ES2669727T3

ES2669727T3 - Procedimiento de obtención de heparinas de bajo y muy bajo peso molecular

Info

Publication number: ES2669727T3
Application number: ES13825506.2T
Authority: ES
Inventors: Guillermo Franco Rodriguez; Ibon Gutierro Aduriz
Original assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Current assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: CN104507972A; JP2015523451A; ES2445494B1; PT2881404T; IN2015MN00435A; WO2014020227A1; SI2881404T1; HUE037251T2; DK2881404T3; EP2881404A1; CN108102007A; HRP20180777T1; CY1120872T1; LT2881404T; JP6298052B2; HK1252082A1; EP2881404A4; PL2881404T3; BR112015002358A2; HK1206042A1

Abstract

La presente invención se refiere al procedimiento de preparación de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y de muy bajo peso molecular (HMBPM) que comprende las etapas de transalificación de heparina en heparinato de benzalconio; despolimerización en medio orgánico y transalificación para formar una sal de un metal alcalino o alcalinotérreo. La presente invención también se refiere a un producto obtenido a través del procedimien-to descrito en la presente invención.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de obtención de heparinas de bajo y muy bajo peso molecular OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al procedimiento de preparación de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y de muy bajo peso molecular (HMBPM).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La heparina es un polisacárido de la familia de los glicosaminoglicanos, formado por unidades de ácido urónico (ácido L-idurónico o D-glucurónico) y D-glucosamina, unidas de forma alternada. El ácido L-idurónico puede estar 2- O-sulfatado y la D-glucosamina, puede estar N-sulfatada y/o 6-O-sulfatada, y en menor extensión N-acetilada o 3-O- sulfatada (Mapping and quantification of the major oligosaccharides component of heparin. Linhardt RJ, Rice KG, Kim YS et al. Biochem J 1988; 254: 781-787). La heparina se usa preferentemente como sal de sodio, pero también puede usarse como sal de otros metales alcalinos o alcalinotérreos y se usa principalmente como medicamento antitrombótico y anticoagulante (Anticoagulant therapy for major arterial and venous thromboembolism. Tran HAM, Ginsberg JS. Basic principles and clinical practice. Colman rW, Marder VJ, Clowes AW, George JN, Goldhaber SZ (Ed). Lippincott Williams and Wilkins; 2006: 1673-1688).

Las heparinas se pueden clasificar de acuerdo con su peso molecular en heparinas no fraccionadas (HNF), heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y heparinas de muy bajo peso molecular (HMBPM). Las HBPM y HMBPM provienen de la despolimerización de la molécula original de HNF.

La acción antitrombótica de las HBPM, como ocurre en otras heparinas, necesita la presencia de la antitrombina III (ATIII). La heparina se une a la antitrombina mediante una secuencia pentasacárida específica, formando un complejo ternario HBPM-ATIII-Factor Xa. Esta inhibición se conoce como acción antitrombótica. Por el contrario, en la acción anticoagulante, la neutralización de la trombina requiere la formación de un complejo ternario, HBPM-ATIII- Factor IIa, para lo que se necesitan al menos 18 sacáridos.

La mejora en las HBPM con respecto a la heparina sódica es debida en gran medida al enriquecimiento en el sitio activador de la ATIII de las primeras con respecto a la segunda.

En la heparina no fraccionada así como en las diversas HBPM o HMBPM obtenidas por los procedimientos conocidos de despolimerización (enzimática, ácido nitroso, p-eliminación, etc.) existe una medida que nos permite la determinación de la cantidad de pentasacárido dentro de la estructura general a través de la cuantificación del contenido de una unidad disacárida específica y exclusiva del pentasacárido, correspondiente a ácido D-glucurónico (G) enlazado con N-sulfo-3-O-sulfo-D-glucosamina (ANS, 3S). Esta medida nos permite obtener una buena correlación entre el porcentaje presente de este disacárido y el contenido de pentasacárido en la estructura heparínica y por tanto de actividad anti-FXa de la heparina en cuestión (Low molecular weight heparins: structural differentiation by bidimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Guerrini M, Guglieri S, Naggi A, Sasisekharam R and Torri G. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 2007; 33: 478-487).

En el estado de la técnica se han descrito varios procedimientos para la preparación de HBPM. En el documento de patente EP01955436 se describe un procedimiento de obtención de HBPM mediante un procedimiento que comprende las etapas de conversión de una sal de heparina en sal de heparinato de bencetonio, esterificación del heparinato de bencetonio con cloruro de bencilo, purificación y obtención de la sal de sodio del éster bencílico de la heparina, conversión de la sal del éster bencílico de heparina en sal de bencetonio, despolimerización con una base fuerte en medio orgánico, saponificación del éster y, si es necesario, purificación del producto. En esta invención fue necesaria la formación previa de un producto intermedio de éster bencílico de heparina del que a su vez hubo que generar su heparinato de amonio cuaternario correspondiente, que fue el sustrato donde actuó la base. En la presente invención el procedimiento descrito es más simple, eliminando la necesidad de preparar el producto intermedio de éster bencílico con el lógico ahorro tanto en costes como en tiempos en el procedimiento.

El documento de patente EP1070503 describe un procedimiento para la obtención de heparinas de bajo peso molecular con las siguientes propiedades: peso molecular medio 2.000-4.000 Daltons, actividad anti-FXa entre 100 y 150 Ul/mg, actividad anti-Flla menor o igual que 10 Ul/mg. Estas HBPM se obtienen mediante tratamiento del heparinato de benzalconio con base en medio no acuoso, que consiste en las siguientes etapas: transalificación de heparina sódica en heparinato de benzalconio, primera despolimerización con base en medio orgánico, conversión de la sal de benzalconio en sal de sodio, formación de la sal de benzalconio del producto intermedio obtenido tras la primera despolimerización, segunda despolimerización con base en medio orgánico, transalificación de la sal de benzalconio en sal de sodio y purificación final.

Por último en el documento de patente ES2003197 se describe el mismo procedimiento que en el documento de patente EP1070503 antes mencionado salvo que la sal que se forma es un heparinato de bencetonio. La base que se usa en este procedimiento es Tritón B, hidróxido de amonio cuaternario y en el documento se describe que puede usarse cualquier hidróxido de amonio cuaternario, sin dar ninguna indicación de cómo puede influir la base en este

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procedimiento y explicando que no es un elemento decisivo y que puede usarse cualquiera.

Por lo tanto, por lo que se conoce en el estado de la técnica, se concluye que sería de un gran interés para la industria desarrollar un procedimiento eficiente alternativo para la preparación de HBPM y HMBPM que proporciona un procedimiento que respete al máximo la secuencia pentasacárida específica ATIII y que elimine etapas como la esterificación del heparinato de bencetonio con cloruro de bencilo, la transalificación de la sal del éster bencílico de heparina en sal de bencetonio y la saponificación posterior de dicho éster.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la invención han encontrado un nuevo procedimiento de obtención de HBPM y HMBPM de alto rendimiento y alta regioselectividad, que hace este procedimiento más selectivo. Además el procedimiento de la invención es más sencillo que otros procedimientos conocidos.

Los autores de la invención han comprobado que en los procedimientos de hemisíntesis de HBPM y HMBPM por mecanismos de p-eliminación el uso específicamente como sustrato para la despolimerización de heparinato de benzalconio confiere a la acción de bases fuertes y con impedimento estérico la capacidad de preservar el pentasacárido activador de la ATIII. Este pentasacárido contiene en su estructura un monosacárido trisulfatado y por tanto con mayor impedimento estérico que otras posibles posiciones de escisión de la molécula con monosacáridos con menor grado de sulfatación.

El procedimiento se caracteriza por una primera etapa de transalificación, es decir, de una reacción de conversión de una sal en otra sal, una despolimerización con una base de fosfaceno o una base derivada de la guanidina y una transalificación final.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de las composiciones de la invención que comprende las etapas de:

a) transalificación de heparina de un metal alcalino o alcalinotérreo en heparinato de benzalconio,

b) despolimerización en medio orgánico con la adición de una base de fosfaceno o una base derivada de la guanidina; y

c) transalificación para formar una sal de un metal alcalino o alcalinotérreo.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La presente memoria descriptiva se complementa con un conjunto de figuras que ilustran una realización preferida, que no son limitativas de la invención.

Figura 1: Representación de la región de las señales anoméricas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC del producto descrito en el ejemplo 4 despolimerizado con Tritón B, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O). El espectro muestra cinco picos de correlación que corresponden a los cinco monosacáridos del pentasacárido. ANSred, N-sulfo-D-glucosamina del extremo reductor; I2S, ácido L-idurónico 2-sulfato; ANS,3S, N-sulfo-3-O-sulfo-D- glucosamina; G-(ANS,3S), ácido D-glucurónico que precede a la unidad ANS,3S y ANS-(G), N-sulfo-D-glucosamina que precede al anillo de ácido D-glucurónico. El pico de correlación H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) se ha resaltado con un círculo porque es la señal más característica del pentasacárido y se tomará como referencia para cuantificar la presencia del mismo en varias muestras.

Figura 2: Representación de la región de las señales anoméricas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC del producto descrito en el ejemplo 4 despolimerizado con BEMP, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O). El espectro muestra cinco picos de correlación que corresponden a los cinco monosacáridos del pentasacárido. ANSred, N-sulfo-D-glucosamina del extremo reductor; I2S, ácido L-idurónico 2-sulfato; ANS,3S, N-sulfo-3-O-sulfo-D- glucosamina; G-(ANS,3S), ácido D-glucurónico que precede a la unidad ANS,3S y ANS-(G), N-sulfo-D-glucosamina que precede al anillo de ácido D-glucurónico. El pico de correlación H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) se ha resaltado con un círculo porque es la señal más característica del pentasacárido y se tomará como referencia para cuantificar la presencia del mismo en varias muestras.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En la presente invención, el término "base de fosfaceno o una base derivada de la guanidina" se refiere a bases neutras fuertes y ligeramente nucleófilas, como bases fuertes P1-t-Bu, P2-t-Bu, t-BuP4 y BEMP (2-terc-butilimino-2- dietilamino-1,3-dimetil-perhidro-1,3-diaza-2-fosforina) y TTMG (2-terc-butil-1,1,3,3-tetrametilguanidina) en disolventes apróticos (MeCNpKa BEMP = 27,6, DMSOpKa t-BuP4H+ = 32)

Como se mencionó anteriormente un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de las composiciones de HMBPM y/o HBPm que comprende las etapas de:

a) transalificación de heparina de un metal alcalino o alcalinotérreo en heparinato de benzalconio;

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b) despolimerización en medio orgánico con la adición de una base de fosfaceno o una base derivada de la guanidina;

Si se desea purificar el producto final entre la etapa b) y la etapa c) se añade un peróxido orgánico y/o inorgánico.

Preferentemente la heparina de un metal alcalino o alcalinotérreo de la etapa a) es una heparina no fraccionada de un metal alcalino o alcalinotérreo.

Preferentemente el peróxido usado es peróxido de hidrógeno. Otros ejemplos de peróxidos orgánicos son: peróxido de metiletilcetona, peróxido de benzoílo, peróxido de acetona. Los ejemplos de peróxidos inorgánicos son compuestos que se caracterizan por la presencia de (O2)'2 con metales de los grupos IA y IIA.

Preferentemente el producto obtenido tras la etapa c) se purifica. Preferentemente la purificación del producto se realiza por solución del producto en agua a una concentración comprendida entre el 5% y el 20% (p/v), ajuste de pH entre un valor comprendido entre 6 y 7,5, adición de cloruro de sodio a una concentración comprendida entre el 3% y el 15% (p/v) y precipitación con alcohol. Preferentemente, el producto se disuelve en agua a una concentración comprendida entre el 7,5 y el 12,5% (p/v), ajuste de pH entre un valor comprendido entre 6,5 y 7,25, adición de cloruro de sodio a una concentración comprendida entre el 5% y el 10% (p/v) y precipitación con metanol.

La etapa de despolimerización se realiza en un disolvente orgánico, preferentemente el disolvente orgánico es diclorometano, dicloroetano, cloroformo, dimetilformamida y/o formamida. Particularmente el disolvente orgánico es diclorometano, a una temperatura comprendida entre 20 y 40°C.

La etapa b) de despolimerización se realiza preferentemente en al menos dos adiciones sucesivas de la base. Particularmente se realizan tres adiciones sucesivas de la base.

La relación peso:volumen entre el heparinato de benzalconio y la base para cada adición está entre 1:0,5 y 1:0,05, y preferentemente entre 1:0,3 y 1:0,1.

La relación peso:volumen entre el heparinato de benzalconio y el peróxido de hidrógeno está entre 1:1 y 1:0,01, y preferentemente entre 1:0,2 y 1:0,05.

Preferentemente la transalificación de la etapa c) se realiza por precipitación del medio de reacción con una solución alcohólica de acetato de sodio, preferentemente con una solución al 10% (p/v) de acetato de sodio en metanol.

Un segundo aspecto de la presente invención es un producto obtenido mediante el procedimiento de la invención que contiene una fracción pentasacárida superior y por tanto mayor actividad antitrombótica.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan a continuación sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitaciones a la invención que se reivindica en el presente documento.

EJEMPLO 1

Se disolvieron 100 g de heparina sódica en 725 ml de agua y se añadió una solución de 880 ml de cloruro de benzalconio (50% p/v) en agua. El producto se filtró, se lavó con agua y se liofilizó. Se obtuvieron 233 g de heparinato de benzalconio.

Se disolvieron 10 g de heparinato de benzalconio obtenido en la etapa anterior en 30 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. A esta solución se le añadió 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetil-perhidro-1,3-diaza-2-fosforina, BEMP, en tres porciones:

-1,72 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

-1,72 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas.

-1,72 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

A la solución se le añadió 1 ml de peróxido de hidrógeno y se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas y

posteriormente se precipitó añadiendo 60 ml de una solución de acetato de sodio en metanol (10% p/v). El precipitado se recogió por centrifugación y se lavó con metanol. El producto obtenido se disolvió en 5 ml de agua, se neutralizó, se añadió cloruro de sodio hasta una concentración del 10% p/v y se precipitó con 125 ml de metanol. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó en horno de vacío a 35°C. Se obtuvieron 3,39 g.

Se disolvieron 2 g del producto despolimerizado en 14,5 ml de agua y se añadieron 17,6 ml de una solución de cloruro de benzalconio al 50% p/v en agua. El producto se filtró, se lavó con agua y se liofilizó. Los 4,84 g de

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producto obtenidos se disolvieron en 14,5 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. Se añadieron 0,83 ml de BEMP y se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas. Transcurrido ese tiempo se precipitó con 26 ml de una solución de acetato de sodio en metanol (10% p/v). El precipitado se recogió por centrifugación y se lavó con metanol. El producto obtenido se disolvió en 5 ml de agua, se neutralizó, se añadió cloruro de sodio hasta una concentración del 10% p/v y se precipitó con 50 ml de metanol. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó en horno de vacío a 35°C. Se obtuvieron en total 1,32 g de producto (rendimiento 52,1%). Las características del producto obtenido fueron las siguientes:

- Peso molecular medio: 2.903 Da.

- Actividad anti-FXa: 193 Ul/mg.

- Actividad anti-Flla: 9,3 Ul/mg.

EJEMPLO 2

Se disolvieron 50 g de heparina sódica en 365 ml de agua y se añadió una solución de 221 g de cloruro de benzalconio al 50% p/v en agua. El producto se filtró, se lavó con agua y se liofilizó. Se obtuvieron 128,18 g de heparinato de benzalconio.

Se disolvieron 5 g de heparinato de benzalconio obtenido en la etapa anterior en 15 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. A esta solución se le añadió BEMP en tres porciones:

- 0,86 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

- 0,86 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas

- 0,86 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

A la solución se le añadieron 0,50 ml de peróxido de hidrógeno y se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas y posteriormente se precipitó con 30 ml de una solución de acetato de sodio en metanol (10% p/v). El precipitado se recogió por centrifugación y se lavó con metanol. El producto obtenido se disolvió en 2,5 ml de agua, se neutralizó, se añadió cloruro de sodio hasta una concentración del 10% p/v y se precipitó con 75 ml de metanol. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó en horno de vacío a 35°C. Se obtuvieron 1,40 g de producto.

Se disolvieron 1,40 g del producto despolimerizado en 10 ml de agua y se añadieron 6,18 g de una solución de cloruro de benzalconio al 50% p/v en agua. El producto se filtró, se lavó con agua y se liofilizó. Se obtuvieron 3,40 g de heparinato de benzalconio y se disolvieron en 10 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. A esta solución se le añadió BEMP en tres porciones:

- 0,58 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

- 0,58 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas.

- 0,58 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

A la solución se le añadieron 0,34 ml de peróxido de hidrógeno y se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas y posteriormente se precipitó con 20 ml de una solución de acetato de sodio en metanol (10% p/v). El precipitado se recogió por centrifugación y se lavó con metanol. El producto obtenido se disolvió en 1,7 ml de agua, se neutralizó y se añadió cloruro de sodio hasta una concentración del 10% p/v y se precipitó con 50 ml de metanol. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó en horno de vacío a 35°C. Se obtuvieron 0,85 g de producto (rendimiento 43,6%). Las características del producto obtenido fueron las siguientes:

- Peso molecular medio: 2.787 Da.

-Actividad anti-FXa: 121,5 Ul/mg.

- Actividad anti-Flla: 8,2 Ul/mg.

EJEMPLO 3

Se disolvieron 0,50 g del producto obtenido en el Ejemplo 2 en 5 ml de agua, se neutralizó, se añadió cloruro de sodio hasta una concentración del 10% p/v y se precipitó con 6 ml de metanol. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó en horno de vacío a 35°C. Se obtuvieron 0,13 g de producto. Las características del producto obtenido fueron las siguientes:

- Peso molecular medio: 3.534 Da.

-Actividad anti-FXa: 125,2 Ul/mg.

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-Actividad anti-Flla: 19,4 Ul/mg.

Se repitieron los mismos pasos que en el párrafo anterior pero cambiando la base BEMP por TTMG Las características del producto obtenido fueron las siguientes:

- Peso molecular medio: 3.704 Da.

-Actividad anti-FXa: 118,5 Ul/mg.

-Actividad anti-Flla: 16,2 Ul/mg.

EJEMPLO 4. Ejemplo comparativo

En este ejemplo se investigó el efecto del cambio de la base en el procedimiento de la invención. Se realizó el mismo ensayo con Tritón B y con BEMP, para demostrar la influencia del uso de una base de fosfaceno en el procedimiento de la invención.

Se disolvieron 50 g de heparina sódica en agua y se añadieron 221 g de cloruro de benzalconio en agua (50% p/v). El producto se filtró, se lavó con agua y se liofilizó. Se obtuvieron 128,18 g de heparinato de benzalconio.

Se disolvieron 25 g de heparinato de benzalconio obtenido en la etapa anterior en 75 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. A esta solución se le añadió Tritón B, en tres porciones:

- 6,25 ml de Tritón B. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

- 6,25 ml de Tritón B. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas.

- 6,25 ml de Tritón B Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

A la solución se le añadieron 2,5 ml de peróxido de hidrógeno y a continuación se purificó el producto para obtener la sal de sodio correspondiente. El producto obtenido se transalificó para obtener la sal de benzalconio, de acuerdo con las condiciones y proporciones descritas anteriormente.

Se disolvieron 15,68 g de heparinato de benzalconio obtenido en la etapa anterior en 47 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. A esta solución se le añadió Tritón B, en tres porciones:

- 3,92 ml de Tritón B. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

- 3,92 ml de Tritón B. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas.

- 3,92 ml de Tritón B Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

El producto se caracterizó por:

- Peso molecular medio: 2.387 Da.

- Actividad anti-FXa: 94 Ul/mg.

Se realizó el mismo ensayo pero usando la base BEMP para la despolimerización.

Se disolvieron 5 g de heparinato de benzalconio en 15 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. A esta solución se le añadió BEMP, en tres porciones:

- 0,86 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

- 0,86 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas.

- 0,86 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

A la solución se le añadieron 0,5 ml de peróxido de hidrógeno y a continuación se purificó para obtener la sal de sodio correspondiente. El producto obtenido se transalificó para obtener la sal de benzalconio, de acuerdo con las condiciones y proporciones descritas anteriormente.

Se disolvieron 3,40 g de heparinato de benzalconio obtenido en la etapa anterior en 10 ml de diclorometano y se calentó a 35°C. A esta solución se le añadió BEMP, en tres porciones:

- 0,58 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

- 0,58 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 16 horas.

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- 0,58 ml de BEMP. Se mantuvo la reacción a 35°C durante 8 horas.

El producto obtenido se caracterizó por:

- Peso molecular medio: 2.787 Da.

-Actividad anti-FXa: 121,5 Ul/mg.

Este ejemplo comparativo muestra que las bases de fosfaceno en el procedimiento aumentan de una forma muy significativa la actividad anti-FXa del producto obtenido.

El contenido medio de monosacáridos en las muestras se determinó por Resonancia Magnética Nuclear (RMN), usando experimentos 13C-1H HSQC bidimensionales cuantitativos, según el procedimiento descrito por Marco Guerrini y col. El incremento de resolución que se consigue con la segunda dimensión permite cuantificar las señales que se superponen en el espectro unidimensional, siendo esta técnica de especial interés para estudiar hidratos de carbono complejos. Estas moléculas presentan graves problemas de superposición en los espectros unidimensionales de 1H que dificultan la determinación de las áreas de picos aislados en 1D para su cuantificación.

La cantidad de la unidad de ácido-D-glucurónico enlazado con N-sulfo-3-O-sulfo-D-glucosamina (G-(ANS,3S)) presente en GAG obtenidos a partir de heparina natural puede relacionarse directamente con su actividad anti-Xa, tal como describen M. Guerrini y col. Este disacárido pertenece al pentasacárido responsable de la interacción con la antitrombina III y sólo se detecta en las secuencias activas. La señal de correlación del carbono anomérico de este tipo de ácido glucurónico con el hidrógeno directamente unido aparece en una región característica y libre de superposición en el espectro HSQC y por tanto puede usarse para cuantificar la proporción del pentasacárido en la muestra.

Los espectros 13C-1H HSQC del producto obtenido por despolimerización con Tritón B y BEMP se muestran respectivamente en las Figuras 1 y 2. La señal de correlación 1H-13C del protón anomérico correspondiente a la unidad de ácido glucurónico del pentasacárido se ha resaltado con un círculo.

La medida de la intensidad de esta señal en los espectros permite determinar la proporción de pentasacárido.

Tabla 1. Diferentes fracciones con Tritón B y BEMP.

FRACCIONES: EJEMPLO 4. DESPOLIMERIZACIÓN CON TRITÓN B, (%) EJEMPLO 4. DESPOLIMERIZACIÓN CON BEMP(%)

ANS: 37,0 37,1

ANAc: 2,5 1,8

I2S: 28,9 28,7

I: 1,4 2,3

G: 4,7 5,7

ANS, 3S: 1,4 2,7

G-ANS 3S: 1,6 2,0

Los resultados muestran que el uso de la base BEMP en lugar de Tritón B confiere una mayor selectividad en la reacción de despolimerización con una mayor preservación del pentasacárido activador de la ATIII, de manera que el % de ANS,3S aumenta en casi el 93% y el % de G-ANS,3S aumenta en el 25% en el producto despolimerizado con BEMP en comparación con el obtenido con Tritón B. Esto garantiza que dicha fracción pentasacárida se preserva claramente en los productos obtenidos mediante el procedimiento de la invención, proporcionando una actividad mejorada en estos productos y asegurando el rendimiento del procedimiento de la invención como consecuencia del aumento de la selectividad de la reacción.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de obtención de heparina de muy bajo peso molecular (HMBPM) y heparina de bajo peso molecular (HBPM) caracterizado porque comprende las etapas de:

a) transalificación de heparina de un metal alcalino o alcalinotérreo en heparinato de benzalconio;

b) despolimerización en medio orgánico con la adición de una base de fosfaceno o una base derivada de la guanidina; y

c) transalificación para formar una sal de un metal alcalino o alcalinotérreo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que entre la etapa b) y la etapa c) se trata el producto obtenido en la etapa b) con peróxido de hidrógeno.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en el que el producto obtenido tras la etapa c) se purifica.
4. Procedimiento según la reivindicación 3 en el que el producto obtenido tras la etapa c) se purifica mediante solución en agua a una concentración comprendida entre el 7,5% y el 12,5% (p/v), ajuste de pH entre un valor comprendido entre 6,5 y 7,25, adición de cloruro de sodio a una concentración comprendida entre el 5% y el 10% (p/v) y precipitación con metanol.
5. Procedimiento según la reivindicación 1a 4 en el que la etapa de despolimerización se realiza en diclorometano, a una temperatura comprendida entre 20 y 40°C.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que en la etapa b) la benzalconio y la base para cada adición está entre 1:0,5 y 1:0,05.
7. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que en la etapa b) la benzalconio y la base para cada adición está entre 1:0,3 y 1:0,1.
8. Procedimiento según la reivindicación 2 en el que en la etapa c) la benzalconio y el peróxido de hidrógeno está entre 1:1 y 1:0,01.
9. Procedimiento según la reivindicación 2 en el que en la etapa c) la benzalconio y el peróxido de hidrógeno está entre 1:0,2 y 1:0,05.
10. Procedimiento de obtención de heparina de muy bajo peso molecular (HMBPM) y heparina de bajo peso molecular (HBPM) caracterizado porque consiste en las etapas de:

a) translificación de heparina de un metal alcalino o alcalinotérreo en heparinato de benzalconio;

b) despolimerización en un disolvente seleccionado entre: diclorometano, dicloroetano, cloroformo, dimetilformamida y/o formamida a una temperatura entre 20°C y 40°C con la adición de una base de fosfaceno o una base derivada de guanidina, en una o dos adiciones sucesivas en la que la relación peso:volumen entre el heparinato de benzalconio y la base para cada adición está entre 1:0,5 y 1:0,05; y

c) transalificación para formar una sal de un metal alcalino o alcalinotérreo y en la que entre la etapa b) y la etapa c), el producto obtenido en la etapa b) se trata con peróxido inorgánico.
11. Heparina de bajo peso molecular (HBPM) o heparina de muy bajo peso molecular (HMBPM) obtenida por el procedimiento según la reivindicación 10.

relación peso:volumen entre el heparinato de relación peso:volumen entre el heparinato de relación peso:volumen entre el heparinato de relación peso:volumen entre el heparinato de