RS56641B1 - Kompozicije i postupci za proizvodnju glikoproteina - Google Patents

Description

Opis

2. STANJE TEHNIKE

Post-translacijska modifikacija proteina posredstvom glikozilacije dovodi do obrazovanja zasebnih glikoformi, koje često imaju jedinstvene karakteristike. Razlike u glikozilaciji proteina mogu imati snažan uticaj na fizičke i hemijske karakteristike proteina, uključujući afinitet vezivanja proteina za određeni ciljni molekul. Poznata je nekolicina metoda modulacije glikozilacije proteina. Različiti ekspresioni sistemi mogu pružati zasebne profile glikozilacije. Pored toga, kodirajuće sekvence proteina mogu biti modifikovane da bi se proizvodili proteini sa uvećanim ili smanjenim nivoom pojedine glikoforme. Isto tako, na profil glikozilacije uticaj mogu imati uslovi pod kojima se kultivišu rekombinantne ćelijske linije.

Antitela, koja se proizvode rekombinantno u ćelijama sisara, često su glikozilirana i na Fc i na Fab regionima antitela. Mnoga glikozilirana antitela sadrže šećer fukozu. Prisustvo fukoze u antitelu može imati uticaja na vezivanje antitela za pojedine proteine na ćelijama. Na primer, antitela koja sadrže visoke nivoe fukoze u Fc regionu antitela mogu ispoljavati smanjeno vezivanje za receptore na limfocitima (npr., ʺnatural killerʺ ćelije). Antitela bez fukoze dovode se u korelaciju sa povećanom ADCC (antitelo-zavisna celularna citotoksičnost) aktivnošću, posebno pri nižim dozama antitela. Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466. Postupci za izradu antitela sa manje fukoze uključuju uzgajanje na ćelijama mijeloma pacova YB2/0 (ATCC CRL 1662). Ćelije YB2/0 ekspresuju niske nivoe mRNK FUT8, koja kodira enzim (a 1,6-fukoziltransferaza), koji je neophodan za fukozilaciju proteina. Alternativni postupci za povećavanje ADDC aktivnosti uključuju mutacije u Fc delu antitela, posebno mutacije koje povećavaju afinitet antitela za FcgR receptor. Korelacija između povećanog vezivanja za FcgR i mutiranog Fc demonstrirana je korišćenjem testova ciljane citotoksičnosti na ćelijskoj bazi. Shields et al., 2001, J. Biol. Chem.

276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc. Trans.30:487-490.

Koncentracija komponenti u medijumu za kultivaciju ili hranjivom medijumu može uticati na glikozilacijski profil proteina. Idealno, određena glikoforma proteina može biti uvećana ili smanjena posredstvom kontrolisanja uslova pod kojima se uzgajaju rekombinantne ćelijske linije. Dok postoji mnoštvo studija koje su usmerene ka povećavanju prinosa proteina posredstvom manipulisanja komponentama medijuma za kultivaciju, dotle je daleko manje izveštaja koji se odnose na modulaciju glikozilacije proteina posredstvom modifikovanja medijuma za kultivaciju ćelija u kome se uzgajaju rekombinantne ćelije, podvrgnute inženjeringu. Jedan primer je izložen u U.S. Patentu No.5,705,364, koji se odnosi na postupak za kontrolisanje sadržaja sijalinske kiseline glikoproteina, proizvedenog od strane ćelija sisara, posredstvom dodavanja alkanske kiseline medijumu za kultivaciju. Međutim, na mogućnost povećavanja ADCC aktivnosti antitela kroz modifikovanje medijuma za kultivaciju u kojima se ekspresuju rekombinantna antitela nije još dovoljno obraćena pažnja. Sledstveno tome, veoma bi poželjno bilo da se razvije medijum ćelijske kulture za kultivaciju ćelija sisara za ekspresiju antitela sa smanjenim nivoima fukoze i povećanom ADCC aktivnošću.

WO 02/066603 prikazuje postupke i kompozicije za hemijski definisane medijume za uzgajanje ćelija sisara za proizvodnju komercijalno korisnih količina ekspresovanih proteina.

3. IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na otkriće da se glikoproteini (npr., antitela) sa povoljnim karakteristikama proizvode kultivisanjem ćelija sisara u medijumu za kultivaciju koji sadrži visoku koncentraciju (npr., najmanje 5 mM) glicina, (dalje u nastavku "medijum sa visokim glicinom"). Određenije, kultivacijom domaćinskih ćelija sisara u medijumima sa visokim glicinom povećavaju se nivoi ne-fukoziliranih glikoformi. Ćelije sisara se mogu koristiti za proizvodnju antitela koja ispoljavaju pojačanu biološku aktivnost, uključujući povećanu aktivnost antitelozavisne celularne citotoksičnosti ("ADCC").

Sledstveno tome, pronalazak uopšteno obezbeđuje postupke i kompozicije za ekspresovanje rekombinantnih proteina (npr., antitela) sa modifikovanim profilima glikozilacije u poređenju sa glikoproteinima koji se ekspresuju u uobičajenim medijumima za kultivaciju. U postupcima i kompozicijama su korišćeni medijumi sa visokim glicinom, za ekspresiju glikoproteina, kao što su antitela, u ćelijama sisara, što pruža prednost proizvodnje glikoproteina sa smanjenim nivoima fukozilacije u poređenju sa glikoproteinima, proizvedenim u uobičajenim medijumima za kultivaciju.

Sledstveno tome, u skladu sa ovim pronalaskom, obezbeđen je postupak proizvodnje IgG1 antitela, koji obuhvata kultivaciju NSO ćelija podvrgnutih inženjeringu, da bi sekretovale i ekspresovale IgG1 antitelo, u medijumu ćelijske kulture koji sadrži glicin u koncentraciji koja se kreće između 5 mM i 30 mM, pod uslovima, koji su pogodni za ekspresiju i sekreciju IgG1 antitela, čime se proizvodi IgG1 antitelo.

Pored toga, postupci pronalaska mogu biti korišćeni za modulaciju i kontrolu glikozilacije proteina tokom proizvodnje. Poboljšana kontrola proizvoda glikozilacije tokom proizvodnje poželjna je zbog toga što se time smanjuje rizik od odbacivanja serije i unapređuje kontrolisanje tokom tehnološkog prenosa između pozicija proizvodnje i tokom razvijanja procesa. Prema tome, mogu biti korišćeni postupci za održavanje reproducibilnosti glikozilacijskih profila proizvoda, bez uvođenja izmena postupka.

Ćelije sisara koje je moguće podvrgnuti inženjeringu da bi se proizveli rekombinantni glikoproteini uključuju: NS0 ćelije, CHO ćelije, SP2/0 ćelije mišjeg mijeloma, BHK-21 ćelije bubrega mladunca hrčka i HEK0291 ćelije bubrega humanog embriona. U određenim ostvarenjima, NS0 ćelije se podvrgavaju rekombinantnom inženjeringu da bi se proizvela antitela.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje medijume za kultivaciju, pogodne za kultivisanje ćelija sisara, koji sadrže glicin u koncentraciji između 5 mM i 100 mM, i opciono druge aminokiseline u različitim koncentracijama, kako je naznačeno u izlaganju. Medijum za kultivaciju je, poželjno, hemijski definisan medijum bez proteina. Koncentracija glicina u medijumu za kultivisanje ćelija može biti, na primer, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 30 mM ili 50 mM. U određenim ostvarenjima, koncentracija glicina u medijumu ćelijske kulture je ograničena posredstvom bilo kog od dva prethodna ostvarenja, npr., koncentracija koja se kreće u rasponu od 5 mM do 10 mM, od 7 mM do 10 mM, od 10 mM do 15 mM, od 12 mM do 17 mM, od 15 mM do 20 mM, od 16 mM do 18 mM, od 10 mM do 30 mM, od 10 mM do 25 mM, od 20 mM do 30 mM, od 10 mM do 50 mM, od 20 mM do 50 mM, itd. Ostale aminokiseline mogu biti prisutne u medijumu za kultivaciju, uopšteno u koncentracijama koje se obično nalaze u uobičajenom bazalnom medijumu. U jednom ostvarenju, koncentracije aminokiselina u medijumima za kultivaciju ovog pronalaska nalaze se u rasponima, navedenim u Tabeli 2. Medijum za kultivaciju može, isto tako, da uključi jednu ili više dodatnih komponenti, kao što su: vitamini, elementi u tragovima, energetski izvori, masne kiseline, faktori rasta, nukleozidi, lipidi, hormoni i/ili antibiotici. Pored toga, medijum može uključiti pufer, regulator osmolaliteta i/ili surfaktant. Ostali detalji takvih dodatnih komponenti mogu se naći u Poglavlju 5.1.

U drugom aspektu, jedna ili više aminokiselina koje nisu glicin imaju koncentracije koje su jednake ili niže od koncentracija, prikazanih u Tabeli 3 ili Tabeli 4. Na primer, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili jedanaest aminokiselina može imati koncentracije, koje su jednake ili niže od koncentracija, koje su navedene u Tabeli 3 ili Tabeli 4. U jednom ostvarenju, koncentracija lizina u medijumu za kultivaciju je između 0.5 mM i 5.0 mM.

U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju glikoproteina od značaja ("GOI"), npr., antitelo od značaja ("AOI"), koji obuhvataju kultivaciju ćelija sisara, npr., NS0 ćelija, koje se podvrgavaju inženjeringu da bi sekretovale i ekspresovale GOI ili AOI u medijumu ćelijske kulture, koji sadrži glicin u koncentraciji od najmanje 5 mM, na primer, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM ili 30 mM. AOI može biti, primera radi, mišje antitelo, humanizovano antitelo, himerično antitelo ili potpuno humano antitelo. U specifičnim ostvarenjima, koncentracija glicina u medijumu ćelijske kulture je ograničena posredstvom bilo kog od dva prethodna ostvarenja, npr., koncentracija glicina koja se kreće u rasponu od 5 mM do 10 mM, od 7 mM do 10 mM, od 10 mM do 15 mM, od 12 mM do 17 mM, od 15 mM do 20 mM, od 16 mM do 18 mM, od 10 mM do 30 mM, od 10 mM do 25 mM, od 20 mM do 30 mM, itd. U određenim ostvarenjima, medijum za kultivaciju je hemijski definisan medijum bez proteina.

U jednom ostvarenju, AOI je HuLuc63 (elotuzumab). Aminokiselinska sekvencazrelog VHlanca elotuzumaba (SEQ ID NO:1), zrelog VLlanca elotuzumaba (SEQ ID NO:2), puna sekvenca teškog lanca elotuzumaba (SEQ ID NO:3) i puna sekvenca lakog lanca elotuzumaba (SEQ ID NO:4) prikazane su u Tabeli 7. Postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula elotuzumaba, u kojima je najmanje 4% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 2.5% glikana manoza5 glikani. U jednom ostvarenju, postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula elotuzumaba u kojima je najmanje 5% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 3% glikana manoza5 glikani.

U drugom ostvarenju, antitelo od značaja je daklizumab. Aminokiselinska sekvencazrelog VHlanca daklizumaba (SEQ ID NO:5), zrelog VLlanca daklizumaba (SEQ ID NO:6), puna sekvenca teškog lanca daklizumaba (SEQ ID NO:7) i puna sekvenca lakog lanca daklizumaba (SEQ ID NO:8) prikazane su u Tabeli 7. Postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula daklizumaba, u kojima je najmanje 3% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 1.5% glikana manoza5 glikoforme. U jednom ostvarenju, postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula daklizumaba u kojima je najmanje 4% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 2% glikana manoza5 glikani.

U drugom ostvarenju, AOI je voloksicimab. Aminokiselinska sekvenca zrelog VHlanca voloksicimaba (SEQ ID NO:9), zrelog VLlanca voloksicimaba (SEQ ID NO:10), puna sekvenca teškog lanca voloksicimaba (SEQ ID NO:11) i puna sekvenca lakog lanca voloksicimaba (SEQ ID NO:12) prikazane su u Tabeli 7. Postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula voloksicimaba, u kojima je najmanje 1% molekula bez fukoze i u kojima su najmanje 0.5% glikana manoza5 glikani.

U daljem ostvarenju, AOI je PDL241. Aminokiselinska sekvenca zrelog VHlanca PDL241 (SEQ ID NO:13), zrelog VLlanca PDL241 (SEQ ID NO:14), puna sekvenca teškog lanca PDL241 (SEQ ID NO:15), puna sekvenca lakog lanca PDL241 (SEQ ID NO:16) prikazane su u Tabeli 7. Postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula PDL241, u kojima je najmanje 14% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 8% glikana manoza5 glikani. U jednom ostvarenju, postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula PDL241 u kojima je najmanje 15% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 9% glikana manoza5 glikani.

U jednom drugom ostvarenju, AOI je PDL192 (enavatuzumab). Aminokiselinska sekvenca zrelog VHlanca enavatuzumaba (SEQ ID NO:17), zrelog VLlanca enavatuzumaba (SEQ ID NO:18), puna sekvenca teškog lanca enavatuzumaba (SEQ ID NO:19) i puna sekvenca lakog lanca enavatuzumaba (SEQ ID NO:20) prikazane su u Tabeli 7. Postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula enavatuzumaba u kojima je najmanje 5% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 2.5% glikana manoza5 glikani. U jednom ostvarenju, postupcima kultivacije ćelija ovog pronalaska proizvodi se populacija molekula enavatuzumaba u kojima je najmanje 6% glikana bez fukoze i u kojima su najmanje 3% glikana manoza5 glikani.

4. KRATKI OPIS SLIKA

SLIKA 1 prikazuje strukturu nekih uobičajenih N-vezanih glikana.

SLIKA 2 prikazuje relativnu količinu ne-fukoziliranih G0 glikana bez GlcNAc (N-acetilglukozamin), vezanih na pet različitih antitela, proizvedenih od strane NS0 ćelija, koje su uzgajane u bazalnom medijumu, dopunjenom dodatnim glicinom. Količina je izražena kao procenat u odnosu na količinu glikana prisutnu u antitelima, proizvedenim od strane NS0 ćelija, koje su kultivisane u kontrolnom bazalnom medijumu bez dopunjavanja dodatnim glicinom.

SLIKA 3 prikazuje relativnu količinu manoza5 (Man5) glikana, vezanih na pet različitih antitela, proizvedenih od strane NS0 ćelija, koje su uzgajane u bazalnom medijumu sa koncentracijom glicina od 17 mM. Količina je izražena kao procenat u odnosu na količinu glikana, koja je prisutna u antitelima, proizvedenim od strane NS0 ćelija, koje su kultivisane u kontrolnom bazalnom medijumu bez dopunjavanja dodatnim glicinom.

SLIKA 4 prikazuje relativnu količinu ukupnih ne-fukoziliranih glikana, vezanih na pet različitih antitela, proizvedenih od strane NS0 ćelija, koje su uzgajane u bazalnom medijumu sa koncentracijom glicina od 17 mM. Količina je izražena kao procenat u odnosu na količinu glikana, prisutnu u antitelima, proizvedenim od strane NS0 ćelija, koje su kultivisane u kontrolnom bazalnom medijumu bez dopunjavanja dodatnim glicinom.

SLIKA 5 prikazuje relativne količine ne-fukoziliranih G0 glikoformi bez GlcNAc (N-acetilglukozamin) i glikoformi Man5-tipa, vezanih za PDL192, proizveden od strane NS0 ćelija koje su uzgajane u bazalnom medijumu, koji je dopunjen različitim koncentracijama glicina (5, 15, 30 mM). Količina je izražena kao procenat u odnosu na količinu glikoformi, koja je prisutna u antitelima, proizvedenim od strane NS0 ćelija, koje su kultivisane u kontrolnom bazalnom medijumu bez dopunjavanja dodatnim glicinom.

SLIKA 6 prikazuje relativnu jačinu vezivanja za CD16a receptor za četiri IgG1 antitela (elotuzumab, daklizumab, PDL192 i PDL241), proizvedena od strane NS0 ćelija koje su uzgajane u bazalnom medijumu, koji je dopunjen dodatnim glicinom. Veličina je izražena kao procenat u odnosu na afinitete vezivanja za CD16a istih antitela, koja su proizvedena od strane NS0 ćelija, kultivisanih u kontrolnom bazalnom medijumu bez dopunjavanja dodatnim glicinom.

SLIKA 7 prikazuje relativnu jačinu vezivanja za CD16a receptor za PDL192 (enavatuzumab), koji je proizveden od strane NS0 ćelija, koje su kultivisane u bazalnom medijumu, dopunjenom različitim koncentracijama glicina (5, 15, 30 mM). Veličina je izražena kao procenat u odnosu na afinitete vezivanja za CD16a istih antitela, proizvedenih od strane NS0 ćelija, koje su kultivisane u kontrolnom bazalnom medijumu bez dopunjavanja dodatnim glicinom.

SLIKES 8A-C prikazuju ADCC aktivnost elotuzumaba, proizvedenog kontrolnim postupkom i postupkom sa visokim glicinom. Studije su izvedene na mononuklearnim ćelijama humane periferne krvi (PBMC-i) od tri različita davaoca. U testove su uključene negativne kontrole, uz korišćenje kontrolnog antitela bez ADCC aktivnosti i uzoraka bez dodavanja antitela.

SLIKE 9A-B prikazuju ADCC aktivnost PDL241, proizvedenog kontrolnim postupkom i postupkom sa visokim glicinom. Studije su izvedene na PBMC ćelijama od dva različita davaoca. U testove su uključene negativne kontrole, uz korišćenje kontrolnog antitela bez ADCC aktivnosti i uzoraka bez dodavanja antitela.

SLIKE 10A-B prikazuju ADCC aktivnost PDL192 (enavatuzumab), proizvedenog kontrolnim postupkom i postupkom sa visokim glicinom. Studije su izvedene na PBMC ćelijama od dva različita davaoca. U testove su uključene negativne kontrole, uz korišćenje kontrolnog antitela bez ADCC aktivnosti i uzoraka bez dodavanja antitela.

SLIKE 11A-B prikazuju ADCC aktivnost daklizumaba, proizvedenog kontrolnim postupkom i postupkom sa visokim glicinom. Studije su izvedene na PBMC ćelijama od dva različita davaoca. U testove su uključene negativne kontrole, uz korišćenje kontrolnog antitela bez ADCC aktivnosti i uzoraka bez dodavanja antitela.

5. DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na kompozicije i postupke za ekspresiju rekombinantnog glikoproteina (npr., antitelo). Kompozicijama i postupcima se proizvode glikoproteini sa redukovanim fukoziliranim glikoformama i povećanom ADCC aktivnošću u poređenju sa glikoproteinom, koji se proizvodi u uobičajenim medijumima za kultivaciju. Antitela, koja se proizvode od strane ekspresionih sistema uz korišćenje kompozicija i postupaka pronalaska, pogodno ispoljavaju manju fukozilaciju, nego kada se proizvode uzgajanjem u uobičajenim medijumima. U nastavku su opisani različiti aspekti pronalaska. U poglavlju 5.1 opisuju se medijumi za kultivaciju koji sadrže povećane koncentracije glicina (t.j., medijumi sa visokim glicinom), koji su pogodni za kultivaciju ćelija sisara, koje su u stanju da ekspresuju proteine. U poglavlju 5.2 opisuju se različiti glikoproteini (npr., antitela) koji se mogu proizvesti u medijumima sa visokim glicinom. U poglavlju 5.3 opisuju se nukleinske kiseline i ekspresioni sistemi za proizvodnju glikoproteina. U poglavlju 5.4 opisuje se postupci kultivisanja koji se mogu koristiti za proizvodnju glikoproteina. U poglavlju 5.5 opisuju se postupci povraćaja i prečišćavanja glikoproteina, proizvedenih postupcima pronalaska. U poglavlju 5.6 opisuju se populacije glikoproteina, koje su proizvedene postupcima pronalaska. U poglavlju 5.7 opisuju se farmaceutske kompozicije glikoproteina, koje su proizvedene postupcima pronalaska. U poglavlju 5.8 opisuju se postupci lečenja raznih bolesti, uz korišćenje primernih antitela, proizvedenih postupcima ovog pronalaska.

5.1. Medijumi ćelijske kulture

U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje medijum za kultivisanje, koji je pogodan za kultivisanje ćelija sisara i koji sadrži visoke koncentracije glicina. Kako je ovde korišćen, naziv "medijum za kultivisanje" odnosi se medijum koji je pogodan za uzgajanje ćelija sisara u in vitro ćelijskoj kulturi. Kako je ovde korišćen, naziv "ćelijska kultura" ili "kultura" odnosi se na rast ćelija sisara u in vitro okruženju. Uobičajeni medijum za kultivisanje sadrži: aminokiseline, vitamine, elemente u tragovima, slobodne masne kiseline i izvor energije. U medijum za kultivisanje mogu biti uključene dodatne komponente za rast, kao što su: faktori rasta, nukleozidi, lipidi, hormoni i antibiotici. Pored toga, medijum može sadržavati pufer, regulator osmolaliteta i surfaktant.

Kao što će stručno lice u ovoj oblasti moći prepoznati, medijumi za kultivisanje i hranjivi medijumi, koji se koriste za kultivisanje ćelija za proizvodnju rekombinantnog proteina (npr., antitelo), kao i druge varijable, kao što su: režim gajenja, brzina rasta, temperatura i nivoi kiseonika, mogu uticati na prinos i kvalitet ekspresovanog proteina. Postupci optimizacije ovih uslova nalaze se unutar okvira delatnosti stručnjaka u ovoj oblasti; primerni uslovi su navedeni u Primernim ostvarenjima pronalaska. Poželjno, ćelije se adaptiraju na rast u medijumima bez prisustva holesterola, seruma i ostalih komponenti životinjskog porekla; u takvim slučajevima, medijumi za kultivisanje i hranjivi medijumi poželjno uključuju definisane hemikalije, koje služe kao zamena za takve komponente. Sledstveno tome, postupci proizvodnje rekombinantnih proteina mogu da uključe kultivisanje rekombinantnih ćelija sisara ovog pronalaska u hemijski definisanom medijumu, bez prisustva komponenti životinjskog porekla.

Medijumi za kultivisanje ovog pronalaska su medijumi sa visokim glicinom. Kako je ovde korišćen, izraz "medijum sa visokim glicinom" odnosi se na medijum u kome je koncentracija glicina veća od koncentracije glicina koja se nalazi u uobičajenim medijumima ćelijske kulture. Kako je prikazano u Tabeli 1 u nastavku, koncentracije glicina u komercijalnim medijumima za kultivaciju (npr., bazalni medijumi) kreću se u rasponu od oko 0.1 mM do približno 2 mM.

Tabela 1: Koncentracija glicina u uobičajenim komercijalnim medijumima za kultivisanje

Koncentracija glicina u medijumima za kultivisanje pronalaska je, poželjno 5 mM ili više. Na primer, koncentracija glicina u medijumima za kultivisanje može biti od 5 mM do 100 mM (npr., 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 25 mM, 30 mM ili 50 mM). U specifičnim ostvarenjima, koncentracija glicina u medijumu za kultivaciju može biti ograničena posredstvom bilo koje od dve prethodne vrednosti, kao što je, ali bez ograničavanja na njih, koncentracija koja se kreće u rasponu od 5 mM do 10 mM, od 7 mM do 10 mM, od 10 mM do 15 mM, od 12 mM do 17 mM, od 15 mM do 20 mM, od 16 mM do 18 mM, od 10 mM do 30 mM, od 10 mM do 25 mM, od 20 mM do 30 mM, od 10 mM do 50 mM ili od 20 mM do 50 mM.

Medijumi za kultivisanje ovog pronalaska mogu sadržavati brojne aminokiseline pored glicina. Na primer, medijumi za kultivisanje mogu sadržavati druge aminokiseline, koje uključuju: alanin, arginin, asparagin, asparaginsku kiselinu, cistein, glutaminsku kiselinu, glutamin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin. U određenim ostvarenjima, medijumi za kultivisanje mogu sadržavati aminokiseline (koje nisu glicin), koje su prisutne u koncentracijama u kojima se obično nalaze u uobičajenim medijumima (npr., bazalni medijumi). Pogodne aminokise imaju koncentracije koje se kreću u rasponima, navedenim u Tabeli 2.

Tabela 2: Primeri raspona koncentracija aminokiselina u medijumima za kultivisanje ovog pronalaska

U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje medijum za kultivisanje u kome je glicin prisutan u koncentraciji od 5 mM do 30 mM, i u kome jedna ili više aminokiselina koje nisu glicin imaju koncentracije koje su jednake ili niže od koncentracija, navedenih u Tabeli 3. Na primer, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili jedanaest aminokiselina može imati koncentracije koje su jednake ili niže od koncentracija, navedenih u Tabeli 3. U jednom ostvarenju, koncentracija lizina u medijumu za kultivisanje je između 0.5 mM i 5.0 mM. Ostale aminokiseline, koje nisu naznačene u Tabeli 2, mogu biti prisutne u medijumu za kultivisanje, na primer, u koncentracijama koje se kreću u rasponima, navedenim u Tabeli 2.

Tabela 3: Primeri maksimalnih koncentracija pojedinih aminokiselina u medijumima za kultivisanje određenih ostvarenja ovog pronalaska

U drugim aspektima, pronalazak obezbeđuje medijum za kultivisanje u kome je glicin prisutan u koncentraciji od 5 mM do 30 mM, i u kome jedna ili više aminokiselina koje nisu glicin imaju koncentracije koje su jednake ili niže od koncentracija, navedenih u Tabeli 4. Na primer, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili jedanaest aminokiselina može imati koncentracije koje su jednake ili niže od koncentracija, navedenih u Tabeli 4. Druge aminokiseline, koje nisu naznačene u Tabeli 3, mogu biti prisutne u medijumu za kultivisanje, na primer, u koncentracijama koje se kreću u rasponima koji su navedeni u Tabeli 2.

Tabela 4: Primeri maksimalnih koncentracija pojedinih aminokiselina u medijumima za kultivisanje određenih ostvarenja ovog pronalaska

Pored toga, medijumi za kultivisanje ovog pronalaska mogu sadržavati različite vitamine. Uobičajeni vitamini uključuju, ali bez ograničavanja na njih, vitamin B-12, biotin, holin, folnu kiselinu, niacinamid, kalcijum pantotenat, piridoksal hidrohlorid, riboflavin i tiamin hidrohlorid. Vitamini mogu pogodno biti korišćeni u rasponima koncentracija, koji su prikazani u Tabeli 5.

Tabela 5: Primeri koncentracija vitamina u medijumima za kultivisanje ovog pronalaska

Dodatno, medijumi ćelijske kulture ovog pronalaska mogu sadržavati različite elemente u tragovima. Uobičajeni elementi u tragovima uključuju, ali bez ograničavanja na njih, kalcijum hlorid anhidrovani, magnezijum hlorid anhidrovani, magnezijum sulfat anhidrovani, kalijum hlorid i natrijum fosfat dibazni anhidrovani. Elementi u tragovima mogu biti, pogodno, korišćeni u medijumima za kultivisanje u rasponima koncentracija, koji su prikazani u Tabeli 6.

Tabela 6: Primeri koncentracija elemenata u tragovima u medijumima za kultivisanje

ovog pronalaska

Medijumi za kultivisanje mogu, isto tako, da uključe najmanje jedan izvor energije. Primeri izvora energije, koji mogu biti uključeni u ćelijsku kulturu, obuhvataju, glukozu, manozu, galaktozu, maltozu i fruktozu. Glukoza se može dodavati medijumu za kultivaciju u koncentraciji koja se kreće u rasponu od 5 g/L do 20 g/L.

Medijumi za kultivisanje ovog pronalaska mogu, isto tako, da sadrže pufer. Pufer se koristi da bi se ćelijska kultura održavala na pogodnom pH. Puferi koji se mogu koristiti u medijumu za kultivisanje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, HEPES, fosfatni pufer (npr., mono- i di-bazni natrijum fosfat) i natrijum karbonat. Pufer može biti korišćen za održavanje pH medijuma za kultivisanje u prihvatljivom rasponu, obično se pH kreće u rasponu od 6.5 do 7.5, a još češće se pH kreće u rasponu od 6.8 do 7.2.

Medijumi za kultivisanje mogu sadržavati soli za regulisanje osmolaliteta. Na primer, regulator osmolaliteta se obično dodaje radi održavanja osmolaliteta medijuma za kultivisanje u rasponu između 250-400 mili-osmola (mOsm), i još češće između 270-350 mOsm. Karakteristični regulatori osmolaliteta uključuju soli, kao što je natrijum hlorid ili kalijum hlorid. Od strane lica stručnog u ovoj oblasti proceniće se da će visoke količine glicina u medijumu za kultivaciju imati uticaja na osmolalitet medijuma. Sledstveno tome, osmolalitet medijuma za kultivisanje može se održavati u odgovarajućem rasponu posredstvom smanjivanja količine regulatora osmolaliteta, koji se dodaje medijumu nakon uzimanja u obzir koliki doprinos osmolalitetu daju visoki nivoi glicina.

Medijumi za kultivisanje ovog pronalaska mogu, isto tako, da sadrže lipidni faktor. Uobičajeni lipidni faktori, uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, lipoinsku kiselinu, holin hlorid, oleinsku kiselinu i fosfatidilholin.

5.2. Glikoproteini

Ovaj pronalazak obezbeđuje glikoproteine, obogaćene ne-fukoziliranim glikoformama. U Poglavlju 5.2.1 opisuju se antitela, koja mogu biti proizvedena postupcima ovog pronalaska. U Poglavlju 5.2.2 opisuju se ostale vrste glikoproteina koje se mogu proizvesti postupcima pronalaska.

5.2.1. Antitela

Antitela (At) i imunoglobulini (Ig) su glikoproteini koji imaju istovetne strukturne karakteristike. Dok antitela ispoljavaju specifičnost vezivanja za specifiču metu, imunoglobulini uključuju i antitela i druge molekule slične antitelu, koje ne poseduju specifičnost prema meti. Nativna antitela i imunoglobulini su obično heterotetramerni glikoproteini od približno 150,000 daltona, koji su sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH), koji slede brojni konstantni domeni. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na njegovom drugom kraju.

Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela, obogaćena ne-fukoziliranim glikoformama. Ukoliko nije navedeno drugačije, naziv "antitelo" (At) odnosi se na imunoglobulinski molekul koji se specifično vezuje, ili ulazi u imunološku reakciju, sa određenim antigenom, a uključuje: poliklonske forme, monoklonske forme, forme podvrgnute genetskom inženjeringu i na drugi način modifikovane forme antitela, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, himerična antitela, humanizovana antitela, heterokonjugate antitela (npr., bispecifična antitela, diatela, triatela i tetratela) i antigen-vezujuće fragmente antitela, uključujući npr., Fab’, F(ab’)2<, Fab, Fv, rIgG i>scFv fragmente. Pored toga, ukoliko nije naznačeno drugačije, naziv "monoklonsko antitelo" (mAt) je utvrđen kako bi uključio intaktne molekule, kao i fragmente antitela (kao što su, na primer, Fab i F(ab’)2fragmenti), koji su u stanju da se specifično vezuju za protein. Fab i F(ab’)2fragmenti nemaju Fc fragment intaktnog antitela, eliminišu se iz cirkulacije životinje mnogo brže, i mogu ispoljavati manje ne-specifičnog tkivnog vezivanja nego intaktno antitelo (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med.24:316). Naziv "scFv" odnosi se na jednolančano Fv antitelo, u kome se varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca iz uobičajenog antitela spajaju, kako bi obrazovali jedan lanac.

Reference koje se tiču "VH" odnose se na varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca antitela, uključujući teški lanac Fv, scFv ili Fab. Reference koje se tiču "VL" odnose se na varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji uključuje laki lanac Fv, scFv, dsFv ili Fab.

Varijabilni domeni i lakog lanca i teškog lanca poseduju regione koji određuju komplementarnost (CDR-i), koji su, takođe, poznati kao hipervarijabilni regioni. Delovi varijabilnih domena koji su više očuvani nazivaju se regionima okvira (FR). Kao što je u struci poznato, pozicija/granica aminokiselina koje obeležavaju hipervarijabilni region antitela može varirati u zavisnosti od konteksta i raznih, u struci poznatih, definicija. Neki položaji u okviru varijabilnog domena mogu biti posmatrani kao hibridni hipervarijabilni položaji time što se može prihvatiti da su ovi položaji, prema jednoj grupi kriterijuma, unutar okvira hipervarijabilnog regiona, dok su, prema drugačijoj grupi kriterijuma, oni van okvira hipervarijabilnog regiona. Jedan ili više od ovih položaja može se, takođe, naći u proširenim hipervarijabilnim regionima. CDR-i u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini, pomoću FR regiona i, sa CDR-ima iz drugog lanca, doprinose obrazovanju ciljnog vezujućeg položaja antitela (vidi Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md.

1987). Kako je ovde korišćeno, brojčano označavanje aminokiselinskih ostataka imunoglobulina je izvedeno prema sistemu numerisanja aminokiselinskih ostataka imunoglobulina Kabata i saradnika, ukoliko nije naznačeno drugačije.

Fragmenti antitela mogu, isto tako, biti proizvedeni korišćenjem kompozicija i postupaka pronalaska. Naziv "fragment antitela" odnosi se na deo antitela pune dužine, uopšteno na metu vezivanja ili varjiabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju: Fab,Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente. "Fv" fragment jeste minimalni fragment antitela koji sadrži kompletni položaj prepoznavanja mete i vezivanja. Ovaj region se sastoji od dimera od varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, ne-kovalentnoj vezi (VH -VL dimer). To znači da u ovoj konfiguraciji tri CDR-a svakog varijabilnog domena ulaze u interakciju, da bi se definisao položaj ciljnog vezivanja na površini VH-VL dimera. Često šest CDR-a prenosi antitelu specifičnost vezivanja za metu. Međutim, u nekim slučajevima čak i pojedinačni varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri CDR-a specifična za metu) može imati sposobnost prepoznavanja i vezivanja za metu. "Jedno-lančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela sadrže VH i VL domene antitela u jednom polipeptidnom lancu. Uopšteno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena, koji omogućuje da scFv obrazuje željenu strukturu za ciljno vezivanje. "Antitela sa jednim domenom" sastavljena su od jednog VH ili VL domena, koji ispoljavaju dovoljan afinitet prema meti. U specifičnom ostvarenju, antitelo sa jednim domenom je antitelo porodice Camelidae (vidi, npr., Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

Fab fragment sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata posredstvom dodavanja nekoliko ostataka na karboksilnom kraju CH1domena teškog lanca, koji uključuju jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. F(ab’) fragmenti se proizvode cepanjem disulfidne veze na cisteinskim ostacima zgloba F(ab’)2proizvoda pepsinske digestije. Dodatna hemijska kuplovanja fragmenata antitela poznata su licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti.

U određenim ostvarenjima, antitela pronalaska su monoklonska antitela. Naziv "monoklonsko antitelo", kako je ovde korišćen, nije ograničen na antitela, proizvedena tehnologijom hibridoma. Naziv "monoklonsko antitelo" odnosi se na antitelo, koje se dobija iz jednog klona, uključujući bilo koji klon eukariota, prokariota ili faga, a ne na postupak kojim se ono proizvodi. Monoklonska antitela, koja se koriste u ovom pronalasku, mogu se izraditi korišćenjem širokog varijeteta tehnika, poznatih u struci, koje uključuju korišćenje hibridoma tehnologije, rekombinantne tehnologije i tehnologije izloženosti faga, ili njihove kombinacije. Antitela pronalaska obuhvataju: himerična, primatizovana, humanizovana ili humana antitela.

Antitela, koja su proizvedena korišćenjem postupaka i kompozicija pronalaska mogu biti himerična antitela. Naziv "himerično" antitelo, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo koje poseduje varijabilne sekvence, dobijene iz ne-humanih imunoglobulina, kao što je antitelo pacova ili miša, i konstantne regione humanih imunoglobulina, koji su obično odabrani iz kalupa humanih imunoglobulina. Postupci za proizvodnju himeričnih antitela poznati su u ovoj oblasti. Vidi, npr., Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. No. 5,807,715; 4,816,567 i 4,816397.

Antitela, koja su proizvedena korišćenjem postupaka i kompozicija pronalaska mogu biti humanizovana antitela. "Humanizovani" oblici ne-humanih (npr., mišjih) antitela su himerični imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su: Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2<ili>drugi subdomeni ciljnog vezivanja antitela), koji sadrže minimalne sekvence dobijene iz nehumanog imunoglobulina. Uopšteno, humanizovano antitelo će u suštini sadržavati sve od najmanje jednog, a najčešće dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju regionima ne-humanog imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR regioni su oni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. Humanizovano antitelo može, isto tako, da sadrži najmanje jedan deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično onaj iz humanih imunoglobulinskih konsenzus sekvenci. Postupci humanizovanja antitela poznati su u ovoj oblasti. Vidi, npr., Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; U.S. Patent No: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370 Queena i saradnika.; EP239400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Patent No.5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.91:969-973; i U.S. Patent No.5,565,332.

Antitela, koja su proizvedena korišćenjem postupaka i kompozicija pronalaska mogu biti humana antitela. Potpuno "humana" antitela mogu biti poželjna za terapeutski tretman humanih pacijenata. Kako su ovde korišćena, "humana antitela" uključuju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina, a uključuju antitela, izolovana iz biblioteka humanih imunoglobulina ili iz životinja koje su transgenske za jedan ili više humanih imunoglobulina i koje ne ekspresuju endogene imunoglobuline. Humana antitela mogu biti dobijena brojnim postupcima, poznatim u struci, koji uključuju postupke izloženih faga, uz korišćenje biblioteka antitela dobijenih iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. Vidi U.S. Patent No. 4,444,887 i 4,716,111; i PCT publikacije WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735 i WO 91/10741.

Humana antitela mogu, isto tako, biti proizvedena korišćenjem transgenskih miševa koji nisu u stanju da ekspresuju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da ekspresuju gene humanih imunoglobulina. Vidi, npr., PCT publikacije WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; U.S. Patent No. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771 i 5,939,598.

Pored toga, kompanije, kao što su: Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL) i Regeneron (Tarrytown, NY), mogu biti angažovane da obezbede humana antitela, usmerena prema odabranom antigenu, uz korišćenje tehnologija, sličnih onima koje su prethodno opisane. Potpuno humana antitela koja prepoznaju odabrani epitop mogu biti proizvedena korišćenjem tehnika, koje se označavaju kao "dirigovana selekcija". U ovom pristupu, odabrano ne-humano monoklonsko antitelo, npr., mišje antitelo, korišćeno je za upravljanje izborom potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).

Antitela, koja se proizvode korišćenjem postupaka i kompozicija pronalaska, mogu biti primatizovana. Naziv "primatizovano antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži varijabilne regione majmuna i konstantne regione čoveka. Postupci za proizvodnju primatizovanih antitela poznati su ovoj oblasti. Vidi, npr., U.S. Patent No.5,658,570; 5,681,722 i 5,693,780.

Antitela, koja se proizvode korišćenjem postupaka i kompozicija pronalaska, mogu biti bispecifična antitela. Bispecifična antitela su monoklonska, često humana ili humanizovana, antitela koja poseduju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena.

Antitela, koja se proizvode korišćenjem postupaka i kompozicija pronalaska uključuju derivatizovana antitela. Primera radi, ali ne i kao ograničenje, derivatizovana antitela su obično modifikovana posredstvom glikozilacije, acetilacije, pegilacije, fosforilacije, amidacije, derivatizacije uz pomoć poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja, povezivanja za ćelijski ligand ili drugi protein, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se izvršiti uz pomoć poznatih tehnika, koje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd.. Pored toga, derivat može da sadrži jednu ili više aminokiselina koje ne postoje u prirodi, npr., korišćenjem ambrx tecnologije (vidi, npr., Wolfson, 2006, Chem. Biol.13(10):1011-2).

U jednom drugom ostvarenju pronalaska, antitela ili njihovi fragmenti mogu biti antitela ili fragmenti antitela, čije sekvence su modifikovane da bi se izmenila najmanje jedna biološka efektorska funkcija, posredovana konstantnim regionom, u odnosu na odgovarajuću sekvencu divljeg tipa.

Na primer, u nekim ostvarenjima, antitelo pronalaska može biti modifikovano da bi se redukovala najmanje jedna biološka efektorska funkcija, posredovana konstantnim regionom, u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr., redukovano vezivanje za Fc receptor (FcR). Vezivanje za FcR može biti redukovano uz pomoć mutiranja segmenta imunoglobulinskog konstantnog regiona antitela na određenim regionima, koji su neophodni za FcR interakcije (vidi npr., Canfield i Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; i Lund et al., 1991, J. Immunol.

147:2657-2662).

U drugim ostvarenjima, antitela koja su proizvedena korišćenjem postupaka i kompozicija pronalaska, modifikovana su da bi se stekla ili poboljšala najmanje jedna biološka efektorska funkcija, posredovana konstantnim regionom, u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr., da bi se povećale FcgR interakcije (Vidi, npr., US 2006/0134709). Primera radi, antitelo sa konstantnim regionom koji se vezuje sa FcgRIIA, FcgRIIB i/ili FcgRIIIA sa većim afinitetom nego odgovarajući konstantni region divljeg tipa, može biti proizvedeno prema postupcima koji su ovde opisani.

Primeri antitela, koja se mogu proizvesti korišćenjem postupaka ovog pronalaska, uključuju, ali ne ograničavajući se njima, adalimumab, elotuzumab, enavatuzumab, daklizumab, voloksicimab, tositumomab, trastuzumab, istekinumab, abcicimab, bezilesomab, etaracizumab, pemtumomab, omalizumab, pertuzumab, natalizumab, sulesomab, tefibazumab, votumumab, motavizumab, oregovomabm, panitumumab, zalutumumab, igovomab, bevacizumab, baziliksimab, atlizumab, bektumomab, belimumab, alemtuzumab, nimotuzumab, mepolizumab, altumomab, ranibizumab, rituksimab, palivizumab, gemtuzumab, golimumab, fontolizumab, nofetumomab, ofatumumab, arcitumomab, cetuksimab, imciromab, certolizumab, rovelizumab, ruplizumab, ipilimumab, labetuzumab, katumaksomab, kanakinumab, denosumab, ekulizumab, fanolesomab, efalizumab, infliksimab, edrekolomab, efungumab, girentuksimab, ertumaksomab i toklizumab.

5.2.2. Ostali glikoproteini

Postupci pronalaska mogu biti korišćeni za proizvodnju glikoproteina bilo kog proteina, uključujući proteine za terapeutske potrebe. Primeri proteina koji mogu biti proizvedeni u skladu sa ovim pronalaskom, uključuju, ali ne ograničavajući se njima, faktore rasta, kao što je eritropoetin (EPO), humani horionski gonadotropin (hCG), faktor koji stimuliše kolonije granulocita (GCSF), antitrombin III, interleukin 1, interleukin 2, interleukin 6, humani horionski gonadotropin (hCG), antitrombin III, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, faktore koagulacije, kao što su faktor VIIIm faktor IX i humani protein C, epidermalni faktor rasta, faktor oslobađanja hormona rasta, epidermalni faktor rasta, angiostatin, vaskularni endotelni faktor-2 rasta i aktivator plazminogena.

5.3. Nukleinske kiseline i ekspresioni sistemi

Standardne rekombinantne DNK metodologije, kao što su one koje su opisane u Molecular Cloning; A Laboratory Manual, drugo izdanje (Sambrook, Fritsch i Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) i u U.S. Patentu No. 4,816,397, mogu biti korišćene za proizvodnju rekombinantnih ćelija sisara, pogodnih za proizvodnju glikoproteina u skladu sa postupcima pronalaska.

Glikoproteinske sekvence su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. U ostvarenjima, u kojima je glikoprotein antitelo, rekombinantne tehnike mogu biti korišćene za dobijanje gena teškog i lakog lanca antitela, ugradnju ovih gena u rekombinantne ekspresione vektore i uvođenje vektora u ćelije domaćina. Da bi se antitelo ekspresovalo rekombinantno, ćelija domaćina se transfektuju sa jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose fragmente DNK koji kodiraju imunoglobulinske lake i teške lance antitela, na takav način da se laki i teški lanci ekspresuju u ćelji domaćina, i, opciono, sekretuju u medijum u kome se kultivišu ćelije domaćina, pri čemu se antitela iz navedenog medijuma mogu povratiti. Da bi se proizvele nukleinske kiseline koje kodiraju antitela, najpre se dobijaju fragmenti DNK koji kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca. Ovi molekuli DNK mogu biti dobijeni posredstvom amplifikacije i modifikacije DNK ili cDNK germinativne linije, koji kodiraju varijabilne sekvence lakog i teškog lanca, na primer, korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR). Sekvence DNK germinativne linije za gene varijabilnih regiona teškog i lakog lanca poznate su u struci (Vidi, npr., "VBASE" bazu podataka za sekvence humane germinativne linije; vidi, takođe, Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol.22T:116-198 i Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol.24:827-836.

Fragment DNK koji kodira varijabilni region teškog ili lakog lanca antitela može biti sintetisan i korišćen kao šablon za mutagenezu, da bi se proizvela varijanta kao što je ovde opisana, uz korišćenje tehnika rutinske mutageneze; a, alternativno, fragment DNK koji kodira varijantu može biti sintetisan direktno.

Čim se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju antitelo, ovi DNK fragmenti mogu biti, dalje, podvrgnuti manipulisanju, uz pomoć standardnih tehnika rekombinante DNK, na primer, da bi se geni varijabilnog regiona konvertovali u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u gen scFv. U ovim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VL- ili VH-operativno se povezuje sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Izraz "operativno povezan", kako je korišćen u ovom kontekstu, utvrđen je kako bi označio da su dva fragmenta DNK spojena tako da aminokiselinske sekvence, koje su kodirane od strane dva fragmenta DNK, ostaju unutar okvira.

Izolovana DNK koja kodira VH region može biti konvertovana u gen teškog lanca pune dužine posredstvom operativnog povezivanja DNK koja kodira VH sa drugim molekulomDNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1<, CH>2<, CH>3<i, opciono, CH>4<). Sekvence>gena konstantnog regiona humanog teškog lanca poznate su u struci (vidi npr., Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), a fragmenti DNK koji pokrivaju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD, ali u određenim ostvarenjima to je konstantni region IgG1 ili IgG4. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VH može biti operativno povezana sa drugim molekulom DNK koji kodira samo CH1konstantni region teškog lanca.

Izolovana DNK koja kodira VL region može biti konvertovana u gen lakog lanca pune dužine (kao i gen lakog lanca Fab), posredstvom operativnog povezivanja DNK koja kodira VL sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca poznate su u struci (Vidi npr., Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto izdanje (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242)) a fragmenti DNK koji pokrivaju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region, a u nekim ostvarenjima je kapa konstantni region. Da bi se proizveo gen scFv, fragmenti DNK koji kodiraju VH- i VL- operativno se povezuju sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr., kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4~Ser)3(SEQ ID NO:21), tako da VH i VL sekvence mogu biti ekspresovane kao uporedni jedno-lančani protein, pri čemu su VL i VH regioni spojeni posredstvom fleksibilnog linkera (Vidi npr., Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).

Da bi se ekspresovali glikoproteini, molekuli DNK, koji kodiraju glikoprotein, umeću se u ekspresione vektore, tako da se geni operativno povezuju sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U ovom kontekstu, izraz "operativno povezan" utvrđen je kako bi označio da je nukleinska kiselina koja kodira glikoprotein uvezana u vektor, tako da transcripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe njihovoj nameravanoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije kodirajuće sekvence glikoproteina. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence su odabrane kako bi bile kompatibilne sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćina. Kada je glikoprotein antitelo, gen lakog lanca i gen teškog lanca antitela mogu biti umetnuti u zasebne vektore ili, još češće, oba gena se umeću u isti ekspresioni vektor.

Nukleinske kiseline koje kodiraju glikoproteine mogu biti umetnute u ekspresioni vektor uz pomoć standardnih postupaka (npr., ligacijom komplementarnih restriktivnih položaja na fragmentu gena antitela i vektora, ili, ukoliko nisu prisutni restriktivni položaji, ligacijom tupih krajeva). Kada je glikoprotein antitelo, pre umetanja sekvenci lakog ili teškog lanca antitela, ekspresioni vektor može već nositi sekvence konstantnog regiona antitela. Na primer, jedan pristup konverziji VH i VL sekvenci antitela u gene antitela pune dužine jeste da se oni umetnu u ekspresione vektore, koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca, odnosno konstantni region lakog lanca, tako da se VH segment operativno povezuje sa CH segmentom(segmentima) unutar vektora, a VL segment se operativno povezuje sa CL segmentom u okviru vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može kodirati signalni peptid, koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može biti kloniran u vektoru, na takav način da se signalni peptid povezuje unutar okvira za amino terminus gena lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologni signalni peptid (t.j., signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).

Rekombinantni ekspresioni vektori mogu nosti regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućih sekvenci glikoproteina u ćeliji domaćina. Izraz "regulatorna sekvenca" utvrđen je kako bi uključio promotere, pojačivače i ostale kontrolne elemente ekspresije (npr., poliadenilacioni signali), koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence opisane su, primera radi, u Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Stručnjaci u ovoj oblasti će proceniti da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora, kao što su izbor domaćinske ćelije za transformisanje, nivo ekspresije željenog proteina, itd.. Pogodne reagulatorne sekvence za ekspresiju domaćinskih ćelija sisara, uključuju virusne elemente, koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači, dobijeni iz citomegalovirusa (CMV) (kao što je CMV promoter/pojačivač), simian virusa 40 (SV40) (kao što je SV40 promoter/pojačivač), adenovirusa (npr., glavni kasni promoter adenovirusa (AdMLP)) i polioma. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci, vidi, npr., U.S. Patent No. 5,168,062 od Stinskog, U.S. Patent No. 4,510,245 od Bella i saradnika i U.S. Patent No. 4,968,615 od Schaffnera i saradnika.

Rekombinantni ekspresioni vektori mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., izvori replikacije) i marker geni za selekciju. Marker gen za selekciju olakšava selekciju domaćinskih ćelija u koje se uvodi vektor (vidi, npr., U.S. Patente No. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axela i saradnika). Na primer, uobičajeno marker gen za selekciju prenosi otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, u domaćinskoj ćeliji u koju se vektor unosi. Pogodni marker geni za selekciju uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za korišćenje u DHFR<-domaćinskim>ćelijama sa metotreksat selekcijom/amplifikacijom) i neo gen (za G418 selekciju). Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(vektori) koji kodira teške i lake lance transfektuje se u ćeliju domaćina uz pomoć standardnih tehnika. Različiti oblici naziva "transfekcija" određeni su kako bi obuhvatili široki varijetet tehnika, koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u ćeliju domaćina sisara.

Glikoproteini pronalaska mogu biti ekspresovani u ćelijama domaćina sisara, zbog optimalne sekrecije ispravno savijenog i imunološki aktivnog proteina. Primeri domaćinskih ćelija sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela pronalaska, uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR-CHO ćelije, koje su opisane u Urlaub i Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, i koje se koriste sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman i Sharp, 1982, Mol. Biol.159:601-621), NSO ćelije mijeloma, COS ćelije, SP2/0 ćelije, EB66® ćelije i PER.C6® ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori, koji kodiraju glikoproteine, uvedu u ćelije domaćina sisara, glikoproteini se proizvode putem kultivacije domaćinskih ćelija tokom vremenskog perioda, koji je dovoljan da se omogući ekspresija glikoproteina u ćelijama domaćina ili sekrecija glikoproteina u medijum za kultivaciju u kome se domaćinske ćelije uzgajaju. Pogodne tehnike za kultivisanje opisane su u Poglavlju 5.4. Glikoproteini mogu biti povraćeni iz medijuma za kultivisanje korišćenjem standardnih tehnika prečišćavanja proteina, na primer, kao što je opisano u Poglavlju 5.5.

5.4. Postupci kultivisanja

Pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju glikoproteina (npr., antitela) putem kultivisanja ćelija sisara, podvrgnutih inženjeringu da bi ekspresovale glikoproteine u medijumu za kultivaciju sa visokim glicinom, kao što je medijum za kultivaciju koji je opisan u Poglavlju 5.1. Postupcima pronalaska obezbeđuju se glikoproteini sa smanjenim fukoziliranim glikoformama u poređenju sa glikoproteinima, koji se proizvode u uobičajenim medijumima za kultivisanje.

Rekombinantne ćelije sisara, koje su opisane u Poglavlju 5.3, mogu biti kultivisane u suspenziji, kao što je kultivacija u balonima za kultivaciju koji se mućkaju, u malim ili velikim razmerama fermentacije (uključujući kontinuirane, ʺbatchʺ, ʺfed-batchʺ fermentacije ili fermentacije u čvrstom stanju) u laboratoriji ili industrijskim fermentatorima, koja se vrši u pogodnom medijumu i pod uslovima koji omogućuju da glikoprotein bude ekspresovan i/ili izolovan. Alternativno, ćelije sisara mogu biti kultivisane prilikom vezivanja za čvrsti supstrat.

U određenim ostvarenjima, rekombinantne ćelije sisara se dodaju bazalnom medijumu, sa početnom gustinom ćelija koja se kreće u rasponu od 0.5 - 5 x 10<5 ćelija po mL, a>još češće u rasponu od 1.5 - 2.5 x 10<5>ćelija po mL. Kulture se uopšteno skupljaju približno 8 dana do 20 dana nakon inokulacije, a još češće, između 10 dana i 14 dana nakon inokulacije.

Nakon inokulacije ćelija sisara, rast ćelija se može podsticati posredstvom dodavanja hranjivih materija prema prethodno utvrđenom režimu uzgajanja ćelija. Dodavanje hranjivog medijuma kulturi može biti izvedeno putem postupaka, poznatih u struci, kao što je kontinuirana kultura, ʺbatchʺ kultura i ʺfed-batchʺ kultura. Da bi se potpomoglo razmnožavanje ćelija, hranjivi rastvor se može dodavati kulturi u naizmeničnim vremenskim intervalima nakon inokulacije. Kako je ovde korišćen, izraz "hranjivi" odnosi se na hranjive materije koje se dodaju kulturi nakon inokulacije. Izraz "hranjivi rastvor" ili "hranjivi medijumi" odnosi se na rastvor koji sadrži hranjive materije koje se dodaju kulturi nakon inokulacije.

5.5. Povraćaj i prečišćavanje

Tehnike za povraćaj i prečišćavanje ekspresovanog proteina dobro su poznate u struci i mogu se kreirati za određeni glikoprotein(glikoproteine), koji je ekspresovan od strane rekombinantnih ćelija sisara. Glikoproteini se mogu povratiti iz medijuma za kultivaciju i ili iz ćelijskih lizata. U ostvarenjima, u kojima je postupak usmeren na proizvodnju sekretovanog glikoproteina, glikoprotein se može povratiti iz medijuma za kultivaciju. Proteini mogu biti povraćeni ili prečišćeni iz medijuma za kultivisanje uz pomoć brojnih, u struci poznatih, procedura, koje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, centrifugiranje, filtraciju, ekstrakciju, sušenje raspršivanjem, uparavanje ili precipitaciju. Povraćeni glikoprotein može biti, nakon toga, dalje prečišćavan brojnim procedurama, poznatim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na njih, hromatografiju (npr., jon-izmenjivačku, afinitetnu, hidrofobnu, hromato-fokusiranje i hromatografiju sa isključivanjem prema veličini), elektroforetske procedure (npr., preparativno izoelektrično fokusiranje (IEF), diferencijalnu rastvorljivost (npr., precipitacija sa amonijum sulfatom) ili ekstrakciju (vidi, npr., Protein Purification, J.-C. Janson i Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

U ostvarenjima gde je glikoprotein antitelo, antitelo može biti prečišćeno uz pomoć postupka koji koristi Protein A afinitetnu hromatografiju, zajedno sa jakom anjon izmenjivačkom (Q-Sepharose) hromatografijom i slabom katjon izmenjivačkom (CM-650M) hromatografijom, uz omogućavanje procesa kontinuiranog protoka, bez razblaživanja procesnih intermedijera. Ovaj postupak za dobijanje prečišćenog antitela može zatevati sledeće korake:

(i) protein A afinitetnu hromatografiju za izolovanje antitela od ostalih komponenti ćelijske kulture;

(ii) inaktivaciju virusa na niskom pH;

(iii) jaku anjon izmenjivačku hromatografiju da bi se odstranila DNK;

(iv) slabu katjon izmenjivačku hromatografiju, da bi se smanjili agregati; i

(v) filtraciju da bi se uklonili virusi.

Koraci (ii) - (v) mogu biti izvedeni bilo kojim redosledom.

Čim se izoluje, antitelo može biti, ukoliko je to poželjno, dalje prečišćeno, npr., posredstvom tečne hromatografije visokih performansi (vidi, npr., Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work i Burdon, eds., Elsevier, 1980), ili posredstvom gel filtracione hromatografije na Superdex™ 75 koloni (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švedska).

5.6. Glikoforme proteina

Post-translacijska modifikacija proteina uz pomoć glikozilacije može imati uticaja na biohemijske i fizičke karakteristike proteina. Na primer, na karakteristike antitela može uticati glikozilacija i na Fc i na Fab regionima antitela. "Glikozilacija" se odnosi na kovalentnu modifikaciju proteina (npr., antitela) sa ugljenim hidratima (npr., oligosaharidni lanci). Uobičajeni šećeri u glikoproteinima uključuju: manozu, glukozu, galaktozu, fukozu, N-acetilgalaktozamin (GalNAc), N-acetilglukozamin (GlcNAc) i sijalinsku kiselinu.

Pojedinačni glikozilirani molekuli (npr., glikozilirana antitela) se ovde označavaju kao glikoforme. "Glikozilacijski profil" se odnosi na grupu glikoformi u određenom uzorku. Glikozilacija se uopšteno odnosi na N-vezanu glikozilaciju ili O-vezanu glikozilaciju. Izraz "N-vezana glikozilacija" odnosi se na kovalentno povezivanje oligosaharidnog lanca sa asparaginskim ostatkom proteina, čime se obrazuju N-vezani oligosaharidi. N-vezani oligosaharidi se, isto tako, označavaju kao N-vezani glikani. Izraz "O-vezana glikozilacija" odnosi se na kovalentno povezivanje oligosaharidnog lanca sa hidroksil grupom ostatka serina ili treonina proteina, čime se obrazuju O-vezani oligosaharidi. O-vezani oligosaharidi se, takođe, označavaju kao O-vezani glikani.

N-vezani glikani se, dalje karakterišu preko broja ostataka galaktoze na njihovim terminalnim krajevima, bez obzira da li sadrže ili ne sadrže fukozu, pričvršćenu za N-vezani-N-acetil glukozamin. N-vezani glikani koji poseduju molekul fukoze, pričvršćen za N-vezani N-acetil glukozamin, ovde se označavaju kao fukozilirani N-vezani glikani. Proteini sa fukoziliranim N-vezanim glikanima označavaju se ovde kao fukozilirane glikoforme. U nastavku su navedene karakteristike četiri različita fukozilirana N-vezana glikana (vidi, takođe, SLIKU 1):

• G0: Biantenarna (t.j., koja ima dve antene) struktura jezgra sa fukozom vezanom za N-vezani N-acetil glukozamin, i jednim N-acetil glukozaminom na svakom ogranku strukture jezgra.

• G1: Biantenarna struktura jezgra sa fukozom vezanom za N-vezani N-acetil glukozamin, jednim N-acetil glukozaminom na svakom ogranku strukture jezgra i terminalnom galaktozom na jednom ogranku strukture jezgra.

• G2: Biantenarna struktura jezgra sa fukozom vezanom za N-vezani N-acetil glukozamin, jednim N-acetil glukozaminom i jednom terminalnom galaktozom na svakom ogranku strukture jezgra.

• G0-GlcNAc: Biantenarna struktura jezgra sa fukozom vezanom za N-vezani N-acetil glukozamin, jednim N-acetil glukozaminom na jednom ogranku strukture jezgra i bez terminalne galaktoze.

N-vezani glikani koji ne sadrže molekul fukoze označavaju se kao ne-fukozilirani glikani. Proteini sa ne-fukoziliranim glikanima označavaju se kao ne-fukozilirane glikoforme. Na primer, G0-GlcNAc-fukoza N-vezani glikan ima biantenarnu strukturu jezgra bez fukoze vezane za N-vezani N-acetil glukozamin, sa jednim N-acetil glukozaminom na jednom ogranku strukture jezgra i bez terminalne galaktoze. Antitelo koje sadrži G0-GlcNAc-fukoza N-vezani glikan se ovde označava kao G0-GlcNAc-fukoza N-vezana glikoforma.

Profili N-vezane glikozilacije mogu se proceniti posredstvom brojnih postupaka. Na primer, profili N-vezane glikozilacije mogu biti procenjeni posredstvom digestije antitela sa tripsinom, analizom nastale peptidne mešavine, uz korišćenje reverzno-fazne hromatografije sa detekcijom masenom spektrometrijom i kvantitativnim određivanjem različitih glikopeptida. U specifičnom postupku, svareni peptidi se analiziraju korišćenjem YMC-Pack ODS-AQ, sa veličinom čestica od 5 um, veličinom pora od 120 angstrema, sa kolonom reverzne faze dimenzija 2.0 mm x 250 mm (YMC Co., Ltd, kataloški broj AQ12S05-2502WT), a eluirani peptidi se detektuju i kvantitativno utvrđuju korišćenjem masenog spektrometra Thermo LCQ Deca XP+ (Thermo Finnigan). Relativna količina svake glikoforme određuje se na osnovu površine pika maseno-spektrometrijskog ekstrahovanog jonskog hromatograma odgovarajućih glikopeptida u odnosu na zbir površina pikova svih utvrđenih glikopeptida.

Alternativno, profili N-vezane glikozilacije mogu se proceniti cepanjem N-vezanih oligosaharida sa amidazom PNGaze F, derivatizacijom oligosaharida sa fluorescentnim obeleživačem, i analizom dobijene mešavine uz pomoć HPLC normalne faze sa fluorescentnom detekcijom. U specifičnom postupku, derivatizovani, otcepljeni N-vezani glikani se razdvajaju na 50°C na Asahipak Amino NH2P-504E koloni, sa vezanim polimernim aminom, sa dimenzijom 250 x 4.6 mm (veličina čestica 5 µm, Phenomenex, kataloški broj CHO-2628).

Studije profila glikozilacije IgG pokazale su da IgG nosi najmanje 30 različitih N-vezanih oligosaharida. Vidi Dwek et al., 1995, J. Anat. 187:279-292. N-vezani glikozilacijski položaji nalaze se i u Fc regionima i u Fab regionima mnogih antitela. N-vezani oligosaharidi bez bilo kakvih grupa sijalinske kiseline često se označavaju kao neutralni N-vezani oligosaharidi. N-vezani oligosaharidi sa jednom ili dve grupe sijalinske kiseline na nereduktivnom šećernom terminusu oligosaharida označavaju se kao monosijalizovani, odnosno disijalizovani N-vezani oligosaharidi. U odnosu na IgG, glikozilacija u Fc je karakterisana niskom učestalošću monosijalizovanih i disijalizovanih struktura, dok je glikozilacija u Fab karakterisana visokom učestalošću monosijalizovanih i disijalizovanih struktura.

Dodatni N-vezani glikani identifikovani su u Fc regionu antitela. Na primer, glikani koji sadrže velike količine manoze, koji su okarakterisani posredstvom glikana koji sadrže samo dva N-acetil glukozamina, sa preostalim ostacima koji uključuju manozu, označeni su kao "glikani sa visokom manozom". Ostaci manoze se kovalentno vezuju za GlcNAc na 2-poziciji oligosaharida. Jedan primer glikana sa visokom manozom pet je "manoza5 glikan". Manoza 5 glikani sadrže pet ostataka manoze. Proteini sa manoza5 glikanima označavaju se ovde kao "manoza5 glikoforme". Glikani sa visokom manozom su primeri ne-fukoziliranih glikana.

Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke proizvodnje antitela, bogatih glikoformama koje ne sadrže fukozu (t.j., ne-fukozilirane glikoforme). Primeri ne-fukoziliranih glikoformi uključuju, ali bez ograničavanja na njih, G0-GLcNAc-fukoza glikoforme i manoza5 glikoforme. Antitela bez fukoze dovedena su u korelaciju sa povećanom ADCC aktivnošću (antitelo-zavisna ćelijska citotoksičnost). Limfociti, posebno ćelije ʺNatural Killer (NK)ʺ, sadrže površinski-vezane receptore, koji su u stanju da se vezuju za Fc region antitela. Na primer, humani CD16a receptor na NK ćelijama vezuje se za Fc region antitela, vezanog za ciljnu ćeliju, čime se inicira uništavanje ciljne ćelije. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da ne-fukozilirane glikoforme, koje su proizvedene u skladu sa postupcima ovog pronalaska, ispoljavaju veći afinitet vezivanja za CD16a receptor na NK ćelijama, nego glikoforme koje sadrže fukozu (t.j., fukozilirane glikoforme), čime su odgovorne za povećanu ADCC aktivnost.

Antitela, koja su proizvedena u medijumima sa visokim glicinom, kao što su ovde opisana, sadrže značajno više ne-fukoziliranih glikoformi nego antitela proizvedena u konvencionalnim medijumima. Kao što je opisano u Poglavlju 5.3, ukupna količina glikana bez fukoze uopšteno raste kako se koncentracija glicina u medijumu kulture povećava sa 2 mM na 30 mM. Određenije, procenat G0-GlcNAc-fukoza i manoza5 glikana raste kada se NS0 ćelije uzgajaju u medijumu za kultivisanje, proizvedenom u skladu sa ovim pronalaskom. Budući da je količina ne-fukozilianih antitela, proizvedenih u medijumima za kultivisanje ovog pronalaska, zavisna od AOI, procenat povećanja glikana bez fukoze uopšteno iznosi najmanje 120% u odnosu na antitela, proizvedena u konvencionalnim medijumima (t.j., medijumima sa koncentracijom glicina od 2 mM ili manje). Na primer, procenat povećanja ukupnih glikana bez fukoze u antitelima, proizvedenim u medijumima za kultivisanje ovog pronalaska, može iznositi 120%, 150%, 180%, 200%, 250%, 300% ili 400% u odnosu na antitela, proizvedena u konvencionalnim medijumima. U specifičnim ostvarenjima, procenat povećanja ukupnih glikana bez fukoze u antitelima, proizvedenim postupcima pronalaska, u odnosu na antitela, koja su proizvedena u konvencionalnim bazalnim medijumima, ograničava se bilo kojom od dve prethodno-navedene vrednosti, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, 120-150%, 150-180%, 150-200% ili 200-300%.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje kompozicije koje sadrže određena antitela od značaja sa izmenjenim profilima glikozilacije u odnosu na antitela, proizvedena u konvencionalnim medijumima. Određenije, antitela, koja su proizvedena postupcima ovog pronalaska imaju veći procenat ne-fukoziliranih glikoformi nego antitela, proizvedena u konvencionalnim medijumima. Kao rezultat, antitela, proizvedena postupcima ovog pronalaska uopšteno ispoljavaju veću ADCC aktivnost nego antitela koja su proizvedena u konvencionalnim medijumima i pokazuju veće vezivanje za CD16a receptor na NK ćelijama.

U jednom određenom ostvarenju, postupci ovog pronalaska mogu biti korišćeni za proizvodnju monoklonskog antitela koje ima VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2. Monoklonsko antitelo, koje se označava kao elotuzumab (HuLuc 63), prikazano je u U.S. Patent Publication No.

2006/0024296, a ima VH i VL regione od SEQ ID NO:41, odnosno SEQ ID NO:44. Elotuzumab ima aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:3 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:4. Elotuzumab ispoljava in vitro antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) na primarnim mijeloma ćelijama i in vivo anti-tumorsku aktivnost (Hsi et al., (2008) Clin. Cancer Res.14(9):2775).

Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži populaciju molekula elotuzumaba, pri čemu je najmanje 4% glikana bez fukoze, a koja je proizvedena u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija iz ovog pronalaska. Na primer, najmanje 4%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 7% ili najmanje 8% glikana u elotuzumabu je bez fukoze. U određenim ostvarenjima, ne-fukozilirani glikani elotuzumaba, koji su proizvedeni u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija ovog pronalaska, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, N-vezane glikane, kao što su G0GlcNAC-fukoza i manoza5 glikani. U ovim ostvarenjima, najmanje 4% N-vezanih glikana je bez fukoze. U ostalim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje molekule elotuzumaba koji poseduju najmanje 2.5% ukupnih glikana, prisutnih u vidu manoza5 glikana. Na primer, najmanje 3%, najmanje 4% ili najmanje 5% glikana u elotuzumabu može biti prisutno u vidu manoza5 glikana.

U drugom ostvarenju, postupci ovog pronalaska mogu biti korišćeni za proizvodnju monoklonskog antitela, koje ima VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:5 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:6. Monoklonsko antitelo, označeno kao daklizumab, jeste humanizovano IgG1antitelo koje se specifično vezuje za alfa subjedinicu (koja se, isto tako, označava kao CD25 ili Tac) humanog interleukin-2 receptora (IL-2R), koji je značajan medijator limfocitne aktivacije. Daklizumab ima aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:7 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:8.

Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži populaciju molekula daklizumaba, u kojoj je najmanje 3% glikana bez fukoze, a koja je proizvedena u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija iz ovog pronalaska. Na primer, najmanje 3%, najmanje 4%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 7% ili najmanje 8% glikana u daklizumabu je bez fukoze. U određenim ostvarenjima, ne-fukozilirani glikani daklizumaba, koji su proizvedeni u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija ovog pronalaska, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, N-vezane glikane, kao što su G0-GlcNAC-fukoza i manoza5 glikani. U ovim ostvarenjima, najmanje 3% N-vezanih glikana je bez fukoze. U ostalim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje molekule daklizumaba koji poseduju najmanje 2% ukupnih glikana, prisutnih u vidu manoza5 glikana. Na primer, najmanje 3%, najmanje 4% ili najmanje 5% glikana u daklizumabu može biti prisutno u vidu manoza5 glikana.

U drugom ostvarenju, postupci ovog pronalaska mogu biti korišćeni za proizvodnju monoklonskog antitela koje ima VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:10. Monoklonsko antitelo, označeno kao voloksicimab, jeste visoko-afinitetno IgG4 himerično (82% humano, 18% mišje) monoklonskoantitelo (mAt), koje se specifično vezuje sa α5<β>1<integrinom, i koje se koristi za tretman brojnih>tumora uznapredovalog stadijuma. Voloksicimab ima aminokiselisku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:11 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:12.

Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži populaciju molekula voloksicimaba, u kojoj je najmanje 1% glikana bez fukoze, a koja je proizvedena u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija iz ovog pronalaska. Na primer, najmanje 1% glikana u voloksicimabu je bez fukoze. U određenim ostvarenjima, ne-fukozilirani glikani voloksicimaba, koji su proizvedeni u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija ovog pronalaska, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, N-vezane glikane, kao što su G0-GlcNAC-fukoza i manoza5 glikani. U ovim ostvarenjima, najmanje 1% N-vezanih glikana je bez fukoze. U ostalim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje molekule voloksicimaba koji poseduju najmanje 0.5% ukupnih glikana, prisutnih u vidu manoza5 glikana.

U drugom ostvarenju, postupci ovog pronalaska mogu biti korišćeni za proizvodnju monoklonskog antitela koje ima VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:13 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:14. Monoklonsko antitelo, označeno kao PDL241, jeste humanizovano IgG1antitelo koje se vezuje sa proteinom CS1 (ali se vezuje za drugačiji epitop nego elotuzumab). PDL241 ima aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:15 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:16.

Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži populaciju molekula PDL241, u kojoj je najmanje 14% glikana bez fukoze, a koja je proizvedena u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija iz ovog pronalaska. Na primer, najmanje 14%, najmanje 15%, najmanje 16%, najmanje 17%, najmanje 18% ili najmanje 19% glikana u PDL241 je bez fukoze. U određenim ostvarenjima, ne-fukozilirani glikani PDL241, koji su proizvedeni u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija ovog pronalaska, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, N-vezane glikane, kao što su G0-GlcNAC-fukoza i manoza5 glikani. U ovim ostvarenjima, najmanje 14% N-vezanih glikana je bez fukoze. U drugim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje molekule PDL241 koji imaju najmanje 8% ukupnih glikana, prisutnih u vidu manoza5 glikana. Na primer, najmanje 9%, najmanje 10%, najmanje 11% ili najmanje 12% glikana u PDL241 može biti prisutno u vidu manoza5 glikana.

U drugom ostvarenju, postupci ovog pronalaska mogu biti korišćeni za proizvodnju monoklonskog antitela koje ima VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:17 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:18. Monoklonsko antitelo, označeno kao enavatuzumab (PDL192), jeste humanizovano IgG1 antitelo na TweakR, koje ispoljava antitumorsku aktivnost na prekliničkim modelima kroz dva mehanizma: direktnu signalizaciju posredstvom TweakR i antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost. Enavatuzumab ima aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:19 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:20.

Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži populaciju molekula enavatuzumaba, u kojoj je najmanje 5% glikana bez fukoze, a koja je proizvedena u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija iz ovog pronalaska. Na primer, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 7%, najmanje 8%, najmanje 9% ili najmanje 10% glikana u enavatuzumabu je bez fukoze. U određenim ostvarenjima, ne-fukozilirani glikani enavatuzumaba, koji su proizvedeni u skladu sa postupkom kultivisanja ćelija ovog pronalaska, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, N-vezane glikane, kao što su G0-GlcNAC-fukoza i manoza5 glikani. U ovim ostvarenjima, najmanje 5% N-vezanih glikana je bez fukoze. U ostalim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje molekule enavatuzumaba koje imaju najmanje 2.5% ukupnih glikana, prisutnih u vidu manoza5 glikana. Na primer, najmanje 3%, najmanje 4% ili najmanje 5% glikana u elotuzumabu može biti prisutno u vidu manoza5 glikana.

Tabela 7 u nastavku prikazuje sekvence elotuzumaba, daklizumaba, voloksicimaba, PDL241 i enavatuzumaba, kako su prethodno definisani.

5.7. Farmaceutske kompozicije

Glikoproteinske kompozicije, koje su prethodno opisane, mogu se nabaviti kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije, koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka primene kompozicije pacijentu). Kompozicije glikoproteina mogu biti primenjene pacijentu raznim putevima, kao što su, oralni, transdermalni, subkutani, intranazalni, intravenski, intramuskularni, intratekalni, površinski ili lokalni put primene. Najpogodniji put primene u bilo kom datom slučaju zavisiće od: pojedinog glikoproteina, ispitanika, prirode i ozbiljnosti bolesti i fizičkog stanja ispitanika. Uobičajeno, glikoproteinske kompozicije će se primenjivati intravenski ili subkutano.

Farmaceutske kompozicije pogodno mogu biti prisutne u oblicima jedinice doze, koji sadrže prethodno utvrđenu količinu glikoproteinske kompozicije pronalaska po dozi. Takva doza može sadržavati, primera radi, ali bez ograničavanja na njih, 0.5 mg do 5 g, na primer 10 mg do 1 g ili 20 do 50 mg. Farmaceutski prihvatljivi nosači za korišćenje u pronalasku, mogu biti u velikom broju različitih oblika, u zavisnosti, npr., od stanja koje se podvrgava lečenju ili puta primene.

Terapeutske formulacije glikoproteinskih kompozicija pronalaska mogu biti pripremljene za čuvanje u vidu liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora, posredstvom mešanja glikoproteina, koji poseduje željeni stepen čistoće, sa opcionim farmaceutskiprihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima koji se obično koriste u ovoj oblasti (pri čemu se svi ovde označavaju kao "nosači"), t.j., puferišućim sredstvima, sredstvima za stabilizaciju, konzervansima, sredstvima za izotoničnost, ne-jonskim deterdžentima, antioksidansima i drugim raznovrsnim aditivima. Vidi, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje (Osol, ed. 1980). Takvi aditivi moraju biti netoksični za primaoca u korišćenim dozažama i koncentracijama.

Puferišuća sredstva pomažu da se pH održi u rasponu koji je približan fiziološkim uslovima. Ova sredstva mogu biti prisutna u koncentraciji koja se kreće u rasponu od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodna puferišuća sredstva za korišćenje u vezi sa ovim pronalaskom, uključuju organske i neorganske kiseline i njihove soli, kao što su citratni puferi (npr., mešavina mononatrijum citrat-dinatrijum citrat, mešavina limunska kiselina-trinatrijum citrat, mešavina limunska kiselina-mononatrijum citrat, itd.), sukcinatni puferi (npr., mešavina sukcinska kiselinamononatrijum sukcinat, mešavina sukcinska kiselina-natrijum hidroksid, mešavina sukcinska kiselina-dinatrijum sukcinat, itd.), tartratni puferi (npr., mešavina vinska kiselina-natrijum tartrat, mešavina vinska kiselina-kalijum tartrat, mešavina vinska kiselina-natrijum hidroksid, itd.), fumaratni puferi (npr., mešavina fumarna kiselina-mononatrijum fumarat, mešavina fumarna kiselina-dinatrijum fumarat, mešavina mononatrijum fumarat-dinatrijum fumarat, itd.), glukonatni puferi (npr., mešavina glukonska kiselina-natrijum glukonat, mešavina glukonska kiselinanatrijum hidroksid, mešavina glukonska kiselina-kalijum glukonat, itd.), oksalatni pufer (npr., mešavina oksalna kiselina-natrijum oksalat, mešavina oksalna kiselina-natrijum hidroksid, mešavina oksalna kiselina-kalijum oksalat, itd.), laktatni puferi (npr., mešavina mlečna kiselinanatrijum laktat, mešavina mlečna kiselina-natrijum hidroksid, mešavina mlečna kiselina-kalijum laktat, itd.) i acetatni puferi (npr., mešavina sirćetna kiselina-natrijum acetat, mešavina sirćetna kiselina-natrijum hidroksid, itd.). Pored toga, mogu se koristiti fosfatni puferi, histidinski puferi i trimetilaminske soli, kao što je Tris.

Konzervansi se mogu dodati da bi se zaustavio rast mikroorganizama, a mogu se dodavati u količinama koje se kreću u rasponu od 0.2%-1% (tež/v). Pogodni konzervansi za korišćenje u vezi sa ovim pronalaskom uključuju: fenol, benzil alkohol, meta-krezol, metil paraben, propil paraben, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, benzalkonijum halide (npr., hlorid, bromid i jodid), heksametonijum hlorid i alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol i 3-pentanol. Sredstva za izotoničnost, koja se ponekad označavaju kao "stabilizatori", mogu biti dodata da bi se obezbedila izotoničnost tečnih kompozicija tekućeg pronalaska, a uključuju polihidrične šećerne alkohole, na primer, trihidrične ili više hidrične šećerne alkohole, kao što je glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenasa, čija funkcija se može kretati u rasponu od sredstva za masu do aditiva koji služi solubilizaciji terapeutskog sredstva ili pomaže u prevenciji denaturacije ili slepljivanja za zidove kontejnera. Uobičajeni stabilizatori mogu biti polihidrični šećerni alkoholi (koji su prethodno nabrojani); aminokiseline, kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što je laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol i slični, uključujući ciklitole, kao što je inozitol; polietilen glikol; aminokiselinski polimeri; reduktivna sredstva koja sadrže sumpor, kao što je urea, glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, a-monotioglicerol i natrijum tio-sulfat; polipeptidi niske molekulske težine (npr., peptidi od 10 ostataka ili manje); proteini, kao što su: humani serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, kao što je polivinilpirolidon, monosaharidi, kao što je ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi, kao što je laktoza, maltoza, saharoza i trisaharidi, kao što je rafinoza; i polisaharidi, kao što je dekstran. Stabilizatori mogu biti prisutni u rasponu od 0.1 do 10,000 težinskih delova po delu težine aktivnog proteina.

Ne-jonski surfaktanti ili deterdženti (poznati, takođe, kao "vlažeća sredstva") mogu biti dodati da bi se pomogla solubilizacija glikoproteina, a isto tako i zaštitio glikoprotein od agregacije, izazvane mućkanjem, što, takođe, omogućuje formulaciji da bude izložena pritisku kojim se razdvaja od površine, bez izazivanja denaturacije proteina. Pogodni ne-jonski surfaktanti uključuju: polisorbate (20, 80, itd.), polioksamer (184, 188, itd.), pluronske poliole, polioksietilen sorbitan monoetre (TWEEN®-20, TWEEN®-80, itd.). Ne-jonski surfaktanti mogu biti prisutni u rasponu od oko 0.05 mg/ml do oko 1.0 mg/ml, na primer, oko 0.07 mg/ml do oko 0.2 mg/ml.

Dodatni raznovrsni ekscipijensi uključuju sredstva za masu (npr., skrob), helatizirajuća sredstva (npr., EDTA), antioksidanse (npr., askorbinska kiselina, metionin, vitamin E) i ko-rastvarače.

5.8. Postupci lečenja

5.8.1. Kompozicije elotuzumaba i PDL241

Kompozicije elotuzumaba i PDL241, koje su opisane u Poglavlju 5.6, korisne su za lečenje brojnih poremećaja i stanja, za koje se smatra da su pod uticajem pojačane ekspresije proteina CS1 na neoplastične ćelije, a koji uključuju, na primer, multipli mijelom. Specifične populacije pacijenata, formulacije, načini primene i dozne količine i režimi, koji su od koristi za lečenje ili prevenciju multiplog mijeloma, opisani su u U.S. Patentu No. 7,709,610. Sve ove formulacije, načini primene, dozne količine i režimi, kao i prikazane specifične populacije pacijenata i kombinovane terapije, podjednako odgovaraju kompozicijama elotuzumaba i PDL241, koje su ovde opisane.

Ovde opisane kompozicije i formulacije elotuzumaba i PDL241, primenjuju se u količinama koje obezbeđuju povoljni terapeutski efekat. Povoljni terapeutski efekat uključuje, ali bez ograničavanja, lečenje osnovnog poremećaja. Povoljni terapeutski efekat može, isto tako, da uključi poboljšanje ili ublažavanje simptoma ili sporednih efekata kod pojedine bolesti, što se procenjuje korišćenjem standardnih dijagnostičkih i ostalih testova. Za multipli mijelom, razni načini za procenu povoljnog terapeutskog učinka opisani su u U.S. Patentu No. 7,709,610. Svi ovi različiti testovi mogu biti korišćeni za procenu povoljnog terapeutskog učinka u kontekstu pacijenata koji boluju od multiplog mijeloma.

5.8.2. Kompozicije voloksicimaba

Kompozicije voloksicimaba, koje su opisane u Poglavlju 5.6, korisne su za lečenje raznih poremećaja i stanja, za koje se smatra da uključuju a5b1integrin, uključujući, na primer, brojne solidne tumore. Specifične populacije pacijenata, formulacije, načini primene i dozne količine i režimi, koji su od koristi za lečenje ili prevenciju solidnih tumora, smanjivanje angiogeneze i umanjivanje proliferacije malignih ćelija, opisani su u U.S. Patentu No.7,662,384. Sve ove formulacije, načini primene, dozne količine i režimi, kao i prikazane specifične populacije pacijenata i kombinovane terapije, u jednakoj meri odgovaraju kompozicijama voloksicimaba, koje su ovde opisane.

Ovde opisane kompozicije i formulacije voloksicimaba primenjuju se u količinama koje obezbeđuju povoljni terapeutski efekat. Povoljni terapeutski efekat uključuje, ali bez ograničavanja, lečenje osnovnog poremećaja. Povoljni terapeutski efekat može, isto tako, da uključi poboljšanje ili ublažavanje simptoma ili sporednih efekata kod pojedine bolesti, što se procenjuje korišćenjem standardnih dijagnostičkih i ostalih testova. Za lečenje tumora, razni načini procene povoljnog terapeutskog efekta opisani su u U.S. Patentu No. 7,662,384. Svi ovi različiti testovi mogu biti korišćeni za procenu povoljnog terapeutskog učinka u kontekstu pacijenata koji boluju od raka.

5.8.3. Kompozicije enavatuzumaba

Kompozicije enavatuzumaba, koje su opisane u Poglavlju 5.6, korisne su za lečenje raznih poremećaja i stanja, za koje se smatra da uključuju Tweak receptor (TweakR), uključujući, na primer, brojne solidne tumore. Specifične populacije pacijenata, formulacije, načini primene i dozne količine i režimi, koji su od koristi za lečenje ili prevenciju solidnih tumora, smanjivanje angiogeneze i umanjivanje proliferacije malignih ćelija, opisani su u U.S. Published App. No.2009/0074762.

Sve ove formulacije, načini primene, dozne količine i režimi, kao i prikazane specifične populacije pacijenata i kombinovane terapije, u jednakoj meri odgovaraju kompozicijama enavatuzumaba, koje su ovde opisane.

Ovde opisane kompozicije i formulacije enavatuzumaba primenjuju se u količinama koje obezbeđuju povoljni terapeutski efekat. Povoljni terapeutski efekat uključuje, ali bez ograničavanja, lečenje osnovnog poremećaja. Povoljni terapeutski efekat može, isto tako, da uključi poboljšanje ili ublažavanje simptoma ili sporednih efekata kod pojedine bolesti, što se procenjuje korišćenjem standardnih dijagnostičkih i ostalih testova. Za lečenje tumora, razni načini procene povoljnog terapeutskog efekta opisani su u U.S. Published App. No.

2009/0074762. Svi ovi različiti testovi mogu biti korišćeni za procenu povoljnog terapeutskog učinka u kontekstu pacijenata koji boluju od raka.

6. PRIMERI

Razni aspekti i karakteristike ovde opisanih pronalazaka, dodatno su opisani uz pomoć primera u nastavku. Karakteristike koje su opisane u vezi sa određenim ostvarenjem (bilo u prethodnom Izlaganju suštine pronalaska, bilo u primerima koji slede) mogu pokazivati odstupanja, bez suštinskog uticaja na poželjne karakteristike postupaka i kompozicija pronalaska, a, pored toga, tako da različita ostvarenja mogu biti kombinovana i korišćena zajedno na razne načine, ukoliko nisu jasno međusobno isključiva. Sledstveno tome, podrazumevalo bi se da su ovde, u nastavku, obezbeđeni primeri dati u ilustrativne svrhe, a ne kao ograničenje, i ne bi ih trebalo tumačiti kao ograničavanje patentnih zahteva koji slede.

6.1. Proizvodnje stabilnih ćelijskih linija NS0

6.1.1. Elotuzumab

Ćelijska linija mišjeg mijeloma NS0-W (W označava da su NS0 ćelije isključene od zahteva za serumom i holesterolom), kako su je opisali Hartman i saradnici, 2007, Biotechnol. Bioeng.96(2):294-306, držana je u bazalnom medijumu bez prisustva proteina. NS0-W ćelije su transfektovane sa pHuLuc63 ekspresionom plazmid DNK, uz pomoć elektroporacije. Transfektanti, koji su stabilno integrisali ekspresioni plazmid, odabrani su u prisustvu mikofenolne kiseline u DMEM medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma. Polazeći od NS0-W transfektanta, koji su proizveo visoki nivo HuLuc63, izvršeno je subkloniranje posredstvom ograničenog razblaživanja. Subklon sa prihvatljivom produktivnošću i karakteristikama proizvoda odabran je kao finalna proizvodna ćelijska linija i označen je kao 192-C17.

6.1.2. Daklizumab

Ćelijska linija mišjeg mijeloma NS0 je nabavljena od European Collection of Cell Cultures (ECACC katalog # 85110503, Salisbury, Wiltshire, Velika Britanija). Bočica ovih NS0 ćelija je razmrznuta u DMEM-u, koji je dopunjen sa 10% FBS. Ćelije su nakon toga kultivisane u bazalnom medijumu SFM-3, koji je dopunjen sa 1 mg/mL BSA. SFM-3 je mešavina DMEM-a i Hamovog F-12, u odnosu 1:1, koja je dopunjena sa 10 mg/L insulina i 10 ug/mL transferina. Tokom perioda od približno 3 meseca, NS0 ćelije su adaptirane na SFM-3, bez suplemenata, posredstvom postepenog smanjivanja količine FBS-a, prisutnog u medijumu za kultivaciju, sve dok se ne eliminiše, a, nakon toga, završnim odstranjivanjem BSA u jednom koraku. Dobijena ćelijska linija domaćina je prošla pasaže 15-20 puta u SFM-3 i izrađena je zamrznuta banka ćelija.

Ćelije, adaptirane na SFM-3, transfektovane su sa pHAT.IgG1.rg.dE posredstvom elektroporacije. Transfektanti, koji su stabilno integrisali vektor, odabrani su u prisustvu mikofenolne kiseline u DMEM medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma. Polazeći od NS0 stabilnog transfektanta, koji je proizveo visoki nivo DAC HYP, izvršeno je subkloniranje posredstvom kloniranja ograničenim razblaživanjem ili fluorescencijom aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS). Subklon sa prihvatljivom produktivnošću i karakteristikama proizvoda odabran je kao finalna produkciona ćelijska linija i označen je kao 7A11-5H7-14-43.

6.1.3. Voloksicimab

Ćelijska linija 46-12, koja proizvodi M200, dobijena je iz NS0-W ćelija, transfektovanih sa ekspresionim plazmidom P-200M. Pre transfekcije, NS0 ćelije, dobijene od ECACC (ECACC No.85110503), adaptirane su na uslove bez prisustva seruma i holesterola na PDL, i označene su sa NS0-W. NS0-W ćelije su transfektovane sa P-200M ekspresionom plazmid DNK, posredstvom elektroporacije. Transfektanti, koji su stabilno integrisali ekspresioni plazmid, odabrani su u prisustvu mikofenolne kiseline u DMEM medijumu koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma. Polazeći od NS0-W transfektanta, koji je proizveo visoki nivo M200, subkloniranje je izvršeno posredstvom ograničenog dilucionog kloniranja. Subklon sa prihvatljivom produktivnošću i karakteristikama proizvoda odabran je kao finalna proizvodna ćelijska linija i označen je sa 46-12.

6.1.4. PDL241

Ćelijska linija mišjeg mijeloma NS0-W (W označava da su NS0 ćelije isključene od zahteva za serumom i holesterolom), kako je opisana od strane Hartmana i saradnika, 2007, Biotechnol. Bioeng. 96(2):294-306, držana je u bazalnom medijumu bez prisustva proteina.

NS0-W ćelije su transfektovane sa PDL241 ekspresionom plazmid DNK, uz pomoć elektroporacije. Transfektanti, koji su stabilno integrisali ekspresioni plazmid, odabrani su u prisustvu mikofenolne kiseline u DMEM medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma. Polazeći od NS0-W transfektanta, koji je proizveo visoki nivo PDL241, subkloniranje je izvršeno posredstvom ograničenog dilucionog kloniranja. Subklon sa prihvatljivom produktivnošću i karakteristikama proizvoda odabran je i označen sa 26-5C6.

6.1.5. Enavatuzumab

Ćelijska linija mišjeg mijeloma NS0-W (W označava da su NS0 ćelije isključene od zahteva za serumom i holesterolom), kako je opisana od strane Hartmana i saradnika, 2007, Biotechnol. Bioeng. 96(2):294-306, držana je u bazalnom medijumu bez prisustva proteina. NS0-W ćelije su transfektovane sa pHu19.2.1 ekspresionom plazmid DNK, posredstvom elektroporacije. Transfektanti, koji su stabilno integrisali ekspresioni plazmid, odabrani su u prisustvu mikofenolne kiseline u DMEM medijumu, koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma. Polazeći od NS0-W transfektanta, koji je proizveo visoki nivo PDL192, izvršeno je subkloniranje posredstvom ograničenog razblaživanja. Subklon, sa prihvatljivom produktivnošću i karakteristikama proizvoda, odabran je kao finalna proizvodna ćelijska linija i označen je sa 299-9.

6.2. Proizvodnja antitela

6.2.1. Kultivacija i povraćaj ćelija

Ćelije su razmrznute iz pojedinačne bočice sa bankom ćelija i rasejane su u progresivno većim zapreminama unutar T-boca, roler boca, spiner boca i bioreaktora, sve dok se ne postigne proizvodna skala. Po završetku proizvodnje kulture, tečnost ćelijske kulture se izbistri centrifugiranjem i dubinskim filtriranjem i prenosi se u rezervoar za čuvanje sakupljene kulture. Proizvodnja kulture traje približno 10 dana.

Kultivacija i povraćaj ćelija može se izvršiti korišćenjem raznih mogućnosti ćelijske kulture, uz upotrebu standardne opreme, kao što je u struci poznata. U drugom primeru, ćelije su razmrznute iz pojedinačne bočice sa bankom ćelija i rasejane su u progresivno većim zapreminama unutar šejker boca i bioreaktora, sve dok se ne postigne proizvodna skala. Po završetku proizvodnje kulture, tečnost ćelijske kulture se izbistri centrifugiranjem i dubinskim filtriranjem i prenosi se u rezervoar za čuvanje sakupljene kulture. Proizvodnja kulture traje približno 10 dana.

6.2.1.1. Izrada inokuluma

Proizvodne serije se pokreću razmrzavanjem pojedinačne bočice sa bankom ćelija. Da bi se proizveli kontrolni medijumi (t.j., bez viška glicina), ćelije se prenose u T-bocu, koja sadrži hemijski definisan medijum, bazalni medijum-2 bez proteina ili Protein Free Basal Medium-2 (PFBM-2). Komercijalni prašak za izradu PFBM-2 može se naručiti od Invitrogena, zahtevajući prašak za hibridom-SFM medijume, koji je izrađen bez NaCl, fenol red-a, transferina i insulina, a uključuje količinu gvožđe (III) natrijumove soli EDTA, koja, kada se rekonstituiše, daje koncentraciju od 5 mg/L, i koji ima količine ostalih komponenti, koje su podešene tako da, kada se rekonstituišu, njihove koncentracije su iste kao rekonstituisanog hibridom-SFM medijuma. Pripremljeni PFBM-2 medijum sadrži sledeće komponente: 8 g/L komercijalnog praška; 2.45 g/L natrijum bikarbonata; 3.15 g/L NaCl i 16.5 g/L monohidrata D-glukoze (15 g/L glukoze). Koncentracija glicina u PFBM-2 medijumu je 2 mM.

Da bi se proizveo medijum sa glicinom, PFBM-2 se najpre proizvede na prethodno opisani način. Zatim se dodatni glicin (npr., 5 mM, 15 nM ili 30 nM) dodaje u PFBM-2 medijum. Da bi se obezbedilo da medijum sa visokim glicinom ima približno isti osmolalitet kao PFBM-2 kontrolni medijum, osmolalitet se podešava dodavanjem odgovarajuće količine NaCl. Kao primer, Tabela 8 prikazuje količine NaCl koje se dodaju u kontrolni medijum i u tri medijuma sa visokim glicinom, da bi se postigao osmolalitet od približno 300 mOsm/kg.

Tabela 8: Koncentracija NaCl u kontrolnom medijumu i medijumu sa visokim glicinom.

Ćelije se rasejavaju serijskim pasažama u roler boce ili spiner boce svaka dva dana nakon toga. T-boce, roler boce i spiner boce stavljaju se u inkubator, koji radi na temperaturi nameštenoj na 37°C, u atmosferi sa 7.5% CO2za T-boce i roler boce i sa 5% CO2za spiner boce.

Spiner boce se dopunjuju sa 5% CO2ili prekrivanjem gornje površine ili raspršivanjem u kulturu, u zavisnosti od zapremine ćelijske kulture, a brzina pokretnog dela se kontroliše na stalnom broju obrtaja u minutu (RPM). Ciljna gustina zasejavanja u svim ekspanzionim pasažama inokuluma bila je približno 2.5 X 10<5>održivih ćelija po mL.

Ćelije se šire serijskom pasažom u šejker boce svaka dva dana nakon toga. Šejker boce se postavljaju u inkubator koji radi na temperaturi nameštenoj na 37°C, u atmosferi sa 7.5% CO2.

Šejker boce se mućkaju na konstantnom broju obrtaja u minutu (RPM) na platformi za mućkanje u inkubatorima. Ciljna gustina zasejavanja u svim ekspanzionim pasažama inokuluma bila je približno 2.2 - 2.5 X 10<5>održivih ćelija po mL.

Približno 14 dana nakon razmrzavanja banke ćelija, kada je proizveden dovoljan broj održivih ćelija, inokulacija se vrši na prvom od nekoliko, obično tri ili četiri, bioreaktora za zasejavanje sa rezervoarom koji se meša, a od nerđajućeg čelika je. Pre korišćenje, bioreaktori za zasejavanje su čišćeni na mestu i sterilisani parom na mestu i dodata je odgovarajuća zapremina PFBM-2 medijuma za kultivaciju. Pre nego što se biorekator steriliše izlaganjem pari na mestu, izvršena je kalibracija pH i sonda sa rastvorenim kiseonikom. Prvi bioreaktor za zasejavanje je inokulisan sa dovoljnim brojem ćelija, da bi se postigla početna gustina ćelija od2.0 - 2.5 X 10<5>održivih ćelija po mL. Sledeći prenos u veću zapreminu (obično, 100L do 300 L, a nakon toga u bioreaktore za zasejavanje od 1,000 L, ili bioreaktore za zasejavanje od 60L do 235L, 950L i 3750L) izvodi se nakon približno dva dana uzgajanja u svakom reaktoru i ciljnih inicijalnih gustina ćelija od 2.0 - 2.5 X 10<5>održivih ćelija po mL. pH kulture se održava dodavanjem ili gasa CO2ili 1M natrijum karbonata (Na2CO3) putem automatske kontrole. Ciljni uslovi rada u bioreaktorima za zasejavanje i proizvodnju uključuju temperaturu, podešenu na 37°C, pH od 7.0 i 30% rastvorenog kiseonika (kao procenat saturacije vazduha). Bioreaktori od 100L, 300L i 1,000L izlažu se mućkanju na 100 rpm, 80 rpm, odnosno 70 rpm. U nekim slučajevima, ciljni radni uslovi bioreaktora za zasejavanje i proizvodnju uključuju temperaturu, podešenu na 37°C, pH od 7.0, sa prskanjem CO2i kontrolom dodavanja baze i 30% rastvorenog kiseonika (kao procenat saturacije vazduha). Bioreaktori veće zapremine mogu se izložiti mućkanju pri brzinama od 100 rpm, 80 rpm, 70 rpm ili 40 rpm.

6.2.2. Bioreaktor za proizvodnju ćelijske kulture

Nakon približno 2 dana u bioreaktoru za zasejavanje od 1,000 L, inokulum se prenosi u rezervoar proizvodnog bioreaktora od nerđajućeg čelika koji se izlaže mešanju. Proizvodni bioreaktor ima radnu zapreminu od približno 10,000 L. Pre korišćenja, bioreaktor je čišćen na mestu, podvrgnut je sterilisanju parom na mestu i napunjen je sa približno 4,000 L kontrolnog PFBM-2 medijuma ili medijuma sa visokim glicinom. Pre nego što se biorekator izloži pari na mestu, izvršena je kalibracija pH i sonda sa rastvorenim kiseonikom.

U drugom primeru, inokulum se uzgajao u bioreaktoru za zasejavanje od 3750L, pre prenošenja u rezervoar proizvodnog bioreaktora od nerđajućeg čelika koji se izlaže mešanju, pri čemu bioreaktor ima radnu zapreminu od približno 15,000 L, čišćen je na mestu, izložen je pari na mestu i napunjen je sa približno 4,000 – 7,000 L PFBM-2 medijuma ili medijuma sa visokim glicinom pre upotrebe.

Ciljna gustina zasejavanja proizvodnog bioreaktora kreće se u rasponu od 2.0 - 2.5 X10<5>održivih ćelija po mL.Tokom kultivisanja dodaje se hemijski definisani koncentrat Protein Free Feed Medium concentrate (PFFM-3) (hemijski definisani koncentrovani hranjivi medijum izrađen rekonstituisanjem PFFM3 subkomponenti 1 i 2, L-glutamina, D-glukoze, heptahidrata natrijum fosfata dibaznog, L-tirozina, folne kiseline, hlorovodonične kiseline i natrijum hidroksida). PFFM3 sadrži komponente, prikazane u Tabeli 9:

Tabela 9: Komponente PFFM3 medijuma

Komponenta Koncentracija

PFFM3 subkomponenta 1 (aminokiseline) 20.4 g/L pripremljeno PFFM3 subkomponenta 2 (vitamini i elementi u tragovima) 4.93 g/L pripremljeno L-glutamin 11.0 g/L pripremljeno D-glukoza 28.0 g/L pripremljeno L-tirozin, dinatrijumova so 1.32 g/L pripremljeno Folna kiselina 0.083 g/L pripremljeno Na2HPO4• 7H2O 1.74 g/L pripremljeno Natrijum hidroksid varira, kontrola pH Glacijalna hlorovodonična kiselina varira, kontrola pH WFI voda

PFFM3 subkomponenta 1 sadrži komponente, koje su prikazane u Tabeli 10 u nastavku:

Tabela 10: PFFM3, subkomponenta 1

Komponente medijuma MT (g/mol) Konc. (mg/L) Konc. (mM)

L-arginin HCl 211. 1,900 9.00E+00

L-asparagin anhidrovani 132.1 1,320 9.99E+00

L-asparaginska kiselina 133.1 119 8.94E-01

L-cistein HCl•H2O 176.0 2,030 1.15E+01

L-glutaminska kiselina 147.1 510 3.47E+00

Glicin 75.1 157 2.09E+00

L-histidin HCl•H2O 210.0 864 4.11E+00

L-izoleucin 131.2 1,440 1.10E+01

L-leucin 131.2 3,130 2.39E+01

L-lizin HCl 183.0 2,160 1.18E+01

L-metionin 149.2 1,260 8.45E+00

L-fenilalanin 165.2 918 5.56E+00

L-prolin 115.1 806 7.00E+00

L-serin 105.1 709 6.75E+00

L-treonin 119.1 1,220 1.02E+01

L-triptofan 204.2 408 2.00E+00

L-valin 117.1 1,450 1.24E+01

PFFM3 subkomponenta 2 sadrži komponente, koje su prikazane u Tabeli 11 u nastavku:

Tabela 11: PFFM3, subkomponenta 2

Komponente medijuma MT (g/mol) Konc. (mg/L) Konc. (mM)

Vitamin B-12 1,355.0 10.72 7.91E-03

Biotin 244.0 0.156 6.39E-04

Holin hlorid 140.0 140 1.00E+00

I-inozitol 180.0 197 1.09E+00 Niacinamid 122.0 31.5 2.58E-01 Kalcijum pantotenat 477.0 103.1 2.16E-01 Piridoksin hidrohlorid 206.0 0.484 2.35E-03

Tiamin hidrohlorid 337.0 99.8 2.96E-01 Putrescin 2HCl 161.1 6.66 4.13E-02 Komponente medijuma MT (g/mol) Konc. (mg/L) Konc. (mM)

DL-lipoinska tioktična kiselina 206.0 4.84 2.35E-02 Natrijum piruvat 110.0 1,716 1.56E+01 Etanolamin HCl 97.54 76.1 7.80E-01

b-merkaptoetanol78.13 60.9 7.80E-01

Linolna kiselina 280.48 0.655 2.34E-03 Pluronski F-68 8,350.0 780 9.34E-02

Kalijum hlorid 74.55 432 5.79E+00 Riboflavin 376.0 3.42 9.09E-03 Magnezijum hlorid anhidrovani 95.21 446 4.69E+00 Magnezijum sulfat anhidrovani 120.4 762 6.33E+00 Natrijum selenit 172.9 0.140 8.12E-04

Bakar sulfat•5H2O 249.7 0.1069 4.28E-04 Gvožđe sulfat•7H2O 278.0 6.51 2.34E-02

Kalijum nitrat 101.1 0.593 5.86E-03

Cink sulfat•7H2O 287.5 15.0 5.23E-02 Mangan sulfat, monohidrat 169.01 0.00264 1.56E-05

Nikl hlorid, 6-hidrat 237.7 0.00186 7.81E-06

Kalaj hlorid 2H2O 225.63 0.001130 5.01E-06 Amonijum molibdat 4H2O 1,235.86 0.00193 1.57E-06 Amonijum meta-vanadat 116.98 0.00913 7.80E-05 Natrijum meta-silikat 9H2O 284.2 2.22 7.79E-03

EDTA, gvožđe(III), natrijumova so 367.05 31.2 8.50E-02

Vreme i količina dodavanja PFFM-3 u kulturu odvija se kao što je opisano u Tabeli 12 u nastavku:

Tabela 12: Primeri režima uzgajanja u DAC HYP bioreaktoru

Dan Količina PFFM-3 (% početne mase)

0 0

1 0

2 4-4.14

3 7.8-8.08

Dan Količina PFFM-3 (% početne mase)

4 7.8-8.08

5 7.8-8.08

6 11-11.38

7 13.13.46

8 15-15.52

9 15-15.52

10 0

pH kulture održava se na približno 7.0, a poželjno između pH 7.0 i pH 7.1, posredstvom automatske kontrole dodavanja gasa CO2i 1M natrijum karbonata (Na2CO3). Omogućeno je da sadržaj rastvorenog kiseonika padne na približno 30% zasićenosti vazduha. Mešavina kiseonik/vazduh je isprskana po kulturi, da bi se postigla konstantna brzina ukupnog protoka gasa, a rastvoreni kiseonik se kontroliše putem podešavanja odnosa gasova vazduha prema kiseoniku, po potrebi i povećavanjem brzine mućkanja nakon što je postignut maksimalni odnos kiseonika prema vazduhu. U drugom primeru, mućkanje se podešava kako bi se održavao konstantni odnos snaga/zapremina. Emulzija protiv penjenja na bazi simetikona dodaje se u bioreaktor na bazi dodavanja po potrebi na osnovu nivoa pene. Uzorci se uzimaju periodično, da bi se ispitala gustina ćelija, održivost ćelija, koncentracija proizvoda, koncentracije glukoze i laktata, rastvoreni O2, rastvoreni CO2, pH i osmolalitet. Kultura bioreaktora sakuplja se približno 10 dana nakon inokulacije. Pre sakupljanja, sadržaji bioreaktora uzorkuju se kao neprerađena masa.

Podrazumevaće se da je moguće podešavati uslove uzgajanja i režim gajenja u proizvodnji svakog antitela, da bi se optimizovao titar. Osmolalnost medijuma kulture može se podešavati po potrebi, da bi se postigao optimalni titar. Pored toga, nivoi glukoze i glutamina mogu se podešavati tokom faze proizvodnje, da bi se održavali optimalni nivoi titra.

6.2.3. Sakupljanje i odstranjivanje ćelija

Neposredno pre sakupljanja, proizvodni bioreaktor se najpre ohladi do < 15°C, a nakon toga se pH podešava na 5.0 ± 0.1, uz korišćenje 0.5 M ili 1 M ili 2 M limunske kiseline, i održava se tokom perioda od približno 30 - 90 ili 45 - 60 minuta, zbog flokulacije ćelija i krhotina ćelija pre prenošenja u sud za sakupljanje. Sakupljeni materijal sa podešenom pH vrednošću, nakon toga se izbistri kontinuiranim centrifugiranjem, koje se odvija prema prethodnodefinisanim parametrima za brzinu diska i brzinu protoka, kako je definisano u zabeleženoj dokumentaciji serije.

Centrat se filtrira kroz dubinski filter, a zatim kroz 0.22 µm membranski filter i sakuplja se u prethodno sterilisan rezervoar. Sakupljeni materijal bez ćelijskog sadržaja, podešava se na približni pH od 6.4, koristeći 1-2 M Tris rastvor i čuva se na 2-8°C za dalje postupanje. U nekim slučajevima, ovo podešavanje pH dešava se u okviru 12 sati od prvobitnog podešavanja pH bioreaktora na pH 5.0.

6.2.4. Prečišćavanje antitela

Sakupljeni materijali iz obrada pilot skale (50 litara i više) prečišćeni su na osnovu tri hromatografske tehnike (MabSelect Protein A afinitetna hromatografija, Q-Sepharose anjonizmenjivačka hromatografija i CM-Sepharose katjon-izmenjivačka hromatografija) u kombinaciji sa korakom inaktivacije virusa pri niskom pH, korakom filtracije virusa, korakom ultrafiltracija/diafiltracija i korakom formulacije. Materijali iz sakupljenih 2 litra podvrgavaju se postupku Protein A hromatografije na koloni, nakon čega je sledilo podvrgavanje hromatografiji sa isključivanjem prema veličini.

6.3. Određivanje profila glikozilacije

6.3.1. Materijali i postupci

Prečišćena antitela dobijena sa različitim uslovima kultivisanja (kontrolni uslovi sa niskim glicinom prema eksperimentalnim uslovima sa visokim glicinom) analitički su okarakterisana. Peptidno mapiranje je korišćeno za kvantitativno utvrđivanje različitih glikoformi u proizvodima antitela. Antitelo se najpre redukuje sa ditiotreitolom, alkiluje se sa jodosirćetnom kiselinom, zatim podvrgava digestiji sa tripsinom, i na kraju analizira uz pomoć RP-HPLC sa MS detekcijom. Dobijene su površine pikova svake glikoforme, a relativni procenat svake glikoforme je, zatim, računski utvrđen iz ukupnih površina pikova.

6.3.2. Rezultati

Relativni procenti svake glikoforme, prisutne u pet različitih antitela, proizvedenih u NS0 ćelijama, koje su kultivisane ili u kontrolnom bazalnom medijumu koji sadrži 2 mM glicina ili u bazalnom medijumu koji je dopunjen sa 15 mM glicina (sa ukupnom koncentracijom od 17 mM), prikazani su u Tabeli 13. Povećanje procenta dve ne-fukozilirane glikoforme za pet različitih antitela, G0-GlcNAc-fukoza glikoforme i Man5 glikoforme, koje se obrazuju u medijumu, koji je dopunjen sa glicinom, u odnosu na kontrolni medijum, prikazano je na SLICI 2 i SLICI 3. Kombinovani ukupni procenat povećanja ne-fukoziliranog antitela u odnosu na kontrolu, prikazan je na SLICI 4. Podaci pokazuju da antitela iz ćelija, koje su kultivisane u medijumu sa visokom koncentracijom glicinom, pokazuju više nivoe ne-fukoziliranih glikoformi nego ista antitela iz kontrolnog postupka sa niskom koncentracijom glicina. U odnosu na G0-GlcNAc-fukoza glikoformu, četiri od pet antitela iz ćelija, kultivisanih u medijumu za kultivisanje sa većom koncentracijom glicina, pokazuju prisustvo ove glikoforme od 150% do gotovo 300% u odnosu na kontrolu. U odnosu na Man5 glikoformu, raspon za četiri od pet antitela iznosi 150% do >200% povećanja ove glikoforme u odnosu na kontrolu. Gledajući zbirno na ukupnu količinu ne-fukoziliranog antitela, svih pet antitela ispoljava povećanje od 1.5 - 2.5 puta kada se ćelije kultivišu u medijumima sa višom koncentracijom glicina.

Tabela 13: Profil glikozilacije za četiri antitela, proizvedena postupcima u skladu sa ovim pronalaskom

U studiji odgovora na dozu, procenti svake glikoforme, prisutne u antitelu PDL192 (enavatuzumab), proizvedenom u ćelijama, koje su kultivisane ili u kontrolnom bazalnom medijumu koji sadrži 2 mM glicina ili u bazalnom medijumu koji je dopunjen različitim koncentracijama glicina (7, 17 i 32 mM) prikazani su u Tabeli 14. Povećanje procenta dve nefukozilirane glikoforme PDL192, G0-GlcNAc-fukoza glikoforme i Man5 glikoforme, koje se obrazuju u medijumu, koji je dopunjen sa glicinom, u odnosu na kontrolni medijum, prikazano je na SLICI 5. Podaci pokazuju da antitelo PDL192, koje je proizvedeno pod uslovima sa ekstra glicinom, pokazuje više nivoe ne-fukoziliranih glikoformi nego antitelo, proizvedeno kontrolnim postupkom. Još određenije, za ne-fukoziliranu G0-GlcNAc-fukoza glikoformu, količina glikoforme se povećava sa povećanjem koncentracije glicina u medijumu za kultivaciju, na dozno-zavisni način. Procenti povećanja kreću se u rasponu od 120% do >160% u odnosu na kontrolu, kako se koncentracija glicina povećavala od 7 do 32 mM.

Tabela 14: Profil glikozilacije i vezivanje za CD16a za PDL192 antitelo, proizvedeno u medijumima za kultivaciju sa viškom glicina

6.4. Test vezivanja za CD16a

6.4.1. Materijali i postupci

Test vezivanja za CD16a izvršen je korišćenjem postupka AlphaScreen (PerkinElmer), da bi se, za četiri različita antitela, procenila jačina vezivanja Fc regiona antitela za humani CD16a receptor. Rastvor antitela je, najpre, pomešan sa rastvorom rekombinantnog humanog CD16a i test puferom, a, nakon toga su dodata Alphascreen donor-zrnca i antiteloakceptor zrnca. Mešavina je inkubirana na položaju, zaštićenom od svetla, tokom 4 sata na sobnoj temperaturi, a fluorescentni signal je detektovan uz korišćenje čitača ploča sa laserskom ekscitacijom na 680 nm i emisijom svetla na 520-620nm. Prikazana je jačina vezivanja u odnosu na referentno antitelo, koje je kultivisano u bazalnom medijumu bez viška glicina.

6.4.2. Rezultati

Rezultati testova jačine vezivanja CD16a za četiri različita IgG1antitela (elotuzumab, daklizumab, PDL192 i PDL241) prikazani su u Tabeli 15. Sva četiri IgG1 antitela iz ćelija, kultivisanih u medijumima sa visokom koncentracijom glicinom, dosledno su pokazivala više od 40% povećanja afiniteta vezivanja za humani CD16a receptor, a, u najekstremnijem slučaju, pokazala su dvostruko povećanje jačine vezivanja u odnosu na kontrolna antitela, koja su proizvedena u bazalnim medijumima bez viška glicina (t.j., medijumi za kultivaciju sa 2 mM glicina). SLIKA 6 prikazuje relativnu jačinu vezivanja za CD16a receptor za četiri IgG1 antitela. Veličina se izražava kao procenat u odnosu na afinitete vezivanja CD16a od strane istih antitela, koja su proizvedena u NS0 ćelijama, kultivisanim u kontrolnom bazalnom medijumu bez dodavanja dopunskog glicina.

Tabela 15: Vezivanje za CD16a od strane četiri antitela, proizvedena postupcima u skladu sa ovim pronalaskom

Rezultati jačine vezivanja za CD16a iz dozno-zavisne studije na antitelu PDL192, prikazani su u Tabeli 14 i na SLICI 7. Antitelo PDL192 iz ćelija, kultivisanih pod uslovima, dopunjenim ekstra glicinom od 5, 15 i 30 mM, pokazalo je veći afinitet vezivanja za CD16a nego antitelo iz kontrolnog postupka, premda dozno-zavisno povećanje vezivanja za CD16a nije zapaženo.

6.5. Antitelo-zavisna ćelijska citotoksičnost (ADCC)

6.5.1. Materijali i postupci

ADCC aktivnost ekspresovanog antitela je analizirana in vitro. Ciljne ćelije su najpreobeležene sa<51>Cr, a efektorske ćelije (mononuklearne ćelije humane periferne krvi, PBMC) su pripremljene iz pune krvi. Ćelije i rastvor antitela su, nakon toga, inkubirani na 37°C, tokom 4 sata. Radioaktivnost u supernatantima je izmerena za eksperimentalno oslobađanje (E), spontano oslobađanje (S, oslobađanje iz ciljnih ćelija bez efektorskih ćelija i antitela) i za ukupni lizat (T, oslobađanje iz ciljnih ćelija, tretiranih sa deterdžentom 1% Triton X-100). Procenat citotoksičnosti je izračunat kao [(E-S)/(T-S)]X100.

6.5.2. Rezultati

Rezultati testova ADCC za četiri različita antitela (elotuzumab, PDL241, PDL192 i daklizumab) prikazani su na SLIKAMA 8A-C, 9A-B, 10A-B i 11A-B, pri čemu je svaki test izvršen na PBMC ćelijama dobijenim od dva ili tri različita davaoca. Na sve četiri slike, antitela iz ćelija, kultivisanih u uslovima sa višom koncentracijom glicina, pokazala su povećanu ADCC aktivnost u poređenju sa istim antitelima iz ćelija, kultivisanih kontrolnim postupkom. Rezultati pokazuju da je ADCC aktivnost u skladu sa jačinom vezivanja za CD16a, a rezultati oba testa su u korelaciji sa obrascima glikozilacije antitela.

SPISAK SEKVENCI

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Postupak proizvodnje IgG1 antitela, koji obuhvata:

kultivaciju NSO ćelija, podvrgnutih inženjeringu, da bi sekretovale i ekspresovale IgG1 antitelo u medijumu ćelijske kulture, koji sadrži glicin u koncentraciji između 5 mM i 30 mM, pod uslovima, pogodnim za ekspresiju i sekreciju IgG1 antitela, čime se proizvodi IgG1 antitelo.

2. Postupak iz zahteva 1, pri čemu je koncentracija glicina u rasponu od 10 mM do 25 mM, ili 15 mM do 20 mM ili 16 mM do 18 mM.

3. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-2, pri čemu medijum je medijum bez proteina.

4. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-3, koji dalje uključuje povraćaj IgG1 antitela.

5. Postupak iz zahteva 4, pri čemu povraćaj IgG1 antitela obuhvata korak izdvajanja NS0 ćelija iz medijuma za kultivisanje, i opciono prečišćavanje IgG1 antitela.

6. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-5, pri čemu su NSO ćelije zasejane u gustini od 1.5 X 10<5>ćelija po mL do 2.5 X 10<5>ćelija po mL, pre navedenog kultivisanja.

7. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-6, pri čemu IgG1 antitelo sadrži VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2, pri čemu opciono IgG1 antitelo ima aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:3 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:4.

8. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-6, pri čemu IgG1 antitelo sadrži VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:5 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:6.

9. Postupak iz zahteva 8, pri čemu IgG1 antitelo poseduje aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:7 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:8.

10. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-6, pri čemu IgG1 antitelo sadrži VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:10.

11. Postupak iz zahteva 10, pri čemu IgG1 antitelo poseduje aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:11 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:12.

12. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-6, pri čemu IgG1 antitelo sadrži VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:13 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:14.

13. Postupak iz zahteva 12, pri čemu IgG1 antitelo poseduje aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:15 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:16.

14. Postupak iz bilo kog od zahteva 1-6, pri čemu IgG1 antitelo sadrži VH region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:17 i VL region od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:18.

15. Postupak iz zahteva 14, pri čemu IgG1 antitelo poseduje aminokiselinsku sekvencu punog teškog lanca od SEQ ID NO:19 i aminokiselinsku sekvencu punog lakog lanca od SEQ ID NO:20.