ES2687458T3 - Composición que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba, y uso de la misma para el tratamiento de disfunciones cutáneas - Google Patents

Abstract

Composición que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba.

Description

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DESCRIPCION

Composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba, y uso de la misma para el tratamiento de disfunciones cutaneas

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden un extracto de Chelidonium majus y resina de Copaifera officinalis (Copaiba).

[0002] La invencion tambien se refiere al uso de la composicion en el campo de la medicina y de la cosmetica para el tratamiento de lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico.

Estado de la tecnica

[0003] La piel humana se compone principalmente de tres capas: una capa superior mas delgada, la epidermis, una capa intermedia mas gruesa, la dermis y una capa inferior de tejido subcutaneo.

[0004] Los queratinocitos son el tipo de celula mas abundante en la dermis (75-80 % del numero total de celulas en la epidermis humana), mientras que la dermis esta compuesta principalmente por fibroblastos. Ademas, la piel esta bien vascularizada con una red densa de vasos arteriales y venosos compuestos de celulas endoteliales vasculares.

[0005] Los factores subyacentes al mantenimiento de la homoeostasis de la piel, es decir, mantenimiento de la morfologia del tejido normal, son la correcta regulacion de la proliferacion, migracion y viabilidad, y del metabolismo celular en general, de la actividad deshidrogenasa mitocondrial en fibroblastos y queratinocitos, de la concentracion de radicales libres y del medio celular y extracelular oxidante y reductor, de las concentraciones de mediadores intracelulares e intercelulares tales como las citoquinas, de la produccion de colageno por fibroblastos, y de la colonizacion microbiana de la piel.

[0006] Se sabe que los cambios en los procesos mencionados anteriormente estan implicados en diversas patologias y afecciones, incluyendo lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico, posiblemente asociadas con infecciones microbianas [Hernandez - Martinez, Repair, regeneration and fibrosis, en Pathology, ed. E. Rubin, J.L. Farber, Philadelphia, Lippincott, 1999; Satish L y Kathju S, Dermatology Research and Practice, 2010, Articulo ID 790234, 11 paginas].

[0007] En consecuencia, cada vez que se produce un estado de hiperproliferacion de la epidermis, asociado a enfermedades y afecciones caracterizadas por una disminucion de la regeneracion y reparacion de la piel (dano dermico), y posiblemente asociado a lesiones vasculares y/o se asocia a una infeccion microbiana tal como, por ejemplo, en acne en la fase activa, en acne en la fase de curacion, en presencia de piel impura, en el envejecimiento de la piel acneica, pieles impuras y envejecimiento de la piel en general, en dermatitis atopica y en dermatitis en general, en presencia de placas psoriasicas, en discromias cutaneas, en hiperseborrea, en pustulas, en papulas, en comedones, en fibrosis cutanea, en formacion de cicatrices, en cicatrices acneicas atroficas, en furunculos, en talones agrietados, en presencia de pelos encarnados, en onicocriptosis, en callos de la piel, en verrugas, en queratosis y similares,

es deseable tener la estimulacion de la viabilidad (efecto revitalizante) y/o proliferacion y/o de la migracion de fibroblastos y de celulas endoteliales vasculares, y la inhibicion de la viabilidad y/o proliferacion de queratinocitos, una reduccion en la concentracion de radicales libres (efecto anti-radicales y protector de la piel), una reduccion en la concentracion de interleucina-1 beta (efecto curativo), antagonismo contra el proceso inflamatorio y el dano oxidativo, antagonismo contra el proceso fibrotico y posiblemente la inhibicion del crecimiento de microorganismos responsables de las infecciones microbianas de la piel.

[0008] Chelidonium majus (C. majus) es una planta herbacea perenne que crece espontaneamente en los bosques de la region mediterranea. Pertenece al genero Chelidonium y a la familia Papaveraceae. Crece a una altura de 3090 cm y se caracteriza por un latex de color amarillo anaranjado que se oxida y oscurece rapidamente en el aire, que sale de los tallos una vez que estan rotos [Bruni A. (1999), Farmacognosia generale e applicata [General and applied parmacognosy, PICCINNUOVA LIBRARIA SpA Padova, pags. 300-301].

[0009] Chelidonium majus contiene numerosas sustancias bioactivas, incluyendo compuestos que pertenecen a las siguientes clases quimicas: alcaloides, acidos, lactonas, carotenoides, vitaminas, flavonoides, fitoesteroides, saponinas y proteinas, que se han aislado e identificado analiticamente por metodos cromatograficos. [Kim HK et al. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1969, 58, 372-374; Slavik J y Slavikova L Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 1977, 42, 2686-2693; Slavik J et al. L Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 1965, 30, 3697-3704; Tin-Wa M et al. Journal of Natural Products, 1972, 35, 87-89]. Los alcaloides isoquinolinicos son especialmente abundantes en C. majus. En particular, C. majus es rico en protopina, coptisina, estilopina, berberina, quelidonina, sanguinarina y queleritrina [Gu Y et al. Journal of Separation Science, 2010, 33, 1004-1009].

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El uso de C. majus como agente queratolitico es conocido en medicina popular [Amenta R et al. Fitoterapia [Phytotherapy] Volumen 71, Suplemento 1, 2000, S13-S20]. Tambien se conoce el uso de algunos de sus principales alcaloides como agentes queratoliticos [documentos WO09112226; US20060045930].

[0010] Sin embargo, dichas preparaciones de C. majus o de alcaloides de C. majus no tienen regeneracion dermica ni efectos estimulantes de la reparacion dermica, asi como tampoco efectos estimulantes de la angiogenesis, ni efectos anti-fibroticos ni efectos anti-radicales. Ademas, los alcaloides tales como sanguinarina y queleritrina tienen efectos toxicos e irritantes en la piel en cantidades habitualmente presentes en extractos de C. majus.

[0011] El documento WO2009/112226 describe composiciones farmaceuticas que comprenden los alcaloides sanguinarina, queleritrina y quelidonina, como extracto de C. majus para su uso en el tratamiento de papilomas, verrugas y placas psoriasicas.

[0012] El documento DE4031960 se refiere a una composicion farmaceutica que comprende C. majus para el tratamiento de la psoriasis.

[0013] El documento FR2661330 describe composiciones farmaceuticas y cosmeticas que comprenden C. majus para su uso en el tratamiento de durezas, callos y verrugas.

[0014] La resina de Copaiba, Copaifera officinalis, se define como una oleorresina (balsamo de Copaiba) obtenida de Copaifera officinalis L., familia de las leguminosas [numero de registro CAS: 9000-12-8/8001-61-4. EINECS/ELINCS: 232-526-3/232-288-0]. Copaiba esta compuesta casi exclusivamente de terpenos. De estos, el principal es la beta-cariofilina, cuya proporcion en la oleorresina varia desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 60 %. Copaiba es conocida sobre todo por su efecto antiinflamatorio y su accion antimicrobiana, asi como por su uso en la medicina popular para el tratamiento de lesiones cutaneas en general [Veiga Junior VF et al. Journal of Ethnopharmacology, 2007, 112, 248-254; Oliveira dos Santos A et al. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2008, 103, 277-281].

[0015] El aceite de Rosa mosqueta se obtiene de las semillas de Rosa Aff. rubiginosa, natural de los Andes sudamericanos conocida localmente como "Rosa mosqueta". El aceite contiene una gran cantidad de acidos grasos poliinsaturados, aproximadamente 70-80 %, incluyendo derivados del acido linoleico en una cantidad de 40-60 %. En medicina popular, el aceite de Rosa mosqueta se usa para el tratamiento de lesiones cutaneas en general.

[0016] Los compuestos de silicona, en particular dimeticona, son ampliamente usados en preparaciones dermatologicas como agentes emolientes y protectores de la piel.

[0017] Con el objetivo de ampliar la posibilidad de tratar estas enfermedades y afecciones, sigue existiendo la necesidad de una composicion que sea eficaz en el tratamiento y la prevencion de enfermedades y afecciones de la piel que requieren estimulacion de la regeneracion y reparacion de la piel asociada a la inhibicion de la hiperproliferacion epidermica y posiblemente la estimulacion de la angiogenesis. En particular, se necesita una nueva composicion que sea capaz de determinar la estimulacion de la viabilidad y migracion de fibroblastos y de celulas endoteliales vasculares, y la inhibicion de la viabilidad de queratinocitos, y que tambien tenga efectos anti- fibroticos, cicatrizantes, citoprotectores y anti-radicales, y posiblemente tambien actividad antimicrobiana.

[0018] El objetivo de la presente invencion es por lo tanto proporcionar composiciones particulares de Chelidonium majus y resina de Copaifera officinalis (Copaiba) que sean clinicamente seguras y utilizables para tratar diversos trastornos de la piel, tales como acne, piel impura, envejecimiento de la piel, dermatitis, psoriasis, discromias cutaneas, fibrosis cutanea, formacion de cicatrices e hiperseborrea, y que no tengan las desventajas mencionadas anteriormente de las composiciones conocidas para la misma aplicacion.

Sumario de la invencion

[0019] El objetivo indicado anteriormente se ha logrado con composiciones que comprenden un extracto de Chelidonium majus y Copaiba.

[0020] Sorprendentemente, se descubrio que las formulaciones de la invencion muestran uno o mas de los siguientes efectos:

- actividad eliminadora frente a radicales libres,

- modulacion de la actividad deshidrogenasa mitocondrial,

- modulacion de la produccion de colageno,

- modulacion de la produccion de IL-1 p,

- modulacion de la produccion de IL-6,

- modulacion de la migracion celular,

- actividad antimicrobiana,

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- ausencia de efectos irritantes.

[0021] Los efectos anteriores indican que las formulaciones relacionadas son muy adecuadas para sus usos en los campos medico y cosmetico descritos mas adelante.

Usos en los campos medico y cosmetico

[0022] Anti-radical (protector de la piel): esto se deduce de los efectos eliminadores de radicales libres.

[0023] Revitalizante: esto se deduce del efecto de aumentar la actividad deshidrogenasa mitocondrial.

[0024] Anti-fibrotico (contra la formacion de cicatrices en general, contra la formacion de cicatrices atroficas, contra la formacion de cicatrices hipertroficas, contra la formacion de cicatrices acneicas): esto se deduce de un efecto antagonico sobre la estimulacion del colageno inducida por 34 ng/ml de TGF-p1 y de un efecto antagonico sobre la estimulacion de IL-1 p y/o IL-6 inducida por 34 ng/ml de TGF-p1, y de la inhibicion de la produccion de IL-1 p y/o IL-6 en condiciones de crecimiento convencional.

[0025] Citoprotector contra el dano oxidativo (antioxidante, antiinflamatorio y anti-envejecimiento): esto se deduce de un efecto antagonico sobre la estimulacion de IL-1 p y/o de IL-6 inducido por 100 pM de H2O2 y la ausencia de cambios en la morfologia celular que se refiere a la senescencia celular.

[0026] Curacion de heridas: esto se deduce de un efecto inhibidor sobre la produccion de IL-1 p y de un efecto estimulante sobre la proliferacion celular en condiciones de crecimiento convencional. Antimicrobiano: esto se deduce de una accion inhibidora sobre el crecimiento de microorganismos tales como bacterias, levaduras y/u hongos.

Efectos toxicos

[0027] Citotoxicidad: esto se deduce de un efecto de reduccion de la actividad deshidrogenasa mitocondrial, o la observacion de cambios en la morfologia celular, que se refiere a la senescencia celular.

[0028] Irritacion: esto se deduce de un efecto de aumento de la produccion de IL-6 y/o de IL-1 p en condiciones de crecimiento convencional.

[0029] Por lo tanto, para las formulaciones de la invencion, se descubrieron sorprendentemente las propiedades y caracteristicas descritas a continuacion.

Anti-radical

[0030] Las formulaciones (4 y 8) muestran efectos anti-radicales.

Colageno

[0031] Las formulaciones (4 y 8) a la concentracion del 0,1 % en condiciones de crecimiento convencional muestran una tendencia a inhibir la produccion de colagenos. Tambien antagonizan la estimulacion del colageno inducida por 34 ng/ml de TGF-p1. Por el contrario, en presencia de 100 pM de H2O2, tienen una tendencia a antagonizar la reduccion en colageno inducida por H2O2.

[0032] A la concentracion de 0,1 % p/v, las formulaciones causan la inhibicion de la produccion de colageno asociada con los efectos anti-radicales (actividad eliminadora) que tambien tienden a contrarrestar la accion oxidante de H2O2 y por consiguiente sus efectos sobre la produccion de colageno.

1L-1 p

[0033] Las formulaciones (4 y 8) a la concentracion del 0,1 % en condiciones convencionales inhiben la produccion de IL-1 p. Tambien antagonizan la produccion de IL-1 p inducida por 100 pM de H2O2 o por 34 ng/ml de TGF-p1.

IL-6

[0034] Las formulaciones (4 y 8) a la concentracion del 0,1 % en condiciones de crecimiento convencional no influyen significativamente en la produccion de IL-6. No muestran ningun efecto significativo sobre la produccion de IL-6 inducida por 100 pM de H2O2. Sin embargo, antagonizan la produccion de IL-6 inducida por 34 ng/ml de TGF-

p1.

[0035] Tambien se ha descubierto sorprendentemente que las composiciones de la invencion, que contienen un extracto de Chelidonium majus y Copaiba, muestran un efecto estimulante sobre la actividad deshidrogenasa

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mitocondrial y la migracion de fibroblastos y celulas endoteliales vasculares (veanse las Figs. 2 y 4, respectivamente), pero muestran un efecto inhibidor sobre la actividad deshidrogenasa mitocondrial de los queratinocitos (vease la Figura 3). Este efecto es sorprendente ya que, aunque los extractos de Chelidonium majus estimulan la actividad deshidrogenasa mitocondrial de los fibroblastos a bajas concentraciones, y Copaiba en las mismas concentraciones inhibe notablemente la actividad deshidrogenasa mitocondrial de dichas celulas (vease la Figura 1b), cuando estas dos sustancias son usadas en una formulacion en cantidades iguales en peso, se observa una marcada estimulacion de la actividad deshidrogenasa mitocondrial de los fibroblastos (vease la Figura 2). Esto significa que Copaiba no antagoniza el efecto estimulante de C. majus sobre la actividad deshidrogenasa mitocondrial; por el contrario, potencia dicho efecto. En otras palabras, la combinacion de Copaiba con un extracto de C. majus en una formulacion da como resultado una potenciacion de los efectos estimulantes de la actividad deshidrogenasa mitocondrial de los fibroblastos si se compara con las sustancias individuales.

[0036] Tambien se ha descubierto que el propilenglicol, usado como un ingrediente en ciertas formulaciones preferentes, muestra actividad antimicrobiana contra diversos microorganismos, bacterias, hongos y levaduras.

[0037] Por lo tanto, los resultados de esta investigacion llevaron a los autores a las conclusiones que se notifican a continuacion y a la identificacion de usos en los campos medico y cosmetico para las formulaciones de la invencion: las formulaciones no presentan efectos toxicos (citotoxicos e irritantes).

[0038] Ademas, se descubrio sorprendentemente que las formulaciones de la invencion se pueden usar como agentes anti-radicales (por ejemplo, como protectores de la piel), agentes revitalizantes de la piel, agentes anti- fibroticos (por ejemplo, como profilacticos de la formacion de cicatrices, incluyendo cicatrices de acne), agentes citoprotectores (por ejemplo, como agentes antioxidantes, antiinflamatorios y anti-envejecimiento, particularmente utiles para el tratamiento del acne), agentes de curacion de heridas y posiblemente agentes antimicrobianos.

[0039] Segun otro aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba, en la que dicha composicion comprende berberina y beta-cariofileno, en la que la relacion entre la cantidad en peso de beta-cariofileno y la cantidad en peso de berberina se situa en el intervalo de 7.000 a 60.000.000.

[0040] En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion en la que dicho extracto de Chelidonium majus comprende protopina, estilopina, quelidonina, sanguinarina, berberina, queleritrina y coptisina y en la que:

- la relacion entre la cantidad en peso de estilopina y la cantidad total en peso de sanguinarina, queleritrina, quelidonina y protopina es superior o igual a 5;

- la relacion entre la cantidad en peso de berberina y la cantidad total en peso de sanguinarina, queleritrina, quelidonina, protopina es superior o igual a 1; y

- la relacion entre la cantidad en peso de berberina y la cantidad en peso de coptisina en el extracto de Chelidonium majus es superior o igual a 0,05.

[0041] Segun otro aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba y aceite de Rosa mosqueta.

[0042] De hecho, tambien se descubrio sorprendentemente que el aceite de Rosa mosqueta potencia adicionalmente los efectos estimulantes de la actividad deshidrogenasa mitocondrial de los fibroblastos de la composicion que comprende Copaiba y un extracto de Chelidonium majus (vease la Figura 2, ejemplos 3, 4, 7 y 8).

[0043] Segun otro aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba y un compuesto de silicona, preferentemente dimeticona.

[0044] De hecho, se descubrio sorprendentemente que la presencia de un compuesto de silicona en una composicion no altera los efectos moduladores de la actividad deshidrogenasa mitocondrial de la composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba y aceite de Rosa mosqueta (veanse las Figs. 2, 3 y 4, ejemplos 1, 2, 3 y 4).

[0045] Las composiciones de la invencion que comprenden un extracto de Chelidonium majus y Copaiba, y que posiblemente contienen aceite de Rosa mosqueta y un compuesto de silicona, se formulan preferentemente en forma de un gel.

[0046] De hecho, tambien se ha descubierto sorprendentemente que la formulacion en forma de gel no altera los efectos moduladores de la actividad deshidrogenasa mitocondrial de la composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba y aceite de Rosa mosqueta (veanse las Figs. 2, 3 y 4).

[0047] De acuerdo con lo anterior, puede deducirse que tal modulacion de la actividad deshidrogenasa mitocondrial determinada por una composicion de la invencion tendra un efecto beneficioso sobre el tratamiento y la

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prevencion de enfermedades y afecciones de la piel que requieren estimulacion de la regeneracion y reparacion de la dermis asociada con la inhibicion de la hiperproliferacion epidermica y posiblemente la estimulacion de la angiogenesis.

[0048] Ademas, en consideracion de la actividad eliminadora sobre radicales libres, los efectos moduladores de la actividad deshidrogenasa mitocondrial, los efectos moduladores de la produccion de IL-1 p, los efectos antagonistas sobre la liberacion de interleucinas IL-6 e IL-1 p inducida por TGF-p1 o por H2O2, los efectos antagonistas sobre la produccion de colageno inducida por TGF-p1 y la actividad antimicrobiana del propilenglicol, los autores descubrieron sorprendentemente que las formulaciones de la invencion se pueden usar como agentes anti-radicales (por ejemplo, como protectores de la piel), agentes revitalizantes de la piel, agentes anti-fibroticos (por ejemplo, como profilacticos de la formacion de cicatrices, incluyendo cicatrices de acne), agentes citoprotectores (por ejemplo, como agentes antioxidantes, antiinflamatorios y anti-envejecimiento, tambien utiles para el tratamiento del acne), agentes de curacion de heridas, y posiblemente agentes antimicrobianos.

[0049] En particular, los autores han descubierto que, en vista de la actividad antimicrobiana ejercida por propilenglicol, las formulaciones de la invencion que contienen un extracto glicolico de C. majus se pueden usar como agentes antimicrobianos. En particular, en vista de la capacidad del propilenglicol para inhibir el crecimiento de Propionibacterium acnes, las formulaciones de la invencion que contienen un extracto glicolico de C. majus se pueden usar como agentes anti-acne.

[0050] Por lo tanto, el uso de formulaciones de la invencion en los campos medico y cosmetico se resume de la siguiente manera:

- uso como agentes anti-radicales con propiedades de proteccion de la piel, ya que ejercen una accion eliminadora en el radical DDPH,

- uso como agentes revitalizantes de la piel, ya que son capaces de estimular la actividad deshidrogenasa mitocondrial en fibroblastos dermicos,

- uso como agentes anti-fibroticos y, por lo tanto, como profilacticos en la formacion de cicatrices, incluyendo las cicatrices del acne, ya que antagonizan la produccion de colageno, IL-6 e IL-1 p estimulada por TGB-p1 en fibroblastos dermicos,

- uso como agentes citoprotectores y, por lo tanto, como agentes antioxidantes, antiinflamatorios y anti- envejecimiento, tambien utiles para el tratamiento del acne, ya que antagonizan la produccion de IL-6 e IL-1 p estimulada por H2O2 en fibroblastos dermicos,

- uso como agentes de curacion de heridas, ya que son capaces de reducir la produccion de IL-1 p en fibroblastos dermicos,

- uso como agentes antimicrobianos, incluyendo el caso del tratamiento del acne, ya que para las formulaciones preferentes de la invencion que contienen propilenglicol a una dosificacion son capaces de ejercer una accion antimicrobiana contra microorganismos tales como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Propionibacterium acnes, Candida albicans, Candida parapsilosis, Aspergillus niger.

[0051] En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a la composicion de la invencion para su uso en el tratamiento y la prevencion de lesiones cutaneas, de enfermedades y afecciones de la piel, posiblemente asociadas con infecciones microbianas, que requieren estimulacion de la regeneracion dermica y reparacion asociadas con la inhibicion de la hiperproliferacion epidermica y posiblemente la estimulacion de la angiogenesis, en la que dichas enfermedades y afecciones de la piel se seleccionan preferentemente entre el grupo que consiste en acne en su fase activa, acne en su fase de curacion, la presencia de piel impura, envejecimiento de la piel acneica, pieles impuras y envejecimiento de la piel en general, dermatitis atopica y dermatitis en general, presencia de placas psoriasicas, discromias cutaneas, hiperseborrea, pustulas, papulas, comedones, fibrosis cutanea, formacion de cicatrices, cicatrices acneicas atroficas, furunculos, talones agrietados, presencia de pelos encarnados, onicocriptosis, callos de la piel, verrugas, queratosis y similares.

Breve descripcion de los dibujos

[0052] Las caracteristicas y ventajas de la presente invencion resultaran obvias a partir de la descripcion detallada dada a continuacion, y de las realizaciones de ejemplo proporcionadas a modo de ilustracion no limitativa, asi como por los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra el efecto de extractos de C. majus, Copaiba y aceite de Rosa mosqueta sobre la actividad deshidrogenasa mitocondrial de fibroblastos dermicos humanos (FDH). En los graficos, la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial se notifica en el eje y como % frente a las concentraciones de la formulacion (eje x). En particular:

La Figura 1a muestra el grafico de la curva de dosis/respuesta a 6 concentraciones de: extracto glicolico de C. majus (EG), Copaiba, aceite de Rosa mosqueta (Olio_rosa) y tintura madre de C. majus (TM). Los ensayos se realizaron despues de 18 horas con 8.000 celulas sembradas por pocillo;

La Figura 1b muestra el grafico de la curva dosis/respuesta a 6 concentraciones de: extracto glicolico de C.

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majus (EG), Copaiba, aceite de Rosa mosqueta (Olio_rosa) y tintura madre de C. majus (TM). Las lecturas se realizaron despues de 42 horas con 2.000 celulas sembradas por pocillo;

La Figura 2 muestra el efecto de ocho formulaciones sobre la actividad deshidrogenasa mitocondrial de fibroblastos dermicos humanos (FDH). Las curvas de dosis/respuesta se trazaron en 6 concentraciones. Las lecturas se realizaron despues de 42 horas con 2.000 celulas sembradas por pocillo. En los graficos, la actividad deshidrogenasa mitocondrial en % se da en el eje y frente a las concentraciones de formulacion dadas en el eje x.

La Figura 3 muestra el efecto de ocho formulaciones de la invencion sobre la actividad deshidrogenasa mitocondrial de los queratinocitos epidermicos humanos (QEH). En particular, las curvas dosis/respuesta se muestran en 6 concentraciones. Las lecturas se realizaron despues de 24 horas con 8.000 celulas sembradas por pocillo.

La Figura 4 muestra las ocho formulaciones de la invencion sobre la actividad deshidrogenasa mitocondrial en celulas endoteliales vasculares umbilicales humanas (CEVUH). En particular, la curva de dosis/respuesta se muestra en 6 concentraciones. Las lecturas se realizaron despues de 24 horas con 8.000 celulas sembradas por pocillo.

La Figura 5 muestra imagenes fotomicrograficas a diversos aumentos de FDH con tincion de colageno con rojo sirio y se sometieron a diversos tratamientos con las formulaciones 4 y 8 a las concentraciones especificadas, durante 24 horas, en condiciones de crecimiento convencional.

La Figura 6 muestra imagenes fotomicrograficas a diversos aumentos de FDH con tincion de colageno con rojo sirio y se sometieron a diversos tratamientos con las formulaciones 4 y 8 a las concentraciones especificadas, durante 24 horas, en presencia de 100 pM de H2O2.

La Figura 7 muestra imagenes fotomicrograficas a diversos aumentos de FDH con tincion de colageno con rojo sirio y se sometieron a diversos tratamientos con las formulaciones 4 y 8 a las concentraciones especificadas, durante 24 horas, en presencia de 34 ng/ml de TGF-p1.

Descripcion detallada de la invencion

[0053] La invencion se refiere asi a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba.

[0054] Como las composiciones estan destinadas a su uso en los campos cosmetico y medico-farmaceutico, tales composiciones y tales extractos han de ser clinicamente seguros y adecuados para su uso en el tratamiento de diversas infecciones de la piel.

[0055] Un objeto de la presente invencion es una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba.

[0056] En una realizacion preferente, la invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba. Dicha composicion comprende berberina y beta-cariofileno, en la que la relacion entre la cantidad en peso de beta-cariofileno y la cantidad en peso de berberina varia de 7.000 a 60.000.000.

[0057] Para los fines de la presente invencion:

- "Chelidonium majus" o "C. majus" o "celidonia" significa una planta herbacea perenne de la region mediterranea que pertenece al genero Chelidonium y a la familia Papaveraceae y se caracteriza por un latex de color amarillo anaranjado, que sale de los tallos una vez se rompen y se oxida rapidamente (oscurece) en el aire. La invencion tiene por objeto comprender todas las variedades y subespecies de la planta, tales como Chelidonium majus var. majus y Chelidonium majus var. laciniatum;

- "Partes aereas de la planta de Chelidonium majus" significa los organos de la planta que, en condiciones naturales, se desarrollan sobre el suelo, tales como flores, brotes y hojas;

- "Extracto de Chelidonium majus" significa una preparacion liquida (extraccion de fluidos), una preparacion solida (extraccion en seco) o una preparacion de consistencia intermedia (extraccion suave) obtenida por el procedimiento de extraccion de la totalidad o parte de la planta de Chelidonium majus, en la forma de una planta fresca o secada al aire o liofilizada o despues de someterse a cualquier otro procedimiento de estabilizacion o conservacion.

- "Copaiba" significa la resina de Copaifera officinalis, una oleorresina (balsamo de Copaiba) obtenida de Copaifera officinalis L., Leguminosae; y

- "Aceite de Rosa mosqueta" significa un aceite obtenido de las semillas de Rosa Aff. rubiginosa, natural de los Andes sudamericanos.

[0058] En una realizacion preferente adicional, la composicion segun la invencion comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba, en la que dicho extracto de Chelidonium majus comprende protopina, estilopina, quelidonina, sanguinarina, berberina, queleritrina y coptisina y en la que:

- la relacion entre la cantidad en peso de estilopina y la cantidad total en peso de sanguinarina, queleritrina, quelidonina y protopina es superior o igual a 5;

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- la relacion entre la cantidad en peso de berberina y la cantidad total en peso de sanguinarina, queleritrina, quelidonina, protopina es superior o igual a 1; y

- la relacion entre la cantidad en peso de berberina y la cantidad en peso de coptisina en el extracto de Chelidonium majus es superior o igual a 0,05.

[0059] En una realizacion preferente adicional, la composicion segun la presente invencion comprende ademas aceite de Rosa mosqueta.

[0060] De hecho, tambien se descubrio sorprendentemente que el aceite de Rosa mosqueta potencia adicionalmente los efectos estimulantes de la actividad deshidrogenasa mitocondrial de los fibroblastos de la composicion que comprende Copaiba y un extracto de Chelidonium majus (vease la Figura 2, ejemplos 3, 4, 7 y 8).

[0061] En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba y propilenglicol.

[0062] En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba y un compuesto de silicona, preferentemente dimeticona.

[0063] De hecho, se descubrio sorprendentemente que la presencia de una silicona en la composicion no altera los efectos moduladores de la actividad deshidrogenasa mitocondrial de la composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba y aceite de Rosa mosqueta (veanse las Figs. 2, 3 y 4, ejemplos 1,2, 3 y 4).

[0064] En otra realizacion preferente, la invencion se refiere a una composicion en la que la relacion entre la cantidad en peso de beta-cariofileno y la cantidad en peso de compuesto de silicona se situa en el intervalo de 10 a 40.

[0065] Ventajosamente, la composicion segun la invencion comprende aproximadamente 10 % de extracto de Chelidonium majus y aproximadamente 10 % de Copaifera officinalis, en referencia al total de la composicion.

[0066] En una forma preferente, la invencion se refiere a una composicion de pago que comprende ademas una cantidad de aceite de Rosa mosqueta que varia de 5 a 10 % y una cantidad de dimeticona que varia de 0 a 0,5 %, en referencia al total de la composicion.

Segun otro aspecto, la presente invencion se refiere a la composicion segun la invencion para su uso en el tratamiento y la prevencion de lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico.

[0067] La expresion "lesion cutanea caracterizada por hiperproliferacion epidermica y dano dermico" significa estados en los que la hiperproliferacion queratinocitica de la epidermis se produce en asociacion con dano dermico caracterizado por una regeneracion y reparacion de la dermis reducidas, es decir, estados tales como acne en la fase activa, acne en la fase de curacion, presencia de piel impura, envejecimiento de piel acneica, pieles impuras y envejecimiento de la piel en general, dermatitis atopica y dermatitis en general, presencia de placas psoriasicas, discromias cutaneas, hiperseborrea, pustulas, papulas, comedones, fibrosis cutanea, formacion de cicatrices, cicatrices acneicas atroficas, furunculos, talones agrietados, presencia de pelos encarnados, onicocriptosis, callos en la piel, verrugas, queratosis y similares.

[0068] Segun otro aspecto, la invencion se refiere a la composicion de la presente invencion para su uso en el campo cosmetico.

[0069] Las composiciones cosmeticas comprenden un extracto de Chelidonium majus y Copaiba segun la invencion y un excipiente cosmeticamente aceptable.

[0070] En ciertas realizaciones, el vehiculo cosmeticamente aceptable de la composicion de la invencion es un excipiente, vehiculo o diluyente adecuado para las formulaciones farmaceuticas.

[0071] Las composiciones se pueden formular, por ejemplo, en geles, lociones, espumas, barras, unguentos, leches o cremas.

[0072] En ciertas realizaciones, la composicion segun la invencion se aplica a la piel en necesidad de tratamiento.

[0073] En ciertas realizaciones, la composicion esta en el producto sanitario, o en una forma farmaceutica medicinal para uso topico.

[0074] En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba, para su uso en el tratamiento de lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico.

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[0075] En una forma preferente, dichas lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico se seleccionan entre el grupo que consiste en acne, piel impura, envejecimiento de la piel, dermatitis, psoriasis, discromia cutanea, queratosis e hiperseborrea.

[0076] En una forma aun mas preferente, las lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico se seleccionan entre el grupo que consiste en acne y queratosis.

[0077] Los extractos de Chelidonium majus se preparan mediante un procedimiento particular que puede ser ventajosamente un procedimiento de extraccion (por ejemplo, extraccion por maceracion, extraccion por infusion, extraccion por digestion o extraccion por percolacion) y puede realizarse bajo diversas condiciones de temperatura, presion y tiempo de extraccion.

[0078] Dicho extracto de Chelidonium majus es preferentemente un extracto obtenido de la planta fresca en propilenglicol. Ventajosamente, en dicho extracto, la relacion entre la planta y el disolvente es del 20 % p/v y se realiza a temperatura ambiente durante 28 dias. El extracto se recupera por decantacion del solvente, presion de la sustancia y filtracion de toda la mezcla.

[0079] Mas preferentemente, dicho extracto se obtiene a partir de las partes aereas de la planta de Chelidonium majus, seleccionadas entre el grupo que consiste en flores, brotes y hojas, preferentemente hojas sin las venas.

[0080] A continuacion, se proporcionan realizaciones de ejemplos de la presente invencion a modo de ilustracion. Ejemplos

Ejemplo 1: PREPARACION Y CARACTERIZACION QUl'MICA DE EXTRACTOS DE C. MAJUS, OLEORRESINA DE COPAIBA Y ACEITE DE ROSA MOSQUETA

Preparacion del extracto glicolico de partes aereas de C. Majus (EG)

[0081] Las partes aereas de la planta, recogidas en el Monti Ernici (Roma, Italia) se picaron y se colocaron en una maceta en presencia de propilenglicol en una relacion del 20 % p/v entre la planta y el disolvente, a temperatura ambiente durante 28 dias. Despues de este tiempo, el extracto se recupero sedimentando el disolvente, tambien prensando todo el material y filtrando el producto liquido obtenido para eliminar cualquier particula de hierba restante.

Preparacion de la tintura madre de C. majus (TM)

[0082] Las partes aereas de la planta, recogidas en el Monti Ernici (Roma, Italia) se picaron y se colocaron en una maceta en presencia de alcohol a 45 °C en una relacion entre la planta y el disolvente del 33 % p/v, a temperatura ambiente durante 28 dias. Despues de este tiempo, el extracto se recupero sedimentando el disolvente, tambien prensando todo el material y filtrando el producto liquido obtenido para eliminar cualquier particula de hierba restante.

Preparacion de la oleorresina de Copaiba

[0083] La oleorresina de Copaifera officinalis o Copaiba fue proporcionada por Beraca (San Paolo, Brasil). El procedimiento de preparacion, segun lo descrito por el proveedor, se presenta a continuacion: se hacen dos orificios en el tronco del arbol de Copaiba, uno a una altura de 60-90 cm, y el otro 3-6 m mas arriba. Una pieza de bambu tubular, dotada de un tapon simple, se ajusta en el agujero mas bajo. En condiciones normales, el Copaiba fluye facilmente y se recoge en tanques. Una vez completada la operacion, ambos orificios se cierran con tapones simples, el arbol sigue creciendo, permitiendo otras futuras tomas de aceite de Copaiba.

Preparacion del aceite de Rosa mosqueta

[0084] El aceite de Rosa mosqueta fue suministrado por Agrar srl (Roma, Italia). El procedimiento de preparacion, segun lo descrito por el proveedor, se presenta a continuacion. Se preparo prensando en frio las semillas de Rosa aeruginosa procedentes de America del Sur, se refinaron, neutralizaron y estabilizaron con vitamina E natural a una concentracion de 300 ppm.

[0085] El analisis anterior, se realizo por HPLC segun una modificacion del procedimiento descrito en Sarkozi A et al. Chromatographia, 2006, 63, pags. 81-86. Esta modificacion permitio que tambien se identificara el alcaloide estilopina.

[0086] En detalle, los analisis se realizaron en HPLC Perkin-Elmer Flexar compuesta de una bomba binaria, un desgasificador de tres canales y un detector UV/VIS. El programa TotalChrome se uso para la adquisicion y procesamiento de datos.

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[0087] La separacion se realizo en una columna de fase inversa Phenomenex Luna 5 pi C18 (250 mm x 4,6 mm I.D.). La longitud de onda usada fue de 280 nm. El volumen de inyeccion fue de 20 pi (medida del bucle). Como eluyente se uso una mezcla isocratica de formiato acetonitrilo-metanol-amonio de 30 mM (pH 2,8) 150:180:670. El caudal fue de 0,8 ml/min. La identificacion de los componentes se realizo anadiendo muestras adecuadas de "patrones", es decir, componentes individuales conocidos. La cantidad de cada "patron", anadida a 35 pi de muestra para ser analizada, fue de 5 pl.

[0088] Los extractos de C. majus se caracterizan por las concentraciones del alcaloide principal. Dicha composicion se notifica en la Tabla 1 (vease a continuacion), en la que las concentraciones se expresan en ppm.

Tabla 1.

Extracto

Protopina Quelidonina Coptisina Estilopina Sanguinarina Berberina Queleritrina

Extracto glicolico (EG)

7,49 12,96 239,24 112,60 0,08 21,63 <0,01

Tintura madre (TM)

0,21 29,29 18,89 0,34 <0,01 0,01 <0,01

[0089] La concentracion de berberina puede cambiar, sin embargo, varia de 0,01 a 22 ppm (mg/l).

Analisis quimico de Copaiba

[0090] La oleorresina de Copaiba es un liquido viscoso, translucido, de un color verdoso transparente. Se caracteriza por los siguientes parametros fisicoquimicos:

Peso especifico: de 0,850-0,950 g/cm3, valor de acidez: </=2,0, valor de peroxido: </=10,0 y porcentaje de p- cariofileno: (GLC) >/=42 %.

[0091] Dado que la densidad minima de 0,85, 1 I de copaiba pesa 850 g, y por lo tanto contiene una cantidad de

beta-cariofileno superior o igual a 850*42 %=357 g, o una concentracion de 357.000 ppm. Dado que la concentracion de beta-cariofileno en varios aceites comercialmente disponibles de Copaiba oscila entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60 % y que la densidad de Copaiba oscila entre 0,85 y 0,95, segun un calculo analogo, la concentracion de beta-cariofileno en Copaiba puede oscilar entre

1 *0,85*0,2*1.000*1.000=170.000 ppm y 1 *0,95*0,6*1.000*1.000=570.000 ppm.

Analisis quimico del aceite de Rosa mosqueta

[0092] El aceite de Rosa mosqueta se caracteriza por los parametros fisicoquimicos dados en la Tabla 2 (vease a continuacion).

_____________Tabla 2. Parametros fisicoquimicos que caracterizan el aceite de Rosa mosqueta_____________

- Nombre INCI (nuevo como = 2006): aceite de semilla de rosa mosqueta

- Descripcion de liquido claro de color amarillo rojizo con un ligero olor caracteristico

- Origen: de las semillas de la planta; posteriormente refinadas, neutralizadas y estabilizadas con vitamina E natural (300 ppm)

- Gravedad especifica a 20 °C: 0,925 g/ml

- Indice de refraccion: 1,478

- Color (Gardner): se conforma

- Color (lovibond): 26 Y/2,4 R -Humedad (K.F.): 0,03 %

- Valor de yodo (Wijs): 169 g/100g

- Valor de saponificacion: 191 mg de KOH/g

- Valor acido: 0,10 mg de KOH/g

- Valor de peroxido: 1,4 meqO2/g

- Insaponificables: aprox. 0,5-2,5 %

-Viscosidad a 25 °C aprox. 40-50 cps

COMPOSICION de los principales ACIDOS GRASOS (media):

- C-16:0 - Palmitico: 2,5-5,0 %

- C-16:1 - Palmitoleico: 0,1-0,4 %

- C-17,0 -Heptadecanoico: 0,1-0,2 %

- C-18:0 - Estearico: 1,0-5,0 %

- C-18:1 - Oleico: 13,0-19,0 %

- C-18:2 - Linoleico: 42,0-55,0 %

- C-18:3 - Linolenico: 27,0-40,0 %

- C-20:0 - Araquico: 0,3-2,0 %

Acidos grasos poliinsaturados totales: 77-80 %_____________________________________________________

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[0093] La concentracion de acido linoleico esta dentro de los limites de 1*0,925*0,42*1.000*1.000=388.000 y 1 *0,925*0,55*1.000*1.000=509.000, expresado como ppm.

Ejemplo 2: Formulaciones

[0094] Se prepararon las siguientes formulaciones:

Formulacion

Extracto presente de Presencia de Presencia de aceite de Presencia de

Chelidonium majus

Copaiba Rosa mosqueta dimeticona

1

Tintura madre SI No SI

2

Extracto glicolico SI No SI

3

Tintura madre SI SI SI

4

Extracto glicolico SI SI SI

5

Tintura madre SI No No

6

Extracto glicolico SI No No

7

Tintura madre SI SI No

8

Extracto glicolico SI SI No

Formulacion 1: Gel cosmetico que contiene Chelidonium majus, Copaifera officinalis y un compuesto de silicona

[0095]

Agua csp ad 100

Chelidonium majus (tintura madre) 10 Resina de Copaifera officinalis 10

Dimeticona 0,15

Carbomero 0,6

Fenoxietanol 0,50

Metilparabeno de sodio 0,20

Propilparabeno de sodio 0,15

Formulacion 2: Gel cosmetico que contiene Chelidonium majus, Copaifera officinalis y un compuesto de silicona

[0096]

Agua csp ad 100

Chelidonium majus (extracto glicolico) 10 Resina de Copaifera officinalis 10

Dimeticona 0,15

Carbomero 0,6

Fenoxietanol 0,50

Metilparabeno de sodio 0,20

Propilparabeno de sodio 0,15

Formulacion 3: Gel cosmetico que contiene Chelidonium majus, Copaifera officinalis, Rosa mosqueta y un compuesto de silicona

[0097]

Agua

csp ad 100

Chelidonium majus (tintura madre)

10

Resina de Copaifera officinalis

10

Aceite de Rosa mosqueta

5

Dimeticona

0,15

Carbomero

0,6

Fenoxietanol

0,50

Metilparabeno de sodio

0,20

Propilparabeno de sodio

0,15

Formulacion 4: Gel cosmetico que contiene Chelidonium maius, Copaifera officinalis, Rosa mosqueta y un compuesto de silicona

10

15

20

[0098]

Agua csp ad 100

Chelidonium majus (extracto glicolico) 10

Resina de Copaifera officinalis 10

Aceite de Rosa mosqueta 5

Dimeticona 0,15

Carbomero 0,6

Fenoxietanol 0,50

Metilparabeno de sodio 0,20

Propilparabeno de sodio 0,15

Formulacion 5:

Gel cosmetico que contiene Chelidonium majus y Copaifera officinalis

[0099]

Agua csp ad 100

Chelidonium majus (tintura madre) 10

Resina de Copaifera officinalis 10

Carbomero 0,6

Fenoxietanol 0,50

Metilparabeno de sodio 0,20

Propilparabeno de sodio 0,15

Formulacion 6:

Gel cosmetico que contiene Chelidonium majus y Copaifera officinalis

[0100]

Agua csp ad 100

Chelidonium majus (como extracto glicolico) 10

Resina de Copaifera officinalis 10

Carbomero 0,6

Fenoxietanol 0,50

Metilparabeno de sodio 0,20

Propilparabeno de sodio 0,15

Formulacion 7:

Gel cosmetico que contiene Chelidonium majus, Copaifera officinalis y Rosa mosqueta

[0101]

Agua csp ad 100

Chelidonium majus (tintura madre) 10

Resina de Copaifera officinalis 10

Aceite de Rosa mosqueta 0,10

Carbomero 0,6

Fenoxietanol 0,50

Metilparabeno de sodio 0,20

Propilparabeno de sodio 0,15

Formulacion 8:

Gel cosmetico que contiene Chelidonium maius, Copaifera officinalis y Rosa mosqueta

[0102]

Agua csp ad 100

Chelidonium majus (extracto glicolico) 10

Resina de Copaifera officinalis 10

Aceite de Rosa mosqueta 5

Carbomero 0,6

Fenoxietanol 0,50

Metilparabeno de sodio 0,20

Propilparabeno de sodio 0,15

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EJEMPLO 3: BIOENSAYOS Y ENSAYOS PARA LA ACTIVIDAD ANTI-RADICAL

Cultivos celulares y tratamientos

[0103] Los fibroblastos dermicos humanos (FDH) se cultivaron y manipularon segun las instrucciones del proveedor (ECACC, cat. 106-05a,
http://www.hpacultures.org.uk/). Los queratinocitos humanos (QEH, queratinocitos epidermicos humanos, ECACC) se cultivaron y manipularon segun las instrucciones del proveedor (ECACC, cat. 102-05a,
http://www.hpacultures.org.uk/).

[0104] Las celulas CEVUH (celulas endoteliales de vena umbilical humana, ECACC) se cultivaron y manipularon segun las instrucciones del proveedor (ECACC, cat. 200-05n,
http://www.hpacultures.orq.uk/).

[0105] Por lo que respecta a la cuantificacion de citoquinas inflamatorias en el sobrenadante celular, analizada mediante el metodo ELISA, la cuantificacion del colageno producido por las celulas FDH, la evaluacion de la proliferacion celular y la evaluacion de la morfologia celular, las celulas se sembraron en placas de fondo plano de 24 pocillos (Corning), se dejan adherir y luego se tratan por triplicado o con la formulacion de ensayo a una concentracion dada, o con un medio de control en presencia o ausencia de 100 pM de H2O2 o de 34 ng/ml de TGF- p1. Las condiciones bajo las cuales las celulas se sometieron a los tratamientos por triplicado, ya sea con la formulacion de ensayo a la concentracion deseada o con medios de control, se definen como "condiciones de crecimiento convencional". El volumen total de medio de cultivo por pocillo fue de 500 pi. Despues de un periodo de tratamiento de 24 horas, el sobrenadante celular o las celulas se analizaron como se describe mejor en los parrafos "Medicion de citoquinas inflamatorias en el sobrenadante celular" y "La fijacion de las celulas sera metanol".

[0106] Con respecto a los ensayos destinados a evaluar la actividad deshidrogenasa mitocondrial, las celulas FDH, QEH y CEVUH se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos (Sarstedt), a una densidad de 2.000 a 8.000 celulas por pocillo, se dejaron adherir y luego se trataron por cuadruplicado con la formulacion de ensayo a la concentracion deseada o con un medio de control. El volumen total del medio de cultivo por pocillo fue de 100 pi. Las formulaciones de ensayo se evaluaron a concentraciones que varian de 1 % v/v a 0,000001 % v/v en el caso de componentes individuales. Se usaron fibroblastos dermicos humanos para analizarse en pases de cultivo III T75. Los queratinocitos humanos se usaron para analizarse entre el pase de cultivo I y el pase de cultivo VI. Las celulas CEVUH se usaron para analizarse entre el pase de cultivo I y el pase de cultivo VI.

[0107] Despues de un periodo de tratamiento de 18 o 42 horas, las celulas se analizaron como se describe mejor en el parrafo "Evaluacion de la actividad deshidrogenasa mitocondrial".

[0108] Con respecto a los ensayos destinados a evaluar la migracion celular, el cultivo de fibroblastos o celulas CEVUH se realizo en placas de fondo plano de 96 pocillos (Sarstedt), llevando a las celulas hasta confluencia. La evaluacion de los efectos de las formulaciones, a una concentracion de 0,02 % v/v, sobre la migracion de fibroblastos o celulas CEVUH se realizo como se describe en el parrafo "Evaluacion de la modulacion de migracion celular".

Evaluacion de la actividad deshidrogenasa mitocondrial

[0109] La actividad de la deshidrogenasa mitocondrial se midio en FDH, QEH y CEVUH mediante el ensayo de formazan, usando el kit Roche Diagnostic WST-1 segun las instrucciones del proveedor. Brevemente, se anadio el reactivo (10 pi por pocillo), la incubacion se continuo durante otras 2 o 4 horas, y al final de este tiempo se leyo la absorbancia durante 1 segundo a una longitud de onda de 450 nm en un lector de microplacas Perkin Elmer Victor 2 Wallac.

[0110] Los resultados se dan en las Figuras 1 a 4, en las que la actividad deshidrogenasa mitocondrial expresada como porcentaje de actividad (% de actividad deshidrogenasa mitocondrial) se define como: % de actividad deshidrogenasa mitocondrial = ((absorbancia de las celulas tratadas - absorbancia del blanco)/(absorbancia del control - absorbancia del blanco)) x 100.

Medicion de citoquinas inflamatorias en el sobrenadante celular

[0111] Se realizaron determinaciones cualitativas y cuantitativas de las citoquinas inflamatorias, ligando CD40 (CD40L), interferon-Y (INF-y), interleucina-1a (IL-1a), interleucina-1 p (IL-1 p), interleucina-6 (IL-6), interleucina 8 (IL- 8), interleucina-17 (IL-17) y factor de necrosis tumoral-a (TNF-a). Cada medicion se realizo por duplicado usando un micromatriz de proteina ELISA R & D System Mosaic™ segun las instrucciones del proveedor. Ademas, con el objetivo de obtener un modelo de correlacion entre la intensidad de la senal luminosa y la concentracion de citoquinas, se obtuvo una curva de calibracion con 6 concentraciones para cada una de estas ultimas. El analisis de los datos se realizo con el software dedicado Quansys Biosciences Q-View™ Imager.

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Fijacion de las celulas con metanol

[0112] Despues de eliminar el sobrenadante celular, las celulas FDH se fijaron en metanol frfo durante la noche a - 20 2C.

Protocolo para tenir las celulas con roio sirio para colageno

[0113] Despues de fijarse con metanol durante una noche, se elimino el disolvente y las celulas FDH fijadas se tineron con 400 pl/pocillo de una solucion al 0,1 % de tincion con Picro-rojo sirio (PSR) durante 4 horas. Esta solucion se prepara disolviendo el reactivo, rojo directo 80 Sigma-Aldrich en una solucion acuosa saturada de acido pfcrico. Despues de 4 h de incubacion con PSR a temperatura ambiente, las celulas se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de una solucion acuosa al 0,1 % de acido acetico, y se secaron.

Evaluacion de la proliferacion celular

[0114] Las fotograffas de las celulas FDH tenidas con rojo sirio en todos los pocillos de las placas se tomaron con un aumento de 100x y su numero, para cada fotograffa, se evaluo mediante la funcion de recuento de celulas del programa ImageJ.

Evaluacion de la morfoloaia celular

[0115] Ademas, se tomaron fotograffas de las celulas FDH tenidas con rojo sirio en todos los pocillos de las placas a aumentos de 100x, 200x y 400x. Su morfologfa, color y forma fueron evaluados mediante el programa ImageJ.

Medicion de la cantidad de colaaeno producido por las celulas mediante la elucion con rojo sirio

[0116] Las celulas de FDH tenidas con rojo sirio se sometieron a la elucion de la tincion de una manera analoga a la notificada en "Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 2007". Brevemente, la tincion retenida dentro de las celulas se eluyo con 200 pl/pocillo de una solucion acuosa de hidroxido de sodio 0,1 N por agitacion en un agitador oscilante, seguido de la transferencia de muestras de la solucion eluida en placas de 96 pocillos. La densidad optica (DO) se leyo usando un lector de microplacas Wallac en absorbancia de la luz a la longitud de onda de 530 nm.

Evaluacion de la modulacion de la migracion celular

[0117] Este ensayo se realizo para evaluar los efectos en la migracion de fibroblastos de formulaciones a una concentracion de 0,02 % v/v.

[0118] Una vez en la confluencia, se realizo una herida artificial en forma de cruz en la monocapa de celulas, usando una punta de plastico esteril en cada muestra. El medio de cultivo celular se elimino y se reemplazo con un medio que contenfa la sustancia de ensayo, con la excepcion de los controles negativos.

[0119] Inmediatamente despues de la ejecucion de la herida (t = 0 h) y en varios momentos (t = 24 y 48 h) se realizaron observaciones por microscopio de contraste de fase invertida de las muestras tratadas y de los controles usando un microscopio de contraste de fase invertida (INV-2 Orma) con un aumento de 200X y 400X. Los resultados se muestran como las areas de observacion contiguas a la herida, en las que se observa la presencia de celulas. Un aumento en esta area en tiempos crecientes corresponde a una reduccion en las dimensiones de la herida, una indicacion de que las celulas han migrado hacia el area dentro del corte. Esta area se midio usando el programa CellProfiler [Carpenter AE et al. Genome Biology, 2006, 7, R100].

Evaluacion de la actividad anti-radical

[0120] Con respecto a los ensayos destinados a evaluar la actividad anti-radical, se uso un ensayo qufmico en la que se evaluo la descomposicion del radical difenilpicrilhidrazilo (DPPH) en ausencia o en presencia de sustancias de ensayo. Con mas detalle, este radical se usa para evaluar la capacidad de las sustancias para actuar como depuradores de radicales libres. DPPH en solucion tiene un color purpura, con una absorcion maxima a 517 nm, que cambia a un color amarillo incoloro cuando este radical extrae un atomo de hidrogeno de un depurador de radicales, para producir la forma reducida de DPPH-H. El ensayo se realizo en microplacas de 96 pocillos (placa de cultivo tisular, celula+ de fondo plano de 96 pocillos SARSTEDT) por cuadruplicado. A cada pocillo de la microplaca, se anadieron 500 mg de formulacion y luego 5 pi de una solucion de DPPH 2 mM (PM 168,18, Aldrich 2,2-di(4-terc- octilfenil)-1 -picrilhidrazilo, radical libre, lote n.° MKBF7574V Cat. n.° 257621-100 mg).

[0121] Un control positivo, que consiste en 500 mg de formulacion con 5 mg de acido ascorbico, y un control negativo, que consiste en 500 mg de formulacion con 5 pi de H2O2 a 36 volumenes, se incluyeron en cada microplaca. 30 minutos despues de la adicion de DPPH, se evaluaron los colores de los controles y de la formulacion, y se tomo una fotograffa de la placa (Canon PowerShot A610 5.0 Mpixels); acto seguido la actividad potencial anti-radical fue evaluada visualmente.

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Evaluacion de la actividad antimicrobiana

[0122] El propilenglicol se almaceno a -20 °C hasta el dfa del ensayo. Antes del ensayo, los aerobicos aislados se rasparon de viales congelados en agar tripticasa de soja y se incubaron durante la noche a 35 °C. Los aislados anaerobicos aislados se rasparon de viales congelados en agar enriquecido con Brucella (que contiene 5 mg/ml de haemina, 1 pg/ml de vitamina K y 5 % de sangre de oveja lisada) y se incubaron a 35 °C en condiciones anaerobicas durante 48 horas. Los aislados de levadura se rasparon de viales congelados en agar dextrosa Sabouraud y se incubaron durante la noche a 35 °C. Los aislados fungicos se cultivaron en agar dextrosa de patata y se incubaron durante 7-10 dfas a 35 °C. Las colonias se muestrearon del medio respectivo, se resuspendieron en el medio de cultivo apropiado, se dividieron en alfcuotas y se almacenaron a -80 °C.

[0123] Para los ensayos en aerobios, se uso el medio Mueller Hinton II (MHBII, BD 212322, Lote 0257287, Becton, Dickinson y Co., Sparks, MD). Para ensayos en anaerobios, se usaron el medio con Brucella (SBB, BD 211088, Lote 0320091; Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD) enriquecido con 5 pg/ml de haemina (H9039, lote 099K1183; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1 pg/ml de vitamina K (V3501; Lote 106K1523; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 5 % de sangre de caballo (Lote 117342-2, Cleveland Scientific). Los aislados tanto de hongos como de levaduras se analizaron en medio RPMI (SH30011.04; Lote AWA92121B; HyClone Labs, Logan, UT) tamponado con MOPS (475898; Lote D00093780; CalBiochem, La Jolla, CA) 0,165 M. II pH del medio RPMI se ajusto a 7,0 con NaOH 1 N. el medio se sometio a filtracion esteril usando un filtro PES de 2 pm y se almaceno a 4 °C hasta el momento del uso.

[0124] El ensayo se realizo segun los metodos descritos por el Instituto de Normas Clmicas y de Laboratorio (INCL). La concentracion inicial de propilenglicol fue del 40 %. Las diluciones en serie del disolvente se realizaron manualmente en placas de 96 pocillos. Los pocillos ubicados en las columnas 2-12 se llenaron con 460 pi de agua esteril; luego, se anadieron 460 pi del disolvente al pocillo ubicado en la columna 2 de la placa "madre" y se mezclaron. El disolvente se diluyo luego en serie y cada una de las alfcuotas debidamente diluidas se anadio a la placa relevante hasta la columna 11. La columna 12 contenfa agua esteril, como control del crecimiento del microorganismo. Las placas "hija" eran placas de microdilucion convencional de 96 pocillos (Costar 3795) y se llenaron con 50 pl del medio adecuado para cada microorganismo. Se anadieron 40 pl de disolvente y de las muestras obtenidas a partir de diluciones en serie preparadas en la placa "madre" a las placas "hija".

[0125] Para cada microorganismo, se preparo un inoculo convencional segun los metodos de CLSI. Para los hongos y las bacterias, las colonias se muestrearon de las placas de agar y se suspendieron en MHBII (aerobios), SBB (anaerobios) o RPMI (levaduras) en un patron de McFarland de 0,5. Para Aspergillus niger624, se pusieron 0,5 ml de solucion salina al 0,85 % en agar, que se habfa inoculado 7-10 dfas antes, y se preparo una suspension de hongos en la superficie de agar. La mezcla resultante se transfirio a un tubo de ensayo esteril y se dejo reposar durante 5 minutos para depositar las partfculas mas pesadas. Se elimino el sobrenadante, se coloco en otro tubo de ensayo y se centrifugo durante 15 segundos. La densidad se ajusto al patron de turbidez McFarland 0,5. Para cada microorganismo, las diluciones se llevaron a cabo en el medio apropiado para alcanzar la concentracion celular descrita en la metodologfa INCL. Luego se inocularon 10 pi de suspension que contenfa cada microorganismo en cada pocillo. Al final del procedimiento, los pocillos de las placas "hija" contenfan 50 pi de medio, 40 pi de propilenglicol y 10 pi de inoculo. Las placas se cubrieron con una tapa. Las que contenfan aerobios, hongos y levaduras se colocaron en bolsas de plastico y se incubaron a 35 °C durante aproximadamente 24-48 horas antes de la lectura. Las que contenfan los anaerobios se colocaron en camaras BD GasPak y se incubaron a 35 °C durante 46-48 horas en condiciones anaerobicas. Las placas se visualizaron a continuacion desde abajo usando un visualizador de placas. La inhibicion del crecimiento se leyo y registro como la concentracion mas baja de disolvente que inhibe el crecimiento visible del organismo.

Analisis estadistico

[0126] Los valores de proliferacion celular, produccion de colageno y produccion de citoquinas inflamatorias obtenidos de experimentos se sometieron a un analisis estadfstico con el programa OpenStat version 26.03.2012 (
www.statproqrams4u.com). En particular, la comparacion entre los valores medios se llevo a cabo usando el ensayo t Student de dos colas. Los valores de P<0,05 se consideraron estadfsticamente significativos.

RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS Y ACTIVIDAD ANTI-RADICAL

[0127] Los resultados del ensayo dirigido a evaluar el efecto de las formulaciones de la invencion sobre la actividad deshidrogenasa mitocondrial se muestran en los graficos que se presentan a continuacion, en los que la actividad deshidrogenasa mitocondrial expresada como el porcentaje de actividad se define como:

% de actividad deshidrogenasa mitocondrial = ((absorbancia de las celulas tratadas - absorbancia del blanco)/(absorbancia del control - absorbancia del blanco) x 100

[0128] En los graficos ilustrados en las Figs. 1-4, se notifica el % de actividad deshidrogenasa mitocondrial (eje y) frente a las concentraciones de las sustancias (eje x). Los resultados del ensayo destinado a evaluar el efecto de las formulaciones de la invencion sobre la migracion celular se dan en la Tabla 3.

Tabla 3. Efecto de cuatro formulaciones de la invencion sobre la migracion de celulas FDH a una concentracion de 0,01 % p/v___________________________________________________________________________________

Ejemplo ID

Porcentaje de area de celulas FDH ± D.T. a las 24 h Porcentaje de area de celulas FDH ± D.T. a las 24 h

Control

32 ± 1 48 ± 4

Formulacion 1

45 ± 9 71 ± 1

Formulacion 2

41 ± 5 71 ± 3

Formulacion 3

33 ± 1 67 ± 7

Formulacion 4

36 ± 14 76 ± 11

[0129] El efecto del tratamiento de las formulaciones 4 y 8, durante 24 horas a las concentraciones especificadas,

5 sobre la morfologia de las celulas FDH tenidas para el colageno con PSR se da en las Figs. 5-7. Estas figuras

muestran los datos obtenidos de FDH cultivadas en condiciones de crecimiento convencional, en presencia de 100 gM de H2O2 y en presencia de 34 ng/ml de TGF-p1, respectivamente. La morfologia celular se evaluo usando un microscopio optico con aumentos de 100x, 200x e 400x.

10 [0130] Por lo que respecta a los datos de proliferacion celular y los datos, normalizados para el numero de celulas,

que se refieren a la produccion de colageno, IL-1 p e IL-6, los resultados se notifican en las Tablas 4 y 5,

respectivamente.

17

Tabla 4. Datos relativos a la proliferacion celular, produccion de colageno y la liberacion de citoquinas inflamatorias obtenidos a partir de FDH para colageno tenido con rojo sirio y sometidas a diversos tratamientos con las formulaciones 4 y 8 a las concentraciones especificadas, durante un periodo de 24 horas, bajo condiciones de crecimiento convencional, en presencia de 100 pM de H2O2 y en presencia de 34 ng/ml de TGF-p1. La proliferacion celular y la produccion de colageno se expresan como el valor medio de tres experimentos ± D.T, mientras que la produccion de citoquinas inflamatorias IL-1 p e IL-6 se expresa como el valor medio de dos experimentos ± D.T.

Tratamiento

Condiciones convencionales 100 pM de H2O2 34 ng/ml de TGF-p1

N.° de fotocelulas3 ± D.T.

Abs*106/N.° de fotocelulas6 ± D.T. IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas)3 ± D.T. IL-6 ng/(ml*N.° de fotocelulas)6 ± D.T. N.2 de fotocelulas3 ± D.T. Abs*106/N.° de fotocelulas6 ± D.T. IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas)3 ± D.T. IL-6 ng/(ml*N.° de fotocelulas)6 ± D.T. N.2 de fotocelulas3 ± D.T. Abs*106/N.° de fotocelulas6 ± D.T. IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas)3 ± D.T. IL-6 ng/(ml*N.° de fotocelulas)6 ± D.T.

Control (C)

186 ± 28 1720 ± 102 112 ± 1 715 ± 32 183 ± 17 1475± 16 142 ± 2 1295± 109 163 ± 4 2576 ± 122 159 ± 6 969 ± 36

Formulacion 40,1 %

210 ± 38 1142±47 102 ± 10 785 ± 4 155 ± 36 2174±58 107± 7 1265 ±40 176 ± 16 2284 ± 272 113 ± 10 676 ± 18

Formulacion 80,1 %

199 ± 22 1206±90 111 ± 1 803 ± 8 142 ± 5 2711 ±359 120 ± 8 1219 ±98 171 ± 23 2345 ± 23 115 ± 5 660 ± 15

a N.° de fotocelulas = numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la proliferacion celular

b Abs*10-6/N.° de fotocelulas = absorbancia escalonada por un factor de 10-6 como una relacion del numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la produccion de colageno por celula

c IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas) = concentracion de IL-1 p expresada en ng/ml como una relacion del numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la produccion de IL-1 p por celula

d IL-6 ng/(ml*N.° de fotocelulas) = concentracion de IL-6 expresada en ng/ml como una relacion del numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la produccion de IL-6 por celula D.T. = desviacion tipica

18

Tabla 5. Comparacion entre los valores medios para la proliferacion celular, produccion de colageno y la liberacion de citoquinas inflamatorias mostrados en la Tabla 4, expresados como una probabilidad (P) obtenida usando el ensayo T de Student. Los valores de probabilidad < 0,05 se muestran en negrita.

Tratamiento

Condiciones convencionales - valor de P vs. control 100 pM de H2O2 - valor de P vs. control + H2O2 34 ng/ml de TGF-p1 - valor de P vs. control + TGF-P1

N.° de fotocelulas3

Abs*106/N.° de fotocelulas6 IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas)3 IL-6 ng/(ml*N. ° de fotocelulas)6 N.2 de fotocelulas3 Abs*106/N.° de fotocelulas6 IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas)3 IL-6 ng/(ml*N.° de fotocelulas)6 N.2 de foto- celulas3 Abs*106/N.° de foto- celulas6 IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas)3 IL-6 ng/(ml*N.° de fotocelulas)6

Control (C)

- - - - - - - - - - - -

Control + H2O2

0,8816 0,0147 0,0028 0,0186 - - - - - - - -

Control + TGF-p1

0,2318 0,0007 0,0083 0,0175 - - - - - - - -

Formulacion 40,1 %

0,4282 0,0009 0,0032 0,0948 0,2901 P<0,0001 0,021 0,7498 0,2439 0,165 0,0307 0,0093

Formulacion 80,1 %

0,5615 0,0028 0,0306 0,3597 0,016 0,004 0,0636 0,5397 0,5848 0,0322 0,0154 0,0079

a N.° de fotocelulas = numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la proliferacion celular

b Abs*10'6/N.2 de fotocelulas = absorbancia escalonada por un factor de 10-6 como una relacion del numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la produccion de colageno por celula

c IL-1 p ng/(ml*N.° de fotocelulas) = concentracion de IL-1 p expresada en ng/ml como una relacion del numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la produccion de IL-1 p por celula

d IL-6 ng/(ml*N.° de fotocelulas) = concentracion de IL-6 expresada en ng/ml como una relacion del numero de celulas leidas por microfotografia, un parametro que indica la produccion de IL-6 por celula D.T. = desviacion tipica

[0131] Los resultados de los ensayos destinados a estimar la actividad anti-radical potencial de las formulaciones de la invencion se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Actividad anti-radical.

Sustancia

Actividad anti-radical

Controles

Control negativo con H2O2

Inactiva

Control positivo con vitamina C

Activa

Formulaciones que contienen extractos de C. majus

Formulacion 4

Activa

Formulacion 8

Activa

5

[0132] Los resultados de los ensayos destinados a estimar la actividad antimicrobiana potencial del propilenglicol se dan en la Tabla 7. Esta tabla muestra las concentraciones de propilenglicol que inhiben el crecimiento de cada uno de los microorganismos analizados expresado como porcentaje.

10 __________________________Tabla 7. Actividad antimicrobiana del propilenglicol__________________________

Microorganismo

Porcentaje de propilenglicol que inhibe el crecimiento de microorganismos

Staphylococcus aureus 100 (ATCC 29213)1

20

Staphylococcus aureus 2119 (EE.UU. 100 SARM)1

20

Escherichia coli 102 (ATCC 25922)1

10

Pseudomonas aeruginosa 103 (ATCC 27853)1

10

Corynebacterium striatum 5975 (ATCC 6940)1

20

Bacteroides fragilis 123 (ATCC 25285)2

10

Finegoldia magna 5976 (ATCC 29328)

>40

Propionibacterium acnes 1286 (ATCC 11829)2

5

Candida albicans 104 (ATCC 90028)3

10/10

Candida parapsilosis 2323 (ATCC 22019)3

10/10

Aspergillus niger 624 (ATCC 16888)2

10

Lectura de placas a las 19 horas de incubacion 2Lectura de placas a las 46-48 horas de incubacion 3Lectura de placas a las 24 y 48 horas de incubacion

[0133] A partir de la descripcion detallada y de los ejemplos mencionados anteriormente, las ventajas que surgen de las composiciones de la presente invencion son obvias. En particular, tales composiciones han demostrado ser sorprendentemente y ventajosamente muy adecuadas para su uso en los campos cosmetico y farmaceutico, y en 15 particular para su uso en el tratamiento de lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico, posiblemente asociadas con una infeccion microbiana.

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Composicion que comprende un extracto de Chelidonium majus y Copaiba.
2. 2. Composicion segun la reivindicacion 1, en la que dicha composicion comprende berberina y beta-cariofileno, en la

   que la relacion entre la cantidad en peso de beta-cariofileno y la cantidad en peso de berberina se situa en el

   intervalo de 7.000 a 60.000.000.
3. 3. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho extracto de Chelidonium majus comprende protopina, estilopina, quelidonina, sanguinarina, berberina, queleritrina y coptisina y en la que:

   - la relacion entre la cantidad en peso de estilopina y la cantidad total en peso de sanguinarina, queleritrina, quelidonina y protopina es superior o igual a 5;

   - la relacion entre la cantidad en peso de berberina y la cantidad total en peso de sanguinarina, queleritrina, quelidonina, protopina es superior o igual a 1; y

   - la relacion entre la cantidad en peso de berberina y la cantidad en peso de coptisina en el extracto de Chelidonium majus es superior o igual a 0,05.
4. 4. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas Rosa mosqueta.
5. 5. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas una silicona.
6. 6. Composicion segun la reivindicacion 5, en la que en dicha composicion la relacion entre la cantidad en peso de beta-cariofileno y la cantidad en peso de compuesto de silicona se situa en el intervalo de 10 a 40.
7. 7. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende propilenglicol.
8. 8. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en la que dicho compuesto de silicona es dimeticona.
9. 9. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico.
10. 10. Composicion para su uso segun la reivindicacion 9, en la que dichas lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico se seleccionan entre el grupo que consiste en acne, dermatitis, psoriasis, discromia cutanea y queratosis.
11. 11. Composicion para su uso segun la reivindicacion 10, en la que dichas lesiones cutaneas caracterizadas por hiperproliferacion epidermica y dano dermico se seleccionan entre el grupo que consiste en acne y queratosis.