ES2691749T3 - Tejido no tejido que contiene material protésico óseo - Google Patents

Abstract

Tejido no tejido que contiene un material protésico óseo en el que el material protésico óseo está incluido entre fibras biocompatibles que constituyen el tejido no tejido, el material protésico óseo presenta un diámetro de partícula de 50 a 5000 μm, y el tejido no tejido presenta una porosidad de 80 a 97%.

Description

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DESCRIPCION

Tejido no tejido que contiene material protesico oseo.

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un tejido no tejido que contiene un material protesico oseo.

Tecnica anterior

En la actualidad, los “tratamientos de implante” estan extendidos universalmente. Los tratamientos de implante designan procedimientos para reparar perdidas dentales debido al envejecimiento, enfermedades periodontales, o similares, mediante el implante de una rafz dental artificial en un hueso alveolar, y cubriendo la rafz dental implantada con una corona artificial y una superestructura.

Cuando se pierde un diente, (es decir, cuando se extrae un diente), el hueso alveolar que ha soportado el diente se absorbe y se reduce inmediatamente. Por tanto, durante los tratamientos de implante, a menudo se encuentra que el hueso alveolar es de grosor insuficiente para la implantacion de la rafz dental artificial. El grosor insuficiente del hueso alveolar hara probablemente que el diente artificial implantado sea inestable. Por tanto, cuando el hueso alveolar presenta grosor insuficiente, se realiza injerto oseo o regeneracion osea.

El metodo de GBR (regeneracion osea guiada) es una de las tecnicas comunes para la regeneracion del hueso alveolar. En el metodo de GBR, se coloca hueso autogeno pulverizado o un material protesico oseo en la parte (parte afectada) en la que el hueso alveolar esta reducido, y se coloca una membrana (tambien denominada membrana de proteccion o membrana de GBR) sobre el mismo (es decir, la parte afectada rellena con el material protesico oseo se cubre con la membrana). De este modo, el metodo de GBR promueve la regeneracion del hueso alveolar a la vez que impide la entrada del tejido gingival. Sin embargo, los materiales protesicos oseos existentes son insuficientes en cuanto a la union celular y la proliferacion celular. Por este motivo, la regeneracion del hueso alveolar lleva mucho tiempo. Ademas, puesto que los materiales protesicos oseos existentes presentan adhesividad insuficiente a los huesos alveolares y retencion insuficiente en la parte afectada, a menudo se produce fuga del material incluso una vez que el material esta cubierto con la membrana de GBR.

Ademas, aunque los tratamientos de implante ocasionalmente utilizan cemento oseo, el cemento oseo presenta un inconveniente porque bloquea la infiltracion celular.

Tal como se describio anteriormente, los materiales de regeneracion osea disponibles actualmente adolecen de union celular y proliferacion celular insuficientes.

Con el fin de resolver tales inconvenientes, se continuo con el estudio y el desarrollo para inventar un material de regeneracion osea adecuado para regeneracion osea (en particular, de hueso alveolar) (por ejemplo, veanse los documentos de patente 1, 2 y 3). El documento de patente 3 da a conocer un andamiaje poroso para regeneracion osea, que comprende fibras electrohiladas y una pluralidad de partfculas que presentan un diametro de 1 a 8 micrometres. El andamiaje presenta una porosidad de aproximadamente el 90% y las partfculas se pulverizan sobre el andamiaje durante el electrohilado.

Listado de referencias

[Documento de patente 1] WO2007/132186 [Documento de patente 2] JP2007-32554 3A [Documento de patente 3] WO2008/093341

Sumario de la invencion

Problema tecnico

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un material de regeneracion osea adecuado para regeneracion osea (en particular, de hueso alveolar).

Solucion al problema

Sorprendentemente, los inventores de la presente invencion encontraron que un tejido no tejido que contiene un material protesico oseo en el que el material protesico oseo esta incluido entre las fibras, que son fibras biocompatibles, puede servir como material de regeneracion osea que garantiza eficacia de proliferacion celular significativamente alta (en particular, de osteoblastos) (alta capacidad de proliferacion celular). Los inventores realizaron intentos para mejorar adicionalmente este tejido no tejido, y finalmente completaron la presente invencion, tal como se define por las reivindicaciones.

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Efectos ventajosos de la invencion

Cuando el tejido no tejido que contiene un material protesico oseo de la presente invencion se utiliza como andamiaje de cultivo celular, la eficacia de proliferacion celular (en particular, de osteoblastos) aumenta significativamente (es decir, aumenta la capacidad de proliferacion celular). Ademas, en particular, cuando el tejido no tejido se utiliza como andamiaje para el cultivo de osteoblastos, proporciona el efecto de un aumento en la eficacia de regeneracion osea, puesto que el tejido no tejido contiene un material protesico oseo. Por tanto, el tejido no tejido puede utilizarse adecuadamente como material de regeneracion osea. Mas espedficamente, en casos de dano oseo debido a factores externos (por ejemplo, accidente), o en casos de absorcion o perdida de hueso debido a factores internos (por ejemplo, osteoporosis, periodontitis, etc.), el tejido no tejido de la presente invencion permite la regeneracion osea rapida (espedficamente, al implantarse en o unirse a la parte afectada).

Breve descripcion de los dibujos

[Figura 1] Vista esquematica sencilla que representa un procedimiento de produccion de tejido no tejido utilizando un metodo de electrohilado.

[Figura 2] Imagenes que representan un ejemplo de un electrodo de masa utilizado para la produccion del tejido no tejido de la presente invencion.

[Figura 3] Vistas en seccion transversal que representa el tejido no tejido de la presente invencion (y un tejido no tejido general producido mediante un metodo de electrohilado).

[Figura 4] Imagenes (tomadas mediante un microscopio electronico de barrido) de secciones transversales del tejido no tejido de la presente invencion.

[Figura 5] Grafico que presenta las capacidades de proliferacion celular de las muestras 1 a 3 del tejido no tejido de la presente invencion.

[Figura 6a] Imagen de un fragmento tisular para mostrar el nivel de infiltracion de un tejido conjuntivo en un material protesico oseo en forma de bloque cuando el material protesico oseo en forma de bloque (bloque de OSferion) se implanta en una rata. La lmea discontinua exterior muestra el contorno del material protesico oseo implantado, y la lmea de puntos interior muestra el extremo superior del tejido infiltrado en el material protesico oseo.

[Figura 6b] Imagen de un fragmento tisular para mostrar el nivel de infiltracion de un tejido conjuntivo en un tejido no tejido cuando el tejido no tejido de la presente invencion se implanta en una rata. La lmea discontinua exterior muestra el contorno del tejido no tejido implantado, y la lmea de puntos interior muestra el extremo superior del tejido infiltrado en el tejido no tejido.

[Figura 7] Imagenes de celulas tenidas con HE tras realizar cultivos celulares utilizando diferentes tipos de tejido no tejido como andamiaje; y distancias de infiltracion celular encontradas a partir de las imagenes.

[Figura 8] Resultados de la medicion del tamano de poro de materiales textiles no tejidos; e imagenes de celulas tenidas con HE tras realizar cultivos celulares utilizando los materiales textiles no tejidos como andamiaje.

[Figura 9] Dibujos que representan esquematicamente un metodo de medicion para determinar la distancia entre fibras (distancia interfibra).

[Figura 10] Resultados de la medicion del tamano de poro de materiales textiles no tejidos; imagenes de celulas tenidas con HE tras realizar cultivos celulares utilizando los materiales textiles no tejidos como andamiaje; y distancias de infiltracion celular encontradas a partir de las imagenes.

Mejor modo de poner en practica la invencion

La presente invencion se describe con mayor detalle a continuacion. El termino “masa” en la presente memoria es equivalente a “peso”.

La presente invencion se refiere a un tejido no tejido que contiene un material protesico oseo. En el tejido no tejido, el material protesico oseo esta incluido entre fibras que constituyen el tejido no tejido. Ademas, estas fibras son fibras biocompatibles.

El material protesico oseo contenido en el tejido no tejido puede seleccionarse de materiales conocidos, incluyendo P-TCP (P-fosfato de tricalcio), a-TCP (a-fosfato de tricalcio), HA (hidroxiapatita), DCPD (fosfato de calcio dibasico dihidratado), OCP (fosfato de octacalcio), 4CP (fosfato de tetracalcio), alumina, circona, aluminato de calcio (CaO-

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AI2O3), aluminosilicate (Na2O-Al2O3-SiO2), vidrio bioactivo, cuarzo y carbonato de calcio. Mas espedficamente, pueden utilizarse fragmented que contienen estos componentes (preferentemente, fragmentos de estos componentes). El material protesico oseo puede estar compuesto por uno de estos componentes, o una combinacion de dos o mas componentes. Los materiales protesicos oseos compuestos por una combinacion de dos o mas componentes incluyen materiales compuestos por un fragmento o fragmentos, cada uno de los cuales contiene dos o mas componentes; o materiales compuestos por multiples fragmentos, cada uno de los cuales presenta un solo componente.

Ademas, cada fragmento del material protesico oseo presenta un tamano que puede incluirse en un tejido no tejido o mas pequeno. Cada fragmento puede presentar una forma arbitraria, tal como una partteula, una forma de bloque, una forma de cilindro, y similares.

El diametro de partteula de cada fragmento del material protesico oseo es preferentemente menor que el grosor del tejido no tejido. El tamano de partteula es de 50 a 5000 |im, de manera adicionalmente preferible de 75 a 5000 |im, de manera adicionalmente mas preferible de 150 a 3000 |im, de manera particularmente preferible de 500 a 1500 |im. Este diametro de partteula es un valor encontrado mediante un metodo de tamizado en seco. Mas espedficamente, el tamano de partteula es un valor encontrado utilizando un agitador Ro-Tap (de rotacion y percusion) que contiene un tamiz segun la regla JIS Z8801. Un material protesico oseo que presenta el diametro de partteula espedfico puede obtenerse a traves de un metodo de tamizado en seco. Ademas, el diametro de partteula de un material protesico oseo con diametro de partteula desconocido tambien puede encontrarse mediante un metodo de tamizado en seco. La expresion “diametro de partteula” en la presente memoria no es para especificar que el material protesico oseo se limita a una forma en polvo, sino solo para definir el intervalo de tamano anterior. El valor de “diametro de partteula” definido en la presente memoria tambien puede encontrarse para un material protesico oseo que presenta otras formas (por ejemplo, una forma de bloque, una forma de cilindro, o similares).

El tejido no tejido de la presente invencion tambien puede seleccionarse de entre materiales protesicos oseos disponibles comercialmente. Los ejemplos de los mismos incluyen OSferion (Olympus Terumo Biomaterials Corp.), Boneceram (Olympus Terumo Biomaterials Corp.), Neobone (MMT Co., Ltd.), Osteograft-S (Japan Medical Materials) y Apaceram (Pentax Corporation).

En el tejido no tejido de la presente invencion, el material protesico oseo existe entre multiples (un gran numero de) fibras del tejido no tejido. Mas espedficamente, el material protesico oseo no se incorpora dentro de una sola fibra, sino que se incorpora entre las fibras que constituyen el tejido no tejido. En otras palabras, las fibras del tejido no tejido estan presentes con el material protesico oseo enmaranado entre ellas. Las fibras del tejido no tejido de la presente invencion son fibras biocompatibles que contienen un polfmero biocompatible. Las fibras biocompatibles son preferentemente biodegradables en un organismo vivo. La cantidad del polfmero biocompatible contenido en las fibras generalmente es de mas del 50% en masa, preferentemente no menos del 75% en masa, mas preferentemente no menos del 80% en masa, de manera adicionalmente preferible no menos del 85% en masa, de manera adicionalmente mas preferible no menos del 90% en masa, de manera particularmente preferible no menos del 95% en masa, de la manera mas preferible sustancialmente del 100% (es decir, una fibra biocompatible compuesta solo por un polfmero biocompatible es lo mas preferible).

Un polfmero biocompatible designa un polfmero que provoca poca o ninguna respuesta de cuerpo extrano cuando se adhiere a o se incluye en un tejido vivo (en otras palabras, un polfmero que no provoca ningun efecto adverso o estimulacion grave en un organismo vivo durante un largo periodo de tiempo; es decir, puede coexistir con tejidos vivos a la vez que garantiza la funcion original). Los ejemplos de tales polfmeros biocompatibles incluyen polfmeros bioabsorbibles y polfmeros biodegradables.

Los ejemplos espedficos de polfmeros biocompatibles incluyen poli(acido lactico), poli(acido glicolico), copolfmero de poli(acido lactico)-poli(acido glicolico), policaprolactona, poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poliestireno, policarbonato, poli(carbonato de hexametileno), poliarilato, poli(isocianato de vinilo), poli(isocianato de butilo), poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de n-propilo), poli(metacrilato de n- butilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de etilo), poli(acrilato de butilo), poliacrilonitrilo, poli(acetato de vinilo), polivinil metil eter, polivinil etil eter, polivinil-n-propil eter, polivinilisopropil eter, polivinil-n-butil eter, polivinilisobutil eter, polivinil-terc-butil eter, poli(cloruro de vinilo), cloruro de polivinilideno, poli(N-vinilpirrolidona), poli(N- vinilcarbazol), poli(4-vinilpiridina), polivinilmetil cetona, polimetil isopropenil cetona, oxido de polietileno, oxido de polipropileno, oxido de policiclopenteno, poliestirenosulfona, Teflon® (politetrafluoroetileno), policianoacrilato, polieter eter cetona, poliuretano, poliimida, poli(cloruro de vinilo), polietileno (incluyendo polietileno de peso molecular super alto), polipropileno, poli(tereftalato de etileno), poli(fluoruro de vinilideno) (poli(difluoruro de vinilideno)), polisulfona, polieter sulfona; y copolfmeros de los mismos y polfmeros sinteticos similares, celulosa regenerada, diacetato de celulosa, triacetato de celulosa, metilcelulosa, propilcelulosa, bencilcelulosa, fibroma, caucho natural y biomacromoleculas similares y derivados de los mismos. Los ejemplos tambien incluyen quitina, gelatina, colageno, poliaminoacidos (polilisina, poliarginina), acido hialuronico, sericina, dextrano y pululano.

Entre ellos, los polfmeros biocompatibles preferidos incluyen poliesteres alifaticos tales como poli(acido lactico), poli(acido glicolico), copolfmero de poli(acido lactico)-poli(acido glicolico), polihidroxibutirato, policaprolactona,

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poli(adipato de etileno), poli(adipato de butileno), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno) y policianoacrilato, o copoUmeros de los mismos; y policarbonatos alifaticos tales como poli(carbonato de butileno) o poli(carbonato de etileno). Ejemplos preferibles adicionales incluyen poli(acido lactico), poli(acido glicolico), copoKmero de poli(acido lactico)-poli(acido glicolico) y policaprolactona. Entre ellos, es particularmente preferible poli(acido lactico). Estos polfmeros biocompatibles pueden utilizarse de manera individual, o en una combinacion de dos o mas.

En tanto que los efectos de la presente invencion no resulten afectados, pueden utilizarse otros polfmeros o compuestos (por ejemplo, copolfmeros de polfmeros, combinaciones de polfmeros, fosfolfpidos, otros compuestos, y mezclas de los mismos).

El diametro de fibra promedio de las fibras del tejido no tejido es preferentemente de aproximadamente 0,05 a 20 |im, mas preferentemente de aproximadamente 0,1 a 5 |im, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente 0,1 a 3 |im. Este intervalo de diametro de fibra promedio permite la facil adhesion de osteoblastos, y tambien es ventajoso en lo que se refiere a mejorar la eficacia de regeneracion osea. El diametro de fibra promedio es un valor encontrado midiendo el diametro de cada fibra en una imagen de microscopio electronico del tejido no tejido, y encontrando un diametro promedio de 50 fibras seleccionadas aleatoriamente.

Un grosor adecuado del tejido no tejido puede determinarse segun la parte afectada (el sitio de defecto oseo en el que se aplica el tejido no tejido). El grosor es preferentemente de aproximadamente 0,1 a 5 cm, mas preferentemente de aproximadamente 0,1 a 1 cm, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente 0,1 a 0, 5 cm. El “grosor” del tejido no tejido en la presente memoria designa una longitud del tejido no tejido en la direccion del grosor medida sin aplicar presion. El grosor puede medirse utilizando un calibre de grosor (calibre de grosor digital, Ozaki Co., Ltd., DG-205M), y similares.

La densidad aparente ((g/cm3), es decir, {peso de tejido no tejido (g)/volumen de tejido no tejido (cm3)}) del tejido no tejido de la presente invencion es preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,6, mas preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,5, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente 0,1 a 0,4, de manera adicionalmente mas preferible de aproximadamente 0,1 a 0,3, aun mas preferentemente de aproximadamente 0,15 a 0,25, de manera particularmente preferible de aproximadamente 0,15 a 0,2. Si el material protesico oseo contenido en el tejido no tejido es p-TCP o a-TCP, es particularmente preferible que la densidad aparente se encuentre dentro del intervalo anterior. El volumen (cm3) del tejido no tejido se encuentra en este caso cortando el tejido no tejido para dar un rectangulo (de aproximadamente 4 cm2), midiendo la longitud vertical, la longitud horizontal y el grosor del rectangulo utilizando un calibre de grosor; y multiplicando la longitud vertical, la longitud horizontal y el grosor.

La porosidad del tejido no tejido de la presente invencion es del 80 al 97%, del 85 al 97%, del 90 al 97%, del 90 al 95%, del 91 al 95%, del 91,5 al 95% y del 92 al 95%, en este orden. La porosidad (%) puede encontrarse a partir de la densidad (densidad real) de las fibras del tejido no tejido y la densidad del material protesico oseo. Mas espedficamente, los volumenes de las fibras y el material protesico oseo pueden encontrarse dividiendo el peso de las fibras contenidas en una parte de 1 cm3 del tejido no tejido de la presente invencion y el peso del material protesico oseo entre sus densidades reales. Por consiguiente, restando el valor total de los volumenes de 1 (cm3) y multiplicando el valor resultante por 100, puede encontrarse la porosidad (%) del tejido no tejido. La siguiente formula muestra este calculo.

[Mat. 1]

porosidad del tejido no tejido (%) = [1-{(peso de fibra/densidad real de fibra) + (peso de material protesico oseo/densidad real de material protesico oseo)}] x 100

La porosidad (%) de la parte de fibras del tejido no tejido tambien puede encontrarse dividiendo el volumen (cm3) de las fibras entre un valor obtenido restando el volumen (cm3) del material protesico oseo de 1 (cm3), y multiplicando el resultado del calculo por 100. La siguiente formula muestra este calculo.

[Mat. 2]

porosidad de las fibras del tejido no tejido (%) = [1-[(peso de fibra/densidad real de fibra)/{1-(peso de material protesico oseo/densidad real de material protesico oseo)}]] x 100

La porosidad de las fibras del tejido no tejido es preferentemente de aproximadamente el 85 al 99,99%, mas preferentemente de aproximadamente el 90 al 99,99%, incluso mas preferentemente de aproximadamente el 97,5 al 99,99%, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente el 98 al 99,8%.

La densidad real en la presente memoria descriptiva se encuentra segun el metodo de expansion a volumen constante. La medicion de la densidad real puede realizarse, por ejemplo, utilizando un picnometro automatico en seco (AccuPyc 1330; Shimadzu Corporation).

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La porosidad del tejido no tejido y la porosidad de las fibras del tejido no tejido que se encuentran dentro del intervalo anterior facilitan particularmente la infiltracion celular; y tambien mejoran la permeabilidad de la sangre y los lfquidos corporales, y permite la facil invasion de nuevos vasos sangumeos tras la regeneracion tisular. En la presente invencion, la porosidad de las fibras del tejido no tejido de la presente invencion es mayor que la de un tejido no tejido general. Aunque no se desea una interpretacion restrictiva, se supone que la incorporacion de un material protesico oseo entre fibras aumenta la porosidad. Pese a la alta porosidad entre las fibras, cuando se aplica una presion sobre el tejido no tejido de la presente invencion, el grosor del tejido no tejido se recupera en cierta medida al liberar la presion (por ejemplo, cuando se presiona el tejido no tejido con una mano, el grosor se recuperara en cierta medida al retirar la mano). Tambien se supone que esto se deriva de la incorporacion de un material protesico oseo entre las fibras.

El tamano de poro del tejido no tejido de la presente invencion es preferentemente de aproximadamente 0,5 a 500 |im, mas preferentemente de aproximadamente 1 a 100 |im, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente 2 a 50 |im, de manera adicionalmente mas preferible de aproximadamente 3 a 30 |im, de manera particularmente preferible de aproximadamente 6 a 20 |im.

El tamano de poro del tejido no tejido en esta memoria descriptiva designa el valor de modo de una muestra de medicion obtenida despegando la capa de superficie del tejido no tejido de la presente invencion. El valor de modo se encuentra segun el metodo de semisecado (regla ASTM E1294-89) utilizando un perfluoropoliester (intervalo de clase = 1 |im). La medicion del tamano de poro puede realizarse utilizando un porometro de flujo de capilaridad (CFP-1200-aEl, Porous Materials, Inc.).

Ademas, el tejido no tejido de la presente invencion presenta una parte de fibras gruesas y una parte de fibras densas (mas espedficamente, la distribucion de fibras presenta densidad variable). La distancia interfibra de la parte de fibras densas es preferentemente de aproximadamente 5 a 40 |im, mas preferentemente de aproximadamente 10 a 30 |im, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente 15 a 25 |im. La distancia interfibra de la parte de fibras gruesas es preferentemente de aproximadamente 50 a 100 |im. La distancia interfibra del tejido no tejido en esta memoria descriptiva designa un valor encontrado detectando fibras a partir de una imagen de un bloque congelado de tejido no tejido obtenida mediante un microscopio, y encontrando la distancia utilizando los datos de fibras detectados segun el metodo del centroide.

La proporcion del material protesico oseo en el tejido no tejido de la presente invencion es preferentemente de aproximadamente el 10 al 98%, mas preferentemente de aproximadamente el 50 al 98%, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente el 80 al 98%.

La proporcion del material protesico oseo en esta memoria descriptiva designa un valor encontrado mediante la siguiente formula.

{material protesico oseo contenido en el tejido no tejido(g)/tejido no tejido (g)}x100(%)

La cantidad (g) del material protesico oseo en el tejido no tejido se encuentra midiendo el peso del residuo una vez que se disuelve el poli(acido lactico) en el tejido no tejido de la presente invencion mediante diclorometano (mas espedficamente, una vez que se disuelve la parte de fibras del tejido no tejido).

El tejido no tejido de la presente invencion puede producirse mediante un metodo de electrohilado. El electrohilado es un metodo bien conocido para producir tejido no tejido. Mas espedficamente, los metodos de electrohilado se realizan descargando una disolucion, que se obtiene disolviendo un polfmero (y, segun sea necesario, un adyuvante de dispersion) en un disolvente volatil (por ejemplo, cloroformo, diclorometano, alcohol hexafluoroisopropflico, o una disolucion mixta de los mismos) en un campo electroestatico formado entre los electrodos, y formando hebras de la disolucion hacia el electrodo (electrodo de masa), produciendo de ese modo una sustancia similar a una fibra. La figura 1 muestra una vista esquematica sencilla de un metodo de electrohilado. El metodo mostrado en la figura 1 es solo un ejemplo de un metodo de electrohilado, y puede utilizarse cualquier metodo de electrohilado conocido que pueda producir el tejido no tejido de la presente invencion para la produccion del tejido no tejido de la presente invencion. La figura 1 se describe brevemente a continuacion. Mediante la aplicacion de una alta tension a una disolucion disuelta de polfmero en una jeringa (que presenta una boquilla en el extremo superior), se descarga la disolucion de polfmero como una gota conica definida. Ademas, aumentando adicionalmente la tension, se expulsa (pulveriza) la disolucion hacia el electrodo de masa (por ejemplo, cobre, aluminio, etc.), formando de ese modo una fibra fina (es decir, tejido no tejido) sobre el electrodo de masa. Por tanto, en el metodo de la figura 1, el electrodo de masa tambien sirve como colector.

En la presente invencion, la concentracion del polfmero biocompatible en la disolucion disuelta de polfmero biocompatible utilizada para el metodo de electrohilado puede determinarse de manera adecuada; la concentracion es en general de aproximadamente el 1 al 30% en masa, preferentemente de aproximadamente el 2 al 25% en masa, mas preferentemente de aproximadamente el 3 al 20% en masa.

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Ademas, la distancia entre los electrodos (en la figura 1, la distancia entre la jeringa y el electrodo de masa) depende generalmente de la cantidad de carga, el tamano de la boquilla, la cantidad de flujo de Kquido durante el hilado, la concentracion del ffquido de hilado y similares, y puede determinarse de manera adecuada. Por ejemplo, cuando la tension aplicada es de aproximadamente 10 kV, la distancia es preferentemente de aproximadamente 5 a 50 cm, mas preferentemente de aproximadamente 10 a 30 cm. Ademas, el potencial electroestatico que va a aplicarse es en general de aproximadamente 3 a 100 kV, preferentemente de aproximadamente 5 a 50 kV, de manera adicionalmente preferible de aproximadamente 5 a 30 kV.

En el metodo de produccion del tejido no tejido de la presente invencion, se suministra un material protesico oseo durante la produccion del tejido no tejido utilizando un metodo de electrohilado. Mas espedficamente, por ejemplo, el tejido no tejido de la presente invencion puede producirse pulverizando una pequena cantidad de una disolucion disuelta de poffmero biocompatible utilizando un metodo de electrohilado para obtener un tejido no tejido, dispersando una cantidad apropiada de material protesico oseo en el tejido no tejido, y pulverizando adicionalmente la disolucion disuelta de polfmero biocompatible en el mismo. El tejido no tejido de la presente invencion se realiza preferentemente repitiendo esta serie de etapas de varias veces a varias decenas de veces (de manera espedfica, de aproximadamente 2 a 50 veces, preferentemente de aproximadamente 5 a 10 veces). En otras palabras, el procedimiento de produccion del tejido no tejido de la presente invencion incluye el procedimiento de produccion anterior, y preferentemente incluye de varias a varias decenas de veces del procedimiento. Un procedimiento de produccion preferible es un metodo de pulverizar la disolucion disuelta de polfmero biocompatible a una velocidad de 0,5 a 1,5 |il/s, y anadir de 0,1 a 0,2 g de un material protesico oseo cada 15 minutos. En este metodo se anade aproximadamente de 1 a 2 g del material protesico oseo en total.

Durante el metodo de electrohilado, cuando el tejido no tejido producido se acumula hasta un grosor determinado, se vuelve diffcil la carga negativa del electrodo de masa debido a la acumulacion del tejido no tejido. Esto dificulta la pulverizacion de la disolucion disuelta de polfmero biocompatible. Por este motivo, ha sido diffcil producir un tejido no tejido con un grosor relativamente grande utilizando un metodo de electrohilado conocido hasta ahora. Por tanto, en la presente invencion, es preferible anadir, por ejemplo, la siguiente estructura al electrodo de masa para permitir la produccion de un tejido no tejido que presenta un grosor relativamente grande. El electrodo de tierra es preferentemente, no una simple placa de metal (por ejemplo, una placa de aluminio o cobre), sino que esta dotada de salientes (preferentemente, salientes cilmdricos o conicos) en la placa de metal. Ademas, los salientes preferentemente pueden moverse hacia arriba y hacia abajo. Mediante la utilizacion de un electrodo de masa que presenta los salientes, cuando aumenta el grosor del tejido no tejido y la carga negativa del electrodo de masa se vuelve diffcil, es posible facilitar la carga negativa del electrodo moviendo los salientes hacia arriba. Los salientes se proporcionan preferentemente en forma de una reffcula con, por ejemplo, intervalos de aproximadamente 1 a 3 cm entre ellos. El area de seccion de los salientes es preferentemente de aproximadamente 0,001 a 0,5 cm2, mas preferentemente de aproximadamente 0,01 a 0,1 cm2. La presente invencion tambien engloba un electrodo de masa para electrohilado que presenta una estructura de este tipo. Tal como se describe mas adelante, la figura 2 muestra un ejemplo de un electrodo de masa para electrohilado que presenta la estructura anterior.

Puesto que el tejido no tejido de la presente invencion garantiza invariablemente un aumento significativo en la eficacia de proliferacion celular (es decir, la capacidad de proliferacion celular) (en particular, de osteoblastos) cuando se utiliza como andamiaje de cultivo celular, el tejido no tejido de la presente invencion puede utilizarse de manera adecuada como andamiaje de cultivo celular, y tambien como material de regeneracion osea. Mas espedficamente, en el caso de dano oseo debido a factores externos (por ejemplo, accidente), o en el caso de absorcion o perdida de hueso debido a factores internos (por ejemplo, osteoporosis, enfermedad periodontal), el tejido no tejido de la presente invencion permite la rapida regeneracion osea (espedficamente, incorporandose en o uniendose a la parte afectada). En particular, el tejido no tejido de la presente invencion presenta un grosor deseable, que no era posible para los materiales textiles no tejidos conocidos hasta ahora; por tanto, el tejido no tejido de la presente invencion puede utilizarse para promover la regeneracion osea al incluirse, como en los materiales textiles no tejidos conocidos hasta ahora, en la parte objetivo (parte afectada).

En particular, en el tejido no tejido de la presente invencion, el material protesico oseo esta enmaranado alrededor de las fibras del tejido no tejido. Con esta estructura, el material protesico oseo presenta una alta capacidad de retencion y tenacidad apropiada; por tanto, el tejido no tejido de la presente invencion puede aplicarse (incluirse) facilmente en la parte afectada, aun cuando la parte afectada tenga una forma complicada. El tejido no tejido tambien presenta permeabilidad celular y permeabilidad a los lfquidos superior.

Una aplicacion preferida del tejido no tejido de la presente invencion es, pero sin limitarse a, en particular, regeneracion del hueso alveolar en el tratamiento de implante.

En el metodo de GBR (regeneracion osea guiada) conocido hasta ahora, es necesario rellenar en primer lugar una region de regeneracion del hueso alveolar con un material protesico oseo, y luego aplicar una membrana de proteccion para impedir la infiltracion de tejido gingival o tejido epitelial, que interfiere con la regeneracion del tejido oseo, en la region (mas espedficamente, el material protesico oseo y la membrana de proteccion deben aplicarse secuencialmente y colocarse juntos). Por tanto, el procedimiento secuencial de rellenado de la region objetivo con un material protesico oseo y luego la aplicacion de una membrana de proteccion es engorroso para el usuario; ademas,

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esta etapa requiere un alto nivel de habilidad por parte del usuario. En cambio, cuando el tejido no tejido de la presente invencion se utiliza como reemplazo de un material protesico oseo, el tejido no tejido de la presente invencion y la membrana de proteccion pueden aplicarse al mismo tiempo, reduciendo de ese modo la carga del usuario con una tecnica mas sencilla que la del metodo conocido hasta ahora. En particular, los metodos conocidos hasta ahora presentan a menudo un problema de fuga del material protesico oseo desde la parte aplicada; sin embargo, el problema puede resolverse utilizando el tejido no tejido de la presente invencion en lugar de un material protesico oseo. Ademas, puesto que el tejido no tejido de la presente invencion es flexible, puede deformarse a lo largo de la parte afectada, o cortarse para dar una forma apropiada segun la forma de la parte afectada.

Ademas, al extender la longitud desde el material protesico oseo incluido dentro del tejido no tejido hasta el exterior del tejido no tejido de la presente invencion (en otras palabras, al aumentar el grosor de la capa de fibras (la capa de fibras en contacto con el tejido gingival o el tejido epitelial) del tejido no tejido de la presente invencion), es posible suprimir la infiltracion de tejido gingival o tejido epitelial en la region de regeneracion (mas espedficamente, es posible anadir una funcion como membrana de proteccion). En este caso, el tejido no tejido de la presente invencion se utiliza de manera individual, en lugar de utilizar el conjunto de la membrana de proteccion y el material protesico oseo.

Ademas, tal como se describio anteriormente, el tejido no tejido de la presente invencion se produce utilizando un metodo de electrohilado repitiendo una serie de las etapas de “pulverizar una pequena cantidad de una disolucion disuelta de polfmero biocompatible para producir tejido no tejido, dispersar una cantidad apropiada de un material protesico oseo sobre el tejido no tejido, y pulverizar adicionalmente la disolucion disuelta de polfmero biocompatible en el mismo”. Sin embargo, cambiando ligeramente el procedimiento de produccion, tambien es posible producir tejido no tejido util de diversas formas. Por ejemplo, repitiendo una serie de las etapas de pulverizar en primer lugar una gran cantidad de una disolucion disuelta de polfmero biocompatible para producir un tejido no tejido ancho y grueso, anadir un material protesico oseo solo a una parte relativamente estrecha sobre el tejido no tejido, y pulverizar una disolucion disuelta de polfmero biocompatible a la parte estrecha, puede obtenerse un tejido no tejido en forma de sombrero de copa, que presenta un material protesico oseo proyectado incluido en una parte la base de tejido no tejido ancho y grueso. Si se supone que el tejido no tejido es un sombrero de copa, el tejido no tejido ancho y grueso es el ala y el resto del tejido no tejido que contiene un material protesico oseo es la copa. Este tejido no tejido en forma de sombrero de copa se aplica incluyendo la parte de copa en la region de regeneracion del hueso alveolar. De este modo, la parte de borde sirve para inhibir la infiltracion de tejido gingival o tejido epitelial en la region. Mas espedficamente, el tejido no tejido en forma de sombrero de copa sirve tanto como membrana de proteccion como material protesico oseo.

Como tal, el tejido no tejido de la presente invencion puede utilizarse como material de regeneracion osea. Ademas, la presente invencion tambien engloba una estructura en la que osteoblastos o similares se adhieren o anaden al tejido no tejido de la presente invencion. Mas espedficamente, la presente invencion engloba un material de regeneracion osea que contiene el tejido no tejido. El material de regeneracion osea puede estar compuesto solo por el tejido no tejido, o tambien puede contener el tejido no tejido anterior que contiene osteoblastos. La incorporacion de osteoblastos puede realizarse, por ejemplo, mediante un cultivo celular utilizando el tejido no tejido como material de andamiaje.

Ademas, el tejido no tejido de la presente invencion puede utilizarse como material de andamiaje de cultivo de osteoblastos. En este caso, el tejido no tejido que presenta la misma caractenstica que el material de regeneracion osea anterior, puede utilizarse como material de andamiaje de cultivo de osteoblastos.

Ademas, el tejido no tejido de la presente invencion es util como material de regeneracion osea. El material de regeneracion osea puede utilizarse, por ejemplo, para los siguientes tratamientos, cirugfas u otras utilizaciones.

• Campo de regeneracion de tejido periodontal y cirugfa maxilofacial

Generacion tisular guiada para defecto infraoseo, lesion de furcacion de clase II, defecto de tipo encogimiento y defecto de tipo escision; generacion osea guiada para aumento oseo del borde alveolar y generacion osea en las proximidades del implante; tecnica de formacion de borde alveolar; procedimiento de elevacion de seno para tecnica de elevacion de fondo del seno maxilar; metodo de preservacion de alveolo para preservacion de alveolo en extraccion; tecnica de elevacion de fondo de la cavidad nasal; cirugfa de extension osea; rellenado oseo tras raspado de la parte osea muerta; rellenado oseo tras raspado de tejido de cancer de huesos; regeneracion osea en procedimiento de rellenado oseo para tratar fractura osea traumatica; tratamientos esteticos tales como para hiperplasia gingival con puente, recubrimiento de rafz para recesion gingival, reconstruccion de papila interdental, u otra hiperplasia gingival; y similares.

• Campo ortopedico

Cirugfa de extension osea; tratamientos tras raspado de parte osea muerta o tras raspado de tejido de cancer de huesos, tratamientos de fractura osea traumatica, fractura por compresion vertebral, tecnica de reconstruccion osea

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para tratamiento de seudoartrosis; cio^a de extension osea; materiales portadores de componentes farmaceuticos para el tratamiento de la osteoporosis; y similares.

La presente invencion tambien engloba un metodo de regeneracion osea que se realiza aplicando el tejido no tejido de la presente invencion a un sitio objetivo sometido a regeneracion osea (preferentemente de hueso alveolar). El metodo puede utilizarse, por ejemplo, para los tratamientos o cirugfas enumerados anteriormente.

Ejemplos

La presente invencion se explica mas espedficamente a continuacion. Sin embargo, la presente invencion no se limita a estos ejemplos. En los experimentos, puede hacerse referencia de manera adecuada a los libros de texto, etc. (por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 Vol. Set); Cold Spring Harbor Laboratory Press), enumerados en la seccion de campo tecnico.

Produccion de tejido no tejido 1

Se anadieron 43 g de una disolucion mixta de alcohol hexafluoroisopropflico:diclorometano = 8:2 (razon en masa) a 7 g de un poli(acido lactico) (Mitsui Chemicals, Inc. LACEA, H-400), obteniendo de ese modo una disolucion de poli(acido lactico) (al 14% p/p). Se lleno una jeringa (Henke SASS WOLF, 5 ml) con la disolucion de poli(acido lactico) obtenida, combinada con una aguja (aguja no biselada 21Gl.1/2, Terumo Corporation), y se fijo en un dispositivo de electrohilado. Se fijo la distancia desde la jeringa hasta el suelo (el objetivo) a 8 cm y se pulverizo la disolucion de poli(acido lactico) mediante la aplicacion de 10 kV de tension, cambiando las condiciones, es decir, variando la duracion de pulverizacion y la cantidad de pulverizacion, tal como se muestra en la tabla 1. Durante la pulverizacion, se anadio un material protesico oseo (oSferion, Olympus Terumo Biomaterials Corporation) cada 15 minutos lo mas uniformemente posible hasta que la cantidad de adicion total llego a ser de 2 g. Se utilizo un material protesico oseo (OSferion) que presentaba un diametro de 0,5 a 1,5 mm (valor convencional). Una vez anadida la cantidad total del material protesico oseo, se pulverizo la disolucion de poli(acido lactico) durante otros 15 minutos. De este modo, se produjeron los cuatro tipos de tejido no tejido mostrados en la tabla 1.

En este metodo de produccion, se utilizo una placa de aluminio dotada de salientes de cobre que podfan moverse hacia arriba y hacia abajo como electrodo de masa (que tambien serna como colector). La figura 2 muestra una vista esquematica del electrodo de masa. Durante la etapa de pulverizacion anterior, los salientes de cobre se elevaron 0,5 mm cada 15 minutos.

[Tabla 1]

Muestras producidas mediante el electrohilado (la muestra 0 no es segun la invencion)

Materiales textiles no tejidos producidos

Cantidad de pulverizacion Duracion de pulverizacion Cantidad de adicion de material protesico oseo Intervalo de adicion de material protesico oseo Cantidad de adicion total de material protesico oseo

Tejido no tejido sin material protesico oseo (Muestra 0)

0,6 |il/s 120 min

Tejido no tejido (Muestra 1)

0,6 |il/s 165 min 0,2 g 15 min 2 g

Tejido no tejido (Muestra 2)

1,2 |il/s 165 min 0,2 g 15 min 2 g

Tejido no tejido (Muestra 3)

1,2 |il/s 315 min 0,1 g 15 min 2 g

Evaluacion de las propiedades fisicas del tejido no tejido 1

Utilizando el metodo a continuacion, se midieron el grosor, la densidad aparente y la proporcion del material protesico oseo con respecto a los cuatro tipos de tejido no tejido (muestras 0, 1, 2 y 3); y el diametro de fibra de las fibras de cada material textil.

Se corto cada muestra para dar un rectangulo (de aproximadamente 4 cm2), y se midio el peso de cada rectangulo. Se encontro la longitud, la anchura y el grosor de la muestra utilizando un calibre de grosor (calibre de grosor digital, Ozaki Seisakusho, DG-205M). Se multiplicaron los valores obtenidos de longitud, anchura y grosor para encontrar el volumen (cm3). Se encontro el grosor obteniendo el promedio de los valores de medicion de 20 partes.

La densidad aparente se determino segun la formula siguiente a partir del peso y el volumen de cada muestra.

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Densidad aparente (g/cm3) = peso de muestra (g)/volumen de muestra (cm3)

Cada muestra asf cortada para dar un rectangulo se coloco en un tubo conico, y se anadieron 50 ml de diclorometano al mismo, disolviendo de ese modo el poli(acido lactico) contenido en la muestra. Entonces, dejando un precipitado en el tubo conico, se retiro el sobrenadante. Se evaporo el diclorometano en el precipitado, y se midio el peso del precipitado restante como el peso del material protesico oseo. La proporcion de material protesico oseo se determino segun la formula siguiente.

Proporcion de material protesico oseo (%) = (materiales insolubles en diclorometano (precipitados)/peso de muestra)x100

Ademas, se obtuvo una imagen de la seccion transversal de cada muestra utilizando un microscopio electronico de barrido (Hitachi High-Technologies Corporation, S-3400N). A partir de una imagen ampliada 500x obtenida mediante el microscopio electronico de barrido, se encontro el diametro de fibra utilizando ImageJ (version 1.43u: software de procesamiento de imagenes desarrollado por NIH). El diametro de fibra de cada muestra se encontro obteniendo el promedio de los diametros de 50 fibras.

La figura 3 muestra imagenes de secciones transversales de las muestras. En la figura 3, las imagenes A, B, C y D corresponden a las muestras 0, 1, 2 y 3, respectivamente. Haciendo referencia a la figura 3, se confirmo que, a diferencia de la muestra 0, las muestras 1 a 3 que conteman un material protesico oseo presentaban un grosor suficiente. La figura 4 muestra imagenes de la seccion transversal de la muestra 3 obtenidas mediante un microscopio electronico de barrido. La figura 4 tambien muestra una vista esquematica de las mismas.

La tabla 2 muestra los resultados de la evaluacion de las propiedades ffsicas.

[Tabla 2]

Evaluacion de las propiedades ffsicas de los materiales textiles no tejidos

Muestras

Proporcion de material protesico oseo Grosor Diametro de fibra Densidad aparente

Tejido no tejido sin material protesico oseo (Muestra 0)

0% 0,163 mm + 0,044 2,685 |im + 0,322

Tejido no tejido (Muestra 1)

97,4% 2,415 mm + 0,430 3,435 |im + 0,741 0,179 g/cm3

Tejido no tejido (Muestra 2)

91,6% 2,733 mm + 0,427 3,170 |im + 0,997 0,194 g/cm3

Tejido no tejido (Muestra 3)

89,0% 2,500 mm + 0,529 2,630 |im + 0,473 0,216 g/cm3

Ademas, para las muestras 1 a 3, se calculo la porosidad (%) del tejido no tejido y la porosidad (%) de las fibras del tejido no tejido. En el calculo, se utilizo una densidad real de 1,26 g/cm3 como la densidad real del poli(acido lactico), y se utilizo una densidad real de 3,17 g/cm3 como la densidad real del material protesico oseo (OSferion). Las densidades reales se encontraron utilizando un densfmetro automatico en seco (AccuPyc 1330; Shirnadzu Corporation).

11

[Tabla 3]

Por 1 cm3 de tejido no tejido

Artfculo

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i)

Proporcion de material protesico oseo (OSferion)

Densidad aparente (g/cm3) Peso de material protesico oseo (g) Volumen correspondiente a material protesico oseo (cm3) Peso de poli(acido lactico) (g) Volumen correspondiente a poli(acido lactico) (cm3) Volumen total de material protesico oseo y poli(acido lactico) (cm3) Razon de vado del tejido no tejido (%) Razon de vado de las fibras del tejido no tejido (%)

Muestra 1

97,4% 0,179 0,174 0,055 0,005 0,004 0,059 94,1% 99,6%

Muestra 2

91,6% 0,194 0,178 0,056 0,016 0,013 0,069 93,1% 98,6%

Muestra 3

89,0% 0,216 0,192 0,061 0,024 0,019 0,080 92,0% 98,0%

Formula de calculo

(a x b) (c/3,17) (b -c) (e/1,26) (d + f) (1-g) x 100 [1 -{f/(1 -d)}] x 100

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El grosor del tejido no tejido de poli(acido lactico) (muestra 0) que no contema un material protesico oseo era pequeno, concretamente de 0,163 mm; este grosor no es suficiente, en particular, como material de regeneracion osea que sirve como relleno de la parte afectada (parte de defecto oseo). Los materiales textiles no tejidos de poli(acido lactico) (muestras de 1 a 3) que conteman un material protesico oseo eran todos materiales textiles no tejidos relativamente gruesos que presentaban un grosor de 2 a 3 mm; por tanto, cuando los materiales textiles no tejidos se presionaron con la mano, se recupero el grosor cuando se liberaron. Tales materiales textiles no tejidos son adecuados como material de regeneracion osea.

Evaluacion de la capacidad de proliferacion celular del tejido no tejido

Se examinaron las capacidades de proliferacion celular de los materiales textiles no tejidos (muestras 1 a 3) segun el procedimiento siguiente. Mas espedficamente, se examino la cantidad de ADN de las celulas proliferadas por cada muestra para determinar la capacidad de proliferacion celular.

• Cultivo celular

Se corto cada muestra de tejido no tejido (muestras 1 a 3) para proporcionar un trozo que presentaba el mismo tamano que el fondo de una placa de 48 pocillos (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., SUMILON, MS-80480), y se coloco sobre el fondo del pocillo. Cada muestra contema aproximadamente un equivalente de 50 mg de material protesico oseo. Como muestra de control, se colocaron aproximadamente 50 mg del propio material protesico oseo (OSferion) en el fondo de un pocillo de la placa de 48 pocillos.

Se coloco un tubo de acero inoxidable (cubeta de penicilina) sobre cada muestra de evaluacion, y se anadieron al mismo 500 |il de medio de cultivo MEM/FBS al 10% (medio de cultivo MEM/FBS al 10% que contema antibioticos y acido glutamico; a continuacion en la presente memoria, “medio de cultivo MEM/FBS al 10%” indica este medio). Cada muestra asf preparada se centrifugo durante 5 minutos utilizando una centnfuga de placas (2500 rpm, temperatura ambiente). Tras la evacuacion, las muestras se centrifugaron adicionalmente durante otros 5 minutos (2500 rpm, temperatura ambiente). Ademas, se anadieron 200 |il de medio de cultivo MEM/FBS al 10% al mismo, y se incubaron las muestras durante al menos una hora en un incubador (37°C, 5% de CO2). Se retiraron 500 |il del medio de cultivo mediante succion. Se suspendieron celulas derivadas de osteosarcoma humano MG-63 en un medio de cultivo MEM/FBS al 10% en una cantidad de 1,6x105 celulas/ml, y se sembraron 100 |il de cada una de las celulas resultantes en cada pocillo (1,6x104 celulas/pocillo). Tras 5 horas de incubacion, se unieron las celulas a las muestras de evaluacion. A continuacion, se anadieron 200 |il de medio de cultivo MEM/FBS al 10% y se cultivaron las muestras. Se examinaron las muestras en el dfa 1, el dfa 3 y el dfa 8 de la incubacion para determinar la capacidad de proliferacion celular.

• Medicion de la capacidad de proliferacion celular

Tras el cultivo, se extrajo cada muestra de evaluacion (tejido no tejido) que presentaba celulas unidas al mismo y se coloco en una placa que contema PBS (solucion salina fisiologica tamponada con fosfato). Se midio el peso de cada muestra de evaluacion que contema PBS, y se encontro una cantidad de absorcion de agua de la muestra de evaluacion a partir del peso seco de la muestra de evaluacion y el peso de la muestra de evaluacion que contema PBS (restando el peso seco (medido en el momento en que se corto cada muestra de evaluacion para dar un trozo del mismo tamano que el fondo de la placa) antes de someterse al experimento a partir del peso de la muestra de evaluacion que contema PBS).

Se anadio una disolucion tampon de TE (Tris/Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM) a la placa de modo que la cantidad de disolucion total de la muestra incluyendo la cantidad de absorcion de agua y la disolucion tampon de TE llego a ser de 1200 |il. Se realizo una congelacion y descongelacion secuencial de la muestra (congelada a -80°C y disuelta a temperatura ambiente) dos veces, seguido por tratamiento con ultrasonidos durante 30 minutos, alterando de ese modo las celulas. Se anadieron 100 |il de un lfquido de lisado celular (es decir, lfquido de celulas alteradas obtenido a traves de la congelacion y descongelacion y el tratamiento con ultrasonidos) a una placa de medicion de fluorescencia de 96 pocillos (Nunc black microwell, cat. 137101) para obtener la medicion de las muestras.

Se diluyo PicoGreen (Invitrogen) (desde 100 |il hasta 20 ml) con una disolucion tampon de TE; se anadieron 100 |il de la misma a cada muestra de medicion, y se incubo la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se midio la intensidad de fluorescencia de cada muestra utilizando un lector de placas de fluorescencia (SpectraMax Gemini XPS, Molecular-Devices) a una longitud de onda de excitacion de 480 nm y una longitud de onda de emision de 520 nm. PicoGreen es un colorante utilizado espedficamente para ADN bicatenario; por tanto, la intensidad de fluorescencia resultante refleja la cantidad de aDn (y el numero de las celulas). La figura 5 muestra los resultados. En comparacion con el caso (control) que utiliza solo un material protesico oseo, se adhirieron muchas celulas a los materiales textiles no tejidos de poli(acido lactico) gruesos (muestras 1 a 3) que conteman un material protesico oseo. Asf se confirmo la proliferacion celular. Por tanto, se confirmo que estos materiales textiles no tejidos son superiores como material de regeneracion osea.

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Medicion del tamano de poro del tejido no tejido

Se midio el tamano de poro (modo) del tejido no tejido segun el metodo de semisecado (regla ASTM E1294-89) utilizando perfluoropoliester (utilizando un adaptador de medicion circular que presenta un diametro de 7 mm). Se utilizo un porometro de flujo capilar (CFP-1200-AEL, Porous Materials Inc.) como dispositivo de medicion. El intervalo de clase en el calculo del modo fue de 1 |im.

Produccion de tejido no tejido 2

Se anadieron 45 g de una disolucion mixta de alcohol hexafluoroisopromlico:diclorometano = 8:2 (razon en masa) a 5 g de un poli(acido lactico) (Evonik Degussa Japan, RESOMER®) para disolver el poli(acido lactico), obteniendo de ese modo una disolucion de poli(acido lactico) (al 10% en peso). Se lleno una jeringa (Henke SASS WOLF, 5 ml) con la disolucion de poli(acido lactico) obtenido, y se fijo en un dispositivo de electrohilado (MEC Co., Ltd., NF-103A). Se fijo la distancia desde la jeringa hasta el electrodo de masa (el objetivo: un bloque de aluminio de 4x4 cm que presentaba el mismo mecanismo que en la figura 2) a 22 cm, y se pulverizo la disolucion de poli(acido lactico) mediante la aplicacion de 15 kV de tension durante 90 minutos en total en una cantidad de 1 ml/hora. Durante la pulverizacion, se anadieron uniformemente 0,033 g de un material protesico oseo (OSferion Gl, Olympus Terumo Biomaterials Corporation) y polvo obtenido pulverizando el material protesico oseo y ajustando el diametro de parttcula mediante tamizado 30 veces cada 3 minutos hasta que la cantidad de adicion total llego a ser de aproximadamente 1 g. De este modo, se produjeron los cinco tipos (A, B, C, D y E) de tejido no tejido mostrados en la tabla 4.

Se produjo un tejido no tejido de la misma manera que anteriormente utilizando un material en forma de bloque (un solido rectangular de 20 mm x 10 mm x 3,5 mm) OSferion (OSferion A1) como material protesico oseo. Este tejido no tejido se denomina a continuacion en la presente memoria “tejido no tejido F” (tabla 4).

[Tabla 4] Los materiales textiles A, E y F no son segun la invencion.

Materiales textiles no tejidos producidos

Cantidad de pulverizacion (ml/hora) Duracion de pulverizacion (min) Cantidad de adicion de material protesico oseo (g) Intervalo de adicion de material protesico oseo (min) Cantidad de adicion total de material protesico oseo (g) Diametro de parttcula de material protesico oseo (|im)

Tejido no tejido sin material protesico oseo (tejido no tejido A)

1,0 90

Tejido no tejido B

93 0,033 3 1 75-180

Tejido no tejido C

150-810

Tejido no tejido D

500-1500

Tejido no tejido E

0,067 5,8 4700-8000

Tejido no tejido F

1,0 93 0,5 31 1 Bloque de 20 mm x 10 mm x 3,5 mm

Evaluacion de las propiedades fisicas del tejido no tejido 2

Utilizando el metodo a continuacion, se midieron y se calcularon el grosor, la densidad aparente y la proporcion del material protesico oseo con respecto a los seis tipos de tejido no tejido (A a F), y el diametro de fibra de las fibras de cada material textil.

Se corto cada muestra para dar un cuadrado de 4x4 cm y se midio el peso de cada muestra. Se midio el grosor de la muestra utilizando un micrometro Digimatic (Mitutoyo Corporation, CLM1-15QM). El grosor de la muestra se encontro obteniendo el promedio de los valores de medicion de 20 partes.

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40

Entonces, de la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Evaluacion de las propiedades ffsicas del tejido no tejido 1”, se midieron y se calcularon la densidad aparente, la proporcion de material protesico oseo de los materiales textiles no tejidos A a F, y el diametro de fibra de las fibras de cada material textil, excepto porque el diametro de fibra se encontro utilizando una imagen de microscopio electronico ampliada 2000x, en lugar de utilizar una imagen ampliada 500x.

La tabla 5 representa los resultados de la evaluacion de las propiedades ffsicas. Puesto que el tejido no tejido F se produjo utilizando un material protesico oseo en forma de bloque, la densidad aparente del tejido no tejido F fue mayor que las de otros materiales textiles no tejidos.

[Tabla 5]

Muestras

Proporcion de material protesico oseo (%) Grosor (mm) Diametro de fibra (ffm) Densidad aparente (g/cm3)

Tejido no tejido sin material protesico oseo (Tejido no tejido A)

0 0,24 + 0,02 2,52 + 0,20 0,273

Tejido no tejido B

75,0 1,70 + 0,18 1,99 + 0,26 0,379

Tejido no tejido C

92,43 2,96 + 0,17 2,43 + 0,23 0,214

Tejido no tejido D

94,0 3,59 + 0,39 2,20 + 0,33 0,152

Tejido no tejido E

92,1 4,68 + 1,09 2,08 + 0,15 0,145

Tejido no tejido F

90,9 1,16 + 1,34 2,25 + 0,31 0,595

Ademas, se calculo la porosidad (%) de cada tejido no tejido y la porosidad (%) de las fibras de cada tejido no tejido. Mas espedficamente, el calculo se realizo utilizando una densidad real de 1,26 g/cm3 como la densidad real del poli(acido lactico), y una densidad real de 3,17 g/cm3 como la densidad real del material protesico oseo (OSferion) de la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Evaluacion de las propiedades ffsicas del tejido no tejido 1”, excepto porque se calculo la porosidad de las fibras del tejido no tejido F utilizando una densidad real de 0,7065 g/cm3 como la densidad real del material protesico oseo, porque el material protesico oseo en forma de bloque contenido en el tejido no tejido F presentaba muchos vados. La tabla 6 muestra los resultados.

La porosidad de las fibras del tejido no tejido F fue menor que las de los otros materiales textiles no tejidos, ya que contiene un material protesico oseo en forma de bloque. Por tanto, el tejido no tejido F era relativamente mas duro que los materiales textiles no tejidos.

[Tabla 6]

Muestras

Razon de vado del tejido no tejido (%) Razon de vado de las fibras del tejido no tejido (%)

Tejido no tejido sin material protesico oseo (Tejido no tejido A)

78,3 78,3

Tejido no tejido B

83,5 91,7

Tejido no tejido C

92,5 98,6

Tejido no tejido D

94,8 99,2

Tejido no tejido E

94,9 99,1

Tejido no tejido F

78,6 81,6

Produccion de tejido no tejido 3

Se produjo tejido no tejido a de la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Produccion de tejido no tejido 2”, excepto porque la concentracion de la disolucion de poli(acido lactico) fue el 5% en peso y la disolucion de poli(acido lactico) se pulverizo desde el dispositivo de electrohilado durante 195 minutos en total en una cantidad de 1 ml/hora; una vez pulverizada la disolucion de poli(acido lactico) durante 15 minutos, se anadieron 0,03 g de un material protesico oseo cada 6 minutos hasta que la cantidad de adicion total llego a ser de aproximadamente 1 g.

Evaluacion de las propiedades ffsicas del tejido no tejido 3

De la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Evaluacion de las propiedades ffsicas del tejido no tejido 2”, se midieron y se calcularon el grosor, la densidad aparente y la proporcion del material protesico oseo del tejido no tejido a, y el diametro de fibra de las fibras del material textil tridimensional. Ademas,

5

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25

30

35

40

45

50

se calcularon la porosidad (%) del tejido no tejido tridimensional y la porosidad (%) de las fibras del tejido no tejido tridimensional. Las tablas 7 y 8 muestran los resultados.

[Tabla 7]

Muestra

Proporcion de material protesico oseo (%) Grosor (mm) Diametro de fibra (|im) Densidad aparente (g/cm3)

Tejido no tejido a

95,0 3,91 0,35 + 0,17 0,156

[Tabla 8]

Muestra

Razon de vacfo del tejido no tejido (%) Razon de vacfo de las fibras del tejido no tejido (%)

Tejido no tejido a

94,7 99,3

Produccion de tejido no tejido 4

Utilizando un bloque de aluminio de 6x25 cm como electrodo de masa, se produjo tejido no tejido p de la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Produccion de tejido no tejido 2”, excepto porque el intervalo fue de 16 cm, y se pulverizo la disolucion de poli(acido lactico) durante 360 minutos en total en una cantidad de 1 ml/hora; durante la pulverizacion se anadieron uniformemente 0,135 g de un material protesico oseo (OSferion) a una muestra de 4x16 cm 59 veces cada 6 minutos hasta que la cantidad de adicion total llego a ser de aproximadamente 8 g.

Evaluacion de las propiedades fisicas del tejido no tejido 4

De la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Evaluacion de las propiedades ffsicas del tejido no tejido 2”, se midieron y se calcularon el grosor, la densidad aparente y la proporcion del material protesico oseo del tejido no tejido p, y el diametro de fibra de las fibras del material textil tridimensional. Ademas, se calcularon la porosidad (%) del tejido no tejido tridimensional y la porosidad (%) de las fibras del tejido no tejido tridimensional. Las tablas 9 y 10 muestran los resultados.

[Tabla 9]

Muestra

Proporcion de material protesico oseo (%) Grosor (mm) Diametro de fibra (|im) Densidad aparente (g/cm3)

Tejido no tejido p

89,0 +1,1 6,34 + 0,18 2,11 + 0,24 0,155

[Tabla 10]

Muestra

Razon de vacfo del tejido no tejido (%) Razon de vacfo de las fibras del tejido no tejido (%)

Tejido no tejido p

94,3 98,6

Implante de tejido no tejido

Se implanto tejido no tejido p en una rata, y se examino el nivel de infiltracion celular en el tejido conjuntivo. Como control, tambien se implanto el propio material protesico oseo en forma de bloque (OSferion A1) en una rata.

Se adquirio una rata macho SD (8 semanas de edad, aproximadamente 200 g) para utilizarse como animal de experimentacion. Se anestesio la rata mediante inhalacion de isoflurano al 2,5%, se afeito el pelo del lomo para exponer el sitio objetivo y se esterilizo el sitio con Isodine® y un alcohol para fricciones. Se abrio mediante corte la piel del lomo, y se realizo un hueco en el tejido conjuntivo suelto. Se incluyo tejido no tejido p o un material protesico oseo en forma de bloque (10 x 10 x 5 mm, Olympus Terumo Biomaterials Corporation, cortado de OSferion A1) en el hueco, y se cerro la incision con un hilo de sutura. Dos semanas despues del implante, la rata sometida al implante se desangro a partir de la aorta abdominal con anestesia mediante inhalacion de isoflurano al 2,5% de modo que se sacrifico la rata. Tras confirmar la muerte de la rata, se obtuvo la muestra incluida con el tejido circundante. Se sumergio la muestra obtenida en un lfquido de formalina tamponada neutra al 10% (Mildform®, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y se inmovilizo. A continuacion, se obtuvo un fragmento tisular no descalcificado congelado de la muestra para someterse a tincion con hematoxilina-eosina. La muestra de fragmento tisular resultante se observo con un microscopio optico. Las tablas 6a y 6b muestran los resultados. La

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infiltracion del tejido no tejido p en el tejido conjuntivo fue mas deseable que el del material protesico oseo en forma de bloque.

Examen de la propiedad de infiltracion celular 1

• Cultivo celular

Se corto cada uno de los materiales textiles no tejidos A a D para dar un trozo que presentaba un diametro de aproximadamente 1 cm, y se coloco sobre el fondo de una placa de 24 pocillos (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., SUMILON, MS-80480). Se presiono cada muestra de evaluacion con una cubeta de penicilina (tubo de acero inoxidable), y se humedecio con 10000 |il de un medio de cultivo MEM/FBS al 10% que contema antibioticos y acido glutamico (a continuacion en la presente memoria, todos los medios de cultivo MEM/FBS al 10% contienen antibioticos y acido glutamico a menos que se especifique de otro modo), seguido por evacuacion. Se incubaron las muestras en un incubador durante al menos una hora a 37°C, 5% de CO2. Se suspendieron celulas MG-63 cultivadas previamente (derivadas de osteosarcoma humano, Human Science Research Resources Bank, Lote 05262004) en un medio de cultivo MEM/FBS al 10% en una cantidad de 3,2 x 105 celulas/ml, y se sembraron 100 |il del mismo en cada pocillo (3,2 x 104 celulas/pocillo). Tras el cultivo durante la noche, las celulas se utilizaron como muestras de evaluacion.

• Evaluacion de la propiedad de infiltracion celular

Se inmovilizaron las celulas con una disolucion de paraformaldel'ndo al 4% durante una hora y se lavaron con PBS. A continuacion, se congelo cada muestra con hexano con enfriamiento en hielo seco y se incluyo en CMC al 4% en estado congelado. Se corto la muestra congelada para dar un trozo de 30 |il de grosor y se sometio a tincion con hematoxilina-eosina (tincion con HE). Se observo la muestra cortada con un microscopio vertical (Olympus Corporation, BH-2). Ademas, utilizando ImageJ version 1.44, se midio la distancia de infiltracion celular maxima. La figura 7 muestra los resultados. Se confirmo que la propiedad de infiltracion celular aumenta a medida que aumenta la porosidad del material textil y la porosidad de las fibras.

Produccion de tejido no tejido 5

Se produjo tejido no tejido y de la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Produccion de tejido no tejido 4”, excepto porque la disolucion de poli(acido lactico) se pulverizo durante 120 minutos en total; durante la pulverizacion, se anadieron uniformemente 0,135 g de un material protesico oseo (OSferion Gl) a una muestra de 4 x 16 cm 39 veces cada 3 minutos hasta que la cantidad de adicion total llego a ser de aproximadamente 5,3 g.

Examen de la propiedad de infiltracion celular 2

Se examinaron las propiedades de infiltracion celular del tejido no tejido p y el tejido no tejido y tal como sigue realizando cultivo celular utilizando los materiales textiles no tejidos p y y. Se corto cada uno de los materiales textiles no tejidos p y y para dar un trozo que presentaba un diametro de aproximadamente 1 cm. Cada muestra se humedecio completamente en un medio de cultivo MEM/FBS al 10% mediante evacuacion. Entonces, se incubaron las muestras en un incubador durante al menos una hora a 37°C, 5% de CO2. Se suspendieron celulas MG-63 cultivadas previamente (derivadas de osteosarcoma humano, Human Science Research Resources Bank, Lote 05262004) en un medio de cultivo MEM/FBS al 10% en una cantidad de 1,6 x 105 celulas/ml y se sumergio cada muestra de evaluacion en 10 ml de la disolucion de celulas durante 60 minutos. Se agito suavemente cada muestra en la disolucion cada 15 minutos. Cada muestra se extrajo de la disolucion celular y se coloco sobre el fondo de una placa de 24 pocillos (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., SUMILON, MS-80240). Se anadio 1 ml de medio y cada muestra se presiono con una cubeta de penicilina (tubo de acero inoxidable) y se cultivo durante la noche. Los materiales textiles no tejidos de cultivo celular obtenidos se utilizaron como muestras. Se inmovilizaron las celulas con una disolucion de paraformaldel'ndo al 4% durante una hora y se lavaron con PBS. A continuacion, se congelo la muestra con hexano con enfriamiento en hielo seco y se incluyo en CMC al 4% en estado congelado. Se corto la muestra congelada para dar un trozo de 30 |il de grosor y se sometio a tincion con HE. Se observo la muestra cortada con un microscopio (Olympus Corporation, BH-2) para evaluar la propiedad de infiltracion celular.

De la misma manera que en el metodo explicado en la seccion anterior “Medicion del tamano de poro de tejido no tejido”, se midio el tamano de poro de cada tejido no tejido. Sin embargo, en la medicion de los tamanos de poros de los materiales textiles no tejidos p y y, se despegaron las superficies exteriores de los materiales textiles no tejidos y la capa obtenida se utilizo para la medicion.

La figura 8 muestra los resultados. Los tamanos de poro en la figura 8 son los modos.

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Ademas, se midio la distancia interfibra del tejido no tejido de la siguiente manera. Se sumergio cada muestra de medicion (tejido no tejido) en PBS y se desespumo a presion reducida. La muestra humeda con PBS se hundio en gel de CMC (carboximetilcelulosa) al 4% y se congelo, preparando de ese modo un bloque congelado. Se obtuvo una muestra que presentaba un grosor de 2 |im a partir del bloque obtenido y se sello en una resina entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Se observo una muestra cortada con un microscopio de contraste de fases. Se detecto la seccion transversal de la fibra a partir de la imagen obtenida y se midio la distancia interfibra utilizando el metodo del centroide. El analisis en el metodo del centroide se realizo utilizando el software “A-Zo Kun” (Asahi Kasei Engineering Corporation, version 2.20). La figura 9 muestra el resumen del analisis. Las distancias interfibra de los materiales textiles no tejidos p y y, y la muestra de tejido no tejido 2 asf medida fue de 18,4 |im, 27,2 |im y 33,3 |im, respectivamente.

Examen de la propiedad de infiltracion celular 3 (ejemplo de referencia)

Con el fin de analizar la relacion entre la propiedad de infiltracion celular y el tamano de poro del tejido no tejido, se produjo un tejido no tejido general (materiales textiles no tejidos planos (i) a (iii): tabla 11) y se examino la propiedad de infiltracion celular.

[Tabla 11]

Materiales textiles no tejidos producidos

Cantidad de pulverizacion (ml/hora) Duracion de pulverizacion (min)

Tejido no tejido (i)

1,0 60

Tejido no tejido (ii)

180

Tejido no tejido (iii)

Mas espedficamente, se anadieron 5 g de una disolucion mixta de alcohol hexafluoroisopropflico:diclorometano = 8:2 (razon en masa) a 5 g de un poli(acido lactico) (Evonik Degussa Japan, RESOMER®, L 206S)) para disolver el poli(acido lactico), obteniendo de ese modo una disolucion de poli(acido lactico) (al 10% en peso). Se lleno una jeringa (Henke-Sass, Wolf GmbH, 5 ml) con la disolucion de poli(acido lactico) obtenido, y se fijo en un dispositivo de electrohilado (MEC Co., Ltd., NF-103A). Se fijo la distancia desde la jeringa hasta el electrodo de masa (el objetivo: bloque de aluminio de 3x3 cm) a 25 cm y se pulverizo la disolucion de poli(acido lactico) mediante la aplicacion de 15 kV de tension durante 60 minutos en total en una cantidad de 1 ml/hora, obteniendo de ese modo el tejido no tejido (i). Ademas, se obtuvieron los materiales textiles no tejidos (ii) y (iii) de la misma manera que el tejido no tejido (i), excepto porque se utilizo un tipo diferente de tambor rotatorio como electrodo de masa.

Se examinaron las propiedades de infiltracion celular de los materiales textiles no tejidos (i) a (iii) de la misma manera que en la seccion anterior “Examen de la propiedad de infiltracion celular 2”. Sin embargo, en la medicion del tamano de poro del tejido no tejido (i), el intervalo de clase en el calculo del modo fue de 0,1 |im. La figura 10 muestra los resultados. Los tamanos de poro en la figura 10 son los modos. La “distancia de infiltracion maxima” en la figura 10 se encontro a partir de imagenes de fragmentos tisulares tenidos con HE. Las distancias interfibra de los materiales textiles no tejidos (i), (ii) y (iii) asf medidas fueron de 7,3 |im, 13,4 |im y 15,8 |im, respectivamente.

Claims (8)

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   REIVINDICACIONES

   1. Tejido no tejido que contiene un material protesico oseo en el que el material protesico oseo esta incluido entre fibras biocompatibles que constituyen el tejido no tejido, el material protesico oseo presenta un diametro de partfcula de 50 a 5000 |im, y el tejido no tejido presenta una porosidad de 80 a 97%.
2. 2. Tejido no tejido segun la reivindicacion 1, en el que las fibras biocompatibles contienen un polfmero biocompatible.
3. 3. Tejido no tejido segun la reivindicacion 2, en el que el polfmero biocompatible es por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste en poli(acido lactico), poli(acido glicolico), copolfmero de poli(acido lactico)-poli(acido glicolico), policaprolactona, quitina, colageno, polilisina, poliarginina, acido hialuronico, sericina, celulosa, dextrano y pululano.
4. 4. Tejido no tejido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el material protesico oseo es por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste en p-TCP (P-fosfato de tricalcio), a-TCP (a- fosfato de tricalcio), HA (hidroxiapatita), DCPD (fosfato de calcio dibasico dihidratado), OCP (fosfato de octacalcio), 4CP (fosfato de tetracalcio), alumina, circona, aluminato de calcio (CaO-A^Oa), aluminosilicato (Na2O-Al2O3-SiO2), vidrio bioactivo, cuarzo y carbonato de calcio.
5. 5. Tejido no tejido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las fibras del tejido no tejido presentan una porosidad de 80 a 99,99%.
6. 6. Tejido no tejido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la densidad aparente (g/cm3) del tejido no tejido es 0,1 a 0,6.
7. 7. Material de regeneracion osea que comprende el tejido no tejido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. 8. Material de andamiaje de cultivo de osteoblastos que comprende el tejido no tejido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.