KR101602688B1 - microRNA-365 활성화제를 포함하는 혈관평활근세포 증식 또는 이동 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 microRNA-365 활성화제를 포함하는 혈관평활근세포 증식 또는 이동 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, microRNA-365는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현을 억제하여 혈관평활근세포의 증식과 이동을 억제하고, 혈관 손상 시 혈관내막 형성을 억제하여 혈관평활근세포의 이상 증식 또는 이동 질환을 예방, 진단, 또는 치료하는데 사용할 수 있다.

Description

microRNA-365 활성화제를 포함하는 혈관평활근세포 증식 또는 이동 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for inhibiting proliferation or migration of vascular smooth muscle cell comprising microRNA-365 activators}

본 발명은 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현을 조절하여 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 microRNA-365의 약제학적 용도에 관한 것이다.

죽상동맥경화증(atherosclerosis)은 콜레스테롤 및 중성지방과 같은 지방물질이 동맥혈관 내에 축적됨으로 인해서 동맥벽이 두꺼워지는 상태로 전세계적으로 높은 사망률을 보이는 질환이다. 죽상동맥경화증은 혈관손상, 이상지질혈증(dyslipidaemia), 당뇨병과 같은 대사장애(metabolic syndrome), 고혈압 등 다양한 원인에 의해서 발병하는 것으로 알려져 있다. 이러한 죽상동맥경화증의 치료에는 스타틴(statin) 계열의 약물, 식이요법, 스텐트(stent) 삽입 또는 경피적 관상동맥 성형술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)과 같은 외과적 수술이 시행되고 있다. 그러나 치료 후 혈관재협착(restenosis)과 같은 부작용이 많은 환자에게서 나타나고 있고, 약물 용출성 스텐트(drug eluting stent) 역시 혈관재협착을 완벽히 차단하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 이러한 한계점을 극복하고 치료효과를 높이기 위해서는 죽상동맥경화증의 병리학적 생태를 기반으로 한 새로운 치료법의 개발이 필요하다.

죽상동맥경화증의 치료를 위한 다양한 외과적 수술 후 혈관재협착에 있어서 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)의 증식(proliferation) 및 이동(migration) 현상은 매우 중요하다. 혈관평활근세포의 증식 및 이동에는 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF)와 같은 성장인자뿐만 아니라 혈장에 포함되어있는 여러 사이토카인(cytokine) 등에 의한 면역세포의 염증반응(inflammation)도 중요한 역할을 한다. 또한 최근 연구 결과 microRNA의 발현 변화가 동맥경화증을 포함한 다양한 질병의 발병 및 진행에 관련되어 있음이 증명되었다.

이에, 본 발명자는 죽상동맥경화증에서 매우 중요한 혈관평활근세포의 증식 및 이동에 microRNA-365가 관여한다는 사실을 실험을 통해 확인하였고, microRNA-365를 활성화했을 때 혈관평활근세포의 증식 및 이동이 억제됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

미국 공개특허 제2013-0078225호 (2013.03.28) 대한민국 공개특허 제2009-0099470호(2009.09.22) 대한민국 공개특허 제2009-0117896호(2009.11.13)

Carcinogenesis, 33(1), pp.220-225 (2012. 01) Biochem Biophys Res Commun, 410(1), pp.127-133 (2011.01.24) Cell Biol Int. 36(3), pp.305-310 (2012.03.01)

따라서, 본 발명의 목적은 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 microRNA-365의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환을 예방, 진단, 또는 치료하기 위한 microRNA-365의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 microRNA-365를 포함하는 혈관평활근세포의 증식 또는 이동 억제용 조성물을 제공한다.

상기 microRNA-365는 이를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 형태로 포함되거나 비바이러스성 전달체와 함께 제공될 수 있다.

상기 microRNA-365는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현을 억제하여 혈관평활근세포의 증식과 이동을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 microRNA-365; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환은 혈관재협착증, 혈관협착증, 동맥경화증, 아테롬성동맥경화증, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중 또는 말초혈관협착증일 수 있다.

본 발명은 또한 microRNA-365의 검출을 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1을 검출하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적 시료에서 microRNA-365의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 대조군에서 microRNA-365의 발현 수준이 감소하면 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 생물학적 시료에서 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가하는지를 추가로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 microRNA-365 및/또는 cyclin D1의 발현 수준은 실시간 RT-PCR 또는 면역 블랏팅에 의해 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 microRNA-365의 발현 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 세포에서 microRNA-365의 발현을 분석하고, 시험물질이 대조군에 비하여 microRNA-365의 발현을 증가시키면 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 치료제 스크리닝 방법은 microRNA-365의 발현 세포에서 시험물질이 대조군에 비하여 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현을 감소시키는지를 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 microRNA-365를 활성화하여 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 억제함으로써 재협착을 막을 수 있고, 바이오마커로서 mciroRNA-365의 발현 변화를 측정하여 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환, 예컨대, 죽상동맥경화증의 발병 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 질환을 예방 및 치료하기 위한 새로운 치료제 개발에 적용 가능하다.

도 1은 혈관평활근세포(VSMC) 증식에 대한 miR-365의 효과를 나타낸 것으로, (A)는 cyclin D1(적색 원)을 표적으로 하는 예상 miRNAs, 정상 흰쥐 대동맥에서 고발현되는 miRNAs(녹색 원) 및 손상 후 유의적으로 발현이 감소된 miRNAs(파란색 원)를 도시한 벤 다이어그램이고, (B)는 CCK-8 분석으로 측정된 VSMC 증식을 나타내며, (C) 및 (D)는 24시간 동안 PDGF-BB(20 ng/mL) 처리한 VSMC에 대해 시간별(C) 및 투여량별(D) 내재성 miR-365의 발현을 실시간 PCR로 측정한 결과이고, (E)는 10% 혈청 및 Ang II(100 nM)로 자극한 VSMC에서 miR-365 발현 변화에 대한 실시간 PCR 결과를 나타낸 것이다(대조군 대비 *P<0.05).
도 2는 혈관평활근세포(VSMC)에서 miR-365의 직접 표적으로서 cyclin D1의 동정 결과를 나타낸 것으로, (A)는 음성 대조군(N.C.) miRNA 또는 miR-365(100 nM)이 형질주입된 VSMC에서 실시간 PCR로 측정한 형질주입 효율을 나타낸 것이고, (B)는 miR-365 결합 서열을 포함하는 흰쥐의 cyclin D1 3' UTR을 루시퍼라아제 리포터 유전자에 클로닝하고, 듀얼 루시퍼라아제 분석으로 루시퍼라아제 활성을 평가하고, 표준화된 음성 대조군으로 사용하기 위해 바다팬지 루시퍼라아제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이며, (C)는 RT-PCR에 따라 cyclin D1의 mRNA 수준을 분석한 결과이며, GAPDH를 대조군으로 사용하였고, (D)는 음성 대조군 또는 miR-365 모방체가 형질주입된 VSMC에 대해 PDGF-BB(20 ng/mL)로 자극한 후 웨스턴 블랏하여 cyclin D1 단백질 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이고, β-액틴을 대조군을 사용한 결과이다(대조군 대비 *P<0.05).
도 3은 혈관평활근세포(VSMC)에서 miR-365의 항-증식 효과를 나타낸 것으로, (A) 내지 (C)는 음성 대조군 또는 miR-365가 형질주입된 VSMC에 PDGF-BB(20 ng/mL)(A), 10% 혈청(B) 또는 Ang II(100 nM)(C)을 처리하거나 그렇지 않은 후 CCK-8 분석을 실시하여 다양한 자극인자가 처리된 VSMC에서 외재성 miR-365의 효과를 평가한 결과이고, (D)는 대조군 miRNA인 음성 대조군, 또는 miR-365 모방체가 형질주입된 VSMC에 PDGF-BB(20 ng/mL)를 처리하고 웨스턴 블랏팅을 이용하여 PCNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 것으로, PCNA의 단백질 수준은 β-액틴으로 표준화한 것이며, (E)는 FACS 분석(PI로 염색함)에 의해 측정된 세포주기 프로파일을 나타낸 것으로, 하단의 막대 그래프는 ModFit LT 프로그램으로 분석하여 세포주기, G0/G1, S 및 G2/M기에서 세포의 비율을 측정한 결과이다(대조군 대비 *P<0.05, 대조군 대비 **P<0.001).
도 4는 혈관평활근세포(VSMC) 이동에 대한 miR-365의 효과를 나타낸 것으로, (A)는 보이덴 챔버 밑바닥에서 보이는 VSMC의 사진도(상단)과, 현미경을 이용하여 대표 필드(100×배율)에서 카운팅한 VSMC의 이동 세포 수를 나타낸 것이며(하단), (B)의 상단은 손상-치유 분석으로 측정한 0시간째와 손상 후 16시간째에서 얻은 세포 이동 분석 결과의 대표 이미지이고(×200), (B)의 하단은 16시간째에서 손상 봉합을 측정하고, Image J를 이용하여 이동하지 않고 남아있는 영역을 측정하여 표준화한 결과를 나타낸 것이다(정상 대비 *P<0.05).
도 5는 흰쥐 풍선 손상 모델에서 miR-365 발현 변화를 나타낸 것으로, (A)는 내재성 miR-365의 발현을 측정한 실시간 PCR 결과로 내부 대조군으로 사용한 U6로 표준화한 결과이며, (B) 및 (C)는 miR-365에 의한 혈관내막 형성 억제를 확인하기 위해 수행한 H&E 염색(B) 및 트리크롬 염색(C) 결과이며, (D)는 PCNA 발현 변화를 측정한 면역조직학적 결과이고, (E)는 PDGF-BB로 자극한 VSMC에서 cyclin D1을 표적으로 하는 miR-365의 역할을 보여주는 도식도이다(정상 대비 *P<0.05)(각 그룹 당 5마리).

microRNA-365는 종양억제제로 종양세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러나 혈관평활근세포에서 microRNA-365의 표적 및 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 본 발명자들은 새로운 분자표적치료(molecular therapy) 방법으로 혈관평활근세포의 증식 및 이동에 관련된 cyclin D1의 발현과 활성을 microRNA-365를 통해서 억제시킴으로써 인 비트로, 엑스 비보, 인 비보 실험을 통해 혈관평활근세포의 리모델링에 긍정적이고 효과적인 치료 효과를 입증하였다.

이와 같이, 본 발명은 microRNA-365를 활성화하여 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 억제함으로써 재협착을 막을 수 있고, 바이오마커로서 mciroRNA-365의 발현 변화를 측정하여 죽상동맥경화증의 발병 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 죽상동맥경화증 치료 및 예방을 위한 새로운 치료제로써 microRNA-365를 조절하는 신약개발에 적용 가능하다.

따라서, 본 발명은 microRNA-365를 포함하는 혈관평활근세포의 증식 또는 이동 억제용 조성물을 제공한다.

명세서에서, 용어 “microRNA(또는 miRNA, miR이라 함)”는 21-25 nt의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질이다[Bartel DP et al ., Cell. 2004.01.23;116(2):281-297]. miRNA의 생성은 Drosha(RNaseⅢ type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 micorRNA(pre-microRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 microRNA로 만들어진다[Kim VN et al ., Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. 05.;6(5):376-385]. 상술한 바와 같이 제조된 microRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다[Wienholds E et al ., Science , 309(5732): 310-311(2005); Nelson P et al ., Trends Biochem Sci., 28: 534-540(2003); Lee RC et al ., Cell, 75: 843-854(1993); 및 Esquela-Kerscher A et al ., Nat Rev Cancer. 6: 259-269(2006)].

본 발명의 microRNA-365는 SEQ ID NO.: 1에 기재되어 있으며, 단일 가닥 분자인 microRNA-365의 성숙한 형태로써, 이중 가닥 부분을 형성할 수 있는 자가-상보적인 분자 즉 스템-루프 구조일 수도 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태 발명에서 사용되는 microRNA-365의 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단이 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3’ 말단 쪽이 돌출(overhang)한 구조와 5’ 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하다. 돌출하는 뉴클레오타이드 수는 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-365는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막고 생체 내 안정성을 높이기 위해 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 당(ribose ring)의 2’-위치의 수산기를 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂, N₃, CN, F, Cl, Br, I 등으로 수식하거나 (이때 R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬기, R'은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬렌일 수 있다), 인산 백본을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트, 또는 보라노포스페이트 등으로 수식할 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 본 발명 miRNA-365는 이의 활성을 저하하지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함한다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-365는 기본적으로 두 가닥의 RNA가 쌍을 이루어 이중가닥을 형성하는 완전한 형태, 즉 인 비트로에서 microRNA를 직접 합성한 뒤 형질주입(transfection)을 통해 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 플라스미드계 pre-microRNA 벡터와 PCR-유도 miRNA 발현 카세트 등에 의한 형질주입에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-365를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G et al ., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002), 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR et al ., Science 296:550-553, 2002), 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 RNaseⅢ 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al ., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-365는 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체(바이러스성 또는 비바이러스성 전달체)와 복합체 형태로 포함될 수 있다. 예컨대, microRNA-365를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 포함될 수 있다. 이를 위하여 사용 가능한 플라스미드로는 예를 들어, pSilencer (Ambion), pSiEx (Novagen), siXpress (Takara Bio), pBLOCK-iT™(Invitrogen), pcDNA3.1(Invitrogen), pCEP4(Invitrogen), SilenCircle™ (Allele), 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 바이러스성 전달체로 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, EB 바이러스 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 포오미바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 또한, 비바이러스성 전달체로서, 전달 시약으로 Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), G-fectin, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 마이셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀, 리간드-DNA 복합체, 유전자총(genegun)이 사용될 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 리포좀의 형태로서는 양친매성 제제(amphipathic agent), 예를 들어 마이셀, 불용성 단일층, 액정, 또는 수용액에 존재하는 라멜라층으로 존재하는 지질과 조합된다. 리포좀 제형을 위한 지질은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 레시틴 인지질, 사포닌, 담즙산, 리포펙틴 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

또한 microRNA-365의 체내 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시키는 등 당업계에 알려진 일반적인 리보핵산 세포 내 전달 기술을 이용하도록 제제화될 수 있다. 또한 전기천공법(electroporation)에 의해 세포를 microRNA가 든 용액에 현탁하여 직류 고전압의 펄스를 통과시켜 세포내로 도입되게 하는 방법도 포함한다. 생체에는 microRNA가 든 용액을 원하는 부위에 투여하고 전극을 통해 직류전압을 펄스로 주어 세포로 도입되게 할 수 있다.

본 발명의 microRNA-365는 혈관평활근세포의 증식 및 이동 억제 활성을 가지므로, 혈관평활근세포의 과도한 증식 및 이동이 억제되어야 하는 필요가 있는 다양한 분야에서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 microRNA-365; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환(vascular smooth muscle cell hyper-proliferative or migrational disorder)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 microRNA-365는 혈관평활근세포의 증식 및 이동 억제 활성을 갖는다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 microRNA-365는 세포 증식의 성장인자로 잘 알려져 있을 뿐만 아니라, 혈관손상 시 나타나는 중막(media)에서 내막(intima)으로의 세포이동에도 중요한 인자인 PDGF-BB로 유도하여 세포증식 및 이동이 증가한 흰쥐의 대동맥 평활근세포에서 microRNA-365의 발현이 저하되어 있음을 확인하였다. 그러나, microRNA-365 모방체를 넣어준 혈관평활근세포에서는 microRNA-365의 발현이 증가되어 있다. 따라서, 증식과 이동에 관여하는 표적 유전자를 선별하여 표적 유전자의 mRNA의 3'UTR에 microRNA-365가 결합하는지를 확인한 결과, cyclin D1의 mRNA의 3'UTR에 microRNA-365가 직접적으로 결합하며, microRNA-365에 의해 cyclin D1의 단백질의 발현은 억제하나 cyclin D1의 mRNA에는 영향을 주지 않음을 확인하였다. 또한, PDGF-BB, 10% 혈청, 안지오텐신 II에 의한 혈관평활근세포의 증식 역시 microRNA-365에 의해 억제되는지 확인한 결과, 세포사멸 마커인 증식세포핵항원(PCNA)은 PDGF-BB에 의해 혈관평활근세포가 증식하면 증가하나, microRNA-365에 의해서는 감소됨을 확인하였다. 세포주기를 분석한 결과, PDGF-BB 에 의해 감소된 G0/G1기와 증가된 S기는 microRNA-365에 의해 G0/G1기는 증가하고 S기는 감소하여 정상 상태의 세포주기와 비슷해짐을 확인하였다. 따라서, microRNA-365에 의해 세포주기 진행에서 G1기에서 S기로 이행되는 과정에 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 아울러, PDGF-BB에 의해 증가된 혈관평활근세포의 이동은 microRNA-365에 의해 억제되며, 손상된 혈관에 microRNA-365를 넣어주면 혈관내막 형성이 억제되고, 증식세포핵항원도 감소하는 특성을 나타냈다.

결론적으로, microRNA-365는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현을 억제하여 PDGF-BB에 의한 혈관평활근세포의 증식과 이동을 억제하여 혈관 손상 시 혈관내막 형성을 억제하는 역할을 한다. 이러한 이유로 PDGF-BB, 혈청, 안지오텐신 II와 같은 성장인자의 자극이나 혈관 손상이 생겼을 때 microRNA-365의 발현이 감소됨으로 인해 세포주기가 활성화되어 혈관평활근세포의 증식과 이동이 증가하게 되는 특성을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "평활근"은 관 모양의 기관, 방광, 복강, 자궁, 생식도관, 위장관, 호흡기관, 맥관구조, 피부 및 모양체근(ciliary muscle), 눈의 홍채 등의 기관의 벽(wall) 내에서 발견되는 비-줄무늬근(nonstriated muscle)이다. 상기 평활근을 구성하는 세포인 "평활근세포"는 단핵세포로서, 시트(sheet)나 다발(bundle)의 형태로 배열되어 갭 정션(gap junction)에 의해 연결되어 있는 것이 특징이다.

본 명세서에서, 용어 "혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)"는 혈관 벽의 평활근을 구성하는 세포를 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환 (VSMC hyper-proliferative or migrational disorder)"이란 혈관평활근세포의 과도한 증식 또는 이동에 기인하여 발생되는 질환 또는 질병을 의미한다.

본 발명에서의 "혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환"은 혈관평활근세포의 이상 증식 또는 이동에 의해 직접적으로 발생되는 혈관재협착증, 혈관협착증, 죽상동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증뿐만 아니라, 혈관협착증, 혈관재협착증 또는 죽상동맥경화증에 의해 이차적으로 유발되는 심혈관계 질환인 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중, 말초혈관협착증 등을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료 또는 예방되는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환은 죽상동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관재협착증 또는 혈관협착증이다.

아테롬성 동맥경화증은 동맥의 내층에 지방 물질이 침착되거나 섬유화(fibrosis)되어 있는 질환이다. 한편, 혈관의 재협착증(restenosis)은 혈관벽이 손상(traumatization)된 후 혈관 통로가 좁아지는 질환이다. 동맥경화 진행과 스텐트 삽입술 후에 발생하는 혈관 재협착증은 혈관평활근세포의 증식, 이동 그리고 세포외 기질(extracellular matrix)의 분비 등에 기인한다고 알려지고 있다 (Circulation, 1997, 95, 1998-2002; J. Clin . Invest. 1997, 99, 2814-2816; Cardiovasc. Res. 2002, 54, 499-502). 이에, 동맥경화의 진행과 혈관 재협착의 방지를 위해 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 약물에 대한 연구가 널리 진행되고 있으며, 현재 몇 가지 약물이 환자의 치료에 사용되고 있다(J. Am . Coll . Cardiol., 2002, 39, 183-193). 따라서, 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 효율적으로 억제하는 본 발명의 microRNA-365는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제형 제조에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 microRNA-365의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 microRNA-365의 검출을 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, PDGF-BB에 의해 유도된 세포증식 및 이동이 증가된 흰쥐의 혈관평활근세포에서 microRNA-365의 발현이 감소되어 있고, 손상된 혈관에서도 microRNA-365의 발현이 감소되어 있으므로 microRNA-365의 발현 수준을 측정하는 것은 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 발병 여부를 판단할 수 있는 것이다.

또한, 세포증식 및 이동이 증가된 흰쥐의 혈관평활근세포에서 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1은 발현이 증가되어 있기 때문에 본 발명의 키트는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1을 검출하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 더 포함하여 진단의 정확도를 높일 수 있다.

상기 miRNA-365와 cyclin D1의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 실시간 RT-PCR 또는 면역 블랏팅에 의해 측정하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적 시료에서 microRNA-365의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 대조군에서 microRNA-365의 발현 수준이 감소하면 혈관평활근세포 이상 증식성 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.

생물학적 시료는 인간을 포함한 포유류인 것이 좋으나, 이에 한정하지는 않는다. 예컨대, 생물학적 시료는 체세포인 것이 바람직하고, 혈관평활근세포 또는 조직인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 방법은 생물학적 시료에서 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가하는지를 추가로 판정하는 단계를 더 포함하여 진단의 정확도를 높일 수 있다.

본 발명의 방법에서, microRNA-365 및 cyclin D1의 발현 수준은 실시간 RT-PCR 또는 면역 블랏팅에 의해 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

본 발명은 또한 microRNA-365의 발현 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 세포에서 microRNA-365의 발현을 분석하고, 시험물질이 대조군에 비하여 microRNA-365의 발현을 증가시키면 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 스크리닝 방법은 microRNA-365 인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시킨다. microRNA-365 인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1을 과다발현하거나 cyclin D1-활성화 돌연변이를 포함하는 세포이고, 보다 바람직하게는 혈관평활근세포이다.

본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 microRNA-365의 발현량을 측정한다. 측정 결과, 본 발명의 microRNA-365의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 증가되면 상기 시험물질은 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

추가로 microRNA-365의 타겟인 cyclin D1의 발현량을 측정하여 시험물질이 대조군에 비하여 cyclin D1의 발현을 감소시키는지를 판단하여 상기 시험물질은 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

microRNA-365 및 cyclin D1의 발현량의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR, 노던 블롯팅, cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응 등을 이용하여 실시할 수 있다.

이와 같은 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환의 치료제 후보물질은 이후의 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 microRNA-365와 cyclin D1 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 촉진 또는 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환 치료제를 개발할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 혈관평활근세포에서 microRNA-365의 약제학적 용도

(흰쥐의 대동맥 평활근세포의 분리 및 배양)

쥐 대동맥 혈관평활근세포는 Kim JS et al.(Cell Biol Int 36:305-310, 2012)에 기재된 방법에 따라 분리하였다. 동물 연구에 대한 모든 실험 절차는 연세대학교 의과대학의 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었고, 실험동물의 관리 및 보호는 위원회의 가이드 라인 및 동물보호법에 따라 수행하였다. 6-8 주령의 Sprague-Dawley 흰쥐에서 흉부대동맥을 뽑아내어, 100 U/mL의 페니실린과 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신 용액이 첨가된 무혈청 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Invitrogen Co, Carlsbad, CA, USA)에 옮겨놓았다. 대동맥을 결합조직에서 분리하고, 1 mg/mL의 collagenase type I(Sigma, St. Louis, MO, USA)과 0.5 ㎍/mL의 elastase(USB Bioscience, Cleveland, OH, USA)가 함유된 5 mL의 효소 분해 혼합액이 있는 페트리 디쉬에 옮기고, 30분 동안 37℃에 배양하였다. 이후 대동맥을 DMEM에 옮겨, 현미경 밑에서 수술용 집게로 외막을 박리하였다. 대동맥을 5 mL의 효소 분해 혼합물을 함유하는 코니칼 튜브(conical tube)에 넣어 37℃에 2시간 동안 배양하였다. 현탁액을 10분 동안 1,500rpm에서 원심분리하고, 펠렛을 10% 소 태아 혈청(FBS)가 함유된 DMEM에 재현탁 시켰다. 쥐 대동맥 혈관평활근세포는 75 cm² 플라스크에 10% FBS DMEM와 함유하여 5% CO₂ 배양기에서 37℃에 배양하였다.

(세포 증식 분석)

VSMC는 96-웰 플레이트에 1×10⁴ cells/well으로 세 칸씩 반복하여 배양하였다. 세포는 0.1% FBS DMEM으로 48시간 동안 전처리 하였고, 그 후에 48시간 PDGF-BB, 안지오텐신 II(angiotensin II), 또는 혈청으로 처리하였다. 처리 후, 세포의 증식은 CCK 분석 키트(Dojindo, Japan)을 사용하여 측정하였다. CCK 분석 키트는 DMEM으로 희석 후 각각의 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 샘플의 흡광도는 분광계를 사용하여 450 nm 파장으로 측정하였다.

(세포주기 분석)

세포주기의 다른 단계에서 혈관평활근세포의 분포는 유동 세포 계측법에 따라 추정하였다. 간단히 설명하면, 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 씨딩하고 1일 동안 무 혈청 배지에서 기아상태(starvation)가 되도록 하였다. 세포들은 miRNA-모방체로 형질주입 시키고 24시간 동안 PDGF-BB(20 ng/mL)로 자극시켰다. 처리 후, 세포를 수확하고, 인산염 완충 식염수(PBS, pH를 7.4)로 세척하고, 4℃에서 PBS으로 희석한 70% 에탄올로 고정시켰다. PBS 세척 후에, 펠렛을 RNase A 용액(20 ㎍/mL)에 용해시키고, 15분 동안 37℃에서 배양하였다. 세포는 30분 동안 propidium iodide(PI)로 염색하고 Fluorescence-activated cell sorting(FACS) analysis(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 각각의 세포주기 단계에 있는 세포의 비율은 ModFit LT 프로그램을 사용하여 분석하였다.

(MicroRNA 형질주입)

성숙한 흰쥐 miR-365와 음성 대조군의 RNA 올리고머(NC)(Genolution Pharmaceuticals, Inc.,Seoul, Korea)를 100 nM의 최종 농도로 사용하였다. 성숙한 miR-365는 5'-UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU-3'이다. 10% FBS를 함유한 높은 혈당의 DMEM에서 혈관평활근세포에 siLentFect™ Lipid reagent(BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 miR-365 모방체를 형질주입한 후, CO₂ 배양기에서 37℃에 4시간 동안 배양한 후, 배지를 바꿔주었다.

(RT-PCR)

단일가닥 cDNA는 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 전체 RNA로부터 합성하였다. 전체 RNA 1 ㎍, 1×RT 버퍼(10mM Tris/HCl(pH 9.0), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 mM dNTP 믹스, 20 U의 RNase 저해제, 0.5 ㎍의 oligo-(dT) 15 및 10 U의 역전사효소가 포함된 20 ㎕의 반응 혼합물을 42℃에서 15분 동안 반응시키고, 99℃에서 5분간 열을 가한 후 4℃에서 5분간 인큐베이션 하였다. PCR은 cyclin D1 서열을 기준으로 3' 및 5' 프라이머들을 사용하여 30 사이클 동안 수행하였다(3분 동안 94℃에서 변성단계, 94℃에서 30초간 변성 과정, 94℃에서 30초간 어닐링 과정, 그 후 72℃에서 30초간 신장 과정이 35 사이클 돌아가도록 했고, 72℃에서 10분간 최종 신장 단계를 거치도록 함). RT-PCR 생성물은 1.2% 아가로즈 젤(BioRad)에서 전기영동으로 분리하였다. GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 내부 표준물질로 사용하였고, 증폭 산물의 신호 강도는 GAPDH의 것에 대해 표준화하였다.

(실시간 PCR)

전체 RNA는 TRIzol^®Reagent(Life technologies)를 사용해서 분리하였다. 10 ng의 정제된 RNA를 특정 microRNA에 작용하는 Taqman 프라이머와 결합하여 역전사(Taqman^®MicroRNA Reverse Transcriptase Kit, Applied Biosystems)하였고, 대조군으로 U6를 사용하였다. 특정 산물의 증폭과 검출은 Light Cycler 480 II(Roche)를 통해 95℃에서 10분, 95℃에서 15초 동안, 그리고 60℃에서 60초 동안 40회 사이클을 수행하였다. 각 표적 유전자의 역치 사이클(threshold cycle; Ct)을 정의, PCR의 선형적인 증폭단계에 도달, U6(ΔCt value) 값에 따라 계산하였다. 세포에서 각각의 microRNA의 발현 비율의 상대적인 차이(ΔΔCt)를 계산하여 2 ΔΔCt 값을 제시하였다.

(면역 블랏 분석)

세포는 PBS로 한번 세척하고, 20 mM Tris/HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 2.5 mM 소듐 파이로포스페이트(sodium pyrophosphate), 1 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM Na₃VO₄, 1 mg/mL 류펩틴 및 1 mM PMSF를 포함하는 라이시스 버퍼(Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA)를 사용하여 추출하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Thermo science)를 사용하여 정량하였다. 단백질은 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel로 분리시켜, 폴리비닐리덴 디-플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene di-fluoride membrane)(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 이동되도록 했다. 5 %(w/v) non-fat dried skimmed milk powder가 함유된 TBS-T(TBS-Tween 20; 0.1% Tween 20)로 멤브레인을 1시간 동안 실온에서 블로킹한 후, TBS-T로 두 번 세척하고 4℃에서 1시간 또는 오버나이트 동안 일차 항체를 붙였다. 이후, 멤브레인을 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하고, 1시간 동안 실온에서 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated secondary antibody와 함께 배양하였다. 여러 번 세척 후, 밴드는 ECL 웨스턴 검출 시약(Amersham Biosciences, Japan)를 사용하여 검출하였다. 밴드의 강도는 ImageJ를 사용하여 측정하였다. Cyclin D1(HD11)과 PCNA(PC10) 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.

(루시퍼라아제 활성 분석)

Cyclin D1의 예측 대상의 miRNAs는 공개적으로 사용가능한 public database(TargetScan, www.targetscan.org)을 이용하였다. 우선 miR-365의 예측 결합부위가 포함된 cyclin D1의 3’UTR 을 합성하였다. 해당 유전자를 pmirGLO vector(Promega)의 XhoI/XbaI site 내에 포함시켰다. 혈관평활근세포는 12 웰 플레이트에 1×10⁵씩 씨딩하였다. 24시간 후에, miRNA에 대한 cylin D1 결합부위가 포함된 pmirGLO 벡터를 miR-365 또는 대조군 miRNA와 함께 형질주입 되도록 하였다. 바다팬지의 루시퍼라아제(Renilla luciferase)를 표준화를 위해 사용하였다. 루시퍼라아제 반응은 24시간 뒤에, 제조회사의 지시대로 luminometer(Promega)를 사용하여 Dual Luciferase assay(Promega)로 측정하였다.

(손상-치유 분석)

VSMC는 6 웰 플레이트에 3×10⁵ cells/well의 밀집도로 배양하였다. 세포가 80% 정도를 차지하게 되면, 세포는 24시간 동안 혈청이 없는 상태를 유지하였고, 그 후에 세포 증식의 강력한 억제제인 mitomycin C (10 ㎍/mL, 배양 배지에 녹임)로 2시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 세포에 200 ㎕의 피펫 끝으로 손상을 입힌 뒤, 플레이트의 바닥에 펜으로 시작지점을 표시하였다. 배지를 혈청이 없는 배지가 함유된 PDGF-BB(20 ng/ml) 있거나 없이 교체하고, 세포를 16시간 동안 배양하였다. 이미지는 Powershot A640 digital camera(Canon)이 장착된 Axiovert 40C inverted microscope (Carl Zeiss)를 사용하여 촬영하였다.

(이동 분석)

혈관평활근세포(8×10³ cell/well)를 8 ㎛ 기공(Costar Corning)이 있는 트랜스웰 필터(Transwell filter)의 상부 챔버에 씨딩하고 10 ㎍/mL의 피브로넥틴으로 코팅하였다. 세포는 16 시간 동안 혈청을 박탈한 후, 자극적 매체 함유 PDGF(20 ng/mL)를 하부 챔버에 첨가하였다. 이후 트랜스웰 챔버를 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 필터의 하측에 균체를 hematoxylin 및 eosin(H&E)으로 염색하였다. 필터의 상부 측에 이동하지 않은(non-migration) 균체를 면봉으로 제거하였다.

(흰쥐의 경동맥 풍선 손상 모델)

풍선 손상은 Tulis DA.(Cardiovasc Res 95:517-526, 2007)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 졸레틸(20 mg/kg)과 롬펀(5 mg/kg)으로 마취한 후에, 왼쪽 경동맥 경부 정중선을 절개하여 노출되도록 했다. 좌경동맥의 근위부와 좌내경동맥의 근원 부위를 수술용 실을 이용하여 임시적으로 봉합하여, 풍선 카테타를 삽입하는 동안 과도하게 출혈이 일어나는 것을 막았다. 2-Fr Fogarty balloon catheter(Baxter Healthcare Corp., City, St-ate, Deerfield, IL, USA)를 삽입하기 위해, 외경동맥 혈관벽 부분을 제거하였다. 풍선 카테타를 삽입한 후에, 임시적으로 봉합해 놓은 좌경동맥의 근위부의 봉합을 풀어주고, 카테타를 대동맥이 흐르는 방향으로 접근시켜 놓았다. 그 다음 동맥 혈관 벽에 충분한 저항력을 가질 만큼 풍선을 팽창시켰다. 팽창된 풍선 카테타는 전체 경동맥 혈관 벽을 따라 전형적인 손상을 가하도록 끌어올려주었다. 이러한 과정은 혈관내막의 완벽한 노출을 위해 세 번 반복 후에, 카테타를 제거하고, 좌경동맥의 근위부를 봉합하였다. 같은 과정을 우경동맥에도 동일하게 수행하였다. 동물 연구에 대한 모든 실험 과정은 연세대학교 의과대학, 동물실험 윤리위원회에 의해 승인되었고, 동물 보호에 대한 규정과 가이드라인에 따라 수행되었다.

(올리고뉴클레오타이드의 혈관 벽으로의 국소 전달)

풍선 손상 후, miR-365 모방체와 N.C를 주입하기 위해서 Xiaojun Liu 등에 의해 기술된 대로(Liu, XJ et al. (2011). Journal of Biological Chemistry 286: 42371-42380), F-127 pluronic gel(Sigma)를 이용하여 국소 올리고뉴클레오타이드 전달 모델을 적용하였다. 우경동맥의 풍선 손상을 일으킨 후 즉시, miR-365 모방체와 N.C를 혼합한 형질주입 용액(Opti-MEM에 녹인 50 ㎕의 0.2 % 형질주입 시약) 경동맥의 절개된 부위에 30분 동안 흡수되도록 하였다. 그 다음에는 200 ㎕의 30 % F-127 pluronic gel과 1% 형질주입 시약을 4℃에서 미리 섞은 90 ㎍의 miR을 손상된 동맥의 외막 부위에 발라주었다.

(조직학적 분석)

신생내막 부위(neointimal area)를 측정하기 위해, 희생된 흰쥐로부터 대동맥을 절제하여, 혈액성분을 제거하기 위해 phosphate buffered saline(PBS)로 관류시킨 후, 4℃에서 24시간 동안 10 % 포르말린 용액으로 고정시켰다. 그 다음, 각기 다른 염색이 손상 부위의 조직에 고르게 염색되도록 하기 위해 조직을 젤라틴이 코팅된 유리 슬라이드에 부착시켰다. 조직의 파라핀을 제거한 뒤, 다시 수화시킨 뒤에, 신생 내막 부위를 측정하기 위해 hematoxylin & eosin(H&E)로 염색하여 NIH Image J software version 1.34e을 이용하여 정량화하였다. 콜라겐은 Masson's Trichrome staining을 이용하였다. 증식(proliferation)한 세포들은 PCNA에 의해 염색하였다. 간단히 설명하자면, 샘플을 2.5% normal horse serum으로 블로킹한 뒤에, 항-PCNA 항체로 인큐베이션 하였다. 그 다음에는 조직에 비오틴이 결합된 pan-특이 유니버셜 2차 항체(Biotinylated pan-specific universal secondary antibody)와 스트렙타비딘/페록시다아제 복합체 시약을 처리하였다. DAB 기질 키트를 사용하여 조직에 항체를 부착시켰다. 1% 메틸 그린으로 카운터염색을 한 뒤에, 100% N-부탄올, 에탄올, 자일렌으로 탈수시킨 뒤에, VectaMount Mounting Medium으로 마운팅(mounting) 하였다. 커버슬립을 각 조직의 위 부분에 올리고, 광학현미경으로 관찰하였다. 정량화를 위해서, 각 군에서 5개의 조직을 사용하였고, 각 조직의 슬라이스에서는 5개의 다른 영역을 선택하였다.

(통계학적 분석)

모든 실험은 세 번의 반복으로 수행하였다. 데이터는 평균±표준오차로 표현하였다. 두 가지 군의 통계적 분석은 t-test에 의해 추정되었다. 두 가지 군 이상의 경우는 Bonferroni test를 사용하여 one-way ANOVA로 완성하였다. P<0.05을 유의한 것으로 간주하였다.

본 발명자들은 microRNAs가 세포주기를 조절하여 혈관평활근세포의 증식을 억제한다는 가설을 검증하기 위해, 인 비보 흰쥐 경동맥 풍선 손상 모델(rat carotid balloon injury model)과 인 비트로에서 PDGF-BB를 처리한 VSMCs에서 microRNAs를 이용하여 세포주기 중 G1/S기 특이적인 cyclin D1의 발현을 조절하고자 하였다. Cyclin D1은 경동맥 손상 후의 혈관평활근세포의 증식과 혈관내막의 증식에 중요한 인자로 알려져 있다. Cyclin D1에 의한 혈관평활근세포의 증식을 조절하는 microRNAs를 찾기 위해, 표적 microRNA를 예측해주는 프로그램인 TargetScan (www.targetscan.org)을 이용하였다. 총 58개의 cyclin D1을 표적으로 하는 microRNAs 중에서, 정상 쥐 경동맥에서 많이 발현되고, 경동맥 풍선 손상 모델에서 많이 감소하는 miR-23a/b, miR-103, miR-107, miR-365를 선별하였다(도 1A). 선별된 4개의 microRNAs 중에서, miR-365가 PDGF-BB에 의한 혈관평활근 세포의 증식 억제 효과가 가장 뛰어났다(도 1B). 혈관평활근세포 내에서 miR-365의 발현은 PDGF-BB 처리 시간과 농도에 따라 감소하였다(도 1C 및 D). 또한, PDGF-BB 외 혈관평활근세포의 증식에 영향을 주는 10% 혈청과 안지오텐신 II(Ang II)에 의해서도 miR-365의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 1E).

따라서, miR-365는 다양한 혈관평활근세포의 증식 유도제에 의한 혈관평활근세포의 증식 과정에서 발현이 감소한다는 것을 알 수 있었다.

miR-365의 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위해, miR-365 모방체를 혈관평활근세포에 주입하여 세포 내 miR-365의 발현을 높여주었다(도 2A). 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석을 통해, miR-365와 cyclin D1 mRNA의 3’UTR이 동시에 존재할 때 루시퍼라아제 발현이 감소하는 것을 확인함으로써 miR-365가 cyclin D1 mRNA의 3’UTR 부분에 직접적으로 결합함을 검증하였다(도 2B). 혈관평활근세포에 PDGF-BB를 처리하면, cyclin D1의 mRNA와 단백질 발현이 모두 증가하지만, miR-365에 의해 cyclin D1의 단백질 발현만 감소하고 mRNA는 영향이 없음을 확인함으로써, cyclin D1이 miR-365의 기능적 표적 유전자(functional target gene)임을 검증하였다(도 2C 및 D).

PDGF-BB, 10% 혈청, Ang II에 의한 혈관평활근세포의 증식은 miR-365에 의해 억제되는 것을 확인하였다(도 3A-C). 세포의 사멸을 확인할 수 있는 인자인 증식세포핵항원(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)은 PDGF-BB에 의해 혈관평활근세포가 증식하면 증가하는 반면 miR-365에 의해 감소되는 것을 볼 수 있었고(도 3D), 세포주기를 분석해 본 결과 PDGF-BB에 의해 감소된 G0/G1기와 증가된 S기는 miR-365에 의해 G0/G1기는 증가하고 S기는 감소하여 정상 상태의 세포주기와 비슷해짐을 확인할 수 있었다(도 3E).

따라서 miR-365는 PDGF-BB에 의한 세포주기 진행에서 G1기에서 S기로 이행되는 과정에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

PDGF-BB는 세포 증식의 성장인자로 잘 알려져 있을 뿐만 아니라, 혈관손상 시 나타나는 중막(media)에서 내막(intima)으로의 세포이동에도 중요한 인자이다. 따라서, miR-365가 이러한 세포 이동 억제효과도 있는지 확인하기 위해, 보이덴 챔버 분석(도 4A)와 손상-치유 분석(도 4B)를 수행하였다. 결론적으로, PDGF-BB에 의해 증가된 혈관평활근세포의 이동은 miR-365에 의해 억제되는 것을 확인하였다.

또한, 쥐 경동맥 풍선 손상 후 7일째 조직에서 miR-365의 발현이 감소하고(도 5A), 혈관평활근세포의 증식으로 혈관내막 형성이 촉진되는 것을 확인하였다(도 5B 및 C). miR-365를 손상된 혈관에 F-127 pluronic gel을 이용해서 국소적으로 넣어주면 혈관내막 형성이 억제되는 것을 확인하였고, 증식세포핵항원도 감소하는 것을 알 수 있었다(도 5D).

상기 실험 결과, miR-365는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현을 조절하여 PDGF-BB에 의한 혈관평활근세포의 증식과 이동을 억제하여 혈관 손상 시 혈관내막형성을 억제하는 역할을 함을 알 수 있었다. 이러한 이유로 PDGF-BB, 혈청, Ang II와 같은 성장인자의 자극이나 혈관 손상이 생겼을 때 miR-365의 발현이 감소됨으로 인해 세포주기가 활성화되어 혈관평활근세포의 증식과 이동이 증가하게 되는 것으로 사료된다(도 5E).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Pharmaceutical composition for inhibiting proliferation or migration of vascular smooth muscle cell comprising microRNA-365 activators <130> P130955 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> miR-365 <400> 1 uaaugccccu aaaaauccuu au 22

Claims (12)

1. microRNA-365를 포함하는 시험관내 혈관평활근세포의 증식 또는 이동 억제용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   microRNA-365는 이를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 형태로 포함되거나 비바이러스성 전달체와 함께 포함되는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   microRNA-365는 세포주기의 G1/S기에서 cyclin D1의 발현을 억제하여 혈관평활근세포의 증식과 이동을 억제하는 것인 조성물.
   
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