ES2678699T3 - Queso procesado con componentes lácteos cultivados y método de fabricación - Google Patents

Queso procesado con componentes lácteos cultivados y método de fabricación Download PDF

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Abstract

Un método de producción de un queso procesado que tiene agentes antimicrobianos naturales, comprendiendo el método: fermentar un medio lácteo líquido con una cepa de Lactococcus lactis para producir un componente lácteo cultivado que incluye nisina y exopolisacárido; añadir el componente lácteo cultivado a un queso natural o mezcla de quesos naturales con uno o más emulsionantes para producir un queso procesado que tiene de aproximadamente 8 a 10 aproximadamente 25 por ciento de proteína y de aproximadamente a aproximadamente 20 por ciento de grasa; en donde el queso procesado incluye una cantidad de nisina, eficaz para evitar la formación de la toxina de C. botulinum determinada por el bioensayo de toxina con ratones, en el queso procesado a los niveles de proteína y grasa del mismo durante aproximadamente 9 días a 30 °C (86 °F); y en donde el queso procesado incluye una cantidad de exopolisacárido eficaz para aumentar la fusión del queso procesado y aumentar la firmeza del queso procesado con respecto a un queso procesado sin nisina ni exopolisacárido.

Description

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DESCRIPCIÓN
Queso procesado con componentes lácteos cultivados y método de fabricación Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la ventaja de la solicitud provisional de Estados Unidos número 61/692.129, presentada el 22 de agosto de 2012.
Presentación del listado de secuencias
El listado de secuencias asociado con esta solicitud se presenta en formato electrónico por medio de la web EFS y se incorpora en la presente memoria descriptiva en su totalidad. El nombre del archivo de texto que contiene la lista de secuencias es “Sequence Listing 1410.131457”. El tamaño del archivo de texto es de 46 kB, y el archivo de texto se creó el 21 de agosto de 2013.
Campo
La presente solicitud se refiere de modo general a métodos de fabricación de composiciones de queso procesado y, más especialmente, a métodos de fabricación de composiciones de queso procesado que contienen componentes lácteos cultivados.
Antecedentes
El queso procesado, ampliamente disponible en forma de lonchas y bloques, se ha convertido en uno de los productos de queso más populares. Los productos de queso procesado son especialmente apreciados por los niños. El queso procesado se prepara convencionalmente mediante calentamiento, trituración y/o mezclado de una o más variedades de quesos naturales que contienen grasa láctea, tales como, por ejemplo, queso Cheddar, queso Colby, queso suizo, queso Brick, queso Muenster, queso pasta filata, cuajada lavada, y queso coágulo granular, por mencionar solo algunos tipos. El queso resultante se mezcla a continuación con otros productos lácteos, tales como leche deshidratada desnatada y sólidos de lactosuero, y sales emulsionantes, tales como fosfato disódico, a temperaturas que son suficientemente elevadas para pasteurizar el queso y para producir un material de queso fluido homogéneo y que se puede bombear que se puede conformar en láminas, lonchas u otras formas deseadas.
A menudo es deseable prolongar el período de validez de los alimentos, tales como queso procesado, y/o aumentar la estabilidad microbiológica de tales alimentos. Al aumentar la cantidad de tiempo que un alimento es estable, los procesadores pueden mitigar las pérdidas de inventario debidas a productos alimenticios que se han deteriorado. Los métodos anteriores, tales como el uso de envasado, conservantes y/o parámetros de almacenamiento específicos (p. ej., refrigeración), han sido utilizados para evitar el deterioro.
En particular, Listeria monocytogenes y C. botulinum pueden, en algunos casos, ser problemáticos con alimentos como la leche cruda, quesos (especialmente las variedades poco curadas), helado, verduras crudas, carne cruda fermentada, embutidos, carne de ave cruda y cocinada, carnes crudas (de todos los tipos), y pescado crudo y ahumado. La capacidad de estos patógenos para crecer, en algunos casos, a temperaturas de tan solo 3 0C permite la multiplicación en alimentos refrigerados.
Además, aunque se desea proporcionar un período de validez más amplio a los alimentos, tales como el queso procesado, también ha habido un mayor deseo de proporcionar alimentos que contengan una mayor cantidad de ingredientes naturales. A este respecto, puede ser deseable proporcionar alimentos que incluyan solo ingredientes naturales o eliminar si no los materiales artificiales. Por ejemplo, a menudo, el queso procesado utiliza conservantes tales como ácido sórbico para mejorar la seguridad y el período de validez del alimento. Puede ser deseable incorporar conservantes y/o agentes antimicrobianos naturales mientras se mantienen y/o mejoran las características del queso procesado.
El documento WO2011/146916 describe un proceso para elaborar un queso cheddar que tiene una buena capacidad de fusión mediante el suministro de un ingrediente enriquecido con EPS con un ingrediente de leche de base.
Sumario
Se proporciona un método de producción de un queso procesado que tiene agentes antimicrobianos naturales. El método incluye fermentar un medio lácteo líquido con una cepa de Lactococcus lactis para producir un componente lácteo cultivado que incluye nisina y exopolisacárido. El componente lácteo cultivado se mezcla a continuación con un queso natural o mezcla de quesos naturales y uno o más emulsionantes para producir un queso procesado que tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 25 por ciento de proteína y de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento de grasa. El método es eficaz para producir queso procesado una cantidad de nisina, eficaz para evitar la formación de la toxina determinada por la toxina C. botulinum determinada por bioensayo
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En otros enfoques, la nisina y el exopolisacárido en el componente lácteo cultivado del método se obtienen a partir de la fermentación de la misma cepa de Lactococcus lactis en el medio lácteo líquido. La cepa Lactococcus lactis puede ser una cepa de Lactococcus lactis aislada que tiene todas las características identificativas de la cepa Lactococcus lactis de número ATCC PTA-120552. El componente lácteo cultivado utilizado en el método también puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 ppm de nisina y de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.000 ppm del exopolisacárido. El queso procesado puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en peso del componente lácteo cultivado.
El método puede incluir la fermentación de la cepa Lactococcus lactis número ATCC PTA-120552 realizada en un medio lácteo líquido 2 veces o 5 veces concentrado a una temperatura de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 °C y un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 durante de aproximadamente 15 a aproximadamente 48 horas. En algunos enfoques, el medio lácteo líquido concentrado es una leche concentrada que tiene un total de sólidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 36 por ciento, de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 por ciento, y de aproximadamente 0 a aproximadamente 16 por ciento de grasa.
En otros enfoques, el método es eficaz de modo que el queso procesado está exento de conservantes artificiales seleccionados del grupo que consiste en ácido sórbico, sorbato potásico, nitritos y mezclas de los mismos.
En algunos enfoques, el componente lácteo cultivado del método incluye nisina A y una cepa bacteriana que tiene al menos un gen de un clúster de genes productores de nisina con homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las Id. de sec. 9 a 19 y al menos un gen de un clúster de genes productores de exopolisacárido con homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las Id. de sec. 21 a 33.
En otros enfoques, el al menos un gen de un clúster de genes productores de nisina y el al menos un gen del clúster de genes productores de exopolisacárido en el método son de la misma cepa de Lactococcus lactis.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un diagrama de flujo de proceso que ilustra la producción de un componente lácteo cultivado ilustrativo producido a partir de un líquido lácteo concentrado;
la Fig. 1A es un diagrama de flujo de proceso alternativo;
la Fig. 2 es un diagrama de flujo de proceso que ilustra una segunda forma de producción de un componente lácteo cultivado ilustrativo producido a partir de ingredientes lácteos en polvo;
la Fig. 3 ilustra perfiles de sabor para el queso procesado con y sin componentes lácteos cultivados;
las Figs. 4A-D son fotografías que muestran comparaciones de diversos quesos procesados con y sin componentes lácteos cultivados;
las Figs. 5A-C son fotografías que muestran comparaciones de diversos quesos procesados con y sin componentes lácteos cultivados;
la Fig. 6 es un gráfico que muestra las mediciones de firmeza para el queso procesado con componentes lácteos cultivados al 8 por ciento en comparación con un control sin componentes lácteos cultivados;
la Fig. 7 es un gráfico que muestra las mediciones de consistencia para el queso procesado con componentes lácteos cultivados al 8 por ciento en comparación con un control sin componentes lácteos cultivados;
la Fig. 8 es un gráfico que muestra las mediciones de firmeza para queso procesado con componentes lácteos cultivados al 8 por ciento en comparación con un control sin componentes lácteos cultivados;
la Fig. 9 es un gráfico que muestra las mediciones de consistencia de queso procesado con 8 por ciento de componentes lácteos cultivados en comparación con un control sin componentes lácteos cultivados;
la Fig. 10 es un gráfico que muestra los resultados de un análisis de tipificación multilocus de secuencias (MLST) comparativo de cepas productoras de nisina;
la Fig. 11 es un gráfico que muestra los resultados de análisis de tipos de fagos de cepas productoras de nisina;
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la Fig. 12 incluye resultados del análisis de Riboprinter de diversas cepas de Lactococcus lactis;
la Fig. 13 es un diagrama que compara los genes relacionados con EPS de diversas bacterias de ácido láctico;
la Fig. 14 muestra la secuencia de aminoácidos de nisina A; y
la Fig. 15 (A) es una imagen de microscopía confocal de barrido que muestra la ausencia de EPS antes de la inoculación y fermentación con cepa 329 de L. lactis y la Fig. 15 (B) es una imagen de microscopía confocal de barrido que muestra la presencia de EPS tras la fermentación con cepa 329 de L. lactis.
Descripción detallada
La presente solicitud se refiere de modo general a métodos de producción de queso procesado que incluyen, entre otros aspectos, agentes antimicrobianos naturales y agentes modificadores de la textura naturales. En una forma, los agentes antimicrobianos naturales se incorporan en el queso procesado mediante componentes lácteos cultivados o componentes lácteos cultivados concentrados, que incluyen un agente antimicrobiano natural y/o un cultivo capaz de producir un agente antimicrobiano natural en condiciones de fermentación apropiadas. Como se utiliza en la presente memoria, los términos “componente lácteo cultivado” o “componente lácteo cultivado concentrado” se refieren, de modo general, a sustratos de leche cultivados o derivados de los mismos que han experimentado, en algunos enfoques, concentración y fermentación con cultivos productores de agentes antimicrobianos seleccionados en condiciones eficaces para producir agentes antimicrobianos, salvo que se identifiquen de forma específica como no incluyentes de agentes antimicrobianos cultivados. Como se utiliza en la presente memoria, “agente antimicrobiano natural” se refiere a un componente con actividad antimicrobiana que es producido por un organismo, tal como un cultivo bacteriano durante un proceso de fermentación.
El componente lácteo cultivado utilizado en el método de la presente invención incluye un sustrato lácteo fermentado con un cultivo productor de agente antimicrobiano que es una cepa de Lactococcus lactis. En algunos enfoques, el sustrato lácteo es un líquido lácteo, tal como leche o un líquido lácteo o sustrato lácteo concentrado, tal como un sustrato de leche concentrado de 2 a 5 veces. En un aspecto, el cultivo productor de agente antimicrobiano que es una cepa de Lactococcus lactis es un cultivo productor de nisina. En una forma particular, la nisina producida por el cultivo es nisina A. En un enfoque, los quesos procesados producidos mediante el método de la presente invención incluyen de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 ppm de nisina, en otros enfoques, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 ppm de nisina, en otros enfoques, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 ppm de nisina y, en otros enfoques, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 ppm de nisina.
El componente lácteo cultivado utilizado en el método de la presente invención también incluye exopolisacárido (EPS). En un aspecto, el EPS se produce durante la fermentación del sustrato de leche en las mismas condiciones y con el mismo medio que se utiliza para producir nisina. En otro aspecto, el EPS se produce mediante el cultivo productor de agente antimicrobiano que es una cepa de Lactococcus lactis y, en algunos enfoques, a partir de la misma cepa bacteriana que se utiliza para producir nisina. En este sentido, cuando el componente lácteo cultivado se utiliza en los métodos para producir quesos procesados en la presente invención, el queso procesado incluye nisina (tal como nisina A) y EPS obtenidos de la misma fermentación y, en algunos enfoques, la misma cepa bacteriana. Junto con la nisina descrita anteriormente, se espera que el componente lácteo cultivado incluya de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 por ciento de exopolisacárido, y el queso procesado final incluya, además de la nisina, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 ppm del exopolisacárido.
Se ha descubierto inesperadamente que un queso procesado producido mediante el método de la presente invención, incluido el componente lácteo cultivado de la presente invención que incluye tanto agentes antimicrobianos naturales (tales como nisina) como exopolisacárido a partir de la misma fermentación y/o la misma cepa bacteriana tiene propiedades antimicrobianas mejoradas, mejor capacidad en estado fundido, y una textura más firme en comparación con el queso procesado con la misma formulación salvo por los conservantes artificiales y/u otros tipos de agentes antimicrobianos naturales anteriores. Al mismo tiempo, el queso procesado producido mediante el método de la presente memoria que incluye el componente lácteo cultivado único también presenta una firmeza que recuerda a la del queso natural. No se esperaba que tanto las mayores propiedades de fusión como una mayor firmeza pudieran obtenerse al mismo tiempo en un queso procesado. Según un enfoque, los quesos procesados producidos mediante el método de la presente invención presentan una firmeza (módulo de Young) de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 2.500 Pa y, al mismo tiempo, presentan una consistencia de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 70.000 Pa/segundo. En otras propuestas, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención con los componentes lácteos cultivados también presenta un aumento en la fusión de aproximadamente 20 a aproximadamente 75 % sobre el mismo queso procesado pero sin el componente lácteo cultivado o con ácido sórbico u otro conservante artificial en lugar del componente lácteo cultivado. Como se utiliza en la presente memoria, queso natural se refiere a queso no pasteurizado elaborado cuajando leche u otro líquido lácteo utilizando alguna combinación de cuajo (o sustituto de cuajo) y acidificación. El queso natural utilizado en el queso procesado descrito en la presente memoria puede ser recién preparado o envejecido.
Como se describe más adelante, los agentes antimicrobianos anteriores solían ser menos eficaces en el contexto de un queso procesado con altos niveles de proteína y grasa debido a que se cree que los niveles de proteína y grasa combinados en el queso procesado, en algunos casos, con niveles inferiores de humedad tienden a
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proteger y/o a evitar la inhibición de diversos patógenos por parte de las formas comerciales de nisina y otros agentes antimicrobianos naturales. Inesperadamente, se descubrió que los agentes antimicrobianos naturales de los componentes lácteos cultivados en el método de la presente invención inhiben de forma eficaz C. botulinum y otros patógenos a un nivel no hallado en el caso de los agentes antimicrobianos naturales anteriores.
Anteriormente, se esperaba que cuando se mejoraba la capacidad de fusión del queso procesado, se obtendría una disminución de la firmeza. Es decir, anteriormente se esperaba que hubiera una relación inversa entre la fusión y la firmeza. Como se ha mencionado anteriormente, los quesos procesados producidos mediante el método de la presente invención, por otro lado, logran una mejora tanto en estado fundido como de textura/firmeza al mismo tiempo cuando se utilizan los componentes lácteos cultivados. Esta doble mejora en la fusión y la firmeza al mismo tiempo tendía a ser opuesta a estas tendencias en las aplicaciones de queso procesado anteriores.
Como se describe en la presente memoria, el término unidad de actividad (“AU”) puede usarse para describir la actividad biológica del agente antimicrobiano natural en el componente lácteo cultivado y el queso procesado en el que se incorpora el agente antimicrobiano. Debe entenderse que la actividad biológica puede expresarse también en unidades internacionales (“UI”), de manera que AU y UI se pueden usar indistintamente. En algunos enfoques, los componentes lácteos cultivados de la presente descripción y los quesos procesados preparados con los mismos pueden tener una actividad de nisina en el queso procesado de aproximadamente 40 a aproximadamente 400 UI/gramo y, en otros enfoques, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 UI/gramo.
En el queso procesado producido mediante el método de la presente invención se pueden incluir uno o más agentes antimicrobianos naturales diferentes. En una forma, el queso procesado producido mediante el método de la presente memoria contiene una cantidad suficiente de agente antimicrobiano natural de manera que el queso procesado no contiene o está exento de conservantes artificiales, tales como ácido sórbico, sorbato potásico y similares. Como se utiliza en la presente memoria, las frases “no contiene”, “está libre de” o
“prácticamente libre de” significan menos de aproximadamente 0,5 %, en otros enfoques, menos de
aproximadamente 0,1 % y, en algunos casos, menos de aproximadamente 0,05 % y, en otros casos, ninguno. En algunos enfoques, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención incluye una cantidad de agente antimicrobiano natural eficaz para evitar la formación de toxinas durante al menos
aproximadamente 9 días cuando el queso procesado se almacena a aproximadamente 30 0C (a
aproximadamente 86 0F). El queso procesado producido mediante el método de la presente invención también incluye componente lácteo cultivado en una cantidad eficaz para evitar un crecimiento superior a 1 log de crecimiento de Listeria monocytogenes durante al menos aproximadamente 4 semanas, en otro aspecto al menos aproximadamente 8 semanas, en otro aspecto al menos aproximadamente 12 semanas, en otro aspecto al menos aproximadamente 16 semanas, en otro aspecto al menos aproximadamente 20 semanas, en otro aspecto al menos aproximadamente 24 semanas y, en otro aspecto, al menos aproximadamente 28 semanas, durante un almacenamiento a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 0C.
El agente antimicrobiano natural se puede producir por fermentación mediante el uso de una cepa productora de agente antimicrobiano de bacterias de ácido láctico. Como se utiliza en la presente memoria, el término “bacterias de ácido láctico” se refiere, de modo general, a bacterias gram positivas que generan ácido láctico como metabolito principal de la fermentación de carbohidratos. La bacteria de ácido láctico es una cepa productora de agentes antibacterianos de Lactococcus lactis o, en propuestas alternativas que no se reivindican, Brevibacterium linens.
El agente antimicrobiano natural comprende nisina y, en algunos enfoques, nisina A. La nisina es un péptido policíclico inhibidor con 34 residuos de aminoácidos. Contiene los aminoácidos no comunes lantionina, metillantionina, deshidroalanina y ácido deshidroaminobutírico. Estos aminoácidos se sintetizan por medio de modificaciones posttraduccionales. En estas reacciones, un 57-mero sintetizado por ribosomas se convierte en el péptido final. Los aminoácidos insaturados se originan a partir de serina y treonina.
La nisina se puede obtener mediante el cultivo de bacterias productoras de nisina en sustratos naturales, incluida la leche. La nisina se ha incluido en productos alimenticios para prolongar la vida útil segura mediante la supresión de las bacterias de descomposición y patógenas gram positivas. Debido a su actividad altamente selectiva, también se puede emplear como agente selectivo en medios microbiológicos para el aislamiento de bacterias gram negativas, levaduras y hongos. Dos agentes antimicrobianos comercialmente disponibles que contienen nisina Nisaplin® y Novasin™ (ambos de Daniso A/S Dinamarca). De forma típica, la nisaplina contiene menos de aproximadamente 3,0 % en peso de nisina, consistiendo el resto en NaCl, proteínas, carbohidratos y humedad. Cuando se hace referencia a un componente de nisina en la presente memoria, el componente puede incluir no solo nisina, sino también otros ingredientes, tales como vehículos, sales, proteína, carbohidratos, y metabolitos que resultan del proceso de fermentación. Como se muestra en los ejemplos y se indica más adelante, las fuentes comercialmente disponibles de nisina no proporcionan el mismo nivel de supresión de bacterias de descomposición y patógenas en el contexto de queso procesado que los componentes lácteos cultivados de la presente descripción.
En un aspecto, los componentes lácteos cultivados elaborados mediante los métodos descritos en la presente memoria incluyen nisina A y/o el cultivo productor de nisina incluye un cultivo productor de nisina A. La nisina A tiene un peso molecular de aproximadamente 3.351,5 Da y la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.° 1. Sin
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embargo, se debe entender que se pueden también utilizar otros agentes antimicrobianos naturales. Por ejemplo, pueden incluirse otras formas de nisina, incluidas nisina Z, nisina Q, nisina F, y nisina F. También se pueden incluir otras bacteriocinas, tales como las bacteriocinas de Clase I, las bacteriocinas de Clase II, las bacteriocinas de Clase III y las bacteriocinas de Clase IV. También se pueden incluir otros agentes antimicrobianos naturales, incluidos agentes antifúngicos de origen natural tales como, por ejemplo, natamicina (producida por Streptomyces natalensis) y polilisina (producida por determinadas especies de Streptomyces).
Además, en el método de la presente invención se utiliza una cepa de Lactococcus lactis que produce agentes antimicrobianos naturales. Las cepas bacterianas son cepas productoras de agentes antibacterianos de bacterias de ácido láctico, tales como, por ejemplo, cepas productoras de nisina de Lactoccocus lactis, o, en una realización no reivindicada, Brevibacterium linens.
El componente lácteo cultivado comprende un componente de nisina y/o incluye un cultivo capaz de producir un componente de nisina en el intervalo de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 ppm en peso del medio de fermentación.
El agente antimicrobiano natural se puede proporcionar cultivando las bacterias productoras de agentes antimicrobianos en condiciones de fermentación adecuadas en un sustrato lácteo. El sustrato lácteo puede incluir, por ejemplo, leche, nata, lactosuero u otro polvo o líquido que contiene materia láctea. El sustrato lácteo puede también comprender dextrosa, jarabe de maíz u otros carbohidratos suplementados con otros nutrientes para el crecimiento bacteriano, con o sin un neutralizante ácido tal como carbonato cálcico.
En algunas formas, la leche puede estar en forma de leche cruda o un producto de leche concentrado, tal como un producto de leche concentrado al menos aproximadamente 2 veces, en otro aspecto un producto de leche concentrado hasta aproximadamente 5 veces. De forma típica, la base de leche contendrá más de aproximadamente 3 por ciento de lactosa y una fuente de nitrógeno. La base puede producirse a partir de polvos hidratados o derivados de líquidos lácteos frescos, tales como leche desnatada, leche al dos por ciento, leche entera y similares. En un enfoque, el sustrato lácteo inicial incluye leche concentrada que tiene un contenido de sólidos total de aproximadamente 5 a aproximadamente 36, un contenido de proteína de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 por ciento, un contenido de grasa de aproximadamente 0 a aproximadamente 16 por ciento, y un contenido de humedad de aproximadamente 64 a aproximadamente 95 por ciento.
Cuando el componente lácteo cultivado se utiliza en la producción de queso procesado, se ha descubierto que es deseable mantener un bajo nivel de humedad en el sustrato lácteo para reducir los costes incrementados asociados con la eliminación de humedad del componente lácteo cultivado antes de su inclusión en el producto de queso procesado. Además, determinados componentes del componente lácteo cultivado pueden ser inestables y pueden degradarse o dañarse de otro modo durante un proceso de eliminación de humedad. Por ejemplo, se cree que el componente EPS del componente lácteo cultivado es relativamente inestable y puede ser dañado por técnicas de eliminación de humedad, tales como deshidratación por pulverización, evaporación, y similares. Sin embargo, el componente lácteo cultivado que incluye agentes antimicrobianos cultivados puede adoptar una variedad de formas tales como líquido y/o polvo, si se desea para una aplicación particular.
La nisina A y el cultivo que produce exopolisacáridos utilizados en la presente invención es la cepa 329 de Lactococcus lactis ss. lactis. El 21 de agosto de 2013, la cepa 329 se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, vA 20110 con el número de registro dado PTA-120552. El depósito se realizó bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para fines de procedimientos de patentes.
Se ha descubierto que la cepa 329 de Lactococcus lactis tiene un perfil genético y fagocítico único en comparación con otras cepas productoras de nisina de bacterias de ácido láctico. Ventajosamente, también se encontró que la cepa 329 es capaz de crecer en sustratos lácteos concentrados, incluida la leche de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces concentrada. Se ha descubierto que pocos cultivos son capaces de crecer en sustratos de leche tan altamente concentrados. Por ejemplo, los cultivos de la presente invención son eficaces para crecer hasta al menos aproximadamente 109 CFU/gramos en aproximadamente 10 gramos y producir más de aproximadamente 2000 IU de nisina A/gramo en aproximadamente 18 horas, incluso en el medio de fermentación concentrado de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces. La cepa 329 se caracterizó utilizando la tipificación multilocus de secuencias (MLST), tipificación de fagos y ribotipificación como se describe más abajo.
Tipificación multilocus de secuencias (MLST)
El genoma públicamente disponible de L. lactis subsp. lactis IL 1403 (taxid:272623), también una cepa productora de nisina, se utilizó como plantilla para la selección de siete genes de mantenimiento para su uso como huellas genéticas en una comparación de IL 1403 con la cepa 329. Los genes seleccionados cubren un intervalo de loci en el cromosoma como se detalla a continuación en la Tabla 1. Se ampliaron y secuenciaron cada uno de los
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siete genes. A continuación se alinearon y compararon las secuencias utilizando IL1403 como referencia. Cada variación de secuencia se contó y representa un alelo individual.
Tabla 1
Gen
Proteína Ubicación del cromosoma
acmD (Id. de sec. n.° 2)
n-acetilmuramidasa 527.413—528.498
gapB (Id. de sec. n.° 3)
Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa 2.332.466—2.333.476
pdhD (Id. de sec. n.° 4)
Componente de lipoil deshidrogenasa de piruvato deshidrogenasa 58.971—60.389
pepC (Id. de sec. n.° 5)
Aminopeptidasa C 1.947.325—1.948.635
thiE (Id. de sec. n.° 6)
Tiamina fosfato pirofosforilasa 1.293.610—1.294.257
yjjD (Id. de sec. n. ° 7)
Proteína permeasa del sistema transportador ABC 993.341—994.963
yyaL (Id. de sec. n. ° 8)
Proteína de unión a GTP 11.119—12.234
Fagotipificación
Se utilizaron placas de ensayos para obtener un perfil de fagos de mezclas madre de fagos de alto título. Los fagos se identifican y los resultados de la fagotipificación se presentan en la Fig. 11.
Ribotipificación
Como se utiliza en la presente memoria, “ribotipificación” se refiere a la huella dactilar de fragmentos de restricción de ADN genómico que contienen la totalidad o parte de los genes que codifican para el ARNr 16S y 23S. Se realizaron técnicas de ribotipificación convencionales utilizando EcoRI como enzima de restricción. Los resultados se muestran en la Fig. 12. La ribotipificación confirmó que la cepa 329 de Lactococcus lactis es sustancialmente diferente de la cepa de Lactococcus lactis ATCC 11454 públicamente disponible, también una cepa productora de nisina.
Análisis de secuencia de ADN
Se descubrió que la cepa 329 de Lactococcus lactis tiene una combinación única de genes de agrupaciones de exopolisacárido y nisina como se muestra en la Fig. 13. La cepa 329 de Lactococcus lactis incluye la secuencia de genes de clúster de nisina de la Tabla 2 mostrada a continuación y produce nisina A que tiene la secuencia de aminoácidos de la Fig. 14 (Id. de sec. n.° 1).
Tabla 2
GEN
Id. de sec. Número
Precursor de nisina A
Id. de sec. n.° 9
Proteína transportadora de nisina (nisG)
Id. de sec. n.° 10
Proteína transportadora de nisina (nisE)
Id. de sec. n.° 11
Proteína transportadora de nisina (nisF)
Id. de sec. n.° 12
Sistema de dos componentes de nisina, regulador de respuesta (nisR)
Id. de sec. n.° 13
Histidina quinasa receptora de sensor de nisina (nisK)
Id. de sec. n.° 14
Proteasa serina de procesamiento de péptido líder de nisina (nisP)
Id. de sec. n.° 15
Proteína de inmunidad de nisina
Id. de sec. n.° 16
Proteínas de biosíntesis de nisina (nisC)
Id. de sec. n.° 17
Proteína de unión a ATP de transporte de nisina (nisT)
Id. de sec. n.° 18
Proteína de biosíntesis de nisina (nisB)
Id. de sec. n.° 19
Se ha descubierto que, al menos en las condiciones de fermentación descritas en la presente memoria con referencia al método de la Fig. 1, la cepa 329 de Lactococcus lactis produce un nivel alto de nisina A 34-mérica en comparación con el péptido precursor de nisina A 57-mérica (el precursor de nisina A tiene la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.° 20). La nisina A se produce por modificación posttraduccional del precursor de nisina A. Al menos en algunos enfoques, la cepa 329 de Lactococcus lactis produce nisina A en relación con el precursor de nisina A, en una relación de al menos aproximadamente 9:1, en otro aspecto de al menos aproximadamente 9,5:0,5. En cambio, Nisaplin® de Danisco incluye aproximadamente 83 por ciento de nisina A y 17 por ciento de precursor de nisina A.
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Bajo las mismas condiciones de fermentación eficaces para producir nisina A descritas anteriormente, la cepa 329 de Lactococcus lactis también produce exopolisacárido, tal como, por ejemplo, en las condiciones de fermentación descritas en la presente descripción con referencia al método de la Fig. 1. La cepa 329 de Lactococcus lactis incluye los genes de clúster de EPS de la Tabla 3 siguiente:
Tabla 3
GEN
Número de Id. de sec.
Regulador transcripcional, familia XRE
Id. de sec. n.° 21
Esterasa (EpsX)
Id. de sec. n.° 22
Modulador transmembrana de tirosina- proteína quinasa (EPSC)
Id. de sec. n.° 23
Quinasa de proteína tirosina
Id. de sec. n.° 24
Undecaprenil fosfato galactosa fosfotransferasa
Id. de sec. n.° 25
Fosfatasa de proteína-tirosina dependiente de manganeso
Id. de sec. n.° 26
Proteína de biosíntesis de polisacárido (cpsF) / glicosil transferasa (cpsG)
Id. de sec. n.° 27
Glicosil transferasa (cpsg) / proteína de biosíntesis de polisacárido (cpsM(v))
Id. de sec. n.° 28
Proteína de familia 2 de glicosiltransferasa
Id. de sec. n.° 29
Azúcar transferasa, (epsL)
Id. de sec. n.° 30
Proteína de función desconocida, familia desconocida
Id. de sec. n.° 31
Proteína de función desconocida, familia desconocida / beta-1,3- glucosiltransferasa
Id. de sec. n.° 32
Proteína de biosíntesis de polisacárido (cpsM(v))
Id. de sec. n.° 33
Al menos en algunos enfoques, una cepa bacteriana productora de agente antimicrobiano útil en los métodos descritos en la presente memoria es capaz de producir tanto nisina A de aproximadamente 2.000 IU/gramo o más como exopolisacárido en las condiciones de fermentación descritas con referencia a la Fig. 1.
La información de secuencia proporcionada en la presente memoria no debe interpretarse de modo tan restrictivo como para requerir la inclusión de nucleótidos erróneamente identificados. Las secuencias descritas en la presente memoria pueden ser utilizadas por el experto en la técnica para aislar el gen completo de la cepa bacteriana y someter el gen a un análisis de secuencia adicional para identificar cualquier error de secuenciación.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos “homología” e “identidad” se usan indistintamente. Con el propósito de determinar el porcentaje de identidad u homología de dos secuencias, las secuencias pueden alinearse para fines de comparación óptimos. A continuación, los nucleótidos o aminoácidos se comparan en las posiciones de nucleótido o aminoácido correspondientes de las dos secuencias. Por ejemplo, un nucleótido o aminoácido en una primera secuencia se considera idéntico a la de la segunda secuencia cuando el mismo nucleótido o aminoácido está ubicado en la posición correspondiente en la segunda secuencia. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas dividido por el número total de posiciones (es decir, posiciones de superposición) multiplicado por 100.
También se contemplan en la presente memoria los equivalentes funcionales de ácido nucleico. Por ejemplo, los equivalentes funcionales de ácido nucleico incluyen mutaciones silenciosas u otras mutaciones que no alteran la función biológica del polipéptido codificado.
En una forma, una cepa bacteriana productora de agente antimicrobiano útil en los métodos descritos en la presente memoria tiene uno o más genes de homología significativa con las Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33 y es capaz de producir nisina A y EPS en las mismas condiciones de fermentación. Como se define en la presente memoria, el término “homología significativa” significa al menos 70 por ciento, en otro aspecto al menos 75 por ciento, en otro aspecto al menos 80 por ciento, en otro aspecto al menos 85 por ciento de identidad, en otro aspecto al menos 90 por ciento de identidad, en otro aspecto al menos 95 por ciento de identidad, aún en otro aspecto al menos 99 por ciento de identidad, y aún en otro aspecto identidad completa.
En algunas propuestas, una cepa bacteriana productora de agente antimicrobiano útil en los métodos descritos en la presente memoria tiene al menos dos genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que
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consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos tres genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos cuatro genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos cinco genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21 - 33, en otro aspecto tiene al menos seis genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos siete genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos ocho genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos nueve genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos diez genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos once genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos doce genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos trece genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos catorce genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos quince genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos dieciséis genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos diecisiete genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n. ° 9-19 y 21 -33, en otro aspecto tiene al menos dieciocho genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos diecinueve genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 919 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos veinte genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos veintiuno de los genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos veintidós genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, en otro aspecto tiene al menos veintitrés genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21-33, y en otro aspecto tiene al menos veinticuatro genes de homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Id. de sec. n.° 9-19 y 21 -33.
Volviendo a más de los detalles relacionados con los métodos de producción de un concentrado lácteo cultivado y un queso procesado eficaces y haciendo referencia primero a la Fig. 1, se proporciona un diagrama 10 de flujo de proceso que ilustra un método de producción de un material lácteo cultivado o concentrado 12 lácteo cultivado eficaz para producir tanto agentes antimicrobianos (tales como nisina A) como EPS a partir del mismo cultivo y en las mismas condiciones; cuyo producto es eficaz para usar con queso procesado. En este proceso ilustrativo 10, se puede utilizar una materia 14 prima láctea líquida, tal como un líquido lácteo como leche entera. En otros enfoques, el líquido lácteo inicial puede ser concentrado de proteína láctea y/o materiales de lactosuero. La materia prima 14 puede tener de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 % de sólidos totales, de aproximadamente 0 a aproximadamente 16 por ciento de grasa, de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 por ciento de proteína, y de aproximadamente 64 a aproximadamente 95 por ciento de humedad. En otra forma, la materia prima 14 es una leche entera concentrada 3,5 veces que tiene de aproximadamente 26 a aproximadamente 30 por ciento de sólidos totales, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 por ciento de grasa, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 por ciento de proteína, y de aproximadamente 70 a aproximadamente 70 por ciento de humedad.
En otro enfoque, la materia prima 14 es un líquido lácteo concentrado obtenido a partir de la ultrafiltración de leche láctea líquida. La materia prima concentrada puede concentrarse a una concentración de 2 a 5 veces, determinado por los sólidos totales; en otros enfoques, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 4 veces, y en otros enfoques, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 3,5 veces de líquido lácteo. Es decir, una concentración triple (3 veces) tiene 3 veces el nivel de sólidos totales con respecto a un líquido lácteo inicial y una concentración quíntuple (5 veces) tiene aproximadamente 5 veces el nivel de sólidos totales con respecto al líquido lácteo inicial. En un enfoque, se puede usar una membrana de ultrafiltración para lograr una materia prima concentrada apropiada. Una membrana adecuada tiene un corte de peso molecular de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 Kd. También pueden utilizarse otros métodos de concentración, incluida microfiltración, nanofiltración y ósmosis inversa según sea necesario para una aplicación particular.
Como se discute con más detalle a continuación, la fermentación en leches concentradas, tales como la leche de 2 veces a 5 veces concentrada de la presente memoria, presenta de forma típica problemas con los cultivos y fermentaciones antimicrobianas anteriores. La cepa 329 utilizada dentro de los productos y métodos de la presente descripción permite únicamente la fermentación en un líquido lácteo concentrado y, al mismo tiempo, permite la formación tanto de nisina como de EPS a partir de la misma cepa y en las mismas condiciones de fermentación. Utilizando las leches concentradas para la fermentación y la producción final de los ingredientes de queso procesado de la presente invención, se controla mejor el contenido de agua en el queso procesado resultante. Los componentes lácteos concentrados de la presente descripción combinan múltiples funcionalidades y componentes (es decir, tales como la nisina y el EPS) en el mismo ingrediente. En algunos enfoques, esto reduce la carga total de humedad en el proceso de fabricación de queso procesado y, en algunos casos, simplifica, además, la línea de ingredientes de queso procesado.
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La materia prima 14, que es un componente lácteo líquido o líquido concentrado, se pasteuriza entonces 16 y entra a continuación en uno o más fermentadores 18. La pasteurización puede ser de aproximadamente 65,6 a aproximadamente 87,8 °C (de aproximadamente 150 a aproximadamente 190 0F) durante un tiempo de aproximadamente 20 a 40 segundos dando lugar a una temperatura de salida de la materia prima pasteurizada de aproximadamente 26,7 a aproximadamente 32,2 °C (de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 0F). Un cultivo 20 productor de agente antimicrobiano, tal como cepas 329 de Lactoccocus lactis, se añade al fermentador 18 junto con una solución base 22 tal como hidróxido de sodio (p. ej., un hidróxido de sodio diluido 5,5 N). En una forma, se añaden al fermentador de aproximadamente 2x106 a aproximadamente 2x108 CFU/ml del cultivo 20 productor de agente antimicrobiano. En una realización, el cultivo 20 es una forma descongelada del cultivo. En un enfoque, la temperatura de fermentación se mantiene a un valor de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 °C (en algunos enfoques de aproximadamente 28 a aproximadamente 32 °C y, en otros enfoques, de aproximadamente 30 0C) y un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 (en otros enfoques, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 5,8 y, en otros enfoques, de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 5,6) en el fermentador. También se pueden usar otras temperaturas y valores de pH si el cultivo es capaz de producir nisina y EPS a niveles deseados en las condiciones seleccionadas. Por ejemplo, en un enfoque, el pH está comprendido de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 y la temperatura está comprendida de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 0C. La composición se puede fermentar en una variedad de diferentes períodos de tiempo para transmitir diferentes características de sabor a la composición. Por ejemplo, en un enfoque, la composición se fermenta de aproximadamente 18 a aproximadamente 22 horas. En otra forma, la fermentación puede tener lugar en un intervalo de aproximadamente 15 a aproximadamente 48 horas. Como se muestra en la Fig. 5, variando el tiempo de fermentación, puede modificarse el sabor del componente diario cultivado y, en consecuencia, el sabor del queso procesado.
La composición se envía a continuación a un dispositivo 24 de cizalladura opcional para someter a cizalladura cuajos pequeños/blandos que pueden haberse formado. En una realización, el dispositivo de cizalladura puede ser un mezclador de rotor/estátor (tal como un dispositivo Dispax) u otro dispositivo de cizalladura de rotor. Este paso puede ser opcional en función de las otras condiciones de procesamiento, así como las propiedades de los materiales utilizados en el proceso. La composición se somete a continuación finalmente a una etapa 26 de tratamiento térmico opcional. En una forma, la composición se somete a tratamiento térmico 26 a una temperatura de aproximadamente 65,6 0C a aproximadamente 71,1 0C (de aproximadamente 150 0F a aproximadamente 160 0F) durante de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 segundos. En otra forma, la composición se somete a tratamiento térmico para reducir el valor de CFU/ml a menos de aproximadamente 1.000 CFU/ml. La composición resultante 12 es un componente lácteo cultivado o un concentrado lácteo cultivado que incluye nisina y/o material productor de nisina y, al mismo tiempo, EPS y/o un material productor de EPS. Al menos en algunos enfoques, estos dos componentes se producen ventajosamente a partir de la misma cepa bacteriana de partida, tal como la cepa 329, y bajo las mismas condiciones de fermentación. La composición puede estar en forma de un líquido que tiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 40 % de sólidos totales. En una forma, el líquido tiene de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 % de sólidos totales y, en algunos enfoques, aproximadamente 28,5 % de sólidos totales.
En un método alternativo 200 mostrado en la Fig. 1A, los polvos hidratados y/o la leche líquida 202 pueden ser primero calentados 204, tal como en una etapa de proceso de esterilización a alta temperatura, de corto tiempo (HTST) o a una temperatura ultra alta (UHT). A continuación, se fermenta 206 el líquido calentado con materiales, cultivos y condiciones similares, como se describe con respecto al método discutido anteriormente. Después de la fermentación, el material se puede someter de forma opcional a cizalladura 208 y a continuación concentrar 210. En este enfoque, la concentración puede ser filtración por membrana, evaporación o centrifugación. Después de la concentración, el concentrado resultante puede calentarse opcionalmente 212 nuevamente con el uso de HTST o UHT, por ejemplo.
En la Fig. 2 se ilustra otro proceso 100 para preparar componentes lácteos cultivados. El proceso 100 de la Fig. 2 utiliza materias primas 112 en polvo tales como concentrado de proteína de leche en polvo y lactosuero en polvo. En este enfoque, se mezclan de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 por ciento de concentrado de proteína de leche en polvo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 por ciento de lactosuero en polvo y de aproximadamente 75 a aproximadamente 95 por ciento de agua en un tanque o un fermentador 118 para formar el medio de fermentación. Los polvos pueden mezclarse 114 e hidratarse antes de añadirlos al fermentador 118. Estos materiales de partida se combinan a continuación con un cultivo productor de agente antimicrobiano 120, tal como la cepa 329 de Lactococcus lactis, en una cantidad de aproximadamente 2x106 CFU/ mL a aproximadamente 2x108 CFU/mL en el recipiente de fermentación 118 y se fermentan de un modo similar al descrito para la Fig. 1. De forma similar al método de la Fig. 1, también se puede añadir al recipiente de fermentación 118 agua de proceso y una base, tal como hidróxido de sodio diluido, desde el tanque 123. Después de la fermentación, la composición puede calentarse o enfriarse, opcionalmente, según sea necesario y, a continuación, prepararse como un componente 112 lácteo cultivado final. En algunos enfoques, el proceso puede incluir un calentamiento y enfriamiento 132 intermedio variado según sea necesario para una aplicación particular. A este respecto, la composición 112 puede colocarse en uno o más tanques de retención 130 u otra ubicación de almacenamiento para usar en forma líquida concentrada. Las temperaturas de mantenimiento del tanque pueden ser de aproximadamente -1,1 a aproximadamente 10 0C (de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 0F). En una realización (tal como en una forma líquida), el componente lácteo cultivado tiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 11 % de sólidos totales y, en otra forma, aproximadamente 20 % de sólidos totales. Además, el componente lácteo cultivado se puede secar por pulverización, tal como en un atomizador 140. En un enfoque, el atomizador puede tener una temperatura de secador de
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aproximadamente 71,1 a aproximadamente 82,2 °C (de aproximadamente 160 a aproximadamente 180 0F) y una caída de presión de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,17 MPa (de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 psi).
El componente lácteo cultivado utilizado en el método de la presente memoria puede adoptar diversas formas. Por ejemplo, como se muestra en las Figs. 1 y 2, el componente lácteo cultivado puede estar en forma de líquido. El componente lácteo cultivado también puede adoptar la forma de un polvo, tal como un producto deshidratación por pulverización como se muestra en la Fig. 2. Además, el componente lácteo cultivado también puede estar en forma concentrada, tal como componentes obtenidos por evaporación, filtración y similares. El producto resultante del método de las Figs. 1 o 2 puede ser un líquido o un producto secado por pulverización dependiendo de la aplicación particular. La Fig. 2 proporciona etapas ilustrativas para la deshidratación por pulverización y se apreciará que estas etapas también se pueden utilizar con los métodos de la Fig. 1. Se apreciará que si el componente lácteo cultivado se procesa adicionalmente por concentración, deshidratación por pulverización o de modo similar, este procesamiento adicional se completará de modo que no afecte de forma sustancial a la nisina ni/o al EPS.
El componente lácteo cultivado producido mediante los métodos de las Figs. 1 y 2 tanto con agentes antimicrobianos como con EPS producido a partir de la misma cepa bacteriana se puede usar a continuación en y/o para fabricar queso procesado. En una realización, el queso procesado puede prepararse mezclando queso natural o mezcla de quesos naturales, humedad, y una fuente de proteína láctea adicional opcional (tal como concentrado de proteína de leche, lactosuero, concentrado de proteína de lactosuero, leche ultrafiltrada, y similares) y el componente lácteo cultivado. El cloruro de sodio puede añadirse para añadir sabor. Pueden añadirse otros ingredientes opcionales para mejorar la textura, el sabor, la nutrición y/o propiedades de coste. Estos incluyen, aunque no de forma limitativa, ingredientes derivados de lactosuero (p. ej., concentrado de proteína de lactosuero), leche deshidratada desnatada, concentrado de proteína de leche, grasa de leche anhidra, gomas, almidones, gelatina y similares. Los ingredientes se mezclan entre sí y a continuación se calientan a temperaturas de pasteurización. Opcionalmente, se puede aplicar cizalladura durante o después del calentamiento.
Proteína de lactosuero se refiere a una colección de proteínas globulares que se pueden aislar del lactosuero, que es el líquido que queda después de haberse cuajado y filtrado la leche. La proteína de lactosuero es de forma típica una mezcla de beta-lactoglobulina, alfa-lactoalbúmina, y proteínas de albúmina sérica. En una realización, se puede utilizar concentrado de proteína de lactosuero (WPC) como fuente de proteína de lactosuero. El WPC se obtiene de lactosuero por medio de técnicas de concentración convencionales. La fuente de proteína de lactosuero también puede incluir lactosa, vitaminas, minerales y grasa.
La humedad se puede añadir a la mezcla mediante cualquier método, tal como, aunque no de forma limitativa, inyectando vapor en la caldera (p. ej., una caldera de depósito), añadiendo a la mezcla vapor condensado de la cocción y/o por adición directa de agua. La humedad también puede entrar en el sistema por supuesto a través de diversos ingredientes (p. ej., humedad del queso natural). La humedad total de los productos de queso final incluye toda la humedad independientemente de la forma en que la humedad se haya introducido en el producto final. De forma ventajosa, debido a que los componentes lácteos cultivados utilizados en el método de la presente descripción, en algunas formas, son componentes lácteos concentrados que incluyen tanto nisina como EPS al mismo tiempo, se mejora el manejo del agua del queso procesado. A este fin, debido a que no es necesario añadir por separado la nisina y otros ingredientes modificadores de la textura, se tiende a añadir menos agua al queso procesado mediante el ingrediente del componente lácteo cultivado.
Como es conocido por el experto en la técnica, los ingredientes pueden usarse en cantidades variables en el queso procesado producido mediante el método de la presente invención en función del resultado deseado del producto de queso. Por ejemplo, para un producto de queso sódico reducido, un maestro quesero puede incluir una cantidad de sal pequeña o no introducir sal en la mezcla de queso. El queso procesado producido mediante el método de la presente invención puede también incluir un intervalo de cantidades de los componentes lácteos cultivados, dependiendo de la forma y composición de los componentes lácteos cultivados y la forma deseada del queso procesado.
Por ejemplo, y en una forma, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención puede incluir de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 % de queso natural. Según otra forma, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención puede incluir de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 % de queso natural. En otra forma más, los quesos procesados producidos mediante el método de la presente invención pueden incluir de aproximadamente 35 a aproximadamente 55 % de queso natural. Como se utiliza en la presente memoria, queso natural significa, generalmente, queso proporcionado a partir de queso no pasteurizado obtenido de leche cuajada y uno de los siguientes: cuajo, sustitutos de cuajo, acidificación y combinaciones de los mismos.
El queso procesado producido mediante el método de la presente invención puede incluir también un número de otros ingredientes lácteos procedentes de diversas fuentes según sea necesario para una aplicación particular. Por ejemplo, y en una forma, el queso procesado producido mediante el método de la presente memoria puede incluir concentrado de proteína de leche de aproximadamente 0 a aproximadamente 50 % (en otros enfoques, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 %), concentrado de proteína de lactosuero de aproximadamente 0 a aproximadamente 25 % (en otros enfoques, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 %), lactosuero de aproximadamente 0 a aproximadamente 30 % (en otros enfoques, de aproximadamente 1 a aproximadamente
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10 %), grasa de leche/nata de aproximadamente 0 a aproximadamente 30 % (en otros enfoques, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 %) y similares. El queso procesado producido mediante el método de la presente invención también incluye emulsionantes, tales como citrato sódico, fosfato disódico y similares en una cantidad de aproximadamente 0 % a aproximadamente 5 % (en otros enfoques, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 %). El queso procesado producido mediante el método de la presente invención también puede incluir sal, saborizantes, enriquecimientos, colorantes y similares para proporcionar el color, el sabor, etc. deseados. El queso procesado producido mediante el método de la presente invención también puede incluir agua y/o humedad añadidos de los ingredientes para proporcionar la humedad del producto acabado deseada. Por ejemplo, también pueden añadirse vitaminas y otros minerales según sea necesario para enriquecer el queso procesado, según un enfoque, de aproximadamente 0 a aproximadamente 3 por ciento de vitamina A, vitamina D y/o polvos de calcio (tales como fosfato tricálcico). En otras aplicaciones, también puede añadirse sal según sea necesario. En algunos enfoques, se pueden añadir de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento de sal.
Además, en lugar de conservantes tradicionales, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención incluye el componente lácteo cultivado de la presente descripción y fabricado mediante los métodos descritos en la presente memoria. En una forma, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 % de componente lácteo cultivado. En otra forma, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención incluye de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 % de componente lácteo cultivado. En algunos enfoques, los componentes lácteos cultivados de la presente descripción proporcionan una actividad antimicrobiana total mucho más elevada como equivalente de nisina con respecto al contenido de nisina (relación de actividad de nisina). Por ejemplo, y en algunos enfoques, los componentes lácteos cultivados y el queso procesado utilizando las cantidades de componentes lácteos cultivados descritos en la presente memoria presentan una relación de actividad de nisina de aproximadamente 0,3 o inferior.
Debe mencionarse que los componentes lácteos cultivados utilizados en el método de la presente invención pueden utilizarse en sustitución de conservantes artificiales y/o pueden usarse, además, para complementar o reemplazar parcialmente otros componentes de la composición de queso procesado total. Por ejemplo, dependiendo de la forma del componente lácteo cultivado, la cantidad del componente lácteo cultivado se puede utilizar para complementar o sustituir de otro modo una parte de los demás materiales lácteos de la composición, tales como la grasa de la leche, la caseína, el lactosuero y similares. En otras palabras, la relación de los otros materiales lácteos se puede modificar como resultado del uso de los componentes lácteos cultivados. Cuando los quesos procesados producidos por el método de la presente invención incluyen los componentes lácteos cultivados de la presente invención, el queso puede estar sustancialmente exento de conservantes tradicionales, tales como ácido sórbico, nitritos y similares. Según un enfoque, sustancialmente exento de generalmente significa menos de aproximadamente 0,5 por ciento, en otros enfoques, menos de aproximadamente 0,1 por ciento y, en otros enfoques, no presente(s) en absoluto.
En una forma, el queso procesado producido mediante el método de la presente invención incluye aproximadamente 40 % de queso natural, 35 % de otros materiales lácteos, aproximadamente 8 % de componentes lácteos cultivados, aproximadamente 12 % de agua y las sales, saborizante, colorantes, vitaminas, minerales y similares restantes. El queso procesado producido mediante el método de la presente invención puede fabricarse como se entiende generalmente con la adición de los componentes lácteos cultivados durante la cocción y, de forma alternativa, durante las etapas de mezclado del queso. En una forma, el producto de queso producido mediante el método descrito en la presente memoria puede ser cualquier salsa de queso, queso para untar, bloque de queso, una loncha de queso, queso rallado, o similares. En algunos enfoques, las diversas formas de queso procesado producido mediante el método de la presente descripción pueden incluir de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 % de queso natural, de aproximadamente 0 a aproximadamente 50 % de concentrado de proteína de leche, de aproximadamente 0 a aproximadamente 30 % de grasa de leche o nata, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 % de agua, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 % de componente lácteo cultivado, de aproximadamente 0 a aproximadamente 30 % de lactosuero, y de aproximadamente 0 a aproximadamente 25 % de concentrado de proteína de lactosuero en combinación con diversos sabores, sales y emulsionantes opcionales arriba descritos.
En otra forma, el queso procesado incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 % de grasa total (en otros enfoques, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 % de grasa), de aproximadamente 8 a aproximadamente 25 % de proteína total (en otros enfoques, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 % de humedad total), y de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 % de humedad total (en otros enfoques, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 % de humedad).
El queso procesado elaborado con los componentes lácteos deshidratados utilizados en el método de la presente descripción no solo presenta ventajas inesperadas de textura porque logra un perfil de fusión mejorado y mayor firmeza sino que, al mismo tiempo, el queso procesado elaborado con los componentes lácteos cultivados utilizados en el método de la presente descripción presenta, además, características antimicrobianas mejoradas en el contexto de un producto de alto contenido en grasa y en proteína, tal como un queso procesado con una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 % de grasa y de aproximadamente 8 a aproximadamente 25 % de proteína. Aunque se entendía que formas comerciales de nisina anteriores inhibían C. botulinum en un medio líquido o caldo, cuando dichas formas anteriores de nisina se utilizaron en sistemas alimentarios de alto contenido en proteína y alto contenido en grasa, tales como queso procesado, la nisina era
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menos eficaz en términos de inhibición del C. botulinum y otros patógenos. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que el alto nivel de proteína, alto nivel de grasa y, en algunos casos, el bajo nivel de humedad de los quesos procesados descritos en la presente memoria, tienden a proteger y/o encapsular C. botulinum y otros patógenos que hacen que la nisina tradicional y los agentes antimicrobianos naturales tradicionales sean menos eficaces. Se ha descubierto de forma inesperada que la nisina obtenida de cultivos antimicrobianos de la presente memoria y, en particular, la cepa 329, son eficaces para inhibir C. botulinum y otros patógenos transmitidos por los alimentos, como la Listeria monocytogenes, en el contexto del queso procesado de alto contenido en grasa y alto contenido en proteína mucho mejor que otras formas de nisina como se muestra de forma general a continuación en el ejemplo 1. En algunos enfoques, el componente lácteo cultivado en el queso procesado obtenido mediante el método de la presente invención proporciona una cantidad de nisina eficaz para evitar la formación de la toxina de al menos C. botulinum según lo determinado por el bioensayo de toxinas convencional con ratones en el queso procesado a los niveles de proteína altos y de grasa altos descritos en la presente memoria durante al menos un período de aproximadamente 9 a aproximadamente 10 días a aproximadamente 30 0C (a aproximadamente 86 0F). En un enfoque, el ensayo de biotoxinas puede realizarse de acuerdo con Haim M. Solomon y col., Bacteriological Analytical Manual, capítulo 17, Clostridium botulinum, enero de 2001, disponible en
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratorvMethods/ucm070879.htm. que se ha incorporado como referencia en la presente memoria.
Los componentes lácteos cultivados producidos mediante el método de la presente descripción no solo inhiben C. botulinum y otros patógenos en el contexto de un queso procesado con alto nivel en proteína y queso, los componentes lácteos cultivados logran tales efectos inhibitorios a niveles de actividad menores y/o niveles de dosificación menores que los posibles anteriormente.
En otros enfoques, las formas líquidas de los componentes lácteos cultivados que se utilizan en el método de la presente invención o se elaboran mediante los procesos de la presente invención retienen niveles más altos de actividad de nisina en el queso procesado final, que no se alcanzaron utilizando las formas comerciales anteriores de nisina cuando se usan en quesos procesados. Según un enfoque, los ingredientes lácteos cultivados utilizados en el método descrito en la presente memoria y fabricados mediante los métodos descritos en la presente memoria son eficaces para retener de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 por ciento de actividad y, en otros enfoques, de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 por ciento de actividad en comparación con la actividad del ingrediente antes de la incorporación en el queso procesado.
En algunos enfoques, el componente lácteo cultivado se prepara utilizando un líquido lácteo ultrafiltrado antes o después de la fermentación. En estas propuestas, el componente lácteo cultivado tiene niveles reducidos de lactosa y otros minerales lácteos. Por ejemplo, y en algunos enfoques, el componente lácteo cultivado y el queso procesado que utilizan el componente lácteo cultivado pueden tener menos de aproximadamente 0,1 por ciento de lactosa y menos de aproximadamente 15 por ciento de lactato de sodio como ácido. En otros enfoques, el componente lácteo cultivado y el queso procesado que utilizan el componente lácteo cultivado también pueden tener menos de aproximadamente 600 mg/100 mg de calcio.
Las ventajas y realizaciones de los métodos, y composiciones obtenidas mediante los métodos descritos en la presente memoria se ilustran de forma más detallada en los siguientes ejemplos; no obstante, las condiciones, diagramas de procesamiento, materiales y cantidades específicos que se mencionan en estos ejemplos, así como otras condiciones y detalles, no se considerarán innecesariamente limitativos de este método. Todos los porcentajes y relaciones dentro de esta descripción son en peso salvo que se indique lo contrario.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran la capacidad de lonchas de queso procesado preparadas con componentes lácteos cultivados como se ha descrito anteriormente y muestras de control de queso procesado sin el componente lácteo cultivado, utilizando, en su lugar, ácido sórbico como conservante. Las muestras se prepararon generalmente como lonchas de queso procesado con aproximadamente 46 por ciento de humedad, aproximadamente 23 por ciento de grasa, aproximadamente 1,2 por ciento de sal, y aproximadamente 18 por ciento de proteína, con cantidades variables de conservantes y/o componentes lácteos cultivados (cuando se indican), saborizantes, colorantes, vitaminas, minerales y similares.
Ejemplo 1
Se prepararon lonchas de queso procesado utilizando un componente lácteo cultivado en líquido con 28 % de sólidos tal como se describe en la presente memoria a partir de la cepa 329 y se comparó con las lonchas de queso procesado preparadas con lactosuero deshidratado por pulverización cultivado. El lactosuero deshidratado por pulverización cultivado estaba en forma de polvo con aproximadamente 96 % de sólidos con prácticamente ninguna grasa y poca proteína. Tanto el lactosuero deshidratado por pulverización comercial, cultivado como el componente lácteo cultivado líquido preparados según el proceso de la Fig. 1 y utilizando la cepa 329 se utilizaron en un queso procesado. La Tabla 4 ilustra a continuación que el queso procesado preparado con componentes lácteos cultivados de la cepa 329 retuvo la actividad antimicrobiana significativamente en mayor medida en comparación con los materiales antimicrobianos
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comercialmente disponibles. Este efecto de retención de actividad se observó para las cargas al 6 % y al 8 % de los componentes lácteos cultivados en el queso procesado. A este respecto, como los componentes lácteos cultivados retienen la actividad antimicrobiana mucho mejor que el agente microbiano disponible comercialmente, el efecto antimicrobiano puede durar más tiempo y requerir por lo demás una dosificación más baja para una misma eficacia.
Tabla 4: Retención de actividad de los agentes antimicrobianos en el queso procesado
Antimicrobiano
Actividad del ingrediente AU/g % de uso en el queso procesado Nivel de dosificación AU/g Nivel de actividad en la loncha de queso procesado, AU/g % de retención
Lactosuero cultivado deshidratado por pulverización, comparativo
20.000 1 % 200 90 45 %
Lactosuero cultivado deshidratado por pulverización, comparativo
20.000 2 % 400 130 32,5 %
Componente lácteo cultivado líquido de la presente descripción
2220 6 % 133,2 90 67,6 %
Componente lácteo cultivado líquido de la presente descripción
2220 8 % 177,6 150 84,5
Se preparó otra comparación, donde se preparó un componente lácteo cultivado líquido preparado a partir de polvos y se combinó con agua líquida según el método de la Fig. 2 con aproximadamente 20 % de sólidos totales. En esta comparación, se incluyó una fuente de nisina comercialmente disponible (Nisaplin, Danisco) y un polvo de lactosuero deshidratado por pulverización en queso procesado y se compararon con un queso procesado similar preparado con el componente lácteo cultivado de la presente descripción. Como se muestra a continuación en la Tabla 5, cuando se utilizó 8 % del componente lácteo cultivado elaborado a partir de la cepa 329 según la presente descripción en lonchas de queso procesado, no se detectó toxina (C. Botulinum) después de aproximadamente 10 días mientras que un queso procesado similar preparado con agentes antimicrobianos comerciales (Nisaplin o lactosuero cultivado deshidratado por pulverización) tenía toxinas presentes al cabo de aproximadamente 7 y 10 días. El estudio de exposición a la toxina fue realizado por el Silliker Laboratory. Si se desea, pueden usarse también otras metodologías convencionales para estudios de exposición a toxina.
Tabla 5: Estudio de exposición a C. botulinum
Antimicrobiano
% de uso en el queso procesado AU medida del producto acabado Resultados clave del estudio de exposición a CBOT
Nisina comercialmente disponible, comparativa (Nisaplin)
0,023 % 210 AU Toxina presente a los 10 días
Lactosuero cultivado, deshidratado por pulverización, comparativo
1 % 90 AU Toxina positiva a los 7 días a 30 0C (86 0F)
Componente lácteo cultivado de la presente descripción (20 % de sólidos totales, líquido)
8 % 70 AU Sin toxina presente a los 10 días
Ejemplo 2
Se realizaron comparaciones de sabor en muestras de lonchas de queso procesado como se muestra en la Fig. 3. Se prepararon muestras de queso procesado con aproximadamente 0,2 por ciento de ácido sórbico como conservante (identificado como “control”) o sin ácido sórbico y aproximadamente 8 % de componente lácteo cultivado preparado según la presente descripción y utilizando la cepa 329 (identificada como “variable 8”) y degustada y evaluada por un panel sensorial entrenado. Como se muestra en la Fig. 8 (que resume la percepción de sabor en la boca del panel entrenado), el queso procesado preparado con los componentes lácteos cultivados de la presente descripción generalmente tenía el mismo perfil de percepción de sabor que el queso procesado preparado con ácido sórbico como conservante. Por lo tanto, se espera que sería aceptable, desde un aspecto de la percepción de sabor, reemplazar ácido sórbico como conservante por componentes lácteos cultivados.
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Ejemplo 3
Se prepararon numerosas muestras de queso procesado para comparar los perfiles de fusión de lonchas de queso procesado preparadas con y sin los componentes lácteos cultivados obtenidos a partir de la cepa 329 de la presente solicitud. Las muestras incluyen de aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 % de componentes lácteos cultivados y se compararon con muestras de control sin los componentes lácteos cultivados. La grasa, humedad, proteína y pH del queso se mantuvieron relativamente constantes entre todas las muestras de ensayo (de aproximadamente 43 a aproximadamente 44 por ciento de humedad y un pH de aproximadamente 5,7). Las muestras de control sin el componente lácteo cultivado contenían 0,18 % de ácido sórbico como conservante o, en algunos casos, estaban exentas de ácido sórbico para descartar que la masa fundida se debía a la falta de ácido sórbico. En este ejemplo, el diámetro en estado fundido de las muestras preparadas con el componente lácteo cultivado aumentó. Las demás no. Esto lo demuestran los datos de las Tablas 6, 7 y 8 siguientes.
Cada muestra de ensayo incluía 3 lonchas circulares de queso procesado apiladas una encima de otra. Las muestras se colocaron en la parte superior de un “hervidor doble” (baño María) y se calentaron con agua hirviendo sobre calor medio durante aproximadamente 4 minutos. Como se muestra en las Figs. 4A-D y 5A-C, las muestras preparadas con componentes lácteos cultivados tenían un área de superficie aumentada cuando se fundieron en comparación con las muestras de control sin los componentes lácteos cultivados de la presente solicitud. Como se muestra en la Fig. 5C, el diámetro de fusión del queso de control era de aproximadamente 2,86 centímetros (aproximadamente 1,125 pulgadas), mientras que el diámetro de fusión de las muestras de la invención con aproximadamente 6 por ciento del componente lácteo cultivado era de aproximadamente 4,06 y aproximadamente 3,68 centímetros (de aproximadamente 1,6 y aproximadamente 1,45 pulgadas). En estas figuras, las muestras de control se etiquetan con “C” y las muestras de la invención se etiquetan con I2, I4, I6, o I8, que representan discos de queso procesado de la invención con aproximadamente 2 por ciento, 4 por ciento, 6 por ciento u 8 por ciento de componente lácteo cultivado elaborado con la cepa 329.
Se completaron mediciones del área superficial para medir los perfiles de fusión de las muestras. Las Tablas 6, 7 y 8 ilustran a continuación las áreas de superficie calculadas usando el programa ImageJ (un programa de procesamiento de imágenes basado en Java, National Institute of Health) para algunas de las muestras que corresponden a las mostradas en las Figs. 4A-D y 5A-C. Como se muestra en las tablas, las muestras de queso procesado preparadas con los componentes lácteos cultivados de la presente solicitud al 4 %, 6 % y 8 % en queso procesado mostraron todas un área de superficie aumentada al fundirse en comparación con los controles sin componentes lácteos cultivados. Generalmente, los consumidores prefieren queso procesado con una mayor capacidad de fusión, tal como muestran las muestras con componentes lácteos cultivados.
Tabla 6: Mediciones de superficie específica
Muestra
Superficie específica (píxeles cuadrados) Superficie específica (píxeles cuadrados)
Lote de control
89088 189300
8 % de componente lácteo cultivado
139149 326995
% de aumento de área con componente lácteo cultivado
56,19 % 72,74 %
Tabla 7: Medición de la superficie específica
Muestra
Superficie específica (píxeles cuadrados) % de aumento de área con componente lácteo cultivado
Lote de control
167488 n/a
4 % de componente lácteo cultivado líquido
211365 26,20 %
4 % de componente en polvo lácteo cultivado
223930 33,70 %
A partir de los datos anteriores, las muestras que incluyen el componente lácteo cultivado de la presente descripción dieron como resultado un disco más amplio que las muestras de control sin el componente lácteo cultivado.
Tabla 8: Medición de la superficie específica
Muestra
Superficie específica (píxeles cuadrados) % de aumento de área con componente lácteo cultivado
Lote de control
179171 n/a
6 % de componente lácteo cultivado en líquidos
233075 30,09 %
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6 % de polvo de componente
248472 36,68 %
lácteo cultivado
Ejemplo 4
Las Figs. 6-9 ilustran comparaciones de firmeza y consistencia entre las lonchas de queso procesado obtenidas con componentes lácteos cultivados preparados mediante los métodos de la presente solicitud utilizando la cepa 329 y sin los componentes lácteos cultivados (control). En este ejemplo, los sólidos, proteína, grasa y humedad se mantuvieron relativamente constantes para todas las muestras probadas. Las muestras sin el componente lácteo cultivado incluían 0,18 de ácido sórbico como conservante y, en algunos casos, no contenían ácido sórbico o conservantes para descartar que la firmeza era debida a la ausencia de ácido sórbico. En este ejemplo, solo las muestras con el componente lácteo cultivado experimentaron un aumento de la firmeza y la consistencia.
Como se muestra en las Figs. 6 y 8, el queso procesado con componentes lácteos cultivados mostró una firmeza (es decir, módulo de Young) aumentada en comparación con las muestras de control obtenidas sin componentes lácteos cultivados. En general, esta mayor firmeza sugiere a los consumidores una composición de queso más natural. El módulo de Young, que también se conoce como módulo de tracción, es una medida de la rigidez de un material. En el contexto de un queso procesado, el módulo de Young es una medida del tacto inicial de la loncha de queso. En el contexto de este ejemplo, el tacto inicial significa la resistencia que proporciona el queso cuando se toca con el dedo o la mano. Es otra medida de la percepción de firmeza. El módulo de Young se midió utilizando un análisis de perfil de textura (MTPA) utilizando una máquina de análisis de textura (Texture Technologies Corp) que mide la cantidad de fuerza necesaria para penetrar una pila de lonchas de queso cuando se aplica un peso conocido. Para esta prueba, se apilan aproximadamente diez lonchas de queso de 21 gramos. En general, el módulo de Young se calcula dividiendo el esfuerzo de tensión por la deformación por tensión en el material y representa la relación de esfuerzo (carga) a la tensión (deformación) en la región inicial de Hooke. Esto representa de forma típica lo rígido o firme que una muestra es en respuesta a una carga externa. Además, un producto que tiene un valor de consistencia más alto debe proporcionar una percepción sensorial más masticable.
Además, las Figs. 7 y 9 ilustran la consistencia de las muestras de queso procesado mediante la firmeza durante el flujo del queso mientras se está aplicando la fuerza durante la prueba MPTA. Como se muestra en las Figs. 7 y 9, el queso procesado con componentes lácteos cultivados mostró una mayor consistencia durante el flujo en comparación con las muestras sin componentes lácteos cultivados. En general, esta mayor firmeza durante el flujo también sugiere una composición de queso más natural para los consumidores. Como se utiliza en la presente memoria, la consistencia se relaciona generalmente con la firmeza durante el flujo o la resistencia al flujo. En el contexto del queso procesado, cuanto más alto sea el valor de la consistencia, menor será la velocidad de disgregación del queso en la boca, que generalmente se percibe como una característica deseable para los consumidores.
Como se ha mostrado anteriormente, las composiciones de queso procesado preparadas con componentes lácteos cultivados de la presente descripción y fabricadas a partir de la cepa 329 son capaces de proporcionar propiedades antibacterianas y funcionalidad del conservante al menos equivalentes, si no mejoradas. Además, se ha descubierto inesperadamente que el queso procesado preparado con estos componentes lácteos cultivados presenta una fusión mejorada y, al mismo tiempo, una mayor firmeza del queso procesado. Generalmente, se esperaba anteriormente que al aumentar la fusión del queso, se redujera su firmeza. Se cree que los materiales generados en el componente lácteo cultivado mediante la cepa 329 también ayudan a mejorar de forma inesperada ambas propiedades del queso al mismo tiempo.
Ejemplo 5
Se usó leche 3 veces concentrada (pH 5,46) como medio líquido para la fermentación de componentes lácteos cultivados. Se tomó una muestra de la leche 3 veces concentrada antes de la inoculación con la cepa 329 de L. lactis. Los componentes lácteos cultivados se prepararon de acuerdo con el proceso de la Fig. 1 con una fermentación de aproximadamente 21 horas. Se tomó otra muestra después de la fermentación (pH 5,46). A continuación, las muestras se tiñeron utilizando conjugado de Concavalina A Alexa Fluor® 488, que se une selectivamente a los residuos de a- manopiranosil y a-glucopiranosil, para determinar si los exopolisacáridos se produjeron durante la fermentación. La ConA de Alexa Fluor 488 se disolvió en tampón de fosfato 0,1 M a pH 6,8 y se diluyó con fracción permeada de lactosuero a pH 6. Se aplicaron gotas de solución colorante a las muestras sobre un portaobjetos de vidrio de cámaras y se dejaron durante 30 minutos a 25 °C. A continuación, los portaobjetos se cubrieron con un cubreobjetos de vidrio y se observaron con un microscopio láser de barrido confocal (CSLM) Leica SP5 con un objetivo de 20 aumentos con longitudes de onda de 495 nm (excitación) y 519 nm (emisión). Como se muestra en las Figs. 15A y 15B (barra de escala 25 pm), se observó exopolisacárido (EPS) en la muestra fermentada pero no en la materia prima de leche 3 veces concentrada antes de la inoculación con la cepa 329. El EPS se observó como una gran masa agregada.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Kraft Foods Group Brands LLC
<120> QUESO PROCESADO CON COMPONENTES LÁCTEOS CULTIVADOS <130> 1410-131457
<160> 33
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211> 34
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_VARIOS <222> (2)..(2)
<223> Deshidrobutirina (beta-metildeshidroalanina)
<220>
<221> TIOET <222> (3)..(7)
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_VARIOS <222> (5)..(5)
<223> Deshidroalanina
<220>
<221> TIOET <222> (8) .. (11)
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_VARIOS <222> (8)..(8)
<223> Ácido aminobutírico
<220>
<221> TIOET <222> (13) . . (19)
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_VARIOS <222> (13)..(13)
<223> Ácido aminobutírico
<220>
<221> TIOET <222> (23)..(26)
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_VARIOS <222> (23)..(23)
<223> Ácido aminobutírico
<220>
<221> TIOET <222> (25)..(28)
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_VARIOS <222> (25)..(25)
<223> Ácido aminobutírico
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<22 0>
<221> CARACTERÍSTICA_VARIOS <222> (33) . . (33)
<223> Deshidroalanina
<400> 1
Ile Xaa Ala
Ile Xaa Leu Ala Xaa Pro Gly Ala Lys Xaa Gly Ala Leu
1
5 10 15
Met Gly Ala
Asn Met Lys Xaa Ala Xaa Ala His Ala Ser Ile His Val
20 25 30
Xaa Lys
<210> 2 <211> 1086 <212> ADN
<213> Lactococcus lactis <400> 2
atgaaacaga
aacataaatt agcgcttggt gcgtcaattg ttgctttggc aagtcttggt
gggattaaag
cacaagctgc atctgttcaa gaaattatta acgctgcggt accagtggca
aatgactacg
gactttatcc atcagtaatg attgcccaag ggattttaga atcaagtggt
ggacaaagtg
ccttagcaag caattataat aatatttttg gagttaaata cacttctggt
acacctgttt
atctaccaac acaagagtat ttgaatggaa caatgacaaa tgttgttgaa
cccttccaag
cttatagctc agtttatgac gcatgtgttg cccaagctaa aatgttacgt
gcttcatcat
attattctgg ggcttggcgt gaaaatacaa gttcttactt agatgcgaca
gcttggcttg
aaggacgtta tgccacggat ccaacttatg cttctaaatt gaatagcgtg
atttctgaac
ttggtttaag tgtttatgac caaggaggag aaatatcagg aggaactgct
gttacaacta
gttcatcagc ctcaacaaat tcagctggca catacaaagt acaagagggt
gattcattat
cagcaatcgc tgctcaatat ggtacaactg ttgatgcact tgtgtcagca
aatagtttag
aaaatgcgaa cgatattcat gtaggagaag ttttgcaagt tgctggtgct
agcacaacta
caacaagtac caatacaact tccaatgtat cgtcaagttc tacttatacc
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gagatagttt atattcgatt gcggaacaat atggaatgac tgtttcatca
ctgatgtcag
ccaatggaat ttatgatgtt aattcaatgc ttcaagtagg acaagtattg
caagtaactg
taagtactag tgcaacaact tcaaacacaa cgacttcaaa cagttataca
attcaaaatg
gtgacagcat ttattcaatt gccacagcaa atggtatgac agctgaccaa
ttagcagccc
tcaatggatt tggaattaat gacatgattc atccaggaca aacaattaga
atctaa
<210> 3
<211> 1011
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360
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900
960
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<212> ADN
<213> Lactococcus lactis
<400> 3 atggtagtta
aagttggtat taacggtttc ggtcgtatcg gtcgtcttgc tttccgtcgt 60
attcaaaatg
ttgaaggtgt tgaagttgtt gcaatcaacg acttgacaga tccagcaatg 120
cttgctcact
tgcttaaata cgatacaact caaggtcgtt ttgatggtaa agttgaagtt 180
aaagatggtg
gttttgaagt taacggtaaa ttcgttaaag ttactgctga atctaaccca 240
gctaacatca
actgggctga agttggtgca gaaatcgttc ttgaagcaac tggtttcttc 300
gcaactaaag
aaaaagctga acaacacttg cacgctaacg gtgctaaaaa agttgttatc 360
actgcacctg
gtggatctga tgttaaaaca atcgttttca acactaacca cgaagtactt 420
gatggaactg
aaacagtaat ttcagctggt tcatgtacaa ctaactgtct tgctccaatg 480
gctgatactt
tgaacaaaca attcggtatc aaagttggta caatgactac agttcacggt 540
tacactggtg
accaaatgac tcttgatggc ccacaccgtg gtggagactt ccgtcgcgca 600
cgtgctgcag
ctgaaaacat cgtacctaac tcaacaggtg ctgctaaagc tatcggtctt 660
gtattgccag
aacttcaagg taaacttcaa ggacatgctc aacgtgtacc agttccaact 720
ggttcattga
ctgaacttgt tactatcctt aacaaagaag ttacagttga cgaaatcaac 780
gcagctatga
aagctgcttc aaatgaatca tttggttaca acgaagacca aatcgtttca 840
tctgatatcg
ttggtatctc aaactcttca ctctttgatg ctactcaaac tgaagttact 900
tcagctgatg
gagctcaact tgttaaaact gtatcttggt acgataacga aatgtcatac 960
acttcaaacc
ttgttcgtac acttgcatac ttcgctaaaa tcgctaaata a 1011
<210> 4 <211> 1419 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 4 atggttgttg
gtgcacaagc aacagaagtt gatttggttg ttattggttc aggccctggt 60
ggttatgttg
cagccatccg tgcggctgaa cttggtaaaa aagttacaat tattgaaaaa 120
gataatgttg
gtggggtttg tttaaatatt ggttgtatcc catcaaaagc attgattaat 180
attggtcatc
attaccaaga atctttggag gaagaaaaag gagaaaatcc ttttggtctt 240
tctgtcggaa
atgttaaatt aaactgggaa tctgcccaaa aatggaaaca agataaagtt 300
gtcaaccagt
tgacaggtgg tgttaaaatg ctacttaaaa aacacaaagt tgacgtgatt 360
caaggaactg
cagaatttat tgataacaat acaataaatg ttgaacaaga agatgggttc 420
caacttttgc
aatttaatga tgtgattatc tcaactggtt cacgtcctat cgaaattcct 480
tctttcccat
ttggtggtcg cattattgac tctactggtg ctttgtcact tccagaagtt 540
cctaaacatt
tgattattgt tgggggagga gttattggtt ctgagcttgg tggagcatac 600
cgtatgctcg
gttctaagat tacaattgtt gaaggtttgg accacatttt aaacgggttt 660
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
gataaagaaa
tgtctgatat cattgctaat cgcgttaaat ctgctggttc tgaaatcttt 720
acttcagcaa
tggctaaatc agctactcaa actgataaag atgtaacttt gacttttgag 780
gttgacggaa
aagaacaaac ggtgactggt gattacttac tcgtttctgt tggacgtcgt 840
ccaaatactg
atttaatcgg cttgaacaac actgatgtta aattgactga ccgtggtttg 900
attgaagttg
acgattctta tgcaactaat gttcctcaca tttatgcaat cggtgatgtg 960
gttcctggtc
caatgctcgc tcacaaagct tctttccaag ctaaagttgc tgctgctgcg 1020
attgctggag
ctgaggacga cgtggactta cacgttgctt tgcctgctgt agcttataca 1080
acaactgaat
tagcaacagt tggagaaacg cctgaatcag ttaaagaccg taaagatgtt 1140
aaaatttcta
agttcccatt tgctgcaaat ggccgtgcca tttcaatgaa tgatacgact 1200
ggtttcttac
gtttgattac tgaaactaaa gaaggggcct taatcggtgc tcaaatcgtt 1260
ggccctggtg
catctgactt gatttctggt ttatcactag cgattgaaaa tggattgact 1320
tctaaagaca
tttcattgac tatccaacct cacccaacac ttggtgaagc gattatggat 1380
acagctgaat
tggctgatgg cttaccaatt cacgtttaa 1419
<210> 5 <211> 1311 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 5 atgacagtaa
catcagattt cacacaaaaa ctctacgaaa attttgcaga aaatacaaaa 60
ttgcgtgcgg
tggaaaatgc cgtgactaaa aatggtttgc tttcatcact cgaagtccgt 120
ggttcacatg
cagcaaattt gcctgagttt tcaattgact tgacaaaaga ccctgtaacg 180
aatcaaaaac
aatctggtcg ttgctggatg tttgctgctt tgaacacttt ccgtcataaa 240
tttatcaatg
aatttaaaac agaggatttt gagttttcac aagcttacac tttcttctgg 300
gataaatatg
aaaaatcaaa ctggttcatg gaacaaatta ttggtgatat tgaaatggac 360
gatcgtcgtt
tgaaattcct tttacaaaca ccacaacaag atggcggcca atgggatatg 420
atggttgcaa
tttttgaaaa atatggaatt gttcccaaag ctgtttatcc tgaatcacaa 480
gcttcaagta
gctcacgtga attgaatcaa tacttgaata aactactccg tcaagatgct 540
gaaattttgc
gttatacaat tgagcaaggt ggagatgttg aagcagttaa agaagaactt 600
ttgcaagaag
tctttaattt ccttgcggta actttaggtt tgccaccaca aaattttgaa 660
tttgctttcc
gtaataaaga taatgaatac aaaaaatttg ttggtagtcc aaaagaattt 720
tacaatgaat
atgttggaat tgatttgaat aattatgtgt cagtaatcaa tgctccaact 780
gctgacaaac
cttataataa gagctacaca gttgagtttc ttggaaatgt tgtcggtggt 840
aaagaagtga
aacatttgaa tgttgaaatg gaccgcttta aaaaattggc cattgcccaa 900
atgcaagctg
gtgaaacagt ttggtttggt tgtgacgtgg gtcaagaatc aaatcgttca 960
gcaggacttt
tgacaatgga ttcttatgat ttcaaatctt cattggatat tgaatttact 1020
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
caaagcaaag
caggacgtct tgactatggt gagtcgttga tgacgcatgc catggtttta 1080
gcgggtgttg
atttagatgc tgacggaaat tcaactaaat ggaaagttga aaattcatgg 1140
ggtaaagatg
cgggtcaaaa aggatatttt gttgcctctg atgaatggat ggatgaatat 1200
acttatcaaa
ttgttgtccg taaagacctt ttaactgaag aagaattggc tgcttacgaa 1260
gagaaacctc
aagtacttct accatgggac ccaatgggtg ctttagctta a 1311
<210> 6 <211> 648 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 6 atgaaaaata
aaattttaga cctgagggca tattttattg ctggcccaca agattttcca 60
aaactttcaa
ttgatgatgc aatcgataaa atttctgtaa tcataaaaag tggagtaacg 120
gtttatcaat
ttcgtgataa gggaacaatt tataaaaata aaaatcaacg attagaagta 180
gcaaaaagac
tacaagaagt agctcagaaa gcggctgttt cttttattgt gaatgatgat 240
gttgaattag
cgcgtgaatt gtcagctgac gggattcatg tcggacaaga cgatgattct 300
gtcagtaaaa
ttcgtgagct gattggccaa gaaatgtggg taggactttc tgtcagtaat 360
gatatggaat
tagaaagcgc tcaaaagagt ggggctgact atttgggaat tggtccaatt 420
tatccaacaa
atagcaagtc cgacgcagca gaaccaattg gggttgacca tttaagaaaa 480
atgcttgagc
ataatcaatt accaactgtt ggaattggtg gaattactga aaattcactg 540
acagagcttt
caaaaattgg tctgggtgga gttgcggtaa tttctttgct gacagaatcc 600
gaaaattaca
aaaatatggt tcaaaaaatt aagcaaaata ttagatga 648
<210> 7 <211> 1623 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 7 atgaaacaac
cactttataa tacaggagtt ttatttaaga ctttaataaa aagggattgg 60
tttaagttag
ttttctggat tttaggaatg cttgcttttg ctgcttcagg ggcagggaaa 120
atggaagttg
cctcgaatcc ggcgacggct agtactcttt atacaatgtt tgtcaaaaat 180
ccagcaatgg
tcggattatt tggaccaact ccaataaata atccaactaa ttatagtctg 240
gggccgattt
ttggtcaaac catgacttta attacggggc tgactttcgc tatcatttcg 300
attatttatg
ttgttaatcg aagcagaaaa gaagaagatg atgggattac agaacttttt 360
cggtcttact
ctattggaaa attggcaaat acgactgctt tagtcatgga acttttgctc 420
ttaaatttaa
taatggctgt cttattagct ctttcaatag aggtccaaaa cgtggctggc 480
ttgaatcatt
tagaaagtaa ttttctattt gctttcacaa caagcgctca gggtttcctt 540
tggggaatgt
ttgctttact tttcggtcaa attttctctg aagcaagtac aactaaaggg 600
atgacatttg
gtttactggg tttgttatat attgttcgaa tgctaacaga tgtaacaaat 660
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
ctttccatag gttggttcaa tcctctgtct tggtcttatc tagcttttcc atatgttaaa 720 ggtcatgaaa attggttagc tgtctttttg acttttctct tagcttttct aattttagga 780 atatcctata ttctagagct taaaagagat gtgggagtgg ggtattttcc cgaaagaaag 840 gcgcgacttc atgggaaaaa gggacatttc ggatttcctg gtctcgtttt gaatcttgaa 900 aaaaagatga ttatcggttg gcttttggca agttttgttc tgggcttagt ttatggttca 960 atgtttggac aaatggacca atttatttca agtaataaaa ccgttaagga gctttttgtt 1020 gggaatgaaa cggcagcgag tgcgattaga ggaaacttca tggtcactct gttttcgata 1080 ttgtcaatct taatcgcagc gtttggtgta attttactga caaaaatggt gagcgaggaa 1140 agaaaaaatc gtctggaagc tctttatgct ttaccacttt cacgactaaa agtgtattcc 1200 acttatttac tgatagctat tctgtcagta attttagctc agtttttagc gctttttgga 1260 atatttattg aacagttggg taataaaaat gctttgagct tcttagaaat tatgaaatct 1320 ggcatgattt ggcttgttgc tgtcatattt gttttagcaa tacttagtct gttacttggg 1380 cttgtgcctc gtttggcaga attaatttgg gtatatcttg ctttcttact ttttatgact 1440 tatcttggaa aattattatc tttgccaaaa tggcttgaaa atttaagcat ttataactat 1500 attcctaaat tgccagttga gaaaatgaat cttcctaccg ttttattcat attaatttta 1560 tctgtcttct tagttttact tggctttgga gcttatagaa gacgcgattt aatcacgggg 1620 taa 1623
<210> 8 <211> 1116 <212> ADN

<213> Lactococcus lactis <400> 8

atggctttaa cagcaggtat cgttggttta ccaaacgttg gtaaatcaac tctttttaat 60

gcaattacaa aagcaggcgc agaagctgca aactatcctt ttgcaacaat tgacccaaat 120

gttgggatgg tagaagtacc ggatgaacgt ttaaacaagt taacagagtt gattaaacct 180

aagaaaactg ttccgacaac ttttgaattt acagatattg ctgggattgt taaaggggct 240

tcacgcggag aaggtctagg aaataaattt cttgccaata ttcgtgaagt agatgccatc 300

attcacgttg ttcgagcttt tgatgatgaa aatgtaatgc gtgaaaataa tcgtgaagat 360

gcttttattg atccaatggc agacattgaa acaattaatc ttgaattaat tttggccgat 420

ttagaatcag tcaataaacg ttatgcgcgt gttgaaaaag ttgctcgtac ggcaaaagat 480

aaagatgcgg tcgcagaatt taatgttttg aaaaagctca aaccggtact tgaagatggt 540

aaatcagcac gaacaattga ctttgacgaa gatgaaataa aggttcttaa aagcttgttc 600

ttattgacaa gtaaaccagt tctttatgta gctaatgttt cagaagatga agtaggcgaa 660

cctgataata tcgaatacgt gaaacaaatt cgtgagtttg cggcgactga aaatgctgaa 720

gttgctgtga tttctgctcg tgttgaagaa gaaatctcag agttggaaga tgatgaaaaa 780
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
gcagaatttt
tggaagcaat tggcttaaaa gaatctggtg ttgatatgtt gactcgtgca 840
gcttaccacc
ttcttggact tgccacttac tttactgctg gtgaaaaaga agtccgtgct 900
tggaccttca
agcgtggaat gaaagctcca caaatggcag gaattattca tacagacttt 960
gaaaaaggct
ttatccgcgc agtaactatg tcttatgatg atttgcttaa atacggttca 1020
gaaaaagctg
ttcgtgaagc cggtcgcttg cgtgaagaag gaaaagaata tgttggtcaa 1080
gatggcgaca
ttatggaatt ccgtttcaac gtgtaa 1116
<210> 9 <211> 411 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 9 atggatcgtt
atactaaaaa agtcattgct tgggatttag gaaagcgaat gactctagaa 60
ttagtgcaaa
ggactttgaa taaggcaatg gaatcacaaa attatccaga agctgtgatg 120
cttcattctg
accaaggaag tcagtatacg agtcatgagt atgaagagac aataaaaaac 180
tctggaatga
ctcactcctt cagtcgtaag ggctatcctt atcataatgc cagtcttgaa 240
tcttggcatg
gacatttaaa aagagagtgg gtgtatcaat ttaaatataa gaactttgaa 300
gaagcctatc
agagtatttt ctggtacatc gaagcctttt ataattcaaa acgaatccat 360
caaagtttag
ggtatcttac gcctaatcaa tttgaaaaag aaatcactta a 411
<210> 10 <211> 645 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 10 atgataagaa
gtgaatgtct caaattaaaa aatagcttag ggttttattt agtttttctc 60
tttactttat
tagagctttt aacggttcct atttatttag cttttggaag aagtcatgtt 120
tcaatgactg
atttatcgct catgattttt ttgttttttc cgttactggt tacaattttg 180
tctattctaa
tctttgaaca ggagagtctg gccaatcgtt tccaagaaat aaatgtaaat 240
aaaaaaagta
gcagaatttg gttatcaaag ctaatagtag tggatttcct tttgttcttt 300
ccatcagcaa
tgatctggat aattacggga gtttcacagg cagtagggca acaaggaatg 360
atgatcgcaa
cagctagctg gttgatggca atttttctta atcattttca tcttttattg 420
acctttataa
tcaatcgagg agggagcatg attatcgcga ttattgaaat attactcatt 480
atttttgcca
gtaataaagt tttattagca gcttattggt gtcccattgc tttacctgtt 540
aattttatga
taactgggcg gtgtgcttat ctgatagctg ccgtagggtg gattgtttta 600
tccacaataa
ttcttgtagc attatctaaa aaaaagatta gataa 645
<210> 11 <211> 729
<212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
729
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
678
<213> Lactococcus lactis
<400> 11 atgaaaagaa
taatagcatc agaagcaata aaattaaaaa aatcaggaac tcttagattg
gtattaatta
tcccttttgt gactctattt atagcatttc ttatgggtgg aatacagatt
tttagtgttt
tttcaattta ttggtgggaa actggttttt tattcctttt gatgagtttg
ctttttcttt
atgatataaa atcagaggag caagctggaa attttcaaaa tgtgaaatgg
aaaaagctga
gttggaaaat tcatttggcc aaaatgttgt tgatttggct aagaggtata
ctagcgagca
tagtcttgat tattttgctt tatttggttg cttttgtgtt tcaaggtatt
gtagtggtgg
attttatgaa agtaagtgtg gcattgattg ctatattact agcagcttct
tggaatttac
cctttatata cttgattttc aagtggatta atacttacgt attgttagct
gcgaatacct
tgatttgttt aattgttgcc ccttttgttg cacaaactcc agtatggttc
ttgctaccat
acacttatca ctataaagtt acagaaagtt tgttaaatat caaaccatca
ggagatttgt
taacagggaa gataaatttc agtatttggg aagttttatt accatttgga
ctttccatag
ttgtaacgat aggagtttcg tatttactta aaggagtgat agaacatgat
aagaagtga <210> 12 <211> 678 <212> ADN <213> Lactococcus lactis <400> 12 atgcaggtaa aaattcaaaa tctttctaaa
acatataaag aaaagcaggt gctacaagat
atcagttttg
atattaaatc tggaacagtc tgtggtttat taggagttaa cggtgcagga
aaatcaactt
tgatgaaaat tttgtttggt ttaatttctg cagatactgg aaaaattttt
tttgatggac
aagaaaagac aaataatcaa cttggagcct taatcgaggc tccagcaata
tatatgaatt
tatctgcttt cgataatctt aaaactaagg ctttgctttt tggaatttca
gataagagaa
ttcatgaaac tctagaagtg attggtttgg cagaaacagg aaagaaaaga
gcaggaaaat
tctctttagg gatgaaacaa cgtttgggaa ttggtatggc tattcttaca
gaacctcaat
ttttaattct tgatgaacct actaatggtt tggatcctga tggtattgcg
gagttgttaa
acttaatctt aaaacttaaa gctaaaggtg tgacaatctt gatttctagt
catcagttgc
acgaaataag taaagtagct agtcaaatta ttattttgaa caaaggtaag
attcgttata
atcgtgcgaa caataaagaa gacgacattg aacagttatt ctttaagatt
gtgcatggag gaatgtga <210> 13 <211> 687 <212> ADN <213> Lactococcus lactis <400> 13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
gtgtataaaa
ttttaatagt tgatgatgat caggaaattt taaaattaat gaagacagca 60
ttagaaatga
gaaactatga agttgcgacg catcaaaaca tttcacttcc cttggatatt 120
actgattttc
agggatttga tttgattttg ttagatatca tgatgtcaaa tattgaaggg 180
acagaaattt
gtaaaaggat tcgcagagaa atatcaactc caattatctt tgttagtgcg 240
aaagatacag
aagaggatat tataaacggc ttaggtattg gtggggatga ctatattact 300
aagcctttta
gccttaaaca gttggttgca aaagtggaag caaatataaa gcgagaggaa 360
cgcaataaac
atgcagttca tgttttttca gagattcgta gagatttagg accaattaca 420
ttttatttag
aagaaaggcg agtctgtgtc aatggtcaaa caattccact gacttgtcgt 480
gaatacgata
ttcttgaatt actatcacaa cgaacttcta aagtttatac gagagaggat 540
atttatgatg
acgtatatga tgaatattct aatgcacttt ttcggtcaat ctcggagtat 600
atttatcaga
ttaggagtaa gtttgcacca tacgatatta atccgataaa aacggttcgg 660
ggacttgggt
atcagtggca tgggtaa 687
<210> 14 <211> 1344 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 14 atgggtaaaa
aatattcaat gcgtcgacgg atatggcaag ctgtcattga aattatcata 60
ggtacttgtc
tacttatcct gttgttactg ggcttgactt tctttctacg acaaattgga 120
caaatcagtg
gttcagaaac tattcgttta tctttagatt cagataattt aactatttct 180
gatatcgaac
gtgatatgaa acactaccca tatgattata ttatttttga caatgataca 240
agtaaaattt
tgggaggaca ttatgtcaag tcggatgtac ctagttttgt agcttcaaaa 300
cagtcttcac
ataatattac agaaggagaa attacttata cttattcaag caataagcat 360
ttttcagttg
ttttaagaca aaacagtatg cctgaattta caaatcatac gcttcgttca 420
atttcttata
atcaatttac ttaccttttc ttttttcttg gtgaaataat actcattatt 480
ttttctgtct
atcatctcat tagagaattt tctaagaatt ttcaagccgt tcaaaagatt 540
gcattgaaga
tgggggaaat aactactttt cctgaacaag aggaatcaaa aattattgaa 600
tttgatcagg
ttctgaataa cttatattcg aaaagtaagg agttagcttt ccttattgaa 660
gcggagcgtc
atgaaaaaca tgatttatcc ttccaggttg ctgcactttc acatgatgtt 720
aagacacctt
taacagtatt aaaaggaaat attgaactgc tagagatgac tgaagtaaat 780
gaacaacaag
ctgattttat tgagtcaatg aaaaatagtt tgactgtttt tgacaagtat 840
tttaacacaa
tgattagtta tacaaaactt ttgaatgatg aaaatgatta caaagcgaca 900
atctccctgg
aggatttttt gatagattta tcagttgagt tggaagagtt gtcaacaact 960
tatcaagtgg
attatcagct agttaaaaaa acagatttaa ccacttttta cggaaataca 1020
ttagctttaa
gtcgagcact tatcaatatc tttgttaatg cctgtcagta tgctaaagag 1080
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
ggtgaaaaaa
tagtcagttt gagtatttat gatgatgaaa aatatctcta ttttgaaatc 1140
tggaataatg
gtcatccttt ttctgaacaa gcaaaaaaaa atgctggaaa actatttttc 1200
acagaagata
ctggacgtag tgggaaacac tatgggattg gactatcttt tgctcaaggt 1260
gtagctttaa
aacatcaagg aaacttaatt ctcagtaatc ctcaaaaagg tggggcagaa 1320
gttatcctaa
aaataaaaaa gtaa 1344
<210> 15 <211> 2010 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 15 ttgggtttat
cagcaactgt gcatggggag acaacaaatt cacaacagtt actctcaaat 60
aatattaata
cggaattaat taatcataat tctaatgcaa ttttatcttc aacagaggga 120
tcaacgactg
attcgattaa tctaggggcg cagtcacctg cagtaaaatc gacaacaagg 180
actgaattgg
atgtaactgg tgctgctaaa actttattac agacatcagc tgttcaaaaa 240
gaaatgaaag
tttcgttgca agaaactcaa gttagttctg aattcagtaa gagagatagc 300
gttacaaata
aagaagcagt tccagtatct aaggatgagc tacttgagca aagtgaagta 360
gtcgtttcaa
catcatcgat tcaaaaaaat aaaatcctcg ataataagaa gaaaagagct 420
aacttcgtta
cttcctctcc gcttattaag gaaaaaccat caaattctaa agatgcatct 480
ggtgtaattg
ataattctgc ttctcctcta tcttatcgta aagctaagga agtggtatct 540
cttagacaac
ctttaaaaaa tcaaaaagta gaggcacaac ctctattgat aagtaattct 600
tctgaaaaga
aagcaagtgt ttatacaaat tcacatgatt tttgggatta tcagtgggat 660
atgaaatatg
tgacaaataa tggagaaagc tatgcgctct accagccctc aaagaaaatt 720
tctgttggaa
ttattgattc aggaatcatg gaagaacatc ctgatttgtc aaatagttta 780
ggaaattatt
ttaaaaatct tgttcctaag ggagggtttg ataatgaaga acctgatgaa 840
actggaaatc
caagtgatat tgtcgacaaa atgggacacg ggacggaagt cgcaggtcag 900
attacagcaa
atggtaatat tttaggagta gcaccaggga ttactgtaaa tatatacaga 960
gtatttggtg
aaaatctttc gaaatcggaa tgggtagcta gagcaataag aagagctgcg 1020
gatgatggga
acaaggtcat caatataagt gctggacagt atcttatgat ttcaggatcg 1080
tatgatgatg
gaacaaatga ttatcaagag tatcttaatt ataagtcagc aataaattat 1140
gcaacagcaa
aaggaagtat tgttgtcgca gctcttggta atgatagttt aaacatacaa 1200
gataaccaaa
caatgataaa ctttcttaag cgtttcagaa gtataaaggt tcctggaaaa 1260
gttgtagatg
caccgagtgt atttgaggat gtaatagccg taggtggaat agatggttat 1320
ggtaatattt
ctgattttag taatattgga gcggatgcaa tttatgctcc tgctggcaca 1380
acggccaatt
ttaaaaaata tgggcaagat aaatttgtca gtcagggtta ttatttgaaa 1440
gattggcttt
ttacaactac taatactggc tggtaccaat atgtttatgg caactcattt 1500
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
gctactccta
aagtatctgg ggcactggca ttagtagttg ataaatatgg aataaagaat 1560
cctaaccaac
taaaaaggtt tcttctaatg aattctccag aagttaatgg gaatagagta 1620
ttgaatattg
ttgatttatt gaatgggaaa aataaagctt ttagcttaga tacagataaa 1680
ggtcaggatg
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aacaagataa agaaattcaa agaaatacaa ataacaattt ttctatcaaa 1800
aatgattttc
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atggctaata
atcgaaattc gagaggtgct gtttctgtac gaagtcaaga aattttacct 1920
gttactggag
atggagaaga ttttttaccg gctttaggta tagtgtgtat ctcaatcctt 1980
ggtatattga
aaagaaagac taaaaattga 2010
<210> 16 <211> 738 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 16 atgagaagat
atttaatact tattgtggcc ttaataggga taacaggttt atcagggtgt 60
tatcaaacaa
gtcataaaaa ggtgaggttt gacgaaggaa gttatactaa ttttatttat 120
gataataaat
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aaagtaaaat
tttataagct gttgattgtt gacatgaaaa gtgagaaact tttatcaagt 240
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ctatgtatgg
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tgagattaca aaactttgat gtgacaagcg atatttctga tgataatttt 420
gttattgata
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gacaccaccg
tatctgatga agaattggga gaatatcagg atgttttagc tgaagtacgt 540
gtgtttgatt
cagttagtgg caaaagtatc ccgaggtctg aatgggggag aattgataag 600
gatggttcaa
attccaaaca gagtaggacg gaatgggatt atggcgaaat ccattctatt 660
agaggaaaat
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acgaaggtag
gaaactag 738
<210> 17 <211> 1245 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 17 atgaataaaa
aaaatataaa aagaaatgtt gaaaaaatta ttgctcaatg ggatgagaga 60
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ataaagaaaa cttcgatttc ggagagttga ctctctctac aggattgcct 120
ggtataattt
taatgttagc ggagttaaaa aataaagata actcaaagat atatcagaaa 180
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attatattga atatattgtt agcaaacttt caacatatgg gcttttaaca 240
ggatcacttt
attcgggagc agctggcatt gcattaagta tcctacattt acgagaagat 300
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
gacgaaaaat
ataagaatct tcttgatagc ctaaatagat atatcgaata tttcgtcaga 360
gaaaaaattg
aaggatttaa tttggaaaac attactcctc ctgattatga cgtgattgaa 420
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ttatcaattt tttatcaaat ctgactaaag aaaacaatgg actaatatcg 540
ctttacatca
aatcggagaa tcagatgtct caatcagaaa gtgagatgta tccactaggc 600
tgtttgaata
tgggattagc acatggactt gctggagtgg gctgtatctt agcttatgcc 660
cacataaaag
gatatagtaa tgaagcctcg ttgtcagctt tgcaaaaaat tatttttatt 720
tatgaaaagt
ttgaacttga aaggaaaaaa cagtttctat ggaaagatgg acttgtagca 780
gatgaattaa
aaaaagagaa agtaattagg gaagcaagtt tcattagaga tgcatggtgc 840
tatggaggtc
caggtattag tctgctatac ttatacggag gattagcact ggataatgac 900
tattttgtag
ataaagcaga aaaaatatta gagtcagcta tgcaaaggaa acttggtatt 960
gattcatata
tgatttgcca tggctattct ggtttaatag aaatttgttc tttatttaag 1020
cggctattaa
atacaaaaaa gtttgattca tacatggaag aatttaatgt taatagtgag 1080
caaattcttg
aagaatacgg agatgaaagt ggcacgggtt ttcttgaagg aataagtggc 1140
tgtatactgg
tattatcgaa atttgaatat tcaatcaatt ttacttattg gagacaagca 1200
cttttacttt
ttgacgattt tttgaaagga gggaagagga aatga 1245
<210> 18 <211> 1803 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 18 atggatgaag
tgaaagaatt cacatcaaaa caatttttta atactttact tactcttcca 60
agcaccttga
agttaatttt tcagttggaa aaacgttatg caatttattt aattgtgcta 120
aatgctatca
cagcttttgt tccgttggct agtcttttta tttatcaaga tttaataaac 180
tctgtgctag
gttcagggag acatcttatc aatattatta tcatctattt tattgttcaa 240
gtgataacaa
cagttctggg acagctggaa agttatgtta gtggaaaatt tgatatgcga 300
ctttcttaca
gtatcaatat gcgcctcatg aggactacct catctcttga attaagtgat 360
tatgagcagg
ctgatatgta taatatcata gaaaaagtta ctcaagacag cacttacaag 420
ccttttcagc
tatttaatgc tatcattgtt gtgctttcat cgtttatctc attgttatct 480
agtctatttt
ttattggaac atggaacatt ggggtagcaa ttttactcct tattgttcca 540
gtattatctt
tggtactttt tctcagagtg ggacaattag agtttttaat ccagtggcag 600
agagcaagtt
ctgaaagaga aacatggtat attgtatatt tattgactca tgatttttca 660
tttaaagaaa
tcaagttaaa taatattagc aattacttca ttcataaatt tggaaaatta 720
aagaaaggat
ttatcaacca agatttagct attgctcgta agaagacata tttcaatatt 780
tttcttgatt
tcattttgaa tttgataaat attcttacga tatttgctat gatcctttcg 840
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
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gaaaacttct tataggtaat ttggtaagtc tcatacaagc tatttctaaa 900
atcaatactt
attctcaaac aatgattcaa aatatttaca tcatttataa tactagtttg 960
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aactttttga gtttttaaag agagaaagtg tagttcacaa aaaaatagaa 1020
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tatgcaatca acatatagga actgttaaag taattaattt atcatatgtt 1080
taccctaatt
cgaatgcctt tgcactaaag aatatcaatt tatcctttga aaaaggagaa 1140
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ttgtaggaaa aaatggttca gggaaaagta cactagtaaa gataatttca 1200
ggattatatc
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cctgaggagt
tttatcagaa aaacatatcg gtgctgttcc aagattttgt gaagtatgag 1320
ttaacgataa
gagagaatat aggattgagt gatttgtctt ctcaatggga agatgagaaa 1380
attattaaag
tactagataa tttaggactc gattttttga aaactaataa tcaatatgta 1440
cttgatacgc
agttaggaaa ttggtttcaa gaagggcatc aactttcagg aggtcagtgg 1500
caaaaaattg
cattagcaag gacattcttt aagaaagctt caatttatat tttagatgaa 1560
ccaagtgctg
cactcgatcc tgtagctgaa aaagaaatat ttgattattt tgttgctctt 1620
tcggaaaata
atatttcaat tttcatttct catagtttga atgctgccag aaaagcaaat 1680
aaaatcgtgg
ttatgaaaga tggacaggtc gaagatgttg gaagtcatga tgtccttctg 1740
agaagatgtc
aatactatca agaactttat tattcagagc aatatgagga taatgatgaa 1800
taa
1803
<210> 19 <211> 2982 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 19 atgataaaaa
gttcatttaa agctcaaccg tttttagtaa gaaatacaat tttatctcca 60
aacgataaac
ggagttttac tgaatatact caagtcattg agactgtaag taaaaataaa 120
gtttttttgg
aacagttact actagctaat cctaaactct atgatgttat gcagaaatat 180
aatgctggtc
tgttaaagaa gaaaagggtt aaaaaattat ttgaatctat ttacaagtat 240
tataagagaa
gttatttacg atcaactcca tttggattat ttagtgaaac ttcaattggt 300
gttttttcga
aaagttcaca gtacaagtta atgggaaaga ctacaaaggg tataagattg 360
gatactcagt
ggttgattcg cctagttcat aaaatggaag tagatttctc aaaaaagtta 420
tcatttacta
gaaataatgc aaattataag tttggagatc gagtttttca agtttatacc 480
ataaatagta
gtgagcttga agaagtaaat attaaatata cgaatgttta tcaaattatt 540
tctgaatttt
gtgagaatga ctatcaaaaa tatgaagata tttgtgaaac tgtaacgctt 600
tgctatggag
acgaatatag agaactatcg gaacaatatc ttggtagtct gatagttaat 660
cattatttga
tctctaattt acaaaaagat ttgttgtcag atttttcttg gaacactttt 720
ttgactaaag
ttgaagcaat agatgaagat aaaaaatata taattcctct gaaaaaagtt 780
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
caaaagttta
ttcaagaata ctcagaaata gaaattggtg aaggtattga gaaactgaaa 840
gaaatatatc
aggaaatgtc acaaattctt gagaatgata attatattca aattgattta 900
attagtgata
gtgaaataaa ttttgatgtt aaacaaaagc aacaattaga acatttagct 960
gagtttttag
gaaatacgac aaaatctgta agaagaacat atttggatga ctataaggat 1020
aaatttatcg
aaaaatatgg tgtagatcaa gaagtacaaa taacagaatt atttgattct 1080
acatttggca
taggagctcc atataattat aatcatcctc gaaatgactt ttatgagtcc 1140
gaaccgagta
ctctatacta ttcagaagag gagagagaaa agtacctcag catgtatgta 1200
gaagccgtta
aaaatcataa tgtaattaat cttgacgact tagagtctca ttatcaaaaa 1260
atggacttag
aaaagaaaag tgaacttcaa gggttagaat tatttttgaa tttggcaaag 1320
gagtatgaaa
aagatatttt tattttaggg gatatcgttg gaaataataa tttgggaggg 1380
gcatcaggta
gattttctgc actctctccg gagttaacaa gttatcatag aacgatagta 1440
gattctgtcg
aaagagaaaa tgagaataaa gaaattacat cgtgtgaaat agtatttctt 1500
ccagaaaata
tcagacatgc taacgttatg catacatcaa ttatgaggag gaaagtactt 1560
ccatttttta
caagtacaag tcacaatgaa gttctgttaa ctaatatcta tattggaata 1620
gacgaaaaag
aaaaatttta tgcacgagac atttcaactc aagaggtatt gaaattctac 1680
attacaagca
tgtacaataa aacgttattc agtaatgagc taagatttct ttacgaaatt 1740
tcattagatg
acaagtttgg taatttacct tgggaactta tttacagaga ctttgattat 1800
attccacgtt
tagtatttga cgaaatagta atatctcctg ctaaatggaa aatttgggga 1860
agggatgtaa
atagtaagat gacaataaga gaacttattc aaagcaaaga aattcccaaa 1920
gagttttata
ttgtcaatgg agataataaa gtttatttat cacaggaaaa cccattggat 1980
atggaaattt
tagagtcggc gataaagaag agctcaaaaa gaaaagattt tatagagcta 2040
caagaatatt
ttgaagatga aaatatcata aataaaggag aaaaggggag agttgccgat 2100
gttgtagtgc
cttttattag aacgagagca ttaggtaatg aagggagagc atttataaga 2160
gagaaaagag
tttcggttga acggcgtgaa aaattgccct ttaacgagtg gctttatcta 2220
aagttgtaca
tttctataaa tcgtcaaaat gaatttttac tgtcgtatct tccagatatt 2280
cagaaaatag
tagcaaacct gggtggaaat ctattcttcc taagatatac tgatcctaaa 2340
ccacatatta
gattgcgtat aaaatgttca gatttatttt tagcttacgg atctattctt 2400
gaaatcttaa
aaaggagtcg gaaaaatagg ataatgtcaa cttttgatat ttctatttat 2460
gatcaagaag
tagaaagata tggtggattt gatactttag agttatccga agcaatattt 2520
tgtgccgatt
ctaaaattat tccaaatttg cttacattga taaaagatac taataatgat 2580
tggaaagtcg
atgatgtatc aatcttggtg aattatttat atctgaaatg cttctttcag 2640
aatgataaca
aaaagattct taattttttg aatttagtta gtcctaaaaa ggttaaagaa 2700
aatgtcaatg
aaaagattga acattatctt aagcttctga aagttaataa tctaggtgac 2760
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
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atgacaagaa ttttaaagaa ttaaagcatg ccataaaaaa tttattttta 2820
aaaatgatag
ctcaagattt tgaacttcag aaagtttatt caattattga cagtatcatt 2880
catgtccata
ataaccgact aattggtatt gaacgagata aagagaaatt aatttattac 2940
acacttcaaa
ggttgtttgt ttcggaagaa tacatgaaat ga 2982

<210> 20 <211> 57
<212> PRT

<213> Lactococcus lactis <400> 20

Met Ser Thr Lys Asp Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Lys 1 5 10 15

Asp Ser Gly Ala Ser Pro Arg Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro 20 25 30

Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr 35 40 45

Cys His Cys Ser Ile His Val Ser Lys 50 55

<210> 21 <211> 318
<212> ADN
<213> Lactococcus lactis
<400> 21
atgaatgatt
tattttatca tcggctaaag gaactagttg aatcaagtgg taaatctgca 60
aatcaaatag
aaagggaatt gggttaccct agaaattctt tgaataatta taagttggga 120
ggagaaccct
ctgggacaag attaatagga ctatcagagt attttaatgt gtctccaaaa 180
tatctgatgg
gtataattga tgagcctaat gacagttctg caattaatct ttttaaaact 240
ctaactcaag
aagagaaaaa agaaatgttt ataatttgtc aaaaatggct ttttttagaa 300
tatcaaatag
agttataa 318

<210> 22 <211> 768
<212> ADN
<213> Lactococcus lactis
<400> 22
atgatgaaaa
aaggaatttt tgtaattact atagtgatat ctatagcatt gataattgga 60
ggtttttata
gttataattc taggataaat aatctttcaa aagctgataa aggaaaagaa 120
gttgtaaaaa
atagcagtga aaaaaatcag atagacctta cctataaaaa gtattataaa 180
aatttaccaa
aatcagttca aaataaaata gatgatattt catccaaaaa taaagaagtt 240
actttaactt
gtatttggca atctgattca gttatttctg aacaatttca acaaaactta 300
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
360
420
480
540
600
660
720
768
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
60
120
180
240
300
360
caaaaatatt
agtgaacaat
gttttatatg
actagtaatg
ccctctccac
tctttatcta
gatgaaatga
aataaggttt
atggaaataa
tattggctga
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agcaacttat
cgatttatgg
caaagtatcc
aggggctgtt
ggctagatta
gttttggaac aaaagttgaa ttttaatgat aacaaatttg tggtgttgtg ctatatagac ttctgatgat tattactaaa
atcaaaaata
aaccaagtat
aaccaaaaca
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taccccgtac
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ggagtatata
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tcacttacaa
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aagaagaaca
gttacccaga
gaacattaaa
caaactaa
tggcgaaact
tcctgatgtt
agcctcactg
aatagttcaa
gtttaaacaa
caaaaattct
tgcttcgggg
23
780
ADN
Lactococcus
lactis
<210>
<211>
<212>
<213>
<400> 23
atgcaggaaa
aggttaggtt
ttttttatag
tcggataatt
attaaccaag
tctgatgact
acgcttactg
aaaatattta
aaagcaaaag
gttatagtcg
aaaattaata
tatgctcaaa
aagtcaagtc
cacaggaaca
taatattatt
cctccccagt
cagcagccta
ttattgttag
ctttccaaaa
ttaaatattc
gttcagacgc
ctcaaacaac
gactagtttt
aagaagaaga
tgagtgattt
cgcctagcga
gacgattgat
tagtgcttta
ttacacagcc
cgctggacaa
tccagtcatt
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taatccttac
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accaattagt
aggtttagcc
tattgaagct
taataagaat
ccatgaagta
ttaagaggga
atagtcacaa
tcaactcaac
gtgaccggga
ttagataaag
gcagcaaatc
attgcacaaa
ttgaatgtta
cctaaaccta
attgctttat
ctggggctca
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aatagatcat
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tattagggag
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ttcaaagtaa
aaacaaattc
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tgaaagaatt
cggttcttgg
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caaaaaggaa
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catctacaca
actaccaaat
ggcgaacaca
tttaaatcta
acaagttatt
cgagactgct
tattctatcc
agcgatatct
gtttgataac
tgtaacaacc
atcgggaact
taaaagatag

<210> 24

<211> 696
<212> ADN

<213> Lactococcus lactis <400> 24
atggctaaaa ataaaagaag catagacaac caatcaccta tttctgaaca atatcgtacg gatcaaggga ttaaaagttt tctagtaaca gcgagtgcta atatagctgt tgcttttgca ggtgatcttc gtaaaccgac tgttaacatt accaatattt taatgcatca atcttcgatt
aatcgttata
attcgtacga
tcttcagaag
caacaaggta
acttttaaag
gaagatgcca
ttattaccag
ccattgattt
cagctgcagg
aaaaagtact
tacaaaatag
tacaagggac
tgtcaatcct
taaaatggcg
taaatcaacc
tttaattgat
agtagggtta
aagactttct
5
10
15
20
25
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35
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45
50
55
60
65
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420
480
540
600
660
6 9 6
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
687
60
120
180
240
300
360
420
480
gaaaatctta
caataattac ctctggtcca attccaccta atccatcgga attattagca
tctagtgcaa
tgaagaattt gattgactct gtgtccgatt tctttgatgt tgttttgatt
gatactccac
ctctctctgc agttactgat gctcaaattt tgagtagtta tgtaggagga
gtggttcttg
ttgtacgtgc ctatgaaaca aaaaaagaga gtttagcaaa aacaaaaaaa
atgctggaac
aagttaatgc aaatatttta ggagttgttt tgcatggggt agactcttct
gactcaccgt
cgtattacta ctacggagta gagtaa
<210> 25 <211> 687 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 25 atggaatttt
ttgaggatgc ctcatcacct gaatcggaag agcctaagtt agtagaatta
aaaaattttt
cttatagaga gctaattata aaaagagcaa ttgatatcct aggaggatta
gcaggttcag
ttttatttct tattgcggct gcattgcttt atgtgcctta caaaatgagc
tcaaaaaaag
atcaagggcc aatgttctat aaacaaaaac ggtatggaaa aaacggtaaa
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ttttgaaatt tagaacaatg attcttaatg ccgagcagta tctagaactt
aatccagatg
ttaaagctgc ttaccatgcc aacggcaata agctagaaaa cgatccacgg
gtaacgaaga
ttggctcatt tataagacga cactcaattg atgaactgcc acaatttatc
aatgttctta
aaggggatat ggcattggtt ggcccaagac caattttgct ttttgaagcg
aaagaatatg
gggagcgcct ctcttactta ctcatgtgta aacctggaat tactggttat
tggacaacac
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tacctccagt
accatagtac caaaaacgat atcaagcttc tagtactcac aattgtacaa
agtattaacg
gatcggacgc atattaa
<210> 26 <211> 765 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 26 atgattgata
ttcattgcca tattttaccg ggtatagatg atggagctaa aacttctgga
gatactctga
caatgctgaa atcagcaatt gatgaaggga taacaactat cactgctact
cctcatcata
atcctcaatt taataatgaa tcaccactta ttttgaaaaa agttaaggaa
gttcaaaata
tcattgacga acatcaatta ccaattgaag ttttacccgg acaagaggtg
agaatatatg
gtgatttatt aaaagaattt tctgaaggaa agttactgac agcagcgggc
acttcaagtt
atatattgat tgaatttcca tcaaatcatg tgccagctta tgctaaagaa
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atattcaatt ggagggactt caacctattt tggtccaccc tgagcgtaat
agcggaatca
ttgagaaccc tgatatatta tttgatttta ttgaacaagg agtactaagt
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
540
600
660
720
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60
120
180
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180
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420
480
507
60
cagataacag
cttcaagtgt cactggtcat tttggtaaaa aaatacaaaa gctgtcattt
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<210> 27 <211> 450 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 27 atgaaaatag
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<210> 28 <211> 507 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 28 atgatttttg
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<210> 29 <211> 987 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 29 atggttaaat
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5
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25
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30
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ADN
Lactococcus
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10
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20
25
30
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60
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240
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660
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60
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180
240
300
360
420
480
540
600
<210> 31 <211> 903 <212> ADN <213> Lactococcus lactis <400> 31 atgaatcaaa aaaagaggcg tcattatcgt
aagaaaaaat acacagtact aaaagttatt
tcaattattt
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ctcaaacaga attagactca gtcaaaaccc tttttgaaaa atctctaaaa
taa <210> 32 <211> 1431 <212> ADN <213> Lactococcus lactis <400> 32 ttgagtaaca caggaataaa agtaactaat
aaccaaatac taataagaaa agtaacagtt
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aagctaatac atatacccca caatgtataa cgttgttaat gattactttg 1380
ggaggatttg
taggaatgag agacaggaga aggaaaaaat ataatggtta a 1431
<210> 33 <211> 702 <212> ADN <213> Lactococcus lactis
<400> 33 atgataccaa
aagtaataca ctattgctgg ttcggagggc aacctttacc agaatctgcg 60
ctaaaatgta
ttgaaagttg gagaaggttt tgtccagatt atgaaataaa acaatggtct 120
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atgatgtaaa taaaattcaa tatacaaaag aagcgtacga aaagaaacgt 180
tatgcttttg
tcacggatgt tgcaaggctt gatatcattt atagtgaggg gggcatttat 240
cttgacactg
atgttgaact gataaaacct ttggatgatt tgcttgtcaa tcaagcatat 300
atgggaatgg
aaactgctgg tcgtgtaaat accggccaag gatttggagc tataaaaaac 360
caccaaatag
ttaaagcaaa tttagaggtt tatgctgaac ttgagtttga tggtacgact 420
acttgtgtga
cttacacaac taatttgtta aaaagatttg gtttacaaaa aaaagatatt 480
aaccaggatt
tacaaggaat aactatcctt ccgacagatt atttatgtcc attaagtctt 540
gaaactagga
aattagtaat tacagaaaat acattttcta ttcatcacta tgatggtggt 600
tggaaaaaag
gaaaagataa atttttatct ctaaaaatta aaattcgacg ctggattggt 660
gataactttt
atgagtcgat aaaaacgaag ttgaagggat ag 702

Claims (7)

  1. 10
    15
    20 2. 3.
    25
  2. 4.
    30 5.
  3. 6.
    35
  4. 7.
    40
  5. 8.
    45
  6. 9.
  7. 10.
    50
    55 11.
    REIVINDICACIONES
    Un método de producción de un queso procesado que tiene agentes antimicrobianos naturales, comprendiendo el método:
    fermentar un medio lácteo líquido con una cepa de Lactococcus lactis para producir un componente lácteo cultivado que incluye nisina y exopolisacárido;
    añadir el componente lácteo cultivado a un queso natural o mezcla de quesos naturales con uno o más emulsionantes para producir un queso procesado que tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 25 por ciento de proteína y de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento de grasa;
    en donde el queso procesado incluye una cantidad de nisina, eficaz para evitar la formación de la toxina de C. botulinum determinada por el bioensayo de toxina con ratones, en el queso procesado a los niveles de proteína y grasa del mismo durante aproximadamente 9 días a 30 0C (86 0F); y
    en donde el queso procesado incluye una cantidad de exopolisacárido eficaz para aumentar la fusión del queso procesado y aumentar la firmeza del queso procesado con respecto a un queso procesado sin nisina ni exopolisacárido.
    El método de la reivindicación 1, en donde la nisina y el exopolisacárido en el componente lácteo cultivado se obtienen a partir de la fermentación de la misma cepa de Lactococcus lactis en el medio lácteo líquido.
    El método de la reivindicación 1, en donde el componente lácteo cultivado incluye de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 ppm de nisina y de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.000 ppm del exopolisacárido.
    El método de la reivindicación 1, en donde el queso procesado incluye de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento del componente lácteo cultivado.
    El método de la reivindicación 1, en donde la cepa de Lactococcus lactis es una cepa de Lactococcus lactis aislada que tiene todas las características de identificación de la cepa de Lactococcus lactis de número ATCC PTA-120552.
    El método de la reivindicación 5, en donde la fermentación de la cepa de Lactococcus lactis número ATCC PTA-120552 se lleva a cabo en un medio lácteo líquido de 2 veces a 5 veces concentrado a una temperatura de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 °C y un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 durante un período de aproximadamente 15 a aproximadamente 48 horas.
    El método de la reivindicación 6, en donde el medio lácteo líquido concentrado es una leche concentrada que tiene un total de sólidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 36 por ciento, de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 por ciento de proteína, y de aproximadamente 0 a aproximadamente 16 por ciento de grasa.
    El método de la reivindicación 1, en donde el queso procesado está exento de conservantes artificiales seleccionados del grupo que consiste en ácido sórbico, sorbato potásico, nitritos, y mezclas de los mismos.
    El método de la reivindicación 1, en donde la nisina es nisina A.
    El método de la reivindicación 1, en donde el componente lácteo cultivado incluye nisina A y al menos un gen de un clúster de genes productores de nisina con homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las Id. de sec. n.° 9 a 19 y al menos un gen de un clúster de genes productores de exopolisacárido con homología significativa con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las Id. de sec. n.° 21 a 33.
    El método de la reivindicación 10, en donde el al menos un gen de un clúster de genes productores de nisina y el al menos un gen del clúster de genes productores de exopolisacárido son de la misma cepa de Lactococcus lactis.
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