JP6570448B2 - インフルエンザウイルス阻害薬 - Google Patents
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Description
[1]インフルエンザウイルス由来PAサブユニット断片。
[2]インフルエンザウイルスがA/Vietnam/1194/2004(H5N1)株、A/WSN/33株(ソ連型H1N1)、A/NT/60/68株(香港型H3N2)、A/HongKong/156/97株(1997年トリ型H5N1)またはA/Kurume/K0910/2009株(2009パンデミックH1N1)である、[1]に記載のPAサブユニット断片。
[3]PAサブユニットのN末端断片である、[1]または[2]に記載のPAサブユニット断片。
[4]PAサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、[1]ないし[3]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[5]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から28番目のプロリン(P)、86番目のメチオニン(M)、91番目のバリン(V)および100番目のバリン(V)よりなる群から選ばれた少なくとも1のアミノ酸を含むPAサブユニット断片である、[1]ないし[4]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[6]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から28番目のプロリン(P)、86番目のメチオニン(M)、91番目のバリン(V)および100番目のバリン(V)を含むPAサブユニット断片である、[5]に記載のPAサブユニット断片。
[7]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から187番目のロイシン(L)および/または188番目のトリプトファン(W)を含むPAサブユニット断片である、[1]ないし[6]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[8]配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、[1]ないし[7]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[9]配列番号4のアミノ酸配列を含む、[1]ないし[8]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[10]配列番号4のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、[1]ないし[9]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[11]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から187番目までのアミノ酸配列(配列番号5)を含むPAサブユニット断片である、[1]ないし[6]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[12]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から188番目までのアミノ酸配列(配列番号6)を含むPAサブユニット断片である、[1]ないし[7]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[13]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から192番目までのアミノ酸配列(配列番号7)を含むPAサブユニット断片である、[1]ないし[7]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[14][1]ないし[13]のいずれかに記載のPAサブユニット断片をコードする核酸。
[15][14]に記載の核酸を含む組換えベクター。
[16][15]に記載のベクターを含む形質転換細胞。
[17]インフルエンザウイルス由来PAサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬。
[18]PAサブユニット断片の由来するインフルエンザウイルスがA/Vietnam/1194/2004(H5N1)株、A/WSN/33株(ソ連型H1N1)、A/NT/60/68株(香港型H3N2)、A/HongKong/156/97株(1997年トリ型H5N1)またはA/Kurume/K0910/2009株(2009パンデミックH1N1)である、[17]に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[19]PAサブユニット断片がPAサブユニットのN末端断片である、[17]または[18]に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[20]PAサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、[17]ないし[19]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[21]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から28番目のプロリン(P)、86番目のメチオニン(M)、91番目のバリン(V)および100番目のバリン(V)よりなる群から選ばれた少なくとも1のアミノ酸を含むPAサブユニット断片である、[17]ないし[20]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[22]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から28番目のプロリン(P)、86番目のメチオニン(M)、91番目のバリン(V)および100番目のバリン(V)を含むPAサブユニット断片である、[21]に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[23]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から187番目のロイシン(L)および/または188番目のトリプトファン(W)を含むPAサブユニット断片である、[17]ないし[22]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[24]PAサブユニット断片が配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、[17]ないし[23]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[25]PAサブユニット断片が配列番号4のアミノ酸配列を含む、[17]ないし[24]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[26]PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、[17]ないし[25]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[27]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から187番目までのアミノ酸配列(配列番号5)を含むPAサブユニット断片である、[17]ないし[22]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[28]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から188番目までのアミノ酸配列(配列番号6)を含むPAサブユニット断片である、[17]ないし[23]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[29]PAサブユニット断片が、天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末端から192番目までのアミノ酸配列(配列番号7)を含むPAサブユニット断片である、[17]ないし[23]のいずれかに記載のPAサブユニット断片。
[30]インフルエンザウイルスの遺伝子複製を阻害することによってウイルス増殖を阻害する、[17]ないし[29]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
[31]A/Vietnam/1194/2004(H5N1)株、A/WSN/33株(ソ連型H1N1)、A/NT/60/68株(香港型H3N2)、A/HongKong/156/97株(1997年トリ型H5N1)およびA/Kurume/K0910/2009株(2009パンデミックH1N1)よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖を阻害する、[17]ないし[30]のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
MetGluAspPheValArgGlnCysPheAsnProMetIleValGluLeuAlaGluLysAlaMetLysGluTyrGlyGluAspProLysIleGluThrAsnLysPheAlaAlaIleCysThrHisLeuGluValCysPheMetTyrSerAspPheHisPheIleAspGluArgSerGluSerIleIleValGluSerGlyAspProAsnAlaLeuLeuLysHisArgPheGluIleIleGluGlyArgAspArgThrMetAlaTrpThrValValAsnSerIleCysAsnThrThrGlyValGluLysProLysPheLeuProAspLeuTyrAspTyrLysGluAsnArgPheIleGluIleGlyValThrArgArgGluValHisThrTyrTyrLeuGluLysAlaAsnLysIleLysSerGluLysThrHisIleHisIlePheSerPheThrGlyGluGluMetAlaThrLysAlaAspTyrThrLeuAspGluGluSerArgAlaArgIleLysThrArgLeuPheThrIleArgGlnGluMetAlaSerArgGlyLeuTrpAspSerPheArgGlnSerGluArgGlyGluGluThrIleGluGluLysPheGluIleThrGlyThrMetArg(配列番号4)
atggaagactttgtgcgacaatgcttcaatccaatgattgtcgagcttgcggaaaaggcaatgaaagaatatggggaagatccgaaaatcgaaacgaacaagtttgctgcaatatgcacacacttggaggtctgtttcatgtattcggattttcactttattgatgaacggagtgaatcaataattgtagaatctggagatccgaatgcattattgaaacaccgatttgaaataattgaaggaagagaccgaacgatggcctggactgtggtgaatagtatctgcaacaccacaggagttgagaaacctaaatttctcccagatttgtatgactacaaagagaaccgattcatcgaaattggagtgacacggagggaagttcatacatactatctggagaaagccaacaagataaaatccgagaagacacatattcacatattctcattcacaggggaggaaatggccaccaaagcggactacacccttgatgaagagagcagggcaagaattaaaaccaggctgttcaccataaggcaggaaatggccagtaggggtctatgggattcctttcgtcaatccgagagaggcgaagagacaattgaagaaaaatttgaaatcactggaaccatgcgctag(配列番号3)
E−MEM(10%FBS)(日水)培地を用いて、HEK293T細胞(Human Embryonic Kidney Cell)を75cm2フラスコにて80%コンフルエントまで37℃、5%CO2存在下で培養した。293T細胞の培地を丁寧に取り除き、1mlの0.25%トリプシン(1mM EDTA含む)(Nakarai)で処理し、30mlのE−MEM(10%FBS含む)を加え縣濁した。懸濁細胞液を6穴プレートに各2ml撒いた。
実施例1と同様の手順により、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)株以外の他のインフルエンザウイルス株由来のPAサブユニット断片についてインフルエンザウイルスの増殖抑制効果を調べた。他のインフルエンザウイルス株としては、A/WSN/33株(ソ連型H1N1)、A/NT/60/68株(香港型H3N2)、A/HongKong/156/97株(1997年トリ型H5N1)およびA/Kurume/K0910/2009株(2009パンデミックH1N1)を用いた。ルシフェラーゼによるレポーターアッセイによる確認だけでなく、インフルエンザウイルスの遺伝子複製と転写活性を特異的に検出できる実験系(Primer Extension Assay)でも確認を行った。
特異性をさらに検証するため、ウミシイタケルシフェラーゼをコントロールとして用いた測定を行った。実施例1に記載のプラスミドに加えて、ウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドとしてpRL-TKを用いた以外は実施例1と同様の手順に従った。
ホタルルシフェラーゼは、細胞内の人工インフルエンザウイルスRNPから生成されるのに対し、ウミシイタケルシフェラーゼは、インフルエンザウイルスRNPとは完全に独立して細胞内に発現した(インターナルコントロール)。この2つのルシフェラーゼは発色基質が異なり、PromegaのDual luciferase測定キットを用いることで、2つのルシフェラーゼの活性を区別して測定できた。測定方法はPromegaの添付マニュアルに準じて行った。
他のインフルエンザウイルス株へのVN PA N212の作用を確認した。実施例1で用いたA/WSN/33(H1N1)に代えて、A/NT/60/68株(香港型H3N2)、A/HongKong/156/97株(1997年トリ型H5N1)、A/WSN/33株(ソ連型H1N1)およびA/Kurume/K0910/2009株(2009パンデミックH1N1)を用いた以外は実施例1と同様の手順に従った。
阻害メカニズムを探るために、インフルエンザウイルスのRNPを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した。
実施例4で用いた細胞抽出液の中のタンパク質量をSDS−PAGE法(12%ゲル化剤)およびウエスタンブロット法(20%メタノール、100V、1時間、Millipore製PVDF膜)を用いて測定した。PA、PB1、NPの検出には、それぞれを認識するウサギ由来のIgGを用いた。インターナルコントロールとして細胞内に恒常的に発現しているベータアクチンを測定した。ベータアクチンの検出用抗体はマウス由来のIgGであった。
PAサブユニット断片による阻害メカニズムを調べるため、PAサブユニット断片に変異を導入して阻害活性を測定した。
これまでに報告されたPAのN末端の機能に、エンドヌクレアーゼとプロテアーゼがある。エンドヌクレアーゼは細胞のmRNAをターゲットとしており、細胞由来のmRNAキャップを切り取る作用がある。またプロテアーゼの基質は未だ不明である。この何れの機能も活性中心が報告されているのでそれぞれの変異体を作成し、阻害効果を確認した。
エンドヌクレアーゼの活性中心はD108だけでなく、K134にも報告がある。そこでさらに深く検証するために、実施例6と同様の手順に従って、108位だけでなく134位の変異体も作成し確認を行った。
VN PA N212変異体を用いてRNPの発現を確認した。実施例7で用いた細胞抽出液の中のタンパク質量をSDS−PAGE法(12%ゲル化剤)およびウエスタンブロット法(20%メタノール、100V、1時間、Millipore製PVDF膜)を用いて測定した以外は実施例5と同様の手順に従った。
PAサブユニット断片による阻害メカニズムをさらに詳細に調べるため、PAサブユニット断片に欠失を導入した各種断片を調製した。具体的には、VN PA N212において、以下のアミノ酸をそれぞれ欠失させた断片を調製した(図12)。
PAサブユニット断片による阻害メカニズムをさらに詳細に調べるため、PAサブユニット断片に欠失を導入した各種断片を調製した。具体的には、VN PA N212において、以下のアミノ酸をそれぞれ欠失させた断片を調製した(図13)。
実施例10の結果は、PAサブユニット断片の阻害活性には天然のPAサブユニットのアミノ酸配列のN末から少なくとも187アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることを示した。このことから、N末端から数えて187番目ロイシン(L)および188番目のトリプトファン(W)がエンドヌクレアーゼ活性にとって重要なアミノ酸であることが推測された。そこで、これらアミノ酸残基を置換して阻害活性に影響が出ないか調べた。具体的には、これらアミノ酸残基をアラニンに置換した断片を調製して阻害活性を調べた(N212/L187AおよびN212/W188A;図14)。
本発明ではPAサブユニット断片を発現させるのに発現ベクターとしてプラスミドを用いているので、本発明の阻害活性がPAサブユニット断片によるのでなくプラスミドそのもの、あるいはプラスミドを導入するという行為によるのではないかとの疑念が残る。そこで、斯かる疑念を除くため、以下の実験を行った。
PA断片の発現用プラスミドとしては、VN PA N212をpcDNA3.1(+)に挿入したもの、および阻害効果の比較対象として、PAのC末端504アミノ酸(VN/PA/C504)をpcDNA3.1(+)に挿入したものおよびプラスミド単独のpcDNA3.1(+)を用いた他は、実施例1と同様に行った。
本発明のPAサブユニット断片が本当に細胞内に発現して作用しているのかという懸念を解消するため、以下の実験を行った。
実施例5と同様にして、VN PA N212およびVN/PA/C504について、インフルエンザウイルスのRNPを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した。2種の濃度について試験した。
結果を図16に示す(図16A)。VN PA N212の発現が確認され、また、その濃度に応じて、RNPの構成成分が全て喪失していた(図16A)。この結果と上記実施例12の結果(プラスミド単独の結果)とから、プラスミドから発現したPAサブユニット断片が阻害効果を発揮していると確認できた。また、ベータアクチンの発現量は顕著な低下を示していないことから、インフルエンザウイルスのRNPに特異的に作用していることが示唆された。
つぎに、阻害効果には108番目と134番目のエンドヌクレアーゼの活性中心が必要なことは、実施例6および7に示したとおりである。そこで、N212/D108A、N212/K134AおよびN212/T157Aについて、実施例5と同様にして発現させた。また、これら変異体について、実施例6と同様にして阻害活性を調べた。その結果を図16に示す(図16BおよびC)。
N212/T157A、N212/K134A、N212/D108Aの全ての変異体において発現が確認された。ここで、エンドヌクレアーゼに関与している部位を変異した断片(N212/K134AとN212/D108A)では、PAサブユニット断片が発現されているにも拘わらず、阻害作用は認められなかった(すなわち、RNPの発現が抑えられなかった)。一方、エンドヌクレアーゼに関わらない部位を変異した断片(N212/T157A)では阻害効果が認められた。これらのことから、エンドヌクレーゼの関与が再度確認され、さらにPAサブユニット断片が発現し、RNPの消失に作用していることが確認された。
Claims (14)
- エンドヌクレアーゼ活性を保持しているインフルエンザウイルス由来PAサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片の由来するインフルエンザウイルスがA/Vietnam/1194/2004(H5N1)株、A/WSN/33株(ソ連型H1N1)、A/NT/60/68株(香港型H3N2)、A/HongKong/156/97株(1997年トリ型H5N1)またはA/Kurume/K0910/2009株(2009パンデミックH1N1)である、請求項1に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片がPAサブユニットのN末端断片である、請求項1または2に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列のN末端から28番目のプロリン(P)、86番目のメチオニン(M)、91番目のバリン(V)および100番目のバリン(V)よりなる群から選ばれた少なくとも1のアミノ酸を含むPAサブユニット断片である、請求項1ないし3のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列のN末端から28番目のプロリン(P)、86番目のメチオニン(M)、91番目のバリン(V)および100番目のバリン(V)を含むPAサブユニット断片である、請求項4に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列のN末端から187番目のロイシン(L)および/または188番目のトリプトファン(W)を含むPAサブユニット断片である、請求項1ないし5のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項1ないし6のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項1ないし7のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、請求項1ないし8のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列のN末端から187番目までのアミノ酸配列(配列番号5)を含むPAサブユニット断片である、請求項1ないし5のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列のN末端から188番目までのアミノ酸配列(配列番号6)を含むPAサブユニット断片である、請求項1ないし6のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- PAサブユニット断片が、配列番号4のアミノ酸配列のN末端から192番目までのアミノ酸配列(配列番号7)を含むPAサブユニット断片である、請求項1ないし6のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- インフルエンザウイルスの遺伝子複製を阻害することによってウイルス増殖を阻害する、請求項1ないし12のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
- A/Vietnam/1194/2004(H5N1)株、A/WSN/33株(ソ連型H1N1)、A/NT/60/68株(香港型H3N2)、A/HongKong/156/97株(1997年トリ型H5N1)およびA/Kurume/K0910/2009株(2009パンデミックH1N1)よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖を阻害する、請求項1ないし13のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
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