KR20190032964A

KR20190032964A - 생체물질의 유실방지를 위한 생체막

Info

Publication number: KR20190032964A
Application number: KR1020170121466A
Authority: KR
Inventors: 나양호; 권혁준; 이동건; 황정민
Original assignee: 한남대학교 산학협력단; 을지대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2019-03-28
Also published as: KR102008999B1

Abstract

본원 발명은 연골재생수술의 한 종류인 미세골절술에 사용되는 생체막에 관한 것으로서, 구체적으로는 개량미세골절술 시술부위에서 밖으로 유출되는 줄기세포와 혈병의 양을 최소화하기 위해서 PVA와 황화 고분자를 포함하는 조성물로 이루어진 생체막의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 생체막에 관한 것이다.

Description

생체물질의 유실방지를 위한 생체막{Bio-cover for preventing wash-out of bio-materials}

본원 발명은 생체물질의 유실방지를 위한 생체막에 관한 것으로서 구체적으로는 개량미세골절술 시술부위에서 밖으로 유출되는 줄기세포와 혈병의 양을 최소화하기 위해서 PVA와 술폰산(SO₃-) 작용기를 갖는 고분자를 포함하는 조성물로 이루어진 생체막의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 생체막에 관한 것이다.

전 세계적으로 노령 인구는 꾸준히 증가하고 있으며, 비만 인구 또한 계속 증가하고 있다. 이에 따라 관절 관련 질환 환자도 증가하고, 관련 시장 또한 매우 빠르게 성장하고 있다.

비특허문헌 1에 의하면, 관절염 관련 국내 시장은 2008년 3억5천만불에서 2017년 6억5천만불로 180% 이상 성장했고, 같은 기간 전 세계 시장은 110억불에서 350억불로 300% 이상 급성장 했다. 연골재생 관련 전 세계 시장은 2016년 4억불에서 2021년에는 7억8천만불로 매년 13.5%씩 성장할 전망이다.

단순한 수명의 연장이 아닌 건강한 삶에 대한 관심이 높아짐에 따라 관절 관련 질환에 대한 새로운 치료법이 필요하다. 퇴행성 관절 질환 치료법으로서 인공 관절이 관심을 끌었지만, 최근에는 부작용이 적고, 시술이 간단하여, 효과가 우수한 연골재생에 대한 관심이 더 높아졌다.

연골세포는 세포 기질의 합성, 조합 및 전환을 조절하는 고도로 분화된 세포다. 연골은 낮은 마찰력과 통증없는 자유로운 운동을 가능케 하지만, 불량한 재생력으로 낮은 치유능력을 가지고 있다.

손상된 연골 치료에 다양한 수술 요법이 사용된다. 골수유래 줄기세포를 이용한 골수 자극법, 자가 또는 동종 골연골 이식술, 자가 연골 세포 이식술 등이 있다.

골수유래 줄기세포를 이용한 골수 자극법은 구체적으로 골천공술(bone drilling), 미세골절술(microfracture), 마모성형술(abrasion arthroplasty)이 있다.

미세골절술이란 관절 연골이 손상되어 뼈가 노출된 부분에 미세한 구멍을 내어서 골수에 있는 피가 손상된 연골쪽으로 나오도록 유도하는 기술이다. 골수에는 줄기세포가 존재하며 이 세포들이 피와 같이 섞여 나와 처음에는 선지처럼 빈 공간에 차있다가 시간이 지나면서 점점 연골세포로 분화한다(도 1 참조).

미세골절술은 이미 널리 사용되는 기술로서, 효과가 입증된 사례가 많다. 최근에는 미세골절술을 개량한 '개량미세골절술'이 시도되고 있다.

개량미세골절술은 시술부위(Catilage)에서 밖으로 유출되는 줄기세포(Stem cells)와 혈병의 양을 최소화하기 위해 세포부착성이 있는 생체막(Bio-cover)을 덮어 기존보다 빠른 회복속도와 뛰어난 치료효과를 얻는 방법이다(도 2 참조). 현재 개량미세골절술에 사용되는 생체막 제품으로 국내에서는 'Artifilm', 해외에는 'Chondro-gide'가 있다.

Artifilm의 원천이 되는 특허문헌 1은 세포 유래 세포외기질막(Extracellular Matrix membrane: ECM membrane)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 동물의 연골 유래 연골세포를 고농도로 체외에서 배양하여 적절한 두께의 연골세포/세포외기질막(ECM membrane)을 형성시킨 다음, 건조하는 것을 특징으로 하는 연골세포 유래 세포외기질막(ECM membrane)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

특허문헌 1과 같은 동물 유래의 연골로부터 연골세포를 분리한 다음 배양하는 세포외기질막은 제조방법이 복잡하여 제조가 어렵고, 대량생산이 곤란하며, 제품의 단가가 높다는 단점이 있다.

특허문헌 2는 조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 구체적으로는 생분해성 고분자 마이크로 섬유 부직포 및 상기 섬유 표면에 형성된 세포외기질을 포함하는 코팅층 형태의 조직재생용 지지체이다. 상기 생분해성 고분자는 폴리락틱산(PLA), 폴리글리콜산, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 폴리디옥사논, 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 폴리하이드록시부틸레이트, 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체, 폴리(ν-에틸 글루타메이트), 폴리안하이드라이드 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이다.

특허문헌 3은 탈세포화된 세포외기질을 이용한 줄기세포 이식용 고분자 지지체의 표면 개질 방법에 관한 것이다. 고분자 지지체의 표면 개질 방법은 특정세포로부터 유래된 탈세포화된 세포외기질을 이용하여 지지체 표면을 개질한다. 특허문헌 3에서 사용되는 고분자 지지체는 생분해성 고분자로서 폴리글리콜산(PGA), 폴리락틱산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 폴리아미노산 및 이들의 유도체와 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함한다.

특허문헌 4는 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질막(ECM) 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 복합 필름 및 그 제조방법에 관한 것이다. 특허문헌 4에서 사용하고 있는 생체적합성 고분자는 폴리 글리콜산, 폴리 락틱산, 폴리 락틱-코-글리콜산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이다.

특허문헌 2, 3, 4는 모두 유사한 생체적합성 고분자를 틀로 사용하고 여기에 세포외기질을 부가한 필름 또는 멤브레인에 관한 것이다. 세포외기질을 사용한 필름 또는 멤브레인은 제조방법이 복잡하여 제조가 어렵고, 대량생산이 곤란하며, 제품의 단가가 높다는 단점이 있다.

특허문헌 5는 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체조직 유래 소재를 분쇄하여 섬유형태로 제작한 후 필터 제조방법을 이용하여 멤브레인 형태로 제조되는 재생 유도용 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것이다. 특허문헌 5에서 상기 재생 유도용 멤브레인은 소, 돼지 또는 말의 뼈, 연골, 치아, 혈관, 근막, 심근막, 소장점막하조직, 양막, 경막, 피부, 방광 및 인대로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특허문헌 5 또한 생체조직만을 사용함으로서 제조방법이 복잡하고 대량생산이 곤란할 뿐만 아니라, 제품의 단가가 높다는 단점이 있다.

등록특허공보 제10-0816395호 공개특허공보 제2017-0022173호 공개특허공보 제2010-0114815호 공개특허공보 제2010-0136811호 공개특허공보 제2014-0059421호

Cartilage Repair/ Cartilage Regeneration Market by Treatment modalities (Chondrocyte Transplantation, Growth Factor Technology, Tissue Scaffolds, Cell-free composites), Application (Hyaline Cartilage, Fibrocartilage), Region - Forecast to 2021. (-Reports/cartilage-repair-regeneration-market-37493272.html). Yong Mei Chen et al., "Cultivation of endothelial cells on adhesive protein-free synthetic", Biomaterials 26 (2005) 4588-4596. PANKAJ CHOPRA, "Development of PVA-Carrageenan based scaffolds and evaluating its efficacy on osteosarcoma upon cryopreservation", Master Thesis, Department of Biotechnology, Thapar University, Patiala 2015.

본원 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 연골재생수술의 한 종류인 미세골절술 후 빠른 회복속도와 뛰어난 효과를 얻을 수 있는 생체막을 단순한 제조방법으로 대량생산할 수 있는 방법 및 이를 통해서 제조된 생체막을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 본원 발명은 관절 연골에 포함된 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)과 유사한 환경을 제공하기 위해 술폰산 작용기(Sulfonate group)를 지닌 고분자를 포함하는 생체막 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본원 발명의 제1양태는 미세골절술에 의해서 손상된 연골 부위에 부착하는 생체막의 제조 방법에 있어서, 1) 술폰산 작용기(Sulfonate group)를 지닌 고분자, 생체 하이드로겔, 증류수를 혼합하는 단계; 2) 상기 1)단계 혼합물을 100℃ 이하에서 가열과 동시에 교반하여 상기 물질들을 녹이는 단계; 3) 2) 단계의 용액을 넓은 면적의 용기에 붓고 1시간 이상 건조한 후 여기에 다시 증류수를 넣어 10시간 이상 팽윤시키는 단계;를 포함하는 생체막의 제조 방법을 제공한다.

본원 발명의 제2양태는 상기 3)단계가, 2) 단계의 용액을 넓은 면적의 용기에 붓고, 영하 10℃ 이하에서 24시간 이상 보관한 후 다시 100℃ 이하에서 24시간 이하 보관 후 건조한 후 여기에 다시 증류수를 넣어 10시간 이상 팽윤시키는 단계;로 대치되는 생체막의 제조 방법을 제공한다.

본원 발명의 제3양태는 상기 술폰산 작용기를 지닌 고분자는 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)를 포함한 이와 유사한 작용기를 지닌 고분자인 생체막의 제조방법을 제공한다. 여기서 상기 술폰산 작용기를 지닌 고분자는 ι-카라기난(ι-carrageenan, I-Car), κ-카라기난(κ-carrageenan, K-Car), 콘드라이친 설페이트(Chondroitin sulfate, CS), 소디움 셀룰로오스 설페이트(sodium cellulose sulpate), 후코이단(fucoidan), PNaAMPS {poly(acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic sodium)} 중 적어도 하나 이상이다.

본원 발명의 제4양태는 상기 생체 하이드로겔은 PVA(폴리비닐알콜, polyvinyl alcohol), 알지네이트(alginate), 젤란(gellan), 아가로스(agarose), 카르복시 메틸셀룰로스 소디움(carboxylmethyl cellulose sodium), 키토산(chitosan), 히알루온산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 풀란(pullan), 헤파린heparin), 구아검(guar gum), 로커스트 빈 검(locust bean gum) 중 적어도 하나 이상인 생체막의 제조방법을 제공한다.

본원 발명의 제5양태는 상기 생체 하이드로겔은 PVA(폴리비닐알콜, Polyvinyl alcohol)이고 술폰산 작용기를 지닌 고분자는 ι-카라기난(ι-carrageenan, I-Car) 또는 κ-카라기난(κ-carrageenan, K-Car)인 생체막의 제조방법을 제공한다.

본원 발명의 제6양태는 상기 1)단계에서 상기 술폰산 작용기를 지닌 고분자 및 생체 하이드로겔의 전체 중량비는 전체 용액의 10% 이하인 생체막의 제조방법을 제공한다.

본원 발명의 제7양태는 상기 생체 하이드로겔의 중량비는 전체 용액의 7% 이상인 생체막의 제조방법을 제공한다.

본원 발명의 제8양태는 상기 100℃ 이하에서 24시간 이하 보관하는 단계는 40℃에서 1시간 이상 12시간 이하 보관하는 것인 생체막의 제조방법을 제공한다.

연골재생방법 중 하나인 미세골절술을 진행 한 뒤, 손상된 연골 부위에 연골 분화를 촉진할 수 있는 본원 발명에 따른 생체막을 씌울 경우 보다 빠른 연골 재생과 뛰어난 치료효과를 얻을 수 있다.

본원 발명에 따른 생체막은 빠른 회복속도와 뛰어난 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 단순한 제조방법으로 대량생산할 수 있는 장점이 있다.

본원 발명에 따른 생체막은 뛰어난 생체적합성 및 세포부착성, 우수한 물성 및 얇은 두께를 가지고 있을 뿐만 아니라 방법 또한 매우 경제적이다. 현재 해외에서 판매되고 있는 유사 제품인 'Chondro-gide'란 제품은 3x4㎝ 필름이 190만원이지만, 본원 발명에 따른 생체막은 동일 크기에 대해서 100원 정도의 원가만 소요되는 지극히 경제적인 방법임을 알 수 있다.

도 1은 종래의 방법에 따른 미세골절술에 대한 도식도이다(Mithoefer K., Williams RJ. III, Warren RF. et al, J. Bone Joint Surg. Am.(2006) 발췌)
도 2는 종래의 방법에 따른 미세골절술과 개량미세골절을 대비한 도식도이다.
도 3은 본원 발명의 생체막에 사용된 PVA와 술폰산 고분자의 일 실시예 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 본원 발명의 생체막 제조 방법으로서 용액 캐스팅 방법(Solution casting method, 이하 'SC법')이다.
도 5는 본원 발명의 생체막 제조 방법으로서 냉동-해동 방법(Freeze-thawing method, 이하 'FT법')이다.
도 6은 생체막의 겔 형태에 대한 안정성을 나타내는 예시 기준이다.
도 7은 팽윤도를 측정하는 한 예시로서 팽윤도에 대한 계산식이 기재되어 있다.
도 8은 본원 발명에 따른 생체막(PVA 10중량%)의 경우 대한 인장강도 측정의 한 예시이다.
도 9 및 도 10은 각각 세포 부착성이 없는 생체막과 세포 부착성이 있는 생체막을 현미경으로 관측한 사진이다.
도 11 및 12는 각각 세포 부착성 관련 mMSC 실험 결과로서 세포가 잘 붙도록 코팅되어 있는 대조군 실험결과이다. 본원 발명에 따른 효과가 나타나기 위해서는 세포가 구형으로 응집되어야 하나, 대조군에서 전반적으로 세포가 부착되는 것으로 관측된다.
도 13 내지 도 15는 본원 발명에 따른 세포 부착성 관련 mMSC 실험 결과이다.
도 16은 세포 부착성 관련 GFP가 부착된 mMSC 실험 결과로서 세포가 잘 붙도록 코팅되어 있는 대조군 실험결과이다.
도 17 내지 도 20은 본원 발명에 따른 세포 부착성 관련 GFP가 부착된 mMSC 실험 결과이다.
도 21은 본원 발명에 따른 생체막의 유무해성에 대한 결과이다.
도 22는 본원 발명에 따른 DSC 측정에 따른 가열과 냉각 시의 측정 결과의 예시를 나타낸다.
도 23과 24는 본원 발명의 실시예에 따른 생체막의 DSC 측정 결과와 T_m 값을 나타낸다.
도 25 내지 도 27은 본원 발명의 실시예에 따른 SEM 측정 결과이다.

이하 본원 발명에 대한 구체적인 내용을 도면을 참조하여 설명한다.

본원 발명에 따른 생체막 제조는 각각 용액 캐스팅 방법(Solution casting method, 이하 'SC법') 및 냉동-해동 방법(Freeze-thawing method, 이하 'FT법')으로 진행하였다.

본원 발명에 따른 생체막의 일 실시예로 폴리비닐알콜(Polyvinyl Alcohol, PVA) 및 술폰산 고분자(Sulfonated polymer)를 혼합하여 사용하였다. 도 2는 술폰산 고분자의 일예를 보여주고 있으며, 도 3은 사용 가능한 다양한 술폰산 고분자의 구조를 나타내고 있다. 본원 발명 실시예에 사용한 술폰산 고분자는 ι-카라기난(ι-carrageenan, I-Car), κ-카라기난(κ-carrageenan, K-Car), 콘드라이친 설페이트(Chondroitin sulfate, CS), PNaAMPS {poly(acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic sodium)} 가 있다.

본원 발명에 따른 PVA의 중량평균 분자량(M_W)는 66,000 내지 124,000이며 술폰산 고분자의 M_W는 10,000 내지 1,000,000을 갖는다. 본원과 전혀 다른 용도인 골육종의 틀로 사용된 PVA와 카라기닌 물질 자체에 대한 설명은 비특허문헌 3에 기재되어 있는바, 이에 대한 자세한 설명은 생략한다. 상기 PNaAMPS에 관해서는 비특허문헌 2에 기재되어 있는바 이에 대한 자세한 설명은 생략한다.

SC법은 FT법보다 대체로 영의 계수(Young's modulus) 등을 포함하는 물성이 우수하지 않지만, 제조방법이 간편하고 제조시간이 짧은 장점이 있다.

<실시예 1> 용액 캐스팅 방법(SC법)(도 4 참조)

① 증류수 10㎖에 폴리비닐알콜(Polyvinyl Alcohol, PVA) 및 술폰산 고분자(Sulfonated polymer)의 합이 10중량%가 되도록 바이알에서 혼합한다.

② 90℃로 1시간 가열하며, 120RPM으로 교반하여 녹인다.

③ 페트리디쉬에 붓고 오븐에서 40℃, 12시간 보관한다.

④ 실온에서 24시간 동안 건조한 후에, 증류수를 넣어 24시간 이상 팽창시킨다.

<실시예 2> 냉동-해동 방법(FT법)(도 5 참조)

② 90℃로 1시간 가열하며, 120RPM으로 교반하여 녹인다.

③ 페트리디쉬에 붓고 -80℃, 24시간 냉동시킨다.

④ 오븐에서 40℃, 12시간 보관한다.

⑤ 실온에서 24시간 동안 건조한 후에, 증류수를 넣어 24시간 이상 팽창시킨다.

<테스트 1. Gelation/형태 안정성 확인>

위에 기재된 SC법 또는 FT법으로 제작 후 7일 이상 팽윤시켜 장시간 둘 경우, 형태 안정성을 유지하는지 육안으로 확인하며 손으로 완성된 겔(Gel)을 문질러보거나 강하게 눌러 잘린 겔의 단면이 형태를 유지하면서 깨끗한지, 형태가 풀리면서 잘렸는지를 확인한다. 도 6은 겔의 형태 안정성에 대한 예시로서 아래와 같은 O, △, X를 기준으로 하였다.

Gelation O : 겔을 손으로 문질러보거나 강하게 눌러도 형태를 유지하며 잘린 단면은 형태를 깨끗하게 유지한다.

Gelation △ : 겔을 손으로 문질러보거나 강하게 누르면 일부 형태가 풀어지며 잘린 단면은 형태를 깨끗하게 유지를 못한다.

Gelation X : 물에 장시간 둘 경우 스스로 형태를 유지를 못하고 풀어진다.

본원 발명에 따른 결과를 각각 아래 표에 나타내었다. PVA의 농도가 높아질수록 겔의 안정성이 높은 것으로 나타났으며, SC법에 비해서 FT법에 의한 겔의 안정성이 높은 것으로 나타났다. 겔의 안정성을 고려한 농도는 PVA 5중량% 이상, 바람직하게는 PVA 6중량% 이상, 더욱 바람직하게는 PVA 7중량% 이상이다. PVA의 농도가 5중량% 미만인 경우는 겔의 안정성이 떨어져 실질적으로 사용이 어렵다.

<테스트 2. 팽윤도 측정>

위에 기재된 SC법 또는 FT법으로 제조된 하이드로겔을 24시간 이상 팽윤 후 겔의 일부를 자르고 무게를 측정 → 무게 측정한 팽윤된 겔을 24 시간 이상 오븐에서 40℃에서 완전 건조 시킨 후 무게를 재측정 → 편차를 고려해서 반복 횟수(n=5)

도 7은 본원 발명에 따른 팽윤도 측정의 한 예시로서 도 7에는 팽윤도를 측정한 수식이 기재되어 있다.

5번의 측정에 대해서 아래 식과 같은 표준편차(σ²)를 사용하였다.

, 여기서 N는 모집단의 크기이다.

본원 발명의 각 실시예에 따른 팽윤도 측정 결과를 아래 표에 나타내었다. 팽윤도 또한 앞의 겔 안정성과 유사한 결과를 나타냈다. PVA의 농도가 높아질수록 팽윤도가 낮은 것으로 나타났으며, SC법에 비해서 FT법에 의한 팽윤도 특성이 바람직한 것으로 나타났다. 단순히 PVA 로만 구성된 것 보다 ι-Carrageenan, κ-Carrageenan, CS, PNaAMPS 일정비율을 섞어준 것이 팽윤도가 우수하였다. 팽윤도의 특성을 고려한 농도는 PVA 6중량% 이상, 바람직하게는 PVA 7중량% 이상, 더욱 바람직하게는 PVA 8중량% 이상이다. PVA의 농도가 5중량% 미만인 경우는 팽윤도가 높아 실질적으로 사용이 어렵다.

<테스트 3. 인장강도 측정>

24시간 이상 증류수에 담가 겔을 완전히 팽윤 → UTM(Universal Testing Machine)에서 500N 로드셀을 이용해서 2㎝/min의 속도로 인장강도를 측정 → 스트레스-스트레인 곡선(Stress-Strain Curve) 그래프를 그리고 그래프를 통해서 영의 계수(Young's modulus) / Fracture Strain / Fracture Stress를 구한다 → 편차를 고려해서 반복횟수 (n=3)

도 8은 본원 발명에 따른 생체막(PVA 10중량%)의 경우 대한 인장강도 측정에 대한 한 예시를 보여준다.

본원 발명의 실시예에 따른 인장강도 측정 결과를 아래 표에 나타내었다. 인장강도 또한 앞의 겔 및 팽윤도 측정과 유사한 결과를 나타내었다. PVA의 농도가 높아질수록 인장강도 등의 물성이 좋은 것으로 나타났으며, 전반적으로 SC법에 비해서 FT법에 의한 물성특성이 더 우수한 것으로 나타났다.

PVA, PVA + ι-Carrageenan, PVA + κ-Carrageenan, PVA + CS는 SC법보다 FT법이 Fracture Stress값이 커졌지만, PVA + PNaAMPS는 SC법보다 FT법이 Fracture Stress값이 작아졌다.

인장강도 특성을 고려한 농도는 PVA 6중량% 이상, 바람직하게는 PVA 7중량% 이상, 더욱 바람직하게는 PVA 8중량% 이상이다. PVA의 농도가 5중량% 미만인 경우는 인장강도가 낮아 실질적으로 사용이 어렵다.

<테스트 4. 세포부착실험>

(mMSC(bone marrow-derived Mesenchymal Stem Cell, 골수기원 중간엽줄기세포)를 이용한 위상차현미경 관찰)

① mMSC를 계대배양시킨다.

② 팽윤된 겔을 24-웰 플레이트(well plate)에 알맞도록 잘라서 멸균처리 된 24-웰 플레이트에 증류수를 포함해서 넣는다.

③ 24-Well Plate를 4시간 이상 UV로 쬐어준다. 이때 충분히 넣은 겔이 멸균되도록 윗 뚜껑을 열어둔다.

④ 24-웰 플레이트에 있는 증류수를 제거한 뒤에 각 웰플에이트당 ① 과정에서 계대배양한 세포 25,000마리를 넣은 후 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 89%, FBS(Fetal Bovine Serum) 10%, PEST(Penicillin and Streptomycin) 1% 용액 0.25㎖를 넣어준다. 즉 이때 세포농도는 1x10⁵개/㎖가 된다.

⑤ 배양액은 필요할 때 꾸준히 갈아주면서 1일, 3일, 5일 변화를 관찰해본다.

(GFP-mMSC(Green Fluorescent Protein(GFP)-transgenic murine Mesenchymal Stem Cells)를 이용한 형광현미경 관찰)

① GFP가 부착된 mMSC를 계대배양시킨다.

④ 24-웰 플레이트에 있는 증류수를 제거한 뒤에 각 웰플에이트당 ① 과정에서 계대배양한 세포 25,000마리를 넣은 후 DMEM 89%, FBS 10%, PEST 1% 용액 0.25㎖를 넣어준다. 즉 이때 세포농도는 1x10⁵개/㎖가 된다.

세포부착과 관련하여 도 9 및 도 10은 각각 세포 부착성이 없는 생체막과 세포 부착성이 있는 생체막을 현미경으로 관측한 사진의 예시이다. 본원 발명에 따른 효과를 나타기 위해서는 각 세포가 구형의 형태로 응집이 되어야 한다. 도 9에서는 이러한 형태가 전혀 나타나지 않았고 본원 발명에 따른 도 10에서는 응집형태가 관찰이 되었다.

도 11 및 12는 각각 세포 부착성 관련 mMSC 실험 결과로서 세포가 잘 붙도록 코팅되어 있는 대조군 실험결과이다. 즉 도 11 및 도 12는 구형 응집이 아닌 세포가 넓게 펴져 잘 붙어 있기 때문에 본원 발명에서 기대하는 효과는 나타나기 어렵다. 단순히 세포가 잘 붙는 코팅은 본원 발명에서 요구하는 효과를 나타내기 어렵다는 것을 알 수 있다.

도 13 내지 도 15는 각각 본원 발명의 실시예에 따른 세포 부착성 관련 mMSC 실험 결과이다. 모두 구형의 응집 형태를 확인할 수 있다.

도 16은 세포 부착성 관련 GFP가 부착된 mMSC 실험 결과로서 세포가 잘 붙도록 코팅되어 있는 대조군 실험결과이다. 구형 응집이 아닌 세포가 넓게 펴져 잘 붙어 있기 때문에 본원 발명에서 기대하는 효과는 나타나기 어렵다.

도 17 내지 도 20은 각각 본원 발명의 실시예에 따른 세포 부착성 관련 GFP가 부착된 mMSC 실험 결과이다. 세척 후에도 모두 구형의 응집 형태를 확인할 수 있다. 도 17과 도 18은 동일한 조건의 결과로서 도 18은 도 17의 결과를 4일 후 PBS(phosphate-buffered saline)에 여러번 세척 후 찍은 사진이다.

본원 발명에 따른 모든 실시예에서 세포 부착성이 대조군과는 다른 특성을 나타내었다. 대조군은 세포가 부착되지 않거나 부착되더라도 넓게 퍼져 부착되어 본원 발명에서 필요로 하는 줄기 세포의 특성을 잘 나타내지 못한 반면 본원 발명에 따른 결과는 응집 형태가 나타났다. 본원 발명에 따른 생체막에서 세포가 부착될 때는 줄기처럼 뻗어나가는 모습보다는 응집된 모습으로 성장해나가는 모습을 찾아볼 수 있다. mMSC를 이용한 위상차현미경으로 관찰했었을 때와는 다르게 GFP가 부착된 mMSC를 이용하여 형광현미경으로 관찰했을때는 ι-Carrageenan 같은 경우 κ-Carrageenan, CS, PNaAMPS보다는 세포부착력이 떨어지는 결과값이 나왔다. PBS에 여러번 세척했음에도 불구하고 어느 정도 세포가 부착되어있는 모습이 관찰됨에 따라 본원 발명에 따른 생체막의 세포 부착력은 양호한 것으로 판단된다.

<테스트 5. 세포독성실험>

① 팽윤된 겔을 2x3㎝²로 잘라서 멸균처리된 6-웰 플레이트(well plate)에 증류수를 포함해서 넣는다.

② 6-웰 플레이트를 4시간 이상 UV로 쬐어준다. 이때 충분히 넣은 겔이 멸균되도록 윗 뚜껑을 열어둔다.

③ 6-웰 플레이트에 있는 증류수를 제거한 뒤에 DMEM 12㎖를 넣는다.

④ 37℃, CO₂ 5% 인큐베이터에서 72시간 동안 용출물을 얻는다.

⑤ ④번 진행과정 중 24시간차에 독성실험을 할 MSC(Mesenchymal Stem Cell, 중간엽줄기세포)를 계대배양 시킨다.

⑥ ④번 진행과정 중 48시간차에 계대배양한 MSC를 96-웰 플레이트에 1만마리씩, 배양액(DMEM 98.5%, FBS 1%, PEST 0.5%) 100㎕를 포함하여 넣는다.

⑦ ④번 진행 과정 72시간차에 96-웰 플레이트에 있는 배양액을 제거한 다음 용출물을 넣는다. (1x = 100% 용출물, 2x = 50% 용출물, 50% 배양액, 4x = 25% 용출물, 75% 배양액, 8x = 12.5% 용출물, 87.5% 배양액)

⑧ 용출물을 넣고 24시간이 지난 뒤 EZ-CYTOX 용액을 배양액 100㎕ + EZ-CYTOX 10㎕를 넣고 30분 후에 흡광도(파장 450㎚)를 측정하고 데이터를 처리한다.

상기 테스트를 통해서 사용하는 겔의 유해성을 판단할 수 있다. 도 21에서 알 수 있듯이 본원 발명에서 사용된 PVA 및 모든 술폰산 고분자를 포함하는 생체막은 인체에 무해한 것으로 나타났다.

<테스트 6. DSC측정>

① 24시간 이상 증류수에 담가 겔을 완전히 팽윤시킨다.

② 시료를 0.2~0.3㎎ 잘라 DSC 측정전용 팬(Pan)에 넣고 고정시킨다.

③ DSC기기에서 가열 온도범위를 25℃~250℃ 측정한다. 이때 온도는 10℃/min로 증가한다.

④ 5분간 안정화한다.

⑤ DSC기기에서 가열 온도범위를 250℃~25℃ 측정한다. 이때 온도는 10℃/min로 감소한다.

⑥ 1 Cycle DSC Curve 그래프를 그리고 그래프를 통해서 T_g, T_m, T_c, △H_m을 구한다.

상기 방법에서 1 cycle에는 측정하는 재료의 열적특성이 나타나고, 2cycle에는 재료에 들어가는 성분의 열적특성이 나타난다.

도 22은 본원 발명에 따른 DSC 측정에 따른 가열과 냉각 시의 측정 결과의 예시를 나타낸다.

도 23은 본원 발명 실시예에 따른 PVA만의 DSC 측정 결과이다. T_m은 228.9℃, T_c는 199.8℃, T_g는 218.8℃로 나타났다.

도 24는 본원 발명의 실시예에 따른 생체막의 DSC 측정 결과 중 T_m 값을 나타낸다. SC법에 의한 생체막의 T_m은 일정한 값을 나타내고 있지만 FT법에 의한 생체막은 술폰산 고분자에 따라서 T_m값이 변화되었다. 상기 결과를 볼 때 SC법에 의한 생체막은 PVA와 술폰산 고분자가 마이크로 단위에서 개별적으로 나누어져 있어 T_m값이 술폰산 고분자 종류에 상관없이 일정한 값을 나타내고 있지만, FT법 생체막은 혼합이 잘되어 분자 단위에서 영향을 미치기 때문에 술폰산 고분자 종류에 따라서 다른 T_m값을 나타내는 것으로 해석된다. 한편 본원 발명에 따른 PVA+술폰산 고분자 생체막은 최소 180℃ 이상의 T_m값을 가지기 때문에 인체내에 삽입시 열로 인한 생체막의 변화는 없으리라 추측할 수 있다.

<테스트 7. SEM측정>

각각 SC법 혹은 FT법으로 제작된 생체막을 24시간 이상 증류수에 담가 완전히 팽윤된 상태에서 일정한 크기 0.5x0.5㎝로 잘라 24시간 냉동건조 후 SEM으로 측정한다.

도 25 내지 도 27은 본원 발명의 실시예에 따른 SEM 측정 결과이다.

SC법 생체막의 경우에는 PVA와 술폰산 고분자가 분자 단위에서 서로 혼용되지 않아, 미세한 마이크로 상을 이루는 것을 관측할 수 있으며, FT법 생체막은 비교적 균일한 상을 이루는 것이 관측된다. SC법에 비해 FT법 방식으로 제조한 겔에서 미미한 구멍이 관찰되었다.

<테스트 8. 접촉각 측정>

24시간 이상 증류수에 담가 완전히 팽윤된 겔을 일정한 크기 2x2㎝로 잘라 표면의 물기를 제거한 뒤 접촉각 측정기기로 접촉각을 측정한다. 본원 발명의 실시예에 따른 접촉각 결과를 아래 표에 나타내었다.

본원의 생체막은 피부 내에 적용되는 것이므로 친수성 성질이 요구된다. 이러한 성질은 즉, 낮은 각도의 접촉각이 바람직하다. 아래 표에서 볼 수 있듯이 모두 양호한 접촉각을 보이고 있다. 다만, 본원 생체막은 술폰산 고분자의 종류와 제조 방법에 따라서 접촉각이 달라지는 것을 알 수 있다. 접촉각만의 특성을 고려할 때 가장 바람직한 경우는 PVA 8중량%와 PNaAMPS 2중량%이며 FT법에 의해서 제조한 경우이다.

상기 기술적 특징과 관련된 사항 이외에 본 발명을 실시함에 필요한 부수적인 요소들은 이 출원이 속하는 기술 분야에서 통상적인 기술 내용에 따라 가감이 가능한 것이므로 이에 대한 구체적인 사항은 기재를 생략하며, 이 출원이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 주지 또는 관용의 기술이 필요에 따라 본 발명에 적용될 수 있다.

또한, 앞서 설명한 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에는 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 통상의 기술자 또는 해당 기술분야에 통상의 지식을 갖는 자라면 후술 될 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 기술 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

미세골절술에 의해서 손상된 연골 부위에 부착하는 생체막의 제조 방법에 있어서,
1) 술폰산 작용기(Sulfonate group)를 지닌 고분자, 생체 하이드로겔, 증류수를 혼합하는 단계;
2) 상기 1)단계 혼합물을 100℃ 이하에서 가열과 동시에 교반하여 상기 물질들을 녹이는 단계;
3) 2) 단계의 용액을 넓은 면적의 용기에 붓고 1시간 이상 건조한 후 여기에 다시 증류수를 넣어 10시간 이상 팽윤시키는 단계;를 포함하는 생체막의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 3)단계가, 2) 단계의 용액을 넓은 면적의 용기에 붓고, 영하 10℃ 이하에서 24시간 이상 보관한 후 다시 100℃ 이하에서 24시간 이하 보관 후 건조한 후 여기에 다시 증류수를 넣어 10시간 이상 팽윤시키는 단계;로 대치되는 생체막의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 술폰산 작용기를 지닌 고분자는 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)를 포함한 이와 유사한 작용기를 지닌 고분자인 생체막의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 술폰산 작용기를 지닌 고분자는 ι-카라기난(ι-carrageenan, I-Car), κ-카라기난(κ-carrageenan, K-Car), 콘드라이친 설페이트(Chondroitin sulfate, CS), 소디움 셀룰로오스 설페이트(sodium cellulose sulpate), 후코이단(fucoidan), PNaAMPS {poly(acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic sodium)} 중 적어도 하나 이상인 생체막의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 생체 하이드로겔은 PVA(폴리비닐알콜, Polyvinyl alcohol), 알지네이트(alginate), 젤란(gellan), 아가로스(agarose), 카르복시 메틸셀룰로스 소디움(carboxylmethyl cellulose sodium), 키토산(chitosan), 히알루온산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 풀란(pullan), 헤파린heparin), 구아검(guar gum), 로커스트 빈 검(locust bean gum) 중 적어도 하나 이상인 생체막의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 생체 하이드로겔은 PVA(폴리비닐알콜, Polyvinyl alcohol)이고 상기 술폰산 작용기를 지닌 고분자는 ι-카라기난(ι-carrageenan, I-Car) 또는 κ-카라기난(κ-carrageenan, K-Car)인 생체막의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 1)단계에서 상기 술폰산 작용기를 지닌 고분자 및 생체 하이드로겔의 전체 중량비는 전체 용액의 10% 이하인 생체막의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 생체 하이드로겔의 중량비는 전체 용액의 7% 이상인 생체막의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 100℃ 이하에서 24시간 이하 보관하는 단계는 40℃에서 1시간 이상 12시간 이하 보관하는 것인 생체막의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 제조방법에 의해서 제조된 생체막.
제10항의 생체막을 포함하는 관절재생용 수술 키트.