ES2655289T3

ES2655289T3 - Polipéptido antagonista del receptor 4 de quimioquina CXC (CXCR-4)

Info

Publication number: ES2655289T3
Application number: ES08774691.3T
Authority: ES
Inventors: Wolf-Georg Forssmann; Frank Kirchhoff; Jan MÜNCH; Ludger STÄNDKER
Original assignee: Pharis Biotec GmbH
Current assignee: Pharis Biotec GmbH
Priority date: 2007-07-03
Filing date: 2008-07-03
Publication date: 2018-02-19
Anticipated expiration: 2028-07-03
Also published as: JP2010531655A; CA2968054C; DK2162462T3; WO2009004054A2; PL3275894T3; ES2770361T3; PT2162462T; US9045563B2; HUE047454T2; JP2014209914A; HUE037931T2; DK3275894T3; PL2162462T3; PT3275894T; US20130029902A1; CN101730709A; EP2162462A2; WO2009004054A3; EP3275894B1; EP2162462B1

Abstract

Un péptido que consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No 21 IVRYTKKVPQVS y sus derivados amidados, acetilados, sulfatados, fosforilados y/o glicosilados.

Description

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(continuación)

Tampón B:: acetato amónico 0,5 M

Equipo:: Sistema de cromatografía de piloto automático (PerSeptive Biosystems,

Wiesbaden, Alemania)

Después de cargar el total de 1.000 litros de líquido durante toda la noche, se lleva a cabo el aclarado con varios volúmenes de columna de 5 mM HCl. Se lleva cabo la elución de los péptidos unidos como una elución continua con acetato amónico 0,5 M. Se consigue una elución completa de los péptidos a través de un valor de pH en rampa (6,8 a 7,2) y una conductividad en rampa (56 mS/cm) en aproximadamente 5 litros de eluato.

2ª etapa: Primera separación preparativa (Lote 01/2003)

Se combinan los eluatos de acetato amónico de la extracción discontinua en una cantidad de 10.000 litros de péptido de hemofiltrado. Después de ajustar el pH a 2,7, se carga el extracto de péptido en el intercambiador de cationes preparativo con la adición de agua completamente desalada con una conductividad de 5,5 mS/cm.

Condiciones de cromatografía: Columna: Vantage 250 VA Material de columna: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm Caudal: hasta 3 l/min durante la carga; 0,5 a 1 l/min durante la elución Detección: 280 nm, pH, conductividad Muestra: Hemofiltrado pH 2,7, conductividad 5,5 mS/cm Equipo: Sistema de cromatografía con piloto automático (PerSeptive Biosystems,

Wiesbaden, Alemania)

Después de cargar el extracto en bruto durante 240 minutos, se aclara la columna con HCl 0,01 M hasta que la conductividad está por debajo de 1 mS/cm. Se lleva a cabo la elución en varias etapas con los tampones que se indican a continuación.

Tampón: Valor pH Sustancias tampón Conductividad (mS/cm)

Tampón de lavado: 2,0 0,01 M HCl 1

Tampón de elución 1: 3,6 0,1 M Monohidrato de ácido cítrico 2,9

Tampón de elución 2: 4,5 0,1 M Ácido acético +0,1 M Acetato sódico 4,0

Tampón de elución 3: 5,0 0,1 M Ácido málico 6,2

Tampón de elución 4: 5,6 0,1 M Ácido succínico 6,1

Tampón de elución 5: 6,6 0,1 M NaH2PO4 4,9

Tampón de elución 6: 7,4 0,1 M NaH2PO4 6,7

Tampón de elución 7: 9,0 0,1 M Carbonato amónico 6,7

Se diseñan los eluatos 1-7 como agrupaciones de pH I-VII. Se recogen por separado y, finalmente, se aclaran con agua completamente desalada. Se lleva a cabo la elución hasta alcanzar una nueva línea base, alcanzándose volúmenes de elución de 10 a 25 litros para cada agrupación de pH individual de I a VII.

3ª etapa: Segunda separación preparativa:

Se separa cada una de las agrupaciones de pH individuales por cromatografía de fase inversa por fraccionamiento y desalación simultánea.

Condiciones de cromatografía: Columna: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg, Alemania) Material de columna: Fuente RPC, 15 μm; 10 x 12,5 cm (FineLine 100) Caudal: 150 ml/min (FineLine 100) Detección: 280 nm, conductividad, pH Tampón A: 10 mM HCl Tampón B: 80 % acetonitrilo en HCl 10 mM Gradiente: 0-60 % tampón B en 5 volúmenes de columna

Después de cargar cada una de las agrupaciones de pH individuales, se lava la columna con tampón A. Durante la elución, se recogen fracciones de 200 ml. Se liofilizan las fracciones y se almacenan a -20 ºC. Se analizan artes alícuotas de las fracciones formadas en un ensayo de inhibición de VIH. Las fracciones 6-8 de la agrupación de pH II contenían el péptido de acuerdo con la invención.

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En la Figura 1A-F: Aislamiento de ALB408-423 de hemofiltrado humano. Se siguió fraccionado el hemofiltrado fraccionado por medio de la etapa de elución de pH pf por HPLC-RP y se midieron las fracciones en un ensayo de inhibición de VIH.

Control: T20 control.

A. 3ª etapa de aislamiento. El fraccionamiento de PR de la agrupación 2 de pH presentó una actividad inhibidora en las fracciones 6-8.

B-E. Etapas de aislamiento 4ª a 7ª. Se purificó la actividad inhibidora hasta que se obtuvo una sustancia pura.

F. Espectro de masas (MALDI-EM) y análisis de secuencia de ALB408-423 purificado.

Se llevaron a cabo ensayos de inhibición de VIH sembrando células 4000 P4-R5 MAGI (P. Charneau y col., J. Mol. Biol. 241: 651, 1994) en 100 μl de DMEM (10% FCS, 100 U/ml penicilina G y 100 mg/ml sulfato de estreptomicina). Se transfectan establemente células P4-R5 con un casete LTR-lacZ y una vez infectado con éxito con VIH-1 expresa β-galactosidasa dependiendo de Tat, que se puede detectar en un ensayo de quimioluminiscencia. Al día siguiente se añadieron partes alícuotas de las fracciones. A continuación, se resuspendieron las fracciones liofilizadas en 80 μl de DMEM y se pipetearon 25 μl de cada una de ellas en células P4-R5, incubadas a 37 °C durante 1 hora y, a continuación, se infectaron con VIH-1 NL4_3 (1 ng de antígeno p24). Se obtuvieron reservas de virus por infección transitoria de linfocitos T 293 con ADN proviral por método de fosfato cálcico (CalPhos™ Mammalian Transfection Kit, Clontech). Se recogieron reservas de virus 48 horas después de la transfección, se filtraron y se utilizaron para infección. Tres días después de la invención, se detectó la actividad de β-galactosidasa en células P4-R5 infectadas utilizando un ensayo GalScreen (Tropix) según la recomendación del fabricante. Brevemente, se separó el sobrenadante, se añadieron 40 μl de una dilución 1:1 de sustrato PBS/GalScreen+, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se transfirieron 30 μl de lisados en lumiplacas de 96 pocillos. A continuación, se detectó la luminiscencia como unidades de luz relativas por segundo en un luminómetro (Berthold, Orion). Se sustrajo de todas las mediciones, la actividad de fondo de β-galactosidasa media de células de control no infectadas. Se calculó el % de valores de infección para cada infección en relación con los controles que no contenía péptido (100 %). Se establecieron las actividades de enzima en las mediciones sin ALB408-423 a 100 % y todos los valores se basaron en ellos. Se examinó la purificación final (etapa 7ª) en exactamente las mismas condiciones en células TZM-bl (X. Wei y col., Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1896, 2002).

4ª Etapa: Cromatografía semipreparativa C18 en fase inversa:

Se separó un total de 200 mg (que corresponde a 1087 litros de cantidad equivalente de hemofiltrado) de las fracciones 6-8 de la agrupación de pH II, que eran bioactivas en el ensayo (Fig. 1A) a través de una columna en fase inversa semi-preparativa. Las fracciones 33 + 34 contenían el sustrato de acuerdo con la invención (Figura 1B).

Condiciones de cromatografía: Columna: 4,7 cm x 30 cm columna de acero Material de relleno: Bakerbond RP-C18, 15-30 μm, 300 Å) Tampón A: 100 % agua, HCl10 mM Tampón B: 80 % acetonitrilo, 20 % agua, HCl 10 mM Gradiente: 0-30 % B en 2000 ml Caudal: 40 ml/min (presión: 40 bar) Detección: 214 nm y 280 nm Equipo de cromatografía: BioCad 250, Perseptive Biosystems Fracciones: 50 ml cada uno desde el inicio del gradiente (min 10,75)

5ª etapa: Cromatografía C18 semi-preparativa en fase inversa:

Se separaron las fracciones 33 + 34 de la etapa de cromatografía anterior, que resultaron bioactivas en el ensayo, a través de una columna en fase inversa semi-preparativa similar utilizando diferentes fases móviles. Los ensayos de infección de VIH posteriores revelaron que las fracciones 5 + 6 contenían la sustancia de acuerdo con la invención (Figura 1C).

Condiciones de la cromatografía: Columna: columna de acero de 4,7 cm x 30 cm Material de relleno: Bakerbond RP-C18, 15-30 μm, 300 Å) Tampón A: 30 % metanol, 70 % agua, HCl 10 mM Tampón B: 100 % metanol, HCl 10 mM Gradiente: 0-15 % B en 40 ml; 15-60 % B en 1900 ml Caudal: 40 ml/min (presión: 30 bar) Detección: 214 nm y 280 nm Equipo de cromatografía: BioCad 250, Perseptive Biosystems Fracciones: 50 ml cada una desde el inicio del gradiente (min 9,75)

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6ª etapa: cromatografía C4 en fase inversa analítica:

Se separaron las fracciones bioactivas 5 + 6 de la cromatografía anterior a través de una columna en fase inversa analítica. Se sometieron a ensayo partes alícuotas en un bioensayo (ensayo de inhibición VIH). Las 51 a 57 contenían la sustancia de acuerdo con la invención (Figura 1D).

Condiciones de cromatografía: Columna: columna de acero de 2 cm x 25 cm Material de relleno: RP-C4, 5 μm, 100 Å, Biotek Silica, Ostringen, Alemania) Tampón A: agua, 0,1 % TFA Tampón B: 80 % acetonitrilo, 20 % agua, 0,1% TFA Gradiente: 0-5 % B en 2 min, 5-35 % B en 60 min, 35-100% B en 3 min Caudal: 7 ml/min Detección: 214 nm y 280 nm Equipo de cromatografía: Kontron Fracciones: 1 min cada una desde min 1

7ª etapa: cromatografía C18 en fase inversa analítica:

Se separaron las fracciones bioactivas 51-57 de la cromatografía anterior a través de una columna en fase inversa analítica. Se sometieron a ensayo partes alícuotas en un bioensayo. La fracción 31 contenía la sustancia de acuerdo con la invención en forma pura (Figura 1E).

Condiciones de cromatografía: Columna: columna de acero de 1 cm x 25 cm Material de relleno: RP-C18, 5 μm, 300 Å, Vydac (Hesperia, Estados Unidos) Tampón A: agua, 0,1 % TFA Tampón B: 80 % acetonitrilo, 20 % agua, 0,1 % TFA Gradiente: 0-15 % B en 5 min, 15-45 % B en 60 min, 45-100 % B en 1 min Caudal: 2 ml/min Detección: 214 nm y 280 nm Equipo de cromatografía: Kontron Fracciones: 1 min cada una desde min 1

La sustancia pura de acuerdo con la invención estaba contenida en la fracción 31 y se examinó en un bioensayo dependiendo de la dosis y se caracterizó por química de péptidos (ejemplo 2).

Ejemplo 2 (Ejemplo de referencia)

Determinaciones de masa

Se llevaron a cabo determinaciones de masa del péptido aislado desde el hemofiltrado (desde la fracción 31 de la etapa 7ª en el Ejemplo 1) y en el péptido químicamente sintetizado (Ejemplo 3) en un espectrómetro de masa MALDI (Voyager DE-Pro). Se determinaron las masas moleculares de los péptidos para corresponder con las siguientes cifras de masa (Pm):

ALB408-423, aislado del hemofiltrado humano (Figura 1F): 1830,9 Da ALB408-423, péptido químicamente sintetizado: 1830,6 Da

Determinación de secuencia

Se analizó el péptido nativo purificado por análisis de acoplamiento EM-EM (ESI-TRAP) suministrado por la empresa PROTEOMEFACTORY AG, Dorotheenstr. 94, 10117 Berlín (Alemania) por comparación de la base de datos de las masas EM-EM ESI establecidas por medio de un motor de búsqueda Mascot, que tuvo como resultado la siguiente secuencia con la probabilidad máxima:

LVRYTKKVPQVSTPTL (Figura 1F).

Comparación de base de datos

Una posterior comparación de la base de datos con la base de datos SwissProt demuestra que la secuencia de péptidos tiene un 100 % de identidad con los aminoácidos 408-423 de la proteína humana albúmina de suero (No. de referencia NP000468) y la secuencia contiene los aminoácidos: LVRYTKKVPQVSTPTL.

La fracción 31 purificada es activa en el bioensayo de inhibición de VIH-1

Se disolvieron 1,6 mg de la fracción 31 de la 7ª etapa del Ejemplo 1 en 160 μl de DMEM. A continuación, se añadieron 10 μl de diluciones en serie de la fracción 31 que contenía ALB408-423 a 60 μl de células TZM-bl (60 μl) y se infectaron con 1 ng de antígeno p24 de VIH-1 NL4_3 en un volumen total de 100 μl. Tres días después, se

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determinaron los índices de infección en un ensayo GalScreen (véase Ejemplo 1). La fracción 31 bloqueó la infección de VIH-1 trópico X4 NL4_3 dependiendo de la dosis. La dosis que bloqueó la infección a la mitad del valor máximo (IC50) fue 21,45 μg/ml (Figura 2).

La Figura 2: ALB408-423 que contiene la fracción 31 bloquea la infección VIH-1 NL4-3. Se incubaron células TZM-bl con diluciones en serie de la fracción 31 y se infectaron con VIH-1NL4-3 trópico X4. 3 días después de la infección, se determinaron los índices de infección por ensayo GalScreen. Se muestran los valores medios ± la desviación típica de infecciones por triplicado en relación con controles tratados con PBS (100 %).

Ejemplo 3 (Ejemplo de referencia)

Síntesis química de ALB408-423

Se llevó a cabo la síntesis química de ALB408-423 por síntesis en fase sólida convencional en un sintetizador de péptidos 9050 (Applied Biosystems) utilizando química Fmoc conocida. Se purificó el péptido obtenido por cromatografía en fase inversa y se estableció su identidad y su pureza por RP-HPLC analítica y por determinación MALDI EM tal como se describe en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4

ALB408-423 sintético bloquea específicamente la infección de variantes de VIH-1 trópico X4

Se sembraron 5000 células TZM-bl en 100 μl de DMEM (10 % FCS, 100 U/ml de penicilina G y 100 μg/ml de sulfato de estreptomicina). Se disolvió ALB408-423 en PBS (10 mg/ml). Un día después, se añadieron 20 μl de diluciones en serie de ALB408-423 en PBS a las células y, a continuación, se infectaron las células con 0,5 ng de antígeno p24 de VIH-1 en un volumen total de 200 μl. Se utilizaron clones moleculares VIH-1 que diferían en el tropismo coreceptor y se generó según la descripción (Papkalla y col., J. Virol. 76: 8455-9, 2002).

La Figura 3: ALB408-423 químicamente sintetizado bloquea específicamente la infección VIH-L trópico X4. Se infectaron células TZM-bl que contenían las diluciones de péptido indicadas con variantes de VIH-1 que diferían en su tropismo co-receptor. 3 días después, se utilizó el ensayo GalScreen para medir los índices de infección. A) inhibición dependiente de dosis de variantes de VIH-1 trópico X4, NL4-3, P51-Sc, P59-S/27 y P34-S o 92ht593.1trópico dual. B) Índices de infección en presencia de 500 μg/ml ALB408-423 que demostraron que el péptido bloquea específicamente la infección VIH-1 trópico X4, pero no R5. Los datos mostrados son los valores medios ± desviación típica derivados de infecciones por triplicado en relación con células que contenían PBS (100 % de infección).

Al cabo de 3 días, se detectó la infección utilizando el ensayo GalScreen (Tropix) (Ejemplo 1). FALB408-423 bloqueó dependiendo de la dosis la infección de todas las variantes de VIH-1 trópico X4 analizados (Figura 3A) (IC50 media de 24,2 μg/ml). La variante trópica dual (usando CXCR4 y CCR5) 92ht593.1 fue bloqueada con menos eficacia. En contraposición, las variantes de VIH-1 trópico CCR5 no fueron inhibidas ni siquiera en presencia de dosis muy altas de ALB408-423 (500 μg/ml) (Figura 3B). Debido a la inhibición específica de la infección causada por variantes de VIH-1 trópico X4, se supone que ALB408-423 interactúa con el receptor de quimioquina CXCR4.

Tanto ALB408-423 purificado desde el hemofiltrado (Ejemplo 2) como ALB408-423 químicamente sintetizado (Ejemplo 4) presentaron una inhibición dependiente de dosis de replicación de VIH-1 en células diana lo que da prueba de que ALB408-423 es una molécula de inhibición de VIH-1 humana natural.

Ejemplo 5 (Ejemplo de referencia)

ALB408-423 sintético bloquea dependiendo de la dosis de infección por lentivirus trópico CXCR4

Se generaron VIH-1 trópico X4 NL4-3 y VIH-2ROD10 o VIH-1 trópico CCR5 NL4-3 92th014, VIH-1-7312 y SIVmac239 por transfección transitoria de linfocitos T 293 y se utilizaron para infectar células TZM-bl que contenían las concentraciones indicadas de ALB408-423. Dos días después, se determinaron los índices de infección y se calcularon según la descripción. (Ejemplo 4). Los resultados demuestran que ALB408-423 bloquea dependiendo de dosis la infección de VIH-1 y VIH-2 trópico X4 (IC50 ∼ 10-20 μM) mientras que el péptido no tuvo efecto en la infección de lentivirus trópico R5 lo que demuestra una inhibición específica de VIH-1 y VIH-2 trópicos CXCR4 (Fig. 4).

Figura 4. ALB408-423 bloquea la infección de lentivirus trópico X4. Se utilizaron reservas de VIH-1, VIH-2 y VIS de infectividad normalizada para infectar células TZM-bl que contenían ALB408-423. Al cabo de tres días, se determinaron los índices de infección utilizando un ensayo Gal Screen. Se muestran los valores medios ± desviación típica derivados de medidas por triplicado. Índices de infección de células que no contienen péptido = 100 %.

Tabla 1. Actividad antiviral de varios fragmentos de ALB contra infección VIH-1 trópico X4 NL4-3. Se infectaron células TZM-bl que contenían diluciones en serie de péptidos sintéticos infectados con VIH-1 NL4-3 y se determinaron los índices de infección y se calcularon tal como se ha descrito en el ejemplo 1 y 2 dos días después de la infección. Se determinaron los valores IC50 utilizando el paquete de software GraphPad Prism. Abreviaturas: Da, peso molecular; IC50 μM, concentración inhibitoria máxima media (50 %) obtenida de los experimentos ALB415-423 ALB414-423 ALB413-423 ALB412-423 ALB411-423 ALB410-423 ALB409-423 ALB408-423 ALB408-422 ALB408-421 ALB408-420 ALB408-419 ALB408-418 ALB408-417 ALB408-416 ALB408-415 ALB408-414 ALB408-413 ALB407-414 ALB407-419

ALB408I-419

ALB408F-419 ALB408A-419 ALB408G-419 variantes ALB408-415 ALB-tipo silvestre ALB-V415A ALB-K414A variantes ALB408-415 ALB-K413A ALB-T412A ALB-Y411A ALB-R410A ALB-V409A

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realizados por triplicado; SEM, error típico de la media; exp, número de experimentos realizados;

Tabla 1 Da IC50 ± SEM exp. SEQ ID No

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KKVPQVSTPTL

TKKVPQVSTPTL

YTKKVPQVSTPTL

RYTKKVPQVSTPTL

VRYTKKVPQVSTPTL LVRYTKKVPQVSTPTL LVRYTKKVPQVSTPT LVRYTKKVPQVSTP LVRYTKKVPQVST LVRYTKKVPQVS LVRYTKKVPQV LVRYTKKVPQ

LVRYTKKV LVRYTKK LVRYTK LLVRYTKK LLVRYTKKVPQVS

IVRYTKKVPQVS

FVRYTKKVPQVS

AVRYTKKVPQVS

GVRYTKKVPQVS

LVRYTKKV LVRYTKKA LVRYTKAV

LVRYTAKV LVRYAKKV LVRATKKV LVAYTKKV LARYTKKV

Ejemplo 6

Estudio de relación estructura-actividad (SAR) utilizando derivados de ALB408-423.

Se sintetizaron químicamente varios derivados de ALB408-423 que contenían deleciones N o C terminales de sustituciones de aminoácidos (Tabla 1) y se disolvieron los péptidos liofilizados en PBS. Se analizó la actividad antiviral en células TZM-bl utilizando VIH-1 trópico X4 NL4-3 tal como se ha descrito (Ejemplo 4). Las deleciones N terminales de ALB408-423 (409-423, 410-423, 411-423, 412-423, 413-423, 414-423, 415-423) deterioraron gravemente o anularon la actividad antiviral lo que indica que la leucina N terminal Leucina (L408) es crucial para la inhibición mediada por ALB408-423 de VIH-1 trópico X4 (Fig. 5 y Fig. 6).

Figura 5. Actividades antivirales de derivados de ALB. Se infectaron células TZM-bl que contenían diluciones en serie de derivados de ALB con VIH-1 trópico X4 NL4-3. Al cabo de 2 días se determinaron los índices de infección por ensayo GalScreen. Se muestran los valores medios derivados de infecciones por triplicado en relación con muestras que no contenían péptido (índice de infección = 100%).

Figura 6. Actividades antivirales de derivados de ALB. Se infectaron diluciones en serie de derivados de ALB que contenían células TZM-bl con VIH-1 trópico X4 NL4-3. Al cabo de 2 días, se determinaron los índices de infección por ensayo GalScreen. Se muestran los valores medios derivados de infecciones por triplicado en relación con muestras que no contenían péptido (índice de infección = 100 %).

Los derivados de ALB408-423 que contenían truncamientos de hasta 8 restos de aminoácidos en el término C (408422, 408-421, 408-420, 408-419, 408-418, 408-417, 408-416, 408-415, 408-414, 408-413) permanecieron activos en el bloqueo de infección VIH-1 trópico X4 (Fig. 5 y 6, Tabla 1). Otras deleciones en el término C (408-414 y 408-413), sin embargo, tuvieron como resultado péptidos inactivos (valores IC50 > 50 μM) (Fig. 6). Cabe destacar que la

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941 1068 1196 1298 1461 1618 1717 1832 1720 1619 1522 1422 1334 1232

n.d. 1006 907 779 1025 1536

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1454 1378 1366

1006 978 949

949 976 914 921 978 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 7,6 ± 1,2 11,8 ± 3,1 11,3 ± 3,3 11,2 ± 2,9 4,4 ± 1,0 18,3 ± 6,8 19,9 ± 4,1

n.d. 17,4 ± 6,5 >50 >50 >100 11,1 ± 1,0 1,55 ± 1,2 93,2 ± 2,1 >100 >100

17,4 ± 6,5 33,0 31,0

56,0 11,2 ± 0,1 91 >1000 32,9 31 32 33 34 35 36 37 78 49 4 10 4 11 8 12 4 13 2 14

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Figura 10. ALB408-423 y los derivados de ALB truncados bloquean específicamente la infección VIH-1 trópico X4. Se infectaron células TZM-bl que contenían o bien PBS o bien 100 mM de los péptidos indicados con clones VIH-1 dualtrópico X4 o R5 de infectividad normalizada. Se midieron os índices de infección 2 días después de la infección utilizando el ensayo GalScreen. Se mueran los valores medios (% de control tratado con PBS) ± desviaciones típicas derivadas de las mediciones por triplicado.

Ejemplo 9:

ALB408-423, ALB408-419 y ALB L408I-419 bloquean la infección VIH-1 trópico X4 y replicación en PBMC.

Para analizar el efecto de ALB408-423 y sus derivados en células primarias pertinentes, se aislaron células mononucleares de sangre periférica de un revestimiento de Buffy, derivada de DRK-Blutspendedienst BadenWürttemberg-Hessen utilizando centrifugado de densidad Ficoll. Se estimularon 1 x 106 PBMC por ml con 1 μg/ml de fitohemaglutinina (PHA, Oxoid, #3085280) y 10 ng/ml de interleuquina 2 (IL-2, Strathmann, #9511192) durante tres días. A continuación, se aglomeraron las células y se resuspendieron en medio que contenía IL-2. Se sembraron 1,5 x 105 PBMC (250 μl) en placas de 96 pocillos, se añadieron péptidos y se infectaron las células con 50 pg/ml de antígeno p24 de VIH-1 trópico X4 NL4-3. Se tomaron los sobrenadantes que contenían virus de progenie el día 1, 3 y 6 tras la infección. Se midió la producción de virus según ELISA de antígeno p24 (SAIC-Frederick, Inc [AIDS & Cáncer virus program]). No se pudo detectar antígeno p24 en los sobrenadantes derivados el día 6 de las células que contenían 100 μM ALB408-423 y ALB L408I-419 y solamente niveles de p24 marginales en los sobrenadantes que contenían 100 μM ALB408-419 (Fig. 11). En presencia de 20 μM péptidos, se perjudicó gravemente la replicación del virus. Estos datos demuestran que ALB408-423 y sus dos derivados analizados bloquean la infección y la replicación de VIH-1 trópico X4 en células diana VIH natural.

Figura 11. ALB408-423 y sus derivados inhibe la infección de VIH-1 trópico X4 de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se incubaron células con las concentraciones indicadas de ALB408-423 o variantes truncadas y se infectaron con VIH-1 trópico X4. Se analizaron los sobrenadantes obtenidos al cabo de 6 días por ELISA de p24. Se muestra la media de los valores de antígeno p24 (ng/ml) derivados de infecciones por triplicado ± desviación típica.

Ejemplo 10.

Péptido ALB 408-423 inhibe la unión de CXCL12 a CXCR4.

Para determinar la capacidad de ALB 408-423 de inhibir la unión de quimioquina CXCL12 a su receptor, CXCR4, se llevó a cabo un ensayo de unión fluorescente en células vivas completas tal como se ha descrito anteriormente (Valenzuela-Fernández, y col.; 2001, JBC 276:26550-26558). Se transfecta establemente el receptor CXCR4 en células embriónicas de riñón humanas (HEK) como proteína de fusión con la proteína fluorescente EGFP fusionada con la parte amino terminal extracelular del receptor (EGFPCXCR4). Se sintetizaron las quimioquinas humanas CXCL12 y CXCL12-rojo de Texas, tal como se ha descrito (Amara y col., 1999, JBC 274:23916-23925; Valenzuela-Fernández, y col., 2001, JBC 276:26550-26558). Se llevó a cabo el seguimiento de la fluorescencia en tiempo real de las interacciones ligando-receptor del siguiente modo: se recogieron células HEK293 que expresan el receptor de fusión, EGFP-hCXCR4, en solución salina tamponada con fosfato suplementada con 5 mM EDTA, pH 7,4, se centrifugaron y se resuspendieron en tampón HEPES-albúmina de suero bovino (10 mM HEPES, 137,5 mM NaCl, 1,25 mM MgCl2, 1,25 mM CaCl2, 6 mM KCI, 10 mM glucosa, 0.4 mM NaH2PO4, 1% albúmina de suero bovino (p/v), pH 7,4) suplementado con inhibidores de proteasa (40 mg/ml bestatina y bacitracina, 20 μg/ml fosforamidon, 50 μg/ml quimiostatina y 1 μg/ml leupeptina). Se llevaron a cabo los experimentos sobre células suspendidas en tampón HEPES-BSA (normalmente a 106 células/ml). Se llevaron a cabo los registros según el tiempo de la fluorescencia emitida a 510 nm (excitación a 470 nm) a 21 ºC utilizando un espectroflurímetro (fluorolog 2, Spex) y se extrajeron muestras cada 0,3 s. Se iniciaron las mediciones de la unión de fluorescencia añadiendo a 30 segundos100 nM de CXCL12-TR a 1 ml de suspensión celular. Para los experimentos de competición, se pre-incubaron células que expresan EGFP-CXCR4 durante 10 minutos en ausencia o presencia de diversas concentraciones del competidor. A continuación, se añadió CXCL12-TR (100 nM) y se registró la fluorescencia hasta que se alcanzó un equilibrio (300 segundos). Se analizaron los datos utilizando un software Kaleidagraph 3.08 (Synergy Software, Reading, PA, Estados Unidos). Se detecta la asociación con CXCL12 fluorescente como un descenso de la emisión de fluorescencia de EGFP que resulta de la transferencia de energía al grupo rojo de Texas (TR) de CXCL12.

Se alcanza la saturación de unión de CXCL12 a concentraciones más allá de 300 nM y la constante de disociación de CXCL12 fluorescente para el receptor CXCR4 equivale a 55 ± 15 nM (Valenzuela-Fernández y col., (2001), JBC 276, 26550-26558), Hachet-Haas y col; (2008), JBC]. Las moléculas no marcadas que compiten con CXCL12 fluorescente impiden la disminución de la emisión de EGFP en función de la ocupación de sitios de receptor. La variación de intensidad de fluorescencia detectada se puede cuantificar (Palanche y col., (2001), JBC 276:3485334861; Vollmer y col., 1999, JBC 274:37915-37922; Ilien y col., 2003, Neurochem 85:768-778) para derivar constantes de unión del competidor.

Los análisis demuestran que ALB408-423 impide dependiendo de la dosis la interacción de CXCL12-Tr con su receptor CXCR4 (Fig. 12). ALB408-423 presenta una constante de disociación (EC50) igual a 8 ± 3 mM, que

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Claims

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