ES2646594T3

ES2646594T3 - Composiciones y métodos para producir glicoproteínas

Info

Publication number: ES2646594T3
Application number: ES13776656.4T
Authority: ES
Inventors: Amit VARMA; James CUENCA; Ying Zhu
Original assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Current assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Priority date: 2012-10-01
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2017-12-14
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: PT2904092T; US20170152540A1; ME02882B; JP6351598B2; IN2015DN02630A; NO2760138T3; US20150259425A1; WO2014055370A1; RS56641B1; SI2904092T1; HRP20171753T1; CY1119602T1; JP2015532096A; MX366106B; SG11201502339YA; IL237916A0; KR102182885B1; HK1207394A1; CA2886753C; EP2904092B1

Abstract

Un método de producción de un anticuerpo IgG1, que comprende: cultivar células NS0 modificadas para que secreten y expresen el anticuerpo IgG1 en un medio de cultivo celular que comprende glicina a una concentración entre 5 mM y 30 mM en condiciones adecuadas para la expresión y secreción del anticuerpo IgG1, produciéndose de esta manera el anticuerpo IgG1.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para producir glicoprotemas

2. Antecedentes

La modificacion post-traduccional de protemas mediante glicosilacion da lugar a la formacion de distintas glicoformas, que a menudo tienen propiedades unicas. Las diferencias en la glicosilacion de protemas pueden tener una profunda influencia en las propiedades ffsicas y qmmicas de la protema, incluyendo la afinidad de union de la protema por una molecula diana en particular. Se conocen varios metodos de modulacion de la glicosilacion de protemas. Los diferentes sistemas de expresion pueden impartir distintos perfiles de glicosilacion. Ademas, las secuencias que codifican protemas se pueden modificar para producir protemas con un nivel aumentado o disminuido de una glicoforma particular. Las condiciones en las que se cultivan las lmeas celulares recombinantes tambien pueden tener influencia en el perfil de glicosilacion.

Los anticuerpos producidos de manera recombinante en celulas de marnffero a menudo se glicosilan en las regiones Fc y Fab del anticuerpo. Muchos anticuerpos glicosilados contienen el azucar fucosa. La presencia de fucosa en un anticuerpo puede tener influencia en la union del anticuerpo a protemas particulares sobre las celulas. Por ejemplo, los anticuerpos que contienen altos niveles de fucosa en la region Fc del anticuerpo pueden tener una union disminuida a los receptores sobre los linfocitos (por ejemplo, los linfocitos citotoxicos naturales). Los anticuerpos que carecen de fucosa se han correlacionado con una actividad ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo) aumentada, especialmente a bajas dosis de anticuerpo. Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466. Los metodos para preparar anticuerpos con menos fucosa incluyen el crecimiento en celulas YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). Las celulas YB2/0 expresan bajos niveles de ARNm FUT8, que codifica una enzima (a 1,6-fucosiltransferasa) necesaria para la fucosilacion de protemas. Los metodos alternativos para aumentar la actividad ADDC incluyen las mutaciones en la parte Fc de un anticuerpo, particularmente las mutaciones que aumentan la afinidad del anticuerpo por el receptor FcyR. Se ha demostrado una correlacion entre el aumento de la union a FcyR con el Fc mutado utilizando ensayos basados en toxicidad celular dirigida. Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc. Trans. 30:487-490.

La concentracion de componentes en un medio de cultivo o medio continuo puede tener influencia en el perfil de glicosilacion de una protema. Idealmente, se puede aumentar o disminuir una glicoforma particular de una protema mediante el control de las condiciones en las que se cultivan las lmeas celulares recombinantes. Aunque ha habido una multitud de estudios dirigidos al aumento de los rendimientos de protemas mediante la manipulacion de los componentes de un medio de cultivo, ha habido muy pocos informes relativos a la modulacion de la glicosilacion de las protemas mediante la modificacion del medio de cultivo celular en el que se cultivan las celulas modificadas de manera recombinante. Un ejemplo se desvela en la Patente de EE. UU. N° 5.705.364, que se refiere a procesos para controlar el contenido de acido sialico de glicoprotemas producidas por celulas de mairnfero mediante la adicion de un acido alcanoico al medio de cultivo. Sin embargo, no se ha hecho frente a la posibilidad de aumentar la actividad ADCC de los anticuerpos mediante modificaciones en el medio de cultivo en el que se expresan los anticuerpos recombinantes suficientemente. En consecuencia, sena altamente deseable desarrollar un medio de cultivo para cultivar celulas de mamffero que exprese anticuerpos con niveles reducidos de fucosa y actividad ADCC aumentada.

El documento WO 02/066603 desvela metodos y composiciones de medios definidos qmmicamente para el cultivo de celulas de mai^ero para la produccion de cantidades comercialmente utiles de protemas expresadas.

3. Sumario de la divulgacion

La presente divulgacion se refiere al descubrimiento de que las glicoprotemas (por ejemplo, los anticuerpos) con propiedades beneficiosas se producen cultivando celulas de mamffero en un medio de cultivo que comprende una alta concentracion (por ejemplo, al menos de 5 mM) de glicina (de aqrn en adelante “medio alto en glicina”). En particular, cultivando celulas huesped de mamffero en medio alto en glicina aumenta los niveles de glicoformas no fucosiladas. Las celulas de mamffero se pueden utilizar para producir anticuerpos que presentan un aumento de la actividad biologica, incluyendo la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (“ADCC”).

En consecuencia, la divulgacion proporciona en general metodos y composiciones para expresar protema recombinantes (por ejemplo, anticuerpos) con perfiles de glicosilacion modificados en comparacion con las glicoprotemas que se expresan en medios de cultivo tradicionales. Los metodos y composiciones utilizan un medio alto en glicina para expresar glicoprotemas, tales como anticuerpos, en celulas de mai^ero, da como resultado ventajosamente glicoprotemas con niveles de fucosilacion reducidos en comparacion con las glicoprotemas producidas en medios de cultivo tradicionales.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, se proporciona un metodo de produccion de un anticuerpo IgG1, que comprende el cultivo de celulas NS0 modificadas para secretar y expresar el anticuerpo IgG1 en un medio de cultivo celular que comprende glicina a una concentracion entre 5 mM y 30 mM en condiciones adecuadas para la expresion y secrecion del anticuerpo IgG1, produciendo de esta manera el anticuerpo IgG1.

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Adicionalmente, los metodos de la divulgacion se pueden utilizar para modular y controlar la glicosilacion proteica durante la fabricacion. El control mejorado de la glicosilacion del producto durante la fabricacion ya que reducira el riesgo de rechazo de lotes y mejora el control durante la tecnologfa de transferencia entre los sitios de fabricacion y durante el aumento de escala del procedimiento. Por lo tanto, los metodos que se pueden utilizar para mantener perfiles reproducibles de la glicosilacion del producto sin introducir cambios de procedimiento.

Las celulas de mairnfero capaces de modificarse para producir glicoprotemas recombinantes incluyen celulas NS0, celulas CHO, celulas SP2/0 de mieloma de raton, celulas de rinon de hamster recien nacido BHK-21, y celulas de rinon embrionario humanas HEK0291. En realizaciones particulares, las celulas NS0 se modifican de manera recombinante para producir anticuerpos.

En un aspecto, la divulgacion proporciona un medio de cultivo adecuado para el cultivo de celulas de mamffero que comprende glicina a una concentracion de entre 5 mM y 100 mM y opcionalmente otros aminoacidos a distintas concentraciones como se indica en la divulgacion. El medio de cultivo preferentemente es un medio libre de protemas definido qmmicamente. La concentracion de glicina en el medio de cultivo celular puede ser, por ejemplo, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 nM, 11 nM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 30 mM o 50 mM. En ciertas realizaciones, la concentracion de glicina en el medio de cultivo celular se une a cualquiera de las dos realizaciones anteriores, por ejemplo, una concentracion que vana desde 5 mM a 10 mM, desde 7 mM a 10 mM, desde 10 mM a 15 mM, desde 12 mM a 17 mM, desde 15 mM a 20 mM, desde 16 mM a 18 mM desde 10 mM a 30 mM, desde 10 mM a 25 mM, desde 20 mM a 30 mM, desde 10 mM a 50 mM, desde 20 mM a 50 mM, etc. Pueden estar presentes otros aminoacidos en el medio de cultivo, en general a concentraciones que se encuentran normalmente en un medio basico tradicional. En una realizacion, las concentraciones de los aminoacidos en el medio de cultivo de la presente divulgacion se encuentran en los intervalos enumerados en la Tabla 2. El medio de cultivo tambien puede incluir uno o mas componentes adicionales tales como vitaminas, elementos traza, fuentes de energfa, acidos grasos, factores de crecimiento, nucleotidos, lfpidos, hormonas y/o antibioticos. Ademas, el medio puede incluir un tampon, un regulador de la osmolalidad y/o un tensioactivo. Los detalles adicionales de dichos componentes adicionales se pueden encontrar en la Seccion 5.1.

En otro aspecto, uno o mas aminoacidos distintos de la glicina tienen concentraciones de o por debajo de las concentraciones que se muestran en la Tabla 3 o la Tabla 4. Por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez u once aminoacidos pueden tener concentraciones de o debajo de las concentraciones enumeradas en la Tabla 3 o la Tabla 4. En una realizacion, la concentracion de lisina en el medio de cultivo esta entre 0,5 mM y 5,0 mM.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos para producir una glicoprotema de interes (“GOI”), por ejemplo, un anticuerpo de interes (“AOI”), que comprende el cultivo de celulas de mamffero, por ejemplo celulas NS0, modificadas para secretar y expresar el GOI o AOI en un medio de cultivo celular que comprende glicina a una concentracion de al menos 5 mM, por ejemplo, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM o 30 mM. El AOI puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo completamente humano. En realizaciones espedficas, la concentracion de glicina en el medio de cultivo celular se une a cualquiera de las dos realizaciones anteriores, por ejemplo, una concentracion de glicina vana desde 5 mM a 10 mM, desde 7 mM a 10 mM, desde 10 mM a 15 mM, desde 12 mM a 17 mM, desde 15 mM a 20 mM, desde 16 mM a 18 mM, desde 10 mM a 30 mM, desde 10 mM a 25 mM, desde 20 mM a 30 mM, etc. En ciertas realizaciones, el medio de cultivo es un medio libre de protemas definido qmmicamente.

En una realizacion, el AOI es HuLuc63 (elotuzumab). La secuencia de aminoacidos de la cadena VH madura de elotuzumab (SEQ ID NO: 1), la cadena VL madura de elotuzumab (SEQ ID NO: 2), la secuencia completa de cadena pesada de elotuzumab (SEQ ID NO: 3) y la secuencia completa de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) se muestran en la Tabla 7. Los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de elotuzumab en la que al menos un 4% de los glucanos carecen de fucosa y en el que al menos un 2,5% de los glucanos son glucanos 5 manosas. En una realizacion, los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de elotuzumab en la que al menos un 5% de los glucanos carece de fucosa y en la que al menos un 3% de los glucanos son glucanos 5 manosas.

En otra realizacion, el anticuerpo de interes es daclizumab. La secuencia de aminoacidos de la cadena VH madura de daclizumab (SEQ ID NO: 5), la cadena VL madura de daclizumab (SEQ ID NO: 6), la secuencia completa de cadena pesada de daclizumab (SEQ ID NO: 7) y la secuencia completa de cadena ligera (SEQ ID NO: 8) se muestran en la Tabla 7. Los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de daclizumab en la que al menos un 3% de los glucanos carecen de fucosa y en el que al menos un 1,5% de los glucanos son glicoformas 5 manosas. En una realizacion, los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de daclizumab en la que al menos un 4% de los glucanos carece de fucosa y en la que al menos un 2% de los glucanos son glucanos 5 manosas.

En otra realizacion, el AOI es voloxicimab. La secuencia de aminoacidos de la cadena VH madura de voloxicimab (SEQ ID NO: 9), la cadena VL madura de voloxicimab (SEQ ID NO: 10), la secuencia completa de cadena pesada

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de voloxicimab (SEQ ID NO: 11) y la secuencia completa de cadena ligera (SEQ ID NO: 12) se muestran en la Tabla 7. Los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de voloxicimab en la que al menos un 1% de los glucanos carecen de fucosa y en el que al menos un 0,5% de los glucanos son glucanos 5 manosas.

En una realizacion adicional, el AOI es PDL241. La secuencia de aminoacidos de la cadena VH madura de PDL241 (SEQ ID NO: 13), la cadena VL madura de PDL241 (SEQ ID NO: 14), la secuencia completa de cadena pesada de PDL241 (SEQ ID NO: 15) y la secuencia completa de cadena ligera (SEQ ID NO: 16) se muestran en la Tabla 7. Los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de PDL241 en la que al menos un 14% de los glucanos carecen de fucosa y en el que al menos un 8% de los glucanos son glucanos 5 manosas. En una realizacion, los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de PDL241 en la que al menos un 15% de los glucanos carece de fucosa y en la que al menos un 9% de los glucanos son glucanos 5 manosas.

En otra realizacion mas, el AOI es PDL192 (enavatuzumab). La secuencia de aminoacidos de la cadena VH madura de enavatuzumab (SEQ ID NO: 17), la cadena VL madura de enavatuzumab (SEQ ID NO: 18), la secuencia completa de cadena pesada de enavatuzumab (SEQ ID NO: 19) y la secuencia completa de cadena ligera (SEQ ID NO: 20) se muestran en la Tabla 7. Los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de enavatuzumab en la que al menos un 5% de los glucanos carecen de fucosa y en el que al menos un 2,5% de los glucanos son glucanos 5 manosas. En una realizacion, los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion producen una poblacion de moleculas de enavatuzumab en la que al menos un 6% de los glucanos carece de fucosa y en la que al menos un 3% de los glucanos son glucanos 5 manosas.

4. Breve descripcion de las figuras

La FIGURA 1 muestra la estructura de algunos glucanos unidos a N.

La FIGURA 2 muestra la cantidad relativa de glucanos G0 no fucosilados sin GlcNAc (N-acetilglucosamina) unidos en cinco anticuerpos diferentes producidos por las celulas NS0 cultivadas en un medio basico suplementado como glicina adicional. La cantidad se expresa como un porcentaje relativo a la cantidad de glucanos presentes en los anticuerpos producidos por las celulas NS0 cultivados en un medio basico de control sin suplementacion adicional de glicina.

La FIGURA 3 muestra la cantidad relativa de glucanos 5 manosas (5Man) unidos en cinco anticuerpos diferentes producidos por celulas NS0 en medio basico con una concentracion de glicina de 17 mM. La cantidad se expresa como un porcentaje relativo a la cantidad de glucanos presentes en los anticuerpos producidos por las celulas NS0 cultivadas en un medio basico de control sin suplementacion adicional de glicina.

La FIGURA 4 muestra la cantidad relativa de glucanos no fucosilados unidos en cinco anticuerpos diferentes producidos por celulas NS0 cultivadas en medio basico con una concentracion de glicina de 17 mM. La cantidad se expresa como un porcentaje relativo a la cantidad de glucanos presentes en los anticuerpos producidos por las celulas NS0 cultivadas en el medio basico de control sin suplementacion adicional de glicina.

La FIGURA 5 muestra las cantidades relativas de la glicoforma G0 no fucosilada sin GlcNAc (N- acetilglucosamina) y glicoformas tipo 5Man unidas en PDL192 producidos por celulas NS0 cultivadas en un medio basico suplementando con diferentes concentraciones de glicina (5, 15, 30 mM). La cantidad se expresa como un porcentaje relativo a la cantidad de la glicoforma presente en anticuerpos producidos por celulas NS0 cultivadas en un medio basico de control sin suplementacion adicional de glicina.

La FIGURA 6 muestra la potencia de union relativa al receptor CD16a para cuatro anticuerpos IgG1 (elotuzumab, daclizumab, PDL192 y PDL241) producidos por celulas NS0 cultivadas en un medio basico suplementado con glicina adicional. La cantidad se expresa como un porcentaje relativo a las afinidades de union al CD16a de los mismos anticuerpos producidos por las celulas NS0 cultivadas en un medio basico de control sin suplementacion adicional de glicina.

La FIGURA 7 muestra la potencia de union relativa al receptor CD16a para el PDL192 (enavatuzumab) producido por las celulas NS0 cultivadas en el medio basico suplementado con diferentes concentraciones de glicina (5, 15, 30 mM). La cantidad se expresa como un porcentaje relativo a las afinidades de union a CD16a de los mismos anticuerpos producidos por celulas NS0 cultivadas en un medio basico de control sin suplementacion adicional de glicina.

Las FIGURAS 8A-C muestra la actividad ADCC del elotuzumab producido en los procedimientos de control y alto en glicina. Los estudios se llevaron a cabo en celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) humanas de tres donantes diferentes. Se incluyeron controles negativos en los ensayos utilizando un anticuerpo de control sin actividad ADCC y muestras sin adicion de anticuerpos.

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Las FIGURAS 9A-B muestran la actividad ADCC de PDL241 producido en los procedimientos de control y alto en glicina. Los estudios se llevaron a cabo en PBMC a partir de dos donantes diferentes. Se incluyeron controles negativos en los ensayos utilizando un anticuerpo de control sin actividad ADCC y muestras sin adicion de anticuerpos.

Las FIGURAS 10A-B muestran la actividad ADCC de PDL192 (enavatuzumab) producido en los procedimientos de control y alto en glicina. Los estudios se llevaron a cabo en PBMC a partir de dos donantes diferentes. Se incluyeron controles negativos en los ensayos utilizando un anticuerpo de control sin actividad ADCC y muestras sin adicion de anticuerpos.

Las FIGURAS 11A-B muestran la actividad ADCC del daclizumab producido en los procedimientos de control y alto en glicina. Los estudios se llevaron a cabo en PBMC a partir de dos donantes diferentes. Se incluyeron controles negativos en los ensayos utilizando un anticuerpo de control sin actividad ADCC y muestras sin adicion de anticuerpos.

5. Descripcion detallada de la divulgacion

La presente divulgacion se refiere a composiciones y metodos para la expresion de glicoprotemas (por ejemplo, anticuerpos) recombinantes. Las composiciones y metodos producen glicoprotemas con glicoformas fucosiladas reducidas y actividad ADCC aumentada en comparacion con la glicoprotema producida en un medio de cultivo tradicional. Los anticuerpos producidos por los sistemas de expresion que utilizan las composiciones y metodos de la divulgacion presentan ventajosamente menos fucosilacion que cando se producen por el cultivo en medios tradicionales. Se describen posteriormente distintos aspectos de la divulgacion. La seccion 5.1 describe los medios de cultivo que contienen concentraciones elevadas (es decir medios altos en glicina) que son adecuadas para el cultivo de celulas de mairnfero capaces de expresar protemas. La seccion 5.2 describe distintas glicoprotemas (por ejemplo, anticuerpos) que se pueden producir en medios altos en glicina. La seccion 5.3 describe acidos nucleicos y sistemas de expresion para producir glicoprotemas. La seccion 5.4 describe los metodos de cultivo que se pueden utilizar para producir glicoprotemas. La seccion 5.5 describe metodos de recuperacion y purificacion de glicoprotemas producidas por los metodos de la divulgacion. La seccion 5.6 describe las poblaciones de glicoprotemas producidas por los metodos de la divulgacion. La seccion 5.7 describe composiciones farmaceuticas de glicoprotemas producidas por los metodos de la divulgacion. La seccion 5.8 describe metodos de tratamiento de distintas enfermedades utilizando los anticuerpos ejemplares producidos por los metodos de la presente divulgacion.

5.1 Medios de cultivo celular

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un medio de cultivo adecuado para el cultivo de celulas de mamfferos que comprende altas concentraciones de glicina. Como se utiliza en el presente documento, la expresion “medio de cultivo” se refiere a un medio adecuado para el crecimiento de celulas de mam^era en un cultivo celular in vitro. Como se utiliza en el presente documento, la expresion “cultivo celular” o “cultivo” se refiere al crecimiento de celulas de marnffero en un ambiente in vitro. Un medio de cultivo tfpico contiene aminoacidos, vitaminas, elementos traza, acidos grasos libres, y una fuente de energfa. Los componentes de cultivo adicionales tales como factores de crecimiento, nucleosidos, lfpidos, hormonas y antibioticos se pueden incluir en el medio de cultivo. Ademas, el medio puede incluir un tampon, un regulador de osmolalidad y un tensioactivo.

Como sera reconocido por el experto, el cultivo y medio nutritivo que se utiliza para cultivar celulas para la produccion de protemas (por ejemplo, anticuerpos) recombinantes, asf como otras variables tales como el calendario de alimentacion, velocidad de crecimiento, temperatura y niveles de oxfgeno, pueden afectar al rendimiento y calidad de la protema expresada. Los metodos de optimizacion de estas condiciones estan en el ambito de un experto; las condiciones ejemplares se exponen en las Realizaciones Ejemplares de la divulgacion. Preferentemente, las celulas se adaptan al crecimiento en medios libres de componentes libres de colesterol, suero y otras fuentes animales; en dichos casos el medio de cultivo y nutritivo incluye preferentemente productos qmmicos definidos que sustituyen dichos componentes. En consecuencia, los metodos de produccion de protemas recombinantes pueden comprender el cultivo de celulas de mai^ero recombinantes de la presente divulgacion en un medio definido qmmicamente, libre de componentes derivados de animales.

Los medios de cultivo de la divulgacion son medios altos en glicina. Como se utiliza en el presente documento, la expresion “medio alto en glicina” se refiere a un medio en el que la concentracion de glicina es mayor que la concentracion de glicina que se encuentra en medios de cultivo tfpicos. Como se muestra en la Tabla 1 posterior, las concentraciones de glicina en los medios de cultivo comerciales (por ejemplo, medios basicos) vanan desde aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2 mM.

Tabla 1: Concentracion de glicina en medios de cultivo comerciales tipicos

TABLA 1

Medio: Concentracion de Glicina (mM)

DMEM: 0,4

DMEM/F12: 0,25

IMDM: 0,4

MEM, F12 de Ham: 0,1

Medium 199: 0,67

Medium suplementado con hidrolizado a 5 g/l (asumiendo un 3% glicina): 2,0

La concentracion de glicina en el medio de cultivo de la divulgacion es preferentemente de 5 mM o mayor. Por ejemplo, la concentracion de glicina en el medio de cultivo puede ser desde 5 mM a 100 mM (por ejemplo, 5 mM, 6 5 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 30 mM o 50 mM). En realizaciones espedficas, la concentracion de glicina en el medio de cultivo se puede encontrar entre cualquiera de los dos valores anteriores, tal como, pero sin limitarse a, una concentracion que vana desde 5 mM a 10 mM, desde 7 mM a 10 mM, desde 10 mM a 15 mM, desde 12 mM a 17 mM, desde 15 mM a 20 mM, desde 16 mM a 18 mM, desde 10 mM a 30 mM, desde 10 mM a 25 mM, desde 20 mM a 30 mM, desde 10 10 mM a 50 mM o desde 20 mM a 50 mM.

Los medios de cultivo de la presente divulgacion pueden contener una variedad de aminoacidos ademas de glicina. Por ejemplo, los medios de cultivo pueden contener otros aminoacidos que incluyen alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistema, acido glutamico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, 15 prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina. En realizaciones particulares, el medio de cultivo puede contener aminoacidos (distintos a la glicina) presentes en concentraciones que se encuentran normalmente en los medios tradicionales (por ejemplo, medios basicos) Los aminoacidos adecuados tienen concentraciones en los intervalos enumerados en la Tabla 2.

20 Tabla 2: Intervalos de concentracion ejemplares de aminoacidos en los medios de cultivo de la presente __________________________divulgacion__________________________

TABLA 2

Aminoacido: Concentracion of aminoacidos en el medio (mM)

Alanina: 0,01-0,07

Arginina: 0,6-1,6

Asparagina: 0,08-1,5

Acido Aspartico: 0,03-0,4

Cistema: 0,1-0,9

Acido Glutamico: 0,03-0,1

Glutamina: 2-12

Glicina: 8-35

Histidina: 0,09-0,7

Isoleucina: 0,9-1,7

Leucina: 1-1,8

Lisina: 0,8-1,6

Metionina: 0,1-0,5

Fenilalanina: 0,2-1

Prolina: 0,5-4

Serina: 0,1-0,8

Treonina: 0,7-1,5

TABLA 2

Aminoacido: Concentracion of aminoacidos en el medio (mM)

Triptofano: 0,08-0,3

Tirosina: 0,2-3

Valina: 0,8-1,6

En ciertas realizaciones, la divulgacion proporciona un medio de cultivo en el que la glicina esta a una concentracion desde 5 mM a 30 mM, y en el que uno o mas aminoacidos distintos a la glicina tienen concentraciones de o por debajo de las concentraciones enumeradas en la Tabla 3. Por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, 5 nueve, diez, u once aminoacidos pueden tener concentraciones de o por debajo de las concentraciones enumeradas en la Tabla 3. En una realizacion, la concentracion de lisina en el medio de cultivo esta entre 0,5 mM y 5,0 mM. Otros aminoacidos no identificados en la Tabla 2 pueden estar presentes en el medio de cultivo, por ejemplo, a las concentraciones en los intervalos enumerados en la Tabla 2.

10 Tabla 3: Concentraciones maximas ejemplares de aminoacidos particulares en medios de cultivos de ciertas ___________________realizaciones de la presente divulgacion___________________

TABLA 3

Aminoacidos: Concentracion de aminoacidos en el medio (mM) Concentracion de aminoacidos en el medio (mg/L)

Asparagina: 2 mM 264

Acido Aspartico: 2 mM 266

Isoleucina: 2 mM 262

Leucina: 2,5 mM 328

Lisina: 6 mM 876

Metionina: 0,45 mM 67

Serina: 4 mM 420

Treonina: 4 mM 476

Triptofano: 0,3 mM 61

Tirosina: 2,5 mM 145

Valina: 1,8 mM 211

En otros aspectos, la divulgacion proporciona un medio de cultivo en el que la glicina esta a una concentracion de 5 mM a 30 mM, y en el que uno o mas aminoacidos distintos de la glicina tienen concentraciones de o por debajo de 15 las concentraciones enumeradas en la Tabla 4. Por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez u once aminoacidos pueden tener concentraciones de o por debajo de las concentraciones de o por debajo de las concentraciones enumeradas en la Tabla 4. Otros aminoacidos no identificados en la Tabla 3 pueden estar presentes en el medio de cultivo, por ejemplo, a las concentraciones en los intervalos enumerados en la Tabla 2.

20 Tabla 4: Concentraciones maximas ejemplares de aminoacidos particulares en los medios de cultivo de _________________________ciertas realizaciones de la presente divulgacion________________________

TABLA 4

Asparagina: 1,5 mM 198

Acido Aspartico: 1,5 mM 200

Isoleucina: 1,5 mM 197

Leucina: 2 mM 262

Lisina: 4 mM 584

TABLA 4

Metionina: 0,4 mM 60

Serina: 2 mM 210

Treonina: 2 mM 238

Triptofano: 0,2 mM 41

Tirosina: 1,5 mM 128

Valina: 1,5 mM 178

Adicionalmente, los medios de cultivo de la presente divulgacion pueden contener una variedad de vitaminas. Las vitaminas tipicas incluyen pero no se limitan a, vitamina B-12, biotina, colina, acido folico, niacinamida, pantotenato calcico, hidrocloruro de piridoxal, riboflavina e hidrocloruro de tiamina. Las vitaminas se pueden utilizar 5 adecuadamente en los intervalos de concentracion que se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: Concentraciones ejemplares de vitaminas en los medios de cultivo de la presente divulgacion

TABLA 5

Vitamina: Concentracion de Vitaminas en el Medio (mM)

Vitamina B-12: 0,00013-0,002

Biotina: 0,00001-0,01

Colina: 0,016-1,3

Acido Folico: 0,0015-0,02

Niacinamida: 0,002-0,07

Pantotenato calcico: 0,012-0,02

Hidrocloruro de Piridoxal: 0-0,04

Riboflavina: 0,00015-0,0023

Hidrocloruro de tiamina: 0-0,3

10 Adicionalmente, los medios de cultivo celular de la presente divulgacion pueden contener una variedad de elementos traza. Los elementos traza tfpicos incluyen, pero no se limitan a, cloruro calcico anhidro, cloruro magnesico anhidro, sulfato magnesico anhidro, cloruro potasico y fosfato sodico dibasico anhidro. Los elementos traza se pueden utilizar adecuadamente en los medios de cultivo en intervalos de concentracion que se muestran en la Tabla 6.

15 Tabla 6: Concentraciones ejemplares de elementos traza en los medios de cultivo de la presente divulgacion

TABLE 6

Elemento Traza: Concentracion de Elementos Traza en el Medio (mM)

Cloruro calcico anhidro: 0,2-1,1

Cloruro magnesico anhidro: 0,1-1,

Sulfato magnesico anhidro: 0,1-1,1

Cloruro potasico: 2-8

Fosfato sodico dibasico anhidro: 0,5-5

Los medios de cultivo pueden incluir tambien al menos una fuente de energfa. Ejemplos de fuentes de energfa que se pueden incluir en el cultivo celular incluyen glucosa, manosa, galactosa, maltosa y fructosa. La glucosa se puede anadir al medio de cultivo a una concentracion que vana desde 5 g/l a 20 g/l.

Los medios de cultivo de la presente divulgacion tambien pueden contener un tampon. Se utiliza un tampon para mantener el cultivo celular a un pH adecuado. Los tampones que se pueden utilizar en el medio de cultivo incluyen,

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pero no se limitan a HEPES, tampon de fosfato (por ejemplo fosfato sodico mono y dibasico) y carbonato sodico. El tampon se puede utilizar para mantener un pH del medio de cultivo en un intervalo aceptable, normalmente a un pH que vana desde 6,5 a 7,5 y mas normalmente a un pH que vana desde 6,8 a 7,2.

Los medios de cultivo pueden contener sales para regular la osmolalidad. Por ejemplo, se anade normalmente un regulador de la osmolalidad para mantener la osmolalidad del medio de cultivo en un intervalo entre 250-400 mili- Osmoles (mOsm), y mas normalmente entre 270-350 mOsm. Los reguladores de la osmolalidad caractensticos incluyen sales tales como el cloruro sodico o el cloruro potasico. Un experto en la tecnica apreciara que las cantidades altas de glicina en un medio de cultivo afectara la osmolalidad del medio. En consecuencia, la osmolalidad del medio de cultivo se puede mantener en un intervalo apropiado reduciendo la cantidad de regulador de la osmolalidad anadido al medio despues de tener en cuenta la osmolalidad a la que contribuye os altos niveles de glicina.

Los medios de cultivo de la presente divulgacion tambien pueden contener un factor lipfdico. Los factores lipfdicos tfpicos, incluyen, pero no se limitan a acido lipoico, cloruro de colina, acido oleico, y fosfatidilcolina.

5.2 Glicoprotemas

La presente divulgacion proporciona glicoprotemas enriquecidas en glicoformas no fucosiladas. La seccion 5.2.1 describe anticuerpos que se pueden producir por metodos de la presente divulgacion. La seccion 5.2.2 describe otros tipos de glicoprotemas que se pueden producir por los metodos de la divulgacion.

5.2.1. Anticuerpos

Los anticuerpos (Ab) e inmunoglobulinas (Ig) son glicoprotemas que tienen las mismas caractensticas estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan la especificidad de union para una diana espedfica, las inmunoglobulinas incluyen tanto los anticuerpos como otras moleculas tipo anticuerpo que carecen de especificidad de diana. Los anticuerpos e inmunoglobulinas son normalmente glicoprotemas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestos por dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un domino variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo.

La presente divulgacion proporciona anticuerpos enriquecidos en glicoformas no fucosiladas. A menos de que se indique otra cosa, el termino “anticuerpo” (Ab) se refiere a una molecula de inmunoglobulina que se une espedficamente a, o es inmunologicamente reactivo con, un antfgeno en particular, e incluye, formas de anticuerpo policlonales, monoclonales, modificados geneticamente y modificados de otra manera, incluyendo pero no limitadas a anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespedficos, diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos), y fragmentos de union al antfgeno de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, fragmentos Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG, y scFv. Ademas, a menos de que se indique otra cosa, la expresion “anticuerpo monoclonal” (mAb) quiere decir que incluye tanto moleculas intactas, asf como, fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unirse espedficamente a una protema. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se aclaran mas rapidamente de la circulacion del animal, y pueden tener una union menos no espedfica que in anticuerpo intacto (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med.24:316). El termino “scFv” se refiere a una cadena sencilla Fv de anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo tradicional se han unido para formar una cadena.

Las referencias a “VH” se refieren a la region variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un Fv, scFv, o Fab. Las referencias a “VL” se refieren a una region variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab.

Los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada tienen regiones determinantes de complementariedad (CDR), tambien conocidas como regiones hipervariables. Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones marco conservadas (FR). Como se conoce en la tecnica, la posicion/lfmite de aminoacidos que delimita una region hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y las distintas definiciones conocidas en la tecnica. Algunas posiciones del domino variable se pueden ver como posiciones hipervariables dbridas en las que esas posiciones se pueden considerar que estan en una region hipervariable en un grupo de criterios mientras que se consideran fuera de una region hipervariable en un grupo de criterios diferente. Una o mas de estas posiciones tambien se pueden encontrar en las regiones hipervariables extendidas. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones fR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a la diana de anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Como se utiliza en el presente documento, la numeracion de los restos de aminoacidos en la inmunoglobulina se hace de acuerdo con el sistema de numeracion de aminoacidos de inmunoglobulina de Kabat, et al., a menos de que se indique otra cosa.

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Tambien se pueden producir fragmentos de anticuerpo utilizando las composiciones y metodos de la divulgacion. La expresion “fragmento de anticuerpo” se refiere a una parte de un anticuerpo de longitud completa, en general la region de union a la diana o variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Un fragmento “Fv” es el mmimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y union a la diana completo. Esta region consiste en un dfmero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en una estrecha asociacion no covalente (dfmero VH-VL). Es en esta configuracion que las tres CDR de cada domino variable interactua para definir un sitio de union a la diana en la superficie del dfmero VH-VL. A menudo, las seis CDR confieren la especificidad de union a la dieta al anticuerpo. Sin embargo, en algunos casos incluso un unico domino variable (o medio de un Fv que comprende solo tres CDR espedficas para una diana) pueden tener la capacidad de reconocer y unirse a una diana. Los fragmentos de anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo en una cadena polipeptfdica sencilla. En general, el polipeptido Fv comprende adicionalmente un enlazador polipeptfdico entre los dominios VH y VL que capacita al scFv para formar la estructura deseada para unirse a la diana. Los “anticuerpos de dominio unico” estan compuestos por un unico domino VH o VL que presenta afinidad suficiente por la diana. En una realizacion espedfica, el anticuerpo de domino unico es un anticuerpo camelizado (vease, por ejemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

El fragmento Fab contiene el domino constante de la cadena ligera y el primer domino constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adicion de unos cuantos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o mas cistemas de la region bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F(ab') se producen por la escision del enlace disulfuro en las cistemas de la bisagra del producto de digestion por pepsina del F(ab')2. Se conocen acoplamientos qmmicos adicionales de fragmentos de anticuerpo por los expertos habituados en la tecnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la divulgacion son anticuerpos monoclonales. La expresion “anticuerpo monoclonal” como se utiliza en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnologfas de hibridoma. La expresion “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se deriva de un unico clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al metodo por el que se produce. Los anticuerpos monoclonales utiles den la presente divulgacion se pueden preparar utilizando una amplia variedad de tecnicas conocidas en la tecnica incluyendo el uso de tecnologfas de hibridoma, recombinantes, y de fago de presentacion, o una combinacion de las mismas. Los anticuerpos de la divulgacion incluyen anticuerpos quimericos, primatizados, humanizados, o humanos.

Los anticuerpos producidos utilizando los metodos y composiciones de la divulgacion pueden ser anticuerpos quimericos. El termino anticuerpo “quimerico” como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tal como de un anticuerpo de rata o raton, y regiones constantes de inmunoglobulina humana, normalmente que se escogen de una matriz de inmunoglobulina humana. Los metodos de produccion de anticuerpos quimericos se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; Patente de EE. UU. N° 5.807.715; 4.816.567; y 4.816397.

Los anticuerpos producidos utilizando los metodos y composiciones de la divulgacion pueden ser humanizados. Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otros subdominios de union a la diana de anticuerpos) que contienen mmimas secuencias derivadas de una inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos o al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender tambien al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Los metodos de humanizacion de anticuerpos se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; Patente de EE. UU. N° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370 de Queen et al.; documento EP239400; publicacion PCT WO 91/09967; Patente de EE. UU. N° 5.225.539; documento EP592106; documento EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; y Patente de EE. UU. N° 5.565.332.

Los anticuerpos producidos utilizando los metodos y composiciones de la divulgacion pueden ser anticuerpos humanos. Los anticuerpos completamente “humanos” pueden ser deseables para el tratamiento terapeutico de pacientes humanos. Como se utiliza en el presente documento, “anticuerpos humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina humana e incluye anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgenicos para una o mas inmunoglobulinas humanas y que o expresan inmunoglobulinas endogenas. Los anticuerpos humanos se pueden producir por una variedad de metodos conocidos en la tecnica que incluyen metodos de fagos de presentacion utilizando bibliotecas de anticuerpos de secuencias de inmunoglobulina humana. Vease, las Patentes de EE. UU. N° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741.

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Los anticuerpos humanos se pueden producir tambien utilizando ratones transgenicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endogenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Vease, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patentes de EE. UU. N° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598.

Ademas, pueden contratarse compares tales como Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), y Regeneron (Tarrytown, NY) para que proporcionen anticuerpos humanos dirigidos contra un antigeno seleccionado utilizando una tecnologfa similar a la que se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epttopo seleccionado se pueden generar utilizando una tecnica a la que se hace referencia como “seleccion guiada”. En esta estrategia se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de raton, para guiar la seleccion de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epftopo (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).

Los anticuerpos producidos utilizando los metodos y composiciones de la divulgacion pueden ser primatizados. La expresion “anticuerpo primatizado” se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes humanas. Los metodos para producir anticuerpos primatizados se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Patentes de EE. UU. N° 5.658.570; 5.681.722; y 5.693.780.

Los anticuerpos producidos utilizando los metodos y composiciones de la divulgacion pueden ser anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos monoclonales, a menudo humanos o humanizados, que tienen especificidades de union por al menos dos antfgenos diferentes.

Los anticuerpos producidos utilizando los metodos y composiciones de la divulgacion incluyen anticuerpos derivados. Por ejemplo, pero no por medio de limitacion, los anticuerpos derivados se modifican normalmente por glicosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivacion por grupos bloqueantes/protectores conocidos, escision proteolttica, union a un ligando celular u otra protema, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones qmmicas por tecnicas conocidas, incluyendo pero no limitadas a, escision qmmica espedfica, acetilacion, formilacion, smtesis metabolica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o mas aminoacidos no naturales, por ejemplo, utilizando la tecnologfa ambrix (vease, por ejemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2).

En otra realizacion mas de la divulgacion, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos cuya secuencia se ha modificado para alterar una funcion biologica efectora mediada por una region constante con respecto a la secuencia de tipo silvestre correspondiente.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la divulgacion se puede modificar para reducir al menos una funcion biologica efectora mediada por la region constante con respecto a un anticuerpo no modificado, por ejemplo, la reduccion de la union al receptor Fc (FcR). La union al FcR se puede reducir mutando el segmento de la region constante de inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones con el FcR (vease, por ejemplo, Canfield y Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662).

En otras realizaciones, los anticuerpos producidos utilizando los metodos y composiciones de la divulgacion modificados para adquirir o mejorar al menos una funcion biologica efectora mediada por la region constante con respecto a un anticuerpo no modificado, por ejemplo, para aumentar las interacciones con el FcyR (Vease, por ejemplo, el documento US 2006/0134709). Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo con una region constante que se une al FcyRIIA, FcyRIIB y/o FcyRIIIA con mayor afinidad que la correspondiente a la region constante de tipo silvestre de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento.

Ejemplos de anticuerpos que se pueden producir utilizando los metodos de la presente divulgacion incluyen pero no se limitan a adalimumab, elotuzumab, enavatuzumab, daclizumab, voloxicimab, tositumomab, trastuzumab, istekinumab, abcicimab, besilesomab, etaracizumab, pemtumomab, omalizumab, pertuzumab, natalizumab, sulesomab, tefibazumab, votumumab, motavizumab, oregovomabm, panitumumab, zalutumumab, igovomab, bevacizumab, basiliximab, atlizumab, bectumomab, belimumab, alemtuzumab, nimotuzumab, mepolizumab, altumomab, ranibizumab, rituximab, palivizumab, gemtuzumab, golimumab, fontolizumab, nofetumomab, ofatumumab, arcitumomab, cetuximab, imciromab, certolizumab, rovelizumab, ruplizumab, ipilimumab, labetuzumab, catumaxomab, canakinumab, denosumab, eculizumab, fanolesomab, efalizumab, infliximab, edrecolomab, efungumab, girentuximab, ertumaxomab y toclizumab.

5.2.2. Otras glicoprotemas

Los metodos de la divulgacion se pueden utilizar para producir glicoprotemas de cualquiera protema, incluyendo protemas con fines terapeuticos. Ejemplos de protemas que se pueden producir de acuerdo con la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a factores de crecimiento tal como al eritropoyetina (EPO), gonadotropina corionica humana (hCG), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), antitrombina III, interleucina 1,

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interleucina 2, interleucina 6, gonadotropina corionica humana (hCG), antitrombina III, interferon alfa, interferon beta, interferon gamma, factores de coagulacion tales como el factor VIII, factor IX y protema C humana, factor de crecimiento epidermico, factor liberador de hormona de crecimiento, factor de crecimiento epidermico, angiostatina, factor 2 de crecimiento endotelial y activador de plasminogeno.

5.3. Acidos nucleicos y sistemas de expresion

Se pueden utilizar metodolog^as de ADN recombinante convencionales tales como las que se describen en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edicion (Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en la Patente de EE. UU. N° 4.816.397 para producir celulas de mairnfero recombinantes adecuadas para la produccion de glicoprotemas de acuerdo con los metodos de la divulgacion.

Las secuencias de glicoprotemas son bien conocidas por los expertos en la tecnica. En realizaciones en las que la glicoprotema es un anticuerpo, se pueden utilizar tecnicas recombinantes para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, incorporar estos genes en vectores de expresion recombinante e introducir los vectores en las celulas huesped. Para expresar un anticuerpo recombinantemente, se transfecta una celula huesped con uno o mas vectores de expresion que albergan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de manera que se expresan las cadenas ligera y pesada en la celula huesped y, opcionalmente, se secretan en el medio en el que se cultivan las celulas huesped, a partir del cual se pueden recuperar los anticuerpos. Para generar los acidos nucleicos que codifican los anticuerpos, los fragmentos de AADN que codifican las regiones variables de la cadena ligera y pesada se obtienen primero. Estos ADN se obtienen por amplificacion y modificacion del ADN de la lmea germinal o el ADNc que codifica las secuencias variables de la cadena ligera y pesada, por ejemplo utilizando la reaccion en cadena de polimerasa (PCR). Las secuencias de ADN de la lmea germinal para los genes de la region variable de cadena pesada y ligera humanas se conocen en la tecnica (vease por ejemplo, la base de datos de la lmea germinal humana “VBASE”; vease tambien E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; y Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836.

Se puede sintetizar un fragmento de ADN que codifica la region variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo y utilizarse como una matriz para la mutagenesis para generar una variante como se describe en el presente documento utilizando tecnicas de mutagenesis rutinarias; de manera alternativa, se puede sintetizar directamente un fragmento de ADN que codifica la variante.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican el anticuerpo, se pueden modificar estos fragmentos de ADN por tecnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo, para convertir los genes de la region variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab, o a genes de scFv. En estas modificaciones, un fragmento de ADN que codifica una VL o VH esta unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra protema, tal como una region contante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresion “unida operativamente”, como se utiliza en este contexto, tiene la intencion de significar que los dos fragmentos de ADN estan unidos de manera que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN se mantienen en fase.

El ADN aislado que codifica la region VH se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica la VH u otra molecula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). Las secuencias de los genes de la region constante de cadena pesada humanas se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que engloban estas regiones se pueden obtener por amplificacion por PCR convencional. La region constante de cadena pesada puede ser una region contante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en ciertas realizaciones es una region constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica la VH puede estar unido operativamente a otra molecula de ADN que codifique solo la region constante CH1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la region VL se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (asf como un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica la VL a otra molecula de ADN que codifica la region constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la region constante de cadena ligera humanos se conocen en la tecnica (Vease, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y se pueden obtener los fragmentos de ADN que engloban estas regiones por amplificacion por PCR convencional. La region constante de cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda, pero en ciertas realizaciones es una region constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL estan unidos operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoacidos (Gly4~Ser)3 (SEQ ID NO: 21), de manera que las secuencias Vh y VL se pueden expresar como una protema de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible

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(vease, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).

Para expresar las glicoprotemas, los ADN que codifican la glicoprotema se insertan en vectores de expresion de manera que los genes esten unidos operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, la expresion “unidos operativamente” pretende significar que una glicoprotema que codifica un acido nucleico esta unido a un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional del vector sirven su funcion pretendida de regulacion de la transcripcion y traduccion de la secuencia que codifica la glicoprotema. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se escogen para ser compatibles con la celula huesped de expresion utilizada. Cuando la glicoprotema es un anticuerpo, el gen de la cadena ligera y el gen de la cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en vectores distintos o, mas tipicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion.

Los acidos nucleicos que codifican la glicoprotema pueden insertarse en el vector de expresion por metodos convencionales (por ejemplo, por union en los sitios de restriccion complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y el vector, o union de extremo romo si no existen sitios de restriccion). Cuando la glicoprotema es un anticuerpo, antes de la insercion de las secuencias de cadena ligera o pesada del anticuerpo, el vector de expresion puede albergar ya las secuencias de region constante de anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia para convertir las secuencias VH y VL de anticuerpo en genes de anticuerpo de longitud completa es insertarlas en los vectores de expresion que ya codifican las regiones constantes de cadena ligera y la region constante de cadena pesada, respectivamente, de manera que el segmento VH este unido operativamente a los segmentos de CH en el vector y el segmento VL esta unido operativamente al segmento CL en el vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido de senal que facilita la secrecion de la cadena de anticuerpo por una celula huesped. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el peptido de senal esta unido en fase al extremo amino del gen de cadena de anticuerpo. El peptido de senal puede ser un peptido de senal de inmunoglobulina o un peptido de senal heterologo (es decir, un peptido de senal de una protema no inmunoglobulina).

Los vectores de expresion recombinante pueden albergar secuencias reguladoras que controlan la expresion de las secuencias codificantes de la glicoprotema en una celula huesped. La expresion “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, amplificadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traduccion de los genes de cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion, que incluye las secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se va a trasformar, el nivel de expresion de la protema deseada, etc. Las secuencias reguladoras adecuadas para la expresion en celulas huesped de marnffero incluyen elementos vmcos que dirigen altos niveles de expresion proteica en celulas de mamffero, tales como promotores y/o amplificadores derivados del citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/amplificador CMV), polioma de Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/amplificador SV40), adenovirus (por ejemplo el promotor tardm principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripcion adicional de elementos reguladores vmcos, y secuencias de los mismos, vease, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 5.168.062 de Stinski, Patente de EE. UU. N° 4.510.245 de Bell et al., y Patente de EE. UU. N° 4.968.615 de Schaffner et al.

Los vectores de expresion recombinantes pueden albergar secuencias adicionales, tal como secuencias que regulan la replicacion del vector en celulas huesped (por ejemplo, ongenes de replicacion) y genes de marcadores geneticos. El gen de marcador genetico facilita la seleccion de celulas huesped en los que se ha introducido el vector (vease, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, normalmente el gen marcador genetico confiere resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula huesped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores geneticos adecuados incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en seleccion/amplificacion de celulas huesped DHFR- con metotrexato) y el gen neo (para la seleccion con G418). Para la expresion de las cadenas ligera y pesada, el vector de expresion que codifica las cadenas pesada y ligera se transfectan en una celula huesped por tecnicas convencionales. Las distintas formas del termino “transfeccion” tienen la intencion de englobar una amplia variedad de tecnicas que se utilizan comunmente para la introduccion de un ADN exogeno en una celula huesped de mamffero.

Las glicoprotemas de la divulgacion se pueden expresar en celulas huesped de mairnfero, para la secrecion optima de una protema plegada apropiadamente e inmunologicamente activa. Las celulas huesped de mamffero ejemplares para la expresion de anticuerpos recombinantes de la divulgacion incluyen las de ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluyendo las celulas CHO DHFR-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:42164220, que se utilizaron con un marcador genetico DHFR, por ejemplo como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), celulas de mieloma NS0, celulas COS, celulas SP2/0, celulas EB66®, y celulas pEr.C6®. Cuando se introducen los vectores de expresion recombinantes que codifican glicoprotemas en celulas huesped de mamffero, las glicoprotemas se producen cultivando las celulas huesped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion de la glicoprotema en las celulas huesped o la secrecion de la glicoprotema en el medio de

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cultivo en el que se cultivan las celulas huesped. Las tecnicas de cultivo adecuadas se describen en la Seccion 5.4. Las glicoprotemas se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando metodos de purificacion de protemas convencionales, por ejemplo, como se describen en la Seccion 5.5.

5.4. Metodos de cultivo

La divulgacion proporciona metodos para producir glicoprotemas (por ejemplo, anticuerpos) cultivando celulas de mairnfero modificadas para expresar las glicoprotemas en un medio de cultivo alto en glicina, tal como un medio de cultivo descrito en la Seccion 5.1. Los metodos de la divulgacion proporcionan glicoprotemas con glicoformas fucosiladas reducidas en comparacion con las glicoprotemas producidas en medios de cultivo tradicionales.

Las celulas de marnffero recombinantes escritas en la Seccion 5.3 se pueden cultivar en suspension, tal como por cultivo en matraces con agitado en una fermentacion a pequena escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continua, discontinua, semi-continua, o en estado solido) en fermentadores de laboratorio o industriales que se llevan a cabo en un medio adecuado y en condiciones que permiten que se exprese y/o se aisle la glicoprotema. De manera alternativa, las celulas de mamffero se pueden cultivar mientras se acoplan a un sustrato solido.

En realizaciones particulares, las celulas de mamffero recombinantes se anaden al medio basico a una densidad celular inicial en el intervalo de 0,5-5 x 10(i) * * * 5 celulas/ml y mas normalmente en el intervalo de 1,5-2,5 x 105 celulas/ml. Los cultivos se recolectan generalmente aproximadamente a los 8 dfas a 20 dfas despues de la inoculacion, y mas normalmente entre 10 dfas a 14 dfas despues de la inoculacion.

Despues de la inoculacion de las celulas de mamffero, el cultivo de las celulas se puede promover por la adicion de nutrientes de cuerdo con un calendario de alimentacion pre-determinado. La adicion del medio de alimentacion al cultivo puede ser mediante procedimientos conocidos en la tecnica tales como el cultivo continuo, cultivo discontinuo y cultivo semi-continuo. Para apoyar la propagacion de las celulas, se puede anadir una solucion de alimentacion al cultivo en momentos intermitentes despues de la inoculacion. Como se utiliza en el presente documento, el termino “alimentacion” se refiere a nutrientes que se anaden al cultivo tras la inoculacion. La expresion “solucion de alimentacion” o “medio de alimentacion” se refiere a una solucion que contiene la alimentacion que se anade al cultivo despues de la inoculacion.

5.5. Recuperacion y purificacion

Las tecnicas para la recuperacion y purificacion de la protema expresada se conocen bien en la tecnica y se puede hacer a medida de la glicoprotema(s) particular que se va a expresar por la celula de mamffero recombinante. Las glicoprotemas se pueden recuperar del medio de cultivo y/o los lisados celulares. En las realizaciones en las que el metodo se dirige a la produccion de una glicoprotema secretada, la glicoprotema se puede recuperar del medio de cultivo. Las protemas se pueden recuperar o purificar del medio de cultivo por una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo pero sin limitarse a, centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion o precipitacion. La glicoprotemas pueden entonces purificarse adicionalmente por una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatograffa (por ejemplo, de intercambio ionico, afinidad, hidrofobia, cromatoenfoque, y exclusion por tamano), procedimientos electroforeticos (por ejemplo, enfoque isoelectrico de preparacion (IEF), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitacion en sulfato amonico), o extraccion (vease, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

En las realizaciones en las que la glicoprotema es un anticuerpo, el anticuerpo puede purificarse por un proceso que utiliza cromatograffa de afinidad por Protema A en conjuncion con una cromatograffa de intercambio anionico fuerte (Q-Sepharose) e intercambio cationico debil (CM-650M), permitiendo un procedimiento de flujo continuo sin dilucion del proceso intermedio. Este metodo para obtener un anticuerpo purificado puede implicar las siguientes etapas:

(i) cromatograffa de afinidad a Protema A para aislar el anticuerpo de otros componentes del cultivo celular;

(ii) inactivacion vmca a pH bajo;

(iii) cromatograffa de intercambio anionico fuerte para retirar el ADN;

(iv) cromatograffa de intercambio cationico debil para reducir los agregados; y

(v) filtracion para retirar los virus.

Las etapas (ii)-(v) se pueden llevar a cabo en cualquier orden.

Una vez aislado, un anticuerpo puede, si se desea, purificarse adicionalmente, por ejemplo, por cromatograffa lfquida de altas prestaciones (vease, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work y Burdon, eds., Elsevier, 1980), o por cromatograffa de filtracion en gel en una columna Superdex™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden).

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5.6. Glicoformas proteicas

La modificacion post-traduccional de una protema por glicosilacion puede tener influencia en las propiedades bioqmmicas y ffsicas de la protema. Por ejemplo, las propiedades de un anticuerpo pueden influenciarse por la glicosilacion en las regiones Fc y Fab del anticuerpo. La “glicosilacion” se refiere a la modificacion covalente de protemas (por ejemplo, anticuerpos) con carbohidratos (por ejemplo, cadenas de oligosacaridos). Los azucares tipicos en glicoprotemas incluyen la manosa, glucosa, galactosa, fucosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N- acetilglucosamina (GlcNAc) y acido sialico.

Se hace referencia a las moleculas individuales glicosiladas (por ejemplo, los anticuerpos glicosilados) en el presente documento como glicoformas. El “perfil de glicosilacion” se refiere al grupo de glicoformas en una muestra particular. La glicosilacion se refiere en general a la glicosilacion unida a N o la glicosilacion unida a O. La expresion “glicosilacion unida a N” se refiere a la union covalente de una cadena de oligosacarido a un resto de asparagina de una protema, formando de esta manera oligosacaridos unidos a N. Tambien se hace referencia a los oligosacaridos unidos a N como glucanos unidos a N. La expresion “glicosilacion unida a O” se refiere a la union covalente de una cadena de oligosacarido al grupo hidroxilo de un resto de serina o treonina de una protema, formando de esta manera oligosacaridos unidos a O. Tambien se hace referencia a los oligosacaridos unidos a O como glucanos unidos a O.

Los glucanos unidos a N se caracterizan adicionalmente por el numero de restos de galactosa en sus extremos, contengan o no una fucosa unida a la N-acetilglucosamina unida a N. Se hace referencia a los glucanos unidos a N que tienen una molecula de fucosa unida a la N-acetilglucosamina como glucanos unidos a N fucosilados. Se hace referencia a las protemas con glucanos unidos a N fucosilados en el presente documento como glicoformas fucosiladas. Las caractensticas de cuatro glucanos unidos a N fucosilados diferentes se enumeran posteriormente (tambien vease la FIGURA 1):

• G0: Estructura central biantenaria (es decir, que tiene dos antenas) con la fucosa unida a la N-acetilglucosamina unida a N y una N-acetilglucosamina en cada rama de la estructura central.

• G1: Estructura central biantenaria con la fucosa unida a la N-acetilglucosamina unida a N, una N- acetilglucosamina en cada rama de la estructura central y una galactosa terminal en una rama de la estructura central.

• G2: Estructura central biantenaria con una fucosa unida a la N-acetilglucosamina unida a N, una N- acetilglucosamina y una galactosa terminal en cada rama de la estructura central.

• G0-GlcNAc: Estructura central biantenaria con fucosa unida a la N-acetilglucosamina unida a N, una N- acetilglucosamida en una rama de la estructura central y sin galactosa terminal.

Se hace referencia a los glucanos unidos a N que no contienen una molecula de fucosa como glucanos no fucosilados. Se hace referencia a los glucanos no fucosilados como glicoformas no fucosiladas. Por ejemplo, un glucano unido a N G0-GlcNAc-Fucosa tiene una estructura central biantenaria sin fucosa unida a la N- acetilglucosamina unida a N, una N-acetilglucosamina en una rama de la estructura central y sin galactosa terminal. Se hace referencia a un anticuerpo que contiene un glucano unido a N G0-GlcNAc-Fucosa como una glicoforma unida a N G0-GlcNAc-Fucosa.

Los perfiles de glicosilacion unida a N se pueden evaluar por distintos metodos. Por ejemplo, los perfiles de glicosilacion unidos a N pueden evaluarse digiriendo el anticuerpo con tripsina y analizando la mezcla peptfdica resultante utilizando una cromatograffa de fase inversa con deteccion por espectrometna de masas y cuantificacion de los distintos glicopeptidos. En un metodo espedfico, los peptidos digeridos se analizan utilizando una columna de fase inversa ODS-AQ YMC-Pack, con un tamano de partmula de 5 um, tamano de poro 120 Angstroms, de 2,0 mm x 250 mm (YMC Co., Ltd, numero de catalogo AQ12S05-2502WT) y los peptidos elrndos se detectan y cuantifican utilizando un espectrometro de masas LCQ Deca XP+ (Thermo Finnigan). La abundancia relativa de cada glicoforma se determina basandose en el area del pico del cromatograma ionico extrafdo por la espectrometna de masas de los glicopeptidos correspondientes con respecto a la suma de las areas del pico de todos los glicopeptidos observados.

De manera alternativa, los perfiles de glicosilacion unida a N se pueden evaluar por escision de los oligosacaridos unidos a n con amidasa PNGasa F, derivatizando los oligosacaridos con un marcador fluorescente y analizando la mezcla resultante mediante HPLC de fase normal con deteccion fluorescente. En un metodo especifico, los glucanos unidos a N derivatizados, escindidos se re-disuelven a 50 °C en una columna NH2P-504E Asahipak Amino unido a amina polimerica de 250 x 4,6 mm (tamano de partfcula 5 mm, Phenomenex, N° de cat. CHO-2628).

Los estudios del perfil de glicosilacion de IgG han revelado que la IgG alberga al menos 30 oligosacaridos unidos a N diferentes. Vease Dwek et al., 1995, J. Anat. 187:279-292. Los sitios de glicosilacion unida a N se encuentran tanto en la region Fc como en las regiones Fab de muchos anticuerpos. Se hace referencia a menudo a los oligosacaridos unidos a N sin ningun grupo de acido sialico como oligosacaridos unidos a N neutros. Se hace

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referencia a los oligosacaridos unidos a N con uno o dos grupos de acido sialico y el extremo del azucar no reductor del oligosacarido como oligosacaridos unidos a N monosializados o disializados, respectivamente. Con respecto a la IgG, la glicosilacion se caracteriza por una baja incidencia de estructuras monosializadas y disializadas mientras que la glicosilacion de Fab se caracteriza por una alta incidencia de estructuras monosializadas y disializadas.

Se han identificado glucanos unidos a N adicionales en la region Fc de los anticuerpos. Por ejemplo, se hacer referencia a los glucanos que contienen altas cantidades de manosa que caracterizan por glucanos que solo contienen dos N-acetilglucosaminas conteniendo el resto de residuos de manosa como “glucanos altos en manosa”. Los restos de manosa estan unidos covalentemente a una GlcNAc en la posicion 2 del oligosacarido. Un ejemplo de un glucano de cinco manosas es el “glucano 5Manosas”. Los glucanos 5Manosas contienen 5 restos de manosa. Se hace referencia a las protemas con glucanos 5Manosas en el presente documento como “glicoformas 5Manosas”. Los glucanos altos en manosa son ejemplos de glucanos no fucosilados.

La presente divulgacion proporciona metodos de produccion de anticuerpos enriquecidos en glicoformas que no contienen fucosa (es decir, glicoformas no fucosiladas). Ejemplos de glicoformas no glicosiladas incluyen, pero no se limitan a glicoformas G0-GlcNAc-Fucosa y glicoformas 5Manosas. Los anticuerpos que carecen de fucosa se han correlacionado con un aumento de la actividad ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo). Los linfocitos, particularmente las celulas citotoxicas naturales (NK), contienen receptores de union en la superficie que son capaces de unirse a la region Fc de los anticuerpos. Por ejemplo, el receptor CD16a humano de las celulas NK se une a la region Fc de un anticuerpo unido a una celula diana, iniciando de esta manera la destruccion de la celula diana. Sin estar ligados por teona alguna, se cree que las glicoformas no fucosiladas de acuerdo con los metodos de la presente divulgacion presentan una afinidad de union mas alta para el receptor DC16a de las celulas NK que las glicoformas que contienen fucosa (es decir, las glicoformas fucosiladas), que es responsable del aumento de la actividad ADCC.

Los anticuerpos producidos en medios altos en glicina como se describen en el presente documento contienen significativamente mas glicoformas no fucosiladas que los anticuerpos producidos en medios convencionales. Como se describe en la Seccion 5.3, la cantidad de glucanos que carecen de fucosa aumentan en general segun aumenta la concentracion de glicina en el medio de cultivo desde 2 mM a 30 mM. En particular el porcentaje de glucanos G0- GlcNAc-Fucosa y 5Manosas aumenta cuando se cultivan celulas NS0 en el medio de cultivo producido de acuerdo con la presente divulgacion. Aunque la cantidad de anticuerpos no fucosilados producidos en el medio de cultivo de la presente divulgacion depende del AOI, el aumento del porcentaje de glucanos que carecen de fucosa es en general al menos un 120% con respecto a los anticuerpos producidos en un medio convencional (es decir, un medio con concentraciones de glicina de 2 mM o menos). Por ejemplo, el aumento del porcentaje del total de glucanos que carecen de fucosa en los anticuerpos producidos en un medio de cultivo de la presente divulgacion puede ser del 120%, 150%, 180%, 200%, 250%, 300% o 400% con respecto a los anticuerpos producidos en medios convencionales. En realizaciones espedficas, el aumento del porcentaje en glucanos que carecen de fucosa en los anticuerpos producidos por los metodos de la divulgacion con respecto a los anticuerpos producidos en medios basicos convencionales pueden unirse por cualquiera de dos de los valores anteriores, tal como, pero sin limitarse a, 120-150%, 150-180%, 150-200%, o 200-300%.

La presente divulgacion proporciona composiciones que comprenden anticuerpos particulares de interes con perfiles de glicosilacion alterados con respecto a los anticuerpos producidos en medios convencionales. En particular, los anticuerpos producidos por la presente divulgacion tienen un porcentaje mayor de glicoformas no fucosiladas que los anticuerpos producidos en medios convencionales. Como resultado, los anticuerpos producidos por los metodos de la presente divulgacion generalmente presentan una actividad ADCC mayor que los anticuerpos producidos en medios convencionales y muestran una mayor union al receptor CD16a de las celulas NK.

En una realizacion particular, los metodos de la presente divulgacion se pueden utilizar para producir una anticuerpo monoclonal que tiene una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. El anticuerpo monoclonal, al que se hace referencia como elotuzumab (HuLuc 63), se desvelo en la Publicacion de Patente de Ee. UU. N° 2006/0024296 y tiene regiones VH y VL de SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 44, respectivamente. El elotuzumab tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 4. El elotuzumab presenta una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) en celulas primarias de mieloma y en actividad antitumoral in vivo (Hsi et al., (2008) Clin. Cancer Res. 14(9):2775).

La divulgacion proporciona una composicion que comprende una poblacion de moleculas de elotuzumab, donde al menos el 4% de los glucanos carecen de fucosa, que se producen de acuerdo con los procedimientos de cultivo celular de la presente divulgacion. Por ejemplo, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7% o al menos un 8% de los glucanos del elotuzumab carecen de fucosa. En realizaciones particulares, los glucanos no fucosilados de elotuzumab producidos de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular del a presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a glucanos unidos a N tales como glucanos G0-GlcNAc-Fucosa y 5Manosas. En estas realizaciones, al menos un 4% de los glucanos unidos a N carecen de fucosa. En otras realizaciones, la divulgacion proporciona moleculas de elotuzumab que tienen al menos un 2,5% del total de glucanos presentes son glucanos 5Manosas. Por ejemplo, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5% de los glucanos en el elotuzumab

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pueden estar presentes como glucanos 5Manosas.

En otra realizacion, los metodos de la presente divulgacion pueden utilizarse para producir un anticuerpo monoclonal que tiene una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6. El anticuerpo monoclonal, al que se hace referencia como daclizumab, es un anticuerpo IgG1 humanizado que se une espedficamente a la subunidad alfa (a la que tambien se hacer referencia como cD25 o Tac) del receptor de interleucina 2 humana (IL-2R), que es un mediador importante de la activacion de linfocitos. El daclizumab tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de SEQ ID NO: 7 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 8.

La divulgacion proporciona una composicion que comprende una poblacion de moleculas de daclizumab, donde al menos el 3% de los glucanos carece de fucosa, que se producen de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular de la presente divulgacion. Por ejemplo, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, o al menos un 8% de los glucanos en el daclizumab que carecen de fucosa. En realizaciones particulares, los glucanos no fucosilados del daclizumab producidos de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular de la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a glucanos unidos a N tales como los glucanos G0- GlcNAc-Fucosa y 5Manosas. En estas realizaciones, al menos el 3% de los glucanos unidos a N carecen de fucosa. En otras realizaciones, la divulgacion proporciona moleculas de daclizumab que tienen al menos un 2% del total de los glucanos presentes son glucanos 5Manosas. Por ejemplo, al menos el 3%, al menos el 4% o al menos el 5% de los glucanos en el daclizumab pueden estar presentes como glucanos 5Manosas.

En otra realizacion, los metodos de la presente divulgacion se pueden utilizar para producir un anticuerpo monoclonal que tiene una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10. El anticuerpo monoclonal, al que se hace referencia como voloxicimab, es un anticuerpo monoclonal (mAb) IgG4 quimerico (82% humano, 18% murino) de alta afinidad que se une espedficamente a la integrina a5p1 que se utiliza para el tratamiento de una variedad de tumores en un estadio avanzado. El voloxicimab tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 12.

La divulgacion proporciona una composicion que comprende una poblacion de moleculas de voloxicimab, donde al menos el 1% de los glucanos carecen de fucosa, que se produce de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular de la presente divulgacion. Por ejemplo, al menos el 1% de los glucanos en el voloxicimab carece de fucosa. En realizaciones particulares, los glucanos no fucosilados del voloxicimab producidos de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular de la presente divulgacion incluyen, peor no se limitan a glucanos unidos a N tales como los glucanos G0-GlcNAc-Fucosa y 5Manosas. En estas realizaciones, al menos un 1% de los glucanos unidos a N carecen de fucosa. En otras realizaciones, la divulgacion proporciona moleculas de voloxicimab que tienen al menos un 0,5% de los glucanos totales presentes como glucanos 5Manosas.

En otra realizacion, los metodos de la presente divulgacion se pueden utilizar para producir un anticuerpo monoclonal que tiene una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 13 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14. El anticuerpo monoclonal, al que se hace referencia como PDL241, es un anticuerpo IgG1 humanizado que se une a la protema CS1 (pero a un epftopo diferente que el elotuzumab). El PDL241 tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de sEq ID NO: 15 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 16.

La divulgacion proporciona una composicion que comprende una poblacion de moleculas de PDL241, donde al menos el 14% de los glucanos carece de fucosa, que se producen de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular de la presente divulgacion. Por ejemplo, al menos un 14%, al menos un 15%, al menos un 16%, al menos un 17%, al menos un 18%, o al menos un 19% de los glucanos en el PDL241 que carecen de fucosa. En realizaciones particulares, los glucanos no fucosilados del PDL241 producidos de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular de la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a glucanos unidos a N tales como los glucanos G0-GlcNAc- Fucosa y 5Manosas. En estas realizaciones, al menos el 14% de los glucanos unidos a N carecen de fucosa. En otras realizaciones, la divulgacion proporciona moleculas de PDL241 que tienen al menos un 8% del total de los glucanos presentes son glucanos 5Manosas. Por ejemplo, al menos el 9%, al menos el 10%, al menos el 11% o al menos el 12% de los glucanos en el PDL241 pueden estar presentes como glucanos 5Manosas.

En otra realizacion, los metodos de la presente divulgacion se pueden utilizar para producir un anticuerpo monoclonal que tiene un region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18. El anticuerpo monoclonal, al que se hace referencia como enavatuzumab (PDL192) es un anticuerpo humanizado IgG1 contra TweakR que presenta actividad anti-tumoral en modelos pre-clfnicos mediante dos mecanismos: senalizacion directa mediante TweakR y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. El enavatuzumab tiene una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada completa de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de longitud completa de SEQ ID NO: 20.

La divulgacion proporciona una composicion que comprende una poblacion de moleculas de enavatuzumab, donde al menos el 5% de los glucanos carece de fucosa, que se producen de acuerdo con el procedimiento de cultivo

celular de la presente divulgacion. Por ejemplo, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, o al menos un 10% de los glucanos en el enavatuzumab que carecen de fucosa. En realizaciones particulares, los glucanos no fucosilados del enavatuzumab producidos de acuerdo con el procedimiento de cultivo celular de la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a glucanos unidos a N tales como los glucanos G0- 5 GlcNAc-Fucosa y 5Manosas. En estas realizaciones, al menos el 5% de los glucanos unidos a N carecen de fucosa. En otras realizaciones, la divulgacion proporciona moleculas de enavatuzumab que tienen al menos un 2,5% del total de los glucanos presentes son glucanos 5Manosas. Por ejemplo, al menos el 3%, al menos el 4% o al menos el 5% de los glucanos en el elotuzumab pueden estar presentes como glucanos 5Manosas.

10 La Tabla 7 posterior proporciona las secuencias de elotuzumab, daclizumab, voloxicimab, PDL241 y enavatuzumab como se han identificado anteriormente.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de produccion de un anticuerpo IgG1, que comprende:

cultivar celulas NS0 modificadas para que secreten y expresen el anticuerpo IgG1 en un medio de cultivo celular que comprende glicina a una concentracion entre 5 mM y 30 mM en condiciones adecuadas para la expresion y secrecion del anticuerpo IgG1, produciendose de esta manera el anticuerpo IgG1.
2. El metodo de la reivindicacion 1, donde la concentracion de glicina esta en el intervalo de desde 10 mM a 25 mM, o 15 mM a 20 mM, o 16 mM a 18 mM.
3. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el medio es un medio libre de protema.
4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente la recuperacion del anticuerpo IgG1.
5. El metodo de la reivindicacion 4, donde la recuperacion del anticuerpo IgG1 comprende la etapa de separar las celulas NS0 del medio de cultivo, y opcionalmente purificar el anticuerpo IgG1.
6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde las celulas NS0 se siembran a una densidad de 1,5 x 105 celulas/ml a 2,5 x 105 celulas/ml, antes de dicho cultivo.
7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el anticuerpo IgG1 comprende una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, opcionalmente donde el anticuerpo IgG1 tiene una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada completa de SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 4.
8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el anticuerpo IgG1 comprende una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6.
9. El metodo de la reivindicacion 8, donde el anticuerpo IgG1 tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de SEQ ID NO: 7 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 8.
10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el anticuerpo IgG1 comprende una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10.
11. El metodo de la reivindicacion 10, donde el anticuerpo IgG1 tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 12.
12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el anticuerpo IgG1 comprende una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 13 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14.
13. El metodo de la reivindicacion 12, donde el anticuerpo IgG1 tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 16.
14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el anticuerpo IgG1 comprende una region VH de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17 y una region VL de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18.
15. El metodo de la reivindicacion 14, donde el anticuerpo IgG1 tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada completa de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera completa de SEQ ID NO: 20.

imagen1

Estructuras de glucanos umdos a N tipicos

N GO-GIcNAc

Simbolosde Monosacaridos

A Fucosa

El N-acetilglucosamina

Manosa

0 Galactosa

F GURA

% Respecto al control % Respecto al control

GO-GIcNAc-Fucosa

imagen2

FIGURA 2

Man5

imagen3

FIGURA 3

% Respecto al control % Respecto al control

Total de anticue rpo no fucosilado

imagen4

FIGURA4

imagen5

Concentration de glicina extra en medio basico (mM)

FIGURA 5

% Respecto al control % Respecto al control

Union a CD16a

imagen6

FIGURA 6

Union a CD16a

imagen7

Concentration de glicina extra en medio basico (mM)

FIGURA 7

imagen8

50-

Control

40-

° Ghcina

uul

umI

0,001 0,01 0,1

102308AKSH1

Ab (ug/ml)

FIGURA8A

HuLuc63 ADCC:Donante n 1070

90

80

70

60

50

40

30

20

10-

Control

o G icina

0,001 0,01 0,1 1 10

102308AKSH2

Ab (ug/ml)

FIGURA 8B

HuLuc63 ADCC:Donante n 1354

Control

40-

° Ghana

yj ,ii mull___i i 11iitM i i ■ i ji*4___i i mini i i

102308AKSH3

Ab (ug/ml)

FIGURA 8C

% Citoto' icidad % Citotoxicidad

imagen9

FIGURA9A

PDL241 ADCC:Donante n°1381

imagen10

FIGURA9B

imagen11

^ 401 30-

Control

o G icina

Ab (ng/ml)

021909AK1

FIGURA10A

PDL192 ADCC:Donante n°1272

50 n

5 30 9

Control

° Ghana

10-

Ab (ug/ml)

0219G9AK2

FIGURA10B

imagen12

Daclizumab medida por liberacion de 51Cr

022409AK1

Anticuerpos (1 pg/mL)

Control

Tj

G hcina

Efector: Reacionesde dianas

FIGURA 11A

Donante n° 1339

Actividad ADCC de

Daclizumab medida por liberacion de 51Cr

33

022409AK2

Anticuerpos (1 pg/mL)

Control

o Ghana

Efector: Relaciones de dianas

FGURA11B