CN108102007A - 低分子量和极低分子量肝素获取工艺 - Google Patents

低分子量和极低分子量肝素获取工艺 Download PDF

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Abstract

本申请涉及低分子量和极低分子量肝素获取工艺。本发明指的是涵盖肝素‑苯索氯胺盐中肝素钠盐化、有机介质解聚和形成碱性金属盐或碱土盐的盐化阶段的低分子量(HBPM)和极低分子量(HMBPM)肝素制备工艺。也可以指通过本发明中所述工艺获取的产物。

Description

低分子量和极低分子量肝素获取工艺
本申请是申请日为2013年8月2日、申请号为“201380041068.8”、发明名称为“低分子量和极低分子量肝素获取工艺”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/ES2013/070575的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明指的是低分子量(HBPM)和极低分子量(HMBPM)肝素制备工艺。
背景技术
肝素是一种由糖醛酸(L-艾杜糖醛苷或D-葡萄糖醛酸)和D-氨基葡萄糖交替组成的黏多糖硫酸脂。L-艾杜糖醛苷可以是2-O-硫酸化的，D-氨基葡萄糖可以为N-硫酸化和/或6-O-硫酸化的，小范围内也可以是N-乙酰化或3-O-硫酸化的(《肝素寡糖主要成分量化和映射》Linhardt RJ，Rice KG，Kim YS et al.Biochem J 1988；254：781-787)。肝素优先作为钠盐而使用，但也可以作为其他碱性金属盐或碱土盐而使用，并且主要作为抗血栓和抗凝血药物而应用(《主要动静脉血栓栓塞抗凝治疗》Tran HAM，Ginsberg JS。《基本原则和临床实践》Colman RW，Marder VJ，Clowes AW，George JN，Goldhaber SZ(Ed)，LippincottWilliams和Wilkins；2006：1673-1688)。
根据分子量，肝素可分为普通肝素(HNF)、低分子量肝素(HBPM)和极低分子量肝素(HMBPM)。HBPM和HMBPM通过HNF原分子的解聚获得。
如在其他类型肝素中出现的一样，HBPM的抗血栓作用需要抗凝血酶III(ATIII)。通过特定的糖胺序列，肝素与抗凝血酶相连，形成HBPM-ATIII-Xa因子三元复合物。该抑制作用也称为抗血栓作用。相反的，在抗凝血作用中，凝血酶中和需要HBPM-ATIII-IIa因子三元复合物的形成，为此，至少需要18种糖类。
HBPM中肝素钠的改进很大程度上是因为与抗凝血作用相比，抗血栓作用中ATIII的活性较强。
另一方面，在普通肝素以及通过解聚方法获得的多种HBPM或HMBPM(酶、亚硝酸、β消除等)中，存在能够让我们通过具体的双糖单位成分量化法确定多糖量的方法，即结合到N-磺基-3-O-磺基-D-葡糖胺(ANS，3S)中的D-葡糖醛酸(G)。该方法可获得肝素结构中双糖占比与多糖成分间的比例关系，即确定相关肝素的抗FXa活性(低分子量肝素：二维核磁共振光谱结构分化。Guerrini M，Guglieri S，Naggi A，Sasisekharam R和Torri G。血栓与止血学术研讨会2007；33：478-487)。
在现有技术中已经记录了多种HBPM制备方法。在EP01955436专利文件中描述了通过涵盖肝素-苯索氯胺盐中肝素盐盐化、肝素-苄索氯铵盐盐化、肝素苄酯钠盐提纯和获取、苄索氯铵盐中肝素钠盐化、有机介质中的强碱解聚、苄酯皂化以及产物提纯(若有需要的话)阶段的工艺获取HBPM的过程。在本发明中生成相应的季铵盐肝素来取代需要事先形成的肝素苄酯中间体，季铵盐肝素提取物可作为基体。本发明中所描述的工艺是最简单的，可省略制备肝素苄酯中间体的步骤，既节省费用也节约了生产时间。
EP1070503专利文件描述了具备以下特性的低分子量肝素获取工艺，平均分子量：2000-4000D，抗FXa活性：100-150UI/mg，抗FIIa活性小于或等于10UI/mg。通过以非水性介质为基体的苄索肝素处理获得HBPM的具体步骤为：肝素-苯索氯胺盐中肝素钠盐化、以有机介质为基础的初级解聚、苄酯钠盐盐化、初级解聚后获得的中间体苄酯钠盐形成、以有机介质为基础的二级解聚、苄酯钠盐盐化和最后的提纯。
除非所形成的盐是苯索肝素盐，否则在ES2003197专利文件中也将描述此前EP1070503专利文件中所建议的相同工艺。本工艺所使用的基体为Triton B-氢氧化四烃铵，在文件中讲述到可使用任何氢氧化四烃铵化物，但没有教授如何在本工艺中影响基体并且解释在使用任何氢氧化四烃铵时，该物质不是具有决定性的元素。
同时，通过对现有技术的了解，在该行业中具备较大的兴趣开发HBPM和HMBPM制备的有效工艺，该工艺可获得最大的ATIII糖胺序列，并且省略掉肝素-苄索氯铵盐盐化、苄索氯铵盐中肝素钠盐化以及苄酯皂化阶段。
发明内容
发明者已经发现了一个高收益和高选择性的HBPM和HMBPM获取新工艺，从而获得最具选择性的制备过程。此外，与其他熟知的工艺相比，所发明的工艺是最简单的。
发明人员已经证实在通过β消除机制进行的HBPM和HMBPM半合成工艺中，苯索肝素盐解聚提取物的专门作用为强碱作用，可以阻止ATIII活性糖胺的保留，因为在其结构中糖胺呈现为三硫酸单糖，与含有较低硫化度单糖的其他分子破裂结构相比，更能阻碍活性糖胺的保留。
工艺的特点是第一阶段为盐化(即一种盐转化为另一种盐的反应)、使用磷基或胍基进行的解聚以及最终的盐化。
因此，发明的第一阶段指的是涵盖以下阶段的发明成分获取工艺：
a)苯索肝素盐中碱性金属肝素钠或碱土肝素钠的盐化
b)添加磷基或胍基的有机介质解聚；以及
c)形成碱性金属盐或碱土盐的盐化
附图说明
以一组发明样例(但不仅限于此)的图片、插图描述本文件。
图1：使用Triton B解聚的样本4中所述产物的13C-1H HSQC光谱异头信号区域(H1-C1关系)展现，在氘化水(D2O)中记录为298K。在光谱中我们可以观察到组成糖胺的5个单糖的相关5个关系峰值。ANSred、还原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-O硫酸化的L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-O-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、来自ANS、3S和ANS-(G)的D-葡糖醛酸、来自D-葡糖醛酸环的N-磺基-D-葡糖胺。画圈突显G-(ANS，3S)单元的H1-C1关系峰值，因为这是最具糖胺特点的信号，并且可视为参考以便在多个样本中确定该信号出现的数量。
图2：使用BEMP解聚的样本4中所述产物的13C-1H HSQC光谱异头信号区域(H1-C1关系)展现，在氘化水(D2O)中记录为298K。在光谱中我们可以观察到组成糖胺的5个单糖的相关5个关系峰值。ANSred、还原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-O硫酸化的L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-O-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、来自ANS、3S和ANS-(G)的D-葡糖醛酸、来自D-葡糖醛酸环的N-磺基-D-葡糖胺。画圈突显G-(ANS，3S)单元的H1-C1关系峰值，因为这是最具糖胺特点的信号，并且可视为参考以便在多个样本中确定该信号出现的数量。
具体实施方式
在本发明中，“磷基或胍基”术语指的是强亲核性中性基团，如P1-t-Bu，P2-t-Bu，t-BuP4和BEMP(2-叔-丁基亚氨基-2-二乙胺基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二吖磷英)和TTMG(2-叔-丁基-1，1，3，3-四甲基胍)，非介子溶剂中的强碱(MeCNpKa BEMP＝27.6，DMSOpKa t-BuP4H+＝32)。
如上所述，发明的第一方面指的是涵盖以下阶段的HMBPM和/或HBPM成分获取工艺：
a)苯索肝素盐中碱性金属肝素钠或碱土肝素钠的盐化
b)添加磷基或胍基的有机介质解聚；以及
c)形成碱性金属盐或碱土盐的盐化
最终产物需要在阶段b)和阶段c)中进行净化时，需添加有机和/或无机过氧化物。
阶段a)中的碱性金属肝素盐或碱土肝素盐最好是碱性金属普通肝素盐或碱土普通肝素盐。
所使用的过氧化物最好是过氧化氢。其他有机过氧化物范例为：过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酰、过氧化丙酮。无机过氧化物范例为含有(O2)-2和IA及IIA组金属物的复合物。
阶段c)后获得的产物需要进行净化处理。最好通过浓度为5-20％(p/v)，pH值为6-7.5，氯化钠浓度为3-15％(p/v)的水溶液，并且使用甲醇沉淀法进行提纯。通过浓度为7.5-12.5％(p/v)，pH值为6.5-7.25，氯化钠浓度为5-10％(p/v)的水溶液，使用甲醇沉淀法进行产物稀释。
使用有机溶剂进行解聚，有机溶剂最好为二氯甲烷，二氯乙烷，氯仿，二甲基甲酰胺和/或甲酰胺。在20-40℃温度环境下所使用的有机溶剂优先考虑二氯甲烷。
至少连续添加2次碱性物进行阶段b)的解聚。最好连续添加3次。
重量比例：苯索肝素盐和每个添加物基体之间的体积比为1∶0.5和1∶0.05，最好为1∶0.3和1∶0.1。
重量比例：苯索肝素盐和过氧化氢之间的体积比为1∶1和1∶0.01，最好为1∶0.2和1∶0.05。
使用醋酸钠醇类溶液中反应介质沉降方法进行阶段c)的盐化，最好在10％(p/v)醋酸钠甲醇溶液中进行。
本发明的第二阶段为通过含有大比例糖胺和较大的抗血栓活性的发明工艺所获得的产物。
范例
接下来所示具体范例用于说明本发明的属性。这些范例仅用于解释性说明，不限制本发明的描述内容。
范例1
100g的肝素钠稀释在725ml的水中，在该溶液中添加880ml的苯扎氯铵/50％p/v水。过滤产物、使用水进行清洗并且冷冻干燥。可获得233g苯索肝素盐。
将在上一阶段获得的10g苯索肝素盐稀释在30ml的二氯甲烷中，并且加热到35℃。在该溶液中按3次份额添加BEMP(2-叔-丁基亚氨基-2-二乙胺基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二吖磷英)：
-1.72ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
-1.72ml的BEMP。在35℃下维持16小时的反应活性。
-1.72ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
在溶液中添加1ml过氧化氢，在35℃下维持16小时的反应活性，此后在60ml的醋酸钠甲醇(10％p/v)溶液中进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗。所获得的产物在5ml的水中进行稀释、中和、添加氯化钠，直至达到10％p/v的浓度，并且使用125ml的甲醇溶剂进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35℃的温度下在真空炉中进行干燥。获得3.39g产物。
将2g解聚产物在14.5ml的水中稀释，在所获得的溶液中添加17.6ml的苯扎氯铵/50％p/v水。过滤产物、使用水进行清洗并且冷冻干燥。所获得的4.84g产物稀释在14.5ml的二氯甲烷中，并且加热到35℃。在该溶液中添加0.83ml的BEMP并且在35℃下维持16小时的反应活性。16小时后在26ml的醋酸钠甲醇(10％p/v)溶液中进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗。所获得的产物在5ml的水中进行稀释、中和、添加氯化钠，直至达到10％p/v的浓度，并且使用50ml的甲醇溶剂进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35℃的温度下在真空炉中进行干燥。获得1.32g产物(52.1％收益)。所获得的产物特点如下所示：
-介质分子量：2903Da.
-抗FXa活性：193UI/mg.
-抗FIIa活性：9.3UI/mg.
范例2
将50g的肝素钠稀释在365ml的水中，在该溶液中添加221g的苯扎氯铵/50％p/v水。过滤产物、使用水进行清洗并且冷冻干燥。可获得128.18g苯索肝素盐。
将在上一阶段获得的5g苯索肝素盐稀释在15ml的二氯甲烷中，并且加热到35℃。在该溶液中按3次份额添加BEMP：
-0.86ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
-0.86ml的BEMP。在35℃下维持16小时的反应活性。
-0.86ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
在溶液中添加0.50ml过氧化氢，在35℃下维持16小时的反应活性，此后在30ml的醋酸钠甲醇(10％p/v)溶液中进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗。所获得的产物在2.5ml的水中进行稀释、中和、添加氯化钠，直至达到10％p/v的浓度，并且使用75ml的甲醇溶剂进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35℃的温度下在真空炉中进行干燥。获得1.40g产物。
将1.40g解聚产物在10ml的水中稀释，在所获得的溶液中添加6.18g的苯扎氯铵/50％p/v水。过滤产物、使用水进行清洗并且冷冻干燥。所获得的3.40g苯索肝素盐稀释在10ml的二氯甲烷中，并且加热到35℃。在该溶液中按三次份额添加BEMP：
-0.58ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
-0.58ml的BEMP。在35℃下维持16小时的反应活性。
-0.58ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
在溶液中添加0.34ml过氧化氢，在35℃下维持16小时的反应活性，此后在20ml的醋酸钠甲醇(10％p/v)溶液中进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗。将所获得的产物在1.7ml的水中进行稀释、中和、添加氯化钠，直至达到10％p/v的浓度，并且使用50ml的甲醇溶剂进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35℃的温度下在真空炉中进行干燥。获得0.85g产物(43.6％收益)。所获得的产物特点如下所示：
-介质分子量：2787Da.
-抗FXa活性：121.5UI/mg.
-抗FIIa活性：8.2UI/mg.
范例3
将在范例2中获得的0.50g产物稀释在5ml的水中，进行中和，添加氯化钠，直至浓度达到10％p/v，并且使用6ml甲醇溶剂进行沉淀。通过离心方式筛出沉淀物，使用甲醇清洗并且在35℃的温度下在真空炉中进行干燥。获得0.13g产物。所获得的产物特点如下所示：
-介质分子量：3,534Da.
-抗FXa活性：125.2UI/mg.
-抗FIIa活性：19.4UI/mg.
重复范例2所述步骤，但要使用TTMG基体，而不是BEMP基体。
所获得的产物特点如下所示：
-介质分子量：3704Da.
-抗FXa活性：118.5UI/mg.
-抗FIIa活性：162UI/mg
范例4.比较性范例
在本范例中研究的是在发明工艺中改变基体的效果。使用Triton B和BEMP分别进行相同的实验，以便展示在发明工艺中使用磷基的影响情况。
将50g的肝素钠稀释在水中，在该溶液中添加221g的苯扎氯铵/50％p/v水。过滤产物、使用水进行清洗并且冷冻干燥。可获得128.18g苯索肝素盐。
将在上一阶段获得的25g苯索肝素盐稀释在75ml的二氯甲烷中，并且加热到35℃。在该溶液中按3次份额添加Triton B：
-6.25ml的Triton B。在35℃下维持8小时的反应活性。
-6.25ml的Triton B。在35℃下维持16小时的反应活性。
-6.25ml的Triton B。在35℃下维持8小时的反应活性。
在溶液中添加2.5ml的过氧化氢，接下来进行净化以便获得相关钠盐。所获得的产物进行盐化，从而在上述条件和比例下获得苯索肝素盐。
将在上一阶段获得的15.68g苯索肝素盐稀释在47ml的二氯甲烷中，并且加热到35℃。在该溶液中按3次份额添加Triton B：
-3.92ml的Triton B。在35℃下维持8小时的反应活性。
-3.92ml的Triton B。在35℃下维持16小时的反应活性。
-3.92ml的Triton B.在35℃下维持8小时的反应活性。
获得的产物特点如下：
-介质分子量：2387Da.
-抗FXa活性：94UI/mg.
使用BEMP基体解聚进行相同的实验。
将5g苯索肝素盐稀释在15ml的二氯甲烷中，加热到35℃。在该溶液中按3次份额添加BEMP：
-0.86ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
-0.86ml的BEMP。在35℃下维持16小时的反应活性。
-0.86ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
在溶液中添加0.5ml的过氧化氢，接下来进行净化以便获得相关钠盐。所获得的产物进行盐化，从而在上述条件和比例下获得苯索肝素盐。
将在上一阶段获得的3.40g苯索肝素盐稀释在10ml的二氯甲烷中，并且加热到35℃。在该溶液中按3次份额添加BEMP：
-0.58ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
-0.58ml的BEMP。在35℃下维持16小时的反应活性。
-0.58ml的BEMP。在35℃下维持8小时的反应活性。
所获得的产物特点如下：
-介质分子量：2787Da.
-抗FXa活性：121.5UI/mg.
在该比较性范例中可以看出工艺中的磷基明显增加了产物的抗FXa活性。
样本中可通过核磁共振(RMN)技术，使用13C-1H HSQC定量二维实验(异核单量子相干)，根据Marco Guerrini等人所述方法确定单糖平均含量。通过二维方法提高分辨率，可确定一维光谱中重叠信号的数量，因而该技术最适用于研究复合碳水化合物。这些分子在1H一维光谱中呈现出较严重的重叠问题，这就难以确定1D中隔绝峰值的区域，进而难以定量。
N-磺基-3-O-硫酸化的D-氨基葡萄糖G-(ANS，3S)中的D-葡糖醛酸单元数量呈现在从天然肝素中获取的GAG中，其数量多少直接与GAG的抗Xa活性相关，如M.Guerrini等人所述。该糖属于与III抗凝血酶具备相互作用的糖胺，并且仅在活跃序列中可以检测到。该葡糖醛酸异头碳与直接相连的氢化物的关系信号出现在典型区域内，并且不会在HSQC光谱中重叠，因此可使用其确定样本中糖胺的比例分量。
使用Triton B和BEMP解聚获得的产物的13C-1H HSQC光谱分别在图1和图2中所示，在图片中多糖葡糖醛酸单元的相应异头质子1H-13C的关系信号通过圆圈突显出来。
光谱中该信号的强度数值可使我们确定糖胺比例。
表1.使用Triton B和BEMP的不同成分比例
由此得知，相比使用Triton B，若使用BEMP基体，在存在较大ATIII活性糖胺的解聚反应中可具备最大选择性，与使用Triton B解聚获得的产物相比，在使用BEMP解聚的产物中ANS，3S的百分比(％)几乎增加为93％，G-ANS，3S百分比(％)为25％，因为增加了反应选择性，因此可确保上述糖胺成分可通过发明工艺明显存留在所获得的产物中，从而在上述产物中提供较好的活性，并确保本发明工艺的效率。
本发明还涉及以下实施方案：
1.HMBPM和/或HBPM成分获取步骤，因为涵盖以下阶段：
a)肝素-苯索氯胺盐中碱性金属肝素盐或碱土肝素盐的盐化；
b)通过添加磷基或胍基进行的有机介质解聚；以及
c)形成碱性金属盐或碱土盐的盐化。
2.根据实施方案1所进行的获取步骤，因为阶段b)到阶段c)谈论的是在阶段b)获得的过氧化氢产物。
3.根据实施方案1和2中任意一条进行的获取步骤，因为阶段c)后获得的产物需要进行提纯。
4.根据实施方案3所进行的获取步骤，因为阶段c)后获得的产物需通过浓度为7.5-12.5％(p/v)，pH值为6.5-7.25，氯化钠浓度为5-10％(p/v)的水溶液，并且使用甲醇沉淀法进行提纯。
5.根据实施方案1-4所进行的获取步骤，因为需要在20-40℃的温度下，在二氯甲烷中进行解聚。
6.根据实施方案1所进行的获取步骤，因为在阶段b)中苯索肝素盐与每个添加基体的重量：体积比为1∶0.5和1∶0.05。
7.根据实施方案1所进行的获取步骤，因为在阶段b)中苯索肝素盐与每个添加基体的重量：体积比为1∶0.3和1∶0.1。
8.根据实施方案2所进行的获取步骤，因为在阶段c)中苯索肝素盐与过氧化氢的重量：体积比为1∶0.1和1∶0.01。
9.根据实施方案2所进行的获取步骤，因为在阶段c)中苯索肝素盐与过氧化氢的重量：体积比为1∶0.2和1∶0.05。
10.通过实施方案1-9所获得的产物。

Claims (9)

1.用于获得HMBPM和/或HBPM的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)碱金属或碱土金属的肝素向苯甲烃铵肝素盐的盐交换；
b)通过添加磷腈碱或由胍衍生的碱在有机介质中的解聚；以及
c)形成碱金属或碱土金属的盐的盐交换，并且
其中在步骤b)与步骤c)之间，用过氧化氢处理在步骤b)中获得的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将在步骤c)之后获得的所述产物纯化。
3.根据权利要求2所述的方法，其中通过将在步骤c)之后获得的产物以7.5％w/v-12.5％w/v的浓度溶解于水中，将pH调节至6.5和7.25之间的值，加入氯化钠至浓度为5％w/v-10％w/v并且使用甲醇沉淀。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在20℃与40℃之间的温度下，在二氯甲烷中进行所述解聚的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中，苯甲烃铵肝素盐与用于每次添加的碱之间的重量∶体积比为1g∶0.5ml至1g∶0.05ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中，苯甲烃铵肝素盐与用于每次添加的碱之间的重量∶体积比为1g∶0.3ml至1g∶0.1ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)与步骤c)之间，苯甲烃铵肝素盐与过氧化氢之间的重量∶体积比为1g∶1ml至1g∶0.01ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)与步骤c)之间，苯甲烃铵肝素盐与过氧化氢之间的重量∶体积比为1g∶0.2ml至1g∶0.05ml。
9.通过权利要求1-8中任一项所述的方法所获得的产物。
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