JP2012525823A - Ａ型及びｂ型インフルエンザウイルス複製阻害ペプチド - Google Patents

Abstract

Ａ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスのＰＡ及びＰＢ１の間のタンパク質−タンパク質相互作用を競合的に阻害する合成又は単離されたインフルエンザウイルス複製阻害ペプチド並びにＡ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を持つペプチドを同定するためのインビトロの結合スクリーニングが開示される。周知のパンデミックＡ型インフルエンザウイルス（１９１８年の”スペイン風邪”インフルエンザ又はＨ５Ｎ１など）に加えて、Ａ型及びＢ型の両ウイルスはヒト感染例及び医療費の圧倒的大部分の原因である例年繰り返し発生する流行の大きな一因となっている。驚くべきことに、新規のウイルス複製阻害は、Ａ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスにおけるヘテロ三量体ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体のＰＡ及びＰＢ１サブユニットの間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害することが可能であることが見出された。３つのウイルスポリメラーゼサブユニットＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡの正確な会合がウイルスのＲＮＡ合成及び感染力に必要とされることから、ウイルスポリメラーゼサブユニットの相互作用ドメインは新たな抗ウイルス剤の有効な標的であることが判明した。
【選択図】図１ｂ

Description

本発明はＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの複製を阻害するインフルエンザウイルス複製阻害ペプチド、インフルエンザウイルスの複製を阻害するインフルエンザウイルス複製阻害剤、インフルエンザポリメラーゼサブユニットの相互作用阻害剤を決定する方法及びインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドを含むインフルエンザ治療剤に関する。

インフルエンザウイルスは毎年の流行及び繰り返し発生するパンデミックの原因であるマイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、多数のヒト感染例及び重度の経済的負担を結果として生じる。周知のパンデミックＡ型インフルエンザウイルス（１９１８年の”スペイン風邪”インフルエンザ又はＨ５Ｎ１など）に加えて、Ａ型及びＢ型の両ウイルスはヒト感染例及び医療費の圧倒的大部分の原因である例年繰り返し発生する流行の大きな一因となっている。ＷＨＯは循環するＡ型インフルエンザ（ＦｌｕＡ）及びＢ型インフルエンザ（ＦｌｕＢ）株に対する年１回のワクチン接種を推奨している。しかしながら、現在のワクチンは流行性インフルエンザに対して不完全な防御を与える。今日までに、ノイラミニダーゼ阻害剤のオセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）のみが両ウイルス型に対する抗ウイルス治療として利用可能である。一方で医学界の中には、両薬剤に対して耐性であるインフルエンザ株の出現が急速に増大していることについて不安の高まりがある。より古いアダマンタン薬はＦｌｕＢに対して効果がなく、オセルタミビルに耐性であるインフルエンザウイルスの世界的拡大はこの種の薬剤の限界を実証している。米国における近年の疫学的調査は、試験されたＨ１Ｎ１分離株の９８．５％がオセルタミビル耐性であることを見出した。従って新たな、改良された及び代替の両ウイルス型に対する抗ウイルス剤が緊急に必要とされている。

本発明の目的は、新たな、改良された及び／又は代替の抗インフルエンザウイルス剤を提供することである。

本発明のさらなる目的は、最新技術から知られている抗インフルエンザウイルス剤の欠点の少なくとも１つを除去又は軽減することである。

本発明のなおさらなる目的は、インフルエンザポリメラーゼサブユニットの相互作用阻害剤を決定するための、新たな、改良された及び代替の方法を提供することである。

驚くべきことに、本発明による新規のウイルス複製阻害ペプチドは、Ａ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスにおけるヘテロ三量体ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体のＰＡ及びＰＢ１サブユニットの間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害することが可能であることが見出された。３つのウイルスポリメラーゼサブユニットＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡの正確な会合がウイルスのＲＮＡ合成及び感染力に必要とされることから、ウイルスポリメラーゼサブユニットの相互作用ドメインは新たな抗ウイルス剤の有効な標的であることが判明した。完全な三量体の複合体についての構造データは存在しない。ＰＢ１のＮ末端との複合体におけるトランケートされたＦｌｕＡ ＰＡの結晶構造に基づき、ＰＢ１における決定的なＰＡ相互作用ドメインはアミノ酸（ａａ５〜１１）により形成される３_１０−ヘリックスからなることが本発明者らにより確立された。ドメインは高度に保存されていて、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの両方においてウイルス型特異的である（図１ａ）。

本発明による新規ペプチドはＡ型及びＢ型の両ウイルスからのアミノ酸配列を含有しており、Ａ型及びＢ型インフルエンザ両方のＰＡサブユニットに結合する。前記新規ペプチドの中で、Ａ型及びＢ型の両ウイルスからのアミノ酸配列を含有するキメラペプチドは両方のＰＡサブユニットに結合するだけでなく、Ａ型及びＢ型のインフルエンザの両方についてウイルスポリメラーゼ活性及び細胞培養中のウイルスの広がりを減少させることが同定された。

本発明の１つの態様において、本発明は単離されたインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドを提供するが、このインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドはヘテロ三量体ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体のＰＡ及びＰＢ１サブユニットのタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを効果的に妨げることが示されており、妨害によってウイルス複製阻害を引き起こす。

本発明のさらなる態様によると、ヘテロ三量体ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体のＰＢ１サブユニットのＰＡ結合ドメインに由来する変異ペプチドを同定するためのＥＬＩＳＡに基づくスクリーニング方法が提供され、この変異ペプチドはＡ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスのＰＡサブユニットに結合することができる。

本発明は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性がある低分子のリード化合物を同定するために、新たなＥＬＩＳＡに基づくスクリーニングアッセイと共に本発明のペプチドを用いることを実行可能にする。かかる低分子は両ウイルス型に対して有効であることから、ノイラミニダーゼ阻害剤の魅力的な代替物を代表するものであり、インフルエンザウイルスに対する切実に必要とされている、ほぼ普遍的な医薬品及びタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン標的のためにインフルエンザで周知の薬剤耐性株がおそらくより出現しにくい医薬品に向けた主要なステップを構成する。

本発明によるペプチドはＭＤＶＮＰＴＬＬＦＬＫである野生型ＰＢ１_１−１１Ａによるポリペプチドと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％又は９０％同一なアミノ酸配列を含む。１つ又は複数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は追加されていても良く、このタンパク質はＡ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスのＰＡ及びＰＢ１サブユニットの間のタンパク質−タンパク質相互作用に対する阻害活性をまだ有している。一方、既知の野生型ＰＢ１_１−１１Ａは明示的に放棄される。

本発明のペプチドは、Ａ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスのヘテロ三量体ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体のＰＡ及びＰＢ１サブユニットの間のタンパク質−タンパク質相互作用を競合的に阻害する合成又は単離されたインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドである。インフルエンザウイルス複製阻害ペプチドは配列Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０を含むアミノ酸配列を含み、Ｘ_５はＰであり、Ｘ_６はＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ又はＭであり、Ｘ_７はＬ又はＦであり、Ｘ_８はＬ、Ｉ、Ｆ又はＭであり、Ｘ_９はＦ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｌ、Ｒ又はＳであり、Ｘ_１０はＬ、Ｉ又はＹである。

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、ＭＤＶＮＰＴＬＬＦＬＫＶＰＡＱである野生型ＰＢ１_１−１５Ａによるポリペプチドと少なくとも６６％、好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７９％、８６％又は９３％同一である。野生型それ自体は再び放棄される。

本出願において全てのアミノ酸はＩＵＰＡＣの１文字コードにより好ましくは示されることに留意されたい。３文字コードが用いられる場合はいつでも、３文字コードはまたＩＵＰＡＣに従う。文字Ｘはある一定の位置におけるワイルドカード／可変の又は他のアミノ酸を示すのに用いられる。

本発明のさらなる態様によると、インフルエンザウイルス複製阻害剤は、細胞透過性ペプチド、好ましくはＨＩＶ−Ｔａｔの細胞透過性ドメインに融合された前記の上述のペプチドのうち少なくとも１つを活性成分として含み、Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ株の複製を阻害する。さらなる実施形態によると、前述のペプチドはウイルス感染可能な細胞内への取り込みを確実にする任意のアダプタータンパク質と関連して、及び／又はペプチドを適合性の担体と共に含むガレヌス製剤として提供される。

本発明によるインフルエンザ予防／治療剤は、前述のペプチドのうち任意の１つのペプチドを少なくとも１つ、及び／又は前述の阻害剤のうち任意の１つのインフルエンザウイルス複製阻害剤を少なくとも１つ、有効成分として含む。本発明のインフルエンザ予防／治療剤はＡ型及びＢ型両方のインフルエンザウイルスの感染に対して有効である。

上記のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、本発明によるペプチドを分泌することができるように細胞内に導入されている。

請求項１〜７のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドを含むインフルエンザ治療剤が開発されている。

本発明によるＤＮＡ又はポリヌクレオチドは前述のペプチドの任意の１つをコードし、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＰＮＡから構成される。

本発明による発現ベクターは前述のＤＮＡを包含する。さらに本発明による細胞は前述の発現ベクターを導入されて、前述のペプチドの任意の１つを分泌する。

前述のペプチドはリポソーム中に含有されても良い。前記リポソーム中のペプチドは好ましい実施形態によるとアルキル化されている。

上述のような医療用途のほか、本発明によるインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドはまた抗ウイルス薬を同定するためのツールとして用いられ得る。ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙのような新規ペプチド及び新規ペプチドのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢの両方の増殖を阻害する能力の同定は、ポリメラーゼサブユニットＰＡ及びＰＢ１の相互作用がＰＡ−ＰＢ１相互作用を特異的に遮断してＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ株のいくつかの増殖を阻害し、広域スペクトルの抗インフルエンザ薬として働く低分子又は他の化合物での抗ウイルス薬開発の新規標的であることを確証する。

加えて、本発明はＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性がある低分子のリード化合物を同定するための、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に基づくスクリーニングアッセイを提供する。両ウイルス型に対して有効であることから、かかる化合物はノイラミニダーゼ阻害剤の魅力的な代替物を代表する。それ故、本発明はインフルエンザウイルスに対して切実に必要とされている、ほぼ普遍的な医薬及びタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン標的のためにインフルエンザで周知の薬剤耐性株がおそらくより出現しにくい医薬に向けた主要なステップを表す。蛍光偏光（ＦＰ）アッセイもまた提供される。

ＥＬＩＳＡはＰＢ１のＰＡへの結合特性をより良好に分析するために確立された。ＥＬＩＳＡは、図１ｂに示されるように、ＦｌｕＡ ＰＡ及びＦｌｕＢ ＰＡのそれぞれＰＢ１_１−２５Ａ及びＰＢ１_１−２５Ｂへの型特異的な結合を確認した。個々のａａの効果をさらに性質決定するため、ＰＢ１_１−２５Ａ由来ペプチドを用いる競合的ＥＬＩＳＡ実験を実施した（表２）。３_１０−ヘリックスを構成するａａを欠失するペプチドは結合について競合せず、ＰＡ／ＰＢ１結合部位の構造と一致している。その上、３_１０−ヘリックスドメイン内に単一のＡｌａ又はＡｓｐ置換を含有するペプチドは、Ｔ６Ａを除いて、ＦｌｕＡ ＰＡに結合する能力を失った（表３）。結合能力の喪失はアロステリック効果又は水素結合の接触の欠如のためであり得る。

ＰＢ１の決定的なＰＡ相互作用ドメインはアミノ酸（ａａ）Ｘ_５〜Ｘ_１１により形成される３_１０−ヘリックスからなることが見出された。このドメインは高度に保存されており、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの両方において型特異的である（図１ａ）。

加えてＦｌｕＢ ＰＢ１は、これら２５ａａがＦｌｕＡ ＰＢ１配列と交換された場合、ＦｌｕＡ ＰＡに結合することができた（図２）。

ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ由来ペプチド（１５ｍｅｒ）のＰＡ−ＰＢ１_１−２５Ａ相互作用についてのＩＣ_５０値を決定し、ＦｌｕＡ／ＦｌｕＢキメラのセットについても同様に決定した（表１）。野生型ＰＢ１_１−１５ＡはＦｌｕＡ ＰＡの同族のペプチドへの結合を効率的に阻害したがＦｌｕＢ ＰＡの結合は阻害せず、一方でＰＢ１_１−１５ＢはＦｌｕＢ ＰＡの結合を遮断したがＦｌｕＡ ＰＡの結合は遮断しなかった。いくつかのキメラペプチドはＦｌｕＡ ＰＡに結合する能力を失った（表１）。驚くべきことに、ペプチドＰＢ１_１−１５Ａ_{Ｔ６Ｙ，Ｌ７Ｆ}はＰＢ１_１−１５Ｂより小さいアフィニティーを持つにも関わらず、ＦｌｕＡ ＰＡへの結合のみならずＦｌｕＢ ＰＡへの結合をも競合した。６位Ｔｙｒの単独導入（ＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６Ｙ）はＦｌｕＢにおいて高度に保存されており、野生型ペプチドよりはなお良好な結合であったものの二重変異体と比較してＦｌｕＡ ＰＡの結合を減少させるに至ったのに対し、ＦｌｕＢ ＰＡへの結合はＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６ＹについてＰＢ１_１−１５Ａ_{Ｔ６Ｙ，Ｌ７Ｆ}と比較して増加した。

Ｌ７Ｆの置換は阻害活性の実質的な喪失を生じさせ（表１）、ＰＢ１_１−１５Ａ_{Ｔ６Ｙ，Ｌ７Ｆ}の好都合な結合特性がＴ６Ｙに起因し得ることを指し示している。構造分析はＦｌｕＢ由来の６位ＴｙｒがＦｌｕＡ ＰＡの未利用の疎水性ポケット内に適合して、ＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６Ｙ及びＦｌｕＡ ＰＡの間の結合を強化することを示唆する（図１ｃ）。この疎水性相互作用はＰｈｅ及びＴｒｐが６位に導入されたＦｌｕＡでは増大された一方でＦｌｕＢ ＰＡへの結合は悪化しており、ＦｌｕＢ ＰＡ及びＰＢ１の間の相互作用が少し異なる様式であることを指し示している。

増加した疎水性相互作用、同様に水置換のエントロピー効果の両者はＰＢ_{１−Ｔ６Ｙ}のＰＡへの結合が強化されたことを説明することができる。

好都合な二重結合特性はより大きいペプチドのＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙにおいて保持され、ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６ＹはまたいくつかのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ株のＰＡサブユニットにも結合しており（図１ｂ及び図３）、広範囲のインフルエンザウイルスサブタイプについてのアフィニティーを実証している。ポリメラーゼ再構成アッセイはＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの二重結合特性がウイルス型に依存しないポリメラーゼ活性阻害に変換されたことを明らかにした。ＧＦＰに融合されたＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６ＹがＦｌｕＡ及びＦｌｕＢの両方のウイルスのポリメラーゼ活性を妨げた一方で、ＰＢ１_１−２５Ａ−ＧＦＰ及びＰＢ１_１−２５Ｂ−ＧＦＰはそれらの同族サブタイプの活性を阻害するのみであった（図１ｄ）。これらの配列を含有するタンパク質での共免疫沈降実験を用いて、一致した知見が観察された（図４）。

治療活性のある分子、すなわち本発明による合成又は単離されたインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドの輸送を改善するため、細胞透過性ペプチドを用いた。前記細胞透過性ペプチドは例えばタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はＴａｔタンパク質としても知られるレンチウイルスからのトランス活性化タンパク質である。ＨＩＶ−Ｔａｔの細胞透過性ドメインに融合されたＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙ（ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙ−Ｔａｔ、表４）はＦｌｕＡ及びＦｌｕＢの両方の増殖を阻害したが、関係のないウイルスの増殖は阻害しなかったことが示されている（図１ｅ）。生化学的特質決定から予想されるように、ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙ−ＴａｔはＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）及び高度病原性Ｈ５Ｎ１株のＡ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（Ｋａｎ−１）／２００４の増殖阻害において野生型ＰＢ１_１−２５Ａ−Ｔａｔと比較して２倍の上昇に至った。

本発明によるインフルエンザ予防／治療剤はＡ型及びＢ型インフルエンザに対して広く有効である。好都合には、本発明の製剤は需要に応じて非常に短い時間で合成的に調製し得る。例えばアジアの国々における鳥インフルエンザ又は最も最近の事例であるメキシコにおけるブタインフルエンザなどの局所的又は地域的な発生により引き起こされる迫り来るパンデミックの場合、広く機能するインフルエンザ予防／治療剤への需要は明らかである。

本発明の他の態様及び特徴は、付随する図と一緒に本発明の特定の実施形態についての以下の記載を検討することで当業者にとって明らかになるであろう。

本発明の目的、特性及び利点、さらに本発明のアイディアも同様に、本明細書で与えられた記載から当業者にとって明らかであろう。本明細書で下に記述された本発明の実施形態及び特定の例は本発明の好ましい例として捉えられることが理解されるものである。本明細書の記載は図示及び説明の目的のみであって、本発明を本明細書の実施形態又は例に限定する意図ではない。さらに様々な変更及び改変が本明細書で与えられた記載に基づいて本明細書で開示された本発明の趣旨及び範囲内でなされ得ることは当業者にとって明らかである。

ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの結合及び阻害活性を示す。上段パネルはＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＰＢ１のＮ末端２５ａａについてのコンセンサス配列のアライメントを示す図である。中段及び下段パネルはＰＢ１完全長配列に由来する利用可能な全てのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ配列のＮ末端２５ａａのアライメントを示す図である。 ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの結合及び阻害活性を示す。細胞抽出液からのＨＡタグ付加ＰＡサブユニットの、ＦｌｕＡ ＰＢ１及びＦｌｕＢ ＰＢ１の異なるドメインに相当する固定化ペプチドへの結合を示す図である。上段パネル：用いられたＰＡ含有細胞抽出液のウエスタンブロット。 ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの結合及び阻害活性を示す。ＦｌｕＡ ＰＡに結合したＦｌｕＡ ＰＢ１_１−１５及びＦｌｕＡ ＰＢ１_{１−１５Ｔ６Ｙ}の構造を示す図である。 ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの結合及び阻害活性を示す。ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢのポリメラーゼ再構成アッセイにおけるＰＢ１_１−２５由来ＧＦＰ融合タンパク質のポリメラーゼ阻害活性を示す図である。 ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの結合及び阻害活性を示す。ＰＢ１_１−２５Ａ−Ｔａｔ、ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙ−Ｔａｔ、ＰＸ−Ｔａｔ（対照ペプチド）をＦｌｕＡ、ＦｌｕＢ及びＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）と共に用いたプラーク減少アッセイを示す図である。 ＰＡのＰＢ１とのウイルス型特異的な相互作用を示す。図２ｂによる試験に用いられたＰＢ１キメラを示す図である。 ＰＡのＰＢ１とのウイルス型特異的な相互作用を示す。指示されたＰＢ１タンパク質及びＣ末端にヘキサヒスチジンタグが付加されたＦｌｕＡのＰＡ（ＦｌｕＡ ＰＡ_Ｈｉｓ）をコードする発現プラスミドでのトランスフェクションの結果を示す図である。 ＦｌｕＡ／ＢペプチドキメラのＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの二重結合特性をＰＢ１_１−２５Ａ及びＰＢ１_１−２５Ｂと比較して示す図である。 図４ｂによる試験において用いられたＧＦＰ−ＰＢ１融合タンパク質を示す図である。 ＰＢ１_１−２５由来ＧＦＰ融合タンパク質並びにＦｌｕＡ及びＦｌｕＢのＨＡタグ付加ＰＡの形成に基づくイムノブロットを示す図である。

本発明の実施形態は例としてのみ、上述の図及び同封の表を参照して、以下に記述される。

材料と方法

ウイルス株

感染実験について、Ｇｈａｎｅｍら（２００７）によるＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ｃｈｏｃｋｅｐｈａｉｂｕｌｋｉｔら（２００５）によるＡ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（Ｋａｎ−１）／２００４、Ｎｏｒｔｏｎ（１９８７）によるＢ／Ｙａｍａｇａｔ／７３及びＳｃｈｗｅｍｍｌｅ（１９９５）において記述されたＶＳＶ（血清型インディアナ）が用いられた。

プラスミド構築

プラスミドｐＣＡ−Ｆｌａｇ−ＧＦＰ、ｐＣＡ−ＰＢ１_１−２５Ａ−ＧＦＰ、ｐＣＡ−ＰＢ１−ＨＡ、ＦｌｕＡミニレプリコンプラスミド及びＦｌｕＢミニレプリコンの発現プラスミドはＧｈａｎｅｍ（２００７）、Ｍａｙｅｒ（２００７）及びＰｌｅｓｃｈｋａ（１９９６）に記述されている。ＦｌｕＢミニゲノム発現プラスミドのｐＰｏｌＩ−ｌｕｃＲＴ＿Ｂは、Ｐｌｅｓｃｈｋａ（１９９６）に従って、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３のセグメント８の非翻訳領域が隣接したホタルルシフェラーゼＯＲＦ（逆向き）をＳａｐＩ消化プラスミドｐＰｏｌＩ−ＳａｐＩ−Ｒｉｂの中にクローニングすることにより得た。ｐＣＡ−ＰＢ１_１−２５Ｂ−ＧＦＰの構築のため、ＰＢ１（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３）の最初の２５コドンを含有するリンカーをｐＣＡ−Ｆｌａｇ−ＧＦＰプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位の中にクローニングし、Ｆｌａｇをコードする配列をＰＢ１_１−２５Ｂと置き換えた。部位特異的変異誘発をｐＣＡ−ＰＢ１_１−２５Ａ−ＧＦＰで行い、プラスミドｐＣＡ−ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙ−ＧＦＰを作った。ＰＢ１（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３）及びＰＡ（Ａ／ＳＣ３５Ｍ、Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（ＫＡＮ−１）／０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３、Ｂ／Ｌｅｅ／４０）のＯＲＦは、ＮｏｔＩ部位（ＦｌｕＡ株）又はＥｃｏＲＩ部位（ＦｌｕＢ株）を開始コドンの上流に含有するセンスプライマー並びに削除された停止コドンの後にＸｍａＩ部位、ＨＡタグをコードする配列及びＸｈｏＩ部位を持つアンチセンスプライマーでＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ又はＮｏｔＩ／ＸｈｏＩのいずれかで消化した改変ｐＣＡＧＧｓｖｅｃｔｏｒ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、２００３）中にクローニングし、ポリメラーゼサブユニットのＣ末端タグ付加バージョンをコードするｐＣＡ−ＰＢ１−ＨＡ又はｐＣＡ−ＰＡ−ＨＡプラスミドを得た。ｐＣＡ−ＰＡ_{Ａ／ＳＣ３５Ｍ}−Ｈｉｓプラスミドを得るため、ｐＣＡ−ＰＡ_{Ａ／ＳＣ３５Ｍ}−ＨＡをＸｍａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＨＡをコードする配列を６×Ｈｉｓリンカーにより置き換えた。Ａ／Ｂキメラ発現プラスミドは、ＳＣ３５Ｍ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３のｐＣＡＰＢ１−ＨＡプラスミドを用いたアセンブリＰＣＲ並びに生じるＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶで消化したｐＣＡ−ＰＢ１_{Ｂ／ｙａｍａｇａｔａ／７３}−ＨＡへのクローニングにより得た。

インフルエンザウイルスポリメラーゼ活性の再構成

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＦｌｕＡ又はＦｌｕＢ由来のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰ発現プラスミドのいずれか、ウイルスのポリメラーゼ活性をモニターするためのレポータータンパク質であるホタルルシフェラーゼをコードするＡ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザウイルス様ＲＮＡを転写するポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）駆動プラスミドを含有するプラスミド混合物並びに指示されたＧＦＰ融合タンパク質をコードする発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした。両ミニゲノムＲＮＡにはそれぞれＦｌｕＡ及びＦｌｕＢのセグメント８の非翻訳領域配列が隣接していた。トランスフェクション混合物はまたウミシイタケルシフェラーゼを恒常的に発現するプラスミドを含有し、トランスフェクション効率における変動を規格化するのに役立った。レポーター活性はトランスフェクションから２４時間後に決定し、Ｄｕａｌ−Ｇｌｕ（登録商標） Ｌｕｆｉｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて規格化した。Ｆｌａｇ−ＧＦＰを含有するトランスフェクション反応で観察された活性を１００％に設定した。

ペプチド合成

ペプチドの固相合成はＰｉｏｎｅｅｒ自動ペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）でＦｍｏｃ化学を利用してＴＢＴＵ／ジイソプロピルエチルアミン活性化を伴って行った。側鎖の保護は以下のようであった：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒはｔ−Ｂｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＨｉｓはＴｒｔ、ＡｒｇはＰｂｆ、Ｌｙｓ及びＴｒｐはＢｏｃ。カップリング時間は１時間であった。二重カップリングは、プログラムＰｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（ＣｏｓｈｉＳｏｆｔ／ＰｅｐｔｉＳｅａｒｃｈ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＵＳＡ）に従って困難なカップリングが予測された場合に行った。全てのペプチドはＲａｐｐ Ｓ ＲＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上での合成によりカルボキシルアミドとして生成された。ビオチンはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）及びＴＢＴＵ／ジイソプロピルエチルアミン活性化を１８時間、その後Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨカップリングを１時間行うことで指示されたペプチドのＣ末端に組み入れられた。ペプチドを樹脂から切断し、３％トリイソブチルシラン及び２％の水を含有するＴＦＡ（１０ｍｌ／ｇ樹脂）での処理を３時間行うことで脱保護した。ｔ−ブチルメチルエーテルによる沈殿の後、生じた未精製のペプチドは調製用ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８）により０．１％ ＴＦＡを含有する水／アセトニトリル勾配で精製し、分析用ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより特性決定した。いくつかのペプチドをｐｅｐｔｉｄｅｓ＆ｅｌｅｐｈａｎｔｓ（Ｎｕｔｈｅｔａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成し、続いて上記のように精製し、特性決定した。

免疫沈降実験

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの中でＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて指示されたプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１％プロテアーゼ阻害剤Ｍｉｘ Ｇ、（Ｓｅｒｖａ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭ ＤＴＴ）と共に氷上で１５分間インキュベートした。４℃で１３．０００ｒｐｍによる遠心分離後、上清をアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）に連結された抗ＨＡ特異的抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。１ｍｌの洗浄バッファー（プロテアーゼ阻害剤混合物を含まない溶解バッファー）で３回洗浄後、結合した物質は変性条件下で溶出させ、ＳＤＳＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウイルスポリメラーゼサブユニット及びＧＦＰの融合タンパク質を、ＨＡに対する抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はＨｉｓタグに対する抗体（Ｑｉａｇｅｎ）若しくはＧＦＰタグに対する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により検出した。

プラーク減少アッセイ

実験はＳｃｈｍｉｄｋｅ（２００１）により記述された方法を改変して行った。コンフルエントなＭＤＣＫ細胞を１００ＰＦＵのＡ／ＷＳＮ／３３、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３、Ａ／ＫＡＮ−１又はＶＳＶ／Ｉｎｄｉａｎａにより、ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で室温で感染させた。接種液除去後、細胞を、１％のＯｘｏｉｄａｇａｒ及び指示された濃度のペプチドを含有する培地（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．０１％ ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ、０．００１％ ＮａＨＣＯ_３を含むＤＭＥＭ）で重層した。それぞれ３７℃で５％のＣＯ２と共に２４時間（ＶＳＶ）、４８時間（Ａ／ＷＳＮ／３３、Ａ／ＫＡＮ−１）、又は３３℃で５％のＣＯ_２と共に７２時間（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３）インキュベーションした後、細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。プラークをカウントし、水対照の平均プラーク数を１００％に設定した。

ＥＬＩＳＡ

マイクロウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を飽和濃度のペプチドと共に室温でインキュベートし、洗浄し、続いてＨＡタグ付加ＰＡと共に室温でインキュベートした。ＰＡ−ＨＡを得るため、Ｍｅｙｅｒら（２００７）により詳細に記述されたように、２９３ｔ細胞を９４ｍｍデイッシュに播種し、各プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションから２４時間後に溶解バッファーで処理した。マイクロウェルプレートの洗浄後、ウェルをＨＡ特異的一次抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）と共にインキュベートした後、３回の洗浄及びペルオキシダーゼが連結された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、ＵＫ）を伴うさらに３０分間のインキュベーションを行った。最後の洗浄ステップの後、ＡＢＴＳ−基質（Ｓｉｇｍａ、既製溶液を添加し、４０５ｎｍにおいて光学密度を決定した。

競合ＥＬＩＳＡは、ＨＡタグ付加ＰＡサブユニットを含有する細胞抽出液の添加前に競合ペプチドが結合ペプチドを含むプレートのウェルに添加された点以外は上記のように行った。

蛍光偏光（ＦＰ）アッセイ

試験サンプルには蛍光標識を包含するタンパク質又はタンパク質サブユニットの既知の結合ペアが包含されており、本発明の好ましい実施形態に従って蛍光偏光により分析し得る。ここで我々は、最初の２５個のＮ末端アミノ酸により代表されるＡ型インフルエンザウイルスポリメラーゼサブユニットＰＢ１とサブユニットＰＡとの相互作用を用いる。次いで、試験サンプルを候補の阻害化合物と接触させ、蛍光偏光を決定する。タンパク質又はタンパク質サブユニットの結合の解離又はさもなければ干渉若しくは妨害を引き起こす化合物の能力を蛍光偏光（ＦＰ）によりモニターする。ＦＰ測定は、結合した蛍光標識されたタンパク質、ペプチド、サブユニット又はその断片と結合していないそれらとの間の区別を可能にする。蛍光標識した第一の断片のＦＰは溶液中で素早く回転し、それ故ランダム化された光選択分布を持ち、観察されるＦＰは小さいという結果となる。第一のサブユニットの蛍光標識した第一の断片が典型的にはより大きくよりゆっくり回転する分子である第二のサブユニットの断片と相互作用すると、蛍光標識した第一の断片の回転は遅くなり、蛍光偏光は増加する。よって、試験化合物によるサブユニット相互作用の破壊は蛍光偏光の減少をもたらし、蛍光偏光の減少はタンパク質相互作用の阻害を示している。試験化合物存在下でのＦＰ測定は試験化合物非存在下でのＦＰ測定と比較され得る。比較はオペレーターにより手動で又はコンピューターにより自動で、特に３８４ウェルプレートを用いるハイスループットアッセイにおいてなされ得る。

タンパク質精製のため、Ａ型インフルエンザウイルスポリメラーゼサブユニットＰＡはＣ末端に付着した６×Ｈｉｓリンカー又はヘマグルチニンエピトープ（ＨＡ）と共に適当な発現ベクター中にクローニングされた。ヒト２９３Ｔ細胞はプラスミドでトランスフェクトされた。細胞溶解液はトランスフェクションから２４時間後に溶解バッファー（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ及び１％ Ｐｒｏｔａｓｅ阻害剤混合物）を用いて調製した。溶解液からの精製のため、ＰＡサブユニットをＮｉ又は抗ＨＡアガロースに結合し、プロテアーゼ混合物を含まない溶解バッファーで洗浄した。２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール中に溶解されたＨＡペプチドでの溶出後、ＰＡタンパク質は必要な場合はＶｉｖａｓｐｉｎ２０ ５０Ｋカラムを用いて濃縮し、−８０℃でさらなる使用時まで冷凍した。解凍後、溶出バッファーを低蛍光グレード試薬に交換し、全てのＨＡペプチドを同時に１０−ＤＧ Ｂｉｏ−Ｇｅｌカラムを用いて除去した。

Ａ型インフルエンザウイルスポリメラーゼサブユニットＰＢ１の最初の２５個のＮ末端アミノ酸に相当する蛍光標識したペプチドを、３ｎＭ濃度で、２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール及び１００ｍｇ／ｍｌウシγグロブリン中に溶解された１０マイクロＭのＨＡ−ＰＡに添加した。混合物を黒色の３８４ウェルプレートに１ウェルあたりの総液量が２０マイクロリットルになるように分配し、氷上で維持した。ＤＭＳＯ中に溶解しれた試験化合物を、終濃度が２５マイクロＭになるように添加した。室温で１０分間のインキュベーション後、プレートはＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００リーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて読み取った。試験化合物を含有するウェルのＦＰ値を、試験化合物を含まないウェル、ＤＭＳＯを含まないウェル及びペプチドのみを含むウェルと比較した。

配列アライメント：アライメントはＥｄｇａｒ（２００４）の中で記述されたように公開インフルエンザウイルスデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から提供された完全長配列を用いて、ＭＵＳＣＬＥで実施した。

モデル化：変異ペプチドのＰＡ（Ｃ）−ＰＢ１（Ｎ）結晶構造（Ｈｅら、２００８）への手動ドッキング、続いてＡｃｃｅｌｒｙｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏでの最小化が実施した。

図表の詳細な説明

表１ａは競合的ＥＬＩＳＡにより決定されたＦｌｕＡ／ＦｌｕＢ由来ペプチドの阻害濃度を示す。競合ペプチド（０．０４８〜３０００ｎＭ）をＦｌｕＡ又はＦｌｕＢいずれかからのＨＡタグ付加ＰＡを含有する細胞抽出液と混合した。表１は１２個の競合的ペプチドを示している。一番目のペプチドＰＢ１_１−１５ＡはＦｌｕＡの野生型で、二番目の列はＦｌｕＢの野生型を示す。行３〜８のペプチドについて、文字はＦｌｕＢ特異的なアミノ酸を示す。行９〜１２はさらに、６位のアミノ酸がＦｌｕＡ特異的でもＦｌｕＢ特異的でもない競合的ペプチドを示している。Ｓ．Ｄ．は括弧内に表示する。アスタリスクは用いた５０％阻害に達しないペプチドの最高濃度を表示する。表に示していないが低いペプチド濃度で５０％阻害に効果的に達したさらなる競合的ペプチドはＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６Ｉ、ＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６Ｌ及びＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６Ｖである。少し低い阻害活性を持つペプチドは同様に表１ａ中に示されていないＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６Ａ及びＰＢ１_１−１５Ａ_Ｔ６Ｍである。

高い阻害活性を持つさらなるペプチドについての包括的及び質的概要は表1bに提供される。表の中で野生型A型変異体のＸ_５位〜Ｘ_１０位におけるアミノ酸配列を示す。

表１ｃに野生型Ａ型変異体のアミノ酸残基Ｘ_５〜Ｘ_１０におけるアミノ酸配列を示す。前記ペプチドは表１ａ及び１ｂによる上述のペプチドよりも低い活性を呈する。

上で表された情報及び結果に基づくと、当業者には、本発明による合成又は単離されたインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドがアミノ酸配列Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０を含み、Ｘ_５がＰであり、Ｘ_６がＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ又はＭであり、Ｘ_７がＬ又はＦであり、Ｘ_８がＬ、Ｉ、Ｆ又はＭであり、Ｘ_９がＦ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｌ、Ｒ又はＳであり、Ｘ_１０がＬ、Ｉ又はＹであることは明確である。前記アミノ酸配列はＭＤＶＮＰＴＬＬＦＬＫである野生型ＰＢ１_１−１１Ａによるポリペプチドと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％又は９０％同一であること明らかである。

前述のペプチド群の中で、アミノ酸配列Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０を含み、Ｘ_６がＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ｉ、Ｌ又はＶであり、Ｘ_７がＬ又はＦであり、Ｘ_８がＬ又はＩであり、Ｘ_９がＦ、Ｙ又はＷであり、Ｘ_１０がＬであるペプチドが好ましい。特定の実施形態により一層好ましいのはアミノ酸配列Ｘ_６Ｘ_７を含み、Ｘ_６がＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ｉ、Ｌ又はＶであり、Ｘ_７がＬ又はＦであるペプチドである。

本発明によるペプチドは好ましい実施形態による少なくとも１１残基のＸ_１−１１を含み、好ましくはタンパク質はアミノ酸配列ＭＤＶＮＰＸ_６Ｘ_７ＬＦＬＫＶＰＡＱを含み、Ｘ_６がＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＭの群から選択され、Ｘ_７がＬ又はＦの群から選択される。好ましいペプチドはＭＤＶＮＰＹＦＬＦＬＫＶＰＡＱ、ＭＤＶＮＰＹＬＬＦＬＫＶＰＡＱ、ＭＤＶＮＰＷＬＬＦＬＫＶＰＡＱ又はＭＤＶＮＰＦＬＬＦＬＫＶＰＡＱの群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

本発明のさらに好ましい実施形態によると、ペプチドは野生型ＰＢ１_１−１５Ａによるが野生型配列ＭＤＶＮＰＴＬＬＦＬＫＶＰＡＱでない、少なくとも１５残基のＸ_１−１５を含む。

表２は競合的ＥＬＩＳＡにより決定されたＦｌｕＡ由来ＰＢ１ペプチドの５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）を示す。ペプチドＰＢ１_１−２５Ａをマイクロウェルプレート上に固定化し、濃度を上昇させた競合ペプチド及びＨＡタグ付加されたＦｌｕＡのＰＡを含有する細胞抽出液と共にインキュベートした。結合したＰＡを上記のようにＨＡ特異的抗体により検出した。Ｓ．Ｄ．は括弧内に示す。アスタリスクは検出可能な阻害作用を持たないで用いられたペプチドの最高濃度を表示する。灰色のボックスは３_１０−ヘリックス部分のアミノ酸を強調しており、３_１０−ヘリックスはＰＢ１のコアＰＡ結合領域を含む。ＰＡ残基と水素結合を形成することが知られているアミノ酸は太字で表す。ＰＢ１のＰＡ結合ドメインを含む２５ｍｅｒペプチドのＮ末端及びＣ末端における体系的なトランケーションは、ＥＬＩＳＡアッセイの結果に基づいて、ｉ）２５ｍｅｒペプチドは結合したペプチド−ＰＡ相互作用を阻害する能力を失うことなく、最初の１４個又は１３個のＮ末端アミノ酸が残るまでＣ末端においてトランケートされ得ることを示した。最初の１２個又は１１個のアミノ酸に至るまでのＣ末端におけるトランケーションは、なお相当な活性を示すペプチドを生じさせた。体系的なトランケーションはｉｉ）Ｎ末端のトランケーションはペプチドの阻害活性を大きく損わずには不可能であることをさらに示した。

表３はＥＬＩＳＡにより決定したＦｌｕＡ由来競合ペプチドの阻害濃度（ＩＣ_５０）を示す。ペプチドＰＢ１_１−２５Ａを再びマイクロウェルプレート上に固定化し、濃度を上昇させた競合ペプチド及びＨＡタグ付加されたＦｌｕＡのＰＡを含有する細胞抽出液と共にインキュベートした。ＨＡ特異的抗体が結合したＰＡを検出した。Ｓ．Ｄ．は括弧内に示す。アスタリスクは検出可能な阻害作用を持たない用いられたペプチドの最高濃度を表示する。

図１に基づいて、本発明によるペプチドの結合及び阻害活性を、好ましいタンパク質であるＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙに焦点を置いて以下の記載部分に示す。図１ａは上段パネルにおいてＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＰＢ１のＮ末端２５ａａについてのコンセンサス配列のアライメントを示し、点模様のボックスはＰＢ１のコアＰＡ結合ドメインを含む３_１０−ヘリックスを表示し、ＦｌｕＡ特異的及びＦｌｕＢ特異的ａａは太字で印刷されている。中段及び下段パネルはＮＣＢＩインフルエンザウイルスデータベースにより提供されたＰＢ１完全長配列由来の、利用可能な全てのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ配列のＮ末端２５ａａのアライメントを示す。細胞抽出液からのＨＡタグ付加ＰＡサブユニットの、ＦｌｕＡ ＰＢ１（ＰＢ１_１−２５Ａ）、ＦｌｕＢ ＰＢ１（ＰＢ１_１−２５Ｂ）又はＦｌｕＡ ＰＢ１ Ｔ６Ｙ（ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙ）ドメインに相当する固定化ペプチドへの結合はＥＬＩＳＡにより決定し、図１ｂに示す。同族ペプチド及び溶解液を用いたシグナルを１に規格化した。ＰＡサブユニットの対照ペプチドへの結合は観察されなかった。上段パネル：用いられたＰＡ含有細胞抽出液のウエスタンブロット。分子量はキロダルトンで示される。

図１ｃはＦｌｕＡ ＰＡに結合したＦｌｕＡ ＰＢ１_１−１５の構造についての図解情報をいくつか提供する。Ｔ６は水分子との水素結合を形成する。分子モデル化は変異体のＴ６Ｙ中の芳香族側鎖が疎水性ポケット内に適合して水分子を置き換えることを示唆する。

ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢポリメラーゼ再構成アッセイにおけるＰＢ１_１−２５由来ＧＦＰ融合タンパク質のポリメラーゼ阻害活性を図１ｄに示す。全ウイルスプラスミド及びＦｌａｇ−ＧＦＰを含有する実験における活性を１００％に設定した。

図１ｅはＰＢ１_１−２５Ａ−Ｔａｔ、ＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙ−Ｔａｔ、ＰＸ−Ｔａｔ（対照ペプチド）をＦｌｕＡ、ＦｌｕＢ及びＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）と共に用いたプラーク減少アッセイを示す。Ｈ_２Ｏ対照がアッセイを標準化するために１００％として用いられた。ＰＢ１_１−２５Ｂ−Ｔａｔは不溶性のために試験され得なかったことに注意されたい。エラーバーはＳ．Ｄ．を表現する。

ＰＡのＰＢ１とのウイルス型特異的な相互作用を図２に図示する。図２ａは図２ｂによる試験に用いられたＡ／ＳＣ３５Ｍ及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／７３由来のＰＢ１キメラを示す。全てのＰＢ１タンパク質はＣ末端のＨＡタグと共に発現されたことに注意されたい。図２ｂは指示されたＰＢ１タンパク質及びＣ末端にヘキサヒスチジンタグが付加されたＦｌｕＡのＰＡ（ＦｌｕＡＰＡ_Ｈｉｓ）をコードする発現プラスミドでトランスフェクトされたヒト２９３Ｔ細胞を示す。細胞溶解液はトランスフェクションから２４時間後に調製され、抗ＨＡ（ａＨＡ）アガロースを用いる免疫沈降（ＩＰ）に供した。沈降した物質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ウエスタンブロットによりＨｉｓ又はＨＡタグ付加ポリメラーゼサブユニットのいずれかの存在について適切な抗体を用いて分析した。タンパク質発現量は同量の細胞溶解液を分析することにより調節した。分子量はキロダルトンで示す。ヘリックスドメインを含む２５ｍｅｒペプチドのＰＢ１_１−２５ＡはＦｌｕＡのポリメラーゼ活性及び複製を阻害する一方、ＦｌｕＢポリメラーゼの活性は影響されない。

図３ではＦｌｕＡ／ＢペプチドキメラであるＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙの二重結合特性を図示する。下段パネルはマイクロウェルプレート上に固定化され、指示されたＦｌｕＡ又はＦｌｕＢ株からのＰＡ−ＨＡを含有する、濃度を上昇させた細胞抽出液と共にインキュベートしたペプチドＰＢ１_１−２５Ａ、ＰＢ１_１−２５Ｂ又はＰＢ１_１−２５Ａ_Ｔ６Ｙを示す。結合したＰＡ−ＨＡはＨＡ特異的抗体及びペルオキシダーゼ標識二次抗体により検出した。結合効率は基質の変換を４０５ｎｍで測定することにより定量した。Ｓ．Ｄ．はエラーバーにより表示する。実験は３連で繰り返された。上段パネルは対応する量の細胞溶解液のウエスタンブロットによる分析を示し、分析によりタンパク質発現量を調節した。分子量はキロダルトンで示す。

図４ａは図４ｂによる試験において用いられたＧＦＰ−ＰＢ１融合タンパク質を示す。ＰＢ１_１−２５由来ＧＦＰ融合タンパク質とＨＡタグ付加されたＦｌｕＡ及びＦｌｕＢのＰＡとの複合体形成を図４ｂに示す。指示されたタンパク質をヒト２９３Ｔ細胞中で発現させ、ＧＦＰ融合タンパク質の結合を抗ＨＡアガロースを用いたＰＡの免疫沈降（ＩＰ）及びその後に続くイムノブロット（ＩＢ）により分析した。沈降した物質は指示された抗体を用いたウエスタンブロットによりＨＡタグ付加ＰＡ又はＧＦＰのいずれかの存在について分析した。分子量はキロダルトンで示す。

上述の本発明の実施形態は例のみを意図されている。代替、改変及び変化は特定の実施形態について当業者によって本発明の範囲から逸脱することなくされ得るものであり、本発明の範囲は本明細書に付属する特許請求の範囲によってのみ定義される。全ての参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。

参考文献
1. http://www.who.int/csr/disease/influenza/vaccinerecommendations1/en/
2. Moscona, A. N Engl J Med 353,1363-1373 (2005).
3. Davies, W.L. et al. Science 144,862-863 (1964).
4. Moscona, A. N Engl J Med 360, 953-956(2009).
5. Dharan, N.J. et al. JAMA 301,1034-1041 (2009).
6. Pilger, B.D, Cui, C. & Coen, D.M.Chem Biol 11, 647-654 (2004).
7. Brownlee, GG. & Sharps, J.L. JVirol 76, 7103-7113 (2002).
8. Perales, B. & Ortin, J. J Virol71, 1381-1385 (1997).
9. Fodor, E. et al. J Virol 76,8989-9001 (2002).
10. He, X. et al. Nature 454, 1123-1126(2008).
11. Obayashi, E. et al. Nature 454,1127-1131 (2008).
12. Ghanem, A. et al. J Virol 81,7801-7804 (2007).
13. Dostmann, W.R. et al. Proc Natl AcadSci USA 97, 14772-14777 (2000).
14. Chokephaibulkit, K. et al. PediatrInfect Dis J 24, 162-166 (2005).
15. Norton, G.P. et al. Virology 156,204-213 (1987).
16. Schwemmle, M, Weining, K.C, Richter,M.F, Schumacher, B. & Staeheli, P. Virology 206, 545-554 (1995).
17. Mayer, D. et al. J Proteome Res 6,672-682 (2007).
18. Pleschka, S. et al. J Virol 70,4188-4192 (1996).
19. Schneider, U., Naegele, M.,Staeheli, P. & Schwemmle, M. J Virol 77, 11781-11789 (2003).
20. Schmidtke, M., Schnittler, U., Jahn,B., Dahse, H. & Stelzner, A. J Virol Methods 95, 133-143 (2001).
21. Edgar, R.C. Nucleic Acids Res 32,1792-1797 (2004).

Claims (17)

1. Ａ型及びＢ型の両インフルエンザウイルスのヘテロ三量体ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体のＰＡ及びＰＢ１サブユニットの間のタンパク質−タンパク質相互作用を競合的に阻害する合成又は単離されたインフルエンザウイルス複製阻害ペプチドであって、配列Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０を含むアミノ酸配列を含み、Ｘ_５はＰであり、Ｘ_６はＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ又はＭであり、Ｘ_７はＬ又はＦであり、Ｘ_８はＬ、Ｉ、Ｆ又はＭであり、Ｘ_９はＦ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｌ、Ｒ又はＳであり、Ｘ_１０はＬ、Ｉ又はＹであり、前記アミノ酸配列がＭＤＶＮＰＴＬＬＦＬＫである野生型ＰＢ１_１−１１Ａによるポリペプチドと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％又は９０％同一であり、前記野生型ＰＢ１_１−１１Ａは除外される、インフルエンザウイルス複製阻害ペプチド。
2. ＭＤＶＮＰＴＬＬＦＬＫＶＰＡＱである野生型ＰＢ１_１−１５Ａによるポリペプチドと少なくとも６６％、好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７９％、８６％又は９３％同一なアミノ酸配列を含み、前記野生型ＰＢ１_１−１５Ａは除外される、請求項１に記載のペプチド。
3. アミノ酸配列Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０を含み、Ｘ_６がＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ｉ、Ｌ又はＶであり、Ｘ_７がＬ又はＦであり、Ｘ_８がＬ又はＩであり、Ｘ_９がＦ、Ｙ又はＷであり、Ｘ_１０がＬである、請求項１又は２に記載のペプチド。
4. アミノ酸配列Ｘ_６Ｘ_７を含み、Ｘ_６がＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ｉ、Ｌ又はＶであり、Ｘ_７がＬ又はＦである、請求項３に記載のペプチド。
5. 前記アミノ酸配列が１５残基のＸ_１−１５を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
6. アミノ酸配列ＭＤＶＮＰＸ_６Ｘ_７ＬＦＬＫＶＰＡＱを含み、Ｘ_６がＴ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＭの群より選択され、Ｘ_７がＬ又はＦの群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
7. ＭＤＶＮＰＹＦＬＦＬＫＶＰＡＱ、ＭＤＶＮＰＹＬＬＦＬＫＶＰＡＱ、ＭＤＶＮＰＷＬＬＦＬＫＶＰＡＱ又はＭＤＶＮＰＦＬＬＦＬＫＶＰＡＱの群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のペプチド。
8. 細胞透過性ペプチド、好ましくはＨＩＶ−Ｔａｔの細胞透過性ドメインに融合した請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として含むインフルエンザウイルス複製阻害剤。
9. Ａ型インフルエンザ株及びＢ型インフルエンザ株の複製を阻害する、請求項８に記載のインフルエンザウイルス複製阻害剤。
10. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として含むインフルエンザ予防／治療剤。
11. Ａ型インフルエンザ株及びＢ型インフルエンザ株に対して有効である、請求項１０に記載のインフルエンザ予防／治療剤。
12. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
13. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド及び適合性の担体を含むガレヌス製剤。
14. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬。
15. インフルエンザの治療に用いるための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
16. インフルエンザを治療する医薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
17. 好ましくは競合的阻害剤としての、前記野生型を包含する請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドの使用を含む、インフルエンザポリメラーゼサブユニットの相互作用の阻害剤をＥＬＩＳＡ又は蛍光偏光アッセイに基づいて決定する方法。

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