ES2651515T3 - La familia miARN-212/132 como diana terapéutica - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de miR-132 para su uso en el tratamiento o prevención de hipertrofia cardíaca, trastornos autofágicos o asociados a hipertrofia cardíaca, y/o disfunción cardíaca, en el que el inhibidor es una molécula de ácido nucleico aislada que tienen suficiente complementariedad con miR-132 para formar un híbrido en condiciones fisiológicas.

Description

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DESCRIPCION

La familia miARN-212/132 como diana terapeutica

La presente invencion se refiere a inhibidores de microARN miR-132 para su uso en medicina, particularmente en el tratamiento o prevencion de trastornos cardfacos, por ejemplo, trastornos asociados a hipertrofia ca^aca o autofagicos.

la invencion se refiere adicionalmente a moleculas aisladas de acido nucleico de microARN miR-132 y secuencias relacionadas para su uso en medicina, particularmente en medicina humana, mas particularmente en el diagnostico, tratamiento o prevencion de trastornos que implican atrofia cardfaca y/o autofagia disfuncional, por ejemplo, caquexia cardfaca.

La insuficiencia cardfaca es una de las causas patologicas que dan lugar a mortalidad en el mundo. Las opciones farmacologicas terapeuticas que se utilizan actualmente para la insuficiencia cardfaca incluyen agentes moduladores de angiotensina, p-bloqueantes, diureticos, antagonistas de aldosterona, vasodilatadores, o agentes inotropicos. Aunque varios estudios clmicos han demostrado disminuciones significativas de las tasas de mortalidad inducidas por la insuficiencia cardfaca para todos estos agentes, la tasa de mortalidad a los 5 anos permanece de manera inaceptable a casi el 50 %. Por lo tanto existe una urgencia en el desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas mas eficaces para la insuficiencia cardfaca.

El crecimiento hipertrofico patologico de los cardiomiocitos puede dar lugar al desarrollo de remodelacion cardfaca, insuficiencia cardfaca y muerte cardfaca repentina. El crecimiento hipertrofico de los cardiomiocitos es una repuesta al aumento de la tension de la pared cardfaca producida por una sobre carga del volumen cardfaco y/o la presion. Inicialmente, la hipertrofia cardfaca es un mecanismo compensatorio con el fin de disminuir la tension de la pared y aumentar el gasto cardfaco. Sin embargo, la hipertrofia cardiaca prolongada progresa hacia una disfuncion contractil, descompensacion cardfaca y finalmente insuficiencia cardfaca (Hill y Olson, 2008; Barry y Townsend, 2010). La transicion de la hipertrofia fisiologica a la patologica puede producirse dependiendo de muchos factores que incluyen perdida de miocitos mediante apoptosis o necrosis, defectos en la respuesta contractil, homeostasis del calcio desregulada, des-sensibilizacion de los receptores adrenergicos, o fibrosis cardfaca (Hill y Olson, 2008; Barry y Townsend, 2010).La senalizacion de hipertrofia esta mediada sobre todo por la ruta de senalizacion de las insulina (DeBosch y Muslin, 2008; Barry y Townsend, 2010). Tanto la insulina como el factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1) activan las rutas pro-hipertroficas en los cardiomiocitos mediante el receptor del IGF-1, que activa la fosfoinositina-3-cinasa (PI3K) (McMullen et al., 2004). La actividad de PI3K da lugar a la activacion de la serina/treonina cinasa Akt mediante su fosforilacion y la Akt activa fosforila los factores de transcripcion FoxO anti- hipertroficos que da lugar a su desestabilizacion y prevencion de la localizacion nuclear (Datta et al., 1999; Skurk et al., 2005; Ronnebaum y Patterson, 2010). Por el contrario, la acetilacion de los factores FoxO mediante la sirtuina -1 (Sirt-1) da lugar a su estabilizacion y la translocalizacion nuclear (Frescas et al., 2005). Los factores de transcripcion FoxO estabilizados se localizan en el nucleo con el fin de regular la expresion de genes anti-hipertroficos. Las funciones anti-hipertroficas de las protemas FoxO estan mediadas sobre todo mediante la supresion de la ruta de senalizacion de calcineurina pro-hipertrofica mediante la expresion de genes anti-hipertroficos diana de los factores FoxO, tales como atrogin-1 (Ni et al., 2006; Ronnebaum y Patterson, 2010; Glas, 2010). Ademas, los factores de transcripcion FoxO tambien inducen apoptosis y regulan la autofagia en cardiomiocitos (Ronnebaum y Patterson, 2010).

La caquexia es una de las consecuencias mas visibles y devastadoras de la enfermedad humana que se ven en varias enfermedades cronicas humanas, incluyendo el cancer, SIDA, tirotoxicosis, y artritis reumatoide (Anker & Coats, 1999). Se pensaba que se relacionaba con la perdida de apetito (anorexia), anemia, y anormalidades metabolicas. a presencia de perdida de peso general en los pacientes con insuficiencia cardfaca se ha denominado caquexia cardfaca. Anker & Coats (1999) sugenan que la “caquexia card^aca dmica" se defima como una afeccion donde exista una perdida de peso de > 7,5 % en comparacion con el peso normal previo durante una duracion de al menos seis meses en pacientes con insuficiencia cardfaca cronica (CHF), que no muestran smtomas de otros estados caquecticos primarios tales como el cancer, enfermedad tiroidea o enfermedad hepatica grave. Tambien se habfa sugerido una clasificacion adicional en caquexia grave (> 15 % de perdida de peso o > 7,5 % de perdida de peso y < 85 % del peso corporal ideal) y temprana o moderada (> 7,5 % a <15 % de perdida de peso y > 85 % de peso corporal ideal) (Anker & Coats (1999).

La deteccion de caquexia cardfaca, a la que tambien se hace referencia como atrofia corporal, es un fuerte riesgo independiente de mortalidad en pacientes con CHF, con una tasa de mortalidad a los 18 meses del 50%, principalmente debido a la ausencia de una terapia espedfica para pacientes caquecticos con CHF (Anker et al., 1997; Anker& Coats, 1999).

La autofagia es un proceso catabolico, que se inicia con la limitacion de nutrientes, estres celular, especies reactivas a oxfgeno (ROS), o la acumulacion de organulos danados o agregados proteicos. El papel de la autofagia en el mantenimiento de la homeostasis cardfaca se evaluo recientemente (Gottlieb y Mentzer, 2010). Por ejemplo, la eliminacion autofagica de organulos danados, especialmente la mitocondria es crucial para la funcion cardfaca

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apropiada, mientras que la actividad autofagica exagerada puede fomentar el desarrollo de la insuficiencia cardfaca (Gottlieb y Gustafsson, 2011). La degradacion autofagica intensificada puede dar lugar a la muerte celular autofagica, que se diferente de la apoptosis ya que no necesita la activacion de la caspasa (Ronnebaum y Patterson, 2010). Por lo tanto, un delicado equilibrio de la autofagia mantiene la homeostasis cardfaca, mientras que el desequilibrio da lugar a la progresion de la insuficiencia cardfaca (Cao et al., 2011).

Los microARN (miARN) son moleculas de ARN pequenas que regulan la expresion genetica de sus genes diana a niveles post-transcripcionales. Mediante su regulacion directa sobre estos genes diana, los microARN pueden regular varis procesos biologicos y rutas de senalizacion. La disfuncion de varios microARN se ha demostrado en muchos caos, incluyendo el cancer, trastornos neurodegenerativos y enfermedades cardiovasculares. Durante los anos recientes, el posible poder terapeutico de los microARN aparecido por las aplicaciones satisfactorias de las inyecciones intravenosas del precursor de microARN o inhibidores de microARN (antagomir), que dan lugar a la regulacion de genes o rutas que eran disfuncionales en condiciones de enfermedad espedficas. Actualmente, estan bajo investigacion muchas estrategias terapeuticas basadas en la modulacion de la expresion de microARN individuales.

Los miARN ejercen su funcion basandose en la complementacion de bases principalmente en las regiones no traducidas 3' (UTR) de sus ARNm dianas, dando lugar al reconocimiento de estos ARNm dirigidos por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) asociado con los miARN (Valencia-Sanchez et al., 2006; Bartel, 2009). La formacion de un duplex por complementariedad de bases entre el miARN y principalmente la region 3' de los ARNm diana, da lugar a la degradacion de los ARNm o la regulacion negativa de la traduccion mediante la asociacion con el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) (Valencia-Sanchez et al., 2006; Bartel, 2009). Sin embargo, hasta la fecha los papeles funcionales de solo unos cuantos miARN individuales se han presentado para el desarrollo cardfaco o la homeostasis cardiaca (van Rooij et al., 2007; Zhao et al., 2007; Ventura et al., 2008; Liu et al., 2008; Callis et al., 2009; van Rooij et al., 2009). Por lo tanto, la generacion de mutantes de perdida de y ganancia de funcion para otros miARN individuales es necesaria para ganar conocimientos adicionales de la mecanica de la regulacion dependiente de miARN de las funciones y homeostasis cardfacas.

El documento WO 2008/016924 desvela la identificacion de un microARN, miR-208, que induce la expresion de la cadena pesada de la p-miosina (p-MHC) y reprime los genes de protema contractil del musculo esqueletico rapido. La inhibicion de esa funcion se ha propuesto como un tratamiento para la fibrosis cardfaca, hipertrofia y/o insuficiencia cardfaca, y el aumento de esta funcion se puede utilizar para reprimir los genes de fibra lenta y activar los genes de fibras rapidas en el tratamiento de trastornos musculoesqueleticos.

El documento WO 2009/106367 desvela una region promotora de microARN, el uso de un microARN, en particular miR-21, y los elementos relacionados para el diagnostico y para la fabricacion de un medicamente para el tratamiento y/o la prevencion de fibrosis y/o enfermedades relacionados con la fibrosis.

Katare et al., 2011, Circ. Res. 109: 894-906 investigaron la actividad terapeutica y dianas mecanicas de celulas progenitoras de pericitos derivados de la vena safena (SVP) en un modelo de infarto de miocardio (IM) de raton, El trasplante del sVp induce una mejora a largo plazo de la funcion cardfaca mediante un nuevo mecanismo paracrino que implica la secrecion de miR-132 y la inhibicion de sus genes diana.

Despues del nacimiento, muchos sistemas organicos se someten a modificaciones funcionales sustanciales, que se consiguen por un cambio post-natal de los programas geneticos 'fetal' a 'adulto' (1). Durante la insuficiencia cardfaca, el programa genetico 'fetal' se reactiva en el corazon adulto debido al estres hemodinamico o metabolico. La re-expresion de los genes que estan normalmente reprimidos en los cardiomiocitos adultos es una adaptacion a las demandas alteradas de energfa y el agrandamiento hipertrofico de los cardiomiocitos (Barry y Townsend, 2010; Taegtmeyer et al., 2010).

El miR-212 se ha descrito como pro-hipertrofico y altamente regulado positivamente en el miocardio humano insuficiente (Thum et al., 2007; Bauersachs y Thum, 2007; Thum et al., 2008).

La familia genetica del miR-212/132 esta altamente conservada en vertebrados, incluyendo peces y mairnferos. Los inventores habfan demostrado anteriormente que la eliminacion genetica del miR-212/312 en ratones da lugar a la alteracion del desarrollo de la glandula mamaria en la pubertad (Ucar et al., 2010; Ucar et al., 2011). Recientemente se ha demostrado tambien que la eliminacion genetica dirigida del miR-212/132 en el hipocampo de ratones da lugar a una maduracion dendntica alterada de las neuronas del hipocampo (Magill et al., 2010). Ademas, la sobre- expresion transgenica de miR-132 en cerebro de ratones, tiene influencia sobre las funciones del comportamiento incluyendo la regulacion del reloj circadiano y reconocimiento de nuevos objetos (Hansen et al., 2010; Alvarez- Saavedra et al., 2011).

Se desarrollo un formato de ensayo que permite el analisis simultaneo de moleculas de miARN con respecto al efecto fenotfpico en cardiomiocitos primarios de rata. En este ensayo, se confirmo el potencial pro-hipertrofico de miR-212. Sin embargo, no se encontro una correlacion entre la expresion del miARN endogeno y el potencial pro- hipertrofico, desfavoreciendo la presuncion de que la fuerte expresion endogena se correlacionaba con la actividad

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(Jentzsch et al., 2011).

Por lo tanto, los papeles funcionales in vivo de miR-212/132 no se ha explorado aun en organismos vivos, particularmente en situaciones patologicas. Aqm, los inventores demuestran que las afecciones hipertroficas inducen la expresion de la familia miR-212/132 y tanto el miR-212 como el miR-132 regulan la hipertrofia ca^aca y la autofagia en cardiomiocitos. Mas particularmente, se demostro que el estfmulo hipertrofico da lugar a la regulacion positiva de la expresion de miR-212 y miR-132 en cardiomiocitos. La regulacion positiva de ambos miR es necesaria y suficiente para dirigir el crecimiento hipertrofico de los cardiomiocitos. Los ratones nulos en miR-212/132 estan protegidos de la insuficiencia cardfaca inducida por sobre-presion, mientras que la sobre-expresion espedfica en cardiomiocitos de la familia miR-212/132 da lugar a hipertrofia cardfaca patologica, fallo cardfaco y mortalidad en ratones. Tanto el miR-212 como miR-132 se dirigen directamente al factor FoxO3 anti-hipertrofico y pro-autofagico. Por lo tanto, la sobre-expresion de miR-212/132 en cardiomiocitos da lugar a la regulacion negativa de la expresion de FoxO3 y en consecuencia a una hiperactivacion de la senalizacion de calcineurina pro-hipertrofica y la actividad transcripcional de NFAT, asf como a una disminucion de la autofagia. El bloqueo farmacologico por inyeccion de un antagomir contra miR-132 rescataba la insuficiencia cardfaca inducida por sobre-presion en ratones, ofreciendo una estrategia terapeutica para la hipertrofia cardfaca patologica.

Por lo tanto, una materia objeto de la presente divulgacion es un inhibidor de miR-132 para su uso en medicina, por ejemplo, en medicina veterinaria o en medicina humana.

Una materia objeto adicional de la presente divulgacion es un metodo para la prevencion o el tratamiento de hipertrofia cardfaca, trastornos asociados a hipertrofia cardfaca o autofagicos, y/o disfuncion cardfaca, que comprende la administracion a un sujeto que necesita el mismo de una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un inhibidor de miR-132. En una realizacion preferida, la invencion se refiere a un inhibidor de miR-132 humano (miR-132 de Homo sapiens UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG (SEQ ID NO: 1)). Tambien se describe un miR-213 de Homo sapiens UAACAGUCUCCAGU-CACGGCC) (SEQ ID NO: 2). Otra realizacion preferida se refiere a un inhibidor del miR-132 de raton (miR-132 de Mus musculus UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG (SEQ ID NO: 3). Tambien se describe es el miR-212 de Mus musculus UAACAGUCUCCAGUCACGGCCA (SEQ ID NO: 4). Las secuencias de miR-132 humano y de raton son identicas. El inhibidor es preferentemente una molecula de acido nucleico, incluyendo molecula de ARN, moleculas de ADN y moleculas de acido nucleico modificado que comprenden al menos un acido nucleico con un componente basico modificado. Preferentemente, el inhibidor es una molecula de ARN que tiene al menos un componente basico modificado. El acido nucleico inhibidor de la presente invencion preferentemente tiene una complementariedad suficiente con el miR-132, particularmente con el miR-132 humano para formar un hibrido en condiciones fisiologicas, reduciendo y/o aboliendo de esta manera el efecto pro- hipertrofico y/o anti-autofagico de miR-132.

El inhibidor puede ser una molecula de cadena sencilla o doble cadena o una molecula de acido nucleico que comprende partes de cadena sencilla y doble cadena. La molecula de acido nucleico se puede conjugar con moleculas heterologas, por ejemplo, moleculas no acidos nucleicos tales como acidos grasos, lfpidos, sacaridos, peptidos, protemas, anticuerpos, nanopartfculas, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), analogos de nucleotidos (LNA).

En una realizacion preferida, el inhibidor de acido nucleico puede comprender al menos un componente basico modificado. Los componentes basicos modificados se pueden seleccionar de componentes basicos modificados en la estructura, en un azucar y una base nucleica y combinaciones de los mismos, es decir, los componentes basicos tienen varias modificaciones, por ejemplo, una modificacion de un azucar o la estructura.

Los componentes basicos modificados en una base nucleica comprenden una base nucleica no convencional o una base nucleica convencional (por ejemplo, adenina, guanina, citosina, timina o uracilo) tal como un uracilo o citosinas modificados en la posicion 5, por ejemplo, 5-metilcitosina, 5-(2-amino) propiluracilo, 5-bromouracilo, adeninas o guaninas modificadas en el posicion 8, por ejemplo, 8-bromoguanina, bases nucleicas deazapurmicas, por ejemplo, 7-deaza-adenina y bases nucleicas O- o N-alquiladas, por ejemplo, N6 alquil-adenina.

Ademas, la invencion engloba componentes basicos modificados en un azucar, particularmente los componentes basicos de ribonucleotidos modificados en un azucar, en los que el grupo 2'OH se sustituye por un grupo que se selecciona de entre H, OR, R, halo, SH, SR, NH, NHR, NR2 o CN, en el que R es un C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo o C2-C6 alquinilo y halo es F, Cl, Br o I. Los nucleotidos adicionales modificados en un azucar se seleccionan de entre LNA o nucleotidos morfolino.

En los componentes basicos modificados en la estructura preferidos, el grupo fosfoester que conecta los componentes basicos adyacentes se sustituyen por un grupo modificado, por ejemplo, remplazando uno o mas atomos de O del grupo fosfoester por S, Se, NR o CR2, en el que R es como se ha definido anteriormente. Se debena senalar que las modificaciones anteriores se pueden combinar.

En una realizacion, el inhibidor puede ser una molecula de ARN de doble cadena capaz de hacer de ARN de interferencia que se dirige contra una transcripcion que comprende el miR-132 o precursores del mismo, por ejemplo una molecula de ARNip que es una molecula de ARN de doble cadena, en el que cada cadena tiene una longitud de

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15-30, preferentemente de 19-25 nucleotidos, que opcionalmente tienen al menos una protuberancia 3' que tiene una longitud de 1-5 o 1-3 nucleotidos. Las moleculas de ARNip tipicas se describen, por ejemplo, en el documento WO 02/044321.

En otra realizacion preferida, el inhibidor de acido nucleico es un antagomir, que es una molecula de ARN de cadena sencilla que tiene una longitud de 10 a 30 nucleotidos, preferentemente de 12 a 25 nucleotidos e incluso mas preferentemente de 15 a 22 nucleotidos. El antagomir puede ser perfectamente complementary a su miARN espedfico diana con una deficiencia en el lado de escision de Ago2 y/o la presencia de al menos un componente basico modificado para inhibir la escision en Ago2. Los antagomires se desvelan, por ejemplo, en Krutzfeldt et al., 2005, Czech, 2006 o Fiedler et al., 2011, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referencia.

Los antagomires preferidos estan conjugados con colesterol, conjugados con LNA o conjugados con FMOE. En una realizacion particular preferida los antagomires se dirigen contra el miR-132 como se ha descrito anteriormente.

Preferentemente, una molecula inhibidora de acido nucleico tiene una complementariedad de secuencia suficiente con el miR-132 y/o un precursor del mismo con el fin de mediar la inhibicion espedfica de la diana, por ejemplo, formando un hibrido de doble cadena con la diana. Preferentemente, la secuencia tiene una complementariedad de al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o hasta el 100 % en la parte que corresponde a la diana.

Los inhibidores de acido nucleico de la invencion se pueden preparar por metodos convencionales, por ejemplo, por metodos de smtesis qmmica habitualmente que implican la smtesis en fase solida de acuerdo con protocolos convencionales. Los inhibidores se pueden tambien preparar por transcripcion enzimatica de matrices de ADN sinteticas o de ADN plasirndicos, por ejemplo, aislados de bacterias recombinantes.

Normalmente, se utilizan polimerasas de fagos ARN, tales como T7, T3 o ARN polimerasa SP6.

El inhibidor de la presente invencion es util en la prevencion o tratamiento de trastornos cardfacos, particularmente de trastornos asociados a hipertrofia cardfaca o autofagicos.

Mas particularmente, el inhibidor es utiles en la prevencion o tratamiento de la disfuncion contractil, descompensacion cardfaca, insuficiencia cardfaca o para evitar el re-modelamiento cardfaco despues de infarto de miocardio, miocarditis, enfermedades valvulares cardfacas tales como estenosis aortica o insuficiencia de la valvula mitral, trastornos cardfacos geneticos con hipertrofia cardfaca, por ejemplo, cardiomiopatfa hipertrofica no obstructiva y obstructiva, enfermedad de Fabry.

Con respecto a los trastornos autofagicos, este termino engloba trastornos en los que los pacientes presentan autofagia disfuncional, en particular autofagia reducida o ausente. Las enfermedades y afecciones que se pueden tratar administrando el inhibidor de acuerdo con la invencion incluye enfermedades neurodegenerativas tal como la Enfermedad de Huntington, Enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Alzheimer, y ataxia medulocerebelar; enfermedades hepaticas; enfermedades musculares tales como la enfermedad de Danon, enfermedad de Pompe, Miositis de cuerpos de inclusion esporadica, distrofia muscular de la cintura apendicular, en particular de tipo 2B, y miopatfa de Miyoshi; cancer, incluyendo cancer de mama, colon, ovarico y prostata, linfoma folicular, canceres epiteliales como consecuencia del smdrome de Peutz-Jeghers; trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, enfermedad de Crohn; enfermedades infecciosas. El trastorno autofagico cardfaco se selecciona de entre los trastornos cardfacos incluyendo la degeneracion muscular cardfaca y esqueletica. Los trastornos adicionales incluyen el envejecimiento, enfermedad de Paget, enfermedad de la neurona motora con atrofia muscular medular y bulbar, enfermedad de Batten, y complejo de esclerosis tuberosa.

En aspectos preferidos, la administracion del inhibidor activa farmacologicamente la autofagia en el paciente. El inhibidor se administra a un sujeto en necesidad del mismo, particularmente a un paciente humano que padece las enfermedades indicadas anteriormente.

En algunas realizaciones, el inhibidor es util para la administracion a pacientes que se seleccionan de entre los pacientes que tiene un aumento del riesgo de insuficiencia cardfaca, pacientes que padecen insuficiencia cardfaca (congestiva), pacientes despues de un infarto de miocardio o pacientes con enfermedades cardfacas congenitas asociadas con hipertrofia cardfaca, tales como estenosis de la vena pulmonar, defectos del septo ventricular o auricular. Preferentemente, la invencion engloba el diagnostico y/o control de la cantidad y/o actividad del miR-132 antes, durante y/o despues de la administracion del inhibidor.

El inhibidor se puede administrar como una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo y diluyente farmacologicamente aceptable. La administracion se puede llevar a cabo por metodos conocidos, en los que el inhibidor se introduce en las celulas diana deseada in vitro o in vivo. Los metodos adecuados de administracion incluyen inyeccion, transferencia vrnca, uso de liposomas, por ejemplo, liposomas cationicos, ingestion oral y/o aplicacion dermica.

Para las aplicaciones farmaceuticas, la composicion puede estar en forma de solucion, por ejemplo, una solucion, emulsion, suspension inyectables o similares. La composicion se puede administrar por cualquier via adecuada, por ejemplo, por inyeccion, infusion, ingestion oral y/o aplicacion dermica. El veldculo puedes ser cualquier veldculo farmaceutico adecuado. Preferentemente, se utiliza un vedculo que es capaz de aumentar la eficacia de las

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moleculas de ARN para penetrar en las celulas diana. Ejemplos adecuados de dichos vehnculos son los liposomas.

El inhibidor se administra en una dosificacion farmaceuticamente eficaz, que puede estar en el intervalo de 0,001 |jg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal dependiendo de la via de administracion y el tipo o gravedad de la enfermedad.

El inhibidor de la presente invencion puede comprender un unico tipo de molecula inhibidora o una pluralidad e diferentes moleculas inhibidoras, por ejemplo, una pluralidad de diferentes antagomires. Por ejemplo, un inhibidor del miR-212, por ejemplo, un antagomir, se puede combinar con un inhibidor de miR-132., por ejemplo, un antagomir.

El inhibidor se puede administrar como una monoterapia o en combinacion con un medicamento diferente adicional, particularmente un medicamento adecuado para la prevencion o tratamiento de trastornos cardfacos como se ha descrito anteriormente. Ejemplos de medicamentos adicionales son agentes moduladores de angiotensina, p- bloqueantes, diureticos, antagonistas de aldosterona, vasodilatadores, agentes inotropicos, estatinas o combinaciones de los mismos.

El un aspecto adicional mas, la presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico, particularmente una molecula de acido nucleico de cadena sencilla o cadena doble, que comprende

(a) una secuencia de nucleotidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 o un precursor de la SEQ ID NO: 1, y/o

(b) una secuencia de nucleotidos que tiene una identidad de al menos un 80 %, al menos un 90 %, o particularmente al menos un 95 % con respecto a una secuencia de (a).

para su uso en el tratamiento o prevencion de trastornos cardfacos que implican trastornos autofagicos cardfacos y/o atrofia cardfaca.

En una realizacion preferida, la molecula de acido nucleico aislada tiene una secuencia de identidad de al menos un 90 %, particularmente al menos un 95 %, respecto a una secuencia de nucleotidos que se muestran en la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3 o respecto a un precursor de la SEQ ID NO: 1 y/o SeQ ID NO: 3, o respecto a una secuencia de nucleotidos que es la complementaria de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y/o 3 o un precursor de las mismas. En particular, un precursor de la SEQ ID NO: 1 o 3 puede tener la secuencia que se muestra en una de las SEQ ID NO: 6 y/o 7.

El porcentaje de identidad de secuencia se puede determinar de acuerdo con la siguiente formula de la siguiente manera:

I = n:L

donde I es el porcentaje de identidad, n es el numero de nucleotidos identicos entre una secuencia determinada y una secuencia de comparacion como se muestra en las SEQ ID NO: 1-4 o sus precursores, o una complementaria de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1,2, 3, y/o 4 o un precursor de las mismas, y L es la longitud de la secuencia de comparacion. De manera importante, cuando se calcula el porcentaje de identidad de secuencia de acuerdo con esta formula, se llevara a cabo un alineamiento de las dos secuencias sin huecos entre las porciones

complementarias. El acido nucleico de la presente invencion preferentemente tiene una identidad de secuencia

suficiente y/o complementariedad de secuencia con el miR-212 y/o miR-132, particularmente con el miR-212 humano y/o miR-132 humano para ser capaz de compensar o inhibir la funcion de miR-212 y/o miR-132 en condiciones fisiologicas, proporcionando de esta manera, la recuperacion, mejora y/o inhibicion del efecto pro- hipertrofico y/o anti-autofagico de miR-212 y/o miR-132.

Las condiciones rigurosas de hibridacion comprenden el lavado durante 1 h en 1 x SSC a 45 0C, preferentemente a

48 oc y mas preferentemente a 50 oc, particularmente durante 1 h en 0,2 x SSC y 0,1 % de SDS.

La molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la invencion puede ser una molecula de acido nucleico de cadena sencilla o cadena doble o una molecula de acido nucleico que comprende partes de cadena sencilla y cadena doble. La molecula de acido nucleico se puede conjugar con moleculas heterologas, por ejemplo, moleculas no acido nucleico tales como acidos grasos, lfpidos, sacaridos, peptidos, protemas, anticuerpos, nanopartfculas, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), analogos de nucleotidos fijados (LNA).

En una realizacion preferida, la molecula de acido nucleico es una molecula de microARN (miARN, miR) o un precursor o un analogo de los mismos. Las moleculas de miARN como tales son moleculas habitualmente de cadena simple, mientras que el precursor de miARN habitualmente una molecula al menos parcialmente auto- complementaria capaz de formar distintas partes de cadena simple y de doble cadena, por ejemplo, estructuras en tallo y en bucle. Las moleculas de ADN que codifican los miARN y las moleculas precursoras de miARN tambien estan presentes habitualmente como moleculas de doble cadena, por ejemplo, en forma de un producto PCR o en un plasmido.

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La molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la invencion tiene preferentemente una longitud de desde 15 a 150 nucleotidos (nt). Las transcripciones primarias, de las que se generan los precursores de miARN, pueden tener tambien una longitud de > 150 nt y hasta 5000 nt. En particular, las moleculas de miARN maduras tienen una longitud de desde 18-25 nucleotidos, preferentemente 19-24 nt, mas preferentemente 21, 22 o 23 nt, y las moleculas precursoras de miARN tienen una longitud de 50-120 nucleotidos, preferentemente 60-110 nt.

Mas preferentemente, una molecula de miARN para su uso de acuerdo con la invencion tiene una longitud de 21 o 22 nucleotidos.

En una realizacion preferida adicional, la molecula de acido nucleico aislada para su uso de acuerdo con la invencion es una molecula de ADN, que comprende al menos un componente basico modificado. Los componentes basicos de nucleotido modificado se pueden seleccionar de componentes basicos modificados en una base nucleica, un azucar, y la estructura y combinaciones de los mismos, es decir, componentes basicos que tienen varias modificaciones, por ejemplo, una modificacion en un azucar y la estructura.

los componentes basicos modificados en una base nucleica comprende una base nucleica no convencional o una base nucleica convencional (por ejemplo, adenina, guanina, citosina, timina o uracilo) tal como un uracilo o citosinas modificadas en la posicion 5, por ejemplo 5-metilcitosina, 5-(2-amino) propiluracilo, 5-bromouracilo, adeninas o guaninas modificadas en la posicion 8, por ejemplo, 8-bromoguanina, bases nucleicas deazapurmicas, por ejemplo, 7-deaza-adenina y bases nucleicas O- o N-alquiladas, por ejemplo, N6 alquil-adenina.

Ademas, la invencion engloba componentes basicos modificados en un azucar, particularmente componentes basicos ribonucleotfdicos modificados en un azucar, en el que el grupo 2'OH esta sustituido por un grupo seleccionado de entre H, OR, R, halo, SH, SR, NH, NHR, NR2 o CON, en el que R es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo o C2-C6 alquinilo y el halo es F, Cl, Br o I. Los nucleotidos adicionales preferidos modificados en un azucar se seleccionan de entre LNA o nucleotidos morfolino.

En los componentes basicos modificados en la estructura, el grupo fosfoester que conecta los componentes basicos adyacentes se sustituye por un grupo modificado, por ejemplo remplazando uno o mas atomos de O del grupo fosfoester por S, Se, NR, o CR2, en el que R es como se ha definido anteriormente. Se debena senalar que las modificaciones anteriores se pueden combinar.

Las moleculas de acido nucleico para su uso de acuerdo con la invencion se pueden sintetizar qmmicamente. Los metodos para la smtesis qrnmica de acidos nucleicos son conocidos por el experto en la tecnica de la bioqmmica de acidos nucleicos.

DE manera alternativa, las moleculas de acido nucleico se pueden obtener, por ejemplo, por metodos recombinantes, tales como la transcripcion enzimatica de estructuras sinteticas de ADN (por ejemplo, productos PCR) o de plasmidos aislados de organismos recombinantes, por ejemplo, bacterias o cepas de levaduras. Para la transcripcion, se utilizan normalmente ARN polimerasas, por ejemplo, T7, T3 o SP6 ARN polimerasas.

Las moleculas de acido nucleico tambien pueden obtenerse mediante un vector de expresion recombinante que comprende un acido nucleico recombinante unido operativamente a una secuencia de control de la expresion, en la que la expresion, es decir, la transcripcion y opcionalmente procesar adicionalmente los resultados en una molecula de miARN molecula precursora de miARN como se ha descrito anteriormente. El vector es preferentemente un vector ADN, por ejemplo, un vector vmco o un plasmido, particularmente un vector de expresion adecuado para la expresion de acido nucleico en una eucariota, mas particularmente en celulas de marnffero. El acido nucleico recombinante contenido en dicho vector puede ser una secuencia de resulta de la transcripcion de la molecula de miARN como tal, un precursor o una transcripcion primaria de la misma, que puede ser procesado adicionalmente para dar lugar a la molecula de miARN.

Las moleculas de acido nucleico aisladas son utiles en el diagnostico, tratamiento o prevencion de trastornos, en particular trastornos cardfacos, que implican autofagia disfuncional, atrofia cardfaca, y/o hipertrofia cardfaca.

Mas particularmente, las moleculas de acido nucleico aisladas son utiles en el diagnostico, tratamiento o prevencion de trastornos que implican atrofia cardfaca y/o autofagia exagerada. Ejemplos de dichos trastornos son cancer, caquexia asociada con cancer, anorexia, y/o bulimia.

En una realizacion preferida, la molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la invencion es para su uso en el diagnostico, tratamiento o prevencion de caquexia cardfaca.

Las moleculas de acido nucleico se administran a un sujeto que tiene necesidad del mismo, particularmente a un paciente humano que padece una o mas de las enfermedades indicadas anteriormente.

En algunas realizaciones, las moleculas de acido nucleico son para la administracion a los pacientes seleccionados de entre: (i) pacientes que tienen un aumento del riesgo o que padecen trastornos autofagicos, (ii) pacientes que

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tienen un aumento del riesgo o que padecen caquexia cardfaca, (iii) pacientes que tienen un aumento del riesgo o que padecen atrofia cardfaca.

Preferentemente, la invencion engloba el diagnostico y/o la monitorizacion de la cantidad y/o actividad del miR-132 antes, durante y/o tras la administracion de las moleculas de acido nucleico.

El inhibidor se puede administrar solo o como una composicion farmaceutica que comprende un vetnculo y/o diluyente farmacologicamente aceptable y opcionalmente excipientes adicionales. La administracion se puede llevar a cabo por metodos conocidos, en los que la molecula de acido nucleico, por ejemplo, un miARN, se introduce en la celula diana deseada in vitro o in vivo. Los metodos de administracion adecuados incluyen la inyeccion, transferencia vmca, uso de liposomas, por ejemplo, liposomas cationicos, ingestion oral y/o aplicacion dermica.

Para las aplicaciones farmaceuticas, la composicion puede estar en forma de una solucion, por ejemplo una solucion, emulsion, suspension inyectables o similares. La composicion se puede administrar de cualquier manera adecuad, por ejemplo, por inyeccion, infusion, ingestion oral y/o aplicacion dermica. El vetnculo puede ser cualquier vetnculo farmaceutico adecuado. Preferentemente, un vetnculo que se utiliza en capaz de aumentar la eficacia de las moleculas de ARN para penetrar en las celulas diana. Los ejemplos adecuados de dichos vetnculos son los liposomas.

El inhibidor se administra en una dosificacion farmaceuticamente eficaz, que puede estar en el intervalo de 0,001 mg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal dependiendo de la via de administracion y el tipo o gravedad de la enfermedad.

En realizaciones adicionales preferidas, la molecula de acido nucleico se administra en combinacion con un medicamento adicional; en particular, el medicamente adicional puede ser utiles en el tratamiento de la misma enfermedad. Ejemplos de medicamentos adicionales son agentes moduladores de angiotensina, p-bloqueantes, diureticos, antagonistas de aldosterona, vasodilatadores, agentes inotropicos, estatinas o combinaciones de los mismos.

Mas adicionalmente, la invencion se refiere a un metodo para la prevencion o tratamiento de un trastorno cardfaco que comprende la administracion a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos una molecula de acido nucleico aislada como se describe en el presente documento.

Ademas, la presente invencion describira con mas detalle mediante las siguientes Figuras y Ejemplos.

Leyenda de las Figuras

Figura 1. Los microARN miR-212 y miR-132 se introducen durante las afecciones hipertroficas y promueven la hipertrofia de cardiomiocitos

(a) La sobre-expresion de precursores de miARN de una biblioteca identificaba miARN que aumentaban el crecimiento de cardiomiocitos y la secrecion de peptidos natriuretico cerebral (BNP). La familia de miARN miR-212/132 esta resaltada en drculos grises.

(b, c) Los efectos de los precursores e inhibidores (anti) de miR-212 y miR-132 sobre el tamano del tamano celular en comparacion con los efectos de los controles desordenados (Scr). (n = 5-13).

Las imagenes representativas utilizadas para la cuantificacion del tamano celular de los cardiomiocitos se muestran en c.

(d) Los efectos de distintos estfmulos pro-hipertroficos sobre la expresion de miR-212 y miR-132 en cardiomiocitos neonatales (n = 6-10).

(e) Los niveles de expresion miR-212 y miR-132 durante la hipertrofia ventricular izquierda inducida por presion 3 y 21 dfas despues de la cirugfa de constriccion transaortica (TAC) en ratones. (n = 4).

(f) los diametros de cardiomiocitos despues de la operacion en falso o 3, 14 y 35 dfas despues de la constriccion transaortica (TAC) (n = 4 por grupo).

(g, h) La expresion de miR-212 y miR-132 (normalizadas a niveles de sno-202) en cardiomiocitos fraccionados y fibroblastos cardfacos derivados de ratones adultos despues de 3 y 35 dfas de la constriccion transaortica (TAC).

Todos los valores representan la media ± SEM.

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,005 FC: vece de cambio, ACTN2: alfa actinina cardfaca, n.s.: diferencia no significativa, a.u: unidad arbitraria. La barra de escala en c representa 50 pm.

Figura 2. Los microARN miR- 212 y miR-132 inducen hipertrofia en Imeas celulares de cardiomiocitos

Efectos de la sobre-expresion de precursores de miR-212 y/o miR-132 (pre-) (a, d) y silenciamiento por inhibidores (anti) (b, e) sobre el tamano de celulas H9c2 (a, b) y HL-1 (d, e) en comparacion con los efectos de controles desordenados (scr), (c) tamano celular de celulas H9c2 de tipo silvestre (TS) y transgenicas (TG) que sobre-expresan miR212/132. Los valores representan la media ± SeM. (n = 5-14) **p<0.01; ***p<0.005; a.u. = unidad arbitraria.

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Figura 3. La familia de miARN miR212/132 reduce la apoptosis en celulas H9c2.

(a) Niveles de expresion de miR-132 y miR-212 en lmeas celulares de H9c2 que sobre-expresan miR- 212/132 (miR-212/132 TG) y de control. (n = 3).

(b) Aumento del numero de celulas dependiente del tiempo en lmeas celulares de H9c2 que sobre-expresan miR-212/132 (TG-I, TG-II) y de control (I, II). (n = 6).

(c, d) Numero de celulas apoptoticas evaluadas por analisis Annexin-V FACS (c) y tasa de proliferacion medida por el ensayo WST (d) en presencia de fCs alto (10 %) y bajo (1 %) en lmeas celulares H9c2 que sobre expresan miR-212/132 y de control. (n = 6). Todos los valores representan la media + SEM en a, c y d; y la media + SD en b. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,0o5; n.s., diferencia no significativa.

Figura 4. La sobre-expresion de la familia miR-212/132 espeafica en cardiomiocitos da lugar a hipertrofia cardiaca patologica e insuficiencia cardiaca en ratones

(a) Sobre-expresion de la construccion de miR-212/132 bajo el control del promotor MHC alfa.

(b) Niveles de expresion de miR-212 y miR-132 en las muestras cardfacas de ratones de tipo silvestre (TS) y transgenicos a miR-212/132 (TG) segun se ensaya por analisis RT-PCR convencional.

Se utilizo el Rnu6b como control constitutivo.

(c) Se analizo la tasa de supervivencia de dos familias de raton miR-212/132 transgenicos (TG-Fam23, TG- Fam43) frente a los controles por el ensayo de supervivencia de Kaplan-Meier. (n = 87, 65, y 53 para TA, TG- Fam23, y TG-Fam43, respectivamente).

(d) Morfologfa de corazones explantados de ratones TG y TS a las 10 semanas tras el nacimiento.

(e - f) Las relaciones entre peso cardfaco respecto al cuerpo (e) y diametro de cardiomiocitos (f) en ratones transgenicos alfa-MHC-miR-212/132 de 8 semanas de edad en comparacion con la misma camada de tipo silvestre. (n = 5-7).

La barra de escala representa 50 pm.

(g - i) Analisis ecocardiografico de las dimensiones cardfacas y funcion de ratones transgenicos alfa-MHC- miR-212/132 y controles de tipo silvestre (n = 16-18).

(g) area sistolica final, (h) area diastolica final, (i) acortamiento fraccional. Todos los valores e-i representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,005; WgA: aglutinina de germen de trigo (tincion de membrana).

Figura 5. La sobre-expresion de la familia miR-212/132 da lugar a hipertrofia cardiaca.

(a) relaciones de peso cardfaco respecto a corporal en lmeas de raton de tipo silvestre (TS) y transgenicas (TG-Fam23 y TG-Fam43) que sobre-expresan miR-212/132 espedficos de cardiomiocitos entre los dfas 10 y 70 post-natal (p) asf como durante la muerte/crisis. Los valores representan la media ± SEM. *p<0,05 frente a niveles p30; ***p<0,005 frente a niveles p30; (n = 3-13).

(b-f) Niveles de expresion de ARNm cardfaco de Anp (b), Bnp (c) cadena pesada de alfa-miosina (Myh6; d), cadena pesada de beta-miosina (Myh7; e) y niveles de protema cardiaca de p-Akt (respecto a Akt; f) en ratones transgenicos (TG) que sobre-expresan miR-212/132 y las mismas camadas de tipo silvestre TS. Los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,005; (n = 5-10).

(g) relaciones pAkt/Akt en lmeas celulares H9c2 de tipo silvestre (TS) y que sobre-expresan miR-212/132 (n = 9). (h) Fenotipo de tipo silvestre (TS) no inyectado, y miR desordenados (scr), embriones de pez cebra inyectados con pre-miR-132 o pre-miR-212 48 h despues de la fertilizacion.

Los embriones inyectados con pre-miR-132 y pre-miR-212 presentan un derrame pericardico grave, en comparacion con los inyectados desordenados o los embriones de control de tipo silvestre (flechas negras). M: marcador de transferencia de western; FC: veces de cambio.

Figura 6. Los ratones nulos en miR-212/132 estan protegidos de la hipertrofia cardiaca mediada por sobrecarga de presion, fibrosis e insuficiencia cardiaca

(a) Relaciones de peso cardfaco respecto a corporal en ratones de 12 semanas de edad nulos a miR-212/132 (KO) y tipos silvestre (TS). (n = 5-6).

(b) Tamano celular de cardiomiocitos de ratones recien nacidos nulos a miR-212/132 y tipo silvestre. (n = 5-6 aislamientos).

(c-f) relaciones de peso cardfaco respecto a corporal (c), diametro de cardiomiocitos (d), fibrosis cardiaca (e), y peso humedo de pulmon (f) en ratones de tipo silvestre operados en falso y ratones nulos a miR-212/132 y tipo silvestre 3 semanas despues de la cirugfa de constriccion transaortica (TAC). (n = 4-7). La barra de escala representa 50 pm.

(g-i) Analisis ecocardiografico de las dimensiones y funcion cardfacas en ratones tipo silvestre operados en falso y ratones nulos a miR-212/132 y tipo silvestre 3 semanas despues de la TAC (n = 4-11). (g) area diastolica final, (h) area sistolica final, (i) acortamiento fraccional). Todos los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,005. #p<0,05 en comparacion con TAC TS; ### p<0,005 en comparacion con TAC TS; PSR: rojo picrosirio (tincion de colageno).

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Figura 7. La represion de miR-212 y miR-132 no afecta la proliferacion, apoptosis o comportamientos migratorios de los fibroblastos cardiacos humanos.

Proliferacion (a), apoptosis (b) y migracion (c) de fibroblastos cardfacos humanos 72 h despues de la transfeccion con control desordenado (Scr) y anti-miR-212 y anti-miR-132. (n = 6). Todos los valores representan la media ± SEM.

Figura 8. Ausencia de fenotipo vascular evidente en ratones nulos en miR-212/132.

Se estudio el sistema vascular en ratinas de ratones miR-212/132"/" adultos en comparacion con la misma camada de tipo silvestre (TS). Area retiniana 8a), numero y diametro total de arterias retinianas centrales que se originan del nervio optico (b, media una distancia de 200 pm del nervio optico), y numero de ramas de 1er orden que se originan de las arterias centrales (c, numero por retina) eran similares en ratones miR-212/132-/- y en las mismas camadas de tipo silvestre. (n = 5-8 retinas de al menos 3 ratones).

(d) Tincion de secciones cardfacas de ratones de tipo silvestre (TS) y miR-212/132"/" (KO) por Pecaml, aglutinina de germen de trigo y DAPI. El grafico representa el numero de capilares por cardiomiocitos. (n = 5). Todos los valores representan la media ± SEM. Las barras de escala representan 2 pm en a, 500 pm en by c. n.s: no significativo.

Figura 9. La familia miR-212/132 regula directamente la expresion de FoxO3 y en consecuencia activa la senalizacion pro-hipertrofica calcineurina/NFAT.

(a) Niveles de actividad de luciferasa en la co-transfeccion de una construccion de luciferasa que contiene el tipo silvestre o la 3'UTR mutada de FoxO3 con el control desordenado (scr), pre-miR-132, o pre-miR-212. (n =9).

(b, c) Niveles de expresion de FoxO3 en ARNm (b) y niveles proteicos (c) en corazones de ratones de tio silvestre (TS) y transgenicos (TG) alfa-MHC- miR-2l2/132. (n = 9-13).

(d) Niveles de ARNm de FoxO3 en cardiomiocitos de rata recien nacida transfectados con el control desordenado (scr), anti-miR-212 y anti-miR-132 despues del tratamiento con fenilefrina (PE, 10 pM) (n = 6-9; valores de p contra scr + PE).

(e-g) Niveles de expresion de atrogin-1 (e) y Mcip1.4 (f) y niveles de actividad de calcineurina fosfatasa (g) en corazones de ratones de tipo silvestre y transgenicos alfa-MHC- miR-212/132. (n = 5-9).

(h) Actividad de luciferasa que muestra la actividad transcripcional NFAT de cardiomiocitos transfectados con el control desordenado (scr), pre-miR-132, o pre-miR-212. (n = 5).

(i, k) Niveles de ARNm Mcip1.4 (i) y atrogin-1 (k) en ratones de tipo silvestre (TS) y nulos en miR-212/132 (KO) 3 semanas despues de la constriccion transaortica (TAC) o la operacion en falso (n = 5-7 por grupo). Todos los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,005. # p<0,05 en comparacion con TAC TS.

Figura 10. La sobre expresion de miR-212/132 da lugar a regulacion negativa de FoxO3 y regulacion positiva de Mcip1.4 en cardiomiocitos

(a) Expresion de ARNm de FoxO3 en celulas H9c2 tipo silvestre (TS) y transgenicos (TG) que sobre- expresan miR-212/132.

(b) Niveles proteicos de FoxO3 en cardiomiocitos neonatales tres dfas despues de la transfeccion con controles desordenados (scr), miR-132, miR-212, o moleculas precursoras de miR-132 y miR-212.

(c) Niveles de Mcip1.4 en celulas H9c2 tipo silvestre (TS) y transgenicas (TG) que sobre-expresan miR- 212/132. FC: veces de cambio. Los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; #p<0,052 (n = 47).

Figura 11. miR-212/132 es un factor anti-autofagico en cardiomiocitos

(a) Niveles de expresion de ARNm de genes marcadores autofagicos en corazones de ratones de tipo silvestre (TS) y transgenicos (TG) alfa-MHC- miR-212/132. (n = 9-10).

(b, c) Relacion de LC3II a LC3I (b) y niveles de protema p62 (c) en ratones de tipo silvestre, nulos a miR- 212/132 (KO) y transgenicos (TG) alfa-MHC- miR-212/132. (n = 4-12).

(d, e) Imagenes representativas (d) y cuantificacion (e) de puntos LCR:mCherrry en celulas H9c2 de control y transgenicas que sobre-expresan miR-212/132 en condiciones normales y de privacion de glucosa/suero. (n = 20).

(h, i) Graficos FACS representativos (h) y cuantificacion (i) del aumento del porcentaje de flujo autofagico en celulas H9c2 de control y transgenicas que sobre-expresan miR-212/132 en condiciones normales y de privacion de glucosa/suero. (n = 3-4 experimentos). Todos los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; ** p<0,005. Las barras de escala representan 50 pm en d y 500 nm en f.

Figura 12. La sobre-expresion de miR-212/132 abroga la autofagia inducida por privacion en cardiomiocitos primarios

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Se cuantifico el numero medio de puntos LC3-GFP por cardiomiocitos en medio normal (DMEM + un 10 % FCS) o medio de privacion (libre de glucosa y FCS) despues de la co-transfeccion con la construccion de LC3-GFP junto con el control desordenado (Scr), pre-miR-212 o pre-miR-132. n = 40-170 cardiomiocitos. Todos los valores representan la media ± SEM. **p<0,01; ***p<0,005. Las imagenes representativas se muestran encima del grafico. Las barras de escala representan 10 pm.

Figura 13. Niveles de expresion de la proteina de fusion LC3-GFP.

Expresion de proteina de fusion LC3-GFP en celulas H9c2 de tipo silvestre (TS) y transgenicas (TG) miR- 212/132 transfectadas con una construccion de expresion LC3-GFP 24 h despues de las condiciones de cultivo normal y de privacion (medio libre de glucosa y suero). Los valores representan la media ± SEM. (n = 4).

Figura 14. La privacion da lugar a la regulacion negativa de la expresion de miR-212/132 en celulas H9c2 Expresion de miR-212 y miR-132 en celulas H9c2 24 h despues de condiciones normales y privacion de suero/glucosa. Los valores representan la media ± SEM. ***p<0,005 (n = 9).

Figura 15. MiR-212/132 inhibe la autofagia inducida por privacion in vivo.

(a) Representacion esquematica de un experimento de privacion en ratones. Las partes blancas y grises de la lmea de tiempo representan las fases de dfa y noche. Las flechas muestran el comienzo y duracion de la privacion y los puntos de tiempo indicados de privacion cuando los animales se valoraron en cuanto al mdice de condicion corporal.

(b) Relaciones de LC3II respecto a LC3I en ratones tipos silvestre alimentados con dieta normal y ratones tipo silvestre, nulos a miR-212/132-/- y transgenicos alfa-MHC miR-212/132 bajo privacion durante 21 horas (n = 4).

(c) Micrograffas electronicas de secciones ultra-finas de biopsias cardfacas embebidas en resina de ratones tipo silvestre (TS) nulos a miR-212/132 (KO) y que sobre-expresan miR-212/132 espedficos de cardiomiocitos (TG). Los puntos blancos alrededor de las mitocondrias (estructuras gris oscuro) son vacuolas autofagicas. Los puntos electrodensos que se muestran con flechas blancas son autofagosomas. Las barras de escala representan 4 pm.

(d) relaciones p-mTOR/mTOR en celulas H9c2 de tipo silvestre y transgenicas miR-212/132 despues de las condiciones normal y de privacion (privados de suero y glucosa) (n = 6).

(e) relaciones p-mTOR/mTOR en ratones de tipo silvestre (TS) y transgenicos (TG) alfa MHC miR-212/132 alimentados con dienta normalo 31 h despues de la privacion (n = 4).

Todos los valores representan la medio ± SEM. **p<0,01; ***p<0,005. #p<0,11.

Figura 16. Autofagia inducida por privacion en corazones de ratones de tipo silvestre, nulos a miR- 212/132 y que sobre-expresan miR-212/132

Fotos de alta magnificacion de micrograffas electronicas correspondientes a la Figura 15c para la confirmacion de vacuolas autofagicas y autofagosomas en los cardiomiocitos. Las estructuras gris oscuro son mitocondrias (Mt). Las estructuras translucidas (que se muestran con flechas) contienen estructuras de membrana enrolladas o membranas de doble capa indicativas de vacuolas autofagicas. Las estructuras negras electrodensas (que se muestran con puntas de flecha) en los cardiomiocitos de ratones TG son autofagosomas/autolisosomas. Las barras de escala representan 1 pm.

Figura 17. La privacion da lugar a un aumento de los niveles cardiacos de p62 in vitro e in vivo.

(a) Expresion de la proteina p62 en celulas H9c2 de tipo silvestre (TS) y transgenicas (TG) miR-212/132 despues de condiciones de cultivo celular normales y de privacion (medio libre de glucosa y suero) (n = 9).

(b) Expresion cardfaca de proteina p62 en ratones de tipo silvestre (TS), nulos a miR-212/132 (KO) y transgenicos (TG) que sobre-expresan miR-212/132 despues de una dieta normal o 31 horas despues de la privacion (n = 4).

Los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,05.

Figura 18. Reduccion de la union de FoxO3 al promotor LC3 en celulas H9c2 que sobre-expresan miR- 212/132

(a) Niveles de promotor LC3 genomico despues de inmunoprecipitacion de cromatina por FoxO3 en celulas H9c2 de tipo silvestre (TS) y que sobre-expresan miR-212/132 (TG).

(b) Niveles de expresion de LC3 de celulas H9c2 de tipo silvestre y transgenicas (TG) miR-212/132 24 h despues de condiciones de cultivo celular normales y de privacion (medio libre de glucosa y suero).

Los valores representan la media ± SEM. **p<0,01; ***p<0,005; (n = 3-6).

Figura 19. Niveles de expresion cardiaca de miR-132 despues del tratamiento con el antagomir de ratones con sobre carga de presion ventricular izquierda.

La expresion cardfaca de miR-132 en los ratones tres semanas despues de la constriccion transaortica y la inyeccion terapeutica de un antagomir desordenado (Scr) o un antagomir dirigido contra miR-132 (Ant-132). Los valores representan la media ± SEM. ***p<0,005; (n = 5-14).

Figura 20. La terapia con anti-miR-132 evita la insuficiencia cardiaca inducida por sobrecarga de presion

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(a-c) Relaciones de peso cardfaco respecto a la corporal (a), diametros de cardiomiocitos (b), y fibrosis cardfaca (c) en ratones operados en falso y ratones tratados con inyeccion intravenosa de control desordenado (Scr) o inhibidores de miR-132 (Ant-132) despues de la TAC. Estos ratones se analizaron tres semanas despues de la TAC. (n = 4-11).

(d-f) Analisis ecocardiografico de las dimensiones ca^acas y funcion en ratones operados en falso y ratones tratados con inyeccion intravenosa del control (Scr) o inhibidores de miR-132 (Ant-132) despues de la TAC. Estos ratones se analizaron tres semanas despues de la TAC ((d) acortamiento fraccional, (e) area diastolica final, (f) area sistolica final). (n = 4-9). (g-i) niveles cardfacos de protema FoxO3 (g) actividad de calcineurina (h) y niveles de ARNm de Mcip1.4 (i) en los ratones tratados con inyeccion intravenosa o el control (Scr) o inhibidores de miR-132 (Ant-132) tres semanas despues de la TAC y el tratamiento (n = 4-8).

Todos los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,005; #p<0,05 contra TAC-control; ##p<0,01 contra TAC-control; ###p<0,005 contra TAC-control. Las barras de escala representan 50 pm.

Figura 21. La expresion de miR-1 esta regulada por la familia miR-212/132.

(a) Niveles de expresion de miR-1 en corazones de ratones (TS) y transgenicos (TG) que sobre-expresan miR-212/132 (n = 5 por grupo).

(b) Niveles de expresion de miR-1 en lmeas celulares de H9c2 de tipo silvestres (TS) y transgenicas (TG) que sobre-expresan miR-212/132 (n = 8 por grupo).

Los valores representan la media ± SEM. *p<0,05; **p<0,01.

Ejemplos

1. Metodos

1.1 Estudios de cultivos celulares

Se prepararon cardiomiocitos primarios a partir de ratones o ratas recien nacidos utilizando protocolos estandar. La lmea celular de cardiomiocitos H9c2 y los cardiomiocitos primarios se mantuvieron en DMEm + 10% de FCS. La lmea de cardiomiocitos HL1 se mantuvo en medio Claycomb + 10 % FCS. Para la transfeccion estable y transitoria de estas celulas, se utilizo el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la exploracion de micro-ARN pro-hipertroficos, se utilizo la biblioteca del precursor de miARN (Pre-miR™ miRNA Precursor Library-Mouse V3; Ambion; de 50 nM cada una). Para la medicion del tamano celular, las celulas se fijaron con un 4 % de PFA y se calculo el area de superficie de los cardiomiocitos utilizando el paquete AxioVison Rel 4.4 (Carl Zeiss GmbH). El porcentaje de celulas que sufna apoptosis en los cardiomiocitos primarios o los cultivos de lmeas celulares se determino por tincion con anexina V y yoduro de propidio seguido por un analisis FACS (kit annexin-V-FLUOS, Roche). Para medir la capacidad proliferativa en celulas moduladas por miARN, se llevo a cabo un ensayo de proliferacion WST-1 (Roche, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Para generar lmeas celulares H9c2 transgenicas que sobre-expresan miR-212/132 transfectadas establemente, se preparo una construccion de expresion clonando el locus genomico completo de miR-212/132 (3,4 kb) corriente abajo del promotor CMV en el vector pTARGET (Promega). La construccion de expresion utilizada contema un gen de neomicina bajo el control de un promotor PGK. La construccion preparada o el vector pTARGET original (como control) se utilizaron en los experimentos de transfeccion de la lmea celular H9c2 utilizando el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Despues de la transfeccion, las celulas se cultivaron en DMEM con un 10% de FCS y 1 mg/ml de G418 (Roche) durante 8 dfas. Se prepararon 2 transfecciones independientes de ambas construcciones de sobre-expresion de miR-212/132 y de control. Despues de la seleccion inicial mediada por G418, las celulas transfectadas establemente se cultivaron durante el mantenimiento y los experimentos con 0,5 mg/ml de G418.

1.2 Estudios con animales

Todos los estudios animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices relevantes y regulaciones y con la aprobacion de las autoridades locales y nacionales. La lmea de raton mutante con perdida-de-funcion miR-212/132 se genero previamente (Ucar et al., 2010). La lmea de raton cruzo entre la C57Bl/6N de origen durante al menos 7 generaciones. Para la generacion de las lmeas de raton transgenicas con la sobre-expresion de miR-212/132 espedficos de cardiomiocitos, se clono una region genomica de 486 pb en el locus genomico miR-212/132, que contema las secuencias que codifican las secuencias del bucle tallo horquillado de miR-212 y miR-132, corriente abajo de la tercera secuencia exonica del gen a-MHC y corriente arriba de la secuencia de senal poliA hGH como se muestra en la Figura 4A. La construccion alineada se microinyecto en el pronucleo de huevos fertilizados. Se obtuvieron dos lmeas fundadoras independientes con sobre-expresion de miR-212/132 espedfica de corazon. A continuacion, ambas lmeas se cruzaron entre la C57BL/6N de origen durante al menos 6 generaciones.

1.3 Modelo de constriccion transaortica (TAC) y aplicacion del antagomir

Se llevo a cabo la constriccion transaortica (TAC) en ratones C57Bl/6 machos (10-12 semanas de edad) de Charles

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River Laboratories o ratones transgenicos alfa-MHC- miR-212/132 o los controles de su misma camada esencial mente como se habfa descrito (Rockman et al., 1991). Los antagomires se sintetizaron como se ha^a descrito (Krutzfeldt et al., 2005) y se dirigieron contra miR-132 (5' CGACCAUGGCUGUAGACUGUUA-chol-3', donde “chol” es colesterol) o una secuencia desordenada (placebo de control). El tratamiento comenzo durante la operacion de TAC y los animales recibieron inyecciones del control o el antagomir-132 por inyeccion retro-orbital (dfa 0 y dfa 1, un volumen de 0,1 ml que contema antagomir-132 o control (cada 80 mg por kg de peso corporal)).

1.4 Experimentos de privacion in vivo

Los inventores llevaron a cabo la privacion in vivo como se habfa descrito anteriormente (Kanamori et al., 2009) con algunas modificaciones. Para los animales que se iban a privar, los inventores los alojaron en jaulas unicas son acceso al alimento, pero con acceso ad libitum al agua 3 horas despues del inicio de la fase de luz. Junto con el departamento de etica animal, los inventores establecieron un protocolo eticamente aceptable para la privacion utilizando los criterios publicados de 'valoracion de la condicion corporal' (Ullman-Cullere & Foltz, 1999), que mostraba un periodo de 31 horas de privacion como el maximo tolerable.

En consecuencia, los inventores controlaron todos los ratones privados durante el experimento y evaluaron su estado de salud basandose en el cambio de los siguientes parametros: peso corporal, estado corporal, estado de hidratacion, alerta y reaccion a la provocacion, y postura corporal, locomocion y estado del pelo. Despues de 31 horas de privacion, los ratones se sacrificaron por dislocacion cervical y se aislaron los corazones y se procesaron como se describe para los experimentos correspondientes.

1.5 Analisis funcional cardiaco

Se analizaron las dimensiones y la funcion cardfacas por electrocardiograffa Doppler de onda pulsatil esencialmente como se habfa descrito (Merkle et al., 2007).

1.6 Modelo de angiogenesis de retina

La preparacion de retina e inmunofluorescencia se llevaron a cabo como se habfa descrito previamente (Napp et al., 2012). . En resumen, se fijaron los ojos completos en paraformaldetHdo al 4% (PFA). Se disecaron las retinas, despues de fijarse con PFS y se bloquearon durante 24 horas con PBS/BSA 1 %/0,5 % Triton X-100. Despues de la incubacion con anticuerpos diluidos en PBS/0,5 %/0,25 % de Triton X-100 se aclararon las retinas con PBS y se montaron en un portaobjetos de cristal con cubreobjetos utilizando medio demo taje de alcohol polivimlico (DAKo). Se utilizaron los siguientes reactivos: Isolectina-B4-FITC (Vector, 1:100), anti-SMA-Cy3 (Sigma-Aldrich, 1:100). Las retinas tenidas se analizaron con un microscopio de fluorescencia (Zeiss Axiovert) utilizando el software Axiovision (Zeiss, Goettingen).

1.7 Ensayos de deposito de colageno, recuento de capilares y diametros de cardiomiocitos

Para el analisis de deposito de colageno, se tineron las secciones de parafina del miocardio ventricular izquierdo con rojo Sirius y acido pfcrico. El contenido en colageno se calculo como el porcentaje del area de cada seccion que estaba tenida con rojo Sirius.

Para el recuento de capilares se tineron las secciones con Pecam1 (CD31), Dapi y aglutinina de germen de trigo (WGA) y se hizo el recuento con el Software NIKON-NIS Element. Para cada animal se hizo el recuento de 4-7 regiones y se obtuvo un valor medio. El area de superficie del cardiomiocito se determino de secciones del miocardio ventricular izquierdo tenido con hematoxilina y eosina o aglutinina de germen de trigo acoplados con Alexa 488. Las imagenes se analizaron utilizando los paquetes de software AxioVision (Zeiss).

1.8 Fraccionamiento de celulas cardiacas

Se perfundieron corazones intactos con solucion enzimatica basada en colagenasa (colagenasa tipo II) a traves de la aorta. A continuacion, se molio y se paso cuidadosamente a traves de una jeringa de 1 ml durante 3 minutos para producir suspensiones celulares. El fraccionamiento celular de cardiomiocitos y los fibroblastos se hicieron como se habfa descrito anteriormente (Thum et al., 2008).

1.9 Reservas y embriones de pez cebra e inyecciones de miARN

El tipo silvestre (cepa AB) se cultivaron y emparejaron a 28,5 0C y los embriones se mantuvieron y manejaron en una solucion E3 convencional (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 de MgSO4, 10-5 % de azul de metileno) tamponado con 2 mM de HEPES (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como se habfa descrito previamente (Hentshel et al., 2007).

Utilizando el dispositivo de inyeccion Nanoject II (Drummond Scientific, Broomall, PA), se inyectaron los miR-132, miR-212 y controles desordenados en embriones fertilizados en estadio de una a cuatro celulas a una concentracion

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final de 5 mM en 4,6 nl de tampon de inyeccion (20 mM de Hepes, 200 mM de KCl y 0,01 % de rojo fenol). Se tomaron fotograffas en un microscopio de diseccion SMZ-U (Nikon) y se proceso utilizando Photoshop 3.0 (Adobe).

1.10 Prediccion de miARN diana

Las bases de datos miARN y las herramientas de prediccion de diana Miranda (
http://www.microma.org/microrna/home.do), PicTar (
http://pictar.mdc-berlin.de/) y TargetScan (
http://www.target- scan.org) se exploraron para identificar las dianas miARN potenciales.

1.11 Analisis RT-PCR cuantitativo

Se aislo el ARN utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) de tejidos o celulas cultivadas. Para la deteccion cuantitativa de microARN, se utilizaron ensayos TaqMan miARN (Applied Biosystems), kit de smtesis de ADNc iScript Select (BIO-RAD) y kits iQSupermix (BIORAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizo Rnu6b como control para la normalizacion. Para la deteccion cuantitativa de niveles de ARNm, se sintetizaron los ADNc utilizando cebadores oligo-dT y kit de smtesis de ADNc iScript Select (BIO-RAD) Se llevaron a cabo analisis de PCR en tiempo real utilizando un conjunto espedfico de cebadores e iQSYBR Green mix (BIO-RAD). Se utilizaron los niveles de Gapdh para la normalizacion de niveles de expresion espedfica del gen. Los niveles de miARN-1 se determinaron por el kit Taqman-RT-PCR para miR-1 (Applied Biosystems). Otras secuencias de oligonucleotidos cebadores se representan en la Tabla 3.

1.12 Analisis de expresion proteica

Se lisaron el tejido o las celulas con 1x de tampon de lisis celular (Cell signaling) y se hizo el aislamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cargaron 20-40 |jg de protema en gel SDS-PAGE para la separacion, lo que se continuo con una transferencia de la protema a una membrana de fluoruro de polivinildeno en un Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell (Bio-Rad). A continuacion, se detectaron diferentes antfgenos utilizando los siguientes anticuerpos primarios: FoxO3 (Cell Signaling n° 2497), pAKT (Cell Signaling n° 9271), Akt (Cell Signaling n° 9272), LC3 (Abcam ab48394), p62 (Abeam ab56416), p-mTOR (Cell Signaling n° 5536), mTOR (Cell Signaling n° 2983), GFP (Abcam ab1218) y Gapdh (Abeam ab8245). Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP y luminol/acido paracumarico/H2O2 para la deteccion de bandas espedficas. Intensidades de bandas obtenidas se cuantificaron utilizando el software ScionImage.

1.13 Ensayos de calcineurina y NFAT

Se llevo a cabo el ensayo de calcineurina utilizando el kit de Ensayo de Actividad Celular de Calcineurina (Enzo Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cuantificacion del producto final se hizo midiendo la absorbancia a 620 nm en un lector de microplacas (Synergy HT). Para la determinacion de la actividad de NFAT se sembraron cardiomiocitos de rata reden nacida en placas de 48 pocillos y se transfectaron despues de 24 h con un control miR desordenado, miR-132 y miR-212 (concentracion final 50 nM; Applied Biosystems, New Jersey, USA) utilizando Lipofectamina™ 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las celulas se cultivaron durante 24 h y se transfectaron con una construccion indicadora de luciferasa NFAT que contema sitios de reconocimiento de NFAT (regalo de J. Molkentin, University of Cincinatti) como se ha descrito anteriormente (concentracion final: 0,75 ng/ml) Se estimularon los grupos respectivos 48 h mas tarde con fenilefrina (50 mM) durante 24 h. Se determino la actividad de luciferasa utilizando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Mannheim, Alemania) y se midio la concentracion proteica utilizando el kit de ensayo proteico Pierce BCA (Thermo Scientific, Bonn, Alemania), ambos de acuerdo con el protocolo del fabricante.

1.14 Ensayos de indicador de luciferasa

La secuencia 3'UTR que alberga la region de base para miR-132/212 se clono en el sitio de clonacion SpeI e HindIII de un vector pMIR-REPORT (Ambion). Tambien se generaron clones con sitios de union de miR-2l2 y miR-132 mutados en la misma secuencia de 3'UTR utilizando un kit de mutagenesis dirigido al sitio (Agilent Technologies). Las construcciones clonadas se co-transfectaron con los miARN de interes (Ambion) y al plasmido p-galactosidasa de control (Promega) en celulas indicadoras HEK293 sembradas en placas de 48 pocillos utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). En cada caso, se utilizaron 10 ng de ADN plasmfdico y 100 nM de miARN. Las celulas se incubaron durante 24 h antes de medirse la actividad de luciferasa y p-galactosidasa utilizando los kits del sistema de ensayo de luciferasa (Promega) y sistema de ensayo de beta-galactosidasa (Promega) en un lector multi-placa (Biotek, Synergy HT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1.15 Analisis estadistico

Se utilizaron el software StatView y GraphPad para llevar a cabo el ensayo t de Student no alterado en caso de dos grupos de tratamientos (conjuntos de datos) o ANOVA de una via siguiendo el analisis post-ensayo de Fisher para mas de dos grupos (conjuntos de datos). Para el ensayo de supervivencia de Kaplan-Meier, se utilizo el ensayo de rango logantmico (Mantel-Cox).

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1.16 Transfeccion y cuantificacion de LC3:mCherry en autofagosomas

La construccion de expresion para la protema de fusion LC3:mCherry la suministro amablemente el Dr. Nathan Brady (Hamach-er-Brady et al., 2006). Las lmeas celulares H9c2 se sembraron en cubreobjetos y despues del 80 % de confluencia se transfectaron con la construccion de expresion LC3:mCherry utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La eficacia de transfeccion se mantuvo entre el 10-20 % con el fin de visualizar las celulas transfectadas a continuacion. Para los grupos de privacion, 12 horas despues de la transfeccion, se sustituyo el medio (DMEM + 10 % de FCS) con solo DMEM. Despues de 24 h de cultivo en DMEM, se sustituyo el medio con DMEM sin glucosa (GIBCO) y se mantuvieron otras 24 h antes de la fijacion. Para los grupos de 'medio completo', los cambios de medio se hicieron exactamente las mismas veces que anteriormente pero siempre con DMEM + 10 % de FCS. Despues del tratamiento, las celulas se fijaron con un 4 % de PFA, se hizo una contra-tincion con Hoechst y se monto. Las imagenes de celulas transfectadas se tomaron utilizando un microscopio de exploracion laser confocal (FluoView 1000; Olympus) con un objetivo de aceite de 60x utilizando el modo de exploracion secuencial. Las imagenes recolectadas se analizaron utilizando un software ImageJ con una macro especial disenada para la cuantificacion de puntos de LC3 en imagenes fluorescentes.

1.17 Microscopia de transmision de electrones

Las lmeas celulares H9c2 se sembraron en placas de 10 cm y se cultivaron primero en DMEM+10 % de FCS hasta una confluencia del 90 %. A continuacion, para los grupos de 'privacion', se cultivaron adicionalmente en DMEM solo durante 24 horas y despues en DMEM sin glucosa durante 24 horas adicionales. Para los grupos de 'medio completo' los cambios de medio se hicieron exactamente al mismo tiempo pero siempre con DMEM+10 % FCS con glucosa. Al final de estos tratamientos, las celulas se fijaron con un 2 % de glutaraldehfdo (calidad-EM, Polysciences Alemania) tamponado en 150 mM de Na-cacodilato pH 7,2. El medio de cultivo se sustituyo directamente por el fijador, seguido por dos cambios con fijador recien preparado y se fijo durante la noche a 4 0C. Despues del lavado en tampon, las celulas fijadas se despegaron, se centrifugaron, los aglomerados se post-fiaron en un 1 % de tetraoxido de osmio (1h/4 0C) y se embebieron en agarosa de baja fusion. La fijacion con osmio se paro con un 67 % de etanol y seguido por una fijacion en bloque con un 1 % de acetato de uranilo. Despues de la deshidratacion total mediante etapas graduales de etanol y oxido de propileno, se embebieron las muestras en resina epoxi. Se prepararon secciones ultra-finas con un grosor nominal de 60 nm, contratado con uranilo y plomo y se observo con un EM 912 (Carl Zeiss NTS, Alemania). Se registraron micrograffas en placas de imagen y se exploraron con una resolucion de 17,5 pm (Ditabis, Alemania). Las cuantificaciones de las vacuolas autofagicas se hicieron independientemente por dos individuos diferentes con los criterios de observacion de la doble membrana y espacio vacuolar o estructuras de membrana enrolladas dentro de las vacuolas autofagicas.

Para los analisis ultra-estructurales de las muestras cardfacas de los ratones alimentados y privados, se prepararon pequenas biopsias utilizando escalpelos nuevos. Se prepararon piezas de tejido menores de 1 mm3 e inmediatamente se sumergieron en aldehfdo con tampon de fosfato que conteman un 2 % de formaldetndo y un 2 % de glutaraldehfdo (ambos de calidad EM, Polysciences Alemania) y se almacenaron durante varios dfas a 4 oc hasta que se procedio a embeberlas en resina, incluyendo la post-fijacion con osmio y uranilo en bloque. Se prepararon secciones ultra-finas de los bloques de resina madurados con un espesor nominal de 60 nm (Ultracut UCT, Leica, Alemania) se contrasto mediante acetato de uranilo y citrato de plomo de Reynold y se observaron con un EM 912 (Carl Zeiss NTS, Alemania). Se registraron micrograffas en las placas de imagenes que se iban a explorar con una resolucion de 17,5 pm (Micron IP-scanner, Ditabis, Alemania).

1.18 Metodo basado en FACS de cuantificacion autofagica

La construccion de expresion de la protema de fusion LC3:GFP la proporciono amablemente el Dr. Nathan Brady (Hamacher-Brady et al., 2006). Las celulas H9c2 transfectadas establemente se sembraron en placas de 12 pocillos un dfa antes de la transfeccion, que se hizo utilizando la construccion LC3:GFP y Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio se cambio 6 horas despues de la transfeccion, con DMEM+10 % FCS (medio completo) y se incubaron durante 24 horas. A continuacion, para los grupos de control se administro el medio completo y para los grupos de privacion se cambio el medio con DMEM (sin glucosa + sin FCS) para inducir la autofagia. 24 horas despues se recolectaron las celulas y se capturaron en un Canto BD para el analisis FACS. Los datos del FACS se analizaron utilizando el software FlowJo.

1.19 Ensayo de inmunoprecipitacion de cromatina (ChiP) por FoxO3

La inmunoprecipitacion de cromatina por FoxO3 en las celulas H9c2 se llevaron a cabo con el Sistema de Inmunoprecipitacion de Cromatina MAGnify™ (Invitrogen). En resumen, se utilizaron 200.000 celulas para entrecruzamiento con formaldetndo. Se llevo a cabo la inmunoprecipitacion con 5 pg de anticuerpos FoxO3 (sc- 9813X, Santa Cruz) o anticuerpo de control (sc-2028, Santa Cruz). Se llevo a cabo posteriormente un analisis RT- PCR de la cromatina inmunoprecipitada aplicando cebadores como se representa en la Tabla 3.

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2. Resultados

La significacion funcional de la re-expresion de ciertos miARN en la enfermedad ca^aca no se entiende bien. Con el fin de determinar los miARN individuals que inducen la hipertrofio en cardiomiocitos, los inventores transfectaron cardiomiocitos de rata recien nacida con una biblioteca de precursores de miARN y estudiaron en paralelo los cambios en el tamano de los cardiomiocitos y la secrecion de peptido natriuretico cerebral (BNP), que es un marcador de hipertrofia de cardiomiocitos. Utilizando un umbral de mas del 20 % de induccion de tamano de cardiomiocitos, los inventores identificaron 26 miARN pro-hipertroficos expresados en cardiomiocitos, de los cuales diez miARN (miR-19a, miR-19b, miR-22, miR-26, miR-132, miR-194, miR-195, miR-212, miR-365, miR-668) indudan tambien una fuerte secrecion del marcador de estres cardfaco BNP (por encima de la media). De manera interesante, el efecto mas fuerte sobre la hipertrofia de cardiomiocitos se vefa despues de la sobre-expresion de miR-212, que junto con el miR-132 comprende la familia conservada evolutivamente miR-212/132 de miARN (Figura 1a).

2.1 Los miARN que inducian hipertrofia, miR-212 y miR-132, son suficientes y necesarios para la induccion de hipertrofia de cardiomiocitos in vitro

Basandose en la exploracion de la biblioteca inicial de miARN de los inventores, se enfocaron en la funcion cardfaca de la familia miR-212/132. Los experimentos de validacion confirmaron que la sobre-expresion de pre-miR-212 o pre-miR-132 da lugar a un aumento del tamano celular tanto en cardiomiocitos neonatales primarios y en lmeas celulares de cardiomiocitos (H9c2, HL-1) (Figura 1b, 1c y Figuras 2a, 2d), indicando que tanto el miR-212 como el miR-132 son suficientes independientemente para inducir la hipertrofia. Ademas, la co-transfeccion de pre-miR-212 y pre-miR-132 demostraba efectos aditivos sobre el tamano de cardiomiocitos. La inactivacion de estos miARN con inhibidores de miARN espedficos en cardiomiocitos primarios y lmeas celulares de cardiomiocitos disminrna el tamano celular (Figuras 1b, 1c y Figuras 2b, 2e) indicando que no solamente son suficientes, sino tambien necesarios para el aumento fisiologico de los cardiomiocitos.

Los niveles de expresion de miR-212 y miR-132 estaban regulados positivamente en cardiomiocitos primaros al tratarlos con diferentes estfmulos hipertroficos, tales como la angiotensina 2 (Ang2), factor de crecimiento tipo insulina -1 (IGF-1), fenilefrina/isoprenalina (P/I) y suero bovino fetal (FCS), sugiriendo que la familia miR-212/132 esta funcionalmente implicada en los procesos hipertroficos inducidos por diferentes rutas pro-hipertroficas in vitro (Figura 1d). Para determinar si la familia miR-212/132 tambien estana regulada positivamente en afecciones hipertroficas in vivo, los inventores indujeron estres cardfaco en ratones tipo silvestre mediante constriccion transaortica (TAC) y se demostro que los niveles de expresion cardfaca de miR-212 y miR-132 aumentaban durante la hipertrofia cardfaca (Figura 1e). Es de senalar que esta regulacion positiva era paralela con el desarrollo de la hipertrofia cardfaca despues de la sobrecarga de presion, que es evidente por el aumento del diametro de cardiomiocitos en estos corazones (Fig. 1f). Para determinar que tipos celulares del corazon contribrnan principalmente a esta hipertrofia indudan la regulacion positiva de miR-212 y miR-132 in vivo, los inventores utilizando experimentos de fraccionamiento celular utilizando corazones de ratones operados en falso y de TAC (5 semanas tras la TAC). Los resultados de los inventores indicaban un aumento significativo en los niveles de expresion de miR-212 y miR-132 en cardiomiocitos aislados, pero no en fibroblastos cardfacos (Fig. 1g, h).

En conjunto, estos resultados demuestran que la expresion de la familia miR-212/132 esta inducida en cardiomiocitos durante la hipertrofia tanto in vitro como in vivo. Tanto el miR-212 como el miR-132 demostraron que eran necesarios y suficientes para la induccion de hipertrofia en cardiomiocitos in vitro.

Para aclarar adicionalmente los papeles funcionales de la familia miR-212/132 en cardiomiocitos, los inventores generaron lmeas celulares transgenicas de H9c2 estables que sobre-expresaban miR-212/132 (aproximadamente con un aumento de 10 veces; Figura 3a) bajo un promotor CMV activo constitutivamente. Las lmeas celulas H9c2 transgenicas adicionales se generaron como control utilizando la construccion similar pero excluyendo la secuencia codificante de miR-212/132. En las lmeas celulares transgenicas, la sobre-expresion de miR-212/132 aumentaba la media de tamano celular (Figura 2c) asf como la tasa de crecimiento en el cultivo (Figura 3b). Para investigar la causa de las mayores tasas de crecimiento en celulas H9c2 que sobre-expresan miR-212/132, los inventores analizaron adicionalmente la proliferacion de los indices apoptoticos. En comparacion con los controles la sobre- expresion de miR-212/132 da lugar a una disminucion en el numero de celulas apoptoticas (Figura 3c) en ambas condiciones de FCS alto y bajo. Sin embargo, la proliferacion celular no estaba afectada por la sobre-expresion de miR-212/132 (Figura 3d), indicando que las mayores tasas de crecimiento celular que se observaba en celulas H9c2 que sobre-expresaban miR-212/132 era debido a la disminucion de eventos apoptoticos mas que a un aumento de proliferacion. Estos resultados demuestran que la familia miR-212/132 regula tanto la apoptosis como el crecimiento hipertrofico de cardiomiocitos in vitro.

Con el fin de aclarar si la sobre-expresion de miR-212/132 es suficiente para inducir la hipertrofia cardfaca tambien in vivo, los inventores generaron una lmea de raton transgenico con sobre-expresion de miR-212/132 espedfica de cardiomiocitos bajo el control de un promotor a-MHC (Figura 4a). Los inventores obtuvieron y analizaron dos familias transgenicas diferentes (Fam23 y Fam43) que se originan de dos lmeas fundadoras independientes. La sobre expresion espedfica de cardiomiocitos de miR-212/132 fue verificado por analisis RT-PCR en muestras de corazon,

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rinon y cerebro obtenidas de los ratones de ambas familias transgenicas en comparacion con las mismas camadas de tipo silvestre (Figura 4b y datos no mostrados). Los ratones transgenicos se criaron de acuerdo con la relacion Mendeliana esperada y no presentaban defectos obvios la nacer. sin embargo, la esperanza de vida de estos ratones transgenicos se reduda a una media de 84 y 119 dfas para la Fam23 y Fam43, respectivamente (Figura 4c). Todos los ratones transgenicos de la Fam23 y Fam43 monan con signos clmicos de insuficiencia cardfaca grave a los 4 o 6 meses tras el nacimiento, respectivamente. De manera interesante, los niveles de miR-212 y miR-132 en la Fam23 eran 2 y 4 veces mayores en comparacion con la Fam43, respectivamente. Por lo tanto, los mayores niveles de expresion de miR-212/132 se correlacionan con la disminucion de supervivencia.

Los corazones explantados de ratones transgenicos estaban significativamente agrandados (Figura 4d). Los inventores cuantificaron las relaciones de peso cardfaco respecto al corporal de diferentes grupos de edad de ambas familias transgenicas en comparacion con las mismas camadas de tipo silvestre y presentaban un aumento progresivo del peso cardfaco durante la adolescencia de los ratones transgenicos (Figura 4e y 5a). Los niveles de expresion de los marcadores de estres cardfaco peptido natriuretico auricular (ANP) y BNP estaban drasticamente aumentados en los corazones transgenicos (Figuras 5b y 5c), indicando el desarrollo de la insuficiencia cardfaca. Aunque el nivel de expresion de a-MHC no estaba alterado en los corazones transgenicos (Figura 5d), el nivel de p- MHC tambien estaba fuertemente aumentado en corazones transgenicos (Figura 5e), indicando la reactivacion del programa genetico 'fetal' y confirmando de esta manera la existencia de remodelacion cardfaca patologica en estos ratones. El p-MHC es la isoforma de MHC, que normalmente se expresa altamente en corazones fetales y se reactiva en corazones insuficientes (Hill y Olson, 2008; Barry y Townsend, 2010). Ademas, los inventores observaron un aumento en los niveles de fosfo-Akt en corazones transgenicos que sobre-expresan miR-212/132 (Figura 5f). Sin embargo, probablemente es un efecto indirecto del desarrollo de hipertrofia cardfaca en estos ratones mas que ser la consecuencia directa de sobre-expresion de miR-212/132, ya que los niveles de fosfo-Akt no cambiaban en celulas H9c2 que sobre-expresan miR-212/132 in vitro (Figura 5g).

Morfologicamente, el diametro de los cardiomiocitos se determino en secciones histologicas de corazones transgenicos frente a los controles estaba significativamente aumentado (Figura 4f). La funcion cardfaca en ratones transgenicos se evaluo en comparacion con las mismas camadas de tipo silvestre por ecocardiograffa de pequenos animales (Figuras 4g-i). Los inventores observaron una significativa dilatacion ventricular izquierda sistolica final y diastolica final en animales transgenicos (Figuras 4g y 4h). El acortamiento fraccional, un parametro de la funcion cardfaca, estaba fuertemente reducida en corazones de ratones transgenicos en comparacion con las mismas camadas de tipo silvestre (Figura 4i). Las evaluaciones hemodinamicas basicas confirmaban una funcion cardfaca alterada de los animales transgenicos (Tabla 1).

En conjunto, estos resultados demuestran que la sobre-expresion de la familia miR-212/132 espedfica de cardiomiocitos en ratones es suficiente para inducir una hipertrofia cardfaca patologica que resulta en el desarrollo de insuficiencia cardfaca.

Para analizar los papeles potencialmente conservados in vivo de la familia miR-212/132 en otras especies, los inventores inyectaron precursores de miR-212 y miR-132 en embriones de pez cebra. A las 48 horas despues de la fertilizacion (hpf), los embriones mostraban un edema cardfaco masivo indicando una disfuncion cardfaca (Figura 5h). Estos resultados apuntan a un papel funcional conservado evolutivo de la familia miR-212/132 en la regulacion de la funcion cardfaca.

2.4 La familia miR-212/132 es necesaria tanto para el crecimiento cardiaco fisiologico como hipertrofia cardiaca patologica en ratones

Los inventores generaron previamente una lmea de raton mutante con perdida-de-funcion para miR-212/132 y demostraron que los ratones miR-212/132'/‘ se cnan con la relacion Mendeliana esperada y llevan una vida sana, aunque las hembras de ratones miR-212/132'/' presentan un desarrollo deficiente de la glandula mamaria durante la pubertad (Ucar et al., 2010, Ucar et al. 2011). Obviamente. lo ratones miR-212/132'/' tambien carecen de expresion cardfaca de miR-212/132 (Ucar et al., 2010). Los inventores han analizado ahora adicionalmente la lmea de ratones miR-212/132'/' con el fin de determinar si miR-212/132 tambien es 'necesaria' para el crecimiento cardfaco fisiologico o la hipertrofia cardfaca patologica en ratones. La relacion de peso cardfaco respecto al corporal de ratones miR- 212/132'/‘ era un 12,3 % menor que la se las mismas camadas de tipo silvestre (Figura 6a), indicando la necesidad de miR-212/132 para el crecimiento cardfaco fisiologico. Ademas, los cardiomiocitos primarios aislados de los ratones miR-212/132'/‘ recien nacidos eran de tamanos celulares menores en comparacion con los controles de las mismas camadas de tipo silvestre (Figura 6b). Sin embargo, funcionalmente no hay diferencias en los parametros cardfacos de los ratones de tipo silvestre y nulos en miR-212/132 (Tabla 2).

Para determinar si se necesita miR-212/132 para la hipertrofia cardfaca patologica, los inventores aplicaron una sobrecarga ventricular izquierda por una operacion TAC los ratones miR-212/132'/' y las mismas camadas de tipo silvestre. La TAC da lugar a un aumento significativo del peso cardfaco y los diametros transversales de cardiomiocitos en animales de tipo silvestre (Figuras 6c y 6d). Por el contrario, los ratones mutantes que carecen de miR-212/132 estaban fuertemente protegidos de la hipertrofia inducida por TAC (Figuras 6c y 6d). La fibrosis cardfaca inducida por la TAC tambien estaba menos presente en corazones mutantes (Figura 6e). El peso del

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pulmon aumentaba significativamente en los animales de tipo silvestre con la TAC, pero con mucho menos extension en los ratones miR-212/132"/", indicando la prevencion de la insuficiencia cardfaca (Figura 6f). Tres semanas despues de la TAC, los ratones de tipo silvestre desarrollaban la dilatacion ventricular izquierda y funcion cardfaca alterada como se muestra por el aumento del diametro diastolico final y sistolico final y la disminucion del acortamiento fraccional (Figuras 6g-i). Por el contrario, los ratones miR-212/132'7' estaban protegidos del desarrollo de dilatacion cardfaca y la funcion ventricular izquierda alterada (Figuras 6g-i).

Estos resultados demuestran que la funcion de la familia miR-212/132 no solo es 'suficiente' para inducir la hipertrofia patologica del corazon, sino tambien es 'necesaria' para la hipertrofia tanto fisiologica como patologica in vivo.

Como los ratones nulos en miR-212/132 tienen una eliminacion constitutiva del gen miR-212/132 en todos los tipos celulares, es necesario investigar si la perdida-de-funcion de miR-212/132 en cardiomiocitos o celulas no cardiomiocitos del corazon es responsable del fenotipo cardioprotector observado. Utilizando los inhibidores de miARN espedficos, los inventores ya habfan demostrado que la anulacion de miR-212 o miR-132 da lugar a una disminucion del tamano celular de cardiomiocitos primarios (Figura 1b, c) asf como las lmeas celulares de cardiomiocitos (Figura 2b, e). Para estudiar las funciones potenciales de la familia miR-212/132 en fibroblastos cardfacos, que representan la fraccion principal de miocitos no cardfacos, los inventores inactivaron miR-132 y/o miR-212 in vitro y comprobaron los posibles efectos sobre la proliferacion, apoptosis o comportamiento de estos fibroblastos. Los resultados de los inventores demostraron ningun efecto significativo en cualquiera de estos procesos sobre la perdida-de-funcion de la familia miR-212/132 (Figura 7). A continuacion, los inventores emplearon el ensayo de angiogenesis retiniana utilizando los ratones de tipo silvestre y nulos en miR-212/132 con el fin de identificar las implicaciones de la perdida-de-funcion de miR-212/132 para la angiogenesis general in vivo.

No se observaron diferencias entre los ratones de tipo silvestre y nulos en miR-212/132 en el tamano de la retina, numero de arterias retinianas, tamano de la arteria central o el numero de ramas por arteria (Figura 8a-c). Ademas, los inventores analizaron las densidades capilares en los corazones de ratones de tipo silvestre y nulos en miR- 212/132 pero tampoco encontraron diferencias significativas (Figura 8d).

En conjunto, el fenotipo cardioprotector observado en los ratones nulos en miR-212/132 se debe probablemente a la perdida-de-funcion de la familia miR-212/132 en cardiomiocitos mas que en otras celulas no cardiomiocitos del corazon.

2.5 MiR-212 y miR-132 inducen hipertrofia cardiaca mediante la regulacion negativa de la transcripcion del factor FoxO3 anti-hipertrofico

Con el fin de aclarar las funciones moleculares de la familia miR-212/132 en la regulacion de la hipertrofia cardfaca, los inventores investigaron las dianas corriente abajo de miR-212/132 que pueden estar implicadas en los cambios fenotfpicos que se observan despues de la modulacion genetica de esta familia de miARN. Los inventores exploraron en primer lugar los genes diana previstos de miR-212 y miR-132 utilizando distintas herramientas bioinformaticas, tales como Miranda, Targetscan, y PicTar, para identificar los genes asociados con hipertrofia. Los inventores identificaron que la transcripcion del factor FoxO3 anti-hipertrofico era una diana prevista para miR-212 y miR-132. Para validar esta prediccion bioinformatica, los inventores clonaron la 3'UTR de FoxO3 corriente abajo del gen de la luciferasa de luciernaga y descubrieron que la actividad de luciferasa normalizada estaba sustancialmente reducida al co-transfectar esta construccion con miR-212 o miR-132 pero no con miARN (desordenado) no relacionado de control. (Figura 9a). La mutacion del sitio de union de miR-212/132 en la 3'UTR de FoxO3 abolfa los efectos represores de miR-212 y miR-132 (Figura 9a). Estos resultados validaban el FoxO3 como una diana directa in vivo de miR-212 y miR-132.

Los inventores analizaron entonces los niveles de expresion fe FoxO3 en corazones de ratones transgenicos con sobre-expresion de miR-212/132 espedfica de cardiomiocitos y descubrieron una expresion reducidas de los niveles tanto de ARN como proteico cuando se comparaban los corazones de las mismas camadas de tipo silvestre (Figuras 9b y 9c). La sobre-expresion de miR-212/132 tambien resulta en niveles de FoxO3 mas bajos en H9c2 y cardiomiocitos primarios (Figuras 10a, b) El tratamiento con fenilefrina pro-hipertrofica de los cardiomiocitos daba lugar a regulacion negativo de la expresion de FoxO3, que podna rescatarse por inhibicion de miR-212 o miR-132 (Figura 9d), indicando que la regulacion negativa de expresion FoxO3 induda hipertrofia ademas esta mediada por la familia miR-212/132. De manera interesante, los inventores tambien demostraron previamente una asociacion entre una disminucion de los niveles de ARNm de FoxO3 e insuficiencia cardfaca humana (Thum et al., 2007) indicando un parecido significativo del fenotipo observado con la insuficiencia cardfaca humana tambien a nivel molecular.

Los factores de transcripcion FoxO ejercen sus funciones anti-hipertroficas sobre todo mediante la supresion de la ruta de senalizacion de calcineurina (Ni et al., 2006; Ronnebaum y Patterson, 2010). El FoxO3 puede activar la expresion de atrogin-1 que induce la ubiquitinacion y por lo tanto la degradacion de calcineurina A en los cardiomiocitos (Sandri et al., 2004; Li et al., 2004). Por lo tanto, los inventores analizaron los niveles de expresion de atrogin-1 en corazones de ratones transgenicos que sobre-expresan miR-212/132 y descubrieron una reduccion

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significativa en comparacion con los corazones de tipo silvestre (Figura 9e). Debido a que la regulacion negativa de FoxO3 dependiente de miR-212/132 y posteriormente de la expresion de atrogin-1, los inventores hicieron la hipotesis de que la actividad de la ruta de senalizacion de calcineurina estana aumentada en los corazones de ratones transgenicos que sobre-expresan miR-212/132. Los inventores determinaron de esta manera la expresion del ARNm MCIP.1 (tambien conocido como Mcip1.3, RCAN1), cuya transcripcion esta regulada directamente por la ruta de senalizacion de calcineurina (Rothermel et al., 2003). Los inventores descubrieron que los niveles de ARNm de MCIP.1 estaban significativamente aumentados en corazones transgenicos en comparacion con los controles de tipo silvestre (Figura 9f) asf como en las lmeas celulares H9c2 transgenicas que sobre-expresan miR-212/132 (Figura 10c). Ademas, la actividad de la calcineurina desfosfatasa estaba aumentada en lisados cardfacos de ratones transgenicos miR-212/132, confirmando de esta manera la hiperactividad de esta ruta de senalizacion pro- hipertrofica (Figura 9g). El efecto pro-hipertrofico de la ruta de senalizacion de la calcineurina esta mediada principalmente por la activacion de los factores de transcripcion NFAT mediante la des-fosforilacion, que da lugar a su activacion y transporte nuclear (Okamura et al., 2000; Barry y Townsend, 2010). Por lo tanto, los inventores tambien comprobaron el nivel de actividad transcripcional NFAT en cardiomiocitos despues de la transfeccion con pre-miR-212, pre-miR-132, o miARN control desordenados. La sobre-expresion de miR-212 o miR-132, pero no del miARN de control, dan lugar a un aumento dramatico en la actividad de NFAT en condiciones pro-hipertroficas tanto basales como inducidas por fenilefrina (PE) (Figura 9h).

Por el contrario, la regulacion positivo de Mcip1.4 despues de la sobrecarga de presion se mitigaba en ratones nulos a miR-212/132 (Figura 9i), indicando que la activacion de la senalizacion pro-hipertrofica calcineurina/NFAT estaba suprimida en ausencia de funcion de miR-212/132. Ademas, los niveles de atrogin-1 estaban disminuidos durante la hipertrofia cardfaca inducida por sobrecarga de presion en corazones de tipo silvestre, pero aumentaba en corazones nulos a miR-212/132 (Figura 9k), indicando la falta de funcion FoxO3 y por lo tanto explica la supresion de senalizacion de calcineurina en corazones mutantes.

En conjunto, estos resultados indican que la familia miR-212/132 regula el equilibrio entre las rutas pro- y anti- hipertroficas en cardiomiocitos mediante su regulacion directa de la expresion de FoxO3. En ausencia de inhibicion mediada por FoxO3, la hiperactivacion de la ruta de senalizacion de calcineurina pro-hipertrofica y consecuentemente el aumento de la actividad transcripcional de NFAT daba lugar probablemente a la hipertrofia patologica observada y la insuficiencia cardfaca asociada en los ratones transgenicos con sobre-expresion de miR- 212/132. Por otra parte, en ausencia de funcion de miR-212/132, la actividad de FoxO3 no suprimida da lugar a la regulacion positiva de atrogin-1 y de esta manera previene la activacion de la senalizacion de calcineurina pro- hipertrofica y de esta manera el desarrollo de hipertrofia cardfaca.

2.6 Las funciones de la familia miR-212/132 como un factor anti-autofagico en cardiomiocitos

Aparte de la regulacion negativa de los procesos hipertroficos, el FoxO3 tambien induce la autofagia en cardiomiocitos (Sengupta et al., 2009; Ferdous et al., 2010). Para determinar si la sobre-expresion de miR-212/132 en cardiomiocitos puede interferir en procesos autofagicos in vivo, los inventores investigaron los niveles de ARNm de varios genes marcadores autofagicos como LC3b, Ulk2, ATG12, Plk3c3, Beclin1, Bnip3, y ATG5b y descubrieron una disminucion dramatica de la expresion de todos estos genes en corazones transgenicos en comparacion con los niveles en corazones de tipo silvestre (Figura 11a). De la misma manera, los niveles de lipidacion de LC3 (relaciones LC3II/LC3I) eran menores (Figura 11b), mientras que los niveles del sustrato de autofagia p62 estaban aumentados en corazones de ratones transgenicos que sobre-expresan miR-212/132 (Figura 11c).

Estos resultados sugieren que la sobre-expresion de miR-212/132 espedfica de cardiomiocitos atenua los procesos autofagicos cardfacos. Por el contrario. los corazones de ratones nulos a miR-212/132 tienen lipidacion de LC3 cardfaco mayor (relaciones LC3II/CL3I) y menores niveles de p62 cuando se comparan con corazones de tipo silvestre (Figuras 11b y c), indicando altas tasas de autofagia en el corazon.

Con el fin de determinar si la expresion reducida de marcadores de autofagia que se observa en los corazones de ratones transgenicos es un efecto directo de la sobre-expresion de miR-212/132, los inventores analizaron los procesos autofagicos en lmeas celulares H9c2 transgenicas transfectadas establemente. Para visualizar la formacion de autofagosomas y cuantificar la cantidad de estructuras autofagicas en los cardiomiocitos individuales, los inventores transfectaron estas celulas con una construccion de expresion para la protema de fusion LC3:mCherry. La protema LC3 se lipido y encones se acumula en las estructuras de membrana de autofagosomas y por lo tanto es posible visualizar las estructuras autofagicas como puntos fluorescentes (Hamacher-Brady et al., 2006). En condiciones normales, el numero medio de puntos LC3 era ligeramente menor en las celulas H9c2 que sobre-expresan miR-212/132 en comparacion con los controles (Figuras 11d y 11e). La privacion de suero y glucosa induce una alto nivel de autofagia en esta lmea celular (Aki et al., 2003). Por lo tanto, los inventores tambien indujeron las condiciones autofagicas privando las celulas en medio libre de suero y glucosa y se cuantifico el numero de puntos LC3 en celulas individuales. Aunque el numero medio de puntos LC3 aumentaba 3 veces con la privacion en celulas de control, casi no cambiaba en celulas H9c2 transgenicas que sobre-expresan miR-212/132, indicando que la familia miR-212/132 de miARN regula negativamente la induccion autofagica en respuesta a la limitacion de nutrientes (Figuras 11d y 11e).

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Tambien se observaron hallazgos similares en cardiomiocitos primarios neonatales en privacion y sobre-expresion de miR-212 o miR-132 (Figura 12). Estos resultados demuestran que la familia miR-212/132 regula negativamente la respuesta autofagica de los cardiomiocitos a la limitacion de nutrientes.

Con el fin de visualizar las estructuras autofagicas con mas detalle, los inventores utilizaron la microscopfa de transmision de electrones para analizar las mismas lmeas celulares transgenicas en las mismas condiciones anteriores y se hizo el recuento del numero de vacuolas autofagicas con membranas dobles. De manera similar a los datos de puntos LC3 de los inventores, la respuesta autofagia a la limitacion de nutrientes estaba mitigada en celulas H9c2 que sobre-expresan miR-212/132 en comparacion con el aumento de casi 2 veces del numero de vacuolas autofagicas en celulas de control (Figuras 11f y 11g). Finalmente, los inventores emplearon tambien un metodo basado en FACS para la deteccion cuantitativa del flujo autofagico tomado como la actividad de la maquinaria autofagica (Shvets y Elazar, 2009). Las celulas H9c2 transgenicas se transfectaron con las construcciones de expresion GFP:LC3 y se analizaron en la condicion de medio completo o condiciones de privacion de suero/glucosa. La disminucion de la fluorescencia de GFP se correlacionaba con los niveles de actividad de la maquinaria autofagica, ya que la intensidad de fluorescencia de GFP disminuye con el ambiente acido de autolisosomas despues de la fusion de los lisosomas con autofagosomas. Los inventores han detectado una disminucion significativa de la intensidad de GFP para la lmea celular H9c2 control despues de la privacion en comparacion con las condiciones del medio completo, indicando que el aumento de la actividad autofagica como resultado de la limitacion de nutrientes. Por el contrario, para la lmea celular H9c2 transgenica que sobre-expresa miR-212/132 esta disminucion de la intensidad de GFP estaba significativamente reducida (Figuras 11h y 11i), que tambien confirma los hallazgos previos de los inventores observados en los analisis de microscopfa de fluorescencia y electronica. Es de senalar, que los niveles de la protema de fusion GFP:LC3 eran similares entre las celulas H9c2 de control y que sobre-expresan miR-212/132 en condiciones experimentales similares, aunque habfa una reduccion con la privacion en el mismo nivel de ambos grupos como se esperaba debido a la eliminacion autofagica de protemas LC3 (Figura 13). Por lo tanto, la diferencia de fluorescencia de GFP entre las celulas H9c2 de control y las que sobre-expresan miR-212/132 se debe probablemente a la reduccion de la fluorescencia de GFP con los autolisosomas como se ha explicado anteriormente.

Tomados en conjunto, los inventores han demostrado, utilizando tres metodos independientes, que familia miR- 212/132 funciona como un factor anti-autofagico en cardiomiocitos, que puede mitigar los mecanismos autofagicos en condiciones de limitacion de nutrientes con su sobre-expresion.

Con el fin de determinar si los hallazgos de los inventores demostraban un mecanismo biologicamente significativo en cardiomiocitos mas que la mera consecuencia del alto nivel de sobre-expresion de los dos microARN, los inventores comprobaron los niveles de expresion de ambos miR-212 y miR-132 en celulas H9c2 de tipo silvestre en condiciones normales y de privacion de suero/glucosa. Los resultados de la RT-PCR cuantitativa mostraban que los niveles de ARNm maduro de ambos miR-212 y miR-132 estaban significativamente reducidos durante las condiciones de privacion en comparacion con las condiciones normales (Figura 14). Este resultado indica que durante la limitacion de nutrientes, los cardiomiocitos regulan negativamente la expresion de miR-212 y miR-132, que son anti-autofagicos, lo que puede representar un mecanismo facilitado por estas celulas para aumentar el nivel de autofagia para sobrevivir durante las condiciones de privacion.

Para estudiar el impacto potencial de la familia miR-212/132 en la respuesta autofagica a la privacion in vivo, los inventores llevaron a cabo experimentos de privacion adicionales utilizando ambas lmeas de raton mutantes miR- 212/132 con perdida-de y ganancia-de funcion (Figura 15a). Como se evalua por los niveles de lipidacion LC3, la privacion da lugar a un aumento drastico de la autofagia cardfaca en ratones tipo silvestre, que estaba significativamente atenuada en los animales transgenicos que sobre-expresan miR-212/132 espedficos de cardiomiocitos (Figura 15b). De manera interesante, con la privacion los niveles de autofagia aumentaban los niveles comparables en corazones de raton de tipo silvestre y nulos en miR-212/132 ('/') (Figura 15 b). Para evaluar las estructuras autofagicas a nivel ultra-estructural, los inventores analizaron estas muestras de corazon tambien por microscopfa de transmision de electrones (Figura 15c y Figura 16). En condiciones normales de 'alimentacion', los inventores observaron un numero mas alto de vacuolas autofagicas en los cardiomiocitos de ratones nulos en miR- 212/132 que en los ratones de tipo silvestre, indicando niveles basales aumentados de autofagia en ausencia de la familia miR-212/132. La privacion induda un aumento drastico en el numero de vacuolas autofagicas en cardiomiocitos de tipo silvestre, que alcanzaban un nivel similar o ligeramente aumentado del numero de vacuolas autofagicas en cardiomiocitos de ratones nulos en miR-212/132 privados.

Por otro lado, en los cardiomiocitos de ratones transgenicos que sobre-expresan miR-212/132 los inventores observaron un numero muy bajo de vacuolas autofagicas y los autofagosomas electrodensos en condiciones normales, que solamente aumentaban ligeramente en condiciones de privacion. Este resultado confirma tambien que los niveles de autofagia basal e inducida por privacion estan mitigados en cardiomiocitos con sobre-expresion de miR-212/132.

A continuacion, los inventores analizaron de la autofagia del sustrato p62 en condiciones de privacion tanto in vitro como in vivo. Sorprendentemente, la limitacion de nutrientes induda una regulacion positiva de los niveles de p62 tanto en celulas H9c2 de tipo silvestre como las que sobre-expresan miR-212/132 aunque los niveles de regulacion

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positivas eran menores en las celulas que sobre-expresaban miR-212/132 (Figura 17a). DE la misma manera, con la privacion, los niveles de p62 tambien estaban aumentados en los corazones de ratones de tipo silvestre y nulos a miR-212/132 (Figura 17b). Por otro lado, los niveles de p62 se manteman sin cambios en los corazones de ratones transgenicos que sobre-expresan miR-212/132 con la privacion. P62 es una protema de union a LC3, que regula la formacion de agregados proteicos y se elimina por autofagia (Kanamori et al., 2011). La respuesta autofagica a la limitacion de nutrientes tambien se controla por la actividad de mTOR (Jung et al., 2010). En condiciones de nutrientes en exceso en el ambiente, la AMPK activa el mTOR, que a su vez suprime la autofagia y aumenta los niveles de protema en la celula.

Por el contrario, la actividad de mTOR, revelada por los niveles de fosfo-mTOR, disminuye en condiciones de privacion que permite la regulacion positiva de la autofagia y la supresion de niveles proteicos en la celula. Para evaluar el impacto potencial de la funcion de la familia miR-212/132 en los niveles de actividad mTOR, los inventores analizaron los niveles de fosfo-mTOR en las celulas H9c2 transgenicas de los inventores in vitro y los corazones de ratones que sobre-expresan miR-212/132 espedficos de cardiomiocitos privados. En las celulas H9c2 de tipo silvestre, la privacion da lugar a la reduccion de los niveles de fosfo-mTOR/mTOR (Figura 15d), que esta de acuerdo con el aumento de autofagia en estas celulas. Por el contrario. los inventores observaron solo una disminucion ligera pero no significativa en celulas H9c2 que sobre-expresan miR-212/132 privadas (Figura 15d), lo que apoya tambien los hallazgos previos de los inventores de una respuesta autofagica mitigada en estas celulas.

De igual manera, en los corazones se los ratones privados los niveles de fosfo-mTOR/TOR disminman drasticamente, aunque el nivel de regulacion negativa era menor en corazones transgenicos que sobre-expresan miR-212/132, demostrando un apoyo adicional del fenotipo de respuesta autofagica atenuada in vivo debido a la sobre-expresion de la familia miR-212/132 (Figura 15e).

Se habfa demostrado que la ruta IGF-1/PI3K y FoxO3 eran reguladoras principales de la autofagia en cardiomiocitos con la privacion (Aki et al., 2003; Sengupta et al., 2009). Aqrn, los resultados de los inventores demuestran que la familia miR-212/132 de miARN, que pueden estar reglados positivamente por la ruta IGF-1 (Figura 1d) y suprime la expresion de FoxO3 (Figura 9a-c), da lugar a autofagia alterada en cardiomiocitos y crecimiento hipertrofico.

Los inventores llevaron a cabo ensayos para validar si la funcion anti-autofagica de la familia miR-212/132 esta relacionada con la supresion de FoxO3 mediada por miR-212/132. Ademas, con el FoxO3 ChiP se podfa amplificar significativamente menos region promotora LC3b del ADN de celulas que sobre-expresan miR-212/132 en comparacion con las celulas H9c2 de tipo silvestre (Figura 18a). Esto era paralelo con la menor expresion de LC3b en la lmea celular transgenica que sobre-expresa miR-212/132 durante la privacion en comparacion con los controles (Figura 18b). Estos resultados demuestran que la funcion autofagica de la familia miR-212/132 esta mediada al menos en parte por su regulacion de la expresion de FoxO3.

Tomados en conjunto, los resultados de los inventores demuestran que miR-212/132 actua como un factor anti- autofagico en cardiomiocitos mediante la regulacion de la expresion de FoxO3. La sobre-expresion de miR-212/132 atenua la repuesta autofagica inducida por privacion en cardiomiocitos tanto in vitro como in vivo. Por otro lado la perdida de funcion de miR-212/132 aumenta los niveles basados de autofagia en el corazon.

2.7 Inhibicion farmacologica de miR-132 in vivo con antagomires espedficos que ofrece una estrategia terapeutica para la insuficiencia cardiaca inducida por la sobrecarga de presion

Como la ganancia-de-funcion de la familia miR-212/132 induda hipertrofia y respuesta autofagica mitigada en cardiomiocitos y la perdida-de-funcion recuperaba la hipertrofia cardfaca inducida por sobrecarga de presion en ratones, los inventores hicieron la hipotesis de que la inhibicion de miR-212 o miR-132 utilizando antagomires espedficos puede evitar el desarrollo de insuficiencia cardfaca inducida por sobrecarga de presion. Para ensayar esta hipotesis, los inventores primero indujeron una hipertrofia cardfaca en ratones tipo silvestre por TAC y se inyectaron por via intravenosa con antagomires espedficos contra miR-132. Como se muestra por RT-PCR cuantitativa, los niveles de miR-132 cardfacos endogenos se anularon satisfactoriamente en los ratones tratados con el antagomir contra miR-132 pero no con un antagomir contra una secuencia desordenada (Figura 19). Las relaciones de peso cardfaco respecto a corporal asf como los diametros de cardiomiocitos estaban significativamente aumentado en los animales tratados de control despues de la sobrecarga de presion, pero menos afectados en los ratones tratados con antagomir-132 (Figuras 20a y 20b). Ademas, los ratones tratados con antagomir-132 mostraba menos aumento en fibrosis cardfaca (Figura 20c). Ademas, la funcion y dilatacion cardfaca se conservaba mejor en los ratones tratados con antagomir-132 en comparacion con el grupo tratado de control (Figuras 20d-f). En los corazones de estos ratones, la expresion de FoxO3 estaba inducida significativamente en el tratamiento con antagomir-132 en comparacion con el tratamiento de control (Figura 20 g). Ademas, el aumento inducido por TAC de la actividad de calcineurina y la expresion de Mcip1.4 estaba atenuado despues del tratamiento con antagomir (Figuras 20h, i).

Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que al menos en los ratones, la anulacion de miR-132 mediada por antagomir solo se puede utilizar para prevenir el desarrollo de hipertrofia cardfaca e insuficiencia cardfaca.

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3. Conclusion

Los inventores han demostrado aqu que la familia miR-212/132 tiene un papel clave en la hipertrofia cardfaca y la insuficiencia ca^aca. Ambos miARN de la familia miR-212/132 estan regulados positivamente por el estres ca^aco in vivo y en condiciones hipertroficas in vitro. Los resultados de los inventores demostraban que miR-212 y miR-132 son ambos necesarios y suficientes para la hipertrofia patologica de cardiomiocitos in vitro e hipertrofia cardfaca in vivo. Las lmeas de ratones transgenicos que sobre-expresaban miR-212/132 desarrollaban hipertrofia cardfaca y posteriormente insuficiencia cardfaca. Un fenotipo similar tambien se observo en pez cebra, indicando una funcion conservada evolutivamente de la familia miR-212/132 en cardiomiocitos. Por otra parte, los ratones miR- 212/132'7' estaban protegidos de la hipertrofia cardfaca patologica inducida por sobrecarga de presion. De manera similar, la inhibicion farmacologica del miR-132 por inyeccion de antagomir bloqueaba la hipertrofia cardfaca y el desarrollo de insuficiencia cardfaca.

Los resultados de los inventores muestran que tanto el miR-212 como el miR-132 se dirigen y regulan negativamente la expresion del factor de transcripcion FoxO3, un potente factor anti-hipertrofico y pro-autofagico en cardiomiocitos (Sengupta et al., 2009; Ni et al., 2006). La regulacion negativa de la expresion de FoxO3 con la sobre-expresion de miR-212/132 da como resultado la hiperactivacion de la ruta de senalizacion de calcineurina y actividad transcripcional de NFAT, que posteriormente da lugar a la hipertrofia de cardiomiocitos tanto in vitro como in vivo. La regulacion negativa de la expresion de FoxO3 puede mitigar tambien la respuesta autofagica de cardiomiocitos con el fin de superar las condiciones de privacion. Por otra parte, la perdida-de funcion genetica de la familia miR-212/132 o la inactivacion medida por antagomir del miR-132 suprime la senalizacion calcineurina/NFAT hipertrofica inducida por sobre carga de presion y de esta manera atenua el desarrollo de hipertrofia cardfaca.

Ademas, los inventores proporcionan pruebas de que la familia miR-212/132 regula la autofagia cardfaca, un proceso que esta estrechamente unido a la homeostasis cardfaca. La sobre-expresion de la diana de miR-212/132 FoxO3 se ha demostrado que reduce el tamano celular de cardiomiocitos y que induce a la autofagia cardfaca (Sengupta et al., 2009). Las condiciones con autofagia cardfaca reducida dan lugar a la acumulacion de productos parcialmente degradados y a veces catabolitos toxicos, que finalmente dan lugar a la insuficiencia cardfaca (Taneike et al., 2010). La autofagia cardfaca reducida se habfa asociado con la cardiomiopatfa relacionada con la edad (Taneike et al., 2010).

Como la sobre-expresion de miR-212/132 espedfica de cardiomiocitos alteraba la autofagia in vitro e in vivo y daba lugar al desarrollo de insuficiencia cardfaca grave en ratones. es posible que la disfuncion de los mecanismos de respuesta autofagica contribuya a la muerte cardfaca observada en esta lmea transgenica de raton.

La inhibicion farmacologica de la regulacion positiva de miR-132 aumentaba los niveles de FoxO3 y recuperaba la hipertrofia e insuficiencia cardfaca inducida por la sobrecarga de presion, proporcionando de esta manera una diana terapeutica valiosa para interferir con los procesos de autofagia asociados a la enfermedad.

Sin embargo, los resultados de los inventores no proporcionan un enlace mecanico entre la autofagia y la hipertrofia cardfaca, sino que mas ben demuestra dos funciones de la familia miR-212/132 en el corazon. Los cardiomiocitos son extremadamente sensibles a las condiciones de limitacion de nutrientes y afrontan la privacion activando sus mecanismos de respuesta autofagica. En este estudio, los inventores demostraron in vitro e in vivo que la familia miR-212/132 tiene una funcion anti-autofagica en cardiomiocitos, que puede atenuar esta respuesta autofagica inducida por la privacion con su sobre-expresion. Por otra parte, los ratones con perdida-de-funcion de miR-212/132 tambien muestran altos niveles de autofagia basal en condiciones normales.

Los miARN pueden regular varias dianas geneticas simultaneamente en una celula. En este estudio, los inventores demostraron que tanto el miR-212 y miR-132 puede regular directamente la expresion de FoxO3 que permitieron a los inventores demostrar los mecanismos moleculares que subyacen en los fenotipos de perdida-de o ganancia-de- funcion observados en ambas estrategias. MiR-212/132 se expresa tambien en celulas no miocitos del corazon, aunque a niveles menores en comparacion con los cardiomiocitos.

De manera importante, la regulacion positiva de miR-212 y miR-132 inducida por hipertrofia se observo exclusivamente en los cardiomiocitos pero no en los fibroblastos cardfacos. Ademas, la modulacion in vitro de la expresion de miR-212/132 no da lugar a ningun cambio fenotfpico obvio en la proliferacion, apoptosis o comportamientos migratorios de fibroblastos cardfacos. Los inventores tampoco fueron capaces de demostrar un defecto de la angiogenesis general o las densidades capilares en el corazon debido a la perdida-de-funcion de la familia miR-212/132. Finalmente, como la sobre-expresion de miR-212/132 espedfica de cardiomiocitos muestra el fenotipo opuesto del fenotipo miR-212/132 con perdida-de-funcion en ratones, es altamente probable que el efecto cardioprotector de la perdida-de-funcion de miR-212/132 se deba a su funcion en los cardiomiocitos mas que en celulas no miocitos del corazon. No obstante, los inventores no pueden descartar cualquier contribucion menor de la perdida-de-funcion de miR-212/132 en celulas no-miocitos da lugar parcialmente al fenotipo cardioprotector observado en estos ratones. Los inventores demostraron recientemente que FoxO3 regula parcialmente los niveles de miR-1 espedficos de cardiomiocitos (Kumarswamy et al., 2012). Aqrn, los inventores observaron una expresion de miR-1 cardfaco significativamente reducida en ratones y lmeas celulares H9c2 transgenicos que sobre-expresan

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miR-212/132 (Figura 21a y b), que puede contribuir tambien al fenotipo de insuficiencia cardfaca observado.

Espedficamente, la inyeccion intravenosa de antagomires espedficos contra el miR-132 recuperaba la hipertrofia cardfaca y la insuficiencia ca^aca posterior en ratones despues de la sobrecarga de presion ventricular izquierda. Las opciones farmacologicas terapeuticas utilizadas actualmente de la insuficiencia cardfaca incluyen agentes moduladores de angiotensina, p-bloqueantes, diureticos, antagonistas de aldosterona, vasodilatadores o agentes inotropicos (Barry y Townsend, 2010). Aunque varios estudios clmicos han demostrado disminuciones significativas en las tasas de mortalidad inducida por insuficiencia cardfaca para todos estos agentes, la tasa de mortalidad a los 5 anos se mantiene inaceptablemente a casi el 50% (Barry y Townsend, 2010). Por tanto, existe una gran urgencia para desarrollar estrategias terapeuticas nuevas y mas eficaces para la insuficiencia cardfaca. A este respecto, los hallazgos de los inventores utilizando la inyeccion intravenosa de antagomires contra miR-132 despues de la induccion de sobrecarga de presion en ratones, que mostraban un resultado beneficioso y evitaban el desarrollo de insuficiencia cardfaca, ofrece una nueva estrategia terapeutica prometedora para la insuficiencia cardfaca inducida por sobrecarga de presion.

Utilizando ambas estrategias de ganancia-de y perdida-de-funcion, este estudio demuestra que la familia miR- 212/132 conservada evolutivamente ha conservado funciones pro-hipertroficas en el corazon y tambien demuestra que sus niveles de expresion apropiados fuertemente regulados son necesarios para el crecimiento y funcion fisiologica normal del corazon. Aunque la regulacion de la autofagia por un miARN se habfa demostrado previamente para el miR-30 en lmeas celulares cancerosas (Zhu et al., 2009), los hallazgos de los inventores representan el primer ejemplo de autofagia regulada por un miARN en una configuracion in vivo y en un modelo patologico no tumoral. Por lo tanto, la familia miR-212/132 proporciona una percepcion mecanica nueva y ofrece una diana terapeuticamente relevante para el tratamiento de la hipertrofia cardfaca y el desarrollo de la insuficiencia cardfaca.

Tabla 1. Analisis basico hemodinamico de ratones de tipo silvestre (TS) y transgenicos (TG) que sobre- expresan miR-212/132 utilizando un sistema de cateter volumen-presion___________________________

Parametros hemodinamicos

TS (n = 3) TG (n = 3)

HR (lpm)

506,05 ± 36,03 487,00 ± 54,35

Ped (mmHg)

2,05 ± 5,42 6,00 ± 3,30

EF ( %)

70,43 ± 9,71 38,36 ± 3,65

HR: frecuencia cardfaca; Ped: presion diastolica final ventricular izquierda; EF: fraccion de eyeccion. Todos los valores representan la media ± S.E.M.; los valores de P son solo significativos (<0,05) para Ef entre TS y TG.

Tabla 2. Analisis hemodinamico de ratones de tipo silvestre (TS) y nulos a miR-212/132 (KO) utilizando un ____________________________ sistema de cateter volumen-presion______________________________

Parametros hemodinamicos

TS (n = 8) KO (n = 6)

HR (lpm)

510,06 ± 10,05 527.05 ± 11.88

SV (ml)

16,43 ± 0,68 16.38 ± 0.54

Ves (ml)

16,45 ± 1,47 14.26 ± 1.59

Ved (ml)

31,26 ± 1,98 27.58 ± 2.60

Pes (mmHg)

87,38 ± 2,66 86.73 ± 3.05

Ped (mmHg)

3,83 ± 0,39 2.62 ± 1.06

dP/dt max (mmHg/s)

8689,95 ± 424,21 9022.13 ± 645.49

dP/dt mm (mmHg/s)

-8753,19 ± 451,06 -9063.34 ± 416.60

SW (mmHgml)

1232,15 ± 54,49 1210.39 ± 58.67

CO (ml/min)

8337,05 ± 247,40 8622.58 ± 270.95

EF ( %)

54,65 ± 1,91 61.86 ± 4.57

Ea (mmHg/ml)

5,36 ± 0,35 5.37 ± 0.35

Tau (ms)

6,24 ± 0,35 5.75 ± 0.50

HR: frecuencia cardfaca; SV: volumen de choque; Ves/Pes: volumen/presion sistolica final ventricular izquierda; Ved/Ped: presion/volumen diastolica final ventricular izquierda; dP/dt: tasa de aumento de presion ventricular izquierda; SW: trabajo de choque; CO: gasto cardfaco; EF: fraccion de eyeccion; Ea: elasticidad aortica. Estadfstica: P no significativo entre TS y KO.

Tabla 3. Secuencias de oligonucleotidos cebadores utilizados para los analisis de ARNm

Gen

Especie Directo Inverso SEQ ID NO.:

Anp

Raton 5'-CCTGTGTACAGTGCGGTGTC-3' 5'- 10

CCTAGAAGCACTGCCGTCTC-3'

11

Bnp

Raton 5'-CTGAAGGTGCTGTCCCAGAT-3' 5'- 12

GTTCTTTTGTGAGGCCTTGG-3'

13

a-MHC

Raton 5'-GGTCCACATTCTTCAGGATTCTC-3' 5'- 14

GCGTTCCTTCTCTGACTTTCG-3'

15

P-MHC

Raton 5'-TCTCCTGCTGTTTCCTTACTTGCT-3' 5'- 16

CAGGCCTGTAGAAGAGCTGTACTC-3'

17

Gapdh

Raton 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3' 5'- 18

GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'

19

FoxO3

Raton 5'-CAAAGCTGGGTACCAGGCTG-3' 5'- 20

TTCCACGGGTAAGGGCTTCA-3'

21

FoxO3

Rata 5'-GATGGTGCGCTGTGTGCCCTAC-3' 5'- 22

CCAAGAGCTCTTGCCAGTCCCTT-3'

23

LC3-region promotora (ChIP)

Rata 5'-GGCTGGACTTGAATTCAGAAA-3' 5'- 24

ACTTGCTGTTCCAGGTGGTC-3'

25

Atroginl

Raton 5'-GCAAACACTGCCACATTCTCTC-3' 5'- 26

CTTGAGGGGAAAGTGAGACG-3'

27

Atroginl

Rata 5'-CCATCAGGAGAAGTGGATCTATGTT-3' 28

5'-GTTCATGAAGTTCTTTTGGGCGATGC-3'

29

Mcipl

Raton 5'-CTGCACAAGACCGAGTT-3' 30

5'-TGTTTGTCGGGATTGG-3'

31

Mcipl

Rata 5'-AGCTCCCTGATTGCCTGTGT-3' 32

5'-TTTGGCCCTGGTCTCACTTT-3'

33

Lc3b

Raton 5'-CGTCCTGGACAAGACCAAGT-3' 34

5'-ATTGCTGTCCCGAATGTCTC-3'

35

Ulk2

Raton 5'-CAGCCCTGGATGAGATGTTT-3' 36

5'-GGATGGGTGACAGAACCAAG-3'

37

Atg12

Raton 5'-GGCCTCGGAACAGTTGTTTA-3' 38

5'-CAGCACCGAAATGTCTCTGA-3'

39

Beclinl

Raton 5'-GGCCAATAAGATGGGTCTGA-3' 40

5'-CACTGCCTCCAGTGTCTTCA-3'

41

Plk3c3

Raton 5'-TGTCAGATGAGGAGGCTGTG-3' 42

5'-CCAGGCACGACGTAACTTCT-3'

43

Bnip3

Raton 5'-GAACTGCACTTCAGCAATGG-3' 44

5'-ATTTCAGCTCTGTTGGTATC-3'

45

Atg5

Raton 5'-GACAAAGATGTGCTTCGAGATGTG-3' 46

5'-ATAATGCCATTTCAGGGGTGTGC-3'

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41. Ucar, A.; Vafaizadeh, V.; Chowdhury, K.; Groner, B. (2011). MicroRNA-dependent regulation of the microenvironment and the epithelial stromal cell interactions in the mouse mammary gland. Cell Cycle. 10, 563-565.

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44. van Rooij, E.; Quiat, D.; Johnson, B.A.; Sutherland, L.B.; Qi, X.; Richardson, J.A.; Kelm, R.J. Jr.; Olson, E.N. (2009). A family of microRNAs encoded by myosin genes governs myosin expression and muscle performance. Dev Cell. 17, 662-673.

45. Ventura, A.; Young, A.G.; Winslow, M.M.; Lintault, L.; Meissner, A.; Erkeland, S.J.; Newman, J.; Bronson, R.T.; Crowley, D.; Stone, J.R. et al. (2008). Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 through 92 family of miRNA clusters. Cell. 132, 875-886.

46. Wang, K.; Li, P.F. (2002). Foxo3a regulates apoptosis by negatively targeting miR-21. J Biol Chem. 285, 16958-16966.

47. Zhao, Y.; Ransom, J.F.; Li, A.; Vedantham, V.; von Drehle, M.; Muth, A.N.; Tsuchihashi, T.; McManus, M.T.; Schwartz, R.J.; Srivastava, D. (2007). Cell. 129, 303-317.

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50. Merkle, S.; Frantz, S.; Schon, M.P.; Bauersachs, J.; Buitrago, M.; Frost, R.J.; Schmitteckert, E.M.; Lohse, M.J.; Engelhardt, S. (2007). A role for caspase-1 in heart failure. Circ Res. 100, 645-653.

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59. Bauersachs, J. & Thum, T. Biogenesis and regulation of cardiovascular MicroRNAs. Circ Res. 109, 334-347

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(2011).

60. Thum, T. et al. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signaling in fibroblasts. Nature 456, 980-984 (2008).

61. Komatsu, M. et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy- deficient mice. Cell. 131,1149-1163 (2007).

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65. Kanamori, H. et al. Functional significance and morphological characterization of starvation-induced autophagy in the adult heart. Am J Pathol. 174, 1705-1714 (2009).

66. Ullman-Cullere, M.H., Foltz, C.J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Lab Anim Sci. 49, 319-323 (1999).

67. Napp LC et al. Extrinsic Notch Ligand Delta-Like 1 Regulates Tip Cell Selection and Vascular Branching Morphogenesis. Circ Res. 110, 530-535 (2012).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Max-Planck-Gesellschaft zur Forderung der Wissenschaften e.V.

Medizinische Hochschule Hannover

<120> La familia miARN-212/132 como diana terapeutica

<130> 51493P WO

<160> 47

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(22)

<223> miR-132

<400> 1

uaacagucua cagccauggu cg 22

<210>2 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(21)

<223> miR-212

<400> 2

uaacagucuc cagucacggc c 21

<210>3 <211> 22 <212> ARN <213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(22)

<223> miR-132

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400>3

uaacagucua cagccauggu cg 22

<210>4 <211> 22 <212> ARN <213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(22)

<223> miR-212

<400> 4

uaacagucuc cagucacggc ca 22

<210>5

<211> 110 <212> ARN <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(110)

<223> Bucle-tallo de miR-212 de Homo sapiens <400> 5

cggggcaccc cgcccggaca gcgcgccggc accuuggcuc uagacugcuu acugcccggg 60

ccgcccucag uaacagucuc cagucacggc caccgacgcc uggccccgcc 110

<210>6 <211> 101 <212> ARN <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(101)

<223> Bucle-tallo de miR-132 de Homo sapiens <400> 6

ccgcccccgc gucuccaggg caaccguggc uuucgauugu uacuguggga acuggaggua 60

acagucuaca gccauggucg ccccgcagca cgcccacgcg c 101

<210>7 <211> 66 <212> ARN <213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(66)

<223> Bucle-tallo de miR-132 de mus musculus <400> 7

gggcaaccgu ggcuuucgau uguuacugug ggaaccggag guaacagucu acagccaugg 60 ucgccc 66

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210>8 <211> 91 <212>ARN <213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(91)

<223> Bucle-tallo de miR-212 de mus musculus <400> 8

gggcagcgcg ccggcaccuu ggcucuagac ugcuuacugc ccgggccgcc uucaguaaca 60

gucuccaguc acggccaccg acgccuggcc c 91

<210> 9 <211> 22 <212>ARN <213> Artificial

<220>

<223> antagomir contra miR-132 <220>

<221> misc_feature <222> (22)..(22)

<223> n = A-chol (chol = colesterol)

<400> 9

cgaccauggc uguagacugu un 22

<210> 10 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo anp de raton <400> 10

cctgtgtaca gtgcggtgtc 20

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso anp de raton <400> 11

cctagaagca ctgccgtctc 20

<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo bnp de raton <400> 12

ctgaaggtgc tgtcccagat 20

<210> 13 <211> 20 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213> Artificial <220>

<223> cebador inverso bnp de raton <400> 13

gttcttttgt gaggccttgg 20

<210> 14 <211> 23 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo alfa-MHC de raton <400> 14

ggtccacatt cttcaggatt ctc 23

<210> 15 <211> 21 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso alfa-MHC de raton <400> 15

gcgttccttc tctgactttc g 21

<210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo beta-MHC de raton <400> 16

tctcctgctg tttccttact tgct 4

<210> 17 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso beta-MHC de raton <400> 17

caggcctgta gaagagctgt actc 24

<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo gapdh de raton <400> 18

ttcaccacca tggagaaggc 20

<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> cebador inverso gapdh de raton <400> 19

ggcatggact gtggtcatga 20

<210> 20 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo foxo3 de raton <400> 20

caaagctggg taccaggctg 20

<210> 21 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso foxo3 de raton <400> 21

ttccacgggt aagggcttca 20

<210> 22 <211> 22 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo foxo3 de rata <400> 22

gatggtgcgc tgtgtgccct ac 22

<210> 23 <211> 23 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso foxo3 de rata <400> 23

ccaagagctc ttgccagtcc ctt 23

<210> 24 <211> 21 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo de la region promotora lc3 (ChIP) de rata <400> 24

ggctggactt gaattcagaa a 21

<210> 25 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 26 <211> 22 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo atroginl de raton <400> 26

gcaaacactg ccacattctc tc 22

<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso atrogin1 de raton <400> 27

cttgagggga aagtgagacg 20

<210> 28 <211> 25 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo atroginl de rata <400> 28

ccatcaggag aagtggatct atgtt 25

<210> 29 <211> 26 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso atrogin1 de rata <400> 29

gttcatgaag ttcttttggg cgatgc 26

<210> 30 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador direscto mcip1 de raton <400> 30

ctgcacaaga ccgagtt 17

<210> 31 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> cebador inverso mcipl de raton <400> 31

tgtttgtcgg gattgg 16

<210> 32 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo mcipl de rata <400> 32

agctccctga ttgcctgtgt 20

<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso mcipl de rata <400> 33

tttggccctg gtctcacttt 20

<210> 34 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo lc3b de raton <400> 34

cgtcctggac aagaccaagt 20

<210> 35 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso lc3b de raton <400> 35

attgctgtcc cgaatgtctc 20

<210> 36 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo ulk2 de raton <400> 36

cagccctgga tgagatgttt 20

<210> 37 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 38 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo atg12 de raton <400> 38

ggcctcggaa cagttgttta 20

<210> 39 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso atg12 de raton <400> 39

cagcaccgaa atgtctctga 20

<210> 40 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo beclin1 de raton <400> 40

ggccaataag atgggtctga 20

<210> 41 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso beclin1 de raton <400> 41

cactgcctcc agtgtcttca 20

<210> 42 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo plk3c3 de raton <400> 42

tgtcagatga ggaggctgtg 20

<210> 43 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<210> 44 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo bnip3 de raton <400> 44

gaactgcact tcagcaatgg 20

<210> 45 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso bnip3 de raton <400> 45

atttcagctc tgttggtatc 20

<210> 46 <211> 24 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo atg5 de raton <400> 46

gacaaagatg tgcttcgaga tgtg 24

<210> 47 <211> 23 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso atg5 de raton <400> 47

ataatgccat ttcaggggtg tgc 23

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un inhibidor de miR-132 para su uso en el tratamiento o prevencion de hipertrofia ca^aca, trastornos autofagicos o asociados a hipertrofia cardfaca, y/o disfuncion ca^aca, en el que el inhibidor es una molecula de acido nucleico aislada que tienen suficiente complementariedad con miR-132 para formar un hnbrido en condiciones fisiologicas.
2. 2. El inhibidor para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que es una molecula de acido nucleico de cadena sencilla y doble cadena, particularmente un antagomir.
3. 3. El inhibidor para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la disfuncion cardfaca se selecciona de entre disfuncion contractil, descompensacion cardfaca o insuficiencia cardfaca, prevencion de remodelado cardfaco despues del infarto de miocardio, miocarditis, enfermedades valvulares ca^acas, trastornos ca^acos geneticos con hipertrofia ca^aca, por ejemplo, cardiomiopatfa hipertrofica no obstructiva y obstructiva, enfermedad de Fabry.
4. 4. El inhibidor para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde el trastorno autofagico cardfaco se selecciona de entre trastornos cardfacos que incluyen degeneracion muscular esqueletica y cardfaca.
5. 5. El inhibidor para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la administracion a pacientes que se seleccionan de entre:

   (i) pacientes que tienen un riesgo aumentado de insuficiencia cardfaca,

   (ii) pacientes que sufren insuficiencia cardfaca (congestiva),

   (iii) pacientes despues de un infarto de miocardio,

   (iv) pacientes con enfermedades cardfacas congenitas asociadas con hipertrofia cardfaca, tal como estenosis de la vena pulmonar, defectos del septo auricular o ventricular.
6. 6. El inhibidor para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en combinacion con un medicamento adicional, particularmente donde el medicamento adicional se selecciona de entre agentes moduladores de angiotensina, p-bloqueantes, diureticos, antagonistas de aldosterona, vasodilatadores, agentes inotropicos o combinaciones de los mismos.
7. 7. Una molecula de acido nucleico, particularmente una molecula de cadena sencilla o doble cadena, que comprende

   (a) una secuencia de nucleotidos que es la complementaria de una secuencia de nucleotidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o un precursor de la SEQ ID nO: 1, y/o

   (b) una secuencia de nucleotidos que tiene una identidad de al menos un 80 %, al menos un 90 %, o particularmente al menos un 95 % con una secuencia de (a),

   para su uso en el tratamiento o prevencion de trastornos cardfacos, que implica trastornos autofagicos cardfacos y/o hipertrofia cardfaca.
8. 8. Una molecula de acido nucleico aislada, particularmente una molecula de acido nucleico de cadena sencilla o doble cadena, que comprende

   (a) una secuencia de nucleotidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 o un precursor de SEQ ID NO: 1, y/o

   (b) una secuencia de nucleotidos que tiene una identidad de al menos un 80 %, al menos un 90 %, o particularmente al menos un 95 % con una secuencia de (a),

   para su uso en el tratamiento o prevencion de trastornos cardfacos que implican trastornos autofagicos y/o atrofia cardfaca.
9. 9. Uso de una molecula de acido nucleico aislada, particularmente una molecula de acido nucleico de cadena sencilla o doble cadena, que comprende

   (a) una secuencia de nucleotidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 o un precursor de SEQ ID NO: 1,

   (b) una secuencia de nucleotidos que es la complementaria de (a), y/o

   (c) una secuencia de nucleotidos que tiene una identidad de al menos un 80 %, al menos un 90 %, o particularmente al menos un 95 % con una secuencia de (a),

   en el diagnostico in vitro de trastornos cardfacos que implican trastornos autofagicos cardfacos y/o hipertrofia cardfaca.
10. 10. La molecula de acido nucleico aislada para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 7-8 o el uso de la

    molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 9, que es una molecula de miARN o un analogo

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    de la misma que tiene una longitud de desde 18-25 nucleotidos, particularmente 21 o 22 nucleotidos; o una molecula precursora de miARN que tiene una longitud de 50-120 nucleotidos o una molecula de ADN que codifica el mismo.
11. 11. El inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, la molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 o 10 o el uso de la molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10, que es una molecula de ARN que comprende opcionalmente al menos un componente basico modificado, donde el componente basico modificado se selecciona particularmente de los componentes basicos con bases nucleicas modificadas, componentes basicos con un azucar modificado, componentes basicos con la estructura modificada y combinaciones de los mismos.
12. 12. La molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 8 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 10-11 donde el tratamiento o prevencion es el tratamiento o prevencion de trastornos cardfacos que implican atrofia cardfaca y/o trastornos autofagicos cardfacos de autofagia exagerada y/o caquexia cardfaca.
13. 13. El uso de la molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en el diagnostico de trastornos que implican trastornos autofagicos, particularmente en el diagnostico de caquexia cardfaca.
14. 14. La molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 o 10-12 para la administracion a pacientes seleccionados de entre:

    (i) pacientes que tienen un aumento del riesgo de o que padecen trastornos autofagicos,

    (ii) pacientes que tienen un aumento del riesgo o padecen caquexia cardfaca

    (iii) pacientes que tienen un aumento del riesgo o padecen atrofia cardfaca.
15. 15. La molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, 10-12 o 14 en combinacion con un medicamento adicional.