KR20210090229A

KR20210090229A - 저항성 고혈압을 위한 조합 치료

Info

Publication number: KR20210090229A
Application number: KR1020217017589A
Authority: KR
Inventors: 존 씨 버넷; 니나 드죠야쉬빌리
Original assignee: 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-07-19
Also published as: JP2022506716A; BR112021008841A2; EP3877402A4; CN113727997A; WO2020097421A1; CA3119055A1; US20220118054A1; MX2021005453A; IL315007A; IL282958A; EP3877402A1; AU2019375988A1; IL282958B1

Abstract

M-심방 나트륨이뇨 펩티드(MANP) 및 이뇨제(예컨대, 푸로세미드)의 조합으로 고혈압(저항성 고혈압 포함)을 치료하기 위한 물질 및 방법이 본원에 기재된다.

Description

저항성 고혈압을 위한 조합 치료

관련 출원에 대한 상호 참조

이 출원은 2018년 11월 9일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/758,009로부터의 우선권의 이익을 주장한다. 이전 출원의 개시는 본 출원의 개시의 일부로 간주된다(참조로 포함된다).

연방 지원 연구 진술

본 발명은 국립 보건원에서 수여하는 HL136340에 따라 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

기술 분야

본 문서는 고혈압을 치료하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이며, 보다 특히 저항성 고혈압을 갖는 포유동물을 치료하기 위해 M-심방 나트륨이뇨 펩티드(MANP)와 이뇨제(예컨대, 푸로세미드)의 조합을 사용하는 방법에 관한 것이다.

높은 혈압으로도 알려진 고혈압(HT)은 동맥의 혈압이 지속적으로 상승하는 장기적인 의학적 상태이다. 고혈압은 항고혈압 약물로의 치료에 점점 더 저항력이 높아지고 있다. 저항성 고혈압(RH)을 갖는 환자는 (1) 이뇨제 및 전형적으로 (2) 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제(ARB) 및 (3) 칼슘 채널 차단제(CCB)를 포함하여 상이한 부류의 3가지 항고혈압제로 공동으로 치료하더라도 혈압이 계속 상승한다. 4가지 이상의 약물로 혈압이 제어되는 환자도 RH를 갖는 것으로 간주된다. 현재 미국에서 RH 치료용으로 승인된 약물 또는 장치는 없다.

본 문서는 적어도 부분적으로는 MANP와 이뇨제의 조합이 Fs 유도된 알도스테론 자극을 억제하면서 강력한 혈압(BP) 저하 작용을 한다는 발견을 기반으로 한다. 이 발견은 RH가 MANP와 푸로세미드(Fs)와 같은 이뇨제의 조합으로 효과적으로 치료될 수 있음을 나타내었다.

제1 측면에서, 본 문서는 포유동물에게 MANP 및 이뇨제를 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 포유동물을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 포유동물은 고혈압(예컨대, RH)을 갖는 것으로 확인될 수 있다. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 5 내지 14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이뇨제는 푸로세미드일 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다. MANP는 정맥내로(예컨대, 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로) 투여될 수 있다. MANP는 피하로(예컨대, 약 0.1 ng/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로) 투여될 수 있다. MANP는 정맥으로 투여되고, 그 후에 피하로 투여될 수 있다. 예컨대, MANP는 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로 정맥내로 투여되고, 그 후에, 약 0.1 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 용량으로 피하로 투여될 수 있다. 이뇨제는 경구, 정맥내 또는 피하로 투여될 수 있다. MANP 및 이뇨제는 동일한 조성물로 동시에 투여될 수 있다. MANP 및 이뇨제는 피하로 투여될 수 있다. 방법은 포유동물에게 MANP 및 이뇨제를 투여하는 단계로 이루어질 수 있다. MANP 및 이뇨제는 단독 활성 성분이 MANP 및 이뇨제인 조성물로 투여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 문서는 포유동물에게 이뇨제 및 MANP를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 이뇨제의 하나 이상의 유익한 효과를 강화하고 이뇨제의 하나 이상의 유해한 효과를 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 포유동물은 고혈압(예컨대, RH)을 갖는 것으로 확인될 수 있다. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 5 내지 14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이뇨제는 푸로세미드일 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다. MANP 및 이뇨제는 정맥내로 투여될 수 있다(예컨대, MANP는 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로 투여됨). MANP 및 이뇨제는 피하로 투여될 수 있다(예컨대, MANP는 약 1 μg/kg 내지 약 10 μg/kg의 용량으로 투여됨). MANP 및 이뇨제는 정맥으로 투여되고, 그 후에 피하로 투여될 수 있다. MANP는 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로 정맥내로 투여되고, 그 후에, 약 1 μg/kg 내지 약 10 μg/kg의 용량으로 피하로 투여될 수 있다. 하나 이상의 유익한 효과는 포유동물에서의 혈압 감소를 포함할 수 있고, 하나 이상의 유해한 효과는 알도스테론 활성화를 포함할 수 있다. 방법은 단독 활성 성분이 이뇨제 및 MANP인 조성물을 투여하는 단계로 이루어질 수 있다. MANP 및 이뇨제는 단독 활성 성분이 MANP 및 이뇨제인 조성물로 투여될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 공개문, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문은 그들 전체가 참조로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 첨부된 도면 및 하기의 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 설명 및 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.

도 1은 심방 나트륨이뇨 펩티드(ANP; 서열번호 1)의 서열 및 일반적인 구조 뿐만 아니라 MANP(서열번호 3)의 서열 및 일반적인 구조를 나타내는 다이아그램이다.
도 2a-2c는 60분의 기간에 걸쳐 비히클, 100 pmol/kg/분 MANP, 300 pmol/kg/분 MANP, 또는 600 pmol/kg/분 MANP(도 2a); 비히클, 1 mg/kg Fs, 5 mg/kg Fs, 또는 10 mg/kg Fs(도 2b), 및 비히클, 300 pmol/kg/분 MANP + 5 mg/kg Fs, 600 pmol/kg/분 MANP + 5 mg/kg Fs, 또는 600 pmol/kg/분 MANP + 10 mg/kg Fs(도 2c)로 처리된 래트에서 평균 동맥 압력(MAP)을 플로팅한 그래프이다. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가졌다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. *p<0.05 vs. Veh, ^#p<0.05 vs Fs10.
도 3a-3c는 60분의 기간에 걸쳐 비히클, 100 pmol/kg/분 MANP, 300 pmol/kg/분 MANP, 또는 600 pmol/kg/분 MANP(도 3a); 비히클, 1 mg/kg Fs, 5 mg/kg Fs, 또는 10 mg/kg Fs(도 3b), 및 비히클, 300 pmol/kg/분 MANP + 5 mg/kg Fs, 600 pmol/kg/분 MANP + 5 mg/kg Fs, 또는 600 pmol/kg/분 MANP + 10 mg/kg Fs(도 3c)로 처리된 래트에서 혈장 cGMP 수준을 플로팅한 그래프이다. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가졌다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. *p<0.05 vs. 비히클 @ p<0.05 vs. MANP100.
도 4는 60분 동안 비히클, 100 pmol/kg/분 MANP, 300 pmol/kg/분 MANP, 600 pmol/kg/분 MANP, 1 mg/kg Fs, 5 mg/kg Fs, 10 mg/kg Fs, 300 pmol/kg/분 MANP + 5 mg/kg Fs, 600 pmol/kg/분 MANP + 5 mg/kg Fs, 또는 600 pmol/kg/분 MANP + 10 mg/kg Fs로 처리된 래트에서 혈장 알도스테론 수준을 플로팅한 그래프이다. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가졌다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. $p<0.05 vs. Fs5, #p<0.05 vs Fs10.
도 5는 60분 동안 비히클, 100, 300, 또는 600 pmol/kg/분 MANP, 1, 5, 또는 10 mg/kg Fs, 또는 300 pmol/kg/분 MANP + 5 mg/kg Fs, 300 pmol/kg/분 MANP + 10 mg/kg Fs, 또는 600 pmol/kg/분 MANP + 10 mg/kg Fs로 래트를 처리한 후 MAP의 변화 대 cGMP 수준의 변화를 플로팅한 그래프이다. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가졌다.
도 6A-6C는 MANP(서열번호 3)에 의해 자극된 미립자 구아닐릴 사이클라제 A(pGC-A) 수용체를 과발현하는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포(도 6A), 1차 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)(도 6B) 및 1차 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)(도 6C)에서 생성된 cGMP의 수준을 플로팅한 그래프이다. 표시된 값은 평균 ± SEM이다. * p< 0.05 vs. 대조군.
도 7A-7C는 MANP 또는 비히클(대조군) 주입(도 7A), Fs 또는 비히클(대조군) 볼루스 주사(도 7B), 및 MANP 주입과 Fs 볼루스 주사의 조합 또는 비히클 주입 및 비히클 볼루스 주사(대조군)(도 7C)의 기준선(BL), 15분 리드-인(Lead-In), 및 15, 30, 45 및 60분 후 래트에서 BP를 플로팅한 그래프이다. 표시된 값은 평균 ± SEM이다. # p< 0.05 MANP300 vs. 비히클; * p<0.05 MANP600 vs. 비히클; § p<0.05 Fs1 vs. 비히클; @ p<0.05 Fs5 vs. 비히클; & p<0.05 Fs10 vs. 비히클; ￡ p<0.05 MANP300+Fs5 vs. 비히클; ® p<0.05 MANP300+Fs10 vs. 비히클; ⓒ p<0.05 MANP600+Fs10 vs. 비히클. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가졌다.
도 8은 비히클 주입(대조군), MANP 주입, Fs 볼루스 주사, 또는 MANP 주입과 Fs 볼루스 주사의 조합의 60분 후 래트에서 BP를 플로팅한 그래프이다. 플로팅된 값은 평균 ± SEM이다. * p< 0.05 vs. 비히클; ￥ p< 0.05 vs. MANP100; ® p<0.05 MANP300 vs MANP300+Fs10; # p<0.05 vs MANP600; § p<0.05 vs. Fs1; @ p<0.05 vs Fs5; & p<0.05 vs Fs10. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가졌다.
도 9A-9C는 MANP 또는 비히클(대조군) 주입(도 9A), Fs 또는 비히클(대조군) 볼루스 주사(도 9B), 및 MANP 주입과 Fs 볼루스 주사의 조합 또는 비히클 주입 및 비히클 볼루스 주사(대조군)(도 9C)의 BL, 30 및 60분 후 래트에서 혈장 cGMP를 플로팅한 그래프이다. 플로팅된 값은 평균 ± SEM이다. * p< 0.05 vs. 비히클. MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가졌다.
도 10은 MANP(서열번호 3), Fs, MANP+Fs 조합, 또는 비히클 투여 60분 후 래트에서 소변 cGMP 배설을 플로팅한 그래프이다. 플로팅된 값은 평균 ± SEM이다. * p< 0.05 vs. 비히클(대조군).
도 11은 MANP(서열번호 3), Fs, MANP+Fs 조합, 또는 비히클 투여 60분 후 래트에서 알도스테론 수준을 플로팅한 그래프이다. 표시된 값은 평균 ± SEM이다. * p< 0.05 vs. 비히클(대조군); @ p<0.05 vs Fs5; & p<0.05 vs Fs10.
도 12는 MANP(서열번호 3), Fs, MANP+Fs 조합, 또는 비히클 투여 후 래트에서 혈장 ANP와 혈장 cGMP 사이의 양의 상관 관계를 나타내는 그래프이다. 피어슨(Pearson) 상관 계수(r) = 0.7479, p< 0.01.
도 13은 MANP(서열번호 3), Fs, MANP+Fs 조합, 또는 비히클 투여 후 래트에서 혈장 cGMP와 평균 동맥 혈압 사이의 음의 상관 관계를 플로팅한 그래프이다. 피어슨 상관 계수(r) = -0.6510, p< 0.01.
도 14A-14C는 MANP(서열번호 3), Fs, MANP+Fs 조합, 또는 비히클 투여 60분 후 GFR(도 14A), 소변 나트륨 배설(도 14B) 및 소변 유량(도 14C)을 플로팅한 그래프이다. 표시된 값은 평균 ± SEM이다. * p< 0.05 vs. 비히클(대조군); ￥ p< 0.05 vs. MANP100; ® p<0.05 vs. MANP300; @ p<0.05 vs MANP600; # p<0.05 vs Fs1; & p<0.05 vs MANP300+Fs5.

본 문서는 MANP와 이뇨제(예컨대, Fs)의 조합으로 RH를 포함한 고혈압을 치료하는 물질 및 방법을 제공한다. 예컨대, 본 문서는 포유동물(예컨대, 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 래트, 마우스, 소, 말, 양 또는 돼지)에게 MANP 및 이뇨제를 투여한 후 포유동물의 BP가 감소되는 방식으로 MANP 및 이뇨제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 알도스테론은 투여 후 포유동물에서 상승되지 않는다. 일부 경우에, 포유동물은 고혈압(예컨대, RT)을 갖는 것으로 확인될 수 있다.

일반적으로 "워터 필(water pill)"로 알려진 이뇨제는 신장이 신체로부터 과도한 수분 및 염분을 제거하는 것을 도와 혈관에서 체액 수준을 감소시킴으로써 혈압을 감소시키는 약물이다. 이뇨제는 종종 고혈압 환자에게 처방되는 제1 유형의 약물이다. 고혈압 환자를 치료하는 데 사용될 수 있는 이뇨제는 제한없이 티아지드 이뇨제[예컨대, 클로르탈리돈(히그로톤), 클로로티아지드(디우릴), 하이드로클로로티아지드(에시드릭스, 하이드로디우릴 또는 마이크로지드), 인다파미드(로졸) 및 메톨라존(미크록스, 자록솔린)], 및 기타, 예컨대 아밀로리드(미다모르), 부메타니드(부멕스), 푸로세미드(라식스), 스피로놀락톤(알닥톤) 및 트리암테렌(디레니움)을 포함한다. 푸로세미드(본원에서 "Fs"로 약칭됨)는 다른 항고혈압제의 효과를 증가시킬 수 있지만, Fs는 또한 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템을 활성화시킨다.

나트륨이뇨 폴리펩티드는 나트륨 배설 증가를 유발할 수 있는 폴리펩티드로 소변으로 나트륨 배설을 증가시킨다. 나트륨이뇨 폴리펩티드는 뇌, 심장, 신장 및/또는 혈관 조직에 의해 생산될 수 있다. 인간의 나트륨이뇨 폴리펩티드 계열은 심장 호르몬인 심방 나트륨이뇨 펩티드(ANP), B형 나트륨이뇨 펩티드(BNP), C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP) 및 유로딜라틴(URO)을 포함한다. 나트륨이뇨 폴리펩티드는 2개의 잘 특성화된 구아닐릴 사이클라제 수용체(ANP, BNP 및 URO의 경우 NPR-A; 및 CNP의 경우 NPR-B) 및 제2 메신저 사이클릭 3'5' 구아노신 모노포스페이트(cGMP)를 통해 기능한다(Kuhn (2003) Circ. Res. 93:700-709; Tawaragi et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 175:645-651; and Komatsu et al. (1991) Endocrinol. 129:1104-1106). 나트륨이뇨 폴리펩티드는, 예컨대 혈장 cGMP 수준 증가, 소변 cGMP 배설 증가, 순 신장 cGMP 생성 증가, 소변 유량 증가, 소변 나트륨 배설 증가, 소변 칼륨 배설 증가, 헤마토크릿 증가, 혈장 BNP 면역반응성 증가, 신장 혈류 증가, 혈장 ANP 면역반응성 증가, 신장 혈관 저항성 감소, 나트륨의 근위 및 원위 분획 재흡수 감소, 평균 동맥 압력 감소, 폐 쐐기 모세관 압력 감소, 우심방 압력 감소, 폐 동맥 압력 감소, 혈장 레닌 활성 감소, 혈장 안지오텐신 II 수준 감소, 혈장 알도스테론 수준 감소, 신장 관류 압력 감소, 및/또는 전신 혈관 저항성 감소에 효과적일 수 있다.

MANP는 혈압 및 혈관 저항성을 상당히 낮출 수 있는 pGC-A/cGMP 활성화제이다. 본원에 제공된 방법은 부분적으로 MANP로 포유동물을 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, MANP는 추가의 12개의 아미노산 카르복시 말단 (

)과 함께 28개의 아미노산 성숙 인간 ANP 서열(

)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 ANP 기반 펩티드이다. MANP의 전장 서열은

이다. MANP를 코딩하는 대표적인 핵산 서열은

이다.

본원에 사용된 "MANP"는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있거나, 서열번호 3에 제시된 서열의 변이체일 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 본원에 제공된 방법에 사용되는 MANP는 서열번호 3에 제시된 전체 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에, MANP는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 함유할 수 있지만, 단 아미노산 서열은 1개 또는 1개 내지 10개(예컨대, 10개, 1개 내지 9개, 2개 내지 9개, 1개 내지 8개, 2개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 2개 또는 1개)의 아미노산 추가, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 예컨대, MANP는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 단일 아미노산 잔기 추가, 결실 또는 치환과 함께 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에, MANP는 서열번호 3의 C-말단 부분(예컨대, 서열번호 3의 마지막 12개 아미노산) 내에 하나 이상의 추가, 결실 및/또는 치환을 가질 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 예는 제한없이 트레오닌 결실(

), 트립토판의 티로신으로의 대체(

), 리신과 글루타민 사이에 세린 추가(

), 또는 이들의 조합의 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 예에서, MANP는 서열번호 3의 마지막 3개 잔기(즉, 서열번호 8(

)에 제시된 바와 같이 서열번호 3의 글리신, 트립토판 및 알라닌 잔기)가 결여될 수 있다. 일부 경우에, MANP는 서열번호 3의 N-말단 부분(예컨대, 서열번호 3의 처음 6개 아미노산) 내에 하나 이상의 추가, 결실 및/또는 치환을 가질 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 예는 제한없이 N-말단에 유로딜라틴으로부터의 4개의 아미노산의 추가(

), 위치 3 및 4의 아르기닌 잔기의 리신 잔기로의 치환(

), 여섯 번째 위치에서 세린의 D-이소형의 치환(

, 네 번째 위치에서 아르기닌의 D-이소형의 치환 및 다섯 번째 위치에서 세린의 결실(

), 위치 1, 5 및 6에서 세린 잔기 대신 트레오닌 잔기의 치환(

), 위치 2에서 루신 대신 트립토판의 치환(

) 또는 이들의 임의의 조합의 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

서열번호 3에 제시된 임의의 아미노산 잔기는 결실될 수 있고, 임의의 아미노산 잔기(예컨대, 20개의 통상적인 아미노산 잔기 중 임의의 것 또는 오르니틴 또는 시트룰린과 같은 아미노산의 임의의 다른 유형)가 서열번호 3에 제시된 서열에 추가될 수 있다. 일부 경우에, MANP는 ε-아미노헥산산과 같은 하나 이상의 화학 구조물; 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, (5R)-5-하이드록시-L-리신, 알로-하이드록시리신 및 5-하이드록시-L-노르발린과 같은 히드록실화된 아미노산; 및/또는 단당류(예컨대, D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, D-글루코사민 및 D-갈락토사민) 또는 단당류의 조합을 함유하는 아미노산과 같은 글리코실화된 아미노산을 함유할 수 있다.

본원에서 "변이체" MANP로도 지칭되는, 서열번호 3에 제시된 대표적인 MANP 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 추가, 결실 또는 치환을 갖는 MANP는 임의의 적절한 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 치환은 (a) 치환 영역에서 펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기(bulk)를 유지하는 효과가 크게 다르지 않은 치환을 선택함으로써 수행될 수 있다. 예컨대, 자연 발생 잔기는 측쇄 특성에 따라 그룹으로 나눌 수 있다: (1) 소수성 아미노산(노르루신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신); (2) 중성 친수성 아미노산(시스테인, 세린 및 트레오닌); (3) 산성 아미노산(아스파르트산 및 글루탐산); (4) 염기성 아미노산(아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신 및 아르기닌); (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 아미노산(글리신 및 프롤린); 및 (6) 방향족 아미노산(트립토판, 티로신 및 페닐알라닌). 이들 그룹 내에서 수행되는 치환은 보존적 치환으로 간주될 수 있다. 유용한 보존적 치환의 비제한적인 예는 제한없이 알라닌 대신 발린, 아르기닌 대신 리신, 아스파라긴 대신 글루타민, 아스파르트산 대신 글루탐산, 시스테인 대신 세린, 글루타민 대신 아스파라긴, 글루탐산 대신 아스파르트산, 글리신 대신 프롤린, 히스티딘 대신 아르기닌, 이소루신 대신 루신, 루신 대신 이소루신, 리신 대신 아르기닌, 메티오닌 대신 루신, 페닐알라닌 대신 루신, 프롤린 대신 글리신, 세린 대신 트레오닌, 트레오닌 대신 세린, 트립토판 대신 티로신, 티로신 대신 페닐알라닌, 및/또는 발린 대신 루신의 치환을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법에서 유용한 MANP 내의 임의의 위치에서 이루어질 수 있는 보존적 치환의 추가 예는 표 1에 제시되어 있다.

일부 실시양태에서, MANP는 하나 이상의 비보존적 치환을 포함할 수 있다. 비보존적 치환은 전형적으로 상기된 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원과 교환하는 것을 수반한다. 이러한 생산은 이러한 화합물의 다량 또는 대안적 실시양태를 제공하기 위해 바람직할 수 있다. 아미노산 변화가 기능적 폴리펩티드를 초래하는지의 여부는, 예컨대 본원에 개시된 방법을 이용하여 폴리펩티드 변이체의 특이 활성을 검정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, MANP는, 예컨대 35 내지 45개의 아미노산 잔기(예컨대, 35 내지 40, 40 내지 45, 35 내지 37, 36 내지 38, 37 내지 39, 38 내지 40, 39 내지 41, 40 내지 42, 41 내지 43, 42 내지 44, 또는 43 내지 45개의 아미노산 잔기)의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 나트륨이뇨 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있지만 특정 수의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예컨대 나트륨이뇨 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있지만 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 예는 제한없이 폴리펩티드의 N-말단 영역 내에서 하나 이상의 L-아미노산을 대체하는 D-아미노산 잔기(예컨대, 서열번호 11에 제시된 바와 같이 위치 6에서 D-세린 잔기, 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같이 위치 4에 D-아르기닌)을 갖는 MANP를 포함한다.

일부 실시양태에서, MANP는 서열번호 3에 제시된 참조 서열에 대해 적어도 90%(예컨대, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 97.5% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열 동일성 백분율은 정렬된 아미노산 서열에서 일치하는 위치의 수를 결정하고 일치하는 위치의 수를 정렬된 아미노산의 총 수로 나눈 다음 100을 곱하여 계산된다. 일치된 위치는 동일한 아미노산이 정렬된 아미노산 서열의 동일한 위치에서 발생하는 위치를 지칭한다. 서열 동일성 백분율은 또한 임의의 핵산 서열에 대해 결정될 수 있다.

특정 핵산 또는 아미노산 서열과 특정 서열 확인 번호에 의해 참조되는 서열 사이의 서열 동일성 백분율은 하기와 같이 결정된다. 먼저, 핵산 또는 아미노산 서열을 BLASTN 버전 2.0.14 및 BLASTP 버전 2.0.14를 함유하는 BLASTZ의 독립형 버전으로부터 BLAST 2 서열(Bl2seq) 프로그램을 사용하여 특정 서열 확인 번호에 제시된 서열과 비교한다. BLASTZ의 이 독립형 버전은 fr.com/blast 또는 ncbi.nlm.nih.gov에서 온라인으로 구할 수 있다. Bl2seq 프로그램 이용 방법을 설명하는 지침은 BLASTZ와 함께 제공되는 리드미(readme) 파일에서 찾을 수 있다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 2개의 서열 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되고, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 2개의 핵산 서열을 비교하기 위해, 옵션은 하기와 같이 설정된다: -i는 비교될 제1 핵산 서열을 함유하는 파일로 설정되고(예컨대, C:\seq1.txt); -j는 비교될 제2 핵산 서열을 함유하는 파일로 설정되고(예컨대, C:\seq2.txt); -p는 blastn으로 설정되고; -o는 임의의 원하는 파일 이름으로 설정되고(예컨대, C:\output.txt); -q는 -1로 설정되고; -r은 2로 설정되고; 다른 모든 옵션은 디폴트 설정으로 유지된다. 예컨대, 하기 명령을 사용하여 2개의 서열 간의 비교를 함유하는 출력 파일을 생성할 수 있다: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. 2개의 아미노산 서열을 비교하기 위해, Bl2seq의 옵션은 하기와 같이 설정된다: i는 비교될 제1 아미노산 서열을 함유하는 파일로 설정되고(예컨대, C:\seq1.txt); -j는 비교될 제2 아미노산 서열을 함유하는 파일로 설정되고(예컨대, C:\seq2.txt). -p는 blastp로 설정되고; -o는 원하는 파일 이름으로 설정되고(예컨대, C:\output.txt); 다른 모든 옵션은 디폴트 설정으로 유지된다. 예컨대, 하기 명령을 사용하여 2개의 아미노산 서열 간의 비교를 함유하는 출력 파일을 생성할 수 있다: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. 2개의 비교된 서열이 상동성을 공유하는 경우, 지정된 출력 파일은 그들 상동성 영역을 정렬된 서열로 제시할 것이다. 비교된 2개의 서열이 상동성을 공유하지 않으면, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열을 제시하지 않을 것이다.

일단 정렬되면, 일치의 수는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 2개의 서열 모두에 제시되는 위치의 수를 계산함으로써 결정된다. 서열 동일성 백분율은 일치의 수를 확인된 서열(예컨대, 서열번호 3)에 제시된 서열의 길이 또는 연결된 길이(예컨대, 확인된 서열에 제시된 서열로부터의 20개의 연속 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기)로 나눈 후 생성된 값에 100을 곱하여 결정된다. 예컨대, 서열번호 3에 제시된 서열과 정렬되었을 때 37개의 일치를 갖는 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시된 서열과 92.5% 동일하다(즉, 37 ÷ 40 x 100 = 92.5). 서열 동일성 백분율 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림된다는 것에 주목한다. 예컨대 75.11, 75.12, 75.13, 및 75.14는 75.1로 내림되고, 75.15, 75.16, 75.17, 75.18, 및 75.19는 75.2로 반올림된다. 또한, 길이 값은 항상 정수일 것이라는 것에 주목한다.

단리된 MANP는 고체상 합성을 포함한 임의의 적절한 방법을 이용하여 생산될 수 있으며, 수동 기술 또는 자동화 기술을 이용하여 생성될 수 있다(예컨대, 어플라이드 바이오시스템스(Applied BioSystems, Foster City, CA) 펩티드 합성기 또는 바이로리서치 인크(Biosearch Inc., San Rafael, CA) 자동 펩티드 합성기를 사용). 시스테인 잔기 사이의 디술파이드 결합은, 예컨대 미국 특허 번호 4,757,048에 교시된 바와 같이 KCN을 사용하여 선형 폴리펩티드의 온화한 산화에 의해 도입될 수 있다. 나트륨이뇨 폴리펩티드는 또한 재조합적으로 생산되거나 상업적으로 얻을 수 있다.

본원에 기재된 MANP는 전형적으로 시스테인 잔기 사이의 디술파이드 결합으로 인해 고리형이다(도 1 참조). 일부 실시양태에서, 시스테인 잔기 상의 술프히드릴기는 대안적 기(예컨대, -CH₂CH₂-)로 대체될 수 있다. 예컨대, 술프히드릴기를 -CH₂-기로 대체하기 위해, 시스테인 잔기를 알파-아미노부티르산으로 대체할 수 있다. 이러한 고리형 유사체 폴리펩티드는, 예컨대 문헌(Lebl and Hruby (1984) Tetrahedron Lett. 25:2067-2068)의 방법론에 따라 또는 미국 특허 번호 4,161,521에 개시된 절차를 이용하여 생성될 수 있다.

또한, 세린 또는 트레오닌의 OH를 아스파르트산 또는 글루탐산의 카르복실기와 반응시켜 구조 -CH₂CO₂CH₂-를 갖는 브릿지를 생성함으로써 에스테르 브릿지를 형성할 수 있다. 마찬가지로, 아미드는 리신의 측쇄를 아스파르트산 또는 글루탐산과 반응시켜 구조 -CH₂C(O)NH(CH)₄-를 갖는 브릿지를 생성함으로써 얻을 수 있다. 이들 브릿지의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌(Schiller et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 127:558, and Schiller et al. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25:171) 참조). 예컨대, 메리필드(Merrifield) 합성 기술을 이용할 때 본 폴리펩티드의 에스테르를 제조하는 하나의 방법은 수지에 따라 염기성 또는 산성 조건 하에서 원하는 알코올의 존재 하에 수지로부터 완성된 폴리펩티드를 절단하는 것이다. 폴리펩티드의 C-말단 말단은 유리산의 분리없이 수지로부터 유리될 때 직접 에스테르화될 수 있다. 폴리펩티드의 아미드는 또한 카르복실산기 또는 전구체를 아미드로 전환하기 위한 기술(예컨대, 당업계에 공지된 기술)을 이용하여 제조될 수 있다. C-말단 카르복실기에서 아미드 형성을 위한 하나의 방법은 적절한 아민으로 고체 지지체로부터 폴리펩티드를 절단하거나, 알코올의 존재 하에 절단하여 에스테르를 생성한 다음 원하는 아민으로 아미노분해하는 것을 포함한다. 다른 브릿지 형성 아미노산 잔기 및 반응은, 예컨대 미국 특허 번호 4,935,492에 제공된다. 아미노산 잔기를 연결하기 위해 비-펩티딜 결합을 포함하는 펩티드 유사체의 제조도 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌(Spatola et al. (1986) Life Sci. 38:1243; Spatola (1983) Vega Data 1(3); Morley (1980) Trends Pharm. Sci. 463-468; Hudson et al. (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177; Spatola, in Chemistry and Biochemistry of Amino Acid Peptides and Proteins, B. Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Hann (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:307; Almquist et al. (1980) J. Med. Chem. 23:1392; Jennings-White et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533; European Patent Application EP 45665; Holladay et al. (1983) Tetrahedron Lett. 24:4401; and Hruby (1982) Life Sci. 31:189)을 참조한다.

폴리펩티드의 아미노기의 N-아실 유도체는 최종 축합을 위해 N-아실 보호된 아미노산을 활용하거나 보호되거나 보호되지 않은 펩티드를 아실화하여 제조될 수 있다. O-아실 유도체는, 예컨대 유리 하이드록시 펩티드 또는 펩티드 수지의 아실화에 의해 제조될 수 있다. 아실화는 아실 할라이드, 무수물, 아실 이미다졸 등과 같은 표준 아실화 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 원하는 경우, N- 및 O-아실화를 모두 수행할 수 있다.

일부 경우에, MANP는 페길화되거나, 아세틸화되거나 또는 둘 다 될 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 투여를 가능하게 하거나 접합된 폴리펩티드의 약동학적 또는 약력학적 프로파일을 개선하는 짧은 양친매성 올리고머와 같은 올리고머에 공유적으로 부착될 수 있다. 올리고머는 수용성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및/또는 지용성 알킬(단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산 중합체, 예컨대 제한없이 팔미트산, 미리스트산, 라우르산, 카프르산 또는 스테아르산)을 포함할 수 있다. 지방산 분자는 자유 아미노 말단 또는 임의의 리신 측쇄(엡실론 아미노기)에 부착될 수 있으며, 이 부착을 위한 리신 잔기는 펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 위치될 수 있다. PEG 또는 또 다른 적합한 중합체에 대한 연결, 또는 알부민 또는 또 다른 적합한 폴리펩티드에 대한 융합은 비변형된 나트륨이뇨 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 갖는 변형된 나트륨이뇨 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 특정 메커니즘에 얽매이지 않고, 증가된 혈청 반감기는 변형된 나트륨이뇨 폴리펩티드의 감소된 단백질분해, 면역 인식 또는 세포 스캐빈징으로부터 발생할 수 있다. PEG에 대한 연결에 의해 폴리펩티드를 변형하는 방법("페길화"로도 지칭됨) 또는 다른 중합체에 대한 연결에 의해 폴리펩티드를 변형하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌(미국 특허 번호. 6,884,780; PCT 공개 번호 WO 2004/047871; Cataliotti et al. ((2007) Trends Cardiovasc. Med. 17:10-14; Veronese and Mero (2008) BioDrugs 22:315-329; Miller et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:267-274; and Veronese and Pasut (2005) Drug Discov. Today 10:1451-1458, 모두 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 제시된 것을 포함한다. 알부민에 대한 융합에 의해 폴리펩티드를 변형하는 방법도 당업계에 공지되어 있으며, 문헌(미국 특허 공개 번호 20040086976 및 Wang et al. (2004) Pharm. Res. 21:2105-2111, 둘 다 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 제시된 것을 포함한다.

일부 경우에, MANP는 면역글로불린 분자(예컨대, IgG1 분자)의 Fc 도메인에 융합되어 상피 세포 장벽을 통한 융합 폴리펩티드의 활성 수송이 Fc 수용체를 통해 발생하도록 할 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 고리형 폴리펩티드일 수 있다. 고리형 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 결합하여 얻을 수 있지만, 시스테인 잔기 상의 술프히드릴기를 대체기, 예컨대 -CH₂-CH₂-로 대체하는 것도 고려된다. 예컨대, 술프히드릴기를 --CH₂--기로 대체하기 위해, 시스테인 잔기를 유사한 알파-아미노부티르산으로 대체할 수 있다. 이러한 고리형 아날로그 펩티드는, 예컨대 문헌(Lebl and Hruby, Tetrahedron Lett., 25:2067-2068, 1984)의 방법론에 따라 또는 미국 특허 번호 4,161,521에 개시된 절차를 이용하여 형성될 수 있다.

MANP의 카르복실기의 염은 폴리펩티드를 1 이상의 당량의, 예컨대 금속 수산화물 염기(예컨대, 수산화나트륨), 금속 탄산염 또는 중탄산염 염기(예컨대, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨), 또는 아민 염기(예컨대, 트리에틸아민, 트리에탄올아민 등)와 같은 원하는 염기와 접촉시켜 제조될 수 있다. 폴리펩티드의 산부가염은 폴리펩티드를 1 이상의 당량의 무기 또는 유기산(예컨대, 염산)과 접촉시켜 제조될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 번역 후 변형(예컨대, 인산화 또는 글리코실화)에 관계없이 2개 이상의 서브유닛 아미노산의 화합물을 지칭한다. 서브유닛은 펩티드 결합 또는, 예컨대 에스테르 또는 에테르 결합과 같은 다른 결합에 의해 연결될 수 있다. 용어 "아미노산"은 D/L 광학 이성질체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.

폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된"은 폴리펩티드가 (1) 자연에서 발견되는 단백질과 회합되지 않거나, (2) 동일한 공급원의 다른 단백질이 없거나(예컨대, 인간 단백질이 없음), (3) 상이한 종의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 단리된 폴리펩티드는, 예컨대 합성 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 일부 조합을 포함하는 DNA 또는 RNA에 의해 코딩될 수 있다.

폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 폴리펩티드가 자연적으로 회합된 다른 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 및 핵산이 실질적으로 없음을 의미한다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 자연 환경에서 제거되고 적어도 60% 순수한 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 적어도 약 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 순수하거나, 또는 약 65 내지 75, 75 내지 80, 80 내지 85, 85 내지 90, 90 내지 95, 또는 95 내지 99% 순수할 수 있다. 전형적으로, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 비환원 폴리아크릴아미드 겔에서 단일 주요 밴드를 생성할 것이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 화학적으로 합성된 폴리펩티드일 수 있다.

실질적으로 순수한 폴리펩티드를 얻기 위해 임의의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 친화성 크로마토그래피 및 HPLC와 같은 일반적인 폴리펩티드 정제 기술 뿐만 아니라 폴리펩티드 합성 기술을 이용할 수 있다. 또한, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 얻기 위한 공급원으로 임의의 물질을 사용할 수 있다. 예컨대, 야생형 또는 트랜스제닉 동물로부터의 조직을 공급원 물질로 사용할 수 있다. 또한, 특정 폴리펩티드를 과발현하도록 조작된 조직 배양 세포를 사용하여 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 폴리펩티드가 친화성 매트릭스에 포획되도록 하는 아미노산 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예컨대, c-myc, 헤마글루티닌, 폴리히스티딘 또는 Flag™ 태그(Kodak)와 같은 태그를 사용하여 폴리펩티드 정제를 도울할 수 있다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단, 또는 그 사이를 포함하여 폴리펩티드 내 어디에서나 삽입될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 융합은 알칼리성 포스파타제와 같이 폴리펩티드의 검출을 돕는 효소를 포함한다.

MANP(예컨대, 서열번호 3에 대해 보존적 및/또는 비보존적 치환을 갖는 변이체 MANP) 뿐만 아니라 서열번호 3의 단편 또는 변이체 MANP(예컨대, 서열번호 3 내지 14 중 임의의 것의 단편) 14)는 다수의 검정 중 임의의 것을 이용하여 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예컨대, MANP의 활성은 배양된 세포(예컨대, 배양된 심장 섬유모세포, 대동맥 내피 세포 또는 사구체 세포)에서 cGMP 생산에 대한 효과를 시험하여 시험관내에서 평가될 수 있다. 세포는 MANP(예컨대, 10^-10 내지 10^-4 M의 MANP)에 노출될 수 있으며, 샘플을 검정하여 cGMP 생성에 대한 폴리펩티드의 효과를 평가할 수 있다. cGMP 생성은, 예컨대 경쟁적 RIA cGMP 키트(Perkin-Elmer, Boston, MA)를 사용하여 검출 및 측정될 수 있다.

MANP의 활성은 또한, 예컨대 혈장 cGMP 수준, 소변 cGMP 배설, cGMP의 순 신장 생성, 사구체 여과율, 혈압, 심박수, 심장 박출량과 같은 혈역학적 기능, 폐 쐐기 압력, 전신 혈관 저항성, 및 신장 혈류, 소변량, 및 포유동물(예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류, 개, 고양이)에 투여한 후 나트륨 배설률과 같은 신장 기능과 같은 인자에 대한 이의 효과를 시험하여 생체내에서 평가될 수 있다. 일부 경우에, 포유동물에서 고혈압을 유도한 후 이러한 파라미터를 평가할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "핵산"은 cDNA, 게놈 DNA 및 합성(예컨대, 화학적으로 합성된) DNA를 포함한 RNA 및 DNA 모두를 포괄한다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다.

핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된"은, 핵산이 유래되는 유기체의 자연 발생 게놈에서는 (하나는 5' 말단에서 및 하나는 3'에서) 바로 인접한 서열 둘 다와 바로 인접하지 않는 자연 발생 핵산을 지칭한다. 예컨대, 단리된 핵산은, 자연 발생 게놈에서 재조합 DNA 분자의 바로 측면에서 일반적으로 발견되는 핵산 서열 중 하나가 제거되거나 부재하는 경우, 제한없이 임의의 길이의 재조합 DNA 분자일 수 있다. 따라서, 단리된 핵산은 제한없이 다른 서열과 독립적으로 별도의 분자(예컨대, cDNA 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 게놈 DNA 단편)로 존재하는 재조합 DNA 뿐만 아니라 벡터, 자율 복제 플라스미드, 바이러스(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스), 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 통합된 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 단리된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산 서열의 일부인 재조합 DNA 분자를 포함할 수 있다.

핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된"은 또한 비천연 발생 핵산 서열이 자연에서 발견되지 않고 자연 발생 게놈에서 바로 인접한 서열을 갖지 않기 때문에 임의의 비천연 발생 핵산을 포함한다. 예컨대, 조작된 핵산과 같은 비천연 발생 핵산은 단리된 핵산으로 간주된다. 조작된 핵산은 일반적인 분자 클로닝 또는 화학적 핵산 합성 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 단리된 비천연 발생 핵산은 다른 서열과 독립적이거나 벡터, 자율 복제 플라스미드, 바이러스(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 또한, 비천연 발생 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산 서열의 일부인 핵산 분자를 포함할 수 있다.

예컨대, cDNA 또는 게놈 라이브러리, 또는 게놈 DNA 제한 분해물을 함유하는 겔 슬라이스 내의 수억 내지 수백만개의 다른 핵산 분자 사이에 존재하는 핵산은 단리된 핵산으로 간주되지 않는다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

일부 경우에, 단리된 핵산 분자는 적어도 약 12개 염기 길이(예컨대, 약 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 120, 130, 140, 150, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 염기 길이)일 수 있고, 하이브리드화 조건 하에서 MANP(예컨대, 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 MANP, 또는 이의 변이체)를 코딩하는 서열을 갖는 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥에 하이브리드화할 수 있다. 하이브리드화 조건은 적당히 또는 매우 엄격한 하이브리드화 조건일 수 있다.

본 문서의 목적 상, 적당히 엄격한 하이브리드화 조건은, 하이브리드화는 25 mM KPO₄(pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트(Denhart) 용액, 50 μg/mL 변성, 초음파 처리된 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드, 10% 덱스트란 술페이트, 및 1-15 ng/mL 프로브(약 5x10⁷ cpm/μg)를 함유하는 하이브리드화 용액에서 약 42℃에서 수행되고, 세척은 2X SSC 및 0.1% 나트륨 도데실 술페이트를 함유하는 세척 용액으로 약 50℃에서 수행됨을 의미한다.

매우 엄격한 하이브리드화 조건은, 하이브리드화는 25 mM KPO₄(pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트 용액, 50 μg/mL 변성, 초음파 처리된 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드, 10% 덱스트란 술페이트. 및 1-15 ng/mL 프로브(약 5x10⁷ cpm/μg)를 함유하는 하이브리드화 용액에서 약 42℃에서 수행되고, 세척은 0.2X SSC 및 0.1% 나트륨 도데실 술페이트를 포함하는 세척 용액으로 약 65℃에서 수행되는 것을 의미한다.

MANP를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 일반적인 분자 클로닝 및 화학적 핵산 합성 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 이용하여 본원에 제공된 나트륨이뇨 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단리된 핵산을 얻을 수 있다. PCR은 표적 핵산이 효소적으로 증폭되는 절차 또는 기술을 지칭한다. 관심 영역의 말단 또는 그 너머로부터의 서열 정보는 전형적으로 증폭될 템플릿의 반대 가닥과 서열이 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는 데 사용된다. PCR은 총 게놈 DNA 또는 총 세포 RNA로부터의 서열을 포함하여 DNA 뿐만 아니라 RNA로부터의 특정 서열을 증폭하는 데 이용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로 14 내지 40개의 뉴클레오티드 길이이지만, 10개 뉴클레오티드 내지 수백 개의 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 일반적인 PCR 기술은 예컨대 문헌(PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. by Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)에 기재되어 있다. RNA를 템플릿의 공급원으로 사용할 때, 역전사효소를 사용하여 상보적 DNA(cDNA) 가닥을 합성할 수 있다. 또한, 리가제 연쇄 반응, 가닥 변위 증폭, 자체 지속 서열 복제 또는 핵산 서열 기반 증폭을 이용하여 단리된 핵산을 얻을 수 있다. 예컨대, 문헌(Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878; and Weiss (1991) Science 254:1292)을 참조한다.

또한, MANP를 코딩하는 단리된 핵산은 단일 핵산 분자(예컨대, 포스포르아미다이트 기술을 이용하여 3'에서 5' 방향으로 자동화된 DNA 합성 이용) 또는 일련의 올리고뉴클레오티드로 화학적으로 합성될 수 있다. 예컨대, 원하는 서열을 함유하는 하나 이상의 긴 올리고뉴클레오티드 쌍(예컨대, >100개 뉴클레오티드)을 합성할 수 있으며, 각각의 쌍은 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐링될 때 듀플렉스가 형성되도록 짧은 상보성 분절(예컨대, 약 15개 뉴클레오티드)를 함유한다. DNA 폴리머라제는 올리고뉴클레오티드를 확장하는 데 사용되어 올리고뉴클레오티드 쌍당 단일 이중 가닥 핵산 분자를 생성한 다음 벡터에 리게이션될 수 있다.

또한, MANP를 코딩하는 단리된 핵산은 돌연변이유발에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 참조 서열은 PCR을 통한 올리고뉴클레오티드 지정된 돌연변이유발 및 부위 지정된 돌연변이유발을 포함하는 표준 기술을 이용하여 돌연변이될 수 있다. 문헌 (Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, edited by Ausubel et al., 1992)을 참조한다. 변이 나트륨이뇨 폴리펩티드의 비제한적인 예가 여기에 제공된다.

또한, 본원에 기재된 것과 같은 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. "벡터"는 삽입된 분절의 복제를 일으키기 위해 또 다른 DNA 분절이 삽입될 수 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터이고, "발현 조절 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 제어하고 조절하는 DNA 서열이다.

발현 벡터에서, 핵산(예컨대, 나트륨이뇨 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)은 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 본원에 사용된 "작동적으로 연결된"은 발현 제어 서열이 관심 코딩 서열의 발현을 효과적으로 제어하도록 유전자 구축물에 통합됨을 의미한다. 발현 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 영역을 포함한다. 프로모터는 전형적으로 전사가 시작되는 지점(일반적으로 RNA 폴리머라제 II의 개시 부위 근처) 상류의 100 내지 500개 뉴클레오티드 이내의 DNA 분자 영역으로 구성된 발현 제어 서열이다. 코딩 서열을 프로모터의 제어 하에 있게 하기 위해, 프로모터의 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 하류에 폴리펩티드의 번역 판독 프레임의 번역 개시 부위를 위치시키는 것이 필요하다. 인핸서는 시간, 위치 및 수준 측면에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리 인핸서는 전사 부위로부터 다양한 거리에 위치될 때 기능할 수 있다. 인핸서는 또한 전사 개시 부위 하류에 위치될 수 있다. 코딩 서열은 RNA 폴리머라제가 코딩 서열을 mRNA로 전사할 수 있을 때 세포에서 발현 제어 서열에 "작동가능하게 연결"되고 이의 "제어 하에" 있으며, 그 후 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역될 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 항체 뿐만 아니라 다른 다가 분자를 생산하는 데 유용할 수 있다.

적합한 발현 벡터는 제한없이 플라스미드 및 예컨대 박테리오파지, 배큘로바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 헤르페스 바이러스, 거대 세포 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련된 바이러스로부터 유래되는 바이러스 벡터를 포함한다. 노바겐(Novagen, Madison, WI), 클론텍(Clontech, Palo Alto, CA), 스트라타젠(Stratagene, La Jolla, CA), 및 인비트로겐/라이프 테크놀로지즈(Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA)와 같은 회사로부터 많은 벡터 및 발현 시스템이 상업적으로 이용 가능하다.

발현 벡터는 발현된 핵산 서열의 후속 조작(예컨대, 정제 또는 국소화)을 용이하게 하도록 설계된 태그 서열을 포함할 수 있다. 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 폴리히스티딘, c-myc, 헤마글루티닌 또는 Flag™ 태그(Kodak, New Haven, CT) 서열과 같은 태그 서열은 전형적으로 코딩된 폴리펩티드와 융합물로 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함하여 폴리펩티드 내의 어느 곳에나 삽입될 수 있다.

또한, 벡터를 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터(예컨대, MANP를 코딩하는 벡터)가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 "형질전환된"및 "형질감염된"은 다수의 기술 중 하나에 의해 핵산 분자(예컨대, 벡터)를 세포에 도입하는 것을 포괄한다. 특정 기술에 제한되지는 않지만, 이들 기술 중 다수는 당업계에 잘 확립되어 있다. 숙주 세포의 형질전환 및 형질감염에 적합한 방법은, 예컨대 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989))에서 찾을 수 있다. 예컨대, 인산칼슘 침전, 전기천공, 열 쇼크, 리포펙션, 마이크로주입 및 바이러스 매개된 핵산 전달을 이용하여 핵산을 세포에 도입할 수 있다. 또한, 네이키드 DNA는 다른 곳(미국 특허 번호 5,580,859 및 5,589,466)에서 기재되는 바와 같이 생체내에서 세포에 직접 전달될 수 있다. 숙주 세포는 코딩된 폴리펩티드를 발현할 수 있지만, 본원에 제공된 단리된 핵산 분자를 함유하는 세포가 폴리펩티드를 발현하는 데 필요하지 않다는 점에 주목한다. 숙주 세포로 형질전환된 단리된 핵산 분자는 세포의 게놈에 통합되거나 에피솜 상태로 유지될 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 본원에 제공된 단리된 핵산 분자를 함유하는 구축물로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다.

단리된 핵산 분자를 생체내 또는 시험관내에서 세포에 도입하기 위해 임의의 적절한 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 인산칼슘 침전, 전기천공, 열 쇼크, 리포펙션, 마이크로주입 및 바이러스 매개된 핵산 전달은 단리된 핵산 분자를 세포에 도입하는 데 이용할 수 있는 방법이다. 또한, 네이키드 DNA는 다른 곳(예컨대, 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,589,466, 및 이의 연속물)에서 기재되는 바와 같이 생체내에서 세포에 직접 전달될 수 있다. 또한, 단리된 핵산 분자는 트랜스제닉 동물을 생성함으로써 세포에 도입될 수 있다.

MANP를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 함유하는 세포를 확인하기 위해 임의의 적절한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 제한없이 노던 및 서던 분석과 같은 PCR 및 핵산 하이브리드화 기술을 포함한다. 일부 경우에, 면역조직화학 및 생화학적 기술을 이용하여 해당 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 검출함으로써 세포가 특정 단리된 핵산 분자를 함유하는지의 여부를 결정할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이 단리된 MANP, MANP를 코딩하는 핵산, 및 이뇨제는 고혈압(예컨대, RH)과 같은 병태를 갖는 것으로 확인된 포유동물을 치료하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 이뇨제 및 하나 이상의 MANP (또는 하나 이상의 MANP를 코딩하는 핵산)는 포유동물(예컨대, 고혈압, RH, 및/또는 심신 질환을 갖거나 가질 위험이 있는 포유동물)에게 투여하기 위한 조성물에 혼입될 수 있다. 임의의 적합한 방법을 이용하여 조성물을 제제화한 후 투여할 수 있다. 용량은 전형적으로 투여되는 작용제(들)에 대한 포유동물의 반응성에 의존하며, 치료 과정은 수일 내지 수개월 또는 그 초과로 지속되거나 적절한 반응이 달성될 때까지 지속된다. 당업자는 최적 용량, 투여 방법 및 반복률을 일상적으로 결정한다. 최적 용량은 각각의 작용제(예컨대, MANP 및 Fs)의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 시험관내 및/또는 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC₅₀을 기준으로 추정될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 MANP 및 하나 이상의 이뇨제를 함유하는 조성물은 매일, 매주, 매월 1회 이상 제공될 수 있거나 더 적은 빈도로 제공될 수 있거나, 일정 기간(예컨대, 시간, 일 또는 주) 동안 연속해서 투여될 수 있다. 예컨대, MANP 또는 MANP를 함유하는 조성물은 적어도 약 0.01 ng MANP/kg 내지 약 100 mg MANP/kg 체질량의 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, MANP 또는 MANP를 함유하는 조성물은 1 내지 30일 또는 그 초과 동안 (예컨대, 약 1 pmol MANP/kg/분 내지 약 500 nmol MANP/kg/분의 용량으로) 주입으로 투여될 수 있다.

하나 이상의 MANP 또는 하나 이상의 MANP를 코딩하는 핵산, 및 하나 이상의 이뇨제는 서로 및/또는 예컨대 리포솜, 수용체 또는 세포 표적 분자, 또는 섭취, 분배 및/또는 흡수를 돕기 위한 경구, 국소 또는 다른 제제와 같은 다른 분자, 분자 구조물, 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리 회합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 MANP (또는 MANP를 코딩하는 핵산), 이뇨제, 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 예컨대 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제, 또는 폴리펩티드 및/또는 다른 화합물을 대상체에게 전달하기 위한 임의의 다른 약리학적 비활성 비히클을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 액체 또는 고체일 수 있으며, 하나 이상의 치료 화합물 및 주어진 약제학적 조성물의 임의의 다른 화합물과 조합될 때 원하는 부피, 일관성 및 다른 관련 수송 및 화학적 특성을 제공하기 위해 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택될 수 있다. 유용한 약제학적으로 허용되는 담체는 제한없이 물; 식염수 용액; 결합제(예컨대, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예컨대, 락토스 또는 덱스트로스 및 다른 당, 젤라틴 또는 황산칼슘); 윤활제(예컨대, 전분, 폴리에틸렌 글리콜 또는 나트륨 아세테이트); 붕해제(예컨대, 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 및 습윤제(예컨대, 나트륨 라우릴 술페이트)를 포함한다.

MANP 또는 핵산 및 이뇨제는 동일한 조성물 내에 존재할 수 있거나, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되고 동일한 경로 또는 별도의 경로를 통해 투여되는 별도의 조성물에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 MANP 및 이뇨제를 함유하는 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부에 따라 다수의 방법으로 투여될 수 있다. 예컨대, 경구 또는 비경구(예컨대, 피하, 척수강내, 심실내, 근육내 또는 복강내 주사에 의한, 또는 정맥내(i.v.) 점적주입에 의한) 투여일 수 있다. 투여는 (예컨대, 주사에 의해) 빠를 수 있거나, (예컨대, 느린 주입 또는 느린 방출 제제의 투여에 의해) 일정 기간에 걸쳐 발생할 수 있다.

비경구, 척수강내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제는 멸균 수용액(예컨대, 멸균 생리 식염수)을 포함하며, 이는 또한 버퍼, 희석제 및 다른 적합한 첨가제(예컨대, 침투 증강제, 캐리어 화합물 및 다른 약제학적으로 허용되는 담체)를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 조성물 및 제제는, 예컨대 분말 또는 과립, 물 또는 비수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사셰 또는 정제를 포함한다. 이러한 조성물은 또한 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제를 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 용액, 에멀젼, 수성 현탁액 및 리포솜 함유 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 조성물은, 예컨대 미리 형성된 액체, 자기 유화 고체 및 자기 유화 반고체를 포함하는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. 에멀젼 제제는 제제의 용이성 및 가용화, 흡수 및 생체이용률의 효능으로 인해 치료 조성물의 경구 전달에 특히 유용하다. 리포솜은 약물 전달의 관점에서 볼 때 그들이 제공하는 특이성 및 작용 지속기간으로 인해 특히 유용할 수 있다.

조성물은 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 대상체에게 투여 시 관련 화합물(예컨대, MANP 또는 이뇨제)에 대한 생물학적 활성 대사산물 또는 그의 잔기를 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 함유할 수 있다. 따라서, 예컨대, 본 문서는 MANP 및 이뇨제의 약제학적으로 허용되는 염, 프로드럭 및 이러한 프로드럭의 약제학적으로 허용되는 염, 및 다른 생물학적 등가물을 제공한다. 프로드럭은 비활성 형태로 제조되고 내인성 효소 또는 다른 화학물질의 작용 및/또는 조건에 의해 신체 또는 이의 세포 내에서 활성 형태(즉, 약물)로 전환되는 치료제이다. 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본원에 제공된 방법에 유용한 MANP 및 이뇨제의 생리학적 및 약제학적으로 허용되는 염(즉, 원하지 않는 독성 효과를 부여하지 않고 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하는 염)을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 양이온(예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 또는 스페르민과 같은 폴리아민)으로 형성된 염; 무기산(예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 또는 질산)으로 형성된 산부가염; 유기산(예컨대, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 팔미트산 또는 푸마르산)으로 형성된 염; 및 원소 음이온(예컨대, 브롬, 요오드 또는 염소)으로 형성된 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

조성물은 추가로 약제학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 보조 성분을 함유할 수 있다. 따라서, 조성물은 또한, 예컨대 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 적합한 약제학적 활성 물질, 또는 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제, 및 안정화제와 같은 조성물의 다양한 제형을 물리적으로 제제화하는 데 유용한 추가 물질을 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 보조제, 예컨대 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 버퍼, 착색제, 향미제, 침투 향상제, 및 방향족 물질과 혼합될 수 있다. 그러나, 첨가될 때 이러한 물질은 조성물 내 다른 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안된다.

일부 경우에, MANP는 지속 방출 제형으로 제제화될 수 있다. 예컨대, MANP 또는 이뇨제는 제어 방출 제제로 제제화될 수 있다. 일부 경우에, 코팅, 외피 또는 보호 매트릭스는 본원에 기재된 하나 이상의 MANP를 함유하도록 제제화될 수 있다. 이러한 코팅, 외피 및 보호 매트릭스는 스텐트, 카테터 및 복막 투석 튜빙과 같은 유치 장치를 코팅하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 중합체성 물질, 리포솜, 마이크로에멀젼, 마이크로입자, 나노입자 또는 왁스에 혼입될 수 있다.

단위 제형으로 편리하게 제공될 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 제제는 제약 산업에 공지된 통상적인 기술을 포함하는 임의의 적합한 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분(들)을 원하는 약제학적 담체(들)와 회합시키는 단계를 포함한다. 전형적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 회합시키고, 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써 제조될 수 있다. 멸균 방법이 제제에 함유된 분자(들)의 효과를 방해하지 않는 한, 원하는 경우, 제제는 멸균될 수 있다.

일부 실시양태에서, MANP 및/또는 Fs와 같은 이뇨제는 주사, 데포 중합체, 약물 패치, 펌프 또는 마이크로입자/나노입자를 통한 피하 전달을 위해 제제화될 수 있다. 예로서 제한없이, PCT 공개 번호 WO 2008/061355는 하이드로겔 튜브에서 전달하기 위한 폴리펩티드를 제제화하기 위한 물질 및 방법을 개시한다. 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되고 본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 양으로 폴리펩티드와 양립할 수 있는 하나 이상의 부형제와 혼합될 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드는 제한없이 미세결정질 셀룰로스, 콜로이드성 이산화규소, 락토스, 전분, 소르비톨, 사이클로덱스트린 및 이들의 조합과 같은 하나 이상의 부형제와 조합될 수 있다. 부형제는 폴리펩티드에 대해 비히클, 담체 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하이드로겔 튜브에 삽입하기 전에 하나 이상의 부형제와 함께 압축, 압밀 또는 압출될 수 있다. 이러한 제제는 바람직한 방출 특성, 개선된 안정성 및/또는 다른 바람직한 특성을 갖는 약제학적 조성물을 생성할 수 있다.

약제학적 조성물은 또한 활택제, 용해제, 계면활성제, 희석제, 결합제, 붕해제 및/또는 윤활제와 같은 보조제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 예컨대, 용해제는 투여 제제로부터 폴리펩티드의 용해 속도를 증가시킬 수 있고, 예컨대 유기산 및/또는 유기산의 염(예컨대, 시트르산과 나트륨 시트레이트)을 포함할 수 있다. 이러한 제제에 유용한 부형제의 다른 예는 합성, 반합성, 개질 및 천연 중합체(예컨대, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, PEG, 사이클로덱스트린, 알콕시 개질된 사이클로덱스트린, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 알부민, 덱스트란, 말리톨, 자일리톨, 카올린 및 메틸 셀룰로스)를 포함한다. 폴리펩티드는 또한 윤활제(예컨대, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 미네랄 오일, 칼슘 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 나트륨 벤조에이트, 염화나트륨, 루신 카르보왁스, 마그네슘 라우릴 술페이트, 또는 글리세릴 모노스테아레이트), 습윤제, 유화제 및 현탁제, 또는 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필 하이드록시벤조에이트)와 혼합될 수 있다.

약제학적 조성물에 첨가될 수 있는 다른 작용제는 용해 및 MANP 또는 이뇨 화합물의 치료학적 유효 혈장 농도 프로파일의 확립 시 마이크로환경의 pH를 변경할 수 있다. 이러한 작용제는 무기산의 염 및 수산화마그네슘을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 작용제는 계면활성제 및 다른 가용화 물질을 포함한다.

유용한 희석제는, 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 락토스, 수크로스, 프룩토스, 글루코스 덱스트로스, 또는 다른 당, 이염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 셀룰로스, 에틸셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 카올린, 만니톨, 락티톨, 말티톨, 자일리톨, 소르비톨, 또는 다른 당 알코올, 건조 전분, 당류, 덱스트린, 말토덱스트린 또는 다른 다당류, 이노시톨 또는 이들의 조합과 같은 약제학적으로 허용되는 비활성 충전제를 포함한다. 일부 경우에, 수용성 희석제가 특히 유용할 수 있다.

활택제는 가공 중 조성물 성분의 유동 및 압축성을 개선하는 데 사용할 수 있다. 유용한 활택제는, 예컨대 콜로이드성 이산화규소(콜로이드성 실리카, 훈증 실리카, 경질 무수 규산, 규산 무수물, 및 훈증 이산화규소로도 지칭됨)를 포함한다.

본원에 기재된 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 계면활성제는 제한없이 나트륨 라우릴 술페이트, 폴리에틸렌 스테아레이트, 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 벤질 벤조에이트, 세트리미드, 세틸 알코올, 도쿠세이트 나트륨, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 레시틴, 중쇄 트리글리세라이드, 모노에탄올 아민, 올레산, 폴록사머, 폴리비닐 알코올 및 소르비탄 지방산 에스테르를 포함한다.

붕해제는, 예컨대 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스포비돈, 크로스카멜로스, 미세결정질 셀룰로스, 저치환된 하이드록시프로필 셀룰로스, 펙틴, 칼륨 메타크릴레이트-디비닐벤젠 공중합체, 폴리비닐 알코올, 틸라미드, 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 전분 유도체, 덱스트린, 베타 사이클로덱스트린, 덱스트린 유도체, 산화마그네슘, 점토, 벤토나이트, 및 이들의 조합을 포함한다.

일부 실시양태에서, MANP 및/또는 이뇨제는 하이드로겔 전달 시스템에 혼입될 수 있다. 예컨대, MANP는 연장된 기간에 걸쳐 연속적으로 지속되는 방식으로 폴리펩티드를 방출할 수 있는 제로겔-하이드로겔 시스템을 통해 환자에게 피하 전달을 위해 제제화될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,226,325 및 PCT 공개 번호 WO 2004/071736을 참조한다.

하이드로겔 튜브의 제조에 유용한 액체 중합 가능한 물질은 다양한 중합 가능한 친수성 및 에틸렌계 불포화 화합물을 포함한다. 예컨대, PCT 공개 번호 WO 2008/061355에 열거된 화합물을 참조한다. 이러한 친수성 단량체의 혼합물은 전형적으로 중합 반응에 사용된다. 단량체의 유형 및 비율은 수화 시 고려되는 적용 또는 사용을 위한 원하는 특징(예컨대, 평형 수분 함량(EWC) 값 및/또는 기공 크기)을 갖는 중합체(예컨대, 가교결합된 균질 중합체)를 생성하도록 선택된다.

일부 경우에, 친수성 단량체 혼합물의 중합은 수성 매질에 다양한 정도로 용해되는 균질한 친수성 공중합체를 생성할 수 있다. 이러한 경우, 소량(예컨대, 최대 약 3%)의 공중합 가능한 폴리에틸렌계 불포화 가교결합제를 단량체 혼합물에 포함시켜 수불용성일 뿐만 아니라 수팽윤성인 균질한 가교결합된 공중합체를 얻을 수 있다. (하이드록시에틸)메타크릴레이트(HEMA)의 약간 가교결합된 단독중합체는 약 38%의 EWC 값을 갖는다. HEMA 및 N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드(HPMA)의 가교결합 공중합체는 EWC 값이 38% 미만인 반면, HEMA 및 아크릴아미드의 가교결합 공중합체는 38 w/v% 초과의 EWC 값을 나타낸다. 따라서, 폴리펩티드의 유용하거나 효과적인 용출 속도에 따라, 공중합체 하이드로겔은 원하는 속도로 폴리펩티드를 용출하도록 맞춤화될 수 있다. 전형적으로, 공중합체는 약 15 내지 약 70 중량%의 HEMA 단위 및 약 85 내지 30 중량%의 제2 에틸렌성 단량체를 함유하므로 약 20% 내지 약 75% 범위의 EWC 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 공중합체의 혼합물은 소량의 폴리에틸렌계 불포화 가교결합제[예컨대, 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트("EDMA") 또는 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트("TMPTMA")]를 추가로 함유할 수 있다.

일부 실시양태에서, 대상체에서 MANP의 제어 방출 전달을 위한 약제학적 조성물은 (a) 폴리펩티드의 복합체(폴리펩티드가 하나 이상의 염기성 작용기를 갖는 경우) 및 헥사하이드록시사이클로헥산으로부터 유래된 폴리음이온(폴리음이온이 적어도 2개의 음으로 하전된 작용기를 갖는 경우)의 복합체; 및 (b) 생분해성의 수불용성 중합체를 함유하는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 예컨대 PCT 공개 번호 WO 2006/017852에 기재되어 있으며, 예컨대 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 점적제, 에어로졸, 크림, 반고체, 페이스트, 캡슐, 정제, 고체 임플란트, 또는 마이크로입자의 형태로 제조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "제어 방출 전달"은 투여 후 일정 기간(예컨대, 수일 내지 수주 또는 수개월)에 걸쳐 생체내에서 약제의 연속 전달을 지칭한다. MANP의 지속적인 제어 방출 전달은, 예컨대 시간 경과에 따른 폴리펩티드의 연속적인 치료 효과(예컨대, 시간 경과에 따른 증상의 연속적인 감소)에 의해 입증될 수 있다. 폴리펩티드의 지속적인 전달은 또한 시간이 경과에 따라 생체내에서 폴리펩티드의 존재를 검출함으로써 입증될 수 있다. 조성물은 낮은 초기 파열 전달을 제공한 다음, 장기간(예컨대, 수일 내지 수개월) 동안 생체내에서 안정적이고 제어된 폴리펩티드 방출을 제공할 수 있다.

이러한 실시양태에서, 물리적 및 화학적으로 안정한 복합체는 폴리펩티드 및 폴리음이온의 적절한 조합 시 형성될 수 있다. 복합체는 폴리펩티드의 수성 제제와 폴리음이온을 조합할 때 생성되는 침전물의 형태를 취할 수 있다. 임의적으로, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제가 복합체에 혼입될 수 있다. 이러한 부형제는 폴리펩티드 및/또는 복합체에 대한 안정화제로서 기능할 수 있다. 적합한 부형제의 비제한적인 예는 중아황산나트륨, p-아미노벤조산, 티오우레아, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 수크로스 및 PEG를 포함한다.

폴리펩티드와 폴리음이온 사이의 안정한 복합체는 임의적으로 하나 이상의 부형제와 함께 생분해성의 수불용성 중합체를 함유하는 약제학적으로 허용되는 담체에 혼입될 수 있다. 용어 "생분해성의 수불용성 중합체"는 생체내에서 사용될 수 있는 생체적합성 및/또는 생분해성 합성 및 천연 중합체를 지칭한다. 용어는 또한 37℃에서 물 또는 생물학적 유체에 불용성이거나 불용성이 되는 중합체를 포함하는 것을 의미한다. 중합체는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 (예컨대, 단량체 및 올리고머를 제거하기 위해) 정제될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 4,728,721을 참조한다. 유용한 중합체의 예는 제한없이 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리카르보네이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리무수물, 폴리아미드, 폴리에스테르아미드, 폴리우레탄, 폴리아세탈, 폴리오르토카르보네이트, 폴리포스파젠, 폴리하이드록시발레레이트, 폴리알킬렌 숙시네이트, 및 폴리오르토에스테르, 및 이들의 공중합체, 블록 공중합체, 분지형 공중합체, 삼원공중합체, 및 조합을 포함한다.

생분해성의 수불용성 중합체는 또한 말단 캡핑, 말단 비캡핑, 또는 말단 캡핑 및 말단 비캡핑 중합체의 혼합물을 포함할 수 있다. 말단 캡핑된 중합체는 일반적으로 캡핑된 카르복실 말단기를 갖는 것으로 정의되고, 비캡핑된 중합체는 유리 카르복실 말단기를 갖는다.

중합체에 적합한 분자량을 결정할 때 고려할 인자는 원하는 중합체 분해 속도, 기계적 강도 및 용매에서 중합체 용해 속도를 포함할 수 있다. 중합체에 유용한 분자량은 사용을 위해 선택된 중합체에 따라, 예컨대 1.1 내지 2.8의 다분산도를 갖는 약 2,000 달톤 내지 약 150,000 달톤일 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 주사용 용액 또는 현탁액, 입자, 필름, 펠릿, 실린더, 디스크, 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 나노스피어, 마이크로입자, 웨이퍼, 미셀, 리포솜 또는 약물 전달에 유용한 다른 중합체 구성의 형태에서 환경 반응 특성(예컨대, 열민감성, pH 민감성 또는 전기 민감성)을 갖는 담체일 수 있다.

다양한 약제학적으로 허용되는 중합체 담체를 형성하는 방법은 당업계에 공지된 것을 포함한다. 예컨대, 미국 특허 번호 6,410,044; 5,698,213; 6,312,679; 5,410,016; 5.529,914; 5,501,863; 4,938,763; 5,278,201; 및 5,278,202; 및 PCT 공개 번호 WO 93/16687을 참조한다.

폴리펩티드/폴리음이온 복합체가 중합체 매트릭스에 분산되어 고체 임플란트를 형성할 때 조성물이 생성될 수 있으며, 이는 대상체에게 주사되거나 이식될 수 있다. 이러한 임플란트는, 예컨대 압출, 압축 성형 및 사출 성형과 같은 통상적인 중합체 용융 가공 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 임플란트의 제조는 무균 조건 하에서 또는 대안적으로 조사(예컨대, 감마 조사 또는 전자 빔 멸균 이용)에 의한 최종 멸균에 의해 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 마이크로스피어 형태의 조성물은 상이한 생물학적 환경으로의 전달에 적합하거나 특정 기능을 수행하는 데 적합한 특성을 갖는 다양한 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체를 사용하여 중합체 담체에 폴리펩티드/폴리음이온 복합체를 캡슐화함으로써 생성될 수 있다. 용해 속도 및 따라서 폴리펩티드의 전달은 캡슐화 기술, 중합체 조성, 중합체 가교결합, 중합체 두께, 중합체 용해도 및 폴리펩티드/폴리음이온 복합체의 크기 및 용해도와 같은 요인에 의해 결정된다.

이러한 마이크로스피어를 제조하기 위해, 캡슐화될 폴리펩티드/폴리음이온 복합체를 유기 용매의 중합체 용액에 현탁시켜 중합체 용액이 폴리펩티드/폴리음이온 복합체를 완전히 코팅할 수 있다. 이어서, 현탁액은 분무 건조, 분무 동결, 에멀젼 또는 용매 증발 에멀젼과 같은 마이크로캡슐화 기술을 적용할 수 있다. 예컨대, 유기 용매에서 중합체와 함께 현탁된 복합체 또는 마이크로입자는 유화제를 함유하는 더 큰 부피의 수용액으로 옮겨져 유기 용매가 중합체로부터 증발하거나 확산되고 고화된 중합체가 폴리펩티드/폴리음이온 복합체를 캡슐화할 수 있다.

캡슐화된 폴리펩티드/폴리음이온 복합체를 제조하는 데 유용한 유화제는, 예컨대 폴록사머 및 폴리비닐 알코올을 포함한다. 이러한 방법에 유용한 유기 용매는 아세트산, 아세톤, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 중합체의 특성에 의존할 다른 비독성 용매를 포함한다. 중합체를 용해시키고 궁극적으로 무독성인 용매가 전형적으로 선택된다.

일부 실시양태에서, MANP는 지속적으로 높은 노출 수준을 제공할 수 있고 (짧은 지연 단계와 함께 또는 지연 단계 없이) 높은 노출 수준에 빠르게 도달할 수 있는 데포로 제제화될 수 있다. 예컨대, 미국 공개 번호 2010/0266704를 참조한다. 데포 제제는 MANP 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예컨대, 무기산, 중합체 산 또는 유기산과의 산부가염)을 포함할 수 있다. 산부가염은 1 또는 2개의 산 등가물이 추가되는지의 여부에 따라 1가 또는 2가 염으로 존재할 수 있다.

미국 공개 번호 2010/0266704에 기재된 바와 같이, 데포 제제는 85:15 내지 65:35의 락타이드:글리콜라이드 공단량체(L:G)의 몰비를 갖는 2개의 상이한 선형 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 중합체를 함유할 수 있으며, 여기서 중합체 중 적어도 하나는 고유 점도가 낮다. 이러한 제제는 연장된 기간 동안 폴리펩티드의 지속적으로 높은 혈장 수준을 제공할 수 있다. 적합한 중합체의 예는 각각 베링거 인겔하임 파르마 게엠베하 & 코. 카게(Boehringer Ingelheim Pharma GmBH & Co. KG , Ingelheim, Germany), 앱소버블 폴리머스 인터내셔날(Absorbable Polymers International, Pelham, AL), 및 알케르메스, 인크.(Alkermes, Inc., Cambridge, MA)에 의해 상품명 RESOMER^®, LACTEL^®, 및 MEDISORB^®로 판매되는 선형 폴리(D,L-락타이드) 및 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드) 중합체를 포함한다.

피하 투여를 위한 높은 노출 데포 제제는 즉각적인 또는 적어도 매우 빠른 작용을 보여 짧은 시간(예컨대, 피하 주사 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일)에 치료 혈장 농도를 달성하거나, 약 1개월 이상에 걸쳐 지속적으로 높은 노출 수준을 나타낼 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 데포 제제는 95:5 내지 50:50의 % wt 비율(예컨대, 85:15 내지 50:50, 80:20 내지 60:40, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45 또는 50:50% wt)로 혼합 또는 블렌딩된 2개의 상이한 PLGA 중합체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 높은 고유 점도를 갖는 중합체는 더 낮은 고유 점도를 갖는 중합체보다 더 높은 % wt를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 높은 고유 점도를 갖는 중합체는 에스테르 말단기를 가질 수 있다. 데포 제제는 유리한 PK 특성을 보유하는 경우 다른 선형 또는 별 모양 PLGA 중합체, 또는 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLG) 또는 폴리락트산(PLA) 중합체를 포함한 추가의 중합체를 함유할 수 있다.

데포 제제의 폴리펩티드 함량(로딩량)은 1% 내지 30%(예컨대, 10% 내지 25%,보다 바람직하게는 15% 내지 20%) 범위일 수 있다. 로딩량은 PLGA 제제의 총 질량에 대한 폴리펩티드의 중량비로 정의된다.

데포 조성물은 무균적으로 제조될 수 있거나, 비무균적으로 제조되고 최종적으로 (예컨대, 감마선 조사를 사용하여) 멸균될 수 있다. 최종 멸균은 가능한 최고의 멸균 보증을 제공하는 생성물을 초래할 수 있다.

데포 조성물은 또한 폴리펩티드의 방출 거동을 조정할 수 있는 하나 이상의 약제학적 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 약 0.1% 내지 약 50%의 양으로 조성물에 존재할 수 있다. 적합한 부형제는 제한없이 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 덱스트린, PEG, 계면활성제, 예컨대 폴록사머(폴리(옥시에틸렌-블록-옥시프로필렌)으로도 공지됨), 상품명 TWEEN^®으로 상업적으로 이용 가능한 폴리(옥시에틸렌)-소르비탄-지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 레시틴, 무기염, 예컨대 탄산아연, 수산화마그네슘, 탄산마그네슘, 프로타민, 및 아민 잔기를 갖는 천연 또는 합성 중합체, 예컨대 폴리리신을 포함한다.

데포 조성물은 조성물, 분자량 및/또는 중합체 구조 측면에서 상이한 중합체의 혼합물 또는 블렌드를 함유할 수 있다. 중합체 블렌드는 본원에서 하나의 임플란트 또는 마이크로입자에서 2개의 상이한 선형 중합체의 고용체 또는 현탁액으로 정의된다. 데포 혼합물은 본원에서 각각의 데포에 하나 이상의 PLGA를 갖는 상이한 조성의 2개의 데포-유사 임플란트 또는 마이크로입자 또는 반고체 제제의 혼합물로 정의된다. 2개의 PLGA가 중합체 블렌드로 존재하는 약제학적 데포 조성물이 특히 유용할 수 있다.

약제학적 데포 조성물은 주사되면 그 자리에서 고형화되는 임플란트, 반고체(겔), 액체 용액, 마이크로입자 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 하기 단락은 중합체 마이크로입자에 초점을 맞추지만 설명은 임플란트, 반고체 및 액체에도 적용 가능하다.

마이크로입자는 수 서브마이크론에서 수 밀리미터(예컨대, 약 0.01 마이크론 내지 약 2 mm, 약 0.1 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 10 내지 약 200 마이크론, 약 10 내지 약 130 마이크론, 또는 약 10 마이크론)의 직경을 가질 수 있다. 약 90 마이크론).

일부 실시양태에서, 마이크로입자는 응집방지제와 혼합되거나 이로 코팅될 수 있다. 적합한 응집방지제는, 예컨대 만니톨, 글루코스, 덱스트로스, 수크로스, 염화나트륨, 및 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 및 PEG와 같은 수용성 중합체를 포함한다.

마이크로입자는 코아세르베이션 또는 상 분리, 분무 건조, 또는 유중수(W/O), 수중유중수(W/O/W), 또는 수중유중고체(S/O/W) 에멀젼/현탁 방법에 이어 용매 추출 또는 용매 증발과 같은 당업계에 공지된 공정을 이용하여 제조될 수 있다. 에멀젼/현탁 방법이 특히 유용할 수 있으며, 하기 단계를 포함할 수 있다:

(i) (a) 적합한 유기 용매(예컨대, 에틸 아세테이트, 아세톤, THF, 아세토니트릴, 또는 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 헥사플루오로이소프로판올과 같은 할로겐화 탄화수소) 또는 용매 혼합물에 중합체 또는 중합체들을 용해시키고, 임의적으로 적합한 첨가제를 용해/분산시키고;

(b) 단계 (a)에서 얻은 중합체 용액에 폴리펩티드를 용해/현탁/유화시키는 것을 포함하는, 내부 유기상을 제조하는 단계:;

(ii) 하나 이상의 안정화제(예컨대, 폴리(비닐알코올), 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 폴리(비닐피롤리돈) 또는 젤라틴) 및 임의적으로 버퍼 염을 함유하는 외부 수성상을 제조하는 단계;

(iii) 내부 유기상을 외부 수성상과 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및

(iv) 용매 증발 또는 용매 추출에 의한 마이크로입자를 경화시키고, (예컨대, 물로) 마이크로입자를 세척하고, (예컨대, 동결 건조 또는 진공 하의 건조에 의해) 마이크로입자를 수집 및 건조시키고, 마이크로입자를 체질(예컨대, 140 μm)하는 단계.

건조 마이크로입자 조성물은 벌크로 또는 최종 용기에 분배한 후에 감마선 조사에 의해 최종적으로 멸균될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벌크 멸균된 마이크로입자는 적합한 비히클에 재현탁될 수 있고 후속 동결 건조와 함께 이중 챔버 주사기와 같은 적합한 장치에 분배될 수 있다.

일부 실시양태에서, 마이크로입자 데포 조성물은 재구성을 용이하게 하는 비히클을 포함할 수 있다. 추가로, 투여 전에, 마이크로입자는 주사에 적합한 비히클(예컨대, 하나 이상의 약제학적 부형제, 예컨대 만니톨, 염화나트륨, 글루코스, 덱스트로스, 수크로스, 또는 글리세린, 및/또는 하나 이상의 비이온성 게면활성제, 예컨대 폴록사머, 폴리(에틸렌)-소르비탄-지방산 에스테르, 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 소르비톨, 폴리(비닐피롤리돈), 또는 알루미늄 모노스테아레이트를 포함하는 물 기반 비히클)에 현탁될 수 있다.

본 문서는 또한 심혈관 장애(예컨대, 고혈압, 저항성 고혈압 또는 심근경색)를 갖는 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 본원에 제공된 MANP 및 이뇨제를 (예컨대, 경구, 비경구 또는 경구와 비경구 방법의 조합으로) 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 치료는 장애와 관련된 하나 이상의 증상, 또는 장애의 하나 이상의 기저 원인에 유익하게 영향을 미치거나 이를 완화시킬 수 있다. 예컨대, 치료는 포유동물의 혈압을 낮출 수 있다.

포유동물에게 MANP 또는 핵산 및 이뇨제, 또는 MANP 및 이뇨제를 함유하는 하나 이상의 조성물을 투여하기 전에, 포유동물은 고혈압(예컨대, RH)와 같은 심혈관 질환의 치료가 필요한지의 여부를 결정하기 위해 포유동물을 평가될 수 있다. 이러한 치료가 필요한 것으로 포유동물을 확인한 후, 포유동물은 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 치료될 수 있다. 예컨대, MANP를 함유하는 조성물은 원하는 결과를 달성하기에(예컨대, 포유동물의 혈압을 낮추거나, 포유동물의 혈압의 추가 상승을 예방 또는 지연시키기에) 효과적인 임의의 양, 임의의 빈도, 및 임의의 기간 동안 포유동물에게 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, MANP를 함유하는 조성물은 다른 용량도 유익한 결과를 제공할 수 있지만 약 0.01 ng 폴리펩티드/체질량 kg 내지 약 100 mg 폴리펩티드/체질량 kg(예컨대, 약 10 ng 폴리펩티드/kg 내지 약 50 mg 폴리펩티드/kg, 약 20 ng 폴리펩티드/kg 내지 약 10 mg 폴리펩티드/kg, 약 0.1 ng 폴리펩티드/kg 내지 약 20 ng 폴리펩티드/kg, 약 3 ng 폴리펩티드/kg 내지 약 10 ng 폴리펩티드/kg, 약 10 ng/폴리펩티드/kg 내지 약 50 ng 폴리펩티드/kg, 약 50 ng 폴리펩티드/kg 내지 약 100 μg 폴리펩티드/kg, 약 1 μg 폴리펩티드/kg 내지 약 10 μg 폴리펩티드/kg, 약 1 μg 폴리펩티드/kg 내지 약 5 μg 폴리펩티드/kg, 약 3 μg 폴리펩티드/kg 내지 약 7 μg 폴리펩티드/kg, 약 5 μg 폴리펩티드/kg 내지 약 10 μg 폴리펩티드/kg, 약 10 μg 폴리펩티드/kg 내지 약 20 μg 폴리펩티드/kg, 또는 약 20 μg 폴리펩티드/kg 내지 약 100 μg 폴리펩티드/체질량 kg)의 용량으로 비경구로(예컨대, 피하 주사와 같은 주사 또는 경구 섭취에 의해) 투여될 수 있다. 일부 경우에, MANP는, 예컨대 약 1 pmol/kg/분 내지 약 500 nmol/kg/분(예컨대, 약 1 내지 10 pmol/kg/분, 약 10 내지 100 pmol/kg/분, 약 100 내지 300 pmol/kg/분, 약 250 내지 500 pmol/ kg/분, 약 500 pmol/kg/분 내지 약 1 nmol/kg/분, 약 1 내지 10 nmol/kg/분, 약 10 내지 100 nmol/kg/분, 약 100 내지 300 nmol/kg/분, 또는 약 250 내지 500 nmol/kg/분)의 용량으로 주입에 의해 투여될 수 있다.

이뇨제는 다른 용량도 유익한 결과를 제공할 수 있지만 적어도 약 1 μg/kg 내지 약 500 mg/체질량 kg(예컨대, 약 1 내지 10 μg/kg, 약 10 내지 50 μg/kg, 약 50 내지 100 μg/kg, 약 100 내지 500 μg/kg, 약 500 μg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 약 5 내지 10 mg/kg, 약 10 내지 50 mg/kg, 약 50 내지 100 mg/kg, 또는 약 100 내지 500 mg/체질량 kg)의 용량으로 투여될 수 있다. 이뇨제의 용량은 MANP의 강화 효과를 고려할 때 시간 경과에 따라 감소될 수 있다. 따라서, 이뇨제는 처음에 약 1 내지 5 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있지만, 시간 경과에 따라 용량을 낮출 수 있다.

MANP 및 이뇨제는 1회(예컨대, 데포 조성물의 이식 또는 주사에 의해) 또는 1회 이상(예컨대, 반복 주사 또는 경구 투여에 의해) 투여될 수 있다. 1회 초과로 투여될 때, 투여 빈도는 1일 1회 이상(예컨대, 1일 1회, 2회, 3회, 4회 또는 그 초과) 내지 2개월에 약 1회(예컨대, 1주일에 3회 내지 5회, 1주일에 약 1회, 1개월에 약 2회, 1개월에 약 1회, 또는 2개월에 약 1회)의 범위일 수 있다. 또한, 투여 빈도는 일정하게 유지되거나 치료 기간 동안 가변적일 수 있다. 다양한 요인이 특정 적용에 사용되는 실제 투여 빈도에 영향을 줄 수 있다. 예컨대, 유효량, 치료 기간, 투여 경로, 및 병태의 중증도는 투여 빈도의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.

일부 실시양태에서, MANP 나트륨이뇨 폴리펩티드 또는 MANP를 함유하는 조성물은 제1 기간 동안 제1 경로(예컨대, 정맥내)를 통해 투여될 수 있고, 이어서 제2 기간 동안 또 다른 경로(예컨대, 피하)를 통해 투여될 수 있다. 예컨대, MANP를 함유하는 조성물은 포유동물(예컨대, 인간)에게 약 1 pmol/kg/분 내지 약 500 nmol/kg/분의 용량으로 1시간 내지 7일(예컨대, 1시간 내지 2시간, 2 내지 4시간, 4 내지 6시간, 6 내지 8시간, 8 내지 12시간, 12 내지 24시간, 24 내지 48시간, 48 내지 36시간, 3 내지 4일, 4 내지 5일, 5 내지 6일, 또는 6 내지 7일) 동안 정맥내로 투여될 수 있고, 후속적으로 포유동물에게 약 0.01 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 용량으로 5 내지 30일 이상(예컨대, 5 내지 7일, 7 내지 10일, 10 내지 14일, 14 내지 21일, 21 내지 28일, 28 내지 30일, 또는 30일 초과) 동안 1일 1 내지 3회 피하로 투여될 수 있다.

포유동물에게 투여되는 MANP (또는 MANP를 코딩하는 핵산) 및 이뇨제의 유효량은 선택된 파라미터(예컨대, 혈압)를 적어도 10% 변경하기에 충분한 양이다. 예컨대, 일부 실시양태에서, MANP 및 이뇨제의 "유효량"은, 처리 이전의 동일한 파라미터의 수준과 비교하여, 또는 대조군의 비처리된 포유동물에서의 파라미터의 수준과 비교하여, 적어도 10%(예컨대, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%)로 나트륨 배설 증가 및/또는 이뇨를 증가시키기에 (또는 나트륨 배설 증가 및/또는 이뇨, 예컨대 혈장 cGMP 수준, 소변 cGMP 배설, 순 신장 cGMP 생성, 소변 유량, 소변 나트륨 배설, 소변 칼륨 배설, 헤마토크릿, 혈장 BNP 면역반응성, 신장 혈류, 혈장 ANP 면역반응성, 신장 혈관 저항성, 나트륨의 근위 및 원위 분획 재흡수, 평균 동맥 압력, 폐 쐐기 모세관 압력, 우심방 압력, 폐 동맥 압력, 혈장 레닌 활성, 혈장 안지오텐신 II 수준, 혈장 알도스테론 수준, 신장 관류 압력 및 전신 혈관 저항성의 특징을 증가 또는 감소시키기에) 충분한 양이다. 따라서, 일부 경우에, MANP 및 이뇨제의 유효량은 고혈압(예컨대, RH)을 갖는 것으로 확인된 포유동물의 혈압을, MANP 및 이뇨제의 투여 전, 또는 MANP 및 이뇨제의 투여없이 포유동물의 혈압과 비교하여, 또는 대조군의 비처리된 포유동물에서의 "정상" 혈압과 비교하여, 적어도 10%(예컨대, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%) 감소시키는 양이다. MANP의 유효량은 또한 이뇨제의 유익한 효과(예컨대, 혈압 감소)가 동일한 양의 이뇨제가 MANP 없이 투여될 때 관찰되는 효과에 비해 (예컨대, 약 적어도 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%) 증가되도록 이뇨제의 효과를 강화하기에 충분한 양일 수 있다. 유효량의 MANP는 또한 이뇨제의 유해한 효과(예컨대, 레닌-안지오텐신-알도스테론 활성화)를 이뇨제가 MANP 없이 투여될 때 관찰되는 유해한 효과와 비교하여 적어도 약 5%(예컨대, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%) 감소시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 포유동물에 대한 MANP 및 이뇨제 투여의 양 및 빈도는, 예컨대 가장 적은 양의 부작용을 가지면서 고혈압을 치료하는 데 가장 효과적인 용량을 확인하기 위해 적정될 수 있다. 포유동물이 특정 양에 반응하지 않는 경우, 양은, 예컨대 2배, 3배, 5배 또는 10배 증가될 수 있다. 이 더 높은 농도를 받은 후, 포유동물은 치료에 대한 반응성 및 독성 증상에 대한 반응성 모두에 대해 모니터링될 수 있고, 이에 따라 용량 및/또는 투여 빈도의 조정이 이루어질 수 있다. 유효량은 일정하게 유지되거나 치료에 대한 포유동물의 반응에 따라 슬라이딩 스케일 또는 가변 용량으로 조정될 수 있다.

투여 빈도는 포유동물에서 유의한 독성을 일으키지 않으면서, 예컨대 포유동물 내의 심혈관 또는 심신 질환의 증상을 감소시키는 임의의 빈도일 수 있다. 예컨대, 투여 빈도는 1일에 약 4회 내지 2개월에 약 1회, 또는 1일에 약 1회 내지 1개월에 약 1회, 또는 2일에 약 1회 내지 1주일에 약 1회일 수 있다. 또한, 투여 빈도는 일정하게 유지되거나 치료 기간 동안 가변적일 수 있다. 유효량과 마찬가지로 다양한 요인이 특정 적용에 사용되는 실제 투여 빈도에 영향을 줄 수 있다. 예컨대, 유효량, 치료 기간, 투여 경로, 및 신장 병태의 중증도는 투여 빈도의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.

유효 투여 기간은 포유동물에서 유의한 독성을 일으키지 않고 포유동물 내의 고혈압 또는 심신 질환의 증상을 감소시키는 임의의 지속기간일 수 있다. 유효 지속기간은 1일에서 수일, 수주, 수개월, 또는 수년까지 다양할 수 있다. 일반적으로, 유효 지속기간은 수일에서 수개월까지 지속될 수 있다. 예컨대, 유효 지속기간은 약 1 내지 2주에서 약 36개월 또는 그 초과까지 다양할 수 있다. 일부 경우에, 치료는 개별 포유동물의 일생 동안 지속될 수 있다. 다수의 인자가 특정 치료 요법에 사용되는 실제 유효 지속기간에 영향을 미칠 수 있다. 예컨대, 유효 지속기간은 투여 빈도, 투여량, 투여 경로 및 병태의 중증도에 따라 달라질 수 있다.

본원에 기재된 MANP 및 이뇨제를 포유동물에게 투여한 후, 장애가 개선되었는지의 여부를 결정하기 위해 포유동물을 모니터링할 수 있다. 예컨대, 포유동물 장애의 하나 이상의 증상이 감소되었는지의 여부(예컨대, 포유동물의 혈압이 감소했는지의 여부)를 결정하기 위해 치료 후 포유동물을 평가할 수 있다. 포유동물이 특정 용량의 MANP 및 이뇨제에 반응하지 않는 경우, 하나 또는 둘 모두의 양은, 예컨대 2배, 3배, 5배 또는 10배 증가될 수 있다. 이 더 높은 농도를 받은 후, 포유동물은 치료에 대한 반응성 및 독성 증상 모두에 대해 모니터링되고 그에 따른 조정이 이루어질 수 있다. 유효량은 일정하게 유지되거나 치료에 대한 포유동물의 반응에 따라 슬라이딩 스케일 또는 가변 용량으로 조정될 수 있다.

일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 포유동물에게 단독 활성 성분이 이뇨제 및 MANP인 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 예컨대, 투여는 단독 활성 성분이 MANP 및 이뇨제인 조성물을 투여하는 것으로 이루어질 수 있거나, 투여는 단독 활성 성분이 MANP인 제1 조성물 및 단독 활성 성분이 이뇨제인 제2 조성물을 투여하는 것으로 이루어질 수 있다.

일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 포유동물에게 단독 활성 성분이 이뇨제, MANP, 및 ACE 억제제, ARB 또는 CCB인 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 예컨대, 투여는 단독 활성 성분이 MANP, 이뇨제 및 ACE 억제제; 또는 MANP, 이뇨제 및 ARB; 또는 MANP, 이뇨제 및 CCB인 조성물을 투여하는 것으로 이루어질 수 있거나, 투여는 단독 활성 성분이 MANP인 제1 조성물, 단독 활성 성분이 이뇨제인 제2 조성물, 및 단독 활성 성분이 ACE 억제제, ARB 또는 CCB인 제3 조성물을 투여하는 것으로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 3개의 활성 성분 중 2개(예컨대, MANP 억제제 및 이뇨제, MANP 및 ACE 억제제, ARB 또는 CCB, 또는 이뇨제 및 ACE 억제제, ARB 또는 CCB)가 하나의 조성물로 투여되고 제3 활성 성분은 별도의 조성물로 투여될 수 있다는 것이 주목된다.

일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 포유동물에게 단독 활성 성분이 이뇨제, MANP, ACE 억제제 또는 ARB, 및 CCB인 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 예컨대, 투여는 단독 활성 성분이 MANP, 이뇨제, ACE 억제제 또는 ARB, 및 CCB인 조성물의 투여로 이루어질 수 있거나, 투여는 단독 활성 성분이 MANP인 제1 조성물, 단독 활성 성분이 이뇨제인 제2 조성물, 단독 활성 성분이 ACE 억제제 또는 ARB인 제3 조성물, 및 단독 활성 성분이 CCB인 제4 조성물의 투여로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 활성 성분 중 2개(예컨대, MANP 및 이뇨제, MANP 및 ACE 억제제 또는 ARB, MANP 및 CCB, 이뇨제 및 ACE 억제제 또는 ARB, 이뇨제 및 CCB, 또는 ACE 억제제 또는 ARB 및 CCB)는 하나의 조성물로 투여될 수 있고 다른 2개의 활성 성분은 별도의 조성물로 투여될 수 있다는 것이 주목된다. 또한, 일부 경우에, 활성 성분 중 3개(예컨대, MANP, 이뇨제 및 ACE 억제제 또는 ARB; MANP, 이뇨제, 및 CCB; MANP, ACE 억제제 또는 ARB, 및 CCB; 또는 이뇨제, ACE 억제제 또는 ARB, 및 CCB)는 하나의 조성물로 투여될 수 있고 나머지 활성 성분은 별도의 조성물로 투여될 수 있다.

일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 포유동물을 고혈압(예컨대, RH)을 갖는 것으로 확인한 다음 포유동물에게 MANP 및 이뇨제(예컨대, Fs)를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 포유동물을 고혈압 또는 RH을 갖는 것으로 확인할 수 있는 능력을 갖는 것은 이들 포유동물을 MANP와 이뇨제의 조합으로 효과적이고 신뢰할 수 있는 방식으로 적절하게 확인하고 치료하도록 할 수 있다. 예컨대, 본원에 기재된 RH 치료(예컨대, MANP 및 Fs의 조합)는 RH를 갖는 것으로 확인된 고혈압 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이다.

실시예

실시예 1 - 래트에서의 MANP 및 Fs의 효과

인간 본태성 고혈압의 가장 많이 연구되고 널리 사용되는 유전 모델인 자발적 고혈압 래트(SHR)에서 BP 및 알도스테론 자극에 대한 MANP(서열번호 3) 및 Fs의 개별 및 조합 효과를 조사하기 위한 연구가 수행되었다(Lerman et al. (2019) Hypertension 73(6):e87-e120). SHR(n=32)을 무작위로 10개의 그룹으로 분류하였다:

그룹 1 - 비히클 식염수로 처리(Veh);

그룹 2 - 1 mg/kg Fs 단독으로 처리(Fs1);

그룹 3 - 5 mg/kg Fs 단독으로 처리(Fs5);

그룹 4 - 10 mg/kg Fs 단독으로 처리(Fs10);

그룹 5 - 100 pmol/kg/분 MANP 단독으로 처리(MANP100);

그룹 6 - 300 pmol/kg/분 MANP 단독으로 처리(MANP300);

그룹 7 - 600 pmol/kg/분 MANP 단독으로 처리(MANP600);

그룹 8 - Fs5+MANP300으로 처리;

그룹 9 - Fs10+MANP300으로 처리; 및

그룹 10 - Fs10+MANP600으로처리.

Fs는 단일 볼루스로 제공되고, 그룹 8, 9 및 10에서는 MANP의 60분 주입이 이어졌다.

평균 동맥 압력(MAP, mmHg)은 Fs1 (△ = -40±9*), Fs5 (△ = -55±8*), Fs10 (△　= -63±11*), MANP 300 (△ = -70±19*), 및 MANP600 (△ = -93±20*^&#) 단독으로의 처리로 감소되었고; 더 큰 효과는 조합된 Fs5+MANP300 (△ = -90±15*^&#), Fs10+MANP300 (△ = -93±6*^&#), 및 Fs10+MANP600 (△ = -95±9*^&#) 처리 그룹에서 관찰되었다(도 2a-2c). Fs, MANP, 및 Fs+MANP 그룹에서 BP의 감소는 나트륨 배설 및 소변 유량 향상과 관련이 있었지만(* p<0.05), Fs와 Fs+MANP 그룹 사이에서 나트륨 배설 증가 또는 이뇨에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 혈장 cGMP는 MANP 및 MANP+Fs 그룹에서 상당히 증가되었으나 Fs 단독으로는 변화되지 않았다(도 3a-3c). 혈장 알도스테론은 저용량 및 고용량 Fs로 증가하는 경향이 있었고, 증가는 Fs + MANP 그룹에서 상당히 약화되었다(p <0.05)(도 4). 특히 MANP+Fs 그룹의 경우, BP의 더 큰 감소는 cGMP의 더 큰 증가와 상관 관계가 있었다(도 5).

따라서, MANP+Fs는 Fs 단독보다 더 강력한 BP 저하 효과를 가졌으며, 또한 Fs 유도된 알도스테론 활성화를 억제하였다. Fs 및 MANP는 둘 다 이뇨 및 나트륨 배설 증가를 유도하고, MANP는 또한 혈관이완을 매개할 수 있으며, 이는 Fs + MANP의 보다 강력한 항고혈압 작용에 대한 가능한 설명을 제공한다. 따라서, 이들 연구는 Fs의 항고혈압 작용을 강화하기 위해 MANP가 RH 치료에 효과적인 추가 약물임을 시사하였다.

실시예 2 - HEK293 세포 및 래트에서의 MANP 및 Fs의 효과

SHR에서 급성 용량 의존적 심신 및 신경액성 작용을 추가로 조사하고, pGC-A를 과발현하는 HEK293 세포에서 직접적인 cGMP 활성화 작용을 확인하고, 고혈압의 중요한 장기 손상 표적인 인간 1차 혈관 세포에서 MANP 매개된 cGMP 활성화를 조사하기 위해 MANP에 대한 연구를 확장하였다. 이들은 둘 다 자연적으로 pGC-A를 발현하는 인간 대동맥 평활근 세포 및 인간 대동맥 내피 세포를 포함하였다.

방법

세포 배양: HEK293 세포를 리포펙타민(Invitrogen, Grand Island, NY)을 사용하여 pGC-A(Origene(Rockville, MD)으로부터의 cDNA 클론)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS)(Gibco), 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스트렙토마이신 및 250 μg/mL G418(Geneticin) 항생제가 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지에서 유지되었다. HAEC(Lonza, Walkersville, MD)는 EGM-2 성장 인자 및 보충제(Lonza) 및 10% FBS(Gibco)를 함유하는 EBM-2 배지(Lonza)에서 배양되었다. HASMC(ScienCell, San Diego, CA)는 SMC 성장 보충제(SMCGS), 페니실린/스트렙토마이신(ScienCell) 및 FBS(ScienCell)를 함유하는 평활근 세포 배지(SMCM)(ScienCell)에서 배양되었다.

세포내 cGMP: 세포를 80% 내지 90% 컨플루언시에서 처리하였다. 간단히 말해서, 세포를 20 mmol/L N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄술폰산], 0.1% 소 혈청 알부민 및 0.5 mmol/L 3-이소부틸-1-메틸잔틴(Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 버퍼에서 인큐베이션하였다. 처리된 세포는 비처리(대조군)되거나 10분 동안 MANP(서열번호 3; 10^-8 M, 10^-7 M, 또는 10^-6 M)를 받았다. MANP 또는 대조군의 각각의 농도에 대해 실험을 삼중으로 수행한 다음, 세포 용해물을 수집하였다. 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 직접적 cGMP ELISA 키트(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY)를 사용하여 검정되었다. 샘플의 총 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트(Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 정량화되었다. 결과는 총 단백질 밀리그램당 cGMP의 피코몰로 표현된다.

SHR에서의 급성 연구 프로토콜: MANP, Fs 또는 이들의 조합의 심신 및 신경액성 작용을 수컷 SHR의 고혈압 유전 모델에서 조사하였다(각 그룹에서 n=6). 래트는 흡입된 이소플루란 2.5%로 유도 챔버에서 마취되었다. 이 짧은 마취 상태 동안, 래트에게 마취를 유지하기 위해 IP 인액틴 100 mg/kg을 투여하였다. 실험이 끝날 때까지 산소 마스크를 사용하였다. 동맥 압력 측정을 위해 경동맥에 캐뉼러를 삽입하고 주입을 위해 오른쪽 경정맥에 캐뉼러를 삽입하였다. 압력은 디지털 방식으로 기록되고 분석되었다(Sonometrics, London, Ontario, Canada). 소변 샘플링을 위해 하부 복벽의 작은 절개를 통해 방광에 캐뉼러를 삽입하였다.

제조 직후, 정맥내 이눌린 주입으로 30분의 평형화 기간이 시작되었다. 혈역학적 측정 및 동맥 혈액 샘플링으로 이루어진 15분 기준선 클리어런스를 수행하였다. 기준선 측정 후, 래트를 무작위로 10개의 그룹으로 할당하였다:

그룹 1 - MANP100으로 처리;

그룹 2 - MANP300으로 처리;

그룹 3 - MANP600으로 처리;

그룹 4 - Fs1로 처리;

그룹 5 - Fs5로 처리;

그룹 6 - Fs10으로 처리;

그룹 7 - MANP300 + Fs5로 처리;

그룹 8 - MANP300 + Fs10으로 처리;

그룹 9 - MANP600 + Fs10으로 처리; 및

그룹 10 - 이눌린, 생리 식염수, 또는 이눌린 및 생리 식염수로 처리.

그룹 1-3의 경우, MANP 주입의 15분 리드-인 후, MANP를 총 60분 동안 연속적으로 주입하였다. 그룹 4-6의 동물은 Fs의 단일 정맥내(IV) 볼루스 투여를 받았다. MANP+Fs 그룹 7-9는 Fs의 단일 IV 볼루스 주사를 받은 다음, 동일한 용량으로 MANP의 추가 60분 연속 주입과 함께 MANP의 15분 리드-인 주입을 받았다. 대조군 동물(그룹 10)은 MANP 대조군으로 연속 이눌린 주입, Fs 대조군으로 0.9% 생리 식염수의 단일 IV 볼루스 주사, 또는 MANP+Fs 처리에 대한 대조군으로 0.9% 생리 식염수의 단일 IV 볼루스 및 연속 이눌린 주입의 조합을 받았다.

신경호르몬 및 전해질 분석: ANP RIA가 MANP를 완전히 검출하므로, 혈장 ANP를 MANP의 평가로서 방사면역검정(Phoenix Pharmaceuticals)에 의해 측정하였다(Burnett et al. (1986) Science 231(4742):1145-1147). 혈장 및 소변 cGMP(Enzo Life Sciences) 및 알도스테론(DRG International, Springfield, NJ)은 ELISA에 의해 결정되었다. 이눌린 농도는 다른 곳에서 기재되는 바와 같이 안트론 방법을 이용하여 측정되었다(Fuhr et al. (1955) Klin. Wochenschr 33:729-730). GFR은 이눌린 클리어런스로 계산되었다. 전해질은 플레임 광도계(IL943, Instrumentation Laboratory, UK)로 측정되었다. 모든 측정은 제조업체 지침에 따라 수행되었다.

통계 분석: 값은 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현된다. 독립 그룹의 비교는 스튜던츠 t-시험에 의해 수행되었다. 일원 분산 분석 시험에 이어 두네트(Dunnett) 사후 시험이 그룹내 비교에 이용되었다. 그룹 간 비교를 위해 이원 분산 분석 시험에 이어 본페로니(Bonferroni) 사후 시험(Statistica 8.0)이 이용되었다. 통계적 유의성은 p-값 <0.05로 정의되었다.

결과

인간 pGC-A 과발현 HEK293 및 1차 인간 대동맥 내피 세포 및 인간 대동맥 평활근 세포에서의 시험관내 cGMP 활성화: 도 6A는 인간 pGC-A 수용체로 형질감염된 HEK293 세포의 MANP 처리 후 cGMP 생산의 시험관내 측정 결과를 나타낸다. cGMP의 수준은 MANP의 농도가 점차 증가함에 따라 증가하였다. MANP는 비처리 대조군에 비해 cGMP 수준을 상당히 증가시켰다. 증가하는 MANP 용량은 또한 HAEC 및 HASMC에서 cGMP 수준의 상당한 증가를 초래하였다(도 6B 및 6C). HEK 293 세포와 마찬가지로 비처리는 유의한 효과는 없었다.

생체내 연구 - 전신 혈역학: 기준선에서 MANP, Fs, MANP+Fs 및 대조군에 대한 SHR에서의 동맥 BP가 표 2에 제시되어 있다. BP에 대한 효과는 도 7A-7C 및 8에 나타나 있다. MANP300 및 MANP600은 대조군과 비교할 때 BP를 상당히 감소시켰다(도 7A). 60분에 BP의 가장 큰 감소는 고용량(MANP600) 그룹에서 나타났다(도 8). 3가지 용량 모두의 Fs는 대조군과 비교하여 BP를 상당히 감소시켰다(도 7B 및 8). 그러나, MANP600 단독은 Fs1 또는 Fs5 단독보다 훨씬 더 큰 항고혈압 효과를 가졌다(도 8). 조합 요법 그룹에서, Fs5 또는 Fs10에 MANP300의 추가 뿐만 아니라 Fs10에 MANP600의 추가도 Fs 단독(단일 약물 요법)과 비교하여 BP를 상당히 감소시켰다(MANP300+Fs5 vs. Fs5 단독, MANP300+Fs10 vs. Fs10 단독, 및 MANP600+Fs10 vs. Fs10 단독에 대해 p <0.05)(도 7C 및 8). 따라서, 조합 요법 MANP+Fs는 Fs의 항고혈압 효과를 상당히 강화하였다.

생체내 연구 - 신경액성 분석: 기준선에서 MANP, Fs, MANP+Fs 및 대조군의 혈장 cGMP 수준에 대한 데이터가 표 2에 요약되어 있다. 혈장 cGMP는 3개의 시점(기준선, 30분 및 60분)에서 결정되었으며, MANP300 및 MANP600으로의 처리 후 대조군에 비해 용량 의존적으로 증가되었다(도 9A). 이에 비해, Fs는 혈장 cGMP를 변화시키지 않았지만(도 9B), MANP+Fs 그룹에서 혈장 cGMP가 현저하게 증가되었다(도 9C).

소변 cGMP 배설은 MANP300 및 MANP600 투여 후 용량 의존적 방식으로 상당히 증가되었으며, 또한 대조군과 비교하여 MANP300+Fs5, MANP300+Fs10 및 MANP600+Fs10 투여 후 상당히 증가되었다(도 10). Fs 그룹에서는 유의한 증가가 없었으며, 이는 비히클(대조군) 그룹과 다르지 않았다(도 10).

알도스테론의 평가는 도 11에 나타나 있다. MANP는 100 pmol/kg/분 및 300 pmol/kg/분의 용량에서 알도스테론을 감소시켰지만 600 pmol/kg/분에서는 그렇지 않았다. 대조군, MANP100 및 MANP300 그룹에 비해 Fs5 및 Fs10 그룹에서 알도스테론 수준이 상당히 더 높았다. 조합 그룹에서, 알도스테론은 Fs5 단독에 비해 MANP300+Fs5 그룹에서 상당히 감소되었을 뿐만 아니라, Fs10 단독에 비해 MANP300+Fs10 및 MANP600+Fs10 그룹에서 상당히 감소되었다. 따라서, MANP+Fs로의 처리는 Fs 유도된 알도스테론 활성화를 억제할 수 있었다.

MANP 주입 단독 또는 Fs와의 조합은 MANP 면역반응성의 척도로 혈장 ANP 면역반응성을 상당히 증가시켰다(표 3). 신경액성 인자 중에서 혈장 ANP 수준은 혈장 cGMP와 유의한 상관 관계가 있었다(r=0.75, p<0.001)(도 12). 혈역학적 파라미터 중에서 혈장 cGMP 농도는 BP와 유의한 상관 관계가 있었다(r=-0.65, p<0.001)(도 13).

생체내 연구- 신장 기능: GFR, 소변 나트륨 배설(UNaV) 및 수분 배설(UV)에 대한 효과가 도 14A-14C에 플로팅되었다. GFR은 비처리 대조군에 비해 Fs 그룹에서 상당히 더 낮았지만, GFR은 Fs 그룹에 비해 MANP300+Fs10 및 MANP600+Fs10 그룹에서 증가되었다(도 14A). MANP 단독 투여 후 뿐만 아니라 Fs와 조합으로의 투여 후, 소변 나트륨 배설(도 14B) 및 수분 배설(도 14C) 모두에서 상당한 증가가 있었다.

기타 실시양태

본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술된 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 제한하지 않음을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기의 청구범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Mayo Foundation for Medical Education and Research <120> COMBINATION TREATMENT FOR RESISTANT HYPERTENSION <130> 07039-1841WO1 <150> US 62/758,009 <151> 2018-11-09 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Ile Thr Ala Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 40 <210> 4 <211> 123 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agcctgcgga gatccagctg cttcgggggc aggatggaca ggattggagc ccagagcgga 60 ctgggctgta acagcttccg gtaccggata acagccaggg aggacaagca gggctgggcc 120 tag 123 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Ala Arg 20 25 30 Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 6 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Gln Gly Tyr Ala 35 40 <210> 7 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Ser Gln Gly Trp Ala 35 40 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Gln 35 <210> 9 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Ala Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 40 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 Ser Leu Lys Lys Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 40 <210> 11 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Ser is D-isoform <400> 11 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 40 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Arg is D-isoform <400> 12 Ser Leu Arg Arg Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala 1 5 10 15 Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala Arg 20 25 30 Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 <210> 13 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 Thr Leu Arg Arg Thr Thr Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 40 <210> 14 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Ser Trp Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala 20 25 30 Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala 35 40

Claims

포유동물에게 M-심방 나트륨이뇨 펩티드(MANP)를 투여하는 단계, 및
상기 포유동물에게 이뇨제를 투여하는 단계
를 포함하는, 포유동물을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 포유동물이 고혈압을 갖는 것으로 확인되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 고혈압이 저항성 고혈압(RH)인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP가 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP가 서열번호 5 내지 14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이뇨제가 푸로세미드인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 MANP가 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP가 피하로 투여되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 MANP가 약 0.1 ng/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP가 정맥내로 투여되고, 그 후에 피하로 투여되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 MANP가 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로 정맥내로 투여되고, 그 후에, 약 0.1 ng/kg 내지 약 100 mg/kg의 용량으로 피하로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이뇨제가 경구로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이뇨제가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이뇨제가 피하로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP 및 상기 이뇨제가 동일한 조성물로 동시에 투여되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 MANP 및 상기 이뇨제가 피하로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에게 MANP 및 이뇨제를 투여하는 단계로 이루어지는 방법.
포유동물에게 이뇨제 및 MANP를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 이뇨제의 하나 이상의 유익한 효과를 강화하고 하나 이상의 유해한 효과를 감소시키는 방법.
제20항에 있어서, 상기 포유동물이 고혈압을 갖는 것으로 확인되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 고혈압이 RH인 방법.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP가 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP가 서열번호 5 내지 14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이뇨제가 푸로세미드인 방법.
제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP 및 상기 이뇨제가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 MANP가 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP 및 상기 이뇨제가 피하로 투여되는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 MANP가 약 1 μg/kg 내지 약 10 μg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MANP 및 상기 이뇨제가 정맥내로 투여되고, 그 후에 피하로 투여되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 상기 MANP가 약 10 pmol/kg/분 내지 약 100 nmol/kg/분의 용량으로 정맥내로 투여되고, 그 후에, 약 1 μg/kg 내지 약 10 μg/kg의 용량으로 피하로 투여되는 것인 방법.
제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유익한 효과가 포유동물에서의 혈압의 감소를 포함하고, 하나 이상의 유해한 효과가 알도스테론 활성화를 포함하는 것인 방법.
제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단독 활성 성분이 이뇨제 및 MANP인 조성물을 투여하는 단계로 이루어지는 방법.