KR101757806B1

KR101757806B1 - microRNA-182 및 Bnip3의 발현 수준을 이용한 허혈성 심장 질환의 진단정보 제공방법

Info

Publication number: KR101757806B1
Application number: KR1020140071090A
Authority: KR
Inventors: 황기철
Original assignee: 가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2017-07-27
Also published as: KR20150142826A

Abstract

본 발명은 microRNA-182를 포함하는 허혈성 심장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, microRNA-182는 Bnip3의 발현을 억제하여 허혈성 심근세포의 사멸을 억제하여 허혈성 심장 질환을 예방, 진단, 또는 치료하는데 사용할 수 있다.

Description

microRNA-182 및 Bnip3의 발현 수준을 이용한 허혈성 심장 질환의 진단정보 제공방법{Diagnostic information provision of ischemic heart disease using expression level of microRNA-182 and Bnip3}

본 발명은 허혈성 심근세포의 사멸을 억제하는 microRNA-182의 약제학적 용도에 관한 것이다.

심근세포는 많은 에너지를 필요로 하는 기관으로, 심근세포 내 미토콘드리아는 다른 기관에 비해 체적 밀도가 매우 높다. 미토콘드리아는 에너지를 생산하는 세포 내 소기관이자 세포사멸을 조절하는 기관이기도 하다. Bcl-2 단백질은 anti- 또는 pro-apoptotic 역할 모두 관여하며, 미토콘드리아 세포막 투과성을 조절한다. 이러한 변화는 세포 내 환경 변화에 따라 반응하여 조절된다. Anti-apoptotic 단백질은 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1 등이 있으며 미토콘드리아를 정상상태로 유지한다. 반면에 pro-apoptotic 단백질은 미토콘드리아로부터 pro-death 단백질을 분비하도록 하여 세포사멸을 유도한다. Pro-apoptotic 단백질은 Bid, Bad, Bim과 같은 BH3-only 단백질과 그들의 effector인 Bax, Bak 이 있다. DNA 손상, 영양분 결핍, 저산소증과 같은 스트레스가 세포에 전해지면 BH3-only 단백질이 활성화 되고 Bax, Bak의 발현이 증가된다 (비특허문헌 1).

Bnip3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kilodalton interacting protein)는 pro-apoptotic BH3-only 단백질로, 심부전 및 암과 같은 다양한 질병의 발병에 중요한 역할을 한다(비특허문헌 2).

Bnip3는 대부분의 정상세포에서는 발현이 억제되어있다가 저산소증이나 허혈 상태와 같은 상황에 놓이면 발현이 증가된다. Bnip3은 pro-apoptotic protein인 Bax, Bak의 알로스테릭 부위(allosteric activator)로 mitochondrial dysfunction와 세포 사멸에 관여하는데, 상기 Bnip3의 발현 증가는 Bax/Bak을 활성화 시키고, anti-apoptotic Bcl-2, Bcl-X_L와 결합한다. 또한 mPTP(mitochondrialpermeability transition pore)를 열어서 미토콘드리아 기능장애를 유발하고 최종적으로 세포사멸을 유도한다(비특허문헌 3). 따라서, 허혈성 심근세포에서 Bnip3의 발현을 억제하면 심근세포의 사멸을 저해하여 조직괴사를 막을 수 있고, 심장기능 상실도 예방할 수 있다.

허혈성 심장에 관여하는 microRNA와 작용기전에 대한 연구가 진행되고 있으나, Bnip3에 관련한 microRNA는 거의 밝혀지지 않았다. 또한, 허혈성 심장 질환에 사용하는 약물이나 현재 개발중인 약물의 Bnip3의 발현 조절에 대한 연구는 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자는 허혈성 심근세포의 세포사멸을 유도하는 Bnip3를 타겟하는 microRNA를 스크리닝을 통해 선별하여 저산소증과 같은 허혈 유사조건에서 심근세포의 세포사멸이 억제됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. Gustafsson AB et al.,Am J Physiol Cell Physiol2006;292:C45-C51 2. Regula KMet al.,Circ Res 2002;91:226-231; Yussman MG et al., Nat Med 2002;8:725-730 3. Hamacher-Brady A et al.,Cell Death Differ 2007;14:146-157; Regula KMet al., Circ Res 2002;91:226-231

또한, 본 발명의 다른 목적은 허혈성 심장 질환을 예방, 진단 또는 치료하기 위한 microRNA-182의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 microRNA-182를 포함하는 허혈성 심장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 microRNA-182는 이를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 형태로 포함되거나 비바이러스성 전달체와 함께 제공될 수 있다.

상기 microRNA-182는 Bnip3의 발현을 억제하여 허혈성 심근세포의 사멸을 억제하는 것을 특징으로 한다.

허혈성 심장 질환은 협심증, 심근경색증 또는 심장마비일 수 있으며, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 microRNA-182의 검출을 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 허혈성 심장 질환의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 생물학적 시료에서 microRNA-182의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 시료에서 대조군에 비하여 microRNA-182의 발현 수준이 감소하면 허혈성 심장 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 허혈성 심장 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 생물학적 시료에서 Bnip3의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가하는지를 추가로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 microRNA-182 및/또는 Bnip3의 발현 수준은 실시간 RT-PCR 또는 면역 블랏팅에 의해 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 microRNA-182의 발현 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 세포에서 microRNA-182의 발현을 분석하고, 시험물질이 대조군에 비하여 microRNA-182의 발현을 증가시키면, 허혈성 심장 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는 허혈성 심장 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 microRNA-182의 발현 세포에서 시험물질이 대조군에 비하여 Bnip3의 발현을 감소시키는지를 추가로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 microRNA-182를 활성화하여 허혈성 심근세포의 사멸을 억제할 수 있으며, 바이오마커로서 mciroRNA-182의 발현 변화를 측정하여 허혈성 심장 질환의 발병 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 질환을 예방 및 치료하기 위한 새로운 치료제 개발에 적용 가능하다.

도 1은 저산소 조건(1% O₂)의 심근세포에서 microRNAs의 Bnip3 발현을 나태낸 그래프 및 western blot 결과이다.
도 2는 저산소 조건의 심근세포에서 시간에 따른 microRNA-182의 발현량을 나타내는 그래프(왼쪽 그래프) 및 시간에 따른 Bnip3의 발현량을 나타내는 그래프와 western blot 결과이다.
도 3은 microRNA-182의 미토콘드리아 세포막에서의 Bnip3 발현 억제 효과를 나타내는 그래프 및 western blot 결과이다.
도 4는 저산소 조건에서 심근세포의 생존 정도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 미토콘드리아를 통해 다양한 조건에서 세포사멸에 관여하는 단백질들의 발현 변화를 나타내는 그래프 및 western blot 결과이다.
도 6은 도 5의 조건에서 미토콘드리아를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 I/R 모델 조직에서 microRNA-182의 발현변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 I/R 모델 조직에서 micorRNA-182가 심장 기능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

허혈성 심장에 관여하는 microRNA의 작용기전에 대한 연구가 진행되고 있으나 Bnip3에 관련한 microRNA는 거의 밝혀지지 않았다. 또한, 허혈성 심장 질환에 사용하는 약물이나 현재 개발 중인 약물의 Bnip3의 발현 조절에 대한 연구는 알려진 바가 없다. 따라서 본 발명자들은 새로운 분자표적치료(molecular therapy) 방법으로 허혈성 심근세포의 사멸에 관련된 Bnip3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kilodalton interacting protein)의 발현과 활성을 microRNA-182를 통해 억제시킴으로써, 인 비트로, 엑스 비보, 인 비보 실험을 통해 허혈성 심근세포의 리모델링에 긍정적이고 효과적인 치료 효과를 입증하였다.

이와 같이, 본 발명은 microRNA-182를 활성화하여 허혈성 심근세포의 사멸을 억제할 수 있고, 바이오마커로서 microRNA-182의 발현 변화를 측정하여 허혈성 심장 질환의 발병 여부를 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 microRNA-182를 포함하는 허혈성 심장 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

명세서에서, 용어 “microRNA(또는 miRNA, miR이라 함)”는 21-25 nt의 단일 가닥 RNA 분자로서 mRNA의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질이다[Bartel DP et al., Cell. 2004.01.23;116(2):281-297]. miRNA의 생성은 Drosha(RNaseⅢ type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 microRNA(premicroRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 microRNA로 만들어진다[Kim VN et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. 05.;6(5):376-385]. 상술한 바와 같이 제조된 microRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다[WienholdsE et al.,Science, 309(5732): 310-311(2005); Nelson P et al., Trends BiochemSci., 28: 534-540(2003); Lee RC et al., Cell, 75: 843-854(1993); 및 Esquela-Kerscher A et al., Nat Rev Cancer. 6: 259-269(2006)].

본 발명의 microRNA-182는 SEQ ID NO.:1에 기재되어 있으며, 단일 가닥 분자인 microRNA-182의 성숙한 형태로써, 이중 가닥 부분을 형성할 수 있는 자가-상보적인 분자 즉 스템-루프 구조일 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태 발명에서 사용되는 microRNA-182의 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단이 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3’말단 쪽이 돌출(overhang)한 구조와 5’ 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하다. 돌출하는 뉴클레오타이드 수는 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-182는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막고 생체 내 안정성을 높이기 위해 당 업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 당(ribose ring)의 2’-위치의 수산기를 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 수식하거나 (이때 R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬기, R'은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬렌일 수 있다), 인산 백본을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트, 또는 보라노포스페이트 등으로 수식할 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 본 발명 miRNA-182는 이의 활성을 저하하지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함한다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-182는 기본적으로 두 가닥의 RNA가 쌍을 이루어 이중가닥을 형성하는 완전한 형태, 즉 인비트로에서 microRNA를 직접 합성한 뒤 형질주입(transfection)을 통해 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 플라스미드계 pre-microRNA 벡터와 PCR-유도 miRNA 발현 카세트 등에 의한 형질주입에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-182를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002), 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR et al., Science 296:550-553, 2002), 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 RNaseⅢ 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 microRNA-182는 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체(바이러스성 또는 비바이러스성 전달체)와 복합체 형태로 포함될 수 있다. 예컨대, microRNA-182를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 포함될 수 있다. 이를 위하여 사용 가능한 플라스미드로는 예를 들어, pSilencer (Ambion), pSiEx (Novagen), siXpress (Takara Bio), pBLOCK-iT™(Invitrogen), pcDNA3.1(Invitrogen), pCEP4(Invitrogen), SilenCircle™ (Allele), 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 바이러스성 전달체로 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, EB 바이러스 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 포오미바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 또한, 비바이러스성 전달체로서, 전달 시약으로 Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), G-fectin, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 마이셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀, 리간드-DNA 복합체, 유전자총(genegun)이 사용될 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 리포좀의 형태로서는 양친매성 제제(amphipathic agent), 예를 들어 마이셀, 불용성 단일층, 액정, 또는 수용액에 존재하는 라멜라층으로 존재하는 지질과 조합된다. 리포좀 제형을 위한 지질은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 레시틴 인지질, 사포닌, 담즙산, 리포펙틴 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

또한 microRNA-182의 체내 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시키는 등 당업계에 알려진 일반적인 리보핵산 세포 내 전달 기술을 이용하도록 제제화될 수 있다. 또한 전기천 공법(electroporation)에 의해 세포를 microRNA가 든 용액에 현탁하여 직류 고전압의 펄스를 통과시켜 세포내로 도입되게 하는 방법도 포함한다. 생체에는 microRNA가 든 용액을 원하는 부위에 투여하고 전극을 통해 직류전압을 펄스로 주어 세포로 도입되게 할 수 있다.

본 발명의 microRNA-182는 허혈성 심근세포 사멸 억제 활성을 가지므로, 상기 허혈성 심근세포의 사멸이 억제되어야 하는 필요가 있는 다양한 분야, 구체적으로 허혈성 심장 질환에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 허혈 상태와 유사한 저산소 조건(1% O₂)에서 심근세포에서는 Bnip3의 발현이 증가되는데, microRNA-182를 형질주입(transfection)한 심근세포에서는 저산소 조건임에도 불구하고 Bnip3의 발현을 정상레벨 가까이 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 즉, 저산소 조건의 심근세포에서 microRNA-182의 발현은 Bnip3의 발현을 억제하였다. 또한, 세포 사멸에 관여하는 단백질인 Cleaved caspase-3, Bax, Bak, 및 미토콘드리아로부터 분비되는 cytochrome C에 microRNA-182를 transfecion하면, 세포사멸을 억제하는 신호전달이 나타나 Cleaved caspase-3이 감소하고, Bax 및 Bak 발현 역시 감소하며, 미토콘드리아로부터 분비되는 cytochrome C의 양도 감소하는 특성을 나타냈다. 또한, 허혈 심장 상태로 만들어주는 ischemia-reperfusion(I/R) injury 모델 조직에서의 microRNA-182의 발현 변화를 살펴본 결과, 저산소 상태와 유사한 I/R 모델에서 세포 내 microRNA-182의 발현이 감소되었으며, microRNA-182를 형질주입(transfection)하면 허혈 심장에서의 기능이 정상 심장과 가까운 상태로 변화하였다.

결론적으로, microRNA-182는 심근세포에 oxidative stress가 주어졌을 때 발현되는 pro-apoptotic 단백질인 Bnip3의 발현을 억제하여 미토콘드리아를 매개로 유도되는 세포 사멸기전을 저해할 뿐만 아니라, 심장 기능 악화를 막는 역할을 가지고 있으므로, 손상 또는 자극으로 인한 허혈성 심장세포의 손실 및 심장기능 악화의 새로운 치료 표적으로서의 잠재적인 가능성이 있다.

본 명세서에서, 허혈은 조직, 장기의 산소수용에 대해 그 공급원인 혈류가 절대적 또는 상대적으로 부족한 상태를 의미하며, 허혈에 의해 저산소(hypoxia) 상태가 발생할 수 있다.

본 명세서에서, 허혈성 심장 질환은 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 막혀 주위조직이 괴사되어 발생된다. 이러한 괴사의 주 원인은 세포사멸(apoptosis)이며, 허혈 조건에서 세포사멸을 억제하면 세포 생존력이 개선되어 치료효과를 높일 수 있다.

본 발명에서의 허혈성 심장 질환은 협심증, 심근경색증 또는 심장마비 등이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제형 제조에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 microRNA-182의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 microRNA-182의 검출을 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 허혈성 심장 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.

쥐의 허혈성 심근세포에서 microRNA-182의 발현이 감소될 수 있다. 따라서, microRNA-182의 발현 수준을 측정하는 것은 허혈성 심장 질환의 발병 여부를 판단할 수 있다.

상기 miRNA-182 및/또는 Bnip3의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 실시간 RT-PCR 또는 면역 블랏팅에 의해 측정하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적 시료에서 microRNA-182의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 시료에서 대조군에 비하여 microRNA-182의 발현 수준이 감소하면 허혈성 심장 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 허혈성 심장 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.

생물학적 시료는 인간을 포함한 포유류인 것이 좋으나, 이에 한정하지는 않는다. 예컨대, 생물학적 시료는 체세포인 것이 바람직하고, 허혈성 심근세포 또는 조직인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 방법은 생물학적 시료에서 Bnip3의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가하는지를 추가로 판정하는 단계를 더 포함하여 진단의 정확도를 높일 수 있다.

본 발명의 방법에서, microRNA-182 및/또는 Bnip3의 발현 수준은 실시간 RT-PCR 또는 면역 블랏팅에 의해 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

본 발명은 또한, microRNA-182 발현 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 세포에서 microRNA-182의 발현을 분석하고, 시험물질이 대조군에 비하여 microRNA-182의 발현을 증가시키면 허혈성 심장 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는 허혈성 심장 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기 스크리닝은 microRNA-182 인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시킨다. microRNA-182 인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 허혈성 심근세포일 수 있다.

본 발명에서 시험물질은 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 microRNA-182의 발현량을 측정한다. 측정 결과, 본 발명의 microRNA-182의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 증가되면 상기 시험물질은 허혈성 심장 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

추가로 microRNA-182의 타겟인 Bnip3의 발현량을 측정하여 시험물질이 대조군에 비하여 Bnip3의 발현을 감소시키는지를 판단하여 상기 시험물질은 허혈성 심장 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

microRNA-182 및 Bnip3의 발현량의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR, 노던 블롯팅, cDNA 마이크로어레이를이용한 혼성화 반응 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응 등을 이용하여 실시할 수 있다.

이와 같은 허혈성 심장 질환의 치료제 후보물질은 이후의 혈관평활근세포 이상 증식 또는 이동 질환 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 microRNA-182 또는 Bnip3 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 촉진 또는 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 허혈성 심장 질환 치료제를 개발할 수 있다.

본 발명에서는 예를 들어, 허혈성 심장 질환의 예방 또는 치료용 물질로 켄파울론(kenpaullone) 등을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실시예 1> 심근세포에서 microRNA의 약제학적 용도

(쥐의 심실 심근세포의 분리 및 배양)

동물 연구에 대한 모든 실험 과정은 연세대학교 의과대학 및 동물실험 윤리위원회에 의해 승인되었고, 동물 보호에 대한 규정과 가이드라인에 따라 수행되었다(NIH Publication No. 85-23, revised 1996). 태어난지 1-2일 된 Sprague Dawley rat pups의 가슴을 절개하여 심실을 분리한 후, Dulbeccos phosphate-buffered saline solution(pH 7.4, Gibco BRL, lacking Ca² ⁺and Mg² ⁺)으로 세척하였다. 해부용 가위를 사용하여 분리한 심장을 1mm³ 이하로 잘게 다진 뒤, 10 ml의 collagenase II (0.8mg/ml, 262units/mg, Gibco BRL)를 37℃에서 5분간 처리하였다. 상등액(Supernatant)은 제거하고, 조직으로부터 분리된 세포는 다시 한 번 collagenase II용액으로 5분간 처리하였다. 상등액(Supernatant)에 존재하는 세포를 cell culture medium(α-MEM containing 10% fetal bovine serum, Gibco BRL)이 든 튜브에 옮겨 담고, 1200rpm에서 4분간 원심분리 한 뒤 얻어진 cell pellets을 5 ml cell culture medium으로 현탁하였다. 이 과정은 조직이 거의 남아있지 않을 때까지 7-9번 반복하였다. 세포현탁액은 모아서 100 mm tissue culture dishes에 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1-3시간 배양하여 fibroblast를 최대한 제거하였다. Non-adherent cells을 모아서 최종적으로 5 x 10⁵cells/ml가 되게 분주하였다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4-6시간 배양 후, 세포를 cell culture medium으로 2번 세척한 뒤, 0.1 μM BrdU를 넣은 다음, 10% (v/v) FBS를 넣고 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

(면역 블랏 분석)

세포들을 모은 다음 PBS로 세척해 준 뒤, 1X lysis buffer(1X lysis buffer; 20 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 250 mM sucrose, 0.1 mM PMSF, 1 mM dithiothreitol, 4 ㎍/ml pepstatin, 4 ㎍/ml leupeptin, 5 ㎍/mL aprotinin)로 suspension시켜 4℃에서 10분간 용해시켰다. 750 g, 4℃에서 10 분간 원심분리 후, 상등액을 10,000g, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 상등액을 분리하여 BCA protein assay reagent(Thermo Scientific)로 정량하며, 동량의 protein을 크기에 맞게 8~15% SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis; Qbiogene)에 loading 후 전기영동하였다. 원하는 크기의 gel을 자른 후 polyvinyldifluoride (PVDF; Millipore) transfer membrane과 transfer buffer(20 mMTrizma® base; Sigma, 190 mM Glycine; Sigma, 20% Methanol; Duksan)를 사용하여 단백질을 이동, 고정시켰다. 전기 이동된 membrane은 10% DifcoTM skim milk(BD)와 TBS-t(1X TBS, 0.1% tween-20)를 혼합한 blocking buffer에서 1시간 반응시키고, 원하는 1차 항체를 넣어 2시간~overnight 반응시켰다. TBS-t로 3번 세척하고 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체(goat anti-mouse and goat anti-rabbit IgG-peroxidases)를 넣어 1시간 반응 시켰다. 반응이 끝나면 TBS-t로 5번 세척하고 Enhanced chemiluminescence plus western blotting system(ECL; Amersham Biosciences)을 이용하여 발광시킨 후 암실에서 HyperfilmTM ECL (Amersham Biosciences)로 밴드를 확인하였다. 밴드 intensity는 NIH ImageJ version 1.34e software로 측정하였다.

(real-time PCT)

전체 RNA는 TRIzol Reagent(Life technologies)를 사용해서 분리하였다. 10 ng의 정제된 RNA를 특정 microRNA에 작용하는 Taqman 프라이머와 결합하여 역전사(Taqman MicroRNA Reverse Transcriptase Kit, Applied Biosystems)하였고, 대조군으로 U6를 사용하였다. 특정 산물의 증폭과 검출은 Light Cycler 480 II(Roche)를 통해 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 그리고 60℃에서 60초 동안 40 회 사이클을 수행하였다. 각 표적 유전자의 역치 사이클(threshold cycle; Ct)을 정의, PCR의 선형적인 증폭단계에 도달, U6(ΔCt value) 값에 따라 계산하였다. 세포에서 각각의 microRNA의 발현 비율의 상대적인 차이(ΔΔCt)를 계산하여 2^ΔΔCt 값을 제시하였다.

(microRNA 형질주입(transfection))

microRNA mimic 형질주입(transfection)은 siLentFect™ Lipid reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. microRNA mimic과 대조군(Genolution Pharmaceuticals, Inc., Korea)은 최종적으로 100 nM을 사용. 37°C CO₂배양기에서 4~6시간 동안 배양한 후에, 배지를 배양배지로 갈아주고 계속해서 배양하였다.

(생존 세포 계수)

심근세포에 microRNA-182를 형질주입(transfection) 하고, 저산소 상태에서 24시간 배양한 한 뒤, trypsin을 처리해서 살아있는 세포를 수확한 뒤 cell counting을 하였다.

(미토콘드리아 모폴러지(Morphology))

미토콘드리아 형태변화를 확인하기 위해 Mitotracker staining(Mitotracker Red CMXRos, Invitrogen)을 사용하였다. 10% conditioned 배양액에 200 nM Mitotracker를 넣은 뒤, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30 분 동안 심근세포를 배양한 뒤, 따뜻한 fresh 배지로 세척해주었다. 세포를 4% formaldehyde solution으로 10 분 동안 고정하고 PBS로 3번 세척하였다. Confocal laser scanning microscope(LSM 700, Zeiss)를 사용해서 visualization하여 fluorescence intensity를 확인하였다.

(Ischemia-reperfusion(I/R) injury model)

동물 연구에 대한 모든 실험 과정은 연세대학교 의과대학 및 동물실험 윤리위원회에 의해 승인되었고, 동물 보호에 대한 규정과 가이드라인에 따라 수행되었다. 8주령이 된 Sprague Dawley 수컷 쥐(약 250g)를 졸레틸:xylazine ＝ 4:1로 1cc 준비하여 한 마리당 0.25 cc씩 둔부에 주사하여 마취시켰다(10 분 정도 경과 후 발바닥을 자극하여 반응 살핌). 마취 된 쥐의 기도에 관을 삽입하고 양성 압력 순환(180ml/min)을 Havard ventilator를 사용하여 산소(2L/min)가 첨가된 실내 공기에 의해 유지하였다. 멸균된 거즈를 이용하여 쥐의 가슴에 포비돈을 충분히 바른 후 쥐의 피부 표피와 가슴근육을 박리하고(가슴 가운데를 중심으로), 가슴 뼈를 자랐다(이때 정가운데로 자르도록 했다). 개흉한 후, 흉부(심장을 중심으로)를 감싸고 있는 내피 막을 제거 한 후, 심장의 좌전 하행 지 관상동맥을 찾았다(심방으로부터 내려오는 혈관 중, 가장 위의 혈관이 2~3가지로 나눠 지며, 나눠 지는 혈관 중 좌측의 혈관을 찾았다). 좌전 하행 지를 6-0 비단 봉합실로 묶었다(혈관 결찰 부분을 너무 깊거나 넓게 잡지 않도록 주의했다. 혈관이 가운데 오도록 묶었다). 60 분 후 실을 다시 풀어 재관류를 하였다. 4-0 봉합 실을 이용하여 가슴 뼈 근육과 표피를 수초하였다. 3~5일간 사육실에서 정상적인 환경으로 키운 뒤 실험에 사용하였다.

(Millar catheterization)

I/R injury 후 3주 뒤, 졸레틸(50 mg/kg)과 xylazine(10 mg/kg)를 4:1 로 혼합한 마취제를 쥐의 대퇴부에 주사하여 마취시킨 후, 수술 부위 확보를 위해 제모를 실시하였다. 피부를 턱 아래부터 쇄골까지 가운데를 따라 절개 후 주변 지방 조직과 근육을 절개하고, 오른쪽 경동맥을 millar 카테터 센서의 길이보다 좀 더 길게 박리하였다(이 때 호흡기관 곁을 지나고 있는 경동맥과 미주신경이 손상을 입지 않게 조심하였다). Proximal과 distal을 결찰하고, micro-scissor를 이용하여 distal 부위를 절개한 후, microsurgery curved forcep을 사용하여 절개부위를 확대하여 카테터를 삽입하고 결찰하였다. 삽입한 카테터를 조심스럽게 좌심실로 밀어 넣고, 압력-용적(P-V) 곡선이 나타나는지 확인하고 압력 및 용적 수치가 안정화 될 때까지 10~30분 정도 데이터를 녹화 후 종료하였다. 혈압 보정을 위하여 20% 나트륨, 고장 염수 50 ㎕를 정맥 주입하여 증가하는 용적의 증가비율을 측정하고 복부대정맥을 폐쇄하여 줄어들었다 다시 증가하는 압력-용적의 기울기를 측정하였다. Blood volume calibration cuvette (product# 910-1048)을 이용하여 2-6번의 well 에 혈액을 정격용량에 맞추어넣은 후 제조사의 정보에 따라 slop, Y-intercept 그리고 Vp 값을 얻어 혈액 용적을 측정하였다. 모든 데이터는 PVAN 3.5 software (Millar)로 분석하였다.

(Local oligonucleotide delivery into left ventricle of heart)

microRNA-182를 심장 조직에 주입하기 위해, F-127 pluronic gel (Sigma)을 이용하여 local oligonucleotide delivery model을 만들었다. 4℃에서 200 ㎕의 30% F-127 pluronic gel과 1% 형질주입(transfection) reagent와 90 ㎍의 microNA-182를 혼합하여 I/R injury를 일으킨 후, left ventricle에 발라주었다. 30분 뒤 가슴 뼈 근육과 표피를 수초하였다.

(통계학적 분석)

모든 실험은 세 번의 반복으로 수행하였다. 데이터는 평균 평균±표준오차로 표현하였다. 두 가지 군의 통계적 분석은 t-test에 의해 추정되었다. 두 가지 군 이상의 경우는 Bonferroni test를 사용하여 one-way ANOVA로 완성하였다. P<0.05을 유의한 것으로 간주하였다.

허혈성 심근세포에 관련있는 microRNA를 선별하기 위해, 심근세포에 다양한 microRNA를 형질주입(transfection) 한 뒤, 저산소 조건(1% O₂)에서 Bnip3을 발현을 western blot을 통해 확인하였다. MicorRNA-182를 형질주입(transfection) 한 심근세포에서 저산소 조건임에도 불구하고 Bnip3의 발현을 정상레벨 가까이 억제하는 효과를 보여주었다(도 1).

또한, 저산소 조건의 심근세포에서 시간이 경과할 수록 microRNA-182의 발현이 감소하는 경향을 보이는 것을 real-time PCR을 통해 확인하였으며, Bnip3의 발현은 점점 증가하는 것을 western blot을 통해 확인하였다(도 2). 이에 의해, microRNA-182의 발현은 Bnip3의 발현과 음의 상관관계를 가지는 것을 보여주었다.

Bnip3이 발현되면 미토콘드리아 세포막에 존재한다. microRNA-182의 미토콘드리아 세포막에서의 Bnip3 발현억제 효과를 확인하기 위해, 저산소 상태에서 심근세포에 microRNA-182fmf 형질주입(transfection)하여 microRNA-182의 발현을 높여주었다. 미토콘드리아 분리 키트(Mitochondria isolation kit for cultured cells, Thermo Scientific, Product # 89874)를 사용하여 미토콘드리아와 세포질을 따로 분리한 뒤, western blot을 시행하였다. 실험 결과, 세포질에는 Bnip3가 존재하지 않고, 미토콘드리아에만 Bnip3가 저산소 상태에서만 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, microRNA-182를 형질주입(transfection)한 심근세포에서는 Bnip3의 발현이 감소되는 것을 알 수 있었다(도 3).

저산소 조건에서 심근세포의 생존 정도를 확인하였다. 정상 상태보다 저산소 조건에서 생존하는 세포의 수가 1/3로 감소하지만 microRNA-182를 형질주입(transfection)한 조건에서는 저산소 상태임에도 불구하고 정상 상태의 세포와 거의 비슷한 세포가 생존하고 있음을 알 수 있었다. 따라서, microRNA182는 저산소와 같은 산화 스트레스에 의한 미토콘드리아 Bnip3의 발현을 저해하여 세포사멸을 억제하는 효과를 가짐을 알 수 있었다(도 4).

미토콘드리아를 통한 세포사멸에 관여하는 단백질들의 변화를 살펴보았다. 저산소 조건에서는 세포사멸기전이 활성화되기 때문에 cleaved caspase-3와 Bax, Bak의 발현이 높아지고, 미토콘드리아로부터 cytochrome C가 세포질로 대량 분비됨을 확인할 수 있었다. 그러나, microRNA-182를 형질주입(transfection)하면 세포사멸이 억제하는 신호전달이 나타나 cleaved caspase-3이 감소하고, Bax, Bak의 발현 역시 감소하며, 미토콘드리아에서 분비되는 cytochrome C의 양도 감소하는 것을 알 수 있었다. microRNA-182에 의한 Bnip3의 발현 감소는 Bnip3의 하위 신호전달 단백질인 Bax, Bak의 발현과 세포사멸 기작에 중요한 cleaved caspase-3와 미토콘드리아로부터 세포질로 cytochrome C의 분비감소를 유도하여 세포사멸을 억제한다(도 5).

살아있는 세포에서 미토콘드리아는 관상의 네트워크를 형성하고 있으며, 분열(fission)과 융합(fusion)의 균형에 의해 모양과 수를 유지한다. 세포사멸노화, 발생과정 등을 포함한 세포의 운명 결정 단계에서 미토콘드리아는 특이적인 형태를 띄고 있으며, 이러한 미토콘드리아의 형태조절은 외부환경의 변화에 대한 세포의 반응, 그리고 세포의 항상성 유지와 밀접하게 연관되어 있다(van der Bliek AM et al.,Cold Spring HarbPerspect Biol. 2013;5(6). pii: a011072). 발병 등으로 인해 미토콘드리아에 세포사멸 신호가 전달되면, 관상의 네트워크가 재 배열되면서 분열에 관여하는 단백질의 발현이 높아지며, 이 단백질들의 재배열에 의해 미토콘드리아가 서로 분리되면서 점 형태를 띠게 된다. 심근세포를 저산소 상태에 두면 미토콘드리아 분열이 나타나 형광현미경으로 관찰하면 점형태의 미토콘드리아가 관찰되는데, 이와 달리 anti-apoptotic 효과를 나타내는 microRNA-182를 형질주입(transfection)한 세포에서는 저산소 상태에 있어도 정상 상태의 미토콘드리아처럼 관상 형태를 유지하고 있음을 알 수 있었다(도 6).

In vivo에서의 microRNA-182의 효과를 확인하기 위해, 허혈 심장 상태를 만들어주는 ischemia-reperfusion(I/R) injury 모델을 사용하였다. I/R 모델 조직에서의 microRNA-182의 발현변화를 real-time PCR로 확인한 결과, in vitro 저산소 상태와 비슷하게 I/R 모델에서 세포 내 microRNA-182의 발현이 감소됨을 알 수 있었다(도 7).

심장의 기능을 평가하는 Millar를 사용하여 상기 I/R 모델에서 microRNA-182가 심장에 미치는 영향을 살펴보았다. I/R injury를 유발 후, F-127 pluronic gel을 사용해서 microRNA-182를 LV region에 형질주입(transfection) 해주었다. I/R 손상이 오면 ejection fraction은 감소하고 심장 wall이 약해져 수축이완이 제대로 일어나지 않기 때문에 end-systolic volume과 maximum volume은 증가하는데, microRNA-182를 넣어준 조건에서는 각 기능이 정상과 가까운 상태로 변화하는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

결과적으로, microRNA-182는 심근세포에 oxidative stress가 주어졌을 때 발현되는 pro-apoptotic 단백질인 Bnip3의 발현을 억제하여 미토콘드리아를 매개로 유도되는 세포 사멸기전을 저해할 뿐만 아니라, 심장기능 악화를 막는 역할을 가지고 있으므로, 손상 또는 자극으로 인한 허혈성 시장세포의 손실 및 심장기능 악화의 새로운 치료 표적으로서의 잠재적인 가능성이 있다.

<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> Composition containing Bnip3 inhibitor for preventing or treating of ischemic heart disease <130> P131632 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 uuuggcaaug guagaacuca caccg 25

Claims

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생물학적 시료에서 microRNA-182의 발현 수준 및 Bnip3의 발현 수준을 측정하는 단계;
생물학적 시료에서 대조군에 비하여 microRNA-182의 발현 수준이 감소하고, Bnip3의 발현 수준이 증가하면 허혈성 심장 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 허혈성 심장 질환 진단 정보 제공 방법.
제 7 항에 있어서,
허혈성 심장 질환은 협심증, 심근경색증 또는 심장마비인 허혈성 심장 질환 진단 정보 제공 방법.
제 7 항에 있어서,
microRNA-182 또는 Bnip3의 발현 수준은 실시간 RT-PCR 또는 면역 블랏팅에 의해 측정되는 허혈성 심장 질환 진단 정보 제공 방법.
microRNA-182의 발현 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
상기 세포에서 microRNA-182의 발현 및 Bnip3의 발현을 분석하고,
시험물질이 대조군에 비하여 microRNA-182의 발현을 증가시키고, Bnip3의 발현을 감소시키면, 허혈성 심장 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는 허혈성 심장 질환의 치료제 스크리닝 방법.
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