乳動物の血圧のさらなる上昇を防止もしくは遅延させる）のに有効な、任意の量を、任意の回数で、任意の期間にわたって、哺乳動物に投与することができる。

いくつかの実施形態において、MANPを含有する組成物は、非経口で（例えば、皮下注射などの注射によって）、または経口摂取によって、約0.01ngポリペプチド/kg体重～約100mgポリペプチド/kg体重の用量で投与することができるが（例えば、約10ngポリペプチド/kg体重～約50mgポリペプチド/kg体重、約20ngポリペプチド/kg体重～約10mgポリペプチド/kg体重、約0.1ngポリペプチド/kg体重～約20ngポリペプチド/kg体重、約3ngポリペプチド/kg体重～約10ngポリペプチド/kg体重、約10ngポリペプチド/kg体重～約50ngポリペプチド/kg体重、約50ngポリペプチド/kg体重～約100μgポリペプチド/kg体重、約1μgポリペプチド/kg体重～約10μgポリペプチド/kg体重、約1μgポリペプチド/kg体重～約5μgポリペプチド/kg体重、約3μgポリペプチド/kg体重～約7μgポリペプチド/kg体重、約5μgポリペプチド/kg体重～約10μgポリペプチド/kg体重、約10μgポリペプチド/kg体重～約20μgポリペプチド/kg体重、または約20μgポリペプチド/kg体重～約100μgポリペプチド/kg体重）、他の投与量でも有益な結果が得られうる。一部の場合には、MANPは、例えば、約1pmol/kg/分～約500nmol/kg/分の用量で輸液によって投与することができる（例えば、約1～10pmol/kg/分、約10～100pmol/kg/分、約100～300pmol/kg/分、約250～500pmol/kg/分、約500pmol/kg/分～約1nmol/kg/分、約1～10nmol/kg/分、約10～100nmol/kg/分、約100～300nmol/kg/分、または約250～500nmol/kg/分）。

利尿剤は、少なくとも約1μg/kg体重～約500mg/kg体重（例えば、約1～10μg/kg体重、約10～50μg/kg体重、約50～100μg/kg体重、約100～500μg/kg体重、約500μg/kg体重～約1mg/kg体重、約1～5mg/kg体重、約5～10mg/kg体重、約10～50mg/kg体重、約50～100mg/kg体重、または約100～500mg/kg体重）の用量で投与することができるが、他の投与量でも有益な結果が得られる可能性がある。注目されるのは、MANPの増強効果を考慮すると、利尿剤の投与量を経時的に減少させられることである。したがって、利尿剤は、最初は約1～5mg/kgの用量で投与してもよいが、時間の経過とともに用量を漸減することができる。

MANPおよび利尿剤は、1回（例えば、デポ組成物の埋め込み、または注射によって）、または2回以上（例えば、繰り返しの注射、または経口投与によって）投与することができる。複数回投与する場合、投与の頻度は、1日1回もしくは2回以上（例えば、1日1回、2回、3回、4回、または5回以上）から、隔月に1回程度まで（例えば、週3～5回、週1回程度、月2回程度、月1回程度、または隔月に1回程度）の範囲とすることができる。さらに、投与の頻度は、治療期間中、一定のままとしてもよく、変動させてもよい。さまざまな要因が、特定の適用に使用される実際の投与頻度に影響を与えうる。例えば、有効量、治療期間、投与経路、および疾患の重症度によって、投与頻度の増加または減少が必要となる場合がある。

いくつかの実施形態において、MANPナトリウム利尿ポリペプチド、またはMANP含有組成物は、第1の期間の間、第1の経路（例えば、静脈内）にて投与し、その後、第2の期間の間、別の経路（例えば、皮下）を経て投与することができる。例えば、MANP含有組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）に、約1pmol／kg／分～約500nmol／kg／分の用量で、1時間～7日（例えば、1～2時間、2～4時間、4～6時間、6～8時間、8～12時間、12～24時間、24～48時間、48～36時間、3～4日、4～5日、5～6日、または6～7日）間にわたって静脈内投与し、その後、約0.01ng/kg～約100mg/kgの用量で、1日1回～3回、5日～30日以上（例えば 5～7日、7～10日、10～14日、14～21日、21～28日、28～30日、または31日以上）にわたって、哺乳動物に皮下投与することができる。

哺乳動物に投与されるMANP（またはMANPをコードする核酸）および利尿剤の有効量とは、選択されたパラメータ（例えば、血圧）を少なくとも10％変化させるのに十分な量である。例えば、いくつかの実施形態において、MANPおよび利尿剤の「有効量」は、ナトリウム利尿および／または利尿を増加させるのに十分な量（または、血漿cGMPレベル、尿中cGMP排泄、正味の腎cGMP生成、尿流量、尿中ナトリウム排泄、尿中カリウム排泄、ヘマトクリット、血漿BNP免疫反応性、腎血流量、血漿ANP免疫反応性、腎血管抵抗、ナトリウムの近位および遠位分画再吸収、平均動脈圧、肺毛細血管楔入圧、右心房圧、肺動脈圧、血漿レニン活性、血漿アンジオテンシンII濃度、血漿アルドステロン濃度、腎灌流圧、および全身血管抵抗などの、ナトリウム利尿および／または利尿に関する特性を増加もしくは減少させるのに十分な量）であって、これらを、治療前の同じパラメータのレベルと比較して、または対照となる未治療の哺乳動物のパラメータのレベルと比較して、少なくとも10％（例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または少なくとも100％）増加（または減少）させるのに十分な量である。したがって、一部の場合には、MANPおよび利尿剤の有効量は、高血圧（例えば、RH）であると確認された哺乳動物の血圧を、MANPおよび利尿剤の投与前の、換言すればMANPおよび利尿剤を投与しない、哺乳動物の血圧と比較して、または対照となる未治療の哺乳動物の「正常な」血圧と比較して、少なくとも10％（例えば、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％）低下させる量である。また、MANPの有効量は、利尿剤の効果を増強するのに十分な量であって、利尿剤の有益な効果（例えば、血圧の低下）を、同量の利尿剤をMANPなしで投与した場合に観察される効果よりも（例えば、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、または少なくとも約50％）増加させるような量とすることができる。有効量のMANPはまた、利尿剤の有害作用（例えば、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン活性化）を、MANPなしで利尿剤を投与したときに観察される有害作用と比較して、少なくとも約5％（例えば、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、または少なくとも約50％）低減することができる。

いくつかの実施形態において、哺乳動物へのMANPおよび利尿剤投与の量および頻度は、例えば、副作用を最小限に抑えながら高血圧を治療するのに最も効果的な投与量を確認するために、漸増させることができる。哺乳動物が特定の量に反応しなかった場合、その量を例えば2倍、3倍、5倍、または10倍に増やすことができる。この高濃度の投与を受けた後、治療に対する反応性および毒性症状の両者について哺乳動物をモニターし、それに応じて投与量および／または投与頻度の調整を行うことができる。有効量は一定のままとすることができるが、治療に対する哺乳動物の反応に応じて、スライドするスケール、すなわち変更可能な用量として調整することができる。

投与頻度は、哺乳動物に有意な毒性をもたらすことなく、例えば、哺乳動物の心血管疾患または心腎臓疾患の症状を軽減する任意の頻度とすることができる。例えば、投与頻度は、1日4回程度から隔月1回程度、または1日1回程度から月1回程度、または隔日1回程度から週1回程度とすることができる。さらに、投与頻度は、治療期間中、一定のままとすることができるが、変更可能としてもよい。有効量についてそうであるように、さまざまな要因が、特定の適用に使用される実際の投与頻度に影響を与えうる。例えば、有効量、治療期間、投与経路、腎疾患の重症度によって、投与頻度の増減が必要となる可能性がある。

有効な投与期間は、哺乳動物に有意な毒性をもたらすことなく、哺乳動物における高血圧または心腎臓疾患の症状を軽減する任意の期間とすることができる。有効な期間は、1日から数日、数週間、数ヶ月、または数年まで、多様な期間とすることができる。一般に、有効な期間は、数日から数ヶ月までの範囲とすることができる。例えば、有効な期間は、約1～2週間から約36ヶ月まで、またはそれ以上に及ぶことがある。一部の場合には、個々の哺乳動物の一生を通じて治療が続くこともある。複数の要因が、特定の治療計画に使用される実際の有効な期間に影響を与えうる。例えば、有効な期間は、投与頻度、投与量、投与経路、および状態の重症度によって多様に異なる可能性がある。

本明細書に記載のMANPおよび利尿剤を哺乳動物に投与した後、疾患が改善されたかどうかを判定するために、哺乳動物をモニターすることができる。例えば、治療後に哺乳動物を評価して、哺乳動物の疾患の１以上の症状が軽減されたかどうか（例えば、哺乳動物の血圧が低下したかどうか）を判定することができる。哺乳動物がMANPおよび利尿剤の特定の用量に反応しなかった場合、一方または両方の量を、例えば、2倍、3倍、5倍、または10倍に増やすことができる。この高濃度の投与を受けた後、治療に対する反応性および毒性症状の両者について哺乳動物をモニターし、状況に応じて適切に調整することができる。有効量は一定のままとすることができるが、治療に対する哺乳動物の反応に応じて、スライドするスケール、すなわち変更可能な用量として調整することができる。

一部の事例において、本明細書に記載の方法は、利尿剤およびMANPをすべての有効成分とする１以上の組成物を、哺乳動物に投与することを含むことができる。このような場合、例えば、投与は、MANPおよび利尿剤をすべての有効成分とする組成物の投与で構成されうるが、投与は、MANPをすべての有効成分とする第1の組成物、および利尿剤をすべての有効成分とする第2の組成物の投与で構成されることもある。

一部の場合には、本明細書に記載の方法は、利尿剤、MANP、およびACE阻害薬、ARB、もしくはCCBのいずれかをすべての有効成分とする１以上の組成物を哺乳動物に投与することを含むことができる。このような場合、例えば、投与は、MANP、利尿剤、およびACE阻害薬；またはMANP、利尿剤、およびARB；または、MANP、利尿剤、およびCCBをすべての有効成分とする組成物の投与で構成されうるが、MANPをすべての有効成分とする第1の組成物、利尿剤をすべての有効成分とする第2の組成物、およびACE阻害薬、ARB、もしくはCCBをすべての有効成分とする第3の組成物の投与で構成されていてもよい。注目されるのは、一部の場合には、3つの有効成分のうち2つ（例えば、MANPおよび利尿剤；MANPおよびACE阻害薬、ARBもしくはCCB；または利尿剤およびACE阻害薬、ARB、もしくはCCB）を1つの組成物として投与し、第3の有効成分を別の組成物で投与することができることである。

一部の場合には、本明細書に記載の方法は、すべての有効成分が利尿剤、MANP、ACE阻害薬もしくはARB、およびCCBである１以上の組成物を、哺乳動物に投与することを含むことができる。このような場合、例えば、投与は、MANP、利尿剤、ACE阻害薬もしくはARB、およびCCBをすべての有効成分とする組成物の投与で構成されうるが、投与は、MANPをすべての有効成分とする第1の組成物、利尿剤をすべての有効成分とする第2の組成物、ACE阻害薬もしくはARBをすべての有効成分とする第3の組成物、およびCCBをすべての有効成分とする第4の組成物の投与で構成されていてもよい。注目されるのは、一部の場合には、有効成分のうち2つ（例えば、MANPおよび利尿剤、MANPおよびACE阻害薬もしくはARB、MANPおよびCCB、利尿剤およびACE阻害薬もしくはARB、利尿剤およびCCB、またはACE阻害薬もしくはARBおよびCCB）を1つの組成物として投与し、他の2つの有効成分を別の組成物で投与することができることである。さらに、一部の場合には、有効成分のうち3つ（例えば、MANP、利尿剤、およびACE阻害薬もしくはARB；MANP、利尿剤、およびCCB；MANP、ACE阻害薬もしくはARB、およびCCB；または利尿剤、ACE阻害薬もしくはARB、およびCCB）を1つの組成物として投与し、残りの有効成分を別の組成物で投与することができる。

一部の場合には、本明細書に記載の方法は、哺乳動物が高血圧（例えば、RH）を有すると確認すること、ならびに、その後、MANPおよび利尿剤（例えば、Fs）を哺乳動物に投与することを含むことができる。哺乳動物を高血圧またはRHであると確認する能力を有することで、それらの哺乳動物を適正に識別し、MANPおよび利尿剤の組み合わせによって効果的かつ信頼性の高い方法で治療することが可能となる。例えば、本明細書に記載のRH治療法（例えば、MANPおよびFsの組み合わせ）は、RHを有すると特定された高血圧患者を治療するために使用することができる。

本発明は以下の実施例でさらに説明されるが、これらは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。

［実施例１］ラットにおけるMANPおよびFsの効果
最もよく研究され、広く使用されているヒトの本態性高血圧の遺伝モデルである、高血圧自然発症ラット（SHR）において、BPおよびアルドステロン刺激に対するMANP（配列番号3）およびFsの個別の効果および複合効果を調べる研究を行った（Lerman et al. (2019) Hypertension 73(6):e87-e120）。SHR（n=32）を無作為に10群に分けた：
グループ1 - 溶媒である生理食塩水で処理（Veh）；
グループ2 - 1mg/kgのFs単独で処理（Fs1）；
グループ3 - 5mg/kgのFs単独で処理（Fs5）；
グループ4 - 10mg/kgのFs単独で処理（Fs10）；
グループ5 - 100pmol/kg/分のMANP単独で処理（MANP100）；
グループ6 - 300pmol/kg/分のMANP単独で処理（MANP300）；
グループ7 - 600pmol/kg/分のMANP単独で処理（MANP600）；
グループ8 - Fs5+MANP300で処理；
グループ9 - Fs10+MANP300で処理；および
グループ10 - Fs10+MANP600で処理。
Fsは単回ボーラス投与で与えられ、グループ8、9、および10ではその後、MANPが60分かけて注入された。

平均動脈圧（MAP、mmHg）は、Fs1（Δ＝-40±9*）、Fs5（Δ＝-55±8^*）、Fs10（Δ＝-63±11^*）、MANP300（Δ＝-70±19^*）、およびMANP600（Δ＝-93±20^*&#）の単独投与で低下した；Fs5+MANP300（Δ＝-90±15^*&#）、Fs10+MANP300（Δ＝-93±6^*&#）、およびFs10+MANP600（Δ＝-95±9^*&#）の併用群でより大きな効果が認められた（図2A-2C）。Fs群、MANP群、およびFs＋MANP群におけるBPの低下は、ナトリウム排泄および尿流量の増加と関連していたが（*p<0.05）、Fs群とFs＋MANP群との間には、ナトリウム排泄もしくは利尿に有意な差異は認められなかった。血漿cGMPは、MANP群およびMANP+Fs群で有意に増加したが、Fs単独では変化しなかった（図3A-3C）。血漿中のアルドステロンは、低用量および高用量のFsで増加する傾向があり、Fs+MANP群ではその増加が有意に抑制された（p<0.05）（図4）。特にMANP+Fs群では、BPの減少が大きいほどcGMPの増加も大きいという相関性があった（図5）。

このように、MANP+FsはFs単独よりも強力な血圧降下作用を示し、Fsによるアルドステロンの活性化も抑制した。FsおよびMANPはともに利尿およびナトリウム利尿を引き起こすが、MANPは血管弛緩にも関与する可能性があり、これはFs+MANPのより強力な降圧作用を説明する可能性がある。したがって、これらの研究は、RHの治療において、Fsの降圧作用を増強するために、MANPが効果的な追加薬物であることを示唆した。

［実施例２］HEK293細胞およびラットにおけるMANPおよびFsの効果
MANPの検討の範囲を広げて、SHRにおいてMANPの用量依存的な急性心腎作用および神経液性作用をさらに検討し、pGC-Aを過剰発現しているHEK293細胞においてMANPの直接的なcGMP活性化作用を確認し、高血圧の重要な臓器損傷ターゲットであるヒト初代血管細胞においてMANPを介したcGMP活性化を調べた。前記血管細胞には、ヒト大動脈平滑筋細胞およびヒト大動脈内皮細胞などが含まれたが、これらはいずれも天然にpGC-Aを発現するものである。

方法
細胞培養：HEK293細胞は、Lipofectamine（Invitrogen, Grand Island, NY）を使用して、pGC-A（Origene（Rockville, MD）社製cDNAクローン）によりトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、10％ウシ胎仔血清（FBS）（Gibco）、100U/mLペニシリン、100U/mLストレプトマイシン、および250μg/mL G418（Geneticin）抗生物質を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。HAEC(Lonza, Walkersville, MD)は、EGM-2成長因子およびサプリメント(Lonza)および10％FBS(Gibco)を含有するEBM-2培地(Lonza)で培養した。HASMC(ScienCell, San Diego, CA)は、SMC成長サプリメント(SMCGS)、ペニシリン／ストレプトマイシン(ScienCell)およびFBS(ScienCell)を含有する平滑筋細胞培地(SMCM)(ScienCell)で培養した。

細胞内cGMP：細胞は80%から90%コンフルエントな状態で処理した。簡潔に述べると、20mmol/L N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]、0.1%ウシ血清アルブミン、および0.5mmol/L 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（Sigma, St.Louis, MO）を含有する緩衝液中で、細胞をインキュベートした。処理された細胞は、無処理（対照）またはMANP（配列番号3；10^-8 M、10^-7 M、または10^-6 M）処理を10分間受けた。実験は、MANPの各濃度または対照について3連で行い、その後、細胞溶解物を回収した。サンプルは、メーカーのプロトコルに従って、Direct cGMP ELISA kit（Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY）を用いてアッセイした。サンプル中の総タンパク質濃度は，BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific, Rockford, IL）を用いて定量した。結果は、総タンパク質1ミリグラムあたりのcGMPのピコモル数で表わされる。

SHRにおける急性試験プロトコル：高血圧の遺伝モデルである雄SHR（各群n=6）において、MANP、Fs、またはそれらの組み合わせの心腎作用および神経液性作用を調べた。ラットは、導入チャンバー内でイソフルラン2.5％吸入により麻酔した。この短時間の麻酔状態の間に、ラットにイナクチン（Inactin）100mg/kgをIP投与して麻酔を維持した。実験終了まで酸素マスクを使用した。動脈圧測定のために頸動脈にカニューレ挿入し、輸液のために右頸静脈にカニューレ挿入した。圧力はデジタル方式で記録し分析した（Sonometrics, London, Ontario, Canada）。採尿のために、下部腹壁の小切開を通して、カニューレを挿入した。

準備後ただちに、イヌリンの静脈内注入により30分間の平衡期間を開始した。血行動態計測および動脈血採取からなる15分間のベースラインクリアランスを行った。ベースライン測定後、ラットを10群に無作為に割り付けた。
グループ1 - MANP100で処理；
グループ2 - MANP300で処理；
グループ3 - MANP600で処理；
グループ4 - Fs1で処理；
グループ5 - Fs5で処理；
グループ6 - Fs10で処理；
グループ7 - MANP300＋Fs5で処理；
グループ8 - MANP300＋Fs10で処理；
グループ9 - MANP600＋Fs10で処理；および
グループ10 - イヌリン、生理食塩水、またはイヌリンおよび生理食塩水で処理。
グループ1-3では、15分間のMANP注入のリードインの後、MANPを合計で60分間持続的に注入した。グループ4-6の動物には、Fsを単回静脈内（IV）ボーラス投与した。MANP＋Fsグループ7-9は、Fsの単回IVボーラス投与に続いて、MANPの15分間のリードイン注入を行い、さらに同量のMANPを60分間連続注入した。対照動物（グループ10）には、MANP対照としてイヌリンの連続注入、Fs対照として0.9％生理食塩水の単回IVボーラス注入を行い、MANP＋Fs処理の対照としては、0.9％生理食塩水の単回IVボーラス注入およびイヌリンの連続注入を組み合わせて行った。

神経ホルモンおよび電解質の分析： ANPラジオイムノアッセイ（RIA）はMANPを十分に検出するので、MANPの評価として血漿ANPをラジオイムノアッセイ（Phoenix Pharmaceuticals）で測定した（Burnett et al. (1986) Science 231(4742):1145-1147）。血漿中および尿中cGMP（Enzo Life Sciences）ならびにアルドステロン（DRG International, Springfield, NJ）はELISAで測定した。イヌリン濃度は、別記のように、アンスロン法を用いて測定した（Fuhr et al. (1955) Klin. Wochenschr 33:729-730）。GFRはイヌリンクリアランスにより算出した。電解質は炎光光度法（IL943, Instrumentation Laboratory, UK）で測定した。すべての測定はメーカーの説明書に従って行った。

統計解析：数値は平均値±平均値の標準誤差（SEM）で表した。独立したグループの比較をスチューデントt検定で行った。グループ内の比較には、一元配置分散分析（ANOVA）検定に続いて、ダネット（Dunnett）の事後検定を用いた。グループ間の比較には、二元配置ANOVA検定を用い、その後、ボンフェローニの事後検定を行った（Statistica 8.0）。統計的有意性は、p値＜0.05と定義した。

結果
ヒトpGC-Aを過剰発現させたHEK293、ならびに初代ヒト大動脈内皮細胞およびヒト大動脈平滑筋細胞におけるin vitroでのcGMP活性化：図6Aは、ヒトpGC-A受容体によりトランスフェクトされたHEK293細胞をMANP処理した後のcGMP生成量をin vitroで測定した結果を示す。cGMPのレベルは、MANP濃度の漸増につれて増加した。MANPは、無処理対照群と比較して、cGMPレベルを有意に増加させた。MANPの投与量を増やすと、HAECおよびHASMCにおいてもcGMPレベルが有意に増加した（図6Bおよび6C）。HEK 293細胞と同様に、無処理では有意な効果は見られなかった。

In Vivo試験 - 全身血行動態：MANP群、Fs群、MANP＋Fs群、および対照群のSHRのベースラインにおける動脈血圧（BP）を表2に示す。血圧への影響を、図7A-7Cおよび図8に示す。MANP300およびMANP600は、対照群と比較して、BPを有意に減少させた（図7A）。60分の時点で、BPの最大の減少は、高用量（MANP600）群で見られた（図8）。Fsは3通りの用量のすべてで、対照と比較して、BPを有意に減少させた（図7Bおよび8）。しかしながら、MANP600単独では、Fs1またはFs5単独よりも有意に大きな降圧効果があった（図8）。併用療法群において、Fs5またはFs10へのMANP300の添加、およびFs10へのMANP600の添加は、Fs単独（単剤療法）と比較して、BPを有意に減少させた（MANP300＋Fs5対Fs5単独、MANP300＋Fs10対Fs10単独、およびMANP600+Fs10対Fs10単独についてp<0.05）（図7Cおよび8）。このように、MANP＋Fsの併用療法は、Fsの降圧効果を有意に増強した。

In Vivo試験-神経液性分析：MANP群、Fs群、MANP＋Fs群、および対照群のベースラインにおける血漿cGMPレベルのデータを表2にまとめた。血漿中cGMPは、3つの時点（ベースライン、30分、60分）で測定され、MANP300およびMANP600による処理後に、対照群と比較して、用量依存的に増加した（図9A）。これに対して、Fsは血漿中cGMPを変化させなかった（図9B）が、MANP＋Fs群では血漿中cGMPが顕著に増加した（図9C）。

尿中cGMP排出量は、MANP300およびMANP600投与後に、用量依存的に有意に増加し、また、MANP300＋Fs5、MANP300＋Fs10およびMANP600＋Fs10の投与後にも、対照と比較して有意に増加した（図10）。Fs群では有意な増加は見られず、溶媒（対照）群と違いはなかった（図10）。

アルドステロンの評価を図11に示す。MANPは、100pmol/kg/分および300pmol/kg/分の用量でアルドステロンを減少させたが、600pmol/kg/分では減少させなかった。Fs5群とFs10群において、対照群、MANP100群、およびMANP300群と比較して、アルドステロンのレベルは有意に高かった。併用群では、Fs5単独と比較してMANP300＋Fs5群において、ならびにFs10単独と比較してMANP300＋Fs10群およびMANP600＋Fs10群において、アルドステロンは有意に減少した。したがって、MANP＋Fsによる処理は、Fsによるアルドステロンの活性化を抑制することができた。

MANPを単独で、またはFsと併用して注入すると、MANP免疫反応の指標である血漿ANP免疫反応が有意に増加した（表3）。神経液性因子のうち、血漿ANP濃度は、血漿cGMPと有意に相関した（r=0.75、p<0.001）（図12）。血行動態パラメータのうち、血漿cGMP濃度はBPと有意に相関した（r=-0.65、p<0.001）（図13）。

In Vivo試験 - 腎機能：GFR、尿中ナトリウム排泄量（UNaV）および水分排泄量（UV）に対する効果を図14A-14Cにプロットした。Fs群では無処理対照群に比べてGFRが有意に低かったが、MANP300＋Fs10群およびMANP600＋Fs10群ではFs群と比較してGFRは増加した（図14A）。MANPの単独投与後、ならびにFsとの併用投与後に、尿中ナトリウム排泄量（図14B）および水分排泄量（図14C）はともに有意に増加した。

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を例証することを目的としており、制限するものではないと理解されるべきである。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (34)

1. 哺乳動物を治療するための方法であって、
   M心房性ナトリウム利尿ペプチド（MANP）を前記哺乳動物に投与すること、および
   利尿剤を前記哺乳動物に投与すること
   を含む前記方法。
2. 前記哺乳動物が高血圧であると確認されている、請求項1に記載の方法。
3. 前記高血圧が抵抗性高血圧（RH）である、請求項2に記載の方法。
4. 前記MANPが配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1～3のいずれか1つに記載の方法。
5. 前記MANPが配列番号5～14のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項1～3のいずれか1つに記載の方法。
6. 前記利尿剤がフロセミドである、請求項1～5のいずれか1つに記載の方法。
7. 前記哺乳動物がヒトである、請求項1～6のいずれか1つに記載の方法。
8. 前記MANPが静脈内に投与される、請求項1～7のいずれか1つに記載の方法。
9. 前記MANPが約10 pmol/kg/分～約100 nmol/kg/分の用量で投与される、請求項8に記載の方法。
10. 前記MANPが皮下に投与される、請求項1～7のいずれか1つに記載の方法。
11. 前記MANPが約0.1 ng/kg～約10 mg/kgの用量で投与される、請求項10に記載の方法。
12. 前記MANPが静脈内に投与され、その後皮下に投与される、請求項1～7のいずれか1つに記載の方法。
13. 前記MANPが静脈内に約10 pmol/kg/分～約100 nmol/kg/分の用量で投与され、その後皮下に約0.1 ng/kg～約100 mg/kgの用量で投与される、請求項12に記載の方法。
14. 前記利尿剤が経口で投与される、請求項1～13のいずれか1つに記載の方法。
15. 前記利尿剤が静脈内に投与される、請求項1～13のいずれか1つに記載の方法。
16. 前記利尿剤が皮下に投与される、請求項1～13のいずれか1つに記載の方法。
17. 前記MANPおよび前記利尿剤が同一組成物として同時に投与される、請求項1～16のいずれか1つに記載の方法。
18. 前記MANPおよび前記利尿剤が皮下に投与される、請求項17に記載の方法。
19. 前記方法が、MANPおよび利尿剤の哺乳動物への投与で構成される、請求項1～18のいずれか1つに記載の方法。
20. 哺乳動物における利尿剤の１以上の有益な効果を増強し、１以上の有害な作用を低減するための方法であって、利尿剤およびMANPを哺乳動物に投与することを含む前記方法。
21. 前記哺乳動物が高血圧であると確認されている、請求項20に記載の方法。
22. 前記高血圧がRHである、請求項21に記載の方法。
23. 前記MANPが配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する、請求項20～22のいずれか1つに記載の方法。
24. 前記MANPが配列番号5～14のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項20～22のいずれか1つに記載の方法。
25. 前記利尿剤がフロセミドである、請求項20～24のいずれか1つに記載の方法。
26. 前記哺乳動物がヒトである、請求項20～25のいずれか1つに記載の方法。
27. 前記MANPおよび前記利尿剤が静脈内に投与される、請求項20～26のいずれか1つに記載の方法。
28. 前記MANPが約10 pmol/kg/分～約100 nmol/kg/分の用量で投与される、請求項27に記載の方法。
29. 前記MANPおよび前記利尿剤が皮下に投与される、請求項20～26のいずれか1つに記載の方法。
30. 前記MANPが約1μg/kg～約10μg/kgの用量で投与される、請求項29に記載の方法。
31. 前記MANPおよび前記利尿剤が静脈内に投与され、その後皮下に投与される、請求項20～26のいずれか1つに記載の方法。
32. 前記MANPが静脈内に約10 pmol/kg/分～約100 nmol/kg/分の用量で投与され、その後皮下に約1μg/kg～約10μg/kgの用量で投与される、請求項31に記載の方法。
33. １以上の有益な効果が、哺乳動物における血圧低下を含み、１以上の有害な作用が、アルドステロン活性化を含む、請求項20～32のいずれか1つに記載の方法。
34. 前記方法が組成物の投与で構成され、利尿剤およびMANPが組成物中のすべての有効成分である、請求項20～33のいずれか1つに記載の方法。

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