ES2650225T3 - Compuestos (Tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-ilo con doble actividad como agonistas inversos de H1/antagonistas de 5-HT2A - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCION

Compuestos (Tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-ilo con doble actividad como agonistas inversos de Hl/antagonistas de 5-HT2A

La histamina juega un papel importante en diversos procesos fisiológicos a través de su interacción con al menos cuatro receptores acoplados a la proteína G diferentes, los receptores H1-H4. En el SNC, los receptores de H1 juegan un papel clave en el ciclo de regulación del sueño y los antagonistas/agonistas inversos de H1 se conocen por inducir la somnolencia.

Del mismo modo, la serotonina juega papeles importantes en diversos procesos fisiológicos a través de su interacción con al menos catorce receptores acoplados a la proteína G diferentes. La modulación de los receptores 5-HT2A en el SNC juega un papel clave en el ciclo de regulación del sueño y los antagonistas de 5-HT2A han demostrado mejorar el sueño de ondas lentas y el mantenimiento del sueño en pacientes con insomnio.

Los compuestos que tienen actividad agonista inversa o antagonista de H1 o 5-HT2A han sido usados en el tratamiento del insomnio (por ejemplo, doxepina y trazodona, respectivamente) y tienen efectos farmacológicos significativos en estudios del sueño en animales. Sin embargo, actualmente no existe en el mercado ningún agonista inverso/antagonista de H1/5-HT2A con actividad doble selectiva.

El documento WO 2007/022068 describe ciertos compuestos (tieno[2,3-b][1,5]benzodiazepina-4-il)piperazin-1-ilo y (tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepina-4-il)piperazin-1-ilo sustituidos para el tratamiento de los trastornos del sueño.

La presente invención ácido proporciona ácido 3-[4-(2,8-dimetil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2- dimetil-propanoico y sales de farmacéuticamente aceptables del mismo, que tienen una alta potencia como agonista inverso para el receptor H1, una alta potencia como antagonista para el receptor 5-HT2A y una buena selectividad para estos receptores, particularmente frente a otros receptores de histamina, receptores de serotonina y otros receptores fisiológicamente relevantes particularmente frente al receptor 5-HT2C, el receptor GABAa, los receptores muscarínicos, los receptores dopaminérgicos, los receptores adrenérgicos, y el canal hER. Estos compuestos también demuestran a través de modelos animales que pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos del sueño caracterizados por un deficiente mantenimiento del sueño. Como tal, se cree que los compuestos son útiles para el tratamiento de trastornos del sueño caracterizados para una deficiente latencia del sueño o una deficiencia en el mantenimiento del sueño o ambos, tales como el tratamiento del insomnio, como por ejemplo el insomnio primario temporal o crónico, o el insomnio secundario temporal o crónico. Ejemplos de insomnio secundario incluyen, pero no se limitan a, insomnio asociado con trastornos depresivos (por ejemplo, trastorno depresivo mayor, distimia, y/o ciclotimia), insomnio asociado con trastornos de ansiedad (por ejemplo, trastorno de ansiedad generalizada y/o fobia social), insomnio asociado con dolor (por ejemplo, fibromialgia, dolor articular u óseo crónico, tal como el asociado con artritis inflamatoria o artrosis, o dolor neuropático diabético), insomnio asociado con reacciones alérgicas (por ejemplo, asma alérgica, prurito, rinitis, congestión, etc.), insomnio asociado con trastornos del pulmón o de las vías respiratorias (por ejemplo, con apnea obstructiva del sueño, enfermedad de las vías respiratorias reactivas, etc.), insomnio asociado con trastornos psiquiátricos, demencia, y/o enfermedades neurodegenerativas, y/o insomnio asociado con trastornos del sueño asociados al ritmo circadiano (por ejemplo, trastorno del sueño por trabajo a turnos, trastorno por jet lag, trastorno de fase del sueño retardada, trastorno del sueño de fase avanzada, y síndrome del sueño- vigilia no de 24 horas, etc.).

Además, los compuestos de la presente invención demuestran la potenciación de sus efectos sobre la fase del sueño que no es la fase de movimiento rápido de los ojos (sueño NREM) cuando se coadministran con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina.

La presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Es decir, ácido 3-[4-(2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4- il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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En otro aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, este aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica para tratar el insomnio, como por ejemplo el insomnio caracterizado por latencia prolongada del sueño o un mantenimiento deficiente del sueño o ambos, como por ejemplo insomnio primario, jet lag, trastorno del sueño por trabajo a turnos, trastorno del sueño de fase retardada, trastorno del sueño de fase avanzada y/o trastornos del sueño-vigilia no de 24 horas, que comprende un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con uno o más excipientes, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Una realización adicional de este aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. En una realización adicional más de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica además comprende un segundo agente terapéutico que es un inhibidor de la recaptación de serotonina, como por ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina.

La presente invención también proporciona un compuesto para su uso en un procedimiento para tratar el insomnio, como por ejemplo el insomnio caracterizado por latencia prolongada del sueño o mantenimiento deficiente del sueño o ambos, como por ejemplo insomnio primario, jet lag, trastorno del sueño por trabajo a turnos, trastorno del sueño de fase retardada, trastorno del sueño de fase avanzada y/o trastornos del sueño-vigilia no de 24 horas, en un mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra realización de este aspecto de la invención, el compuesto para su uso en un procedimiento comprende además administrar en combinación simultánea, separada o secuencial, un segundo agente terapéutico el cual es un inhibidor de la recaptación de serotonina, como por ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina. En una realización particular de estos procedimientos de tratamiento, el mamífero es un ser humano.

Esta invención también proporciona un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia. Dentro de este aspecto, la invención proporciona un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento del insomnio. En realizaciones adicionales, el insomnio se caracteriza por latencia prolongada del sueño o mantenimiento deficiente del sueño o ambos, como por ejemplo insomnio primario, jet lag, trastorno del sueño por trabajo a turnos, trastorno del sueño de fase retardada, trastorno del sueño de fase avanzada y/o trastornos del sueño-vigilia no de 24 horas. En otra realización de este aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un inhibidor de la recaptación de serotonina, como por ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina, en el tratamiento del insomnio. Una realización particular de este aspecto de las invenciones, los usos son en mamíferos, particularmente en seres humanos.

Otro aspecto de esta invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del insomnio, como por ejemplo insomnio primario caracterizado por latencia prolongada del sueño o mantenimiento deficiente del sueño o ambos, como por ejemplo insomnio primario, jet lag, trastorno del sueño por trabajo a turnos, trastorno del sueño de fase retardada, trastorno del sueño de fase avanzada y/o trastornos del sueño-vigilia no de 24 horas. Otra realización de este aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un segundo agente terapéutico el cual es un inhibidor de la recaptación de serotonina, como por ejemplo citalopram, paroxetina, fluoxetina y/o fluvoxetina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del insomnio, como por ejemplo, el insomnio caracterizado por latencia prolongada del sueño y/o mantenimiento deficiente del sueño, como por ejemplo insomnio primario, jet lag, trastorno del sueño por trabajo a turnos, trastorno del sueño de fase retardada, trastorno del sueño de fase avanzada y/o trastornos del sueño-vigilia no de 24 horas.

Por motivos de claridad, en toda la solicitud, se usará la siguiente numeración de la estructura del anillo tricíclico:

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El compuesto de esta invención tiene restos básicos y ácidos, y por consiguiente reacciona con diversos ácidos orgánicos e inorgánicos y bases para formar sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables del compuesto de la presente invención están contempladas dentro del alcance de la presente solicitud. El término “sal farmacéuticamente aceptable” como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sal de un compuesto de la invención que es sustancialmente no tóxico para los organismos vivos. Tales sales incluyen las citadas en el Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977), las cuales son conocidas por el experto en la materia.

Las abreviaturas usadas en el presente documento son las definidas a continuación:

“Salmuera” significa solución acuosa saturada de NaCI.

“DMEM” significa Medio de Eagle mínimo de Dulbecco.

“DMSO” significa dimetil sulfóxido.

“EDTA” significa ácido etilendiaminatetraacético.

“Equiv” significa equivalente(s).

“FBS” significa suero bovino fetal.

“HEPES” significa ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazin etanosulfónico.

“HPLC” significa cromatografía líquida de alta presión.

“h” significa hora u horas.

“IC50” significa la concentración en la cual se logra el 50 % de la inhibición máxima.

“LC-MS” significa espectrografía de masas por HPLC.

“MeOH” significa metanol.

“min” significa minuto o minutos.

“MS” significa espectroscopia de masas.

“MS (ES+)” significa espectroscopia de masas usando ionización por electronebulización.

“RMN” significa resonancia magnética nuclear.

“RO” significa ocupación del receptor.

“THF” significa tetrahidrofurano.

Química general

El compuesto de la presente invención se puede preparar de acuerdo con los siguientes ejemplos sintéticos. Preparación 1. 5-metiltiofen-3-carboxilato de metilo

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Se combinó 4-bromo-2-metil-tiofeno (24,5 g, 138,37 mmol), bis-(1,3-difenilfosfino)propano (2,35 g, 5,53 mmol), acetato de paladio (1,24 g, 5,53 mmol), trietilamina (38,57 ml, 276,73 mmol), metanol (40 ml) y dimetilsulfóxido (80 ml) y el recipiente de reacción se purgó con monóxido de carbono. Se presurizó a 206,84 kPa con monóxido de carbono y se calentó a 70 °C, con agitación durante la noche en monóxido de carbono. Los compuestos volátiles se evaporaron a presión reducida para dar una solución anaranjada oscura. Se añadió agua (300 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 ml) después se lavaron los extractos orgánicos combinados con agua (2 x 100 ml). Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a presión reducida. Se añadió éter dietílico 10 % en iso-hexano (500 ml) y el precipitado amarillo oscuro resultante se eliminó por filtración. Se evaporó el filtrado a presión reducida para dar 5-metiltiofen-3-carboxilato de metilo (18,894 g, 87,42 % de rendimiento) como un líquido. RMN de 1H (400,13 MHz, CDCla): 8 7,84 (d, J = 1,5, 1H), 7,16 (t, J = 1,5, 1H), 3,83 (s, 3H) y 2,46 (d, J = 1,5, 3H).

Preparación 2. Ácido 5-Metiltiofen-3-carboxílico

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A un matraz de 250 ml se añadió 5-metiltiofen-3-carboxilato de metilo (16,4 g, 104,99 mmoles, 1,00 equiv) y se disolvió en metanol (57,40 ml). Se añadió NaOH (12,60 g, 314,97 mmoles, 3 equiv) y agua (19,68 ml). Se calentó la suspensión a reflujo (65 °C) durante 45 min., hasta que la reacción se completó por LC-MS. Se enfrió la mezcla de

reacción a temperatura ambiente, después se añadió HCI acuoso 5M (85 ml, 5 vol), seguido por acetato de etilo (130 ml, 7,5 vol). Se agitó durante 15 min, hasta que todos los sólidos se disolvieron. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 130 ml). Los compuestos orgánicos combinados se lavaron con agua (3 x 130 ml), después salmuera (85 ml). Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y concentró para dar un sólido 5 de ácido 5-metiltiofen-3-carboxílico (13,93 g, 93,32 % de rendimiento). MS (m/z): 141,0 (M-H). rMn de 1H (400,13 MHz, CDCla): 7,99 (d, J= 1,5 Hz, 1 H), 7,20 (d, t= 1,5 Hz, 1H), 2,50 (d, J = 1,5, 3H).

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A una solución de ácido 5-metil-tiofen-3-carboxílico (13,93 g, 97,98 mmoles, 1,00 equiv) en ácido acético (119,80

10 ml), se añadió gota a gota bromo (5,03 ml, 97,98 mmoles, 1,00 equiv) como una solución en ácido acético (59,90 ml) durante 20 min. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, hasta que la reacción se completó por LC-MS. La mezcla de reacción se vertió lentamente en agua (696,50 ml) a temperatura ambiente y el precipitado resultante se recogió por filtración. Se lavó con agua (100 ml) y se secó en vacío y nitrógeno en una almohadilla durante 16 h para dar un sólido blanco de ácido 2-bromo-5-metil-tiofen-3-carboxílico (20,55 g, 94,88 % 15 de rendimiento). MS (m/z): 218,89, 220,79 (M-H). RMN de 1H 400,13 MHz, CDCla): 7,08 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 2,42 (s, 3H).

Preparación 4. 2-Bromo-N-(2-hidroxi-4-metil-fenil)-5-metil-tiofen-3-carboxamida

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20 A una suspensión de ácido 2-bromo-5-metil-tiofen-3-carboxílico (45,2 g, 204,46 mmoles, 1,00 equiv) en diclorometano (316,40 ml) en un matraz de 1 l, se añadió gota a gota dimetilformamida (500 pl), seguido por cloruro de oxalilo 2M en diclorometano (112,45 ml, 224,90 mmoles, 1,1 equiv) (precaución desprendimiento de gas). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h hasta que la mezcla de reacción se volvió una solución oscura, clara y la reacción se completó por TLC (eluyente EtOAc 30 % en iso-hexano). Se evaporó la 25 solución a sequedad y después se redisolvió el sólido resultante en tetrahidrofurano anhidro (678 ml). Esta solución se añadió a un matraz que contenía 6-amino-m-cresol (33,40 g, 265,79 mmoles 1,3 equiv), piridina (82,67 ml, 1,02 moles, 5 equiv) y tetrahidrofurano anhidro (678 ml). Se agitó a temperatura ambiente durante 2 h hasta que la reacción se completó por LC-MS. La mezcla de reacción se vertió en HCI acuoso 1M (2,71 l, 60 vol) con agitación y el precipitado resultante se recogió por filtración. Se lavó con HCI acuoso 1M (250 ml), después agua (250 ml) y se 30 secó a vacío en una almohadilla de filtro durante la noche para dar un sólido rojo de 2-bromo-N-(2-hidroxi-4-metil- fenil)-5-metil-tiofen-3-carboxamida (62,34 g; 93,47 % de rendimiento). Si es necesario, el sólido puede ser purificado además lavando con metanol. MS (m/z): 325,98, 327,93 (M+H).

Preparación 5. 2,8-Dimetil-5H-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-ona

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En un matraz de 500 ml se disolvió 2-bromo-N-(2-hidroxi-4-metil-fenil)-5-metil-tiofen-3-carboxamida (62,34 g, 191,10 mimóles, 1,00 equiv) en dimetilsulfóxido (1,56 l) y se añadió carbonato de potasio (79,23 g, 573,30 mmoles, 3 equiv). Se calentó la mezcla de reacción a 140 °C con agitación durante 4 h hasta que la reacción se completó por LC- MS. Se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y después se vertió en agua (2,5 l) controlando la exotermia con un baño de hielo. Se acidificó con HCI acuoso 2M (450 ml), se extrajo con diclorometano (4 x 800 ml) y se lavó la fase orgánica con bicarbonato de sodio acuoso saturado (1,2 l), después agua (2x2 l). Se secó, se filtró y concentró. Se purificó por cromatografía instantánea en columna sobre gel de sílice (750 g) eluyendo con acetato de etilo 0 % a 20 % en diclorometano para dar un sólido de 2,8-dimetil-5H-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-ona (28,1 g; 59,94 %). MS (m/z): 246,09 (M+H).

Preparación 6. 4-Cloro-2,8-dimetil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepina

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Se calentó una suspensión de 2,8-dimetil-5H-tieno[2,3- b][1,5]benzoxazepin-4-ona (26,84 g, 109,42 mmoles, 1,00 equiv) en metoxibenceno (107,36 ml) en un matraz de 500 ml hasta aproximadamente 60 °C. Se añadió N,N- dimetilanilina (38,89 ml, 306,37 mmoles, 2,8 equiv) en una porción, seguido por cloruro de fosforilo (23,39 ml, 251,66 mmoles, 2,3 equiv) durante 15 min. Se calentó la solución resultante a 100 °C durante 2 h, hasta que la reacción se completó por LC-MS. Se enfrió la mezcla de reacción ligeramente y se evaporó para dar un sólido oscuro de 4-cloro- 2,8-dimetil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepina (28,85 g, cuantitativo asumido). MS (m/z): 264,0 (M+H).

Preparación 7. 3-[4-(2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoato de metilo

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A una solución de 4-cloro-2,8-dimetil-tieno[2,3-b][1,5]benzoxazepina (28,85 g, 109,39 mmoles, 1,00 equiv) en acetonitrilo (288,50 ml), se añadió 2,2-dimetil-3-piperazin-1-il-propanoato de metilo (59,77 g, 218,77 mmoles , 2 equiv) y carbonato de potasio (136,06 g, 984,47 mmoles, 9 equiv). Se calentó la mezcla a un reflujo suave (82 °C) durante 3 h hasta que la reacción se completó por LC-MS. Se enfrió la reacción y se evaporó. Después se dividió entre agua (300 ml) y acetato de etilo (3 x 300 ml). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con agua (2 x 300 ml) y después con salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó. Se purificó por cromatografía instantánea en columna sobre gel de sílice (800 g) eluyendo con acetato de etilo 0 % a 30 % en iso-hexano para dar un aceite espeso de 3-[4-(2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoato de metilo (37,95 g; 81,14 % de rendimiento). MS (m/z): 428,1 (M+H).

Ejemplo 1. Ácido 3-[4-(2,8-Dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoico

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A una suspensión de 3-[4-[2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoato de metilo (37,95 g, 88,76 mmoles, 1,00 equiv) en alcohol isopropílico (227,70 ml) y agua (227,70 ml), se añadió hidróxido de sodio (10,65 g, 266,27 mmoles, 3 equiv) y se calentó la mezcla a reflujo suave (85 °C) durante 1,5 h hasta que se produjo la disolución completa y la reacción se completó por LC-MS. Se enfrió a temperatura ambiente y neutralizó a aproximadamente pH 6,0 - 6,5 usando HCI acuoso 2M (aprox. 120 ml), para dar un sólido precipitado.

El disolvente orgánico se eliminó a vacío para dar una suspensión. Se verificó el pH de la suspensión y en caso necesario se ajustó además a pH 6,0-6,5 con HCI acuoso 2M (aprox. 15 ml). Se filtró la suspensión y se lavó con agua, después se secó durante la noche a vacío. Se suspendió el material sólido bruto en acetonitrilo (100 ml, 2,5 vol), se sonicó y después se calentó suavemente (40 °C) con agitación durante 15 min. Se filtró, se lavó con 5 acetonitrilo (3 x 20 ml), después se secó el producto en vacío para dar un sólido de ácido 3-[4-(2,8-dimetiltieno[2,3- b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoico (29,5 g, 80,37 % de rendimiento). MS (m/z): 414,1 (M+H). RMN de 1H (400,13 MHz, CDCI3): 6,99 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,90 (dd, J = 7,8 y 1,5 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 3,67 (sa, 4H), 2,86 (sa, 4H), 2,59 (s, 2H), 2,34 (s, 3H), 2,28 (s, 3H) 1,26 (s, 6H).

Ejemplo 2. Diclorhidrato del ácido 3-[4-(2,8-Dimetiltieno[2,3- b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2- 10 dimetil-propanoico

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A una suspensión de ácido 3-[4-[2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoico (300 mg, 725,44 (emoles, 1,00 equiv) en alcohol isopropílico (4,50 ml) a 50 °C, se añadió HCI 4M en 1,4-dioxano (453,40 ^l, 1,81 mmoles, 2,5 equiv). Se calentó la solución resultante a 60 °C durante 30 min, después se enfrió a 15 temperatura ambiente. Se evaporó a vacío, se suspendió el sólido resultante en éter dietílico (4,50 ml) durante 15 min, después se recogió por filtración, y se secó en la almohadilla. Además se secó en horno a vacío durante 1 h para dar un sólido cristalino de diclorhidrato de ácido 3-[4-(2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1- il]-2,2-dimetil-propanoico (346 mg, 98,0 %). MS (m/z): 414,0 (M+H).

Ejemplo 3. Ácido 3-[4-(2,8-Dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1 -il]-2,2-dimetil-propanoico; 20 ácido 4-metilbencensulfónico

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A una suspensión de ácido 3-[4-(2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoico (300 mg, 725,44 emoles, 1,00 equiv) en etanol (6 ml) a 50 °C, se añadió ácido p-toluenosulfónico (124,92 mg, 725,44 emoles, 1 equiv) y se agitó la solución resultante a 50 °C durante 30 min. Se enfrió a temperatura ambiente y 25 se evaporó a vacío para dar un sólido. El sólido se suspendió en éter dietílico (4,50 ml) durante 15 min, después se recogió por filtración y se secó en la almohadilla. Además se secó en horno a vacío durante 1 h para dar un sólido cristalino de ácido 3-[4-(2,8-dimetiltieno[2,3-b][1,5]benzoxazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoico; ácido 4- metilbencensulfónico (413 mg, 97 %). MS (m/z): 414,0 (M+H).

Los datos extraídos de la bibliografía (Morairty SR, Hedley L, Flores J, Martin R, Kilduff TS. (2008) Selective 5-HT2A 30 and 5-HT6 receptor antagonists promote sleep in rats. Sleep 31, 34-44. y Barbier, A.J., and Bradbury, M.J., Histaminergic Control of Sleep-Wake Cycles: Recent Therapeutic Advances for Sleep and Wake Disorders, CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, vol 6, pg. 31-43 (2007)) y los datos obtenidos en estudios no clínicos en animales apoyan un papel para los agonistas inversos de H1/antagonistas de 5-HT2A con actividad doble en el tratamiento del insomnio y el tratamiento sintomático del insomnio asociado con otros trastornos tales como 35 trastornos depresivos, trastornos de ansiedad, dolor, alergias, trastornos de pulmón y vías respiratorias, trastornos psiquiátricos, demencia y/o enfermedades neurodegenerativas y/o trastornos del sueño asociados al ritmo circadiano. Especialmente se ha observado que ciertos agonistas inversos de H1/antagonistas de 5-HT2a con actividad doble son efectivos en el incremento del tiempo de sueño total usando roedores controlados por EEG sin hipoactividad desproporcionada o clínicamente relevante, disminución del sueño REM o hipersomnolencia.

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Para demostrar adicionalmente las características de los presentes compuestos, pueden llevarse a cabo siguientes ensayos in vitro e in vivo:

Ensayos de unión y actividad in vitro:

Ensayo de unión competitiva a H1

Se llevaron a cabo experimentos de unión a [3H]-pirilamina en un formato de SPA (ensayo de proximidad de centelleo) con 96 pocillos. Las membranas usadas en este ensayo se preparan a partir de células HEK-293 que expresan de forma estable el receptor H1 recombinante (humano). La incubación es iniciada por la adición de una mezcla de perlas WGA PVT SPA (1 mg/pocillo, Perkin Elmer (Ma, USA) RPNQ0001) y 3 |jg de membranas al tampón de ensayo (Tris 67 mM; pH 7,6) que contiene [3H]-pirilamina 3,5 nM y diferentes concentraciones del compuesto de ensayo (curvas de concentración-respuesta de 10 puntos). Se determinaron uniones no específicas en la presencia de triprolidina 10 jM. Las muestras se incubaron durante 4 ha temperatura ambiente (22 °C) y después se leyeron en un Microbeta Trilux.

Ensayo de unión competitiva a 5-HT?a

Se llevaron a cabo experimentos de unión a [3H]-cetanserina en un formato de SPA con 96 pocillos. Las membranas usadas en este ensayo se prepararon a partir de células AV-12 que expresan de forma estable el receptor 5-HT2a recombinante (humano). La incubación se inició con la adición de una mezcla de perlas WGA YSi SPA (1 mg/pocillo, Perkin Elmer (MA, USA), RPNQ0011) y 2 jg de membranas al tampón de ensayo (Tris 67 mM, 0,5 mM EdTa; pH 7,6) que contienen [3H]-cetanserina 3,1 nM y diferentes concentraciones del compuesto de ensayo (curvas de concentración-respuesta de 10 puntos). Se determinaron uniones no específicas en la presencia de 1-(1- naftil)piperazina 20 jM. Las muestras se incubaron durante 4 ha temperatura ambiente (22 °C) y después se leyeron en un Microbeta Trilux.

Ensayo de unión competitiva a 5-HT?c

Se llevaron a cabo experimentos de unión a [125l]-(±)DOI en un formato SPA con 96 pocillos. Las membranas usadas en este ensayo se prepararon a partir de células AV-12 que expresan de forma estable el receptor 5-HT2c recombinante (humano). La incubación se inició por la adición de una mezcla de perlas WGA PVT SPA (0,5 mg/pocillo, Perkin Elmer (MA, USA), RPNQ0001) y 2,5 jg membranas al tampón de ensayo (Tris-HCl 50 mM, MgCh 10 mM, EDTA 0,5 mM, pargilina 10 jM, ácido ascórbico 0,1 %, pH 7,4) que contiene [[125l]-(±)DOI 0,2 nM y diferentes concentraciones del compuesto ensayado (curvas de concentración-respuesta de 10 puntos). Se determinaron uniones no específicas en la presencia de 1-(1-naftil)piperazina 20 jM. Las muestras se incubaron durante 4 ha temperatura ambiente (22 °C) y después se leyeron en un Microbeta Trilux.

Análisis de los datos de unión

Se evaluaron las curvas usando una ecuación no lineal logística de 4 parámetros para obtener la concentración del competidor provocando 50 % de inhibición de unión del radioligando (IC50). Se calcularon las constantes de disociación de equilibrio (Ki) de acuerdo con la ecuación K¡ = IC50/O +L/Kd), en donde L es igual a la concentración de radioligando usado en el experimento y Kd es igual a la constante de disociación de equilibrio del radioligando para el receptor, determinada del análisis de saturación estándar o experimentos de competencia homólogos. Los valores dados para Ki, en donde los valores n son los indicados, se muestran como media geométrica ± el error estándar de la media (SEM), estando el número de determinaciones replicadas indicadas por n. Las medias geométricas se calcularon por la ecuación GeoMean = 10A(Promedio (log Ki 1 + log Ki 2 +...log Ki n)/n cuadrado).

Antagonismo de GABAa usando receptores nativos en cultivos neuronales primarios

Se evaluó la actividad de los compuestos en receptores GABAa nativos mediante el control de los flujos de calcio usando el sistema FLIPR® en formato de 96 pocillos (Lector de placa por formación de imagen fluorométrica (FLIPR®, Molecular Devices). En resumen, se disociaron neuronas embrionarias corticales se disociaron de embriones de rata E18 y se sembraron en placas a una densidad óptima en placas FLIPR® de 96 pocillos recubiertos con poli-D-lisina de fondo transparente y pared negra. Después de cargar las células con un tinte sensible al calcio (Fluo4-AM, Molecular Devices), las células se bañaron en una solución que contiene bajos niveles de cloruro (cloruro reemplazado por gluconato). En estas condiciones, la activación de los receptores GABAa causan un flujo de salida de iones cloruro (en la dirección del gradiente químico), lo que tiene como resultado la despolarización de la membrana y la consiguiente activación de los canales de calcio regulados por voltaje (VGCC). Se registró el influjo de calcio a través de los VGCC y se analizaron en estado desconectado usando el sistema FLIPR®. Para una validación farmacológica del ensayo, se registraron las curvas de concentración-respuesta (CRC) para el agonista estándar (GABA) y el antagonista estándar (gabazina). Se determinan cualquiera de los efectos en modo CRC frente a una concentración fija del agonista GABA a 10 jM (equivalente a una respuesta GABA de EC90).

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Procedimientos:

Los efectos antagonistas de los compuestos son cuantificados usando curvas dosis-respuesta de 10 puntos comparando las respuestas de fluorescencia máximas al GABA agonista en la presencia y ausencia del compuesto. La ventana de ensayo se define como la respuesta máxima obtenida por GABA en su concentración EC90 predeterminada menos la respuesta obtenida por una concentración de inhibición completa de gabazina (50 |jM). Se calcularon los efectos antagonistas como un porcentaje de la ventana de ensayo. Se calcularon todos los datos como valores IC50 relativos usando un programa de ajuste de curva logística de cuatro parámetros (Prism Graphpad® 3.01). Se compararon las potencias de antagonista para todos los compuestos con gabazina con tres replicados en cada ensayo.

Además, los compuestos de la invención pueden ser probados en ensayos de unión y ensayos de actividad funcional por procedimientos bien conocidos para otros receptores fisiológicamente importantes tales como, pero sin limitarse a, canal hERG, otros receptores de serotonina (específicamente receptores 5-HT-ib, 5-HT-id, ausencia de actividad agonista en receptores 5-HT2B, receptores 5-HT2C, 5-HT5, 5-HT6 y 5-HT7), receptores dopaminérgicos (específicamente D1, D2, y D3), receptores GABAa, receptores adrenérgicos y transportadores de monoamina.

Los compuestos del ejemplo 2 son probados esencialmente como se ha descrito anteriormente y se ha observado que tienen los perfiles de actividad como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Datos de selectividad

Ejemplo 2

H1 Ki (nM)

131

5-HT2A Ki (nM)

11,3

5-HT2B Ki (nM)

95,8

Agonista de 5-HT2B EC50 (nM)

>10.000

Antagonista de 5-HT2B Kb (nM)

45

5-HT2C Ki (nM)

883

GABAa IC50 (|jM)

98

Canal hERG (jM)

>100

Dopamina D1 Ki (nM)

2.350

Dopamina D2 Ki (nM)

2.480

Dopamina D3 Ki (nM)

>5.660

5-HT-ib Ki (nM)

ND

5-HT-id Ki (nM)

>3.980

5-HT5 Ki (nM)

>8.830

5-HT7 Ki (nM)

>2.060

Alfa adrenérgico-iA Ki (nM)

>10.500

Alfa adrenérgico-iB Ki (nM)

>16.200

Alfa adrenérgico2A Ki (nM)

>9.020

Alfa adrenérgico2B Ki (nM)

3.710

Alfa adrenérgico2C Ki (nM)

>5.550

Transportador de serotonina Ki (nM)

>651

Transportador de norepinefrina Ki (nM)

>674

Transportador de dopamina Ki (nM)

>877

Por lo tanto, las dosis fisiológicamente relevantes de los compuestos de la invención se espera que proporcionen inhibición sustancial de los receptores H1 y 5-HT2A in vivo, a la vez que no interactúan sustancialmente con otros receptores fisiológicamente relevantes, y de este modo se espera que proporcione la farmacología deseada mientras se evitan los efectos no deseados asociados con la actividad no diana. Estos efectos no deseados incluyen, pero no se limitan a los siguientes: actividad antagonista de 5-HT2C asociada con aumento de peso durante el tratamiento, actividad agonista de 5-HT2B asociada con valvulopatía, modulación del canal hERG asociada con prolongación QT y actividad antagonista de GABAa asociada con actividad convulsiva. Además, se evita la interferencia con la fisiología del sueño/vigilia por la selectividad sobre los receptores de dopamina, otros receptores

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de serotonina, receptores adrenérgicos y transportadores de monoamina.

Ocupación del receptor 5-HT?a: Se ensaya la ocupación del receptor (RO) para demostrar la actividad del antagonista/agonista inverso en el receptor 5-HT2a in vivo. Brevemente, a ratas macho Sprague-Dawley (Harían Sprague-Dawley, Indianápolis, IN) que pesan aproximadamente 230-280 gramos se les permite acceso libre al alimento y al agua hasta el comienzo de las 3 h del protocolo experimental. Se usa 1 mg/kg de cetanserina (antagonista 5-HT2a no selectivo) como un control positivo para establecer la validez del ensayo. Los compuestos de prueba o control son administrados mediante sonda oral en un vehículo comprendido por hidroxipropil beta- ciclodextrina 20 %. Se usa MDL 100907 ((R)-(+)-a-(2,3-Dimetoxifenil)-1-[2-(4- fluorofenil)etil]-4-piperidinmetanol), un antagonista selectivo de 5-HT2a, como un indicador. El MDL 100907 se suspende en agua con 5 |jI de ácido láctico diluido (1 mg/ml), diluido a 6 jg/ml con solución salina y administrado en un volumen de 1 ml/kg por vía intravenosa a través de la vena lateral de la cola para proporcionar una dosis indicadora de 3 jg/kg. Se administra a las ratas el compuesto de prueba, cetanserina, o vehículo (N = 4), seguido 1 hora después de una dosis indicadora de 3 jg/kg, intravenosa, de MDL 100907. Se considera que la medición de la ocupación del receptor se produce en el momento de la administración del indicador. Quince minutos después de la administración del indicador, las ratas son sacrificadas por dislocación cervical. Se extraen muestras de plasma y muestras de la corteza frontal y cerebelo. El nivel del indicador MDL 100907 es medido en cada muestra cortical y cerebelar. La ocupación del receptor se calcula usando el procedimiento de relación bien establecido el cual emplea una región de alta densidad del receptor representativa de la unión total (corteza frontal) normalizada por un área sin o con niveles muy bajos del receptor (cerebelo). Esta región, denominada como la región cero, representa la unión no específica de la sonda del ligando. La relación de vehículo de los niveles indicadores en la corteza con relación al cerebelo representa 0 % de ocupación. Una relación de 1 representa el 100 % de ocupación y se logra cuando toda la unión específica al receptor 5-HT2a del indicador MDL 100907 es bloqueada. Las relaciones intermedias entre indicador cortical y cerebelar de cada grupo pretratado con el compuesto de prueba son interpoladas linealmente entre la relación de los niveles de indicador en los animales tratados con vehículo (0 % de ocupación) y una relación de 1 (100 % de ocupación) con el fin de determinar el porcentaje de ocupación del receptor 5-HT2a.

Análisis de MDL 100907: Se pesaron muestras de corteza y cerebelo y se dispusieron en tubos cónicos de centrífuga en hielo. A cada tubo se añaden cuatro volúmenes (p/v) de acetonitrilo que contiene ácido fórmico 0,1 %. Las muestras son a continuación homogenizadas y centrifugadas a 14.000 RPM (21.920 x g) durante 16 min. El sobrenadante se diluye añadiendo100 - 900 jl de agua estéril en viales de inyección de HPLC para análisis de LC/MS/MS. El análisis de MDL 100907 se lleva a cabo usando un aparato de HpLC Agilent modelo 1200 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) y un espectrómetro de masas API 4000. La separación cromatográfica se realiza en una columna C18 de 2,1 X 50 mm (Agilent número de pieza 971700-907) con una fase móvil que consiste en acetonitrilo 60 % en agua con un contenido total de ácido fórmico 0,1 %. La detección de MDL 100907 se realiza controlando la transición del precursor al ion del producto con una relación de masa a carga (m/z) de 374,2 a 123,0. Los patrones se preparan añadiendo cantidades conocidas de analito a muestras de tejido cerebral a partir de ratas no tratadas y procesándolas como se describe anteriormente.

Procedimientos estadísticos: Las curvas para cada estudio son ajustadas a una función logística de 4 parámetros con el fondo fijo a 0 % usando JMP® versión 8.0 (SAS Institute Inc, Cary NC) y ED50 absoluta se calcula mediante el software. Los valores son dados como medias, errores estándar e intervalos de confianza del 95 %. El compuesto del Ejemplo 2 se prueba esencialmente como se describe y se determina que consigue una alta ocupación del receptor 5-HT2a con una ED50 de 0,09 mg/kg.

Inhibición de la actividad de sacudidas de la cabeza inducidas por DOI: La actividad antagonista del receptor 5-HT2a in vivo del compuesto de la presente invención es además demostrada por su capacidad para bloquear la actividad de sacudimiento de la cabeza inducida por el agonista del receptor 5-HT2a 2,5-dimetoxi-4-yodoanfetamina (DOI). (véase por ejemplo, Bartoszyk GD, van Amsterdam C, Bottcher H, Seyfried CA. EMD 281014, a new selective serotonin 5-HT2A receptor antagonist. Eur J Pharmacol. 2003 473: 229-230). Brevemente, ratones macho C57BL/6J (20-25 g, Charles River) son alojados en condiciones de alojamiento estándar (32 ratones en una jaula IVC grande, fase de luz 07.00 a 19.00, temperatura constante (19-23 °C) y humedad (50 % +/-10), alimento y agua a voluntad). Los ratones recibieron vehículo (metilcelulosa 0,25 %), DOI (3 mg/kg en solución salina) o compuesto de prueba a 10 mg/kg PO más DOI (3 mg/kg en solución salina). Los compuestos de prueba son individualmente evaluados en grupos de cuatro por experimento con n=4 para cada compuesto, junto con el vehículo y DOl + vehículo (n=8). Después de un tiempo de pre-tratamiento con el compuesto de prueba durante 60 minutos, los ratones recibieron vehículo (solución salina) o 3 mg/kg de DOI administrados subcutáneamente y después son colocados en cámaras de observación perspex transparentes. Cinco minutos después de la administración del vehículo o DOI, se cuenta durante 15 minutos el número de sacudidas de cabeza registradas visualmente que presenta cada ratón individual. Los datos son analizados usando una prueba ANOVA y Dunnet post-hoc. El compuesto del Ejemplo 2 es probado esencialmente como se describe y se demuestra que inhibe la respuesta al movimiento de cabeza inducido por DOI al 100 % con 10 mg/kg.

Control del sueño y del comportamiento en ratas: El compuesto de la presente invención es probado en ratas para determinar su capacidad para incrementar la cantidad de sueño o disminuir la interrupción de sueño o ambos sin efectos no deseados tales como inhibición de sueño REM, deterioro motor del despertar, y/o insomnio de rebote. Los animales de prueba son controlados de forma continua mediante electroencefalogramas (EEG),

5

10

15

20

25

30

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45

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60

electromiogramas (EMG) y movimiento para medir el sueño no REM acumulado, sueño total acumulado, duración de episodio de sueño promedio, duración de episodio de sueño más largo, insomnio de rebote, inhibición del sueño REM e intensidad de actividad locomotora durante el desvelo. Los procedimientos para tales estudios se conocen en la técnica (véase por ejemplo, los procedimientos descritos en Edgar DM, Seidel WF. Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hypersomnolence in the rat. J Pharmacology & Experimental Therapeutics 1997; 283: 757-769; van Gelder RN, Edgar DM, Dement WC. Real-time automated sleep scoring: validation of a microcomputer-based system for mice. Sleep 1991, 14: 48-55; and Gross BA, Walsh CM, Turakhia AA, Booth V, Mashour GA, Poe GR. Open-source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats. J Neurosci Methods. 2009; 184(1):10-8). Los estudios se realizan de la siguiente manera:

Preparación del animal. Ratas Wistar macho, adultas (aproximadamente 270-300 g en el momento de la cirugía) son quirúrgicamente fijadas para el registro crónico de EEG, EMG y el movimiento como sigue: Las ratas son quirúrgicamente preparadas con un implante craneal que consiste en cuatro tornillos de acero inoxidable para registro de EEG (dos frontales [3,9 mm anterior del bregma y ± 2,0 mm mediolateralmente] y dos occipitales [6,4 mm posterior del bregma, ± 5,5 mm mediolateralmente]), y con dos alambres de acero inoxidable recubiertos de Teflón para registro del EMG (posicionado bajo los músculos trapezoides de la nuca). Todos los cables son soldados a un conector en miniatura (Microtech, Boothwyn, PA) previo a la cirugía. El ensamble del implante es fijado al cráneo por la combinación de los tornillos de registro del EEG de acero inoxidable, aplicando cianoacrilato entre el conector de implante y el cráneo y acrílico dental. La actividad locomotora es controlada mediante un transmisor miniatura (Minimitter PDT4000G, Philips Respironics, Bend, OR) quirúrgicamente colocado en el abdomen. Se dejan al menos 3 semanas para la recuperación.

Entorno de registro. Cada rata es alojada individualmente dentro de una jaula microaisladora modificada con un elevador superior de filtro de policarbonato insertado para permitir el espacio para la cabeza más vertical. Un cable flexible que restringe mínimamente el movimiento es conectado en un extremo a un conmutador fijo a la parte superior de la jaula y en el otro extremo al implante craneal del animal. Cada jaula está localizada dentro de compartimientos ventilados, separados de una cámara de registro de sueño-vigilia de acero inoxidable. El alimento y el agua están disponibles a voluntad y la temperatura ambiental es mantenida a aproximadamente 23 ± 1 °C. Un ciclo de luz-oscuridad de 24 horas (LD 12:12) usando luz fluorescente es mantenido a través del estudio. La humedad relativa promedio es de aproximadamente 50 %. Los animales no son molestados durante al menos 30 h antes y después de cada tratamiento.

Diseño del estudio y dosificación. El vehículo (placebo, metilcelulosa, 15 centipoises 0,25 % en agua) o uno de los niveles de dosis del compuesto de prueba es administrado pseudo-aleatoriamente por vía oral a razón de 1 ml/kg de manera que ninguna rata recibe el mismo tratamiento dos veces, y ninguna rata recibe más de dos de los 8 tratamientos en cualquier estudio. Cada rata es sacada de su jaula durante aproximadamente un minuto para ser pesada y tratada. Antes y después de cada tratamiento existe un período de “lavado” de seis días.

Recogida de datos. La discriminación entre vigilia y sueño puede ser automatizada (por ejemplo, Van Gelder y col., 1991 (más arriba); Edgar y col., 1997 (más arriba); Winrow CJ, y col., Neuropharmacology 2010; 58(1):185-94 y Gross y col., 2009 (más arriba). El EeG es amplificado y filtrado (X10.000, paso de banda 1-30 Hz), el EMG es amplificado e integrado (paso de banda 10-100 Hz, integración RMS) y la actividad locomotora no específica (LMA) es controlada simultáneamente. Los estados de excitación son clasificados en partes temporales de 10 segundos como sueño no REM, sueño REM, vigilia o vigilia dominada por ondas theta. La actividad locomotora (LMA) es registrada como recuentos por minuto y es detectada por receptores de telemetría comercialmente disponibles (ER4000, Minimitter, Bend, OR).

Análisis estadístico. Todos los animales de los que se dispone al menos un resultado son incluidos en el resumen de los resultados (por ejemplo, se incluyeron datos apropiados de un tratamiento de un animal para el cual son utilizables los datos de telemetría pero no los datos del EEG). El período de observación post-tratamiento se divide en intervalos post-dosificación apropiados para cada resultado, donde el tiempo de dosificación es definido como el inicio de la Hora = 0 y los resultados son resumidos en el período de observación por cálculo ya sea del valor acumulado o de la media de cada hora en cada período (véase la leyenda de la Tabla 2 para una definición precisa de cada resultado). Los episodios de sueño son analizados en la escala log para estabilizar la variación y el resto de las variables son analizadas en la escala lineal. Cada resultado en cada período es analizado por análisis de covarianza usando el grupo de tratamiento y los datos de tratamiento como factores y el intervalo de pre-tratamiento correspondiente, 24 horas antes, como la covarianza. Las medias ajustadas y el cambio de medios de vehículo y sus errores estándar correspondientes son resumidos para cada grupo de tratamiento. Los resultados analizados en la escala log son transformados nuevamente para dar las medias geométricas y los resultados de la relación- vehículo media.

El compuesto del Ejemplo 2 es probado básicamente como se describe. Se observa que el compuesto del Ejemplo 2 aumenta significativamente el tiempo del sueño NREM acumulado y el tiempo del sueño total acumulado sin insomnio de rebote significativo, o la inhibición de la intensidad locomotora (LMI) con 3 mg/kg. La inhibición del sueño REM, sin embargo, no puede ser descartada por estos datos. (Véase perfil del sueño e intensidad de la actividad locomotora en la Tabla 2).

Tabla 2. Compuesto del Ejemplo 3

Dosis (mg/kg PO)

Variables de la eficacia Sueño NREM acumulado N Media aj. EE Variables de efecto no deseado Insomnio de rebote N Media aj. LCL

10 3 1 0,5 0,25 0,025

4 36,7 8,8 4 0,4 -9,0

8

29,2 6,9 8 -1,3 -8,5

10

31,9 6,5 10 -3,8 -10,6

9

21,7 6,8 9 -0,3 -7,4

4

34,3 9,1 4 1,0 -8,2

4

1,3 8,9 4 0,3 -9,0

Sueño total acumulado nhibición REM

Dosis

N Media aj. EE N Media aj. LCL

(mg/kg

PO)

10

4 32,8 9,9 4 -12,1 -20,9

3

8 26,9 7,8 8 -4,2 -11,2

1

10 30,8 7,3 10 0,1 -6,4

0,5

9 21,7 7,9 9 0,7 -6,1

0,25

4 33,5 10,3 4 -1,5 -10,4

0,025

4 -2,3 10,1 4 -2,7 -11,6

Episodio de sueño medio Intensidad de la actividad locomotora

Dosis

N Media aj. EE N Media aj. LCL

(mg/kg

PO)

10

4 1,7 0,3 4 -3,7 -6,5

3

8 1,5 0,2 8 -2,6 -4,8

1

10 1,7 0,2 10 -2,5 -4,6

0,5

9 1,6 0,2 9 0,0 -2,2

0,25

4 1,6 0,2 4 -1,6 -4,4

0,025

4 1,0 0,1 4 -0,1 -2,9

Episodio de sueño más largo

Dosis

N Media aj. EE

(mg/kg

PO)

10

4 1,9 0,4

3

8 1,9 0,3

1

10 2,2 0,3

0,5

9 2,1 0,3

0,25

4 1,6 0,3

0,025

4 1,0 0,2

Tabla 2. Estadísticas de resultados: Abreviaturas: N = tamaño de muestra; Media adj. = valor medio del grupo

ajustado con relación a los controles del vehículo; EE = error estándar de la media;

LCL = límite de confianza al 95

% inferior, NREM = no REM, es decir, todos los sueños distintos del sueño REM

. El tamaño de la muestra del

grupo de vehículo de referencia paralelo fue N=27,

Las definiciones y unidades - medias son las diferencias ajustadas a partir de los controles de vehículo:

• Sueño acumulado: en las primeras 6 horas post-tratamiento, en minutos ('Sueño total' indica sueño NREM + 5 sueño REM).

• Episodio de sueño promedio: promedio de episodios de sueño promediados por hora en las primeras 6 horas post-tratamiento, expresado como incremento de n-veces sobre los controles del vehículo.

• Episodio de sueño más largo: el episodio de sueño más largo en las primeras 6 horas post-tratamiento expresado como incremento de n veces sobre los controles de vehículo.

5 • Insomnio de rebote: minutos acumulados de sueño NREM + REM durante las primeras 3 horas de iluminación en

el período, es decir, 7a, 8a y 9a horas post-tratamiento.

• Inhibición REM: minutos acumulados de sueño REM durante las primeras 12 horas post-tratamiento.

• Intensidad de la actividad locomotora (LMA): expresada como recuentos de LMA por minuto de vigilia definida por el EEG, promediada en las primeras 6 horas post-tratamiento.

10 Determinación de la eficacia. La eficacia umbral de cada una de las cuatro variables de eficacia se calcula trazando el incremento en cada variable con relación a los controles del vehículo durante el período de 6 horas después del tratamiento frente al log(dosis). La eficacia umbral para cada variable es aquella dosis, estimada por la regresión no lineal logística de 4 parámetros, que da el valor de umbral de eficacia definido; +30 min de sueño no REM acumulado adicional, +25 min de sueño total acumulado adicional, incremento 1,75x en la duración del episodio de 15 sueño promedio, e incremento 1,5x en la duración del episodio de sueño más largo. Se determinó que el compuesto del ejemplo 2 tiene unas dosis de eficacia umbral como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3

Dosis de eficacia estimada (mg/kg) Intervalo de confianza del 95 % (mg/kg)

acumulación NREM = 30 min.

0,05 0,04-n.e.*

acumulación de sueño total = 25 min.

0,07 0,03-0,09

episodio de sueño más largo (aumento 1,75 veces)

0,26 0,07-0,20

episodio de sueño promedio (aumento 1,5 veces)

0,21 0,03-0,06

*n.e. = no estimable, estadísticamente

Inhibición del sueño REM

(minutos)

imagen13

imagen14

Dosis (mg/kg)

20

30

15

Insomnio de rebote o (minutos)

-15

imagen15

-30: U

0,01

imagen16

imagen17

Dosis (mg/kg)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Alteración de la

actividad 4

locomotora (LMA) q

(Recuentos de LMA por -4

minuto de vigilia definida por el EEG) ’8

imagen18

imagen19

Dosis (mg/kg)

Determinación de efectos no deseados. Cada variable de resultado de 'efecto no deseado' (véase en la leyenda de Tabla 2 las definiciones) es trazada frente al log(dosis). El valor de umbral para la inhibición del sueño REM es definido como una reducción acumulada de sueño REM de -10 min. El valor de umbral para el insomnio de rebote es definido como -20 min. El valor de umbral para la LMI reducida se define como -5 recuentos de la actividad locomotora por minuto de vigilia definida por el EEG. Un efecto no deseado significativo se define como aquel que ocurre cuando el límite de confianza inferior está por debajo del valor umbral en cualquier dosis en o por debajo de 10 veces la dosis eficaz promedio y es evidente una tendencia respuesta-dosis para las dosis por encima de la dosis de eficacia umbral. Para los compuestos del Ejemplo 2, la inhibición del sueño REM excedió el valor de umbral a 3 mg/kg, pero esta dosis es más de 10 veces la dosis más conservadora eficaz de 0,26 mg/kg (Tabla 3); la inhibición del sueño REM aparente a 0,25 mg/kg y 0,025 mg/kg no son parte de una tendencia relacionada con la dosis y no son estadísticamente significativas a estas dosis y pueden por lo tanto ser consideradas un artefacto del tamaño pequeño de la muestra a estas dosis; sin embargo, la inhibición del sueño REM no puede ser descartada por estos datos. Se concluye que con 10 veces la dosis de eficacia más conservadora no se observa ninguna ocurrencia no deseada de insomnio de rebote de REM, o reducción en la LMI, no pudiéndose descartar la inhibición del sueño REM. Los valores negativos indican inhibición REM, insomnio de rebote y LMI reducida, respectivamente.

En estudios adicionales, los compuestos de la presente invención pueden ser coadministrados con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina para demostrar una potenciación de su efecto en el sueño no REM (movimientos rápidos de los ojos) (sueño NREM) y el mantenimiento del sueño. El compuesto del Ejemplo 2 es coadministrado con citalopram en estudios de sueño en rata esencialmente como se describe anteriormente para el compuesto solo y se observó que aumentaba significativamente el sueño NREM a dosis significativamente inferiores.

Aclaramiento del plasma: Es importante en un compuesto útil para tratar trastornos del sueño tales como insomnio que sea adecuadamente eliminado del cuerpo con una velocidad de aclaramiento favorable para evitar efectos no deseados tales como somnolencia prolongada más allá del período de sueño deseado, somnolencia diurna, cognición deteriorada después de despertar, etc. La presente invención proporciona compuestos con velocidades de aclaramiento mejoradas. La velocidad de aclaramiento puede ser ensayada esencialmente como se describe más abajo.

Las ratas macho Sprague Dawley (intervalo de peso corporal 250-320 g) con cánulas permanentes en la arteria femoral son adquiridas en Charles River, Wilmington, MA 01887, EE.UU. El compuesto de prueba es administrado intravenosamente en solución (1 ml/kg) en Captisol® 20 % en tampón fosfato 22,5 mM, pH 2, a una concentración de fármaco final de 1,0 mg/ml (equivalentes de base libre). Las muestras de sangre se obtuvieron usando la cánula permanente durante 24 h. Las muestras de plasma de obtuvieron por centrifugación y se almacenaron congeladas (20 °C), o en hielo seco, antes del análisis.

Los perros Beagle macho (intervalo de peso corporal 10-12 kg) se obtuvieron de Marshall Bioresources, EE.UU. El compuesto de prueba se administró intravenosamente en solución (1 ml/kg) en Captisol® 20 % en tampón fosfato 22,5 mM, pH 2, a una concentración de fármaco final de 1,0 mg/ml (equivalentes de base libre). Las muestras de sangre se obtuvieron de la vena yugular durante 24 h. Las muestras de plasma se obtienen por centrifugación y se almacenaron congeladas (-20 °C) antes del.

Las muestras de plasma congeladas son descongeladas a temperatura ambiente para el bioanálisis de las concentraciones del compuesto de prueba. Se añadió a todas las muestras de plasma (1:1, v/v) un compuesto patrón interno relacionado en acetonitrilo/metanol (1:1, v/v)- Las muestras son centrifugadas para eliminar la proteína precipitada ante del análisis. Los sobrenadantes son analizados por inyección y elución de gradiente rápido en una columna Javelin Betasil C18 (cartucho 20 x 2,1 mm, Fase Móvil A: Agua/NH^COa 1M, 2000:10 v/v, Fase Móvil B: MeOH/NH4HCO3 1M, 2000:10 v/v). Los analitos eluidos son detectados por análisis LC-MS-MS usando un espectrómetro de masas cuadrupolo triple Sciex API 4000, Las concentraciones del compuesto se determinaron a partir de los patrones preparados y analizados en condiciones idénticas. La separación se calcula usando un análisis

5

10

15

20

25

30

no compartimental en Watson 7,4, Thermo Fisher Scientific, Inc.

. , . . Dosis

Aclaramiento = -----------------------------------------------------------------------------

Area bajo la curva de concentración plasmática/tiempo

El compuesto del Ejemplo 2 se analiza básicamente como se describe y se determina que tiene perfiles de aclaramiento favorables:

Ejemplo Aclaramiento (ml/min./Kg)

Rata Perro

2 27 (+/- 7,3, n=3) 2,8 (+/-1,2, n=3)

Aunque es posible administrar los compuestos como se emplean en los procedimientos de esta invención directamente sin ninguna formulación, los compuestos son habitualmente administrados en la forma de composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como un principio activo y al menos un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden ser administradas por una variedad de rutas que incluyen oral, sublingual, nasal, subcutánea, intravenosa e intramuscular. Tales composiciones farmacéuticas y los procedimientos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia, ed., 21 ed., Lippincott Williams & Wilkins Co., 2005).

Las composiciones son preferiblemente formuladas en una forma de dosificación unitaria, cada dosificación contiene de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60 mg, más habitualmente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 mg, como por ejemplo entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg del principio activo. La expresión “forma de dosificación unitaria” se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con al menos un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado.

Los compuestos de Formula I son en general efectivos en un amplio intervalo de dosificación. Por ejemplo, las dosificaciones por día normalmente están en el intervalo de aproximadamente 0,002 a aproximadamente 1,0 mg/kg, más habitualmente de aproximadamente 0,008 a 0,5 mg/kg, y como por ejemplo entre 0,015 y 0,15 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente son más que adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis todavía más altas sin causar ningún efecto secundario nocivo y, por lo tanto, los intervalos de dosificación anteriores no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna forma. Se entenderá que la cantidad del compuesto realmente administrada será determinada por un médico en vista de las circunstancias relevantes, incluyendo la afección a ser tratada, la vía de administración elegida, el compuesto o compuestos reales administrados, la edad, peso y la respuesta del paciente individual y la gravedad de los síntomas del paciente.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   imagen1

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   5 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es una sal HCI.
2. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es una sal tosilato.
3. 4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

   10 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso

   en terapia.
4. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento del insomnio.
5. 7. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

   15 donde el insomnio se caracteriza por dificultad en la conciliación del sueño o mantenimiento del sueño o ambos.
6. 8. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en un ser humano.
7. 9. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con al menos un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable y un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina.