ES2665035T3 - Compuestos de (tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-ilo como agonistas inversos de H1/antagonistas de 5-HT2A de actividad doble - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCION

Compuestos de (tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-ilo como agonistas inversos de Hl/antagonistas de 5- HT2A de actividad doble

La histamina desempeña un papel importante en una diversidad de procesos fisiológicos a través de su interacción con al menos cuatro receptores acoplados a proteína G diferentes, los receptores H1-H4. En el SNC, los receptores H1 desempeñan un papel clave en el ciclo de regulación del sueño y se conoce que los antagonistas/agonistas inversos de H1 inducen somnolencia.

Asimismo, la serotonina desempeña papeles importantes en una diversidad de procesos fisiológicos a través de su interacción con al menos catorce receptores acoplados a proteína G diferentes. La modulación de los receptores 5- HT2A en el SNC desempeña un papel clave en el ciclo de regulación del sueño y se ha mostrado que los antagonistas de 5-HT2A mejoran el sueño de ondas lentas y el mantenimiento del sueño en pacientes con insomnio.

Se han usado compuestos que tienen actividad agonista inversa o antagonista de H1 o 5-HT2A en el tratamiento de insomnio (por ejemplo, doxepina y trazodona, respectivamente) y han exhibido efectos farmacológicos significativos en estudios de sueño animal. Sin embargo, en la actualidad no está disponible en el mercado ningún agonista inverso/antagonista de H1/5-HT2A de actividad doble selectiva.

El documento de Patente WO 2007/022068 describe ciertos compuestos de (tieno[2,3-b][1,5]benzodiazepina-4- il)piperazin-1-ilo y (tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepina-4-il)piperazin-1-ilo sustituidos para el tratamiento de trastornos del sueño.

La presente invención proporciona ácido 3-[4-(2-cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2- dimetil-propanoico y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que tiene una alta potencia de agonista inverso para el receptor H1, una alta potencia de agonista para el receptor 5-HT2A, y una buena selectividad para estos receptores, particularmente en comparación con otros receptores de histamina, receptores de serotonina y otros receptores fisiológicamente pertinentes, particularmente en comparación con el receptor 5-HT2C, receptor GaBAa, receptores muscarínicos, receptores dopaminérgicos, receptores adrenérgicos, y el canal de hERG. Estos compuestos también demuestran a través de modelos animales que pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos del sueño caracterizados por un mal mantenimiento del sueño. Como tales, se cree que los compuestos son útiles para el tratamiento de trastornos de sueño caracterizados por una mala latencia del sueño o un mal mantenimiento del sueño o ambos, tal como el tratamiento de insomnio, a modo de ejemplo insomnio primario crónico o transitorio, o insomnio secundario crónico o transitorio, o ambos. Algunos ejemplos de insomnio secundario incluyen, pero no se limitan a, insomnio asociado a trastornos depresivos (por ejemplo, trastorno depresivo mayor, distimia, y/o ciclotimia), insomnio asociado a trastornos de ansiedad (por ejemplo, trastorno generalizado de ansiedad y/o fobia social), insomnio asociado al dolor (por ejemplo, fibromialgia, dolor óseo o articular crónico, tal como asociado a artritis u osteoartritis inflamatoria, o dolor neuropático diabético), insomnio asociado a reacciones alérgicas (por ejemplo, asma alérgica, prurito, rinitis, congestión, etc.), insomnio asociado a trastornos pulmonares o de las vías aéreas (por ejemplo, con apnea del sueño obstructiva, enfermedad reactiva de las vías aéreas, etc.), insomnio asociado a trastornos psiquiátricos, demencia, y/o enfermedades neurodegenerativas, y/o insomnio asociado a trastornos del sueño del ritmo circadiano (por ejemplo, trastorno del sueño por turno de trabajo, trastorno de descompensación horaria, trastorno de fase de sueño retrasada, trastorno de fase del sueño avanzada, y síndrome de ciclo de sueño-vigilia distinto de 24 horas, etc.).

Además, los compuestos de la presente invención demuestran la potenciación de sus efectos en el sueño sin movimientos oculares rápidos (sueño NREM) cuando se administran conjuntamente con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina.

La presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Es decir, ácido 3-[4-(2-cloro-8-metiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin- 4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, este aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de insomnio, a modo de ejemplo insomnio caracterizado por una latencia de sueño prolongada o un mal mantenimiento del sueño o ambos, a modo de ejemplo insomnio primario, descompensación horaria, trastorno del sueño por turno de trabajo, trastorno de fase de sueño retrasada, trastornos de fase de sueño avanzada, y/o trastornos de ciclo de sueño-vigilia distinto de 24 horas, que comprende un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con uno o más excipientes, vehículos, o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Una realización adicional de este aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente otros ingredientes del apróticos. En una realización adicional más de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica comprende además un segundo agente terapéutico que es un inhibidor de la recaptación de serotonina, a modo de ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina.

La presente invención también proporciona un compuesto para su uso en un procedimiento para tratar insomnio, a modo de ejemplo insomnio caracterizado por una latencia de sueño prolongada o un mal mantenimiento del sueño o ambos, a modo de ejemplo insomnio primario, descompensación horaria, trastorno del sueño por turno de trabajo, trastorno de fase de sueño retrasada, trastornos de fase de sueño avanzada, y/o trastornos de ciclo de sueño-vigilia distinto de 24 horas, en un mamífero que comprende administrar a un mamífero con necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra realización de este aspecto de la invención, el compuesto se usa en un procedimiento que comprende además administrar en combinación simultánea, separada o secuencial, un segundo agente terapéutico que es un inhibidor de la recaptación de serotonina, a modo de ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina. En una realización particular de estos compuestos para su uso en tratamiento, el mamífero es un ser humano.

La presente invención también proporciona un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia. En este aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de insomnio. En realizaciones adicionales, el insomnio está caracterizado por una latencia de sueño prolongada o un mal mantenimiento del sueño o ambos, a modo de ejemplo insomnio primario, descompensación horaria, trastorno del sueño por turno de trabajo, trastorno de fase de sueño retrasada, trastorno de fase de sueño avanzada, y/o trastornos de ciclo de sueño-vigilia distinto de 24 h. En otra realización de este aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en una combinación simultánea, separada o secuencial con un inhibidor de la recaptación de serotonina, a modo de ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina, en el tratamiento de insomnio. Una realización particular de este aspecto de las invenciones, los usos son en mamíferos, en particular seres humanos.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de insomnio, a modo de ejemplo insomnio primario caracterizado por una latencia del sueño prolongada o un mal mantenimiento del sueño o ambos, a modo de ejemplo insomnio primario, descompensación horaria, trastorno del sueño por turno de trabajo, trastorno de fase de sueño retrasada, trastorno de fase de sueño avanzada, y/o trastornos de ciclo de sueño-vigilia distinto de 24 h. Otra realización de este aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un segundo agente terapéutico que es un

inhibidor de la recaptación de serotonina, a modo de ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de insomnio, a modo de ejemplo, insomnio caracterizado por una latencia del sueño prolongada y/o un mal mantenimiento del sueño, a modo de ejemplo insomnio primario, descompensación horaria, trastorno del sueño por turno de trabajo, trastorno de fase de sueño retrasada, trastorno 5 de fase de sueño avanzada, y/o trastornos de ciclo de sueño-vigilia distinto de 24 h.

Para mayor claridad, se usará la siguiente numeración de la estructura de anillos tricíclica en la solicitud:

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El compuesto de la presente invención tiene restos básicos y ácidos, y por lo tanto reacciona con una diversidad de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos para formar sales farmacéuticamente aceptables. Las sales 10 farmacéuticamente aceptables del compuesto de la presente invención se incluyen dentro del ámbito de la presente solicitud. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sal de un compuesto de la invención que es básicamente no tóxica para los organismos vivos. Tales sales incluyen las que se enumeran en Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977), que conoce el experto en la materia.

15 Las abreviaturas que se usan en el presente documento se definen como sigue a continuación:

"DMEM" significa Medio Eagle Mínimo de Dulbecco.

"DMSO" significa dimetilsulfóxido.

"EDTA" significa ácido etilendiaminatetraacético.

"FBS" significa suero bovino fetal.

20 "HEPES" significa ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina etanosulfónico.

"HPLC" significa cromatografía líquida de alta presión.

"h" significa horas.

"CI50" significa la concentración a la que se consigue un 50 % de la inhibición máxima.

"LC-MS" significa HPLC-espectrografía de masas.

25 "MeOH" significa metanol.

"min" significa minutos.

"MS" significa espectroscopía de masas.

"MS (ES+)" significa espectroscopía de masas usando ionización por electronebulización.

"RMN" significa resonancia magnética nuclear.

30 "THF" significa tetrahidrofurano.

Química general

El compuesto de la presente invención se puede preparar de acuerdo con los siguientes ejemplos sintéticos. Preparación 1. Cloruro de 2,5-diclorotiofeno-3-carbonilo

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35 A una suspensión de ácido 2,5-dicloro-tiofeno-3-carboxílico (49,7 g; 252,23 mmoles; 1,00 equiv.) en diclorometano (500 ml), añadir dimetilformamida (0,5 ml; 6,47 mmoles) seguido de una solución 2 M de cloruro de oxalilo en diclorometano (138,73 ml; 277,45 mmoles; 1,1 equiv.) durante 1,5 h (purgar el gas que se desprende a través de una solución cáustica). Agitar la solución trasparente resultante a temperatura ambiente durante 1 h hasta que haya cesado el desprendimiento de gas y la reacción esté completa mediante LCMS (inactivar la muestra en NH3 7 40 M/MeOH para monitorizar la reacción) MS (m/z): = 195,9, 197,9 (M + H)+ para la correspondiente amida primaria. Evaporar hasta sequedad para dar el compuesto intermedio del título en forma de un aceite de color pardo (55 g,

252 mmol, cuantitativa).

Preparación 2. 2,5-dicloro-N-(2-hidroxi-4-metil-fenil)tiofeno-3-carboxamida

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A una solución de 6-amino-m-cresol (34,14 g; 277,20 mimóles; 1,1 equiv.) en THF (450 ml), añadir piridina (40,76 ml; 5 504,00 mmoles; 2 equiv.), seguido de una solución de cloruro de 2,5-didorotiofeno-3-carbonilo (54,30 g, 252

mimóles, 1,00 equiv.) en THF (250 ml) durante 30 min, usando un baño de hielo para mantener una temperatura de 15-20 °C. Agitar la mezcla espesa resultante a temperatura ambiente durante 1 h para dar el consumo completo del aminofenol mediante LC-MS. Verter sobre una mezcla de HCl acuoso 2 M (500 ml) y hielo (250 ml) con agitación. Recoger el sólido de color beige resultante por filtración, lavar bien con agua, y secar en aire. EM (m/z): = 301,84, 10 303,94 (M + H)+. Secar en un horno de vacío a 40 °C sobre P2O5 durante una noche para dar el compuesto

intermedio del título (84,5 g, supuesto cuantitativo).

Preparación 3. 2-cloro-8-metil-5H-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-ona

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A una suspensión bien agitada de 2,5-dicloro-N-(2-hidroxi-4-metilfenil)tiofeno-3-carboxamida (76,15 g; 252 mmoles; 15 1,00 equiv.) en dimetilsulfóxido (450 ml), añadir carbonato potásico (38,31 g; 277,20 mmoles; 1,1 equiv.) y calentar la

mezcla a 100-110 °C durante 4,5 h para dar una conversión básicamente completa mediante LCMS. Dejar enfriar a temperatura ambiente y añadir lentamente a dos vasos de precipitados separados que contienen ácido clorhídrico acuoso 1 M (500 ml), observando desprendimiento de gas. Agitar a temperatura ambiente durante 0,5 h y recoger el sólido de color gris oscuro resultante por filtración. Lavar secuencialmente con agua, seguido de una pequeña 20 cantidad de etanol, seguido de una pequeña cantidad de dietil éter. Secar en un horno de vacío a 45 °C durante una noche para dar el compuesto intermedio del título (58,5 g, 87 %). EM (m/z): = 265,99 (M + H)+.

Preparación 4. 2,4-dicloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepina

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Cargar un matraz de fondo redondo de 1 l con metoxibenceno (225 ml, 5 V), 2-cloro-8-metil-5H-tieno[2,3- 25 b][1,5]benzoxazepin-4-ona (45 g; 169,4 mmoles; 1 equiv.) y N,N-dimetilanilina (47,2 g; 389,5 mmoles; 2,3 equiv.). Calentar a 60 °C y añadir cloruro de fosforilo (85,7 g; 558,9 mmoles; 3,3 equiv.) gota a gota durante 0,5 h. Calentar a 100 °C y agitar durante 2 h hasta que esté completa mediante análisis por TLC. Enfriar a 40-60 °C y evaporar para obtener el compuesto intermedio del título en forma de un sólido de color pardo oscuro (123,1 g, 433,2 mmoles, 256 % de rendimiento sin corregir mediante ensayo). EM (m/z): 283,8 (M + H).

30 Preparación 5. 3-[4-(2-Cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoato de metilo

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Cargar un matraz de fondo redondo de 1 l con 2,4-didoro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepina (121,1 g; 169,4 mimóles; 1,0 equiv.), seguido de acetonitrilo (600 ml, 12,5 V), y a continuación carbonato potásico (119,4 g; 863,9 mmoles) en una porción. Agitar durante 10-20 min y a continuación añadir diclorhidrato de 2,2-dimetil-3-(piperazin-1- 5 il)propanoato de metilo (55,54 g; 203,3 mmoles; 1,2 equiv.) en una porción. Calentar a 80 °C y agitar durante 30 h. Concentrar la mezcla hasta sequedad al vacío, y a continuación cargar acetato de etilo (1920 ml, 40 V) y agua (1920 ml, 40 V) en la mezcla. Agitar, filtrar y a continuación separar la fase de agua y extraer con acetato de etilo (960 ml, 20 V). Combinar las fases orgánicas y lavar con agua (960 ml x 2) y salmuera (200 ml, 4 V). Concentrar y purificar mediante columna de gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo (0 a 10 %)) para obtener el compuesto 10 intermedio del título en forma de un sólido de color amarillo (55,4 g, 123,7 mmoles, 95,8 % de pureza, 73,0 % rendimiento sin corregir mediante ensayo). EM (m/z): 448,2 (M + H). RMN 1H (400 MHz,CDCl3): 8 7,03 (m, 1H), 6,91 (m, 1H), 6,85 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,47 (m, 4H), 2,58-2,54 (m, 6H), 2,28 (s, 3H), 1,19 (s, 6H).

Ejemplo Ácido 1,3-[4-(2-cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoico

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15 Cargar un matraz de fondo redondo de 2 l con 3-[4-(2-cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]- 2,2-dimetil-propanoato de metilo (70,3 g; 156,9 mmoles; 1,0 equiv.), alcohol isopropílico (469 ml; 6,67 V) y agua (469 ml; 6,67 V). A continuación añadir hidróxido sódico (18,83 g; 470,8 mmoles; 3,0 equiv.) y calentar la mezcla a 80 °C con agitación durante 3 h. Enfriar a 20 °C y neutralizar a pH 7 con HCl acuoso 5 M. Evaporar la mayor parte del alcohol isopropílico y a continuación ajustar el pH a 6-7 con HCl acuoso 5 M y concentrar para retirar los disolventes.

20 Cargar acetato de etilo (2800 ml, 40 V) y agua (2800 ml, 40 V) y a continuación agitar durante 30 min antes de filtrar para obtener un producto bruto. Separar la fase de agua y extraer con acetato de etilo (700 ml, 10 V). Combinar las fases de acetato de etilo y evaporar para obtener un producto en bruto. Cargar el producto en bruto y alcohol isopropílico (500 ml, 7 V) en un matraz de fondo redondo de 1 l. Calentar a 80 °C y agitar durante 1 h, y a continuación enfriar a 20 °C lentamente. Filtrar y lavar la torta con alcohol isopropílico (70 ml, 1 V) para obtener el

25 compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (60,4 g; 138,6 mmoles; 99,3% de pureza, 88,3 % rendimiento corregido mediante ensayo). EM (m/z): 434,0 (M + H). RMN 1H (400 MHz, CDCh): 8 7,01 (m, 1H), 6,94 (m, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 3,64 (s a, 4H), 2,86 (s a, 4H), 2,60 (s, 2H), 2,29 (s, 3H), 1,26 (s, 6H). RMN 13C (400 MHz, CDCla): 8178,57, 161,10, 154,37, 152,00, 136,63, 135,64, 127,95, 127,14, 121,88, 121,20, 120,14, 118,58, 65,70, 54,46, 46,45, 41,54, 25,34, 20,70.

30 Ejemplo 2. Ácido 3-[4-(2-doro-8-metM-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepm-4-N)piperazm-1-M]-2,2-dimetN-propanoico

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A una suspensión de 3-[4-(2-cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoato de metilo (22,5 g; 50,23 mmoles; 1,00 equiv.) en una mezcla de alcohol isopropílico (150 ml; 1,96 moles) y agua (150 ml) añadir hidróxido sódico (6,03 g; 150,68 mmoles; 3 equiv.) y calentar la mezcla a 80 °C (baño de aceite) durante 35 2,5 h para dar la conversión completa mediante LC-MS. Dejar enfriar y neutralizar a pH 7 con HCl acuoso 5 M.

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Evaporar la mayor parte del alcohol isopropílico para dar un precipitado fino. Reajustar el pH con HCl acuoso 5 M a pH 7. Colocar el matraz en un refrigerador durante 0,5 h y a continuación recoger el sólido de color amarillo pálido por filtración, lavando con agua. Secar en un horno de vacío a 45 °C sobre P2O5 durante una noche para dar el compuesto del título (20,6 g, 95 %). EM (m/z): = 434,1 (M + H)+.

Ejemplo 3. Diclorhidrato de ácido 3-[4-(2-cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepm-4-N)piperazm-1-M]-2,2- dimetil-propanoico

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Suspender ácido 3-[4-(2-cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoico (5,8 g; 13,3 mmol) en una pequeña cantidad de acetonitrilo, a continuación añadir una solución 4 M en dioxano de cloruro de hidrógeno (14,06 g; 53,57 mmoles; 4 equiv.) y evaporar la solución resultante hasta sequedad. Triturar con una pequeña cantidad de dietil éter, recoger por filtración y secar en un horno de vacío para dar el compuesto del título (4,74 g, 70 %); EM (m/z): = 434,1 (M + H)+.

Purificación adicional de la sal de diclorhidrato

Tomar diclorhidrato de ácido 3-[4-(2-cloro-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil- propanoico (7,5 g; 14,80 mmoles; 1,00 equiv.) y calentar en etanol (150 ml) con uso de ultrasonidos hasta que se obtenga una mezcla completa. Evaporar hasta sequedad. Triturar con una pequeña cantidad de dietil éter y recoger el sólido de color beige por filtración. Moler hasta un polvo fino y secar en un horno de vacío a 50 °C durante 2 noches para dar el compuesto del título (7,14 g, 95 %). Em (m/z): = 434,1 (M + H)+.

Los datos de las referencias (Morairty SR, Hedley L, Flores J, Martin R, Kilduff TS. (2008) Selective 5-HT2A and 5- HT6 receptor antagonists promote sleep in rats. Sleep 31, 34-44.; y Barbier, A.J., y Bradbury, M.J., Histaminargic Control of Sleep-Wake Cicles: Recent Therapeutic Advances for Sleep and Wake Disorders, CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, Vol 6, pág. 31-43 (2007)) y los datos generados en estudios animales no clínicos apoyan el papel de los agonistas inversos de H1 / antagonistas de 5-HT2A de actividad doble en el tratamiento de insomnio y en el tratamiento sintomático de insomnio asociado a otros trastornos tales como trastornos depresivos, trastornos de ansiedad, dolor, alergias, trastornos pulmonares o de las vías aéreas, trastornos psiquiátricos, demencia, y/o enfermedades neurodegenerativas, y/o trastornos del sueño del ritmo circadiano. Específicamente, se ha descubierto que ciertos agonistas inversos de H1 / antagonistas de 5-HT2A de actividad doble son eficaces en el aumento del tiempo total de sueño usando roedores monitorizados por EEG sin hipoactividad desproporcionada o clínicamente pertinente, disminución del sueño REM, o hipersomnolencia.

Para demostrar adicionalmente las características de los presentes compuestos, se pueden procesar en los siguientes ensayos in vitro e in vivo:

Ensayos de unión y actividad in vitro:

Ensayo de unión competitiva de H1

Se realizan experimentos de unión de [3H]-pirilamina en SPA (ensayo de proximidad de centelleo) en formato de 96 pocillos. Las membranas usadas en este ensayo se preparan a partir de células HEK-293 que expresan de forma estable receptor (humano) de H1 recombinante. La incubación se inicia mediante la adición de una mezcla de perlas WGA PVT SPA (1 mg/pocillo, Perkin Elmer (MA, USA) RPNQ0001) y 3 |jg de membranas a tampón de ensayo (Tris 67 mM; pH 7,6) conteniendo [3H]-Pirilamina 3,5 nM y concentraciones variables del compuesto de ensayo (curvas de respuesta a concentración de 10 puntos). La unión no especifica se determina en presencia de Triprolidina 10 jM. Las muestras se incuban durante 4 h a temperatura ambiente (22 °C) y a continuación se leen en Microbeta Trilux.

Ensayo de unión competitiva de 5-HT?a

Se realizan experimentos de unión de [3H]-Ketanserina en SPA en formato de 96 pocillos. Las membranas usadas en este ensayo se preparan a partir de células AV-12 que expresan de forma estable receptor (humano) de 5-HT2a recombinante. La incubación se inicia mediante la adición de una mezcla de perlas WGA YSi SPA (1 mg/pocillo, Perkin Elmer (MA, USA), RPNQ0011) y 2 jg de membranas a tampón de ensayo (Tris 67 mM, EDtA 0,5 mM; pH 7,6) conteniendo [3H]-Ketanserina 3,1 nM y concentraciones variables del compuesto de ensayo (curvas de respuesta a concentración de 10 puntos). La unión no especifica se determina en presencia de 1-(1 -Naftil) piperazina 20 jM. Las muestras se incuban durante 4 h a temperatura ambiente (22 °C) y a continuación se leen en Microbeta

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Ensayo de unión competitiva de 5-HT?c

Se realizan experimentos de unión de [125I]-(±)DOI en SPA en formato de 96 pocillos. Las membranas usadas en este ensayo se preparan a partir de células AV-12 que expresan de forma estable receptor (humano) de 5-HT2c recombinante. La incubación se inicia mediante la adición de una mezcla de perlas WGA PVT SPA (0,5 mg/pocillo, Perkin Elmer (MA, USA), RPNQ0001) y 2,5 |jg de membranas a tampón de ensayo (Tris-HCl 50 mM, MgCh 10 mM, EDTA 0,5 mM, pargilina 10 jM, ácido ascórbico al 0,1 %, pH 7,4) conteniendo [[125I]-(±)DOI 0,2 nM y concentraciones variables del compuesto de ensayo (curvas de respuesta a concentración de 10 puntos). La unión no especifica se determina en presencia de 1-( 1-Naftil) piperazina 20 jM. Las muestras se incuban durante 4 h a temperatura ambiente (22 °C) y a continuación se leen en Microbeta Trilux.

Análisis de los datos de unión

Se evalúan las curvas usando una ecuación no lineal logística de 4 parámetros para obtener la concentración de competidor que causa un 50 % de inhibición de la unión de radioligando (CI50). Se calculan las constantes de disociación de equilibrio (Ki) de acuerdo con la ecuación Ki = Cl50/(1+L/Kd), en la que L es igual a la concentración de radioligando usada en el experimento y Kd es igual a la constante de disociación de equilibrio del radioligando para el receptor, determinada a partir de análisis de saturación convencional o experimentos competitivos homólogos. Los valores informados para Ki en la que se indican los valores de n, se muestran cómo la media geométrica ± el error estándar de la media (SEM), con el número de determinaciones por duplicado indicado mediante n. Las medias geométricas se calculan mediante la ecuación GeoMean = 10A(valor medio de (log Ki 1 + log Ki 2 +...log Ki n)/raíz de n).

Antagonismo de GABAa usando receptores nativos en cultivos neuronales primarios

La actividad de los compuestos en receptores GABAa nativos se evalúa mediante la monitorización de los flujos de calcio usando un sistema FLIPR® en formato de 96 pocillos (lector de placas de formación de imagen fluorométrica (FLIPR®, Molecular Devices). En resumen, se disocian neuronas embrionarias corticales de embriones de rata E18 y se siembran en placa a una densidad óptima en placas FLIPR® de 96 pocillos revestidas con poli-D-lisina de fondo transparente y paredes de color negro. Después de cargar las células con un colorante sensible al calcio (Fluo4-AM, Molecular Devices), las células se bañan en una solución que contiene una baja concentración de cloruro (cloruro reemplazado con gluconato). En estas condiciones la activación de los receptores GABAa causa un flujo de salida de iones cloruro (en la dirección del gradiente químico), que da como resultado la despolarización de la membrana y posteriormente la activación de los canales de calcio accionados por tensión (VGCC). El flujo de entrada de calcio a través de los VGCC se registra y se analiza fuera de línea usando el sistema FLIPR®. Para una validación farmacológica de ensayo, se registran las curvas de respuesta a concentración (CRC) para el agonista convencional (GABA) y el antagonista convencional (Gabazina). Cualquier efecto se determina en el modo de CRC frente a una concentración fija de agonistas de GABA a 10 jM (equivalente a una respuesta CE90 a GABA).

Procedimientos:

Los efectos de antagonista de los compuestos se cuantifican usando curvas de respuesta a dosis de 10 puntos por comparación de las respuestas de fluorescencia de pico al agonista de GABA en presencia y ausencia de compuesto. La ventana de ensayo se define como la respuesta máxima obtenida por GABA a su concentración EC90 predeterminada menos la respuesta obtenida por una concentración completamente inhibidora de gabazina (50 jM). Los efectos de antagonista se calculan como un porcentaje de la ventana de ensayo. Todos los datos se calculan como valores de CI50 relativos usando un programa de ajuste a curva logística de cuatro parámetros (Prism Graphpad® 3.01). Las potencias de antagonista para todos los compuestos se comparan con respecto a la gabazina con tres duplicados en cada ensayo procesado.

Además, los compuestos de la invención se pueden someter a ensayo en ensayos de unión y ensayos de actividad funcional mediante procedimientos bien conocidos para otros receptores fisiológicamente importantes tales como, pero sin limitarse a, el canal de hERG, otros receptores de serotonina (específicamente receptores 5-HT-ib, 5-HT-id, falta de actividad agonista en los receptores 5-HT2b, receptores 5-HT2c, 5-HTs, 5-HT6, y 5-HTz ), receptores dopaminérgicos (específicamente D1, D2, y D3), receptores GABAa, receptores adrenérgicos y transportadores de monoamina.

Los compuestos de los ejemplos 1 y 13 se someten a ensayo básicamente como se ha descrito anteriormente y se descubre que tienen los perfiles de actividad que se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Datos de selectividad

Ejemplo 1 Ejemplo 3

Ki H1 (nM)

20,6 58,8

Ki 5-HT2a (nM)

3,37 7,01

Ki 5-HT2b (nM)

121

CE50 agonista 5-HT2b (nM)

- >10.000

Kb antagonista 5-HT2b (nM)

78,6

Ki 5-HT2c (nM)

137 328

CI50 GABAa (pM)

>100

Canal de hERG (pM)

>100

Ki Dopamina D1 (nM)

592

Ki Dopamina D2 (nM)

2780 >4570

Ki Dopamina D3 (nM)

>5510 >5680

Ki 5-HT-ib (nM)

>5580

Ki 5-HT-id (nM)

>3980

Ki 5-HT5 (nM)

>8810

Ki 5-HT6 (nM)

>5830

Ki 5-HT7 (nM)

>2060

Ki alfa-iA adrenérgico (nM)

>10200

Ki alfa-m adrenérgico (nM)

>14700

Ki alfa2A adrenérgico (nM)

>8990

Ki alfa2B adrenérgico (nM)

>5760

Ki alfa2c adrenérgico (nM)

>4230

Transportador de serotonina

>661

Transportador de norepinefrina

>696

Transportador de dopamina

>871

Por lo tanto, se espera que las dosis fisiológicamente pertinentes de los compuestos de la invención proporcionen una inhibición considerable de los receptores H1 y 5-HT2A in vivo, mientras que básicamente no interaccionen con otros receptores fisiológicamente pertinentes, y de ese modo se espera que proporcionen la farmacología deseada 5 mientras se evitan los efectos indeseados asociados a la actividad fuera de diana. Tales efectos indeseados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: actividad antagonista de 5-HT2C asociada a la ganancia de peso que surge del tratamiento, actividad agonista de 5-HT2B asociada a valvulopatía, modulación del canal de hERG asociada a prolongación de QT, y actividad antagonista de GABAa asociada a actividad de convulsiones. Además, se evita la interferencia con la fisiología de sueño/vigilia mediante la selectividad sobre receptores de dopamina, 10 otros receptores de serotonina, receptores adrenérgicos, y transportadores de monoamina.

Ocupación de los receptores 5-HT2a: La ocupación de receptores se somete a ensayo para demostrar la actividad de antagonista/agonista inverso en el receptor 5-HT2a in vivo. En resumen, se da acceso a alimento y agua a voluntad a ratas macho Sprague-Dawley (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) que pesan aproximadamente 230-280 hasta el comienzo del protocolo experimental del 3 h. Se usa 1 mg/kg de ketanserina (antagonista no selectivo de 515 HT2a) como control positivo para establecer la validez del ensayo. Se administran los compuestos de ensayo o el

control mediante una sonda oral en un vehículo comprendido por un 20 % de hidroxipropil betaciclodextrina. Se usa

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60

como trazador MDL 100907 ((R)-(+)-a-(2,3-Dimetoxifenil)-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-4-piperidinametanol), un antagonista selectivo de 5-HT2A. Se suspende MDL 100907 en agua con 5 |jl de ácido láctico diluido (1 mg/ ml), se diluye a 6 |jg/ml con solución salina, y se administra en un volumen de 1 ml/kg por vía intravenosa a través de la vena lateral de la cola para producir una dosis de trazador de 3 jg/kg. Se administra a las ratas el compuesto de ensayo, ketanserina, o vehículo (N = 4), seguido 1 h más tarde con una dosis intravenosa de trazador de 3 jg/kg de MDL 100907. Es en el momento de la administración del trazador en el que se considera que se ha medido la ocupación de los receptores (RO). Quince min después de la administración del trazador, las ratas se sacrifican mediante dislocación cervical. Se recogen muestras de plasma y las muestras de la corteza frontal y el cerebelo se retiran. Se mide el nivel de trazador MDL 100907 en cada muestra cortical y de cerebelo. Ro se calcula usando el procedimiento de proporción bien establecido que emplea una región de alta densidad de receptores representativa de unión total (corteza frontal) normalizada con un área sin o con niveles muy bajos de receptor (cerebelo). Esta región, denominada región nula, representa la unión no específica de la sonda de ligando. La proporción de vehículo de los niveles de trazador en la corteza con respecto al cerebelo representa un 0 % de ocupación. Una proporción de 1 representa un 100 % de ocupación y se consigue cuando se bloquea toda la unión específica al receptor 5-HT2A del trazador MDL 100907. Las proporciones intermedias de trazador cortical con respecto al cerebelar del grupo tratado previamente con el compuesto de ensayo se interpolan linealmente entre la proporción de los niveles de trazador en los animales tratados con vehículo (0 % de ocupación) y la proporción de 1 (100 % de ocupación) con el fin de determinar el porcentaje de Ro de 5-HT2A.

Análisis de MDL 100907: Las muestras de corteza y cerebelo se pesan y se colocan en tubos cónicos de centrífuga en hielo. Se añaden cuatro volúmenes (p/v) de acetonitrilo que contiene un 0,1 % de ácido fórmico a cada tubo. A continuación, las muestras se homogeneizan y se centrifugan a 14.000 RPM (21.920 x g) durante 16 min. El sobrenadante se diluye por adición de 100 - 900 jl de agua estéril en viales de inyección de HPLC para análisis de LC/MS/MS. El análisis de MDL 100907 se realiza usando un equipo de HpLc Agilent modelo 1200 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) y un espectrómetro de masas API 4000. La separación cromatográfica es en una columna C18 de 2,1 X 50 mm (Agilent, número de catálogo 971700-907) con una fase móvil que consiste en un 60 % de acetonitrilo en agua con un contenido global de un 0,1 % de ácido fórmico. La detección de MDL 100907 se consigue mediante la monitorización de la transición iónica de precursor a producto con una proporción de masa con respecto a carga (m/z) de 374,2 a 123,0. Se preparan patrones por adición de cantidades conocidas de analito a muestras de tejido cerebral de ratas no tratadas y procesamiento como se ha descrito anteriormente.

Procedimientos estadísticos: Las curvas para cada estudio se ajustan a una función logística de 4 parámetros con un fondo fijo a un 0 % usando JMP® versión 8.0 (SAS Institute Inc, Cary NC) y se calcula la DE50 absoluta mediante el software. Los valores se dan como valores medios, errores estándar e intervalos de un 95 % de confianza. El compuesto del Ejemplo 3 se somete a ensayo básicamente como se ha descrito y se descubre que consigue una alta ocupación de los receptores 5-HT2A con una DE50 de 0,09 mg/kg.

Agonismo inverso de H1: Para determinar la naturaleza agonista inversa de los compuestos de la presente invención, se miden sus efectos en los niveles de fosfato de Mio-Inositol 1 (IP1) en células HEK293 transfectadas con receptor H1 humano recombinante (HEK293/hm H1 clon R-40). En resumen, se cultivan células HEK293/hm H1 (clon R-40) hasta ~90 % de confluencia (DMEM/F12 3:1, 5 % de FBS, HEPES 20 mM, 500 jg/ ml de G418, 1 % de Pen/Estrep/Glutamina) y se recogen el día del ensayo usando 1x Tripsina/EDTA (PAA Pasching, Austria L11-003). Se siembran 35 jl de células (300K) en placas de fondo sólido de color blanco de área media de 96W (Corning, UK 3688) en tampón de estimulación (NaCl 146 mM, CaCl21 mM, KCl 4,2 mM, MgCh 0,5 mM, Glucosa 5,5 mM, HEPES 10 mM y LiCl 50 mM). Los compuestos de ensayo se disuelven inicialmente en un 100 % de DMSO a 100x la concentración final. Estos se diluyen adicionalmente hasta x2 la concentración final de ensayo en un tampón de estimulación y se añaden a continuación 35 jl de esta solución a las células en la placa de ensayo. Se incuban las células más el compuesto durante 1 h 30 min a 37 °C / 5 % de CO2 antes de la adición de 15 jl de cada uno de los reactivos del kit de detección HTRF IP1 (CisBio 62P1APEC). La placa de células se incuba durante un periodo adicional de una hora a temperatura ambiente antes de medir la acumulación de IP 1 (lector de placas Envision, Perkin Elmer). La acumulación de IP1 (nM) se calcula mediante extrapolación a partir de la curva patrón de IP1 procesada en el día del ensayo. Los valores de eficacia negativa se expresan con respecto al control positivo de Tripelenamina (10 jM, Sigma, UK P5514). El compuesto 3 se somete a ensayo básicamente como se ha descrito y se descubre que suprime completamente la actividad constitutiva (105 % a 1 jM y 85 % a 10 jM (n = 2)).

Inhibición de la actividad de desaprobación (Headshake) inducida por DOI: La actividad antagonista del receptor 5- HT2A in vivo del compuesto de la presente invención se demuestra adicionalmente mediante su capacidad para bloquear la actividad de desaprobación inducida por el agonista del receptor 5-HT2A 2,5-dimetoxi-4-yodoanfetamina (DOI). (véase, por ejemplo Bartoszyk GD, van Amsterdam C, Bottcher H, Seyfried CA. EMD 281014, a new selective serotonin 5-HT2A receptor antagonist. Eur J Pharmacol. 2003 473: 229-230.) En resumen, se alojan ratones macho C57BL/6J (20-25 g, Charles River) en condiciones de alojamiento convencionales (32 ratones en una jaula IVC grande, fase de luz de 07.00 a 19.00, temperatura (19-23 °C) y humedad (50 % +/-10) constantes, alimento y agua a voluntad). Los ratones recibieron vehículo (0,25 % de Metil celulosa), DOI (3 mg/kg en solución salina) o compuesto de ensayo a 10 mg/kg PO más DOI (3 mg/kg en solución salina). Los compuestos de ensayo se evaluaron de forma individual en grupos de cuatro por experimento con n = 4 para cada compuesto, junto con vehículo y DOI + vehículo (n = 8). Después de un tiempo de pretratamiento de compuesto de ensayo de 60 min los ratones recibieron vehículo (solución salina) o 3 mg/kg de dOi dosificado por vía subcutánea, y a continuación se colocaron en cámaras de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

observación de plexiglás trasparentes. Cinco min después de la administración de DOI o vehículo se contó el número de desaprobaciones calificadas visualmente exhibido por cada ratón individual durante 15 min. Los datos se analizan usando un ANOVA y Ensayo de Dunnet post-hoc. El compuesto de ejemplo 3 se somete a ensayo básicamente como se ha descrito y se descubre que inhibe la respuesta de desaprobación inducida por DOI en un 100 % a 10 mg/kg.

Monitorización de sueño y conducta en ratas: El compuesto de la presente invención se somete a ensayo en ratas para su capacidad para aumentar la cantidad de sueño o disminuir la interrupción de sueño o ambos sin efectos indeseados tales como inhibición del sueño REM, deterioro motor en la vigilia, y/o insomnio de rebote. Los animales de ensayo se monitorizan de forma continua mediante electroencefalogramas (EEG), electromiogramas (EMG), y movimiento para medir el sueño no REM acumulado, sueño total acumulado, duración de acceso de sueño promedio, duración de acceso de sueño más largo, insomnio de rebote, inhibición de sueño REM e intensidad de la actividad locomotora durante la vigilia. Los procedimientos para tales estudios se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, los procedimientos que se describen en Edgar DM, Seidel WF. Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hipersomnolence in the rat. J Pharmacology & Experimental Therapeutics 1997; 283: 757-769; van Gelder RN, Edgar DM, Dement WC. Real-time automated sleep scoring: validation of a microcomputer-based system for mice. Sleep 1991, 14: 48-55; y Gross BA, Walsh CM, Turakhia AA, Booth V, Mashour GA, Poe GR. Open-source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats. J Neurosci Methods. 2009; 184( 1):10-8.) Los estudios se realizaron como sigue a continuación:

Preparación de animales. Se equiparon quirúrgicamente ratas adultas macho Wistar (aproximadamente 270-300 g en el momento de la cirugía) para el registro crónico de EEG, EMG, y movimiento como sigue a continuación: Las ratas se preparan quirúrgicamente con un implante craneal que consiste en cuatro tornillos de acero inoxidable para el registro de EEG (dos frontales [3,9 mm anteriores al bregma, y ± 2,0 mm mediolateralmente] y dos occipitales [6,4 mm posteriores al bregma, ± 5,5 mm mediolateralmente]), con dos hilos de acero inoxidable revestidos con teflón para el registro de EMG (situados bajo los músculos trapezoides de la nuca). Todos los cables se soldaron a un conector en miniatura (Microtech, Boothwyn, PA) antes de la cirugía. El montaje de implante se fija al cráneo mediante la combinación de tornillos de registro de EEG de acero inoxidable, cianoacrilato aplicado entre el conector de implante y el cráneo, y acrílico dental. La actividad locomotora se monitoriza a través de un transmisor en miniatura (Minimitter PDT4000G, Philips Respironics, Bend, OR) situado quirúrgicamente en el abdomen. Se permiten al menos 3 semanas para la recuperación.

Ambiente de registro. Cada rata se aloja individualmente en una jaula de microaislamiento modificada con un elevador de filtro superior de policarbonato insertado para permitir una altura libre más vertical. Un cable flexible que restringe mínimamente el movimiento se conecta en un extremo a un conmutador sujeto a la parte superior de la jaula y en el otro extremo al implante craneal del animal. Cada jaula se sitúa en compartimentos ventilados separados de una cámara de registro de sueño-vigilia de acero inoxidable. La comida y al agua están disponibles a voluntad y la temperatura ambiente se mantiene a aproximadamente 23 ± 1 °C. Se mantiene un ciclo de luz- oscuridad de 24 h (LD 12:12) usando luz fluorescente a lo largo del estudio. La humedad relativa promedio aproximadamente un 50 %. Sus animales se mantienen sin molestar durante al menos 30 h antes y después de cada tratamiento.

Diseño del estudio y dosificación. El vehículo (placebo, metilcelulosa de 15 centipoise al 0,25 % en agua) o uno de los niveles de dosis de compuesto de ensayo se administra por vía oral a 1 ml/kg pseudoaleatoriamente de un modo tal que ninguna rata reciba el mismo tratamiento dos veces, y ninguna rata reciba más de dos de 8 tratamientos en ningún estudio. Cada rata se retira de su jaula durante aproximadamente un minuto para pesarse y tratarse. Un período de al menos 6 días de "lavado" precede y sigue a cada tratamiento.

Recogida de datos. La discriminación de sueño y vigilia se puede automatizar (por ejemplo, Van Gelder y col. 1991 (citado anteriormente); Edgar y col. 1997 (citado anteriormente); Winrow CJ, y col., Neuropharmacology 2010; 58(1):185-94.; y Gross y col., 2009 (citado anteriormente). EEG se amplifica y se filtra (X10.000, paso de banda de 1-30 Hz), EMG se amplifica y se integra (paso de banda de 10-100 Hz, integración RMS ), y la actividad locomotora no especifica (LMA) se monitorizan simultáneamente. Los estados de estimulación se clasifican en épocas de 10 segundos como sueño no REM, sueño REM, vigilia, o vigilia dominada por theta. La actividad locomotora (LMA) se registra como cuentas por minuto y se detecta mediante receptores de telemetría disponibles en el mercado (ER4000, Minimitter, Bend, OR).

Análisis estadístico. Todos los animales que tienen al menos un resultado se incluyen en los resultados resumidos (por ejemplo, los presentes inventores incluyen los datos apropiados de un tratamiento de animal para el que los datos de telemetría son utilizables pero los datos de EEG no). El periodo de observación posterior al tratamiento se divide en intervalos de dosificación posterior apropiados a cada Resultado, en el que el tiempo de dosificación se define como el comienzo de la Hora = 0, y los resultados se resumen en el período de observación mediante el cálculo del valor medio horario o el valor acumulado a través de cada periodo (véase la leyenda de la Tabla 1 para una definición precisa de cada Resultado). Los accesos de sueño se analizan en la escala logarítmica para estabilizar la variación, todas las demás variables se analizan en la escala lineal. Cada resultado en cada periodo se analiza mediante análisis de covarianza usando el grupo de tratamiento y el dato de tratamiento como factores y el

intervalo de tratamiento previo correspondiente, 24 h antes, como la covariable. Los valores medios ajustados y el cambio de los valores medios de vehículo y sus correspondientes errores estándar se resumen para cada grupo de tratamiento. Los resultados analizados en la escala logarítmica se transforman de nuevo para informar los valores medios geométricos y los resultados medios de proporción con respecto al vehículo.

El compuesto de los Ejemplos 3 se somete a ensayo básicamente como se ha descrito. Se descubre que el compuesto del Ejemplo 3 aumenta considerablemente el tiempo de sueño NREM acumulado y el tiempo de sueño total acumulado sin insomnio de rebote considerable, inhibición del sueño REM o inhibición de la intensidad locomotora (LMI) a 3 mg/kg. (Véanse el perfil de sueño y la intensidad de actividad locomotora en la Tabla 2.)

Tabla 2. Compuesto del Ejemplo 3.

Variables de eficacia

Variables de efecto indeseado

Sueño NREM acumulado

Insomnio de rebote

Dosis (mg/kg PO)

N Media Aj. SE N Media Aj. LCL

10

9 29,1 6,4 9 -3,1 -11,0

3

10 31,7 6,1 10 0,3 -7,3

1

4 34,0 9,0 4 1,6 -9,8

0,5

4 32,9 9,0 4 -5,0 -16,3

0,25

12 37,9 6,0 12 -2,2 -9,8

0,1

8 26,7 7,4 8 -3,7 -13,0

0,05

14 23,4 5,7 14 0,2 -7,0

0,035

7 19,2 7,1 7 1,3 -7,7

0,025

10 6,5 6,1 10 1,4 -6,3

Sueño total acumulado Inhibición de REM

Dosis (mg/kg PO)

N Media Aj. SE N Media Aj. LCL

10

9 26,5 7,1 9 -9,4 -3,8

3

10 29,7 6,8 10 -4,6 0,7

1

4 33,6 10,1 4 -0,1 7,8

0,5

4 30,9 10,1 4 0,4 8,2

0,25

12 38,9 6,7 12 2,0 7,2

0,1

8 28,7 8,3 8 4,9 11,4

0,05

14 25,3 6,5 14 4,2 9,2

0,035

7 18,9 8,0 7 -1,8 4,4

0,025

10 7,7 6,9 10 0,5 5,8

(continuación)

Acceso de sueño promedio Dosis (mg/kg PO) N Media Aj. SE

10

9 2,0 0,2

3

10 2,0 0,2

1

4 1,7 0,3

0,5

4 1,8 0,3

0,25

12 2,1 0,2

0,1

8 1,7 0,2

0,05

14 1,6 0,2

0,035

7 1,3 0,2

0,025

10 1,2 0,1

Intensidad de la actividad locomotora

N Media Aj. LCL

9

-1,9 -0,1

10

-3,1 -1,3

4

-1,6 0,9

4

0,6 3,1

10

-0,7 1,1

8

0,1 2,3

10

-0,3 1,6

6

0,2 2,4

9

0,2 2,1

Acceso de sueño más largo Dosis (mg/kg PO) N Media Aj. SE

10

9 2,3 0,3

3

10 2,7 0,3

1

4 2,0 0,3

0,5

4 2,2 0,4

0,25

12 2,0 0,2

0,1

8 1,5 0,2

0,05

14 1,4 0,2

0,035

7 1,1 0,2

0,025

10 1,1 0,1

Tabla 2. Estadística de resultados: Abreviaturas: N= tamaño de muestra; Media Aj. = valor medio del grupo

ajustado con respecto a los controles de vehículo; SE = error estándar de la media; LCL = límite de confianza inferior 5 a un 95 %, NREM = no REM, es decir, todo el sueño distinto del sueño REM. El tamaño de la muestra del grupo de

vehículo de referencia paralelo fue N = 27.

Definiciones y unidades - los valores medios son diferencias ajustadas a partir de los controles de vehículo:

• Sueño acumulado: a través de las primeras 6 h posteriores al tratamiento, en minutos ('Sueño total' representa sueño NREM + sueño REM).

10 • Acceso de sueño promedio: promedio de los accesos de sueño promediados por hora, a través de las primeras 6

h posteriores al tratamiento, expresada como n veces el aumento sobre los controles de vehículo.

• Acceso de sueño más largo: el acceso de sueño más largo en las primeras 6 horas posteriores al tratamiento, expresada como n veces el aumento sobre los controles de vehículo.

• Insomnio de rebote: minutos acumulados de sueño NREM + REM durante las primeras 3 h del periodo de luz, es

15 decir, 7a, 8a y 9a horas posteriores al tratamiento.

• Inhibición de REM: minutos acumulados de sueño REM durante las primeras 12 h posteriores al tratamiento.

• Intensidad de la actividad locomotora (LMA): expresada como recuentos por minuto de LMA de vigilia definida por EEG, promediada a través de las primeras 6 h posteriores al tratamiento.

Determinación de la eficacia. La eficacia de umbral para cada una de las cuatro variables de eficacia se calcula 20 representando el aumento de cada variable con respecto a los controles de vehículo durante el periodo de 6 h

después del tratamiento frente a log(dosis). La eficacia de umbral para cada variable es la dosis, estimada mediante regresión no lineal logística de 4 parámetros, que da el valor de un umbral de eficacia definido; +30 min del sueño no REM acumulado adicional, +25 min de sueño total acumulada adicional, 1,75x de aumento de la duración del acceso de sueño promedio, y 1,5x de aumento de la duración del acceso de sueño más largo. Se ha descubierto que el 5 compuesto del ejemplo 3 tiene las dosis eficaces de umbral que se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3

Dosis de eficacia estimada (mg/kg) Intervalo de confianza de un 95 % (mg/kg)

Acumulación de NREM = 30 min.

0,09 0,04-n.e.*

acumulación de sueño total = 25 min.

0,05 0,03-0,09

acceso de sueño más largo (aumento de 1,75 veces)

0,12 0,07-0,20

acceso de sueño promedio (aumento de 1,5 veces)

0,04 0,03-0,06

*n.e. = no estimable, estadísticamente.

imagen11

20 , 15

Inhibición del [ sueño REM ^ !

(minutos) .5 I

-10 4 -15 4

Deterioro de la actividad locomotora (LMA)

Dosis (mg / kg)

Insomnio de rebote (minutos)

(Recuentos por minuto de LMA

de vigilia definida por EEG)

Dosis (mg / kg)

Dosis (mg / kg)

4

0

-4

-8

Determinación de efectos indeseados. Cada variable de resultado de "efecto indeseado" (véanse las leyendas de la Tabla 2 para definiciones), se representa frente a log(dosis). El valor de umbral para la inhibición de rEm se define como una reducción acumulada de sueño REM de -10 min. El valor de umbral para el insomnio de rebote se define 10 como -20 min. El valor de umbral para LMI reducida se define como -5 recuentos por minuto de actividad locomotora de vigilia definida por EEG. Se define que se produce un efecto indeseable significativo cuando el límite inferior de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

confianza está por debajo del valor de umbral en cualquier dosis o por debajo de 10 veces la dosis media de eficacia, y es evidente una tendencia de respuesta a dosis para dosis superiores a la dosis de eficacia de umbral. Para el compuesto del Ejemplo 3, no se observa ninguna aparición no deseada de inhibición de REM, insomnio de rebote, o reducción en LMI a dosis de hasta al menos 1,2 mg/kg (1,2 mg/kg es 10 veces la dosis de eficacia más conservadora de 0,12 mg/kg [Tabla 3]). Los valores negativos indican inhibición de REM, insomnio de rebote y LMI reducida, respectivamente.

En estudios adicionales, los compuestos de la presente invención se pueden administrar conjuntamente con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina para demostrar una potenciación de su efecto en el sueño sin movimientos oculares rápidos (sueño NREM) y el mantenimiento del sueño. El compuesto del Ejemplo 3 se administra conjuntamente con citalopram en estudios de sueño en ratas básicamente como se ha descrito anteriormente para el compuesto solo, y se ha descubierto que aumenta significativamente el sueño NREM a dosis significativamente inferiores.

Aclaramiento de plasma: Es importante en un compuesto útil para el tratamiento de trastornos del sueño tales como insomnio que se pueda eliminar de forma adecuada del cuerpo con una tasa favorable de aclaramiento para evitar efectos indeseados tales como somnolencia prolongada más allá del período de sueño deseado, somnolencia diurna, cognición deficiente durante la vigilia, etc. La presente invención proporciona compuestos con tasas mejoradas de aclaramiento. La tasa de aclaramiento se puede someter a ensayo básicamente como se describe a continuación.

Se obtienen ratas macho Sprague Dawley (intervalo de peso corporal de 250-320 g) con cánulas residentes en la arteria femoral en Charles River, Wilmington, MA 01887, USA. El compuesto de ensayo se administra por vía intravenosa en solución (1 ml/kg) en un 20 % de Captisol® en tampón fosfato 22,5 mM, pH 2, a una concentración final de fármaco de 1,0 mg/ ml (equivalentes de base libre). Se obtienen muestras de sangre usando la cánula residente durante 24 h. Se obtienen muestras de plasma por centrifugación y almacenamiento congelado (-20 °C), o en hielo seco, antes del análisis.

Se obtienen perros macho Beagle (intervalo de peso corporal de 10-12 kg) en Marshall Bioresources, USA. El compuesto de ensayo se administra por vía intravenosa en solución (1 ml/kg) en un 20 % de Captisol® en tampón fosfato 22,5 mM, pH 2, a una concentración final de fármaco de 1,0 mg/ ml (equivalentes de base libre). Se obtienen muestras de sangre de la vena yugular durante 24 h. Se obtienen muestras de plasma por centrifugación y almacenamiento congelado (-20 °C) antes del análisis.

Las muestras de plasma se descongelan a temperatura ambiente para bioanálisis de concentraciones de compuesto de ensayo. Se añade un compuesto patrón interno relacionado en acetonitrilo/ metanol (1:1, v/v) a todas las muestras de plasma (1:1, v/v). Las muestras se centrifugan para retirar la proteína precipitada antes del análisis. Los sobrenadantes se analizan por inyección y elución rápida en gradiente en una columna C18 Javelin Betasil (cartucho de 20 x 2,1 mm, Fase móvil A: Agua/ NH4HCO31 M, 2000:10 v/v, Fase móvil B: MeOH/ NH4HCO31 M, 2000:10 v/v). Los analitos eluidos se detectan mediante análisis por LC-MS-MS usando un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple Sciex API 4000. Las concentraciones de compuestos se determinan a partir de patrones preparados y analizados en condiciones idénticas. El aclaramiento se calcula usando análisis no compartimentado en Watson 7,4, Thermo Fisher Scientific, Inc.

Aclaramiento

Los compuestos de los Ejemplos 1 perfiles de aclaramiento favorables:

Ejemplo

1

3

Dodu

” .irea bajo lacirva para conctntrari:n de plasmatiempo

y 3 se procesan básicamente como se ha descrito y se descubre que tienen

Aclaramiento ( ml/min/kg)

Rata Perro

14,1 (+/- 6,9, n = 3) -

14,5 (+/-1,4, n = 3) 3,2 (+/-0,7, n = 3)

Aunque es posible administrar los compuestos de la presente invención directamente sin ninguna formulación, los compuestos se administran habitualmente en forma de composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como principio activo y al menos un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden administrar mediante una diversidad de rutas que incluyen oral, sublingual, nasal, subcutánea, intravenosa, e intramuscular. Tales composiciones farmacéuticas y procedimientos para prepararlas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia, ed., 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins Co., 2005).

Las composiciones se formulan preferentemente en una forma de dosificación unitaria, conteniendo cada dosificación de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60 mg, más habitualmente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 mg, a modo de ejemplo entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg del principio activo. La expresión "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como 5 dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, junto con al menos un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado.

Los compuestos de Fórmula I son generalmente eficaces en un amplio intervalo de dosificación. Por ejemplo, las dosificaciones por día entran normalmente dentro del intervalo de aproximadamente 0,002 a aproximadamente 1,0 10 mg/kg, más habitualmente de aproximadamente 0,008 a 0,5 mg/kg, y a modo de ejemplo entre 0,015 y 0,15 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite del intervalo anteriormente mencionado pueden ser más adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aún mayores sin causar ningún efecto secundario perjudicial, y por lo tanto los intervalos de dosificación anteriores no se pretende que limiten el ámbito de la invención en modo alguno. Se ha de entender que la cantidad del compuesto 15 administrado realmente se determinará por un médico, a la vista de las circunstancias pertinentes, incluyendo la afección que se va a tratar, la ruta de administración seleccionada, el compuesto o compuestos reales administrados, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, así como la gravedad de los síntomas del paciente.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de fórmula

   imagen1

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   5 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es una sal de HCl.
2. 3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
3. 4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso 10 en terapia.
4. 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de insomnio.
5. 6. El compuesto o la sal para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el insomnio está caracterizado por dificultades en el comienzo del sueño o el mantenimiento del sueño o ambos.

   15 7. El compuesto o la sal para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 en un ser humano.
6. 8. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, y otro ingrediente terapéutico que es un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina.