CN113727997A - 顽固性高血压的组合治疗 - Google Patents

Abstract

本文描述了用M‑心房利钠肽(MANP)和利尿剂(例如呋塞米)的组合治疗高血压(包括顽固性高血压)的材料和方法。

Description

顽固性高血压的组合治疗

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月9日提交的美国临时专利申请系列号62/758,009的优先权。该在先申请的公开内容视为本申请公开的一部分(且通过引用纳入本文)。

联邦资助研究的声明

本发明得到国家卫生研究院第HL136340号政府资助。政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本文涉及用于治疗高血压的材料和方法，更具体地，涉及使用M-心房利钠肽(MANP)和利尿剂(例如呋塞米)的组合治疗哺乳动物顽固性高血压的方法。

背景技术

高血压(Hypertension)(HT)，也称为高血压(high blood pressure)，是动脉中的血压持续升高的长期的医学病症。高血压对抗-高血压药物的治疗正在变得越来越有耐药性。患有顽固性高血压(RH)的病人的血压即使在三种不同类型抗压剂的同时治疗下仍然升高，其包含(1)利尿剂，(2)通常是血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)和(3)钙通道阻滞剂(CCB)。以4种或更多药物治疗控制血压的患者也被认为患有RH。目前在美国没有获批用于治疗RH的药物或装置。

发明内容

本文至少部分基于这样的发现，即MANP和利尿剂的组合有潜在的降血压(BP)功能同时抑制Fs-诱导的醛固酮刺激。此发现表明可用MANP和利尿剂例如呋塞米(Fs)的组合有效治疗RH。

第一方面，本文记载了一种用于治疗哺乳动物的方法，所述方法可包括给予所述哺乳动物MANP和利尿剂。所述哺乳动物可被鉴定为患有高血压(例如RH)。所述MANP可具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。利尿剂可以是呋塞米。哺乳动物可以是人。MANP可以静脉内给予(例如，以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量)。MANP可以皮下给予(例如，以约0.1ng/kg至约10mg/kg的剂量)。MANP可以静脉内给予，随后皮下给予。例如，MANP可以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量静脉内给予，随后以约0.1ng/kg至约100mg/kg的剂量皮下给予。利尿剂可通过口服，静脉内或皮下给予。MANP和利尿剂可以在同样的组合物中同时给予。MANP和利尿剂可以皮下给予。该方法可由给予哺乳动物MANP和利尿剂组成。MANP和利尿剂可以以组合物给予，其中唯一的活性成分是MANP和利尿剂。

另一方面，本文记载了一种用于在哺乳动物中增强利尿剂的一种或多种有益效果，并减少利尿剂的一种或多种不良影响的方法，其中该方法包括给予哺乳动物利尿剂和MANP。所述哺乳动物可被鉴定为患有高血压(例如RH)。所述MANP可具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。利尿剂可以是呋塞米。哺乳动物可以是人。MANP利尿剂可以静脉内给予(例如，其中MANP以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量给予)。MANP和利尿剂可以皮下给予(例如，其中MANP以约1μg/kg至约10μg/kg的剂量给予)。MANP和利尿剂可以静脉内给予，随后皮下给予。MANP可以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量静脉内给予，随后以约1μg/kg至约10μg/kg的剂量皮下给予。所述一种或多种有益效果可包含哺乳动物的血压降低，且所述一种或多种不良影响可包含醛固酮激活。该方法可由给予唯一活性成分为利尿剂和MANP的组合物组成。MANP和利尿剂可以以组合物给予，其中唯一的活性成分是MANP和利尿剂。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然可用与本文所述类似或等同的方法和材料来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。若有抵触，以本包括定义在内的本申请说明书为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。

附图和以下说明进一步详细说明了本发明的一种或多种实施方式。从本文说明、附图以及权利要求书还可清楚地看出本发明的其他特征、目的和优势。

附图说明

图1是显示心房利钠肽(ANP；SEQ ID NO:1)的序列和一般结构，以及MANP(SEQ IDNO:3)的序列和一般结构的示意图。

图2A-2C是绘制大鼠在60分钟的时间内的平均动脉压(MAP)的曲线图，以载剂、100pmol/kg/分钟MANP、300pmol/kg/分钟MANP或600pmol/kg/分钟MANP处理示于图2A；以载剂、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs或10mg/kg Fs处理示于图2B，和以载剂、300pmol/kg/分钟MANP+5mg/kg Fs、600pmol/kg/分钟MANP+5mg/kg Fs或600pmol/kg/分钟MANP+10mg/kg Fs处理示于图2C。所述MANP具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。数据表示为平均值±SD。*为与载剂对比p<0.05。^#为与Fs10对比p<0.05。

图3A-3C是绘制大鼠在60分钟的时间内的血浆cGMP水平的曲线图，以载剂、100pmol/kg/分钟MANP、300pmol/kg/分钟MANP或600pmol/kg/分钟MANP处理示于图3A；以载剂、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs或10mg/kg Fs处理示于图3B，和以载剂、300pmol/kg/分钟MANP+5mg/kg Fs、600pmol/kg/分钟MANP+5mg/kg Fs或600pmol/kg/分钟MANP+10mg/kg Fs处理示于图3C。所述MANP具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。数据表示为平均值±SD。*为与载剂对比p<0.05。@为与MANP100对比p<0.05。

图4是绘制大鼠60分钟的血浆醛固酮水平的曲线图，以载剂、100pmol/kg/分钟MANP、300pmol/kg/分钟MANP、600pmol/kg/分钟MANP、1mg/kg Fs、5mg/kg Fs、10mg/kg Fs、300pmol/kg/分钟MANP+5mg/kg Fs、600pmol/kg/分钟MANP+5mg/kg Fs或600pmol/kg/分钟MANP+10mg/kg Fs处理。所述MANP具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。数据表示为平均值±SD。$为与Fs5对比p<0.05。#为与Fs10对比p<0.05。

图5是绘制大鼠经治疗后的60分钟内MAP水平变化相比于cGMP水平变化的曲线图，以载剂，100、300或600pmol/kg/分钟MANP，1、5或10mg/kg Fs，或300pmol/kg/分钟MANP+5mg/kg Fs、300pmol/kg/分钟MANP+10mg/kg Fs或600pmol/kg/分钟MANP+10mg/kg Fs处理。所述MANP具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

图6A-6C是绘制在以下中产生的cGMP水平的图表，过表达微粒鸟苷酸环化酶A(pGC-A)受体的人胚肾293(HEK293)细胞中(图6A)，原代人主动脉内皮细胞(HAEC)中(图6B)和受MANP(SEQ ID NO:3)刺激的原代人主动脉平滑肌细胞中(HASMC)(图6C)。值表示为平均值±SEM。*为与对照对比p<0.05。

图7A-7C是绘制以下时间大鼠BP的图表，在基线处(BL)，15分钟引入(Lead-In)和输注MANP或载剂(对照)后15、30、45和60分钟(图7A)，在推注Fs或载剂(对照)之后(图7B)和在输注MANP和推注Fs的组合或输注载剂和推注载剂的组合(对照)之后(图7C)。值表示为平均值±SEM。#为MANP300与载剂对比p<0.05；*为MANP600与载剂对比p<0.05；§为Fs1与载剂对比p<0.05；@为Fs5与载剂对比p<0.05；&为Fs10与载剂对比p<0.05；￡为MANP300+Fs5与载剂对比p<0.05；

为MANP300+Fs10与载剂对比p<0.05；

为MANP600+Fs10与载剂对比p<0.05。所述MANP具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

图8是绘制在载剂输注(对照)、MANP输注、Fs推注或MANP输注和Fs推注组合之后60分钟的大鼠BP的图表。值绘制为平均值±SEM。*为与载剂对比p<0.05；￥为与MANP100对比p<0.05；

为MANP300与MANP300+Fs10对比p<0.05；#为与MANP600对比p<0.05；§为与Fs1对比p<0.05；@为与Fs5对比p<0.05；&为与Fs10对比p<0.05。所述MANP具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

图9A-9C是绘制以下时间大鼠血浆cGMP的图表，在基线处(BL)，在输注MANP或载剂(对照)后30和60分钟(图9A)，在推注Fs或载剂(对照)后(图9B)，和在输注MANP和推注Fs的组合或输注载剂和推注载剂的组合(对照)之后(图9C)。值绘制为平均值±SEM。*为与载剂对比p<0.05。所述MANP具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

图10是绘制在给予MANP(SEQ ID NO:3)，Fs，MANP+Fs的组合或载剂后60分钟的大鼠的尿cGMP排泄的图表。值绘制为平均值±SEM。*为与载剂(对照)对比p<0.05。

图11是绘制在给予MANP(SEQ ID NO:3)，Fs，MANP+Fs的组合或载剂后60分钟的大鼠的醛固酮水平的图表。值表示为平均值±SEM。*为与载剂(对照)对比p<0.05；@为与Fs5对比p<0.05；&为与Fs10对比p<0.05。

图12是显示在给予MANP(SEQ ID NO:3)，Fs，MANP+Fs的组合或载剂后大鼠的血浆ANP和血浆cGMP之间呈正相关性的图表。皮尔逊相关系数(r)＝0.7479，p<0.01。

图13是绘制在给予MANP(SEQ ID NO:3)，Fs，MANP+Fs的组合或载剂后大鼠的血浆cGMP和平均动脉压之间呈负相关性的图表。皮尔逊相关系数(r)＝-0.6510，p<0.01。

图14A-14C是绘制在给予MANP(SEQ ID NO:3)，Fs，MANP+Fs的组合或载剂后60分钟，GFR(图14A)，尿钠排泄(图14B)和尿流量(图14C)的图表。值表示为平均值±SEM。*为与载剂(对照)对比p<0.05；￥为与MANP100对比p<0.05；

为MANP300对比p<0.05；@为与MANP600对比p<0.05；#为与Fs1对比p<0.05；&为与MANP300+Fs5对比p<0.05。

发明详述

本文提供了用于治疗高血压(包括RH)的材料和方法，使用MANP和利尿剂(例如Fs)的组合。例如，本文提供了包括以某种方式给予哺乳动物(例如，人、非人灵长类、狗、猫、大鼠、小鼠、奶牛、马、绵羊或猪)MANP和利尿剂的方法，从而在给药后降低所述哺乳动物的BP。在一些情况下，在给药后所述哺乳动物的醛固酮不升高。在一些情况下，所述哺乳动物可被鉴定为患有高血压(例如RT)。

利尿剂，俗称“水丸”，是帮助肾脏去除体内过量的水和盐的药物，从而降低血管中的液体水平，降低血压。利尿剂通常是开给高血压患者的第一类药物。可用于治疗高血压患者的利尿剂包括但不限于噻嗪类利尿剂[例如氯噻酮(Hygroton)、氯噻嗪(Diuril)、氢氯噻嗪(Esidrix、Hydrodiuril或Microzide)、吲达帕胺(Lozol)和美托拉宗(Mykrox、Zaroxolyn)]，以及其他利尿剂，例如阿米洛利(Midamor)、布美他尼(Bumex)、呋塞米(Lasix)、螺内酯(Aldactone)和氨苯蝶啶(Dyrenium)。呋塞米(本文中缩写为“Fs”)能增加其他抗压剂的有效性，但Fs也激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统。

利钠多肽是能造成钠尿(增加尿中的钠排泄)的多肽。利钠多肽可由脑、心、肾和/或血管组织产生。人体内的利钠多肽家族包括心脏激素心房利钠肽(ANP)、B型利钠肽(BNP)、C型利钠肽(CNP)和尿舒张肽(URO)。利钠多肽通过两个充分表征的鸟苷酸环化酶受体(ANP、BNP和URO的NPR-A；CNP的NPR-B)和第二信使环3’5’单磷酸鸟苷(cGMP)行使功能(Kuhn(2003)Circ.Res.93:700-709；Tawaragi等.(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.175:645-651；和Komatsu等.(1991)Endocrinol.129:1104-1106)。利钠多肽可有效地，例如，增加血浆cGMP水平、增加尿cGMP排泄、增加肾净cGMP生成、增加尿流量、增加尿钠排泄、增加尿钾排泄、增加血细胞比容、增加血浆BNP免疫反应性、增加肾血流量、增加血浆ANP免疫反应性、降低肾血管阻力、降低钠的近端和远端重吸收分数、降低平均动脉压、降低肺毛细血管楔压、降低右心房压、降低肺动脉压、降低血浆肾素活性、降低血浆血管紧张素II水平、降低血浆醛固酮水平、降低肾灌注压和/或降低全身血管阻力。

MANP是pGC-A/cGMP激活剂，其能够显著降低血压和血管阻力。本文提供的方法可包括，部分地，用MANP治疗哺乳动物。如图1所示，MANP是基于ANP的肽，其氨基酸序列包含28个氨基酸的成熟人ANP序列(SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；SEQ ID NO:1)和另外12个氨基酸的羧基末端(RITAREDKQGWA；SEQ ID NO:2)。所述MANP的全长序列为SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRIT AREDKQGWA(SEQ ID NO:3)。编码MANP的代表性核酸序列为5′-agcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccggtaccggataacagccagggaggacaagcagggctgggcctag-3′(SEQ ID NO:4)。

本文所用“MANP”可具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或可为示于SEQ ID NO:3的序列的变体。因此，在一些情况下，本文提供的所述方法中使用的MANP可包含SEQ ID NO:3所示的整个氨基酸序列。在一些情况中，MANP可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，条件是氨基酸序列包含一个或1-10个之间(例如，10，1-9，2-9，1-8，2-8，1-7，1-6，1-5，1-4，1-3，2或1)的氨基酸的添加、减去和/或取代。例如，MANP可包含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单独氨基酸残基的添加、减去或取代。在一些情况下，MANP在SEQ ID NO:3的C-末端部分(例如SEQ ID NO:3的最后12个氨基酸)具有一个或多个添加、减去和/或取代。这种多肽的实例包括但不限于具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽，其中苏氨酸被删除(SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRIA REDKQGWA；SEQ ID NO:5)、色氨酸被酪氨酸取代(SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGYA；SEQ ID NO:6)、在赖氨酸和谷氨酰胺之间添加丝氨酸(SLRRSSCFGGRMDRIGAQS GLGCNSFRYRITAREDKSQGWA；SEQ ID NO:7)或其任意组合。在另一个实例中，MANP可缺乏SEQ ID NO:3的最后3个残基(即，SEQ ID NO:3的甘氨酸、色氨酸和丙氨酸残基，如SEQ ID NO:8(SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY RITAREDKQ)所示)。在一些情况下，MANP在SEQ ID NO:3的N-末端部分(例如SEQ ID NO:3的前6个氨基酸)具有一个或多个添加、减去和/或取代。此类多肽的实例包括但不限于具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽，其中在N-末端添加了来自尿舒张肽的4个氨基酸(TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA；SEQ ID NO:9)，位置3和4的精氨酸残基被赖氨酸残基取代(SLKKSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA；SEQ ID NO:10)，丝氨酸的D-同种型在第六位被取代(SLRRSSCFGGRM DRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA；SEQ ID NO:11)，精氨酸的D-同种型在第四位被取代，而在第五位的丝氨酸被删除(SLRRSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA；SEQ ID NO:12)，苏氨酸残基取代位置1、5和6的丝氨酸残基(TLRRTTCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYRITAREDKQGWA；SEQ ID NO:13)，色氨酸取代位置2的亮氨酸(SWRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY RITAREDKQGWA；SEQ ID NO:14)或其任意组合。

SEQ ID NO:3所示的任何氨基酸残基均可被减去，并且任何氨基酸残基(例如20个常规氨基酸残基中的任一个或任何其它类型的氨基酸如鸟氨酸或瓜氨酸)均可被添加至SEQ ID NO:3所示的序列。在一些情况中，MANP可含有一种或多种化学结构，例如ε-氨基己酸；羟基化的氨基酸，例如3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸，(5R)-5-羟基-L-赖氨酸，异-羟基赖氨酸和5-羟基-L-正缬氨酸；和/或糖基化氨基酸，例如含有单糖的氨基酸(例如，D-葡萄糖，D-半乳糖，D-甘露糖，D-葡萄糖胺和D-半乳糖胺)或单糖的组合。

相对于SEQ ID NO:3中所示代表性MANP序列，具有的一个或多个氨基酸的添加、减去或取代的MANP，本文中也称为“变体”MANP，可以使用任何合适的方法产生。在一些情况中，可选择就维持以下特征而言没有显著差异的取代来进行氨基酸取代：(a)取代区域中肽主链的结构，(b)目标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。例如，天然残基可基于侧链性质分组如下：(1)疏水性氨基酸(正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(2)中性亲水性氨基酸(半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；(3)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；(4)碱性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸)；(5)影响链取向的氨基酸(甘氨酸和脯氨酸)；和(6)芳族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)。以上组内取代被认为是保守性取代。有用的保守取代的非限制性实例可包括但不限于：缬氨酸取代丙氨酸、赖氨酸取代精氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、谷氨酸取代天冬酰胺、丝氨酸取代半胱氨酸、天冬酰胺取代谷氨酰胺、天冬酰胺取代谷氨酸、脯氨酸取代甘氨酸、精氨酸取代组氨酸、亮氨酸取代异亮氨酸、异亮氨酸取代亮氨酸、精氨酸取代赖氨酸、亮氨酸取代蛋氨酸、亮氨酸取代苯丙氨酸、甘氨酸取代脯氨酸、苏氨酸取代丝氨酸、丝氨酸取代苏氨酸、酪氨酸取代色氨酸、苯丙氨酸取代酪氨酸和/或亮氨酸取代缬氨酸。

表1示出了本文所述方法中有用的MANP中任何位置可以进行保守性取代的其他示例。

在一些实施方式中，MANP可包含一个或多个非保守性取代。非保守性取代一般指将上述类别之一的成员更换为另一种类别的成员。这样生产可能有益于提供大量的该化合物或其替代性实施方式。氨基酸变化是否导致功能性多肽可通过使用例如本文公开的方法测定多肽变体的特定活性来确定。

在一些实施方式中，MANP可具有长度为，例如，35-45个氨基酸残基(例如，35-40、40-45、35-37、36-38、37-39、38-40、39-41、40-42、41-43、42-44或43-45个氨基酸残基)。在一些实施方式中，利钠多肽可包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，但有特定数目的氨基酸取代。例如，利钠多肽可具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，但有1、2、3、4或5个氨基酸取代。这种氨基酸序列的实例包括但不限于，MANP多肽N-末端区域内D-氨基取代一个或多个L-氨基酸(例如，如SEQ ID NO:11所示，在位置6处具有D-丝氨酸残基，或如SEQ ID NO:12所示，在位置4处具有D-精氨酸)。

表1

保守氨基酸取代示例

在一些实施方式中，MANP可包含与SEQ ID NO:3所示参考序列有至少90％(例如，至少90％、至少92.5％、至少95％、至少97.5％或100％)序列相同性的氨基酸序列。序列相同性百分数通过如下方式计算：确定比对氨基酸序列中匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比对氨基酸的总数目，并乘以100。匹配位置指比对氨基酸序列中相同位置出现相同氨基酸的位置。也可确定任何氨基酸序列的序列相同性百分数。

如下所述测定特定核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列之间的序列相同性百分比。首先，使用来自含有BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLASTZ独立版本的BLAST 2序列(Bl2seq)程序比较核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列。该BLASTZ独立版本可在fr.com/blast或ncbi.nlm.nih.gov在线获取。解释如何使用Bl2seq程序的说明书可参见BLASTZ附带的自述文件。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两条序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两种核酸序列，可采用如下方式：-i设为含有待比较的第一核酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二核酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastn；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；-q设为-1；-r设为2；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两条序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-ic:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r 2。为比较两条氨基酸序列，如下所述设置Bl2seq的选项：-i设为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两条氨基酸序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-ic:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastp-o c:\output.txt。如果两条比较的序列具有同源性，则指定的输出文件会以对齐序列的形式显示那些同源区域。如果比较的两条序列不具有同源性，则指定的输出文件不会显示对齐序列。

比对后，通过对两条序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置数进行计数来确定匹配数。将匹配的数目除以鉴定的序列(如SEQ ID NO:3)中所列序列长度或连接的长度(如来自鉴定的序列中所列序列的20个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将结果值乘以100，从而确定序列相同性百分比。例如，与SEQ ID NO:3所列序列比对具有37处匹配的氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示序列具有92.5％相同性(即37÷40x 100＝92.5)。应注意序列相同性百分比值四舍五入至小数点后第一位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下四舍五入至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上四舍五入至75.2。还应注意，长度值始终是整数。

分离的MANP可以使用任何合适的方法生产，包括固相合成，并且可以使用手动技术或自动技术(例如，使用应用生物系统公司(Applied BioSystems)(福斯特市，加利福尼亚州)的肽合成器或生物研究公司(Biosearch Inc.)(圣拉斐尔市，加利福尼亚州)的自动肽合成器)生成。半胱氨酸残基之间的二硫键可使用KCN通过线性多肽的温和氧化引入，如美国专利号4,757,048中教导的。利钠多肽也可重组生产或商业获得。

由于半胱氨酸残基之间的二硫键，本文描述的MANP通常是环状的(见图1)。在一些实施方式中，半胱氨酸上的巯基基团可由替代性基团取代(例如-CH₂CH₂-)。为了用-CH₂-基团取代巯基基团，例如，半胱氨酸残基可由α-氨基丁酸取代。这种环状多肽类似物可根据例如Lebl和Hruby的方法((1984)Tetrahedron Lett.25:2067-2068)产生，或通过使用公开于美国专利号4,161,521的方法产生。

此外，通过丝氨酸或苏氨酸的OH与天冬氨酸或谷氨酸的羧基反应生成具有结构-CH₂CO₂CH₂-的桥，可以形成酯桥。类似地，通过赖氨酸的侧链与天冬氨酸或谷氨酸反应生成具有结构-CH₂C(O)NH(CH)₄-的桥，可以得到酰胺。这些桥的合成方法是本领域已知的(参见，例如，Schiller等.(1985)Biochem.Biophys.Res.Comm.127:558,和Schiller等.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25:171)。例如，制备本发明的多肽的酯的一种方法是，当使用Merrifield合成技术时，在所需醇的存在下，基于树脂，在碱性或酸性条件下从树脂中裂解完整的多肽。多肽的C-末端在从树脂中释放时可以直接酯化，而不需要分离游离酸。多肽的酰胺也可以使用将羧酸基团或前体转化为酰胺的技术(例如，本领域已知的技术)制备。在C-末端羧基上形成酰胺的一种方法包括用适当的胺从固相载体上裂解多肽，或在醇的存在下裂解，得到酯，然后用所需的胺进行胺解。其它形成桥的氨基酸残基和反应在例如美国专利号4,935,492中提供。包含非肽基键连接氨基酸残基的肽类似物的制备也是本领域已知的。参见,例如，Spatola等.(1986)Life Sci.38:1243；Spatola(1983)Vega Data 1(3)；Morley(1980)Trends Pharm.Sci.463-468；Hudson等.(1979)Int.J.Pept.Prot.Res.14:177；Spatola于《氨基酸肽和蛋白质的化学与生物化学》(Chemistry and Biochemistry of Amino Acid Peptides and Proteins),B.Weinstein编,Marcel Dekker公司，纽约，第267页(1983)；Hann(1982)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:307；Almquist等.(1980)J.Med.Chem.23:1392；Jennings-White等.(1982)Tetrahedron Lett.23:2533；欧洲专利申请EP 45665；Holladay等.(1983)Tetrahedron Lett.24:4401；和Hruby(1982)LifeSci.31:189。

多肽的氨基的N-酰基衍生物可通过利用N-酰基保护的氨基酸进行最终缩合，或通过酰化保护或未保护的肽来制备。O-酰基衍生物可以例如通过游离羟基肽或肽树脂的酰化来制备。任何一种酰化都可以使用标准酰化试剂如酰卤、酸酐、酰基咪唑等进行。如果需要，N-和O-酰化可以一起进行。

在一些情况下，MANP可以是聚乙二醇化的、乙酰化的或两者皆有的。在一些情况下，多肽可以共价连接到寡聚物，例如短的两亲寡聚物，所述寡聚物能够给药或改善偶联多肽的药代动力学或药效动力学曲线。寡聚物可包含水溶性聚乙二醇(PEG)和/或脂溶性烷基(短链、中链或长链脂肪酸聚合物，例如但不限于棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、癸酸或硬脂酸)。脂肪酸分子可以连接到游离氨基末端或任何赖氨酸侧链(ε氨基)，并且用于这种连接的赖氨酸残基可以置于肽的C-末端或N-末端。与未修饰的利钠多肽相比，与PEG或另一种合适的聚合物的连接，或与白蛋白或另一种合适的多肽的融合可导致修饰的利钠多肽的半衰期增加。不受具体机制的束缚，血清半衰期增加可能是由于修饰的利钠多肽的蛋白水解降解、免疫识别或细胞清除作用降低。通过连接到PEG(也称为“PEG化”)或其它聚合物来修饰多肽的方法是本领域已知的，其包括示于以下的那些：美国专利号6,884,780；PCT公开号WO2004/047871；Cataliotti等.((2007)Trends Cardiovasc.Med.17:10-14；Veronese和Mero(2008)BioDrugs 22:315-329；Miller等.(2006)Bioconjugate Chem.17:267-274；以及Veronese和Pasut(2005)Drug Discov.Today 10:1451-1458，其全部通过引用全文纳入本文。通过融合到白蛋白来修饰多肽的方法也是本领域已知的，其包括示于以下的那些：美国专利公开号20040086976和Wang等.(2004)Pharm.Res.21:2105-2111，其皆通过引用全文纳入本文。

在一些情况下，MANP可融合到免疫球蛋白分子(例如IgG1分子)的Fc结构域，从而通过Fc受体发生跨上皮细胞屏障的融合多肽的主动转运。在一些情况中，多肽可以是环状多肽。环状多肽可以通过键合半胱氨酸残基获得，然而，也可以设想用替代基团取代半胱氨酸残基上的巯基，例如–CH₂–CH₂–。例如，为了用--CH₂--基团取代巯基基团，可以用类似的α-氨基丁酸取代半胱氨酸残基。这种环状多肽类似物可根据例如Lebl和Hruby的方法((1984)Tetrahedron Lett.25:2067-2068)产生，或通过使用公开于美国专利号4,161,521的方法形成。

MANP的羧基盐可以通过使多肽与一个或多个当量的所需碱(例如金属氢氧化物碱(例如氢氧化钠)、金属碳酸盐或碳酸氢盐碱(例如碳酸钠或碳酸氢钠)、或胺碱(例如三乙胺、三乙醇胺等)接触来制备。多肽的酸加成盐可以通过使多肽与一个或多个当量的无机或有机酸(例如盐酸)接触来制备。

本文所用的术语“多肽”指具有两个或更多个亚基氨基酸的化合物，不论是否经过翻译后修饰(例如磷酸化或糖基化)。亚基可以通过肽键或其他键，例如酯或醚键连接。术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括D/L光学异构体。

本文中提及多肽时使用的术语“分离的”是指多肽(1)与自然界中发现的蛋白质不相关，(2)不含来自相同来源的其他蛋白质(例如，不含人类蛋白质)，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界。分离的多肽可由，例如DNA或RNA，包含合成的DNA或RNA或其一些组合编码。

本文关于多肽使用的术语“基本上纯的”是指基本上不含与其天然相关的其他多肽、脂质、碳水化合物和核酸的多肽。基本上纯的多肽可以是从其天然环境中移出且至少为60％纯的任何多肽。基本上纯的多肽可以是至少约65、70、75、80、85、90、95或99百分比纯的多肽，或约65-75、75-80、80-85、85-90、90-95或95-99百分比纯的多肽。通常，基本上纯的多肽可在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上产生一条主要条带。在一些实施方式中，基本上纯的多肽可以是化学合成的多肽。

任何方法都可用于获得基本上纯的多肽。例如，可以使用亲和层析、HPLC等常见的多肽纯化技术以及多肽合成技术。此外，任何材料都可以作为获得基本上纯的多肽的来源。例如，来自野生型或转基因动物的组织可以用作源材料。此外，经工程化改造以过表达特定多肽的组织培养细胞可用于获得基本上纯的多肽。进一步地，多肽可以被工程化改造以包含允许多肽被捕获到亲和基质上的氨基酸序列。例如，标签如c-myc、血球凝集素、多组氨酸或Flag^TM标签(柯达公司(Kodak))可用于辅助多肽纯化。这样的标签可以插入多肽内的任何地方，包括羧基端或氨基端，或两者之间。其他可以使用的融合包括有助于检测多肽的酶，如碱性磷酸酶。

MANP(例如，相对于SEQ ID NO:3具有保守和/或非保守取代的变体MANP)，以及SEQID NO:3或变体MANP的片段(例如，SEQ ID NO:3至14中任一个的片段)，可以通过使用多种测定中的任何一种筛选其生物活性。例如，MANP的活性可以通过测试其对培养细胞(例如，培养的心脏成纤维细胞、主动脉内皮细胞或肾小球细胞)中cGMP生成的影响体外评估。可以将细胞暴露于MANP(例如，10^-10-10^-4M的MANP)，并测定样品以评估多肽对cGMP生成的影响。可以使用例如竞争性RIA cGMP试剂盒(珀金埃尔默生命科学公司(Perkin-Elmer)，马萨诸塞州，波士顿)检测和测量cGMP生成。

MANP的活性还可以体内评估，通过例如测试其对哺乳动物(例如人、非人灵长类、啮齿类、狗、猫、猪、羊、马或牛)给药后，对以下因素的影响例如：血浆cGMP水平，尿cGMP排泄，cGMP的肾净生成，肾小球滤过率，血压，心率，血流动力学功能如心输出量，肺楔压，全身血管阻力以及肾功能如肾血流量，尿量和钠排泄率等。在某些情况下，这些参数可以在哺乳动物诱发高血压后进行评估。

本文所用术语“核酸”涵盖RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成的(例如化学合成的)DNA。核酸可以是双链的或单链的。在单链的情况下，所述核酸可以是正义链或反义链。此外，核酸可以是环状或线性的。

本文中关于核酸使用的术语“分离的”是指天然产生的核酸，其与其来源生物体的天然产生的基因组中与其紧接的两个序列(一个在5’端，一个在3’端)都不紧接。例如，分离的核酸可以但不限于是任何长度的重组DNA分子，条件是在天然存在的基因组中通常紧侧接该重组DNA分子的核酸序列之一被除去或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于：独立于其他序列作为分离的分子存在的重组DNA(例如PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及纳入载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或纳入原核或真核生物的基因组DNA的重组DNA。此外，分离的核酸可包括重组DNA分子，其为杂交或融合核酸序列的部分。

本文关于核酸所用的术语“分离的”还包括任何非天然产生的核酸，因为这样的非天然产生的核酸序列不存在于自然界，且在天然产生的基因组中没有紧接的序列。例如，非天然产生的核酸例如工程改造的核酸被认为是分离的核酸。工程改造的核酸可利用一般分子克隆或化学核酸合成技术制造。分离的非天然产生的核酸可以是独立于其他序列的，或纳入载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或原核或真核生物的基因组DNA。此外，非天然产生的核酸可包括核酸分子，其为杂交或融合核酸序列的部分。

对本领域技术人员显而易见的是，存在于例如cDNA或基因组文库或含有基因组DNA限制性酶切物的凝胶切片中的数百至数百万其它核酸分子中的核酸不被认为是分离的核酸。

在一些情况下，分离的核酸分子可以是长度至少约12个碱基(例如长度至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、120、130、140、150、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基)，并且可以在杂交条件下与具有编码MANP的序列(例如具有SEQ ID NO:3所示序列的MANP或其变体)的核酸的正义或反义链杂交。杂交条件可以是中度或高度严谨杂交条件。

为了本文的目的，中度严谨杂交条件是指在约42℃的杂交溶液中进行杂交，该杂交溶液含有25mM KPO₄(pH 7.4)、5X SSC、5X Denhart's溶液、50μg/mL变性的经超声处理的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5x10⁷ cpm/μg)，而洗涤是在约50℃的洗涤溶液中进行的，该洗涤溶液含有2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。

高度严谨杂交条件是指在约42℃的杂交溶液中进行杂交，该杂交溶液含有25mMKPO₄(pH 7.4)、5X SSC、5X Denhart's溶液、50μg/mL变性的经超声处理的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5x10⁷ cpm/μg)，而洗涤是在约65℃的洗涤溶液中进行的，该洗涤溶液含有0.2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。

编码MANP的分离的核酸分子可以使用标准技术生产，包括但不限于一般分子克隆和化学核酸合成技术。例如，聚合酶链反应(PCR)技术可用于获得包含编码利钠多肽的核苷酸序列的分离核酸，如本文所提供的。PCR指酶促扩增靶核酸的方法或技术。通常，使用感兴趣的区域末端或之外的序列信息设计寡核苷酸引物，其与待扩增的模板相对链的序列一致。可用PCR从DNA和RNA扩增特定的序列，包括来自全基因组DNA或全细胞RNA的序列。引物长度通常为14-40个核苷酸，但长度也可在10个核苷酸至数百个核苷酸之间。一般PCR技术描述于例如《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer:A Laboratory Manual)，Dieffenbach和Dveksler编，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1995。当使用RNA作为模板来源时，可使用逆转录酶合成互补DNA(cDNA)链。连接酶链式反应、链置换扩增、自主维持序列复制或基于核酸序列的扩增可用于获得分离的核酸。参见，例如，Lewis(1992)Genetic Engineering News 12:1；Guatelli等.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878；和Weiss(1991)Science 254:1292。

编码MANP的分离核酸也可以化学合成，或作为单独核酸分子(例如，使用亚磷酰胺技术在3'至5'方向上使用自动DNA合成)，或者作为一系列寡核苷酸。例如，可以合成包含所需序列的一对或多对长寡核苷酸(例如>100个核苷酸)，每对包含互补的短区段(例如约15个核苷酸)，使得当寡核苷酸对退火时形成双链体。DNA聚合酶被用来延伸寡核苷酸，使得每个寡核苷酸对产生一个单独的双链核酸分子，然后可以连接到载体上。

此外，可通过诱变获得编码MANP的分离核酸。例如，用标准技术，包括通过PCR的寡核苷酸定向诱变和定点诱变来突变参照序列。参见例如《分子生物学简规》(Short Protocols in Molecular Biology)，第8章，格林出版协会(Green PublishingAssociates)和约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，Ausubel等编,1992。本文提供了变体利尿多肽的非限制性实例。

还提供了含有本文所述的核酸的载体。“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其中插入另一DNA区段以使所插入区段进行复制。“表达载体”是包含一种或多种表达控制序列的载体，而“表达控制序列”是控制并调节另一个DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

在表达载体中，核酸(例如，编码利钠多肽的核酸)可操作地连接到一个或多个表达控制序列。如本文所用的“操作性地连接”表示纳入遗传构建体从而表达控制序列有效地控制感兴趣的编码序列表达。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录中止区。启动子是由DNA分子区域组成的表达控制序列，通常在转录起始位点上游的100-500核苷酸内(一般接近RNA聚合酶II的起始位点)。为了将编码序列置于启动子控制之下，需要将所述多肽的翻译阅读框的翻译起始位点置于所述启动子下游的1-约50个核苷酸。增强子在时间、位置和水平上提供表达特异性。与启动子不同，增强子可在距转录位点不同距离的位置发挥功能。增强子也可以位于转录起始位点下游。编码序列“操作性地连接”细胞中的表达控制序列并“在其控制之下”，其时RNA聚合酶能将编码序列转录成mRNA，其随后可翻译为所述编码序列编码的蛋白质。因此，表达载体可用于产生抗体以及其它多价分子。

合适的表达载体包括，但不限于，来自例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒和腺相关病毒的质粒和病毒载体。各种载体和表达系统可购自以下公司，如诺瓦基公司(Novagen)(威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))、克隆泰克公司(Clontech)(加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto,CA))、司查塔基公司(Stratagene)(加利福尼亚州拉由拉(La Jolla,CA))和英杰/生命技术公司(Invitrogen/Life Technologies)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))。

表达载体可包括标签序列，其设计以促进所表达的核酸序列的随后操作(例如纯化或定位)。标签序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血球凝集素或Flag^TM标签(柯达公司，纽黑文，康涅狄格州)序列通常与编码的多肽融合表达。这样的标签可以插入多肽内的任何地方，包括羧基端或氨基端。

还提供了包含载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”意在包括原核和真核细胞，其中可被引入重组的表达载体(例如编码MANP的载体)。如本文所用，“转化”和“转染”包括通过多种技术之一将核酸分子(例如载体)引入细胞。尽管不限于特定的技术，但许多这些技术在本领域中是成熟的。转化和转染宿主细胞的合适的方法可见于，例如：于Sambrook等,《分 子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第二版),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory),纽约(1989)。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质体转染、显微注射和病毒介导的核酸转移可用于将核酸引入细胞。此外，裸DNA可直接递送到体内细胞，如他处所述(美国专利号5,580,859和5,589,466)。宿主细胞可表达编码的多肽，但应注意，不需要包含本文提供的分离核酸分子的细胞来表达多肽。转化进宿主细胞内的分离的核酸分子可被整合到宿主细胞的基因组中或维持在游离基因状态。因此，宿主细胞可用包含有本文提供的分离核酸分子的构建体稳定地或瞬时地转染。

可以使用任何适当的方法在体内或体外将分离的核酸分子引入细胞。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质体转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是可用于将分离的核酸分子引入细胞的方法。此外，裸DNA可直接递送到体内细胞，如他处所述(例如，美国专利号5,580,859和5,589,466及其延续)。进一步地，分离的核酸分子可通过生成转基因动物引入细胞。

可以使用任何适当的方法鉴定包含编码MANP的分离核酸分子的细胞。这些方法包括但不限于PCR和核酸杂交技术，例如Northern和Southern分析。在一些情况下，免疫组织化学和生化技术可通过检测该核酸分子编码的多肽的表达，以确定细胞是否包含特定分离的核酸分子。

本文所述的分离的MANP(编码MANP的核酸)和利尿剂可用于治疗鉴定为患有病症例如高血压(例如RH)的哺乳动物。因此，一种或多种利尿剂和一种或多种MANP(或编码一种或多种MANP的核酸)可以纳入组合物中以对哺乳动物(例如，患有或有风险患有高血压、RH和/或心肾疾病的哺乳动物)给药。可以使用任何适当的方法配制并随后给予组合物。剂量通常取决于哺乳动物对所给予药剂的响应性，疗程持续几天到几个月或更长，或直至达到合适的响应。本领域普通技术人员可常规地确定最佳剂量，给药方法和重复率。最佳剂量可根据各药剂(例如MANP和Fs)的相对效力变化，且通常可基于体外和/或体内动物模型中发现的有效的EC₅₀估计。本文所述的包含一种或多种MANP和一种或多种利尿剂的组合物可每天、每周、每月或甚至更不频繁地给予一次或更多次，或可在一段时间内(例如几小时、几天或几周)连续给药。例如，MANP或包含MANP的组合物可以至少约0.01ng MANP/kg至约100mgMANP/kg的体重剂量给予患者。在一些情况下，MANP或包含MANP的组合物可以输注的方式给予1-30天或更长时间(例如，以约1pmol MANP/kg/分钟至约500nmol MANP/kg/分钟的剂量)。

一种或多种MANP或编码一种或多种MANP的核酸和一种或多种利尿剂可以混合、包封、偶联或以其他方式关联彼此和/或其它分子、分子构建体或化合物混合物，例如脂质体、受体或细胞靶向分子、或用于辅助摄取、分布和/或吸收的口服、局部或其它制剂。

在一些实施方式中，组合物可包含MANP(或编码MANP的核酸)、利尿剂或两者皆有，与药学上可接受的运载体组合使用。药学上可接受的运载体包括，例如，药学上可接受的溶剂、助悬剂或任何其他药理学惰性的载剂，用于将多肽和/或其他化合物递送给对象。药学上可接受的运载体可以是液体或固体，并且在与一种或多种治疗性化合物和给定药物组合物的任何其他组分组合时，可以考虑计划的给药方式来选择，以提供所需的体积、稠度和其他相关的运输和化学性质。有用的药学上可接受的运载体包括但不限于：水；生理盐水；结合剂(例如聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖或葡萄糖和其他糖、明胶或硫酸钙)；润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂(例如淀粉或乙醇酸淀粉钠)；和润湿剂(如十二烷基硫酸钠)。

MANP或核酸和利尿剂可以存在于同一组合物中，或者可以存在于在同一时间或不同时间，经由相同途径或经由单独途径给药的单独组合物中。含有本文所述的MANP和利尿剂的药物组合物可以通过多种方法给予，这取决于所需要的是局部或全身治疗。给药可以是，例如，口服或肠胃外(例如，通过皮下、鞘内、心室内、肌肉内或腹膜内注射，或通过静脉(i.v.)滴注)。给药可以是快速的(例如，通过注射)或可以在一段时间内发生(例如，通过缓慢输注或缓释制剂的给药)。

用于肠道外、鞘内或心室内给药的化合物和制剂包括无菌水性溶液(例如无菌生理盐水)，其也可包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂(例如渗透增强剂、运载体化合物和其他药学上可接受的运载体)。用于口服给药的组合物和制剂包括，例如，粉末或颗粒、水中或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。这些组合物也可以加入增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。

药物组合物包括但不限于溶液、乳液、水性悬浮液和含脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分生成，所述组分包括例如预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。乳剂制剂由于其易于配制和增溶、吸收和生物利用度的功效，特别适用于治疗性组合物的口服递送。由于其特异性和在药物递送点提供作用的持续时间，脂质体特别有用。

组合物可包含任何药学上可接受的盐，酯或这种酯的盐，或任何其他化合物，其在给予对象时能够(直接或间接地)提供相关化合物(例如MANP或利尿剂)的生物学活性代谢物或残基。因此，例如，本文提供MANP和利尿剂的药学上可接受的盐，前药和这种前药的药学可接受的盐和其他生物等效物。前药是以非活性形式制备并在体内或其细胞内通过内源性酶或其它化学物质和/或条件的作用转化为活性形式(即药物)的治疗剂。术语“药学上可接受的盐”指的是本文提供的方法中有用的生理学和药学上可接受的MANP和利尿剂的盐(即，保持母体化合物所需的生物学活性而不赋予不需要的毒理作用)。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，与阳离子(例如钠、钾、钙或多胺如精胺)形成的盐；与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸或硝酸)形成的酸加成盐；与有机酸(如乙酸、柠檬酸、草酸、棕榈酸或富马酸)形成的盐；和与元素阴离子(如溴、碘或氯)形成的盐。

组合物另外包含在药学组合物中常规存在的其他辅助组分。因此，组合物还可包括相容的药学活性材料，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或用于物理配制各种剂型组合物的附加材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。进一步地，组合物可与助剂混合，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂、渗透增强剂和芳香族物质。但是，当加入时，这些材料不应过度干扰组合物中其他组分的生物学活性。

在一些情况下，MANP可以被配制为缓释剂型。例如，MANP或利尿剂可配制为控释制剂。在一些情况中，涂层、包膜或保护基质可配制为包含本文所述的一种或多种MANP。这种涂层、包膜和保护基质可用于涂覆留置装置例如支架、导管和腹膜透析管。在一些情况下，多肽可被纳入聚合物、脂质体、微乳剂、微粒、纳米颗粒或蜡中。

本文公开的药学制剂，其可方便地以单位剂型存在，可根据任何合适的方法制备，包括制药工业中已知的常规技术。这些技术包括使活性成分与所需药物运载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体运载体或细分的固体运载体或两者均匀且紧密地结合，然后在必要时使产品成型来制备制剂。如果需要可以将制剂灭菌，条件是灭菌的方法不干扰制剂中含有的分子的有效性。

在一些实施方式中，MANP和/或利尿剂例如Fs可制备以通过注射、贮库聚合物、药物贴剂、泵或微粒/纳米颗粒皮下递送。例如但不限于，PCT公开号WO 2008/061355公开的用于制备在水凝胶管中递送的多肽的材料和方法。多肽可以适合用于本文所述方法的量与一种或多种药学上可接受且与多肽相容的赋形剂混合。例如，多肽可与一种或多种赋形剂组合，例如但不限于微晶纤维素、胶体二氧化硅、乳糖、淀粉、山梨醇、环糊精及其组合。赋形剂可以是固体、半固体或液体材料，其用作多肽的载剂、运载体或介质。在一些实施方式中，多肽在嵌入水凝胶管之前，可以用一种或多种赋形剂压缩、压实或挤出。这种制备可产生具有所需释放性能、改进的稳定性和/或其它所需性能的药物组合物。

药物组合物也可包括助剂或赋形剂，例如助流剂、溶解剂、表面活性剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂。例如，溶解剂可增加多肽从剂量制剂中溶解的速率，可包括，例如，有机酸和/或有机酸的盐(例如，柠檬酸钠与柠檬酸)。在这些制剂中有用的赋形剂的其他实例包括：合成的、半合成的、改性的和天然的聚合物(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、PEG、环糊精、烷氧基-改性环糊精、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、微晶纤维素、白蛋白、葡聚糖、麦芽糖醇(malitol)、木糖醇、高岭土和甲基纤维素)。所述多肽也可以与润滑剂(例如，滑石、硬脂酸镁、硬脂酸或矿物油、硬脂酸钙、氢化植物油、苯甲酸钠、氯化钠、亮氨酸碳蜡、十二烷基硫酸镁或单硬脂酸甘油酯)、润湿剂、乳化和悬浮剂或防腐剂(例如羟基苯甲酸甲酯或丙酯)混合。

可添加到药物组合物中的其它试剂可在MANP或利尿剂化合物的溶解和治疗有效血浆浓度曲线的建立时改变微环境的pH。这种试剂包括无机酸的盐和氢氧化镁。可用的其他试剂包括表面活性剂和其他增溶材料。

有用的稀释剂包括，例如，药学上可接受的惰性填料，例如微晶纤维素、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖或其它糖、磷酸氢钙、硫酸钙、纤维素、乙基纤维素、纤维素衍生物、高岭土、甘露醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、山梨醇或其它糖醇、干淀粉、糖类、糊精、麦芽糊精或其它多糖、肌醇或其组合。在一些情况中，水溶性稀释剂特别有用。

助流剂可用于改进组合物成分在加工期间的流动和压缩性。有用的助流剂包括，例如，二氧化硅胶体(也称为硅胶、煅制二氧化硅、轻无水硅酸、硅酸酐和气相二氧化硅)。

适用于本文所述药物组合物的表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠、聚乙烯硬脂酸酯、聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯烷基醚、苯甲酸苄酯、溴棕三甲胺、十六醇、多库酯钠、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、卵磷脂、中链甘油三酯、单乙醇胺、油酸、泊洛沙姆、聚乙烯醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯。

合适的崩解剂包括例如淀粉、淀粉乙醇酸钠、交聚维酮、交联羧甲基纤维素、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、果胶、甲基丙烯酸钾-二乙烯基苯共聚物、聚乙烯醇)、乙酰胺、碳酸氢钠、碳酸钠、淀粉衍生物、糊精、β环糊精、糊精衍生物、氧化镁、粘土、膨润土及其组合。

在一些实施方式中，MANP和/或利尿剂可被纳入水凝胶递送系统。例如，MANP可配制成经由干凝胶-水凝胶系统皮下递送给患者，其可在延长的时间内以连续持续的方式释放多肽。参见例如，美国专利号5,226,325和PCT公开号WO 2004/071736。

用于制备水凝胶管的液体可聚合材料包括多种可聚合的亲水性和烯键式不饱和化合物。参见,例如,列于PCT公开号WO 2008/061355的化合物。这些亲水性单体的混合物通常用在聚合反应中。选择单体的类型和比例以产生聚合物(例如，交联均相聚合物)，其在水合时具有预期应用或用途的所需特性(例如，平衡水含量(EWC)值和/或孔径)。

在一些情况中，亲水性单体的混合物的聚合可产生均一的亲水共聚物，其在不同程度上溶于水性介质。在这样的情况下，可以在单体混合物中包括少量(例如，多至约3％)可共聚的多烯键式不饱和交联剂，以获得不溶于水且水可溶胀的均相交联共聚物。(羟乙基)甲基丙烯酸酯(HEMA)的轻度交联均聚物具有约38％的EWC值。HEMA和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)的交联共聚物的EWC值低于38％，而HEMA和丙烯酰胺的交联共聚物的EWC值高于38w/v％。因此，根据有用或有效的多肽洗脱率，可以定制共聚物水凝胶以所需的速率洗脱多肽。通常，共聚物包含约15至约70重量％的HEMA单位和约85至30重量％的第二烯单体(second ethylenic monomer)，因此具有在约20％至约75％范围内的EWC值。在一些实施方式中，共聚物混合物可进一步包括少量多烯键式不饱和交联剂[例如，乙二醇二甲基丙烯酸酯(“EDMA”)或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(“TMPTMA”)]。

在一些实施方式中，用于在对象中控释递送MANP的药物组合物可包括(a)多肽(其中多肽具有至少一个碱性官能团)和衍生自六羟基环己烷的聚阴离子(其中聚阴离子具有至少两个带负电官能团)复合物；(b)一种药学上可接受的运载体，其包含可生物降解的、不溶于水的聚合物。这种组合物描述于例如PCT公开号WO 2006/017852中，并且可以例如溶液、悬浮液、分散体、乳液、滴剂、气雾剂、乳膏、半固体、糊剂、胶囊、片剂、固体植入物或微粒的形式制备。如本文所用，术语“控释递送”是指在给药后一段时间(例如，数天至数周或数月)内在体内持续递送药剂。可以通过例如多肽随时间的持续治疗效果(例如，症状随时间持续减少)来证明MANP的持续控释递送。多肽的持续递送也可以通过检测体内多肽随时间的存在来证明。该组合物可提供低的初始突释递送，随后是多肽在体内长时间(例如，从数天到数月)的稳定、受控释放。

在这些实施方式中，多肽和聚阴离子的适当组合后，可形成物理和化学稳定的复合物。该复合物可在多肽和聚阴离子的水性制备物结合后以沉淀形式产生。任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂可被纳入该复合物。这些赋形剂可作为多肽和/或复合物的稳定剂。合适的赋形剂的非限制性实例包括：亚硫酸氢钠、对氨基苯甲酸、硫脲、甘氨酸、蛋氨酸、甘露醇、蔗糖和PEG。

在多肽和聚阴离子之间的稳定复合物可纳入药学上可接受的运载体，其包含可生物降解的、不溶于水的聚合物，可选地与一种或多种赋形剂。属于“可生物降解的不溶于水的聚合物”指的是可用于体内的生物相容性的和/或可生物降解的合成的和天然的聚合物。该术语还意在包括在37℃下不溶于或变得不溶于水或生物流体的聚合物。可以使用本领域已知的技术纯化该聚合物(例如，去除单体和寡聚物)参见例如，美国专利号4,728,721。有用的聚合物的实例包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚己内酯、聚二噁烷酮、聚碳酸酯、聚羟基丁酸酯、聚草酸亚烷基酯、聚酸酐、聚酰胺、聚酯酰胺、聚氨酯、聚缩醛、聚原碳酸酯、聚磷腈、聚羟基戊酸酯、聚亚烷基琥珀酸酯和聚原酸酯，以及其共聚物、嵌段共聚物、支化共聚物、三元共聚物和组合。

可生物降解的不溶于水的聚合物还可包括封端、未封端或封端和未封端聚合物的混合物。封端聚合物通常定义为具有封端的羧基端基，而未封端聚合物具有游离的羧基端基。

在确定聚合物的合适分子量时要考虑的因素可包括所需的聚合物降解速率、机械强度和聚合物在溶剂中的溶解速率。聚合物的有用分子量可为约2,000道尔顿至约150,000道尔顿，例如，具有1.1至2.8的多分散性，这取决于选择使用哪种聚合物。

药学上可接受的运载体可以是具有环境响应特性(例如，热敏感、pH敏感或电敏感)的运载体，呈可注射溶液或悬浮液、颗粒、薄膜、丸剂、圆柱体、圆盘、微胶囊、微球、纳米球、微粒、晶片、胶束、脂质体或任何其他可用于药物递送的聚合物构型的形式。

形成各种药学上可接受的聚合物运载体的方法包括本领域已知的那些。参见例如，美国专利号6,410,044；5,698,213；6,312,679；5,410,016；5.529,914；5,501,863；4,938,763；5,278,201；和5,278,202；以及PCT公开号WO 93/16687。

当多肽/聚阴离子复合物分散在聚合物基质中以形成固体植入物时可产生组合物，其可被注射或植入对象。此类植入物可使用常规聚合物熔融加工技术制备，例如挤出、压塑和注塑。此类植入物的制备可以在无菌条件下进行，或替代地通过辐射以最终灭菌(例如，使用γ辐射或电子束灭菌)。

在一些实施方式中，微球形式的组合物可以通过将多肽/聚阴离子复合物包封在聚合物的运载体中生产，使用具有适合递送至不同生物环境或实现特定功能的特性的各种生物相容性和/或可生物降解聚合物。多肽的溶解速率和因此的递送由诸如包封技术、聚合物组成、聚合物交联、聚合物厚度、聚合物溶解度以及多肽/聚阴离子复合物的大小和溶解度等因素决定。

为了制备这样的微球，可以将待包封的多肽/聚阴离子复合物悬浮在有机溶剂中的聚合物溶液中，使得聚合物溶液完全包覆多肽/聚阴离子复合物。然后可使悬浮液经过微囊化技术，例如喷雾干燥、喷雾冷凝、乳化或溶剂蒸发乳化。例如，悬浮的复合物或微粒与聚合物在有机溶剂中一起转移到更大体积的含有乳化剂的水性溶液中，使得有机溶剂蒸发或扩散离开聚合物，并且固化的聚合物包封多肽/聚阴离子复合物。

可用于制备包封的多肽/聚阴离子复合物的乳化剂包括例如泊洛沙姆和聚乙烯醇。可用于此类方法的有机溶剂包括乙酸、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿和其他取决于聚合物性质的无毒溶剂。通常选择溶解聚合物且最终无毒的溶剂。

在一些实施方式中，MANP可以储库形式配制，其可以持续提供高暴露水平并且可以快速达到高暴露水平(滞后期短或没有)。参见例如，美国公开号2010/0266704。储库制剂可包括MANP或其药学上可接受的盐(例如，与无机酸、聚合酸或有机酸形成的酸加成盐)。酸加成盐可以单价或二价盐形式存在，这取决于加入的是一个还是两个酸当量。

如美国公开号2010/0266704中所述，储库制剂可包含两种不同的线性聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物，其丙交酯：乙交酯共聚单体(L:G)的摩尔比为85:15至65:35，其中至少一种聚合物具有低特性粘度。这种制剂可以在延长的时间内提供多肽的持续高血浆水平。合适的聚合物的实例包括由勃林格殷格翰制药公司GmBH&Co.KG(BoehringerIngelheim Pharma GmBH&Co.KG)(德国殷格翰(Ingelheim,Germany))、可吸收聚合物国际公司(Absorbable Polymers International)(阿拉巴马州佩勒姆(Pelham,AL))和阿尔凯默斯公司(Alkermes,Inc.)(马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA))分别以商品名

和

销售的线性聚(D,L-丙交酯)和聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物。

用于皮下给药的高暴露储库制剂可显示立即或至少非常快速的作用，从而在短时间内(例如，皮下注射后1、2、3、4、5、6或7天)达到治疗性血浆浓度，并且可以在大约一个月或更长时间内显示出持续的高暴露水平。

在一些实施方式中，本文提供的储库制剂可包含以95:5至50:50重量％的比例混合或掺混的两种不同的PLGA聚合物(例如，85:15至50:50、80:20至60:40、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45或50:50重量％)。在一些实施方式中，具有较高特性粘度的聚合物可具有比具有较低特性粘度的聚合物更高的重量％。在一些实施方式中，具有较高特性粘度的聚合物可具有酯端基。储库制剂可包括其他聚合物，包括其他线性或星形PLGA聚合物，或聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)或聚乳酸(PLA)聚合物，条件是保留有利的PK特性。

储库制剂多肽含量(装载量)可以在1％至30％范围内(例如，10％至25％，更优选为15％至20％)。装载量定义为多肽与PLGA制剂总质量的重量比。

储库组合物可无菌制备，或可非无菌制备并最终灭菌(例如，使用γ辐射)。最终灭菌可产生具有最高无菌保证可能的产品。

储库组合物也可包含一种或多种药物赋形剂，其可调节多肽的释放行为。这种赋形剂可以以约0.1％至约50％的量存在于组合物中。合适的赋形剂包括但不限于聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、糊精、PEG、表面活性剂例如泊洛沙姆(也称为聚(氧乙烯-嵌段-氧丙烯)、商品名为

的市售可得的聚(氧乙烯)-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、卵磷脂、无机盐如碳酸锌、氢氧化镁、碳酸镁、鱼精蛋白和含有胺残基的天然或合成聚合物如聚赖氨酸。

就组成、分子量和/或聚合物结构而言，储库组合物可以包含不同聚合物的混合物或掺混物。聚合物掺混物在本文中定义为两种不同的线性聚合物在一个植入物或微粒中的固溶体或悬浮液。储库的混合物在本文中定义为不同组成的两种类-储库植入物或微粒或半固体制剂与每储库中一种或多种PLGA的混合物。其中两种PLGA以聚合物掺混物的形式存在的药物储库组合物可能特别有用。

药物储库组合物可以是植入物、半固体(胶体)、液体溶液、微粒或一旦注射就原位固化的悬浮液的形式。以下段落聚焦于聚合物微粒，尽管这些描述也适用于植入物、半固体和液体。

微粒的直径可从几亚微米到几毫米(例如，从约0.01微米到约2mm、约0.1微米到约500微米、约10到约200微米、约10到约130微米，或约10到约90微米)。

在一些实施方式中，微粒与抗附聚剂混合或用抗附聚剂涂覆。合适的抗附聚剂包括，例如，甘露醇，葡萄糖，右旋糖，蔗糖，氯化钠和水溶性聚合物例如聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和PEG。

微粒可以使用本领域已知的工艺制造，例如凝聚或相分离、喷雾干燥或油包水(W/O)、水包油包水(W/O/W)、或水包油包固体(S/O/W)乳液/悬浮液的方法，然后进行溶剂萃取或溶剂蒸发。乳液/悬浮液法可能特别有用，可包括以下步骤：

(i)制备内部有机相，其包括

(a)将一种或多种聚合物溶解在合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯、丙酮、THF、乙腈或卤代烃例如二氯甲烷、氯仿或六氟异丙醇)或溶剂混合物中，并任选地溶解/分散合适的添加剂；

(b)将步骤(a)获得的聚合物溶液中的多肽溶解/悬浮/乳化；

(ii)制备含有一种或多种稳定剂(例如，聚(乙烯醇)、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)或明胶)和任选的缓冲盐的外部水相；

(iii)将内部有机相和外部水相混合以形成乳液；且

(iv)通过溶剂蒸发或溶剂萃取硬化微粒，洗涤微粒(例如用水)，收集并干燥微粒(例如通过冷冻干燥或真空干燥)，并筛分微粒(例如，经过140μm)。

干燥微粒组合物可整批地或分散到最终容器中后通过γ辐射最终灭菌。在一些实施方式中，整批灭菌的微粒可重悬于合适的载剂中并分散进合适的装置中，例如双室注射器，并随后冷冻干燥。

在一些实施方式中，微粒储库组合物可包括促进重构的载剂。此外，在给药之前，微粒可被重悬在合适的注射用载剂中(例如，含有一种或多种药物赋形剂例如甘露醇、氯化钠、葡萄糖、右旋糖、蔗糖或甘油的水基载剂，和/或一种或多种非离子表面活性剂例如泊洛沙姆、聚(氧乙烯)-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯、羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)或单硬脂酸铝)。

本文还提供了用于治疗患有心血管疾病(例如，高血压、顽固性高血压或心肌梗塞)的哺乳动物的方法。该方法包括给予(例如口服、肠胃外或口服和肠胃外组合法)本文提供的MANP和利尿剂。治疗可有益地影响或减轻与疾病相关的一种或多种症状，或疾病的一种或多种根本原因。例如，治疗可降低哺乳动物的血压。

在向哺乳动物给药MANP或核酸及利尿剂，或一种或多种含有MANP和利尿剂的组合物前，评估哺乳动物以确定该哺乳动物是否有治疗心血管疾病例如高血压(例如RH)的需求。鉴定该哺乳动物需要这种治疗后，用本文所述的组合物治疗该哺乳动物。例如，可以将含有MANP的组合物以有效实现期望效果(例如，降低哺乳动物血压，或防止或推迟哺乳动物血压的进一步升高)的任何量、任何频率和任何持续时间给予哺乳动物。

在一些实施方式中，可以肠胃外给予(例如，通过注射，例如皮下注射，或通过口服摄取)包含MANP的组合物，以约0.01ng多肽/kg至约100mg多肽/kg体重(例如，约10ng多肽/kg至约50mg多肽/kg、约20ng多肽/kg至约10mg多肽/kg、约0.1ng多肽/kg至约20ng多肽/kg、约3ng多肽/kg至约10ng多肽/kg、约10ng/多肽/kg至约50ng多肽/kg、约50ng多肽/kg至约100μg多肽/kg、约1μg多肽/kg至约10μg多肽/kg，约1μg多肽/kg至约5μg多肽/kg，约3μg多肽/kg至约7μg多肽/kg，约5μg多肽/kg至约10μg多肽/kg，约10μg多肽/kg至约20μg多肽/kg，或约20μg多肽/kg至约100μg多肽/kg)体重的剂量，尽管其他剂量也可提供有益的结果。在一些情况下，MANP可以以输注的方式给予，以剂量为例如约1pmol/kg/分钟至约500nmol/kg/分钟(例如，约1至10pmol/kg/分钟、约10至约100pmol/kg/分钟、约100至300pmol/kg/分钟、约250至500pmol/kg/分钟、约500pmol/kg/分钟至约1nmol/kg/分钟、约1至10nmol/kg/分钟，约10至100nmol/kg/分钟，约100至300nmol/kg/分钟，或约250至500nmol/kg/分钟)。

利尿剂可以以至少约1μg/kg至约500mg/kg体重的剂量(例如，约1至10μg/kg、约10至50μg/kg、约50至100μg/kg、约100至500μg/kg、约500μg/kg至约1mg/kg、约1至5mg/kg、约5至10mg/kg、约10至50mg/kg、约50至100mg/kg、或约100至500mg/kg)给予，尽管其他剂量也可提供有益结果。应注意，由于MANP的增强效果，利尿剂的剂量可以随着时间减少。因此，虽然利尿剂最初可以约1至5mg/kg的剂量给予，但随着时间的推移，剂量可滴定降下来。

MANP和利尿剂可给药一次(例如通过植入或注射储库组合物)或不止一次(例如通过重复注射或口服给药)。当给药超过一次时，给药频率可以从一天一次或多次(例如，一天一次、两次、三次、四次或更多次)到大约每隔一个月一次(例如，一周三至五次、一周大约一次、一个月大约两次、一个月大约一次或每隔一个月大约一次)。此外，给药频率可以保持恒定或可以在治疗的持续时间内变化。多种因素可以影响特定应用所需使用的实际给药频率。例如，有效量，治疗持续时间，给药途径，以及病症的严重程度可能需要增加或减少给药频率。

在一些实施方式中，MANP利钠多肽或含有MANP的组合物可经由第一途径(例如，静脉注射)给药第一时间段，然后可经由另一途径(例如，皮下)给药第二时间段。例如，含有MANP的组合物可以静脉注射给哺乳动物(例如人)，以约1pmol/kg/分钟至约500nmol/kg/分钟的剂量持续1小时至7天(例如，1到2小时、2到4小时、4至6小时、6至8小时、8至12小时、12至24小时、24至48小时、48至36小时、3至4天、4至5天、5至6天或6至7天)，随后可以约0.01ng/kg至约100mg/kg的剂量皮下注射给哺乳动物，每天1至3次，持续5至30天或更长时间(例如，5至7天、7至10天、10至14天、14至21天、21至28天、28至30天或超过30天)。

给予哺乳动物的MANP(或编码MANP的核酸)和利尿剂的有效量是足够改变所选参数(例如血压)至少10％的量。例如，在一些实施方式中，MANP和利尿剂的“有效量”是与治疗前相同参数的水平相比，或与对照未治疗哺乳动物中的参数的水平相比，足以增加钠尿和/或利尿(或增加或减少钠尿和/或利尿的特性如血浆cGMP水平、尿cGMP排泄、肾净cGMP生成、尿流量、尿钠排泄、尿钾排泄、血细胞比容、血浆BNP免疫反应性、肾血流量、血浆ANP免疫反应性、肾血管阻力、钠的近端和远端重吸收分数、平均动脉压、肺毛细血管楔压、右心房压、肺动脉压、血浆肾素活性、血浆血管紧张素II水平、血浆醛固酮水平、肾灌注压和全身血管阻力)至少10％(例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少100％)的量。因此，在一些情况下，MANP和利尿剂的有效量是与在给药MANP和利尿剂之前或未给药MANP和利尿剂的哺乳动物中的血压相比，或与对照未治疗哺乳动物中的“正常”血压相比，将被鉴定为患有高血压(例如，RH)的哺乳动物中的血压降低至少10％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％或至少50％)的量。MANP的有效量还可以是足以增强利尿剂有效性，使得利尿剂的有益效果(例如，降低血压)比在无MANP的情况下给予相同量的利尿剂时观察到的效果增加(例如，增加约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％)的量。有效量的MANP还可将利尿剂的不良影响(例如肾素-血管紧张素-醛固酮激活)与无MANP给予利尿剂时观察到的不良影响相比降低至少约5％(例如，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％)。

在一些实施方式中，可以滴定给予哺乳动物的MANP和利尿剂的量和频率，以便，例如，确定最有效地治疗高血压同时具有最少量的不良影响的剂量。如果哺乳动物无法对特定量产生反应，那么可以增加量，例如，2倍、3倍、5倍或10倍。在接受较高浓度后，可以监测该哺乳动物治疗的反应和毒性症状，并据此做出给药剂量和/或频率的相应调整。有效量可以保持恒定或可以根据哺乳动物对治疗的反应以滑动量或可变剂量进行调整。

给药频率可以是减少(例如哺乳动物体内心血管或心肾疾病)症状而不会对哺乳动物产生显著毒性的任何频率。例如，给药频率可以从每天约四次到每隔一个月约一次，或者从每天约一次到每月约一次，或者从每隔一天约一次到每周约一次。此外，给药频率可以保持恒定或可以在治疗的持续时间内变化。与有效量一样，多种因素可以影响用于特定应用的实际给药频率。例如，有效量，治疗持续时间，给药途径，以及肾脏疾病的严重程度可能需要增加或减少给药频率。

给药的有效持续时间可以是降低哺乳动物体内高血压或心肾疾病症状而不对哺乳动物产生显著毒性的任何持续时间。有效持续时间可以从一天到几天、几周、几个月或几年不等。通常，有效持续时间可以在几天到几个月的持续时间范围内。例如，有效持续时间可以在约1到2周至约36个月的范围内，或甚至更长。在一些情况下，治疗可能会持续整个个体哺乳动物的一生。多种因素可以影响用于特定治疗方案的实际有效持续时间。例如，有效持续时间可随给药频率，给药量，给药途径和病症严重程度变化。

向哺乳动物给药本文所述的MANP和利尿剂后，可以监测该哺乳动物以确定病症是否已改善。例如，可以在治疗后评估哺乳动物，以确定该哺乳动物病症的一种或多种症状是否已经减轻(例如，该哺乳动物的血压是否已经降低)。如果哺乳动物无法对特定剂量的MANP和利尿剂产生反应，那么可以增加单个或两者的量，例如，2倍、3倍、5倍或10倍。在接受较高浓度后，可以监测该哺乳动物对治疗的反应和毒性症状，并据此做出相应调整。有效量可以保持恒定或可以根据哺乳动物对治疗的反应以滑动量或可变剂量进行调整。

在一些情况下，本文提供的方法可以包括向哺乳动物给予一种或多种组合物，其中唯一的活性成分是利尿剂和MANP。在这类情况下，例如，给药可以由给予其中唯一活性成分是MANP和利尿剂的组合物组成，或给药可以由给予其中唯一活性成分是MANP的第一组合物和其中唯一活性成分是利尿剂的第二组合物组成。

在一些情况下，本文提供的方法可以包括向哺乳动物给予一种或多种组合物，其中唯一的活性成分是利尿剂，MANP，以及ACE抑制剂、ARB或CCB中任一个。在这种情况下，例如，给药可由给予其中唯一活性成分是MANP，利尿剂和ACE抑制剂；或MANP，利尿剂和ARB；或MANP，利尿剂和CCB的组合物组成，或给药可由给予其中唯一活性成分为MANP的第一组合物，其中唯一活性成分为利尿剂的第二组合物和其中唯一活性成分为ACE抑制剂，ARB或CCB的第三组合物组成。应注意，在某些情况下，三种活性成分中的两种(例如，MANP抑制剂和利尿剂，MANP和ACE抑制剂、ARB或CCB，或利尿剂和ACE抑制剂、ARB或CCB)可以在一种组合物中给药，第三活性成分可以在单独的组合物中给药。

在一些情况下，本文提供的方法可以包括向哺乳动物给予一种或多种组合物，其中唯一的活性成分是利尿剂，MANP，ACE抑制剂或ARB，和CCB。在这种情况下，例如，给药可由给予其中唯一活性成分是MANP，利尿剂和ACE抑制剂或ARB，和CCB的组合物组成，或给药可由给予其中唯一活性成分为MANP的第一组合物，其中唯一活性成分为利尿剂的第二组合物，其中唯一活性成分为ACE抑制剂或ARB的第三组合物和其中唯一活性成分为CCB的第四组合物组成。应注意，在某些情况下，所述活性成分中的两种(例如，MANP和利尿剂，MANP和ACE抑制剂或ARB，MANP和CCB，利尿剂和ACE抑制剂或ARB，利尿剂和CCB，或ACE抑制剂或ARB和CCB)可以在一种组合物中给药，其他两种活性成分可以在单独的组合物中给药。此外，在某些情况下，所述活性成分中的三种(例如，MANP，利尿剂，和ACE抑制剂或ARB；MANP，利尿剂，和CCB；MANP，ACE抑制剂或ARB，和CCB；或利尿剂，ACE抑制剂或ARB，和CCB)可以在一种组合物中给药，剩余活性成分可以在单独的组合物中给药。

在一些情况下，本文提供的方法可以包括鉴定哺乳动物患有高血压(例如，RH)，然后给向哺乳动物给药MANP和利尿剂(例如，Fs)。具有鉴定哺乳动物患有高血压或RH的能力可以允许这些哺乳动物得到正确的鉴定，并以有效和可靠的方式用MANP和利尿剂进行组合治疗。例如，本文所述的RH治疗(例如，MANP和Fs的组合)可用于治疗鉴定为患有RH的高血压患者。

以下通过实施例进一步说明本发明，这些实施例对于权利要求书描述的本发明范围不构成约束。

实施例

实施例1–MANP和Fs在大鼠中的效果

在自发性高血压大鼠(SHR)中进行研究以检测MANP(SEQ ID NO:3)和Fs在BP和醛固酮刺激上单独和组合的效果，SHR是研究最多和广泛使用的人原发性高血压遗传模型(Lerman等.(2019)Hypertension 73(6):e87-e120)。将SHR(n＝32)随机分成10组：

组1–用载剂盐水处理(Veh)；

组2–用1mg/kg Fs单独处理(Fs1)；

组3–用5mg/kg Fs单独处理(Fs5)；

组4–用10mg/kg Fs单独处理(Fs10)；

组5–用100pmol/kg/分钟MANP单独处理(MANP100)；

组6–用300pmol/kg/分钟MANP单独处理(MANP300)；

组7–用600pmol/kg/分钟MANP单独处理(MANP600)；

组8–用Fs5+MANP300处理；

组9–用Fs10+MANP300处理；以及

组10–用Fs10+MANP600处理。

Fs作为单次推注给药，在组8、9、10中，随后是60分钟的MANP输注。

Fs1(Δ＝-40±9*)、Fs5(Δ＝-55±8*)、Fs10(Δ＝-63±11*)、MANP 300(Δ＝-70±19*)和MANP600(Δ＝-93±20*^&#)单独治疗降低了平均动脉压(MAP,mmHg)；在组合的Fs5+MANP300(Δ＝-90±15*^&#)、Fs10+MANP300(Δ＝-93±6*^&#)和Fs10+MANP600(Δ＝-95±9*^&#)治疗组中观察到更大效果(图2A-2C)。Fs、MANP和Fs+MANP组BP的降低与钠排泄和尿流量增加相关(*p<0.05)，但在Fs和Fs+MANP组之间未观察到钠尿或利尿的显著差异。血浆cGMP在MANP和MANP+Fs组中显著增加，但在单独的Fs组没有变化(图3A-3C)。血浆醛固酮倾向于随着低剂量和高剂量Fs增加，并且在Fs+MANP组中增加显着减弱(p<0.05)(图4)。特别是对于MANP+Fs组，BP的更大下降与cGMP的更大增加相关(图5)。

因此，MANP+Fs比单独使用Fs具有更强的降低BP效果，并且还抑制Fs诱导的醛固酮活化。Fs和MANP均诱导利尿和尿钠排泄，而MANP也可能介导血管舒张，为Fs+MANP更强的抗高血压作用提供了可能的解释。因此，这些研究表明，MANP是治疗RH的有效附加药物，以增强Fs的抗高血压作用。

实施例2–MANP和Fs在HEK293细胞和大鼠中的效果

MANP的研究扩展到进一步研究其在SHR中的急性剂量依赖性心肾和神经体液作用，确认其在过度表达pGC-A的HEK293细胞中直接激活cGMP的作用，并检测人原代血管细胞中MANP介导的cGMP激活，其为高血压的重要器官损害靶点。这些包括人主动脉平滑肌细胞和人主动脉内皮细胞，两者都天然表达pGC-A。

方法

细胞培养：使用Lipofectamine(英杰公司(Invitrogen)，纽约州格兰德岛(GrandIsland,NY))用pGC-A(cDNA克隆来自傲锐基因公司(Origene)，马里兰州罗克维尔(Rockville,MD))转染HEK293细胞。转染的细胞维持在达氏改良的伊氏培养基(Dulbecco’smodified Eagle’s medium)中，补充有10％胎牛血清(FBS)(吉布可公司(Gibco)),100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和250μg/mL G418(遗传霉素)抗生素。HAEC(隆萨公司(Lonza)，马里兰州沃克斯维尔(Walkersville,MD))在含有EGM-2生长因子和补充剂(隆萨公司)和10％FBS(吉布可公司)的EBM-2培养基(隆萨公司)中培养。HASMC(ScienCell,加利福尼亚州圣迭戈(San Diego,CA))在含有SMC生长因子补充剂(SMCGS)、青霉素/链霉素(ScienCell)和FBS(ScienCell)的平滑肌细胞培养基(SMCM)(ScienCell)中培养。

胞内cGMP:在80％至90％融合度时处理细胞。简而言之，将细胞在含有20mmol/LN-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸]、0.1％牛血清白蛋白和0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylzanthine)的缓冲液中孵育(西格玛(Sigma)，圣路易斯，密苏里州(St.Louis,MO))。处理的细胞在未接受任何处理(对照)或持续10分钟的MANP(SEQ IDNO:3；10^-8M,10^-7M或10^-6M)。对每个浓度的MANP或对照进行三次重复实验，然后收集细胞裂解物。根据制造商的方案使用直接cGMP ELISA试剂盒(恩佐生物科学公司(Enzo LifeSciences)，纽约州法明代尔(Farmingdale,NY)测定样品。使用BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，伊利诺州洛克福德(Rockford,IL))定量样品中的总蛋白质浓度。结果表示为每毫克总蛋白质的cGMP皮摩尔数。

SHR中的急性研究方案：在男性SHR高血压遗传模型中研究了MANP、Fs或其组合的心肾和神经体液作用(每组n＝6)。大鼠在诱导室中吸入2.5％异氟烷麻醉。在这个短期麻醉状态期间，给大鼠腹膜内注射(IP)硫仲丁比妥钠盐(Inactin)100mg/kg以维持麻醉。使用氧气面罩直到实验结束。颈动脉插管用于动脉压测量，右颈静脉插管用于输液。数字记录和分析血压(Sonometrics,加拿大安大略省伦敦(London,Ontario,Canada))。通过下腹壁上的一个小切口，将膀胱插管进行尿液取样。

制备后立刻静脉内输注菊粉开始30分钟的平衡期。进行15分钟基线清除，其由血流动力学测量和动脉血取样组成。基线测量后，大鼠被随机分配成10组：

组1–用MANP100处理；

组2–用MANP300处理；

组3–用MANP600处理；

组4–用Fs1处理；

组5–用Fs5处理；

组6–用Fs10处理；

组7–用MANP300+Fs5处理；

组8–用MANP300+Fs10处理；

组9–用MANP600+Fs10处理；以及

组10–用菊粉、生理盐水或菊粉和生理盐水处理。

对于组1-3，在15分钟导入MANP输注后，连续输注MANP共60分钟。组4-6的动物接受单次静脉内(IV)推注Fs给药。MANP+Fs组7-9接受了Fs单次IV推注，然后是15分钟MANP导入输注，再以相同剂量连续输注60分钟MANP。对照动物(组10)接受了连续菊粉输注作为MANP的对照，单次IV推注0.9％生理盐水作为Fs的对照，或接受单次IV推注0.9％生理盐水和连续菊粉输注的组合作为MANP+Fs治疗的对照。

神经体液和电解质分析：通过放射免疫测定法(凤凰药业(PhoenixPharmaceuticals))测量血浆ANP作为MANP的评估，因为ANP RIA完全检测MANP(ANP RIAfully detects MANP)(Burnett等.(1986)Science 231(4742):1145-1147)。通过ELISA确定血浆和尿液cGMP(恩佐生物科学公司)和醛固酮(DRG国际公司(DRG International)，新泽西州斯普林菲尔德(Springfield,NJ))。使用蒽酮法测量菊粉浓度，如别处所述(Fuhr等.(1955)Klin.Wochenschr 33:729-730)。通过菊粉清除率计算GFR。通过火焰光度法(IL943，仪器实验室公司(Instrumentation Laboratory)，英国)测量电解质。根据制造商的说明进行所有测量。

统计学分析：值以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。通过斯氏t检验进行独立组的比较。使用单向ANOVA测试后再做Dunnett事后检验进行组内比较。使用双向ANOVA测试组间比较，然后进行Bonferroni事后检验(Statistica 8.0)。统计学显著性被定义为p值<0.05。

结果

过表达人pGC-A的HEK293和原代人主动脉内皮细胞和人主动脉平滑肌细胞中的体外cGMP激活：图6A显示了转染了人pGC-A受体的HEK293细胞经MANP处理后cGMP产生的体外测量结果。cGMP水平随着MANP浓度的逐渐增加而增加。与无治疗的对照组相比，MANP显著增加了cGMP水平。MANP剂量增加也导致HAEC和HASMC中cGMP水平显著增加(图6B和6C)。与HEK293细胞类似，无治疗组没有明显效果。

体内研究－全身血液动力学：表2显示了基线时MANP、Fs、MANP+Fs和对照组的SHR的动脉BP。对BP的效果示于图7A-7C和图8。与对照组相比，MANP300和MANP600显著降低了BP(图7A)。在60分钟处，BP的最大降低出现在高剂量(MANP600)组中(图8)。与对照相比，所有三个剂量的Fs都显著降低了BP(图7B和图8)。然而，单独MANP600比单独Fs1或Fs5有更显著的抗高血压效果(图8)。在组合治疗组中，向Fs5或Fs10中添加MANP300，以及向Fs10中添加MANP600，与单独Fs(单药治疗)相比显著减少了BP(MANP300+Fs5对比单独Fs5、MANP300+Fs10对比单独Fs10和MANP600+Fs10对比单独Fs10的p<0.05)(图7C和图8)。因此，MANP+Fs组合疗法显著增强了Fs的抗高血压效果。

体内研究－神经体液分析：表2总结了基线时MANP、Fs、MANP+Fs和对照组的血浆cGMP水平数据。血浆cGMP在3个时间点处(基线、30分钟和60分钟)测定，与对照组相比，MANP300和MANP600处理后剂量依赖性增加(图9A)。相比较而言，Fs不改变血浆cGMP(图9B)，但在MANP+Fs组中血浆cGMP显著增加(图9C)。

表2

MANP、Fs、MANP+Fs和载剂组中血浆cGMP和BP基线值

处理	基线BP(mmHg)	基线cGMP(pM/mL)
			对照(载剂)	163±10	36±5
MANP 100	166±11	42±6
			MANP 300	165±9	48±3
MANP 600	169±7	57±3
			Fs 1	165±5	56±2
Fs 5	168±11	51±3
			Fs 10	169±8	48±5
MANP 300+Fs5	169±8	43±9
			MANP 300+Fs10	168±9	43±6
MANP 600+Fs10	170±7	41±1

尿cGMP排泄在MANP300和MANP600给药后剂量依赖性显着增加，并且与对照相比，在MANP300+Fs5、MANP300+Fs10和MANP600+Fs10给药后也显着增加(图10)。Fs组中无显著增加，其与载剂(对照)组无区别(图10)。

图11显示了醛固酮评估。MANP在100pmol/kg/分钟和300pmol/kg/分钟的剂量下降低了醛固酮，但在600pmol/kg/分钟时不降低。与对照、MANP100和MANP300组相比，Fs5和Fs10组中醛固酮水平显著更高。在组合组中，MANP300+Fs5组相比单独Fs5醛固酮显著降低，并且MANP300+Fs10和MANP600+Fs10相比单独Fs10也是如此。因此，MANP+Fs治疗能抑制Fs诱导的醛固酮活化。

单独或与Fs组合输注MANP导致血浆ANP免疫反应性显著增加，其为MANP免疫反应性的量度(表3)。在神经体液因子中，血浆ANP水平与血浆cGMP显著相关(r＝0.75,p<0.001)(图12)。在血液动力学参数中，血浆cGMP浓度与BP显著相关(r＝-0.65,p<0.001)(图13)。

体内研究－肾功能：对GFR、尿钠排泄量(UNaV)和水排泄量(UV)的影响绘制在图14A-14C中。与无处理对照组相比，Fs组的GFR显着较低，但与Fs组相比，MANP300+Fs10和MANP600+Fs10组的GFR增加(图14A)。MANP单独以及与Fs组合给药后，尿钠排泄量(图14B)和水排泄量(图14C)都有显著增加。

表3

在MANP、Fs、MANP+Fs或载剂的60分钟处理后的血浆ANP水平

处理	ANP(pG/mL)
		载剂	19±1
MANP 100	430±99
		MANP 300	2577±568
MANP 600	20611±3041
		Fs 1	14±1
Fs 5	16±3
		Fs 10	19±3
MANP 300+Fs5	7089±507
		MANP 300+Fs10	6362±417
MANP 600+Fs10	11561±1259

其它实施方式

应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。

序列表

<110> 梅约医学教育与研究基金会（Mayo Foundation for Medical Education andResearch）

<120> 顽固性高血压的组合治疗

<130> 07039-1841WO1

<150> US 62/758,009

<151> 2018-11-09

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

20 25

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Arg Ile Thr Ala Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35 40

<210> 4

<211> 123

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

agcctgcgga gatccagctg cttcgggggc aggatggaca ggattggagc ccagagcgga 60

ctgggctgta acagcttccg gtaccggata acagccaggg aggacaagca gggctgggcc 120

tag 123

<210> 5

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Ala Arg

20 25 30

Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Gln Gly Tyr Ala

35 40

<210> 7

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Ser Gln Gly Trp Ala

35 40

<210> 8

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Gln

35

<210> 9

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met

1 5 10 15

Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

20 25 30

Arg Ile Thr Ala Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35 40

<210> 10

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Ser Leu Lys Lys Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35 40

<210> 11

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Ser是D-同种型

<400> 11

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35 40

<210> 12

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Arg是D-同种型

<400> 12

Ser Leu Arg Arg Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala

1 5 10 15

Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala Arg

20 25 30

Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35

<210> 13

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Thr Leu Arg Arg Thr Thr Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35 40

<210> 14

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Ser Trp Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Ile Thr Ala

20 25 30

Arg Glu Asp Lys Gln Gly Trp Ala

35 40

Claims (34)

1.一种用于治疗哺乳动物的方法，其包括：

向所述的哺乳动物给予M-心房利钠肽(MANP)，以及

向所述的哺乳动物给予利尿剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物被鉴定为患有高血压。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述高血压是顽固性高血压(RH)。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述MANP具有SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述MANP具有SEQ ID NO：5至14中任一项所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述利尿剂是呋塞米。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述MANP是静脉内给药。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述MANP是以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量给药。

10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述MANP是皮下给药。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述MANP是以约0.1ng/kg至约10mg/kg的剂量给药。

12.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述MANP是静脉内给药，随后皮下给药。

13.如权利要求12中所述的方法，其中，所述MANP以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量静脉内给药，随后以约0.1ng/kg至约100mg/kg的剂量皮下给药。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述利尿剂是口服给药。

15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述利尿剂是静脉内给药。

16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述利尿剂是皮下给药。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述MANP和所述利尿剂是在同一组合物中同时给药。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述MANP和所述利尿剂是皮下给药。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述方法由向哺乳动物给予所述MANP和所述利尿剂组成。

20.一种用于增强利尿剂在哺乳动物中的一种或多种有益效果并减少一种或多种不良影响的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予所述利尿剂和MANP。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述哺乳动物被鉴定为患有高血压。

22.如权利要求21所述的方法，其中，所述高血压是RH。

23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述MANP具有SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。

24.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述MANP具有SEQ ID NO：5至14中任一项所示的氨基酸序列。

25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中，所述利尿剂是呋塞米。

26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。

27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中，所述MANP和所述利尿剂是静脉内给药。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述MANP是以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量给药。

29.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中，所述MANP和所述利尿剂是皮下给药。

30.如权利要求29所述的方法，其中，所述MANP是以约1μg/kg至约10μg/kg的剂量给药。

31.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中，所述MANP和所述利尿剂是静脉内给药，随后皮下给药。

32.如权利要求31中所述的方法，其中，所述MANP以约10pmol/kg/分钟至约100nmol/kg/分钟的剂量静脉内给药，随后以约1μg/kg至约10μg/kg的剂量皮下给药。

33.如权利要求20-32中任一项所述的方法，其中所述一种或多种有益效果包括降低哺乳动物的血压，且其中所述一种或多种不良影响包括醛固酮激活。

34.如权利要求20-33中任一项所述的方法，其中所述方法由给予组合物组成，其中唯一的活性成分是所述利尿剂和所述MANP。

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