CN104797707A

CN104797707A - 用于产生糖蛋白的组合物和方法

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Publication number: CN104797707A
Application number: CN201380058690.XA
Authority: CN
Inventors: A·瓦尔玛; J·昆卡; Y·朱
Original assignee: AbbVie Biotechnology Ltd
Current assignee: AbbVie Biotechnology Ltd; AbbVie Biotherapeutics Inc
Priority date: 2012-10-01
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2015-07-22
Also published as: PT2904092T; US20170152540A1; ME02882B; JP6351598B2; IN2015DN02630A; NO2760138T3; US20150259425A1; WO2014055370A1; RS56641B1; SI2904092T1; HRP20171753T1; CY1119602T1; JP2015532096A; MX366106B; SG11201502339YA; IL237916A0; ES2646594T3; KR102182885B1; HK1207394A1; CA2886753C

Abstract

本公开内容涉及通过在相对于传统基本培养基具有增加的甘氨酸浓度的培养基中培养哺乳动物细胞来产生具有增加水平的非岩藻糖基化糖形的抗体的方法。

Description

用于产生糖蛋白的组合物和方法

1.序列表

本申请包括已通过EFS-Web以ASCII形式提交的序列表并将其通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2013年9月24日，名称为381493-735WO(118134)_SL.txt，并且其大小为42,313字节。

2.背景

蛋白质通过糖基化的翻译后修饰导致不同糖形的形成，所述糖形常常具有独特的性质。蛋白质糖基化的差异可对该蛋白质的物理和化学性质(包括该蛋白质对特定靶分子的结合亲和力)具有显著的影响。已知若干种调节蛋白质糖基化的方法。不同的表达系统可产生不同的糖基化模式。此外，蛋白编码序列可被修饰以产生具有升高或降低水平的特定糖形的蛋白质。培养重组细胞系的条件也可影响糖基化模式。

在哺乳动物细胞中重组产生的抗体常常在该抗体的Fc和Fab区上发生糖基化。许多糖基化的抗体包含糖类岩藻糖。岩藻糖在抗体中的存在可影响抗体对细胞上特定蛋白的结合。例如，在抗体的Fc区中包含高水平的岩藻糖的抗体可具有减弱的与淋巴细胞(例如天然杀伤细胞)上的受体的结合。不含岩藻糖的抗体与增强的ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒性)活性相关，尤其是在低剂量抗体的情况下。Shields等人，2002、J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa等人,2003、J.Biol.Chem.278:3466。制备岩藻糖较少的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中的生长。YB2/0细胞表达低水平的FUT8mRNA，所述mRNA编码蛋白质的岩藻糖基化所必需的酶(α1,6-岩藻糖基转移酶)。用于增加ADDC活性的备选方法包括抗体的Fc部分中的突变，特别是增加抗体针对FcγR受体的亲和力的突变。已使用基于细胞的定向细胞毒性测定证实了增加的FcγR结合与突变的Fc之间的相互关系。Shields等人,2001，J.Biol.Chem.276:6591-6604；Presta等人,2002，Biochem Soc.Trans.30:487-490。

培养基或补料培养基中成分的浓度可影响蛋白质的糖基化模式。理想地，可通过控制重组细胞系所生长的条件来增加或减少蛋白质的特定糖形。虽然已有很多研究通过控制培养基的成分来增加蛋白产率，但远少得多的报道涉及通过改良培养重组工程化细胞的细胞培养基来调节蛋白质的糖基化。一个实例公开于美国专利No.5,705,364中，该专利涉及通过将链烷酸添加至培养基来控制由哺乳动物细胞产生的糖蛋白的唾液酸含量的方法。然而，通过改良其中表达重组抗体的培养基来增加抗体的ADCC活性的可能性未得到充分的解决。因此，开发用于培养哺乳动物细胞以表达具有降低的岩藻糖水平和增加的ADCC活性的抗体的细胞培养基会是非常期望的。

3.公开内容概述

本公开内容涉及这样的发现：通过在包含高浓度(例如至少5mM)的甘氨酸的培养基(在下文中被称作“高甘氨酸培养基”)中培养哺乳动物细胞，产生了具有有益性质的糖蛋白(例如抗体)。具体地，在高甘氨酸培养基中培养哺乳动物宿主细胞增加非岩藻糖基化糖形的水平。哺乳动物细胞可被用于产生显示增强的生物活性的抗体，所述增强的生物活性包括增强的抗体依赖性细胞细胞毒性(“ADCC”)活性。

因此，本公开内容总的来说提供用于表达重组蛋白(例如抗体)的方法和组合物，所述重组蛋白相较于在传统培养基中表达的糖蛋白而言具有改良的糖基化模式。所述方法和组合物利用高甘氨酸培养基来在哺乳动物细胞中表达糖蛋白例如抗体，从而有利地导致相较于在传统培养基中产生的糖蛋白而言具有降低的岩藻糖基化水平的糖蛋白。

此外，本公开内容的方法可用于在生产期间调节和控制蛋白质糖基化。在生产期间产品糖基化的改善的控制是期望的，因为这将减小批次报废的风险和改善生产地点之间的技术转移期间和工艺的按比例放大期间的控制。因此，所述方法可用于维持可再现的产品糖基化模式而无需引入工艺变化。

能够经工程化以产生重组糖蛋白的哺乳动物细胞包括NS0细胞、CHO细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞、幼仓鼠肾BHK-21细胞和人胚肾HEK0291细胞。在具体的实施方案中，NS0细胞被重组工程化以产生抗体。

在一个方面，本公开内容提供了适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含介于5mM和100mM之间的浓度的甘氨酸和任选地如本公开内容中指出的不同浓度的其它氨基酸。所述培养基优选是化学成分确定的无蛋白质培养基。细胞培养基中甘氨酸的浓度可以是例如5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、22mM、25mM、30mM或50mM。在某些实施方案中，细胞培养基中甘氨酸的浓度以任何两个前述实施方案为界，例如浓度的范围为5mM至10mM、7mM至10mM、10mM至15mM、12mM至17mM、15mM至20mM、16mM至18mM、10mM至30mM、10mM至25mM、20mM至30mM、10mM至50mM、20mM至50mM等。其它氨基酸可存在于培养基中，一般以通常发现于传统基本培养基中的浓度存在。在一个实施方案中，氨基酸在本公开内容的培养基中的浓度见于表2中列出的范围之中。培养基还可包含一种或多种另外的成分，例如维生素、微量元素、能量来源、脂肪酸、生长因子、核苷、脂质、激素和/或抗生素。此外，培养基可包含缓冲液、重量摩尔渗透压浓度调节剂和/或表面活性剂。这些另外的成分的进一步细节可见于5.1节中。

在另一个方面，除甘氨酸以外的一种或多种氨基酸的浓度为表3或表4中显示的浓度或低于这些浓度。例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十一种氨基酸的浓度可以是表3或表4中列出的浓度或低于这些浓度。在一个实施方案中，赖氨酸在培养基中的浓度介于0.5mM和5.0mM之间。

在另一个方面，本公开内容提供了用于产生目标糖蛋白(“GOI”)例如目标抗体(“AOI”)的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养经工程化以分泌和表达所述GOI或AOI的哺乳动物细胞例如NS0细胞，其中所述细胞培养基包含至少5mM，例如5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、22mM、25mM或30mM的浓度的甘氨酸。所述AOI可以是例如鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或完全人抗体。在具体的实施方案中，细胞培养基中甘氨酸的浓度以任何两个前述实施方案为界，例如甘氨酸浓度的范围为5mM至10mM、7mM至10mM、10mM至15mM、12mM至17mM、15mM至20mM、16mM至18mM、10mM至30mM、10mM至25mM、20mM至30mM等。在某些实施方案中，所述培养基是化学成分确定的无蛋白质培养基。

在一个实施方案中，AOI是HuLuc63(依洛珠单抗)。依洛珠单抗的成熟V_H链(SEQ ID NO:1)、依洛珠单抗的成熟V_L链(SEQ ID NO:2)、依洛珠单抗的全长重链序列(SEQ ID NO:3)和依洛珠单抗的全长轻链序列(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列显示于表7中。本公开内容的细胞培养过程产生其中至少4％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少2.5％的聚糖是甘露糖5聚糖的依洛珠单抗分子群。在一个实施方案中，本公开内容的细胞培养过程产生其中至少5％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少3％的聚糖是甘露糖5聚糖的依洛珠单抗分子群。

在另一个实施方案中，目标抗体是达克珠单抗。达克珠单抗的成熟V_H链(SEQ ID NO:5)、达克珠单抗的成熟V_L链(SEQ ID NO:6)、达克珠单抗的全长重链序列(SEQ ID NO:7)和达克珠单抗的全长轻链序列(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列显示于表7中。本公开内容的细胞培养过程产生其中至少3％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少1.5％的聚糖是甘露糖5糖形的达克珠单抗分子群。在一个实施方案中，本公开内容的细胞培养过程产生其中至少4％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少2％的聚糖是甘露糖5聚糖的达克珠单抗分子群。

在另一个实施方案中，AOI是伏洛昔单抗(voloxicimab)。伏洛昔单抗的成熟V_H链(SEQ ID NO:9)、伏洛昔单抗的成熟V_L链(SEQ IDNO:10)、伏洛昔单抗的全长重链序列(SEQ ID NO:11)和伏洛昔单抗的全长轻链序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列显示于表7中。本公开内容的细胞培养过程产生其中至少1％的分子不含岩藻糖并且其中至少0.5％的聚糖是甘露糖5聚糖的伏洛昔单抗分子群。

在其它实施方案中，AOI是PDL241。PDL241的成熟V_H链(SEQ IDNO:13)、PDL241的成熟V_L链(SEQ ID NO:14)、PDL241的全长重链序列(SEQ ID NO:15)和PDL241的全长轻链序列(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列显示于表7中。本公开内容的细胞培养过程产生其中至少14％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少8％的聚糖是甘露糖5聚糖的PDL241分子群。在一个实施方案中，本公开内容的细胞培养过程产生其中至少15％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少9％的聚糖是甘露糖5聚糖的PDL241分子群。

在另一个实施方案中，AOI是PDL192(enavatuzumab)。enavatuzumab的成熟V_H链(SEQ ID NO:17)、enavatuzumab的成熟V_L链(SEQ ID NO:18)、enavatuzumab的全长重链序列(SEQ ID NO:19)和enavatuzumab的全长轻链序列(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列显示于表7中。本公开内容的细胞培养过程产生其中至少5％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少2.5％的聚糖是甘露糖5聚糖的enavatuzumab分子群。在一个实施方案中，本公开内容的细胞培养过程产生其中至少6％的聚糖不含岩藻糖并且其中至少3％的聚糖是甘露糖5聚糖的enavatuzumab分子群。

4.附图概述

图1显示了一些典型的N-连接的聚糖的结构。

图2显示了在补充了额外的甘氨酸的基本培养基中培养的NS0细胞所产生的五种不同抗体中连接的无GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)的非岩藻糖基化的G0聚糖的相对量。将所述量表达为相对于在无额外甘氨酸补充的对照基本培养基中培养的NS0细胞所产生的抗体中存在的聚糖的量的百分比。

图3显示了在具有17mM的甘氨酸浓度的基本培养基中培养的NS0细胞所产生的五种不同抗体中连接的甘露糖5(Man5)聚糖的相对量。将所述量表达为相对于在无额外甘氨酸补充的对照基本培养基中培养的NS0细胞所产生的抗体中存在的聚糖的量的百分比。

图4显示了在具有17mM的甘氨酸浓度的基本培养基中培养的NS0细胞所产生的五种不同抗体中连接的总的非岩藻糖基化聚糖的相对量。将所述量表达为相对于在无额外甘氨酸补充的对照基本培养基中培养的NS0细胞所产生的抗体中存在的聚糖的量的百分比。

图5显示了在补充有不同浓度甘氨酸(5、15、30mM)的基本培养基中培养的NS0细胞所产生的PDL192中连接的无GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)的非岩藻糖基化G0糖形(N-乙酰葡糖胺)和Man5-型糖形的相对量。将所述量表达为相对于在无额外甘氨酸补充的对照基本培养基中培养的NS0细胞所产生的抗体中存在的糖形的量的百分比。

图6显示了在补充有额外的甘氨酸的基本培养基中培养的NS0细胞所产生的四种IgG1抗体(依洛珠单抗、达克珠单抗、PDL192和PDL241)对CD16a受体的相对结合效力。将量表达为相对于在无额外甘氨酸补充的对照基本培养基中培养的NS0细胞所产生的相同抗体的CD16a结合亲和力的百分比。

图7显示了在补充有不同浓度甘氨酸(5、15、30mM)的基本培养基中培养的NS0细胞所产生的PDL192(enavatuzumab)对CD16a受体的相对结合效力。将量表达为相对于在无额外甘氨酸补充的对照基本培养基中培养的NS0细胞所产生的相同抗体的CD16a结合亲和力的百分比。

图8A-C显示了从对照和高甘氨酸过程产生的依洛珠单抗的ADCC活性。该研究是在来自3个不同供体的人外周血单核细胞(PBMC)上进行的。包括在测定中的阴性对照使用无ADCC活性的对照抗体和无抗体添加的样品。

图9A-B显示了从对照和高甘氨酸过程产生的PDL241的ADCC活性。该研究是在来自2个不同供体的PBMC上进行的。包括在测定中的阴性对照使用无ADCC活性的对照抗体和无抗体添加的样品。

图10A-B显示了从对照和高甘氨酸过程产生的PDL192(enavatuzumab)的ADCC活性。该研究是在来自2个不同供体的PBMC上进行的。包括在测定中的阴性对照使用无ADCC活性的对照抗体和无抗体添加的样品。

图11A-B显示了从对照和高甘氨酸过程产生的达克珠单抗的ADCC活性。该研究是在来自2个不同供体的PBMC上进行的。包括在测定中的阴性对照使用无ADCC活性的对照抗体和无抗体添加的样品。

5.公开内容详述

本公开内容涉及用于重组糖蛋白(例如抗体)表达的组合物和方法。所述组合物和方法产生相较于在传统培养基中产生的糖蛋白而言具有减少的岩藻糖基化糖形和增加的ADCC活性的糖蛋白。通过利用本公开内容的组合物和方法的表达系统产生的抗体有利地显示出比当在传统培养基中培养产生时更少的岩藻糖基化。本公开内容的各个方面描述于下文中。5.1节描述包含升高的浓度的培养基(即高甘氨酸培养基)，其适合用于培养能够表达蛋白的哺乳动物细胞。5.2节描述可在高甘氨酸培养基中产生的各种糖蛋白(例如抗体)。5.3节描述用于产生糖蛋白的核酸和表达系统。5.4节描述可用于产生糖蛋白的培养方法。5.5节描述回收和纯化由本公开内容的方法产生的糖蛋白的方法。5.6节描述由本公开内容的方法产生的糖蛋白群。5.7节描述由本公开内容的方法产生的糖蛋白的药物组合物。5.8节描述使用由本公开内容的方法产生的示例性抗体治疗各种疾病的方法。

5.1细胞培养基

在一个方面，本公开内容提供了适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含高浓度的甘氨酸。如本文中所用，术语“培养基”是指适合用于哺乳动物细胞在体外细胞培养物中的生长的介质。如本文中所用，术语“细胞培养”或“培养”是指哺乳动物细胞在体外环境中的生长。典型的培养基包含氨基酸、维生素、微量元素、游离脂肪酸和能量来源。另外的生长成分例如生长因子、核苷、脂质、激素和抗生素也可包含在培养基中。此外，培养基可包含缓冲液、重量摩尔渗透压浓度调节剂和表面活性剂。

如本领域技术人员将认可的，用于培养产生重组蛋白(例如抗体)的细胞的培养基和补料培养基，以及其它变量例如补料方案、生长速率、温度和含氧量，可影响所表达的蛋白质的产率和质量。优化这些条件的方法在本领域技术人员的能力范围之内；示例性条件示于本公开内容的示例性实施方案中。优选地，细胞适于生长在不含胆固醇-、血清-和其它动物-来源的成分的培养基中；在这样的情况下，培养基和补料培养基优选包含替代这样的成分的确定的化学物质。因此，产生重组蛋白的方法可包括在不含动物-来源的成分的化学成分确定的培养基中培养本公开内容的重组哺乳动物细胞。

本公开内容的培养基是高甘氨酸培养基。如本文中所用，术语“高甘氨酸培养基”是指其中甘氨酸的浓度高于发现于典型细胞培养基中的甘氨酸的浓度的培养基。如下表1中所显示的，商业培养基(例如基本培养基)中甘氨酸的浓度为约0.1mM至约2mM。

表1：典型商业培养基中甘氨酸的浓度

本公开内容的培养基中甘氨酸的浓度优选为5mM或更多。例如，培养基中甘氨酸的浓度可以是5mM至100mM(例如5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、22mM、25mM、30mM或50mM)。在具体的实施方案中，培养基中甘氨酸的浓度可以以任何两个前述值为界，例如但不限于5mM至10mM、7mM至10mM、10mM至15mM、12mM至17mM、15mM至20mM、16mM至18mM、10mM至30mM、10mM至25mM、20mM至30mM、10mM至50mM或20mM至50mM的浓度。

本公开内容的培养基可包含除甘氨酸以外的多种氨基酸。例如，培养基可包含其它的氨基酸，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在具体的实施方案中，培养基可包含以通常发现于传统培养基(例如基本培养基)中的浓度存在的氨基酸(除甘氨酸以外)。适当的氨基酸具有表2中列出的范围中的浓度。

表2：本公开内容的培养基中氨基酸的示例性浓度范围

在某些实施方案中，本公开内容提供的培养基中甘氨酸的浓度为5mM至30mM，并且其中除甘氨酸以外的一种或多种氨基酸的浓度为表3中列出的浓度或低于这些浓度。例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十一种氨基酸的浓度可以是表3中列出的浓度或低于这些浓度。在一个实施方案中，培养基中赖氨酸的浓度介于0.5mM和5.0mM之间。表2中未指出的其它氨基酸可存在于培养基中，例如以表2中列出的范围中的浓度存在。

表3：本公开内容的某些实施方案的培养基中特定氨基酸的示例性最大浓度

在其它方面，本公开内容提供的培养基中甘氨酸的浓度为5mM至30mM，并且其中除甘氨酸以外的一种或多种氨基酸的浓度为表4中列出的浓度或低于这些浓度。例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十一种氨基酸的浓度可以是表4中列出的浓度或低于这些浓度。表3中未指出的其它氨基酸可存在于培养基中，例如以表2中列出的范围中的浓度存在。

表4：本公开内容的某些实施方案的培养基中的特定氨基酸的示例性最大浓度

此外，本公开内容的培养基可包含多种维生素。典型的维生素包括但不限于维生素B-12、生物素、胆碱、叶酸、烟酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素和盐酸硫胺素。可以以表5中显示的浓度范围来适当地使用维生素。

表5：本公开内容的培养基中维生素的示例性浓度

此外，本公开内容的细胞培养基可包含多种微量元素。典型的微量元素包括但不限于无水氯化钙、无水氯化钙、无水氯化镁、无水硫酸镁、氯化钾和无水磷酸氢二钠。可以以表6中显示的浓度范围来讲微量元素适当地用于培养基中。

表6：本公开内容的培养基中微量元素的示例性浓度

培养基还可包含至少一种能量来源。可包含在细胞培养物中的能量来源的实例包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、麦芽糖和果糖。可以将葡萄糖以5g/L至20g/L的浓度添加至培养基。

本公开内容的培养基还可包含缓冲液。缓冲液被用来将细胞培养物维持在适当的pH。可在培养基中使用的缓冲液包括但不限于HEPES、磷酸盐缓冲液(例如磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)和碳酸钠。缓冲液可被用来将培养基的pH维持在可接受的范围中，通常是6.5至7.5的pH，更通常地是6.8至7.2的pH。

培养基可包含盐类以调节重量摩尔渗透压浓度。例如，通常加入重量摩尔渗透压浓度调节剂以将培养基的重量摩尔渗透压浓度维持在250-400毫渗透压摩尔(mOsm)之间的范围之中，更通常地270-350mOsM之间的范围之中。特征性重量摩尔渗透压浓度调节剂包括盐类例如氯化钠或氯化钾。本领域技术人员将理解培养基中的高甘氨酸量将影响培养基的重量摩尔渗透压浓度。因此，可通过在考虑了由高甘氨酸水平贡献的重量摩尔渗透压浓度之后减少添加至培养基的重量摩尔渗透压浓度调节剂的量来将培养基的重量摩尔渗透压浓度维持在适当的范围中。

本公开内容的培养基还可包含脂质因子。典型的脂质因子包括但不限于硫辛酸、氯化胆碱、油酸和磷脂酰胆碱。

5.2糖蛋白

本公开内容提供了富含非岩藻糖基化糖形的糖蛋白。5.2.1节描述了可通过本公开内容的方法产生的抗体。5.2.2节描述了可通过本公开内容的方法产生的其它类型的糖蛋白。

5.2.1抗体

抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体显示对特定靶的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶特异性的其它抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条重链在一个末端具有可变结构域(VH)后接多个恒定结构域。每条轻链在一个末端具有可变结构域(VL)并在其另一末端具有恒定结构域。

本公开内容提供了富含非岩藻糖基化糖形的抗体。除非另有指明，否则术语“抗体”(Ab)是指与特定抗原特异性结合或免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、基因工程化和另外地修饰的形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异缀合抗体(例如双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody)和抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')₂、Fab、Fv、rIgG和scFv片段。此外，除非另外指明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意欲包括能够特异性结合蛋白质的完整分子和抗体片段(例如Fab和F(ab')₂片段)。Fab和F(ab')₂片段缺乏完整抗体的Fc片段，其更快速地从动物的循环清除，并且可具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(Wahl等人,1983,J.Nucl.Med.24:316)。术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中将来自传统抗体的重链和轻链的可变结构域连接起来以形成一条链。

“VH”的使用是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的重链。“VL”的使用是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。

轻链和重链可变结构域都具有互补决定区(CDR)，也被称作高变区。可变结构域的更加高度保守的部分被称作框架区(FR)。如本领域中已知的，描绘抗体高变区的氨基酸位置/边界可取决于上下文和本领域中已知的不同定义而不同。可变结构域内的一些位置可被视作混合高变位置，因为这些位置可在一组标准下被视为在高变区之内而在不同的一组标准下被视为在高变区之外。这些位置中的一个或多个还可见于延伸的高变区中。每条链中的CDR通过FR区紧密相邻地保持在一起并且与其它链的CDR一起促成抗体靶结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.1987)。如本文中所用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是按照Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行的，除非另有指明。

还可利用本公开内容的组合物和方法来产生抗体片段。术语“抗体片段”是指全长抗体的部分，通常是靶结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段。“Fv”片段是包含完整靶识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的紧密的非共价缔合的二聚体(VH-VL二聚体)组成。其是这样的构造：每个可变结构域的3个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上定义靶结合位点。通常地，该6个CDR赋予抗体靶结合特异性。然而，在一些情况下即使单个可变结构域(或仅包含特异于靶的3个CDR的Fv的一半)也可具有识别和结合靶的能力。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含单个多肽链的抗体VH和VL结构域。通常地，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于靶结合的期望结构。“单结构域抗体”包含显示出对于靶的充分亲和力的单个VH或VL结构域。在特定实施方案中，单结构域抗体是骆驼化抗体(参见例如Riechmann,1999,Journal ofImmunological Methods 231:2538)。

Fab片段包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH₁)。Fab'片段与Fab片段不同之处在于在重链CH₁结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')片段通过切割F(ab')₂胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键来产生。抗体片段的另外的化学偶联对于本领域技术人员是已知的。

在某些实施方案中，本公开内容的抗体是单克隆抗体。如本文中所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆的抗体，而不是产生其的方法。可使用本领域已知的多种技术包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合，来制备用于本公开内容的单克隆抗体。本公开内容的抗体包括嵌合的、灵长目源的、人源化的或人抗体。

利用本公开内容的方法和组合物产生的抗体可以是嵌合抗体。如本文中所用的术语“嵌合”抗体是指具有来源于非人免疫球蛋白例如大鼠或小鼠抗体的可变序列和通常从人免疫球蛋白模板选择的人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法在本领域是已知的。参见例如通过引用整体并入本文的Morrison,1985,Science229(4719):1202-7；Oi等人,1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies等人,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816397。

利用本公开内容的方法和组合物产生的抗体可以是人源化的。非人(例如鼠的)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人免疫球蛋白的最小限度的序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其它靶结合子结构域)。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个和通常两个可变结构域，其中对应于非人免疫球蛋白的CDR区的所有的或基本上所有的CDR区和所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，通常是人免疫球蛋白恒定序列的至少部分。抗体人源化的方法在本领域是已知的。参见例如Riechmann等人.,1988,Nature 332:323-7；Queen等人的美国专利No:5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；EP239400；PCT公开WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka等人,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；和美国专利No.5,565,332，将所有这些文献通过引用整体并入本文。

利用本公开内容的方法和组合物产生的抗体可以是人抗体。完全的“人”抗体可对于人患者的治疗是期望的。如本文中所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并包括从人免疫球蛋白文库或从针对一种或多种人免疫球蛋白是转基因的并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体。可通过本领域中已知的多种方法包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示法来制备人抗体。参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735；和WO 91/10741，将每一文献通过引用整体并入本文。还可使用转基因小鼠来产生人抗体，所述转基因小鼠不能够表达功能性内源免疫球蛋白，但可表达人免疫球蛋白基因。参见例如PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利No.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，将其通过引用整体并入本文。此外，公司诸如Medarex(Princeton,NJ)、Astellas Pharma(Deerfield,IL)和Regeneron(Tarrytown,NY)可使用与上文所述的相似的技术提供针对选择的抗原的人抗体。可使用被称作为“导向选择”的技术来产生识别选择的表位的完全人抗体。在该方法中，将选择的非人单克隆抗体例如小鼠抗体用于导向识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等人,1988,Biotechnology12:899-903)。

利用本公开内容的方法和组合物产生的抗体可以是灵长目源的。术语“灵长目源抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。用于产生灵长目源抗体的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,658,570；5,681,722；和5,693,780，将其通过引用整体并入本文。

利用本公开内容的方法和组合物产生的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是具有针对至少两种不同的抗原的结合特异性的单克隆(通常是人或人源化的)抗体。

利用本公开内容的方法和组合物产生的抗体包括衍生抗体。例如但非限定性地，衍生抗体通常发生如下的修饰：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白等。多种化学修饰的任一种可通过已知的技术来进行，包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，所述衍生物可包含一种或多种非天然氨基酸，例如使用ambrx技术(参见例如Wolfson,2006,Chem.Biol.13(10):1011-2)。

在本公开内容的另一个实施方案中，抗体或其片段可以是其序列已被修饰以相对于对应的野生型序列改变至少一种恒定区介导的生物效应子功能的抗体或抗体片段。

例如，在一些实施方案中，本公开内容的抗体可以被修饰以相对于未经修饰的抗体减小至少一种恒定区介导的生物效应子功能，例如减小的与Fc受体(FcR)的结合。可通过突变FcR相互作用所必需的特定区域处的抗体免疫球蛋白恒定区节段来减小FcR结合(参见例如，and Morrison,1991,J.Exp.Med.173:1483-1491；和Lund等人,1991,J.Immunol.147:2657-2662)。

在其它实施方案中，利用本公开内容的方法和组合物产生的抗体被修饰以相对于未经修饰的抗体获得或改善至少一种恒定区介导的生物效应子功能，例如以增强FcγR相互作用(参见例如US2006/0134709)。例如，可按照本文中描述的方法产生具有以比对应的野生型恒定区更大的亲和力结合FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的恒定区的抗体。

可使用本公开内容的方法产生的抗体的实例包括但不限于阿达木单抗、依洛珠单抗、enavatuzumab、达克珠单抗、伏洛昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、istekinumab、abcicimab、贝索单抗、埃达珠单抗、pemtumomab、奥马珠单抗、培妥珠单抗、那他珠单抗、硫索单抗、替非珠单抗、伏妥木单抗、莫维珠单抗、oregovomabm、帕木单抗、扎芦木单抗、伊戈伏单抗、贝伐珠单抗、巴利昔单抗、atlizumab、贝妥莫单抗、贝利木单抗、阿伦珠单抗、尼妥珠单抗、美泊珠单抗、阿妥莫单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、帕利珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、芳妥珠单抗、诺非单抗、奥法木单抗、阿西莫单抗、西妥昔单抗、英西单抗、赛妥珠单抗、罗维珠单抗、芦利珠单抗、伊匹木单抗、拉贝珠单抗、卡妥索单抗、卡那奴单抗、地舒单抗、依库珠单抗、fanolesomab、依法珠单抗、英利昔单抗、依屈洛单抗、依芬古单抗、吉瑞西单抗、厄马索单抗和托珠单抗。

5.2.2其它糖蛋白

本公开内容的方法可用于产生任何蛋白质的糖蛋白，包括用于治疗性目的的蛋白质。可按照本公开内容产生的蛋白质的实例包括但不限于生长因子例如促红细胞生成素(EPO)、人慢性促性腺素(hCG)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、抗凝血酶III、白细胞介素1、白细胞介素2、白细胞介素6、人慢性促性腺素(hCG)、antitrombin III、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、凝结因子例如因子VIIIm因子IX和人蛋白C、表皮生长因子、生长激素释放因子、表皮生长因子、血管生成抑制因子、血管内皮生长因子-2和纤溶酶原激活物。

5.3核酸和表达系统

标准重组DNA方法学例如描述于Molecular Cloning；ALaboratory Manual,Second Edition(Sambrook,Fritsch andManiatis(eds),Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)、CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.et al.,eds.,Greene Publishing Associates,1989)和美国专利No.4,816,397中的那些可用于产生适合用于按照本公开内容的方法产生糖蛋白的重组哺乳动物细胞。

糖蛋白序列对于本领域技术人员而言是公知的。在其中糖蛋白是抗体的实施方案中，重组技术可用于获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体和将载体引入宿主细胞。为了重组表达抗体，用携带编码抗体免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转染重组细胞，以使得轻链和重链在宿主细胞中表达并任选地分泌至其中培养宿主细胞的培养基中，从所述培养基中可回收所述抗体。为了产生编码抗体的核酸，首先获得编码轻链和重链可变区的DNA片段。可通过扩增和修饰编码轻链和重链可变序列的生殖系DNA或cDNA来获得这些DNA，例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)来进行。用于人重链和轻链可变区基因的生殖系DNA序列在本领域是已知的(参见例如“VBASE”人生殖系序列数据库；还参见Kabat,E.A.等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242；Tomlinson等人,1992,J.Mol.Biol.22T:116-198；和Cox等人,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836；将这些文献的每一个的内容通过引用并入本文)。编码抗体的重链或轻链可变区的DNA片段可被合成并用作诱变的模板以使用常规诱变技术来产生如本文中所述的变体；可选择地，编码变体的DNA片段可被直接合成。

获得编码抗体的DNA片段后，可通过标准重组DNA技术来进一步操作这些DNA片段，例如以将可变区基因转换成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，VL-或VH-编码DNA片段被有效连接至另一个编码另一种蛋白质的DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头。如该上下文中使用的术语“有效连接”意指两个DNA片段如此连接以使得由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在阅读框内。

可通过将VH-编码DNA有效连接至另一个编码重链恒定区(CH_l,CH₂,CH₃和任选地CH₄)的DNA分子来将分离的编码VH区的DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242)并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可以是IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在某些实施方案中是IgG₁或IgG₄恒定区。对于Fab片段重链基因，VH-编码DNA可有效连接至另一个仅编码重链CH_l恒定区的DNA分子。

可通过将VL-编码DNA有效连接至另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子来将分离的编码VL区的DNA转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition(U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242))并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但在某些实施方案中是κ恒定区。为了产生scFv基因，将VH-和VL-编码DNA片段有效连接至另一个编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly₄～Ser)₃(SEQ ID NO:21))的片段，以使得VH和VL序列可被表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人,1988,Science 242:423-426；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人,1990,Nature 348:552-554)。

为了表达糖蛋白，编码糖蛋白的DNA被插入表达载体中以使得基因有效连接至转录和翻译控制序列。在该上下文中，术语“有效连接”意指糖蛋白编码核酸被整合至载体中以使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节糖蛋白编码序列的转录和翻译的功能。表达载体和表达控制序列被选择为与所使用的表达宿主细胞是相容的。当糖蛋白是抗体时，轻链基因和抗体重链基因可被插入单独的载体中或更通常地，两种基因被插入相同的表达载体中。

可通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补性限制性位点，或如果不存在限制性位点时的平端连接)将糖蛋白编码核酸插入表达载体中。当糖蛋白是抗体时，在插入抗体轻链或重链序列之前，表达载体可已经携带抗体恒定区序列。例如，一种将抗体VH和VL序列转换成全长抗体基因的方法是将它们分别插入已编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，以使得VH节段有效连接至载体内的CH节段并且VL节段有效连接至载体内的CL节段。另外地或可选择地，重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞的分泌的信号肽。抗体链基因可被克隆至载体中以使得所述信号肽在阅读框内地连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自不是免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。

重组表达载体可携带控制糖蛋白编码序列在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”意欲包括启动子、增强子和其它控制抗体链基因的转录或翻译的表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这样的调控序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,1990)中。本领域技术人员将理解表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于这样的因子如待被转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的适当调控序列包括支配哺乳动物细胞中高水平的蛋白表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。对于病毒调控元件及其系列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利No.5,168,062、Bell等人的美国专利No.4,510,245和Schaffner等人的美国专利No.4,968,615。

重组表达载体可携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起始点)和选择性标记基因。选择性标记基因帮助选择其中已引入载体的宿主细胞(参见例如Axel等人的美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常地选择性标记基因给其中已引入载体的宿主细胞赋予对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。适当的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在DHFR^-宿主细胞中与甲氨蝶呤选择/扩增一起使用)和neo基因(用于G418选择)。对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意欲包括通常用于将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞中的广泛多样的技术。

可将本公开内容的糖蛋白表达在哺乳动物宿主细胞中，用于适当折叠的且免疫活性的蛋白的最优分泌。用于表达本公开内容的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括DHFR^-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR选择性标记一起使用，例如如描述于Kaufman and Sharp,1982,Mol.Biol.159:601-621中的)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2/0细胞、细胞和PER.细胞。当将编码糖蛋白的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许糖蛋白在宿主细胞中的表达或糖蛋白至其中生长宿主细胞的培养基中的分泌的时期来产生糖蛋白。适当的培养技术描述于5.4节中。可使用标准蛋白纯化方法例如如描述于5.5节中的方法从培养基回收糖蛋白。

5.4培养方法

本公开内容提供了用于通过在高甘氨酸培养基例如5.1节中描述的培养基中培养经工程化以表达糖蛋白的哺乳动物细胞来产生糖蛋白(例如抗体)的方法。本公开内容的方法提供相较于在传统培养基中产生的糖蛋白具有减少的岩藻糖基化糖形的糖蛋白。

可将5.3节中描述的重组哺乳动物细胞进行悬浮培养，例如通过在实验室或工业发酵罐中以小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)在适当的培养基中并在允许表达和/或分离糖蛋白的条件下进行的摇瓶培养。可选择地，可将哺乳动物细胞附着至固体衬底上进行培养。

在具体的实施方案中，将重组哺乳动物细胞以0.5-5x 10⁵个细胞/mL范围内和更通常地1.5-2.5x 10⁵个细胞/mL范围内的起始细胞密度添加至基本培养基中。通常在接种后的大约8天至20天和更通常地在的10天至14天之间收获培养物。

在哺乳动物细胞的接种后，可通过按照预定的补料方案添加营养物来促进细胞的生长。补料培养基至培养物的添加可通过本领域已知的方法例如连续培养、分批培养和补料分批培养来进行。为了支持细胞的增殖，可在接种后的周期时间将补料溶液添加至培养物。如本文中所用，术语“补料”是指在接种后添加至培养物的营养物。术语“补料溶液”或“补料培养基”是指包含在接种后被添加至培养物的补料的溶液。

5.5回收和纯化

用于回收和纯化表达的蛋白质的技术在本领域中是公知的并且可针对被重组哺乳动物细胞表达的具体糖蛋白进行特制。可从培养基和/或细胞裂解物中回收糖蛋白。在其中方法涉及产生分泌的糖蛋白的实施方案中，可从培养基中回收糖蛋白。可通过本领域中已知的多种程序包括但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀来从培养基回收或纯化蛋白质。所回收的糖蛋白随后可通过本领域中已知的多种程序来进行一步纯化，所述程序包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如制备式等电聚焦(IEF))、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)或抽提(参见例如Protein Purification,J.-C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。

在其中糖蛋白是抗体的实施方案中，可通过利用与强阴离子交换(Q-琼脂糖)层析和弱阳离子交换(CM-650M)层析结合的蛋白A亲和层析的方法来纯化抗体，从而允许连续流动过程而不稀释过程中间产物。用于获得纯化的抗体的该方法可需要下列步骤：

(i)蛋白A亲和层析以从其它细胞培养组分分离抗体；

(ii)低pH病毒灭活；

(iii)强阴离子交换层析以除去DNA；

(iv)弱阳离子交换层析以减少聚集物；和

(v)过滤以除去病毒。

可以以任何次序进行步骤(ii)-(v)。

经分离后，若需要，可进一步纯化抗体，例如通过高效液相色谱法(参见例如Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology(Work and Burdon,eds.,Elsevier,1980))，或通过在Superdex^TM 75柱(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)上的凝胶过滤层析来进行。

5.6蛋白质糖形

蛋白质通过糖基化的翻译后修饰可影响该蛋白质的生化和物理性质。例如，抗体的性质可受到该抗体的Fc和Fab区上的糖基化的影响。“糖基化”是指用碳水化合物(例如寡糖链)对蛋白质(例如抗体)的共价修饰。糖蛋白中的典型糖类包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸。

个体糖基化分子(例如糖基化抗体)在本文中被称作为糖形。“糖基化模式”是指特定样品中的糖形组。糖基化通常是指N-连接的糖基化或O-连接的糖基化。术语“N-连接的糖基化”是指寡糖链至蛋白质的天冬酰胺残基的共价连接，从而形成N-连接的寡糖。N-连接的寡糖也被称作为N-连接的聚糖。术语“O-连接的糖基化”是指寡糖链至蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的共价连接，从而形成O-连接的寡糖。O-连接的寡糖也被称作为O-连接的聚糖。

N-连接的聚糖的特征还在于其末端上的半乳糖残基的数量、其是否包含连接至N-连接的-N-乙酰葡糖胺的岩藻糖。具有连接至N-连接的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖分子的N-连接的聚糖在本文中被称作为岩藻糖基化的N-连接的聚糖。具有岩藻糖基化的N-连接的聚糖的蛋白质在本文中被称作为岩藻糖基化的糖形。四种不同的岩藻糖基化的N-连接的聚糖的特征列于下文(也参见图1)：

·G0：双触角(即具有两个触角)核心结构，其具有连接至N-连接的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖并且在核心结构的每个分支上具有一个N-乙酰葡糖胺。

·G1：双触角核心结构，其具有连接至N-连接的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖，在核心结构的每个分支上具有一个N-乙酰葡糖胺并且在核心结构的一个分支上具有末端半乳糖。

·G2：双触角核心结构，其具有连接至N-连接的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖，在核心结构的每个分支上具有一个N-乙酰葡糖胺和一个末端半乳糖。

·G0-GlcNAc：双触角核心结构，其具有连接至N-连接的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖，在核心结构的一个分支上具有一个N-乙酰葡糖胺并且不具有末端半乳糖。

不包含岩藻糖分子的N-连接的聚糖被称作为非岩藻糖基化的聚糖。具有非岩藻糖基化的聚糖的蛋白质被称作为非岩藻糖基化的糖形。例如，G0-GlcNAc-岩藻糖N-连接的聚糖具有无连接至N-连接的N-乙酰葡糖胺的岩藻糖的双触角核心结构，其中核心结构的一个分支上具有N-乙酰葡糖胺并且不具有末端半乳糖。包含G0-GlcNAc-岩藻糖N-连接的聚糖的抗体在本文中被称作为G0-GlcNAc-岩藻糖N-连接的糖形。

N-连接的糖基化模式可通过多种方法来评估。例如，可通过用胰蛋白酶消化抗体并使用反相色谱法利用质谱检测和定量多种糖蛋白来分析所得的肽混合物以评估N-连接的糖基化模式。在具体的方法中，使用YMC-Pack ODS-AQ、5um粒径、120埃孔径、2.0mm x 250mm反相柱(YMC Co.,Ltd,catalog number AQ12S05-2502WT)来分析经消化的肽并使用Thermo LCQ Deca XP+质谱仪(Thermo Finnigan)来检测和定量洗脱的肽。基于对应的糖肽相对于所有观察的糖肽的峰面积的总和的质谱提取的离子色谱图峰面积来确定每种糖形的相对丰度。

可选择地，可通过用酰胺酶PNGase F切割N-连接的寡糖、用荧光标记衍生化该寡糖和通过正相HPLC利用荧光检测分析所得的混合物来评估N-连接的糖基化模式。在具体的方法中，于50℃在250x 4.6mm多聚-胺键合的Asahipak Amino NH₂P-504E柱(5μm粒径,Phenomenex,cat.No.CHO-2628)上解析衍生化的经切割的N-连接的聚糖。

IgG的糖基化模式的研究已显示IgG具有至少30个不同的N-连接的寡糖。参见Dwek等人,1995,J.Anat.187:279-292。在很多抗体的Fc区和Fab区上发现了N-连接的糖基化例证。没有任何唾液酸基团的N-连接的寡糖常常被称作为中性N-连接的寡糖。在寡糖的非还原性糖末端上具有一个或两个唾液酸基团的N-连接的寡糖分别被称作为单唾液酸化或双唾液酸化的N-连接的寡糖。关于IgG，Fc糖基化的特征在于单唾液酸化和双唾液酸化结构的低发生率而Fab糖基化的特征在于单唾液酸化和双唾液酸化结构的高发生率。

在抗体的Fc区中已鉴定了另外的N-连接的聚糖。例如，包含大量甘露糖的特征在于聚糖仅包含两个N-乙酰葡糖胺而其余残基包含甘露糖的聚糖被称作为“高甘露糖聚糖”。甘露糖残基在寡糖的2-位置上共价连接至GlcNAc。高甘露糖五聚糖的一个实例是“甘露糖5聚糖”。甘露糖5聚糖包含5个甘露糖残基。具有甘露糖5聚糖的蛋白质在本文中被称作为“甘露糖5糖形”。高甘露糖聚糖是非岩藻糖基化聚糖的实例。

本公开内容提供了产生富含不包含岩藻糖的糖形(即非岩藻糖基化的糖形)的抗体的方法。非岩藻糖基化糖形的实例包括但不限于G0-GLcNAc-岩藻糖糖形和甘露糖5糖形。不含岩藻糖的抗体与增强的ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒性)活性相关。淋巴细胞，特别是天然杀伤(NK)细胞，包含能够与抗体的Fc区结合的表面结合受体。例如，NK细胞上的人CD16a受体与结合至靶细胞的抗体的Fc区结合，从而起始杀死靶细胞。在不受理论的约束的情况下，据信按照本公开内容的方法产生的非岩藻糖基化糖形显示出比包含岩藻糖的糖形(即岩藻糖基化糖形)更高的对NK细胞上的CD16a受体的结合亲和力，这导致了增加的ADCC活性。

在如本文中描述的高甘氨酸培养基中产生的抗体包含比在常规培养基中产生的抗体显著更多的非岩藻糖基化糖形。如在5.3节中描述的，不含岩藻糖的聚糖的总量一般随着培养基中甘氨酸浓度从2mM增加至30mM而增加。具体地，当NS0细胞在按照本公开内容产生的培养基中培养时，G0-GlcNAc-岩藻糖和甘露糖5聚糖的百分比增加。虽然在本公开内容的培养基中产生的非岩藻糖基化抗体的量取决于AOI，但不含岩藻糖的聚糖相对于在常规培养基(即具有2mM或更少的甘氨酸浓度的培养基)中产生的抗体的百分比增加通常为至少120％。例如，在本公开内容的培养基中产生的抗体上的总的不含岩藻糖的聚糖相对于在常规培养基中产生的抗体的百分比增加可以是120％、150％、180％、200％、250％、300％或400％。在具体的实施方案中，通过本公开内容的方法产生的抗体上的总的不含岩藻糖的聚糖相对于在常规基本培养基中产生的抗体的百分比增加以任何两个前述值为界，例如但不限于120-150％、150-180％、150-200％或200-300％。

本公开内容还提供包含特定目标抗体的组合物，所述抗体相对于在常规培养基中产生的抗体具有改变的糖基化模式。具体地，通过本公开内容的方法产生的抗体具有比在常规培养基中产生的抗体更高百分比的非岩藻糖基化糖形。作为结果，通过本公开内容的方法产生的抗体通常显示出比在常规培养基中产生的抗体更高的ADCC活性并且显示与NK细胞上的CD16a受体更强的结合。

在一个具体的实施方案中，本公开内容的方法可用于产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH区和氨基酸序列SEQ ID NO:2的VL区的单克隆抗体。该单克隆抗体被称作为依洛珠单抗(HuLuc63)，并在美国专利公开No.2006/0024296中被公开为分别具有SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:44的VH和VL区，将该专利公开的内容通过引用并入本文。依洛珠单抗具有SEQ ID NO:3的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的完全轻链氨基酸序列。依洛珠单抗显示出体外的在原代骨髓瘤细胞中的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和体内的抗肿瘤活性(Hsi等人,(2008)Clin.Cancer Res.14(9):2775)。

本公开内容提供了包含依洛珠单抗分子群的组合物，其中至少4％的聚糖不含岩藻糖，所述组合物按照本公开内容的细胞培养方法来产生。例如依洛珠单抗上至少4％、至少5％、至少6％、至少7％或至少8％的聚糖不含岩藻糖。在具体的实施方案中，按照本公开内容的细胞培养方法产生的依洛珠单抗的非岩藻糖基化聚糖包括但不限于N-连接的聚糖例如G0-GlcNAC-岩藻糖和甘露糖5聚糖。在这些实施方案中，至少4％的N-连接的聚糖不含岩藻糖。在其它实施方案中，本公开内容提供了具有以甘露糖5聚糖存在的至少2.5％的总的聚糖的依洛珠单抗分子。例如，依洛珠单抗上至少3％、至少4％或至少5％的聚糖可以以甘露糖5聚糖存在。

在另一个实施方案中，本公开内容的方法可用于产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VH区和氨基酸序列SEQ ID NO:6的VL区的单克隆抗体。该单克隆抗体被称作为达克珠单抗，其是特异性结合人白细胞介素-2受体(IL-2R)(其是淋巴细胞活化的重要介导物)的α亚基(也被称作为CD25或Tac)的人源化IgG₁抗体。达克珠单抗具有SEQ ID NO:7的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:8的完全轻链氨基酸序列。

本公开内容提供了包含达克珠单抗分子群的组合物，其中至少3％的聚糖不含岩藻糖，所述组合物按照本公开内容的细胞培养方法来产生。例如达克珠单抗上至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％或至少8％的聚糖不含岩藻糖。在具体的实施方案中，按照本公开内容的细胞培养方法产生的达克珠单抗的非岩藻糖基化聚糖包括但不限于N-连接的聚糖例如G0-GlcNAC-岩藻糖和甘露糖5聚糖。在这些实施方案中，至少3％的N-连接的聚糖不含岩藻糖。在其它实施方案中，本公开内容提供了具有以甘露糖5聚糖存在的至少2％的总的聚糖的达克珠单抗分子。例如，达克珠单抗上至少3％、至少4％或至少5％的聚糖可以以甘露糖5聚糖存在。

在另一个实施方案中，本公开内容的方法可用于产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的VH区和氨基酸序列SEQ ID NO:10的VL区的单克隆抗体。该单克隆抗体被称作为伏洛昔单抗，其是特异性结合α₅β₁整联蛋白用于治疗多种晚期肿瘤的高亲和力IgG4嵌合(82％人、18％鼠)单克隆抗体(mAb)。伏洛昔单抗具有SEQ ID NO:11的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的完全轻链氨基酸序列。

本公开内容提供了包含伏洛昔单抗分子群的组合物，其中至少1％的聚糖不含岩藻糖，所述组合物按照本公开内容的细胞培养方法来产生。例如伏洛昔单抗上至少1％的聚糖不含岩藻糖。在具体的实施方案中，按照本公开内容的细胞培养方法产生的伏洛昔单抗的非岩藻糖基化聚糖包括但不限于N-连接的聚糖例如G0-GlcNAC-岩藻糖和甘露糖5聚糖。在这些实施方案中，至少1％的N-连接的聚糖不含岩藻糖。在其它实施方案中，本公开内容提供了具有以甘露糖5聚糖存在的至少0.5％的总的聚糖的伏洛昔单抗分子。

在另一个实施方案中，本公开内容的方法可用于产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的VH区和氨基酸序列SEQ ID NO:14的VL区的单克隆抗体。该单克隆抗体被称作为PDL241，其是结合蛋白CS1(但在与依洛珠单抗不同的表位上)的人源化IgG₁抗体。PDL241具有SEQ IDNO:15的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:16的完全轻链氨基酸序列。

本公开内容提供了包含PDL241分子群的组合物，其中至少14％的聚糖不含岩藻糖，所述组合物按照本公开内容的细胞培养方法来产生。例如PDL241上至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％或至少19％的聚糖不含岩藻糖。在具体的实施方案中，按照本公开内容的细胞培养方法产生的PDL241的非岩藻糖基化聚糖包括但不限于N-连接的聚糖例如G0-GlcNAC-岩藻糖和甘露糖5聚糖。在这些实施方案中，至少14％的N-连接的聚糖不含岩藻糖。在其它实施方案中，本公开内容提供了具有以甘露糖5聚糖存在的至少8％的总的聚糖的PDL241分子。例如，PDL241上至少9％、至少10％、至少11％或至少12％的聚糖可以以甘露糖5聚糖存在。

在另一个实施方案中，本公开内容的方法可用于产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:17的VH区和氨基酸序列SEQ ID NO:18的VL区的单克隆抗体。该单克隆抗体被称作为enavatuzumab(PDL192)，其是针对TweakR的人源化IgG₁抗体，其在临床前模型中显示出通过两种机制的抗肿瘤活性：通过TweakR的直接信号转导和抗体依赖性细胞细胞毒性。Enavatuzumab具有SEQ ID NO:19的完全重链氨基酸序列和SEQID NO:20的完全轻链氨基酸序列。

本公开内容提供了包含enavatuzumab分子群的组合物，其中至少5％的聚糖不含岩藻糖，所述组合物按照本公开内容的细胞培养方法来产生。例如enavatuzumab上至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％的聚糖不含岩藻糖。在具体的实施方案中，按照本公开内容的细胞培养方法产生的enavatuzumab的非岩藻糖基化聚糖包括但不限于N-连接的聚糖例如G0-GlcNAC-岩藻糖和甘露糖5聚糖。在这些实施方案中，至少5％的N-连接的聚糖不含岩藻糖。在其它实施方案中，本公开内容提供了具有以甘露糖5聚糖存在的至少2.5％的总的聚糖的enavatuzumab分子。例如，enavatuzumab上至少3％、至少4％或至少5％的聚糖可以以甘露糖5聚糖存在。

下表7提供了如上所述的依洛珠单抗、达克珠单抗、伏洛昔单抗、PDL241和enavatuzumab的序列。

表7：依洛珠单抗、达克珠单抗、伏洛昔单抗、PDL241和enavatuzumab的序列

5.7药物组合物

可将上述糖蛋白组合物提供为包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的部分。该组合物可以为任何适当的形式(取决于期望的将其施用至患者的方法)。可通过多种途径例如经口地、经皮地、皮下地、鼻内地、静脉内地、肌内地、鞘内地、局部地或全身地将糖蛋白组合物施用至患者。在任何给定情况下用于施用的最适途径将取决于具体的糖蛋白、受试者和疾病的性质和严重度以及受试者的身体状况。通常地，将静脉内或皮下地施用糖蛋白组合物。

药物组合物可方便地呈现为单位剂型，其包含每剂量预定量的本公开内容的糖蛋白组合物。这样的单位可包含例如但不限于0.5mg至5g，例如10mg至1g，或20至50mg。用于本公开内容的药学上可接受的载体可取决于例如待被治疗的病况或施用途径而采取广泛多样的形式。

可通过将具有期望纯度的糖蛋白与本领域中通常采用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(在本文中其都被称作为“载体(carrier)”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂(isotonifier)、非离子型去垢剂、抗氧化剂和其它各种各样的添加剂)混合来将本公开内容的糖蛋白组合物的治疗学制剂制备为用于储存的冻干制剂或水溶液。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition(Osol,ed.1980)。这样的添加剂必须在所采用的剂量和浓度上对受体是无毒性的。

缓冲剂帮助将pH维持在近似生理条件的范围之内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。用于与本公开内容使用的适当缓冲剂包括有机和无机酸及其盐例如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐例如Tris。

可添加防腐剂来阻止微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量来添加。用于与本公开内容使用的适当防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八基二甲基苯甲基氯化铵、苯扎卤铵(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己双铵和对羟基苯甲酸烷酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加有时被称作为“稳定剂”的等渗剂以确保本公开内容的液体组合物的等渗性，所述等渗剂包括多羟基糖醇例如三羟基或更多糖醇，例如丙三醇、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。稳定剂是指广泛类别的赋形剂，其在功能上可以是从填充剂至使治疗剂增溶或帮助防止变性或至容器壁的附着的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(如上列举的)；氨基酸例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、myoinisitol、半乳糖醇、丙三醇等，包括环醇类例如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如具有10个或更少的残基的肽)；蛋白质例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖例如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖例如棉子糖；和多糖例如葡聚糖。稳定剂可以以每份活性蛋白重量0.1至10,000重量的范围存在。

可添加非离子型表面活性剂或去垢剂(也被称作为“湿润剂”)以帮助增溶糖蛋白以及保护糖蛋白避免搅拌诱导的聚集，其还允许将制剂暴露于在不引起蛋白质的变性的情况下进行应力的切变面。适当的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯类(20、80等)、polyoxamer(184、188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇甲醚(( 等)。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。

另外的各种各样的赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。

5.8治疗方法

5.8.1依洛珠单抗和PDL241组合物

描述于5.6节中的依洛珠单抗和PDL241组合物可用于治疗被认为牵涉蛋白CS1在赘生性细胞上的增加的表达的多种病症和病况，包括例如多发性骨髓瘤。可用于治疗或预防多发性骨髓瘤的制剂、施用方式和给药量及方案以及特定患者群体描述于美国专利No.7,709,610中，将其通过引用并入本文。所有这些制剂、施用方式、给药量及方案以及所公开的特定患者群体和组合疗法，同等地适用于本文描述的依洛珠单抗和PDL241组合物。

将本文描述的依洛珠单抗和PDL241组合物和制剂以提供治疗性益处的量进行施用。治疗性益处包括但不限于治疗潜在的病症。治疗性益处还可包括改善或减轻如使用标准诊断和其它测试所评估的特定疾病的症状或副作用。对于多发性骨髓瘤，评估治疗性益处的多种方法描述于美国专利No.7,709,610中。所有这些各种各样的测试可被用于评估患有多发性骨髓瘤的患者背景中的治疗性益处。

5.8.2伏洛昔单抗组合物

描述于5.6节中的伏洛昔单抗组合物可用于治疗被认为牵涉α₅β₁整联蛋白的多种病症和病况，包括例如多种实体瘤。可用于治疗或预防实体瘤、减少血管发生和减少癌细胞增殖的制剂、施用方式和给药量及方案以及特定患者群体描述于美国专利No.7,662,384中，将其通过引用并入本文。所有这些制剂、施用方式、给药量及方案以及所公开的特定患者群体和组合疗法，同等地适用于本文描述的伏洛昔单抗组合物。

将本文描述的伏洛昔单抗组合物和制剂以提供治疗性益处的量进行施用。治疗性益处包括但不限于治疗潜在的病症。治疗性益处还可包括改善或减轻如使用标准诊断和其它测试所评估的特定疾病的症状或副作用。对于肿瘤的治疗，评估治疗性益处的多种方法描述于美国专利No.7,662,384中。所有这些各种各样的测试可被用于评估患有癌症的患者背景中的治疗性益处。

5.8.3Enavatuzumab组合物

描述于5.6节中的enavatuzumab组合物可用于治疗被认为牵涉Tweak受体(TweakR)的多种病症和病况，包括例如多种实体瘤。可用于治疗或预防实体瘤、减少血管发生和减少癌细胞增殖的制剂、施用方式和给药量及方案以及特定患者群体描述于美国公开申请No.2009/0074762中，将其通过引用并入本文。所有这些制剂、施用方式、给药量及方案以及所公开的特定患者群体和组合疗法，同等地适用于本文描述的enavatuzumab组合物。

将本文描述的enavatuzumab组合物和制剂以提供治疗性益处的量进行施用。治疗性益处包括但不限于治疗潜在的病症。治疗性益处还可包括改善或减轻如使用标准诊断和其它测试所评估的特定疾病的症状或副作用。对于肿瘤的治疗，评估治疗性益处的多种方法描述于美国公开申请No.2009/0074762中。所有这些各种各样的测试可被用于评估患有癌症的患者背景中的治疗性益处。

6.实施例

将本文描述的发明的各个方面和特征通过实施例的方式在下文进行进一步的描述。可在不实质性影响本公开内容的方法和组合物的期望性质的情况下改变与具体实施方案(无论是在上文的概述中或是在下文的实施例中)结合描述的特征，并且此外不同的实施方案可进行组合并以多种方式一起使用除非它们是明显相互排斥的。因此，应理解下文提供的实施例意欲是举例说明性的并且是非限制性的，且不应被解释为限定下文的权利要求。

6.1NS0稳定细胞系的产生

6.1.1依洛珠单抗

将如Hartman等人,2007,Biotechnol.Bioeng.96(2):294-306描述的小鼠骨髓瘤细胞系NS0-W(W表示所述NS0细胞已脱离了其对于血清和胆固醇的需要)维持在不含蛋白质的基本培养基中。用pHuLuc63表达质粒DNA通过电穿孔转染NS0-W细胞。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中于麦考酚酸存在的情况下选择已稳定整合表达质粒的转染子。从产生高水平HuLuc63的NS0-W转染子开始，通过有限稀释进行亚克隆。将具有可接受的生产率和产物特性的亚克隆选择为最终的生产细胞系并命名为192-C17。

6.1.2达克珠单抗

小鼠骨髓瘤细胞系NS0获自European Collection of CellCultures(ECACC catalog#85110503,Salisbury,Wiltshire,UK)。将一小瓶这些NS0细胞解冻至补充有10％FBS的DMEM中。随后在补充有1mg/mL BSA的基本培养基SFM-3中培养所述细胞。SFM-3是补充有10mg/L胰岛素和10ug/mL转铁蛋白的Ham’s F-12和DMEM的1:1混合物。在约3个月的时期内，通过逐步减少培养基中存在的FBS的量直到将其去除和随后最终在单个步骤中去除BSA，来使NS0细胞适应于不含有补充物的SFM-3。将所得的宿主细胞系在SFM-3中传代15-20次并制备冷冻库。

用pHAT.IgG1.rg.dE通过电穿孔转染SFM-3适应的细胞。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中于麦考酚酸存在的情况下选择已稳定整合该载体的转染子。从产生高水平的DAC HYP的NS0稳定转染子开始，通过有限稀释克隆或荧光激活细胞分选(FACS)进行亚克隆。将具有可接受的生产率和产物特性的亚克隆选择为最终的生产细胞系并命名为7A11-5H7-14-43。

6.1.3伏洛昔单抗

M200-产生细胞系46-12来源于用表达质粒P-200M转染的NS0-W细胞。在转染前，使获自ECACC(ECACC No.85110503)的NS0细胞在PDL上适应于不含血清和胆固醇的条件并命名为NS0-W。用P-200M表达质粒DNA通过电穿孔转染NS0-W细胞。在含有5％胎牛血清的DMEM培养基中于麦考酚酸存在的情况下选择已稳定整合表达质粒的转染子。从产生高水平的M200的NS0-W转染子开始，通过有限稀释克隆进行亚克隆。将具有可接受的生产率和产物特性的亚克隆选择为最终的生产细胞系并命名为46-12。

6.1.4.PDL241

将如Hartman等人,2007,Biotechnol.Bioeng.96(2):294-306所描述的小鼠骨髓瘤细胞系NS0-W(W表示所述NS0细胞已脱离了其对于血清和胆固醇的需要)维持在不含蛋白质的基本培养基中。用PDL241表达质粒DNA通过电穿孔转染NS0-W细胞。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中于麦考酚酸存在的情况下选择已稳定整合表达质粒的转染子。从产生高水平的PDL241的NS0-W转染子开始，通过有限稀释克隆进行亚克隆。选择具有可接受的生产率和产物特性的亚克隆并命名为26-5C6。

6.1.5.Enavatuzumab

将如Hartman等人,2007,Biotechnol.Bioeng.96(2):294-306所描述的小鼠骨髓瘤细胞系NS0-W(W表示所述NS0细胞已脱离了其对于血清和胆固醇的需要)维持在不含蛋白质的基本培养基中。用pHu19.2.1表达质粒DNA通过电穿孔转染NS0-W细胞。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中于麦考酚酸存在的情况下选择已稳定整合表达质粒的转染子。从产生高水平的PDL192的NS0-W转染子开始，通过有限稀释进行亚克隆。将具有可接受的生产率和产物特性的亚克隆选择为最终的生产细胞系并命名为299-9。

6.2抗体的产生

6.2.1.细胞培养和回收

将细胞从单个细胞库小瓶解冻并在T-培养瓶、滚瓶、转瓶和生物反应器内以逐渐更大的体积扩增直到获得生产规模。在完成生产培养后，通过离心和深层过滤澄清细胞培养液，并将其转移至收获储存罐。生产培养持续时间为约10天。

可在多种不同的细胞培养设施中使用标准设备进行细胞培养和回收，如本领域中已知的。在另一个实例中，将细胞从单个细胞库小瓶解冻并在摇瓶和生物反应器内以逐渐更大的体积扩增直到获得生产规模。在完成生产培养后，通过离心和深层过滤澄清细胞培养液，并将其转移至收获储存罐。生产培养持续时间为约10天。

6.2.1.1.接种物制备

生产批次通过解冻单个细胞库小瓶起始。为了产生对照培养基(即不含过量的甘氨酸)，将细胞转移至包含化学成分确定的培养基(不含蛋白质的基本培养基-2(PFBM-2))的T培养瓶。用于制备PFBM-2的定制粉末可通过要求杂交瘤-SFM培养基粉末被制备为不含NaCl、酚红、转铁蛋白和胰岛素，包括一定量的EDTA铁(III)钠盐(当重建时产生5mg/L的浓度)，并且具有经调整以使得当重建时其浓度与所重建的杂交瘤-SFM相同的浓度的其余成分的量，而从Invitrogen订购。所制备的PFBM-2培养基包含下列成分：8g/L定制粉末；2.45g/L碳酸氢钠；3.15g/L NaCl；和16.5g/L D-一水葡萄糖(15g/L葡萄糖)。PFBM-2培养基中甘氨酸的浓度为2mM。

为了产生甘氨酸培养基，首先如上所述产生PFBM-2培养基。随后将额外的甘氨酸(例如5mM、15nM或30nM)添加至所述PFBM-2培养基。为了确保高甘氨酸培养基具有与PFBM-2对照培养基大致相同的重量摩尔渗透压浓度，通过添加适当水平的NaCl来调节重量摩尔渗透压浓度。例如，表8显示了被添加至对照培养基和3个高甘氨酸培养基以获得约300mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度的NaCl的量。

表8：对照培养基和高甘氨酸培养基中NaCl的浓度

此后通过每两天连续传代至滚瓶或转瓶中来扩增细胞。将T-培养瓶、滚瓶和转瓶在对于T-培养瓶和滚瓶7.5％CO₂和对于转瓶5％CO₂的空气下置于在37℃的温度设定点下运转的恒温箱中。

取决于细胞培养体积，通过铺于顶部空间中或通过喷射至培养基中来用5％CO₂补充转瓶，并且将叶轮转速控制在恒定的每分钟转数(RPM)上。所有接种物扩增传代的目标接种密度为约2.5×10⁵个活细胞/mL。

此后通过每两天连续传代至摇瓶中来扩增细胞。将摇瓶在7.5％CO₂的空气下置于在37℃的温度设定点下运转的恒温箱中。

将摇瓶在恒温箱中的摇床上以恒定的每分钟转数(RPM)摇动。所有接种物扩增传代的目标接种密度为约2.2-2.5×10⁵个活细胞/mL。

在细胞库解冻后的约14天，当已产生了充足数量的活细胞时，接种若干个通常是3或4个不锈钢搅拌釜接种生物反应器的第一个。在使用前，将接种生物反应器进行就地清洗、就地汽蒸(steamed-in-place)并用适当体积的PFBM-2培养基进行装填。在生物反应器进行就地汽蒸之前校准pH和溶解的氧探针。将第一接种生物反应器用充足数量的细胞进行接种以靶向2.0-2.5×10⁵个活细胞/mL的起始细胞密度。至更大体积的相继转移(通常地，100L至300L随后至1,000L接种生物反应器，或60L至235L、950L和3750L接种生物反应器)在于每个反应器中生长约2天之后进行并靶向2.0-2.5×10⁵个活细胞/mL的起始细胞密度。通过自动控制CO₂气体或1M碳酸钠(Na₂CO₃)的添加来维持培养pH。接种和生产生物反应器的目标运行条件包括37℃的温度设定点、pH 7.0和30％的溶解氧(空气饱和的百分比)。分别在100rpm、80rpm和70rpm下搅拌100L、300L和1,000L生物反应器。在一些情形中，接种和生产生物反应器的目标运行条件包括37℃的温度设定点、利用CO₂喷射和碱添加控制的7.0的pH和30％的溶解氧(空气饱和的百分比)。较大体积的生物反应器可在100rpm、80rpm、70rpm或40rpm的速度下进行搅拌。

6.2.2.细胞培养物生产生物反应器

在于1,000L接种生物反应器中约2天后，将接种物转移至不锈钢搅拌釜生产生物反应器中。所述生产生物反应器具有约10,000L的工作体积。在使用前，将生物反应器进行就地清洗、就地汽蒸并用适当的4,000L的PFBM-2对照培养基或高甘氨酸培养基进行装填。在生物反应器进行就地汽蒸之前校准pH和溶解的氧探针。

在另一个实例中，将接种物生长于3750L接种生物反应器中，随后转移至具有约15,000L的工作体积的不锈钢搅拌釜生产生物反应器，将所述生产生物反应器在使用前进行就地清洗、就地汽蒸并用适当的4,000-7,000L的PFBM-2培养基或高甘氨酸培养基进行装填。

生产生物反应器的目标接种密度在2.0–2.5×10⁵个活细胞/mL的范围中。在培养过程中添加化学成分确定的不含蛋白的接种培养基浓缩物(PFFM-3)(通过重建PFFM3亚成分1和2、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、碳酸氢二钠七水合物、L-酪氨酸、叶酸、盐酸和氢氧化钠制成的一种化学成分确定的浓缩接种培养基)。PFFM3包含表9中显示的成分：

PFFM3亚成分1包含下表10中显示的成分：

PFFM3亚成分2包含下表11中显示的成分：

PFFM-3至培养物的添加的时机和量如下表12中所显示的发生：

通过CO₂气体或1M碳酸钠(Na₂CO₃)添加的自动控制来将培养pH维持在约pH 7.0，优选在pH 7.0和pH 7.1之间。允许溶解的氧含量下降至空气饱和的约30％。将氧/空气混合物喷射至培养物中以实现恒定的总气体流动速率并通过按需调节空气对氧气体的比率和通过在达到最大的氧对空气比率后增加搅拌速度来控制溶解的氧。在另一个实例中，调节搅拌以维持恒定的功率/体积比。按需要在基于泡沫水平的基础上将基于二甲基硅油的消泡乳剂添加至生物反应器。定期获取样品以测试细胞密度、细胞活力、产物浓度、葡萄糖和乳酸盐浓度、溶解的O₂、溶解的CO₂、pH和重量摩尔渗透压浓度。接种后约10天收获生物反应器培养物。在收获前，将生物反应器内含物取样为未处理的大块物。

将理解补料条件和补料方案可针对每种抗体的生产进行调整以优化滴度。培养基的重量摩尔渗透压浓度可按需要进行调节以获得最优滴度。此外，可在生产阶段调节葡萄糖和谷氨酰胺水平以维持最优滴度。

6.2.3.收获和细胞去除

就在收获之前，首先将生产生物反应器冷却至<15℃，随后使用0.5M或1M或2M柠檬酸调节至5.0±0.1的pH，并保持约30-90或45-60分钟的时期以在转移至收获容器之前使细胞和细胞碎片絮凝。随后通过在如批记录文件中确定的转筒速度和流动速率的预定参数下运行的连续离心来澄清所述经pH调节的收获物。

将离心滤液通过深层过滤和随后通过0.22μm膜滤器进行过滤并收集在预灭菌的罐中。使用1-2M Tris溶液将不含细胞的收获物调节至约6.4的pH并储存于2–8℃用于进一步的处理。在一些情形中，该pH调节在至pH 5.0的原始生物反应器pH调节的12小时之内进行。

6.2.4.抗体纯化

基于与低pH病毒灭活步骤、病毒过滤步骤、超滤/渗滤步骤和配制步骤组合的3种层析技术(MabSelect蛋白A亲和层析、Q-琼脂糖阴离子交换层析和CM-琼脂糖阳离子交换层析)纯化来自中试规模运行(50升及更多)的收获材料。通过蛋白A柱随后通过尺寸排阻色谱法处理来自2升回收物的材料。

6.3.糖基化模式的测定

6.3.1.材料和方法

分析性地表征来自不同培养条件(具有低甘氨酸的对照条件相对于具有高甘氨酸的实验条件)的纯化抗体。将肽作图用于定量抗体产物中的不同糖形。将抗体首先用二硫苏糖醇还原、用碘乙酸烷基化随后用胰蛋白酶消化，最后通过RP-HPLC用MS检测进行分析。获得每种糖形的峰面积并随后从总的峰面积计算每种糖形的相对百分比。

6.3.2.结果

存在于从在包含2mM甘氨酸的对照基本培养基或补充有15mM(具有17mM的总浓度)的基本培养基中培养的NS0细胞产生的5种不同抗体中的每种糖形的相对百分比显示于表13中。在补充了甘氨酸的培养基中形成的5种不同抗体的两种非岩藻糖基化糖形G0-GlcNAc-岩藻糖糖形和Man5糖形相对于对照培养基的百分比增加显示于图2和图3中。非岩藻糖基化抗体相对于对照的组合的总百分比增加显示于图4中。数据表明来自在高浓度的甘氨酸下培养的细胞的抗体显示比来自利用低浓度的甘氨酸的对照过程的相同抗体更高水平的非岩藻糖基化糖形。对于G0-GlcNAc-岩藻糖糖形，来自在更高甘氨酸浓度培养基中培养的细胞的5种抗体中的4种显示相对于对照的150％至几乎300％的该糖形。对于Man5糖形，5种抗体中的4种的范围是相对于对照的该糖形的150％至>200％的增加。综合起来看非岩藻糖基化抗体的总量，当在更高甘氨酸浓度培养基中培养细胞时所有5种抗体均显示1.5-2.5倍的增加。

表13：通过根据本公开内容的方法产生的4中抗体的糖基化模式

在剂量反应研究中，存在于从在包含2mM甘氨酸的对照基本培养基或补充有不同浓度(7、17和32mM)甘氨酸的基本培养基中培养的细胞产生的抗体PDL192(enavatuzumab)中的每种糖形的百分比显示于表14中。在补充了甘氨酸的培养基中形成的PDL192的两种非岩藻糖基化糖形G0-GlcNAc-岩藻糖糖形和Man5糖形相对于对照培养基的百分比增加显示于图5中。数据表明在具有额外的甘氨酸的条件下产生的PDL192显示比从对照过程产生的抗体更高水平的非岩藻糖基化糖形。更具体地对于非岩藻糖基化G0-GlcNAc-岩藻糖糖形，糖形的量以剂量依赖性方式随着培养基中甘氨酸浓度的增加而增加。增加的百分比随着甘氨酸浓度从7mM增加至32mM而是相对于对照的120％至>160％。

表14：在具有额外的甘氨酸的培养基中产生的PDL192的糖基化模式和CD16a。

6.4.CD16a结合测定

6.4.1.材料和方法

使用AlphaScreen(PerkinElmer)方法来进行CD16a结合测定以评价4种不同抗体的抗体Fc区对人CD16a受体的结合效力。首先将抗体溶液与重组人CD16a溶液和测定缓冲液混合，并随后添加Alphascreen供体小珠和抗体接受小珠。将混合物在光保护位置中于室温温育4小时并使用读板仪利用680nm处的激光激发和光发射520-620nm检测荧光信号。报告了相对于在不含额外的甘氨酸的基本培养基中培养的抗体参照的结合效力。

6.4.2.结果

针对4种不同IgG1抗体(依洛珠单抗、达克珠单抗、PDL192和PDL241)的CD16a效力测定的结果显示于表15中。来自在高浓度甘氨酸下培养的细胞的所有4种IgG1抗体一致地显示对人CD16a受体的结合亲和力的40％的增加，并且在最极端的情况下显示出在结合效力方面相对于在不含额外的甘氨酸的基本培养基(即2mM甘氨酸培养基)中产生的对照抗体的两倍的增加。图6显示了4种IgG1抗体对CD16a受体的相对结合效力。将量表达为相对于由在不含另外的甘氨酸补充的对照基本培养基中培养的NS0细胞产生的相同抗体的CD16a结合亲和力的百分比。

表15：通过根据本公开内容的方法产生的4种抗体的CD16a结合

来自对PDL192的剂量反应研究的CD16a效力结果显示于表14和图7中。来自在补充有额外的5、15和30mM甘氨酸的条件下培养的细胞的PDL192显示比来自对照过程的抗体更高的CD16a结合亲和力，虽然没有观察到CD16a结合的剂量依赖性增加。

6.5.抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)

6.5.1.材料和方法

在体外分析了所表达的抗体的ADCC活性。首先用⁵¹Cr标记靶细胞并从全血制备效应细胞(人外周血单核细胞，PBMC)。随后将细胞和抗体溶液在37℃温育4小时。针对实验释放(E)、自发释放(S，来自无效应细胞和抗体的靶的释放)和总裂解物(T，来自用去垢剂1％Tri ton X-100处理的靶细胞的释放)测量了上清液中的放射性。将百分比细胞毒性计算为[(E-S)/(T-S)]×100。

6.5.2.结果

4种不同抗体(依洛珠单抗、PDL241、PDL192和达克珠单抗)的ADCC测定的结果显示于图8A-C、9A-B、10A-B和11A-B中，其中每个测定在来自两个或三个不同供体的PBMC上进行。在所有4个图中，来自在高浓度的甘氨酸下培养的细胞的抗体显示相较于来自在对照过程下培养的细胞的相同抗体的增加的ADCC活性。结果表明ADCC活性与CD16a结合效力是一致的，并且两种测定结果均与抗体的糖基化模式相关。

7.具体的实施方案，通过引用的并入

为了所有目的将本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文献通过引用以其整体并入本文至相同的程度如同分别指明为了所有目的将每个个体出版物、专利、专利申请或其它文献通过引用并入。

虽然已举例说明和描述了多个具体的实施方案，但将理解可进行多种改变而不背离本发明的精神和范围。

Claims

1.产生目标抗体(“AOI”)的方法，包括：

在适合表达和分泌所述AOI的条件下，于包含介于5mM和30mM之间的浓度的甘氨酸的细胞培养基中培养经工程化以分泌和表达所述AOI的NS0细胞，从而产生所述AOI。

2.权利要求1的方法，其中所述甘氨酸的浓度在10mM至25mM的范围之内。

3.权利要求1的方法，其中所述甘氨酸的浓度在15mM至20mM的范围之内。

4.权利要求1的方法，其中所述甘氨酸的浓度在16mM至18mM的范围之内。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述培养基是不含蛋白质的培养基。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其还包括回收所述AOI。

7.权利要求6的方法，其中回收所述AOI包括从所述培养基分离所述NS0细胞的步骤。

8.权利要求7的方法，其还包括纯化所述AOI。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中在所述培养之前以1.5X10⁵个细胞/mL至2.5X 10⁵个细胞/mL的密度接种所述NS0细胞。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述AOI是包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的VH区和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL区的IgG1单克隆抗体。

11.权利要求10的方法，其中所述AOI具有SEQ ID NO:3的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的完全轻链氨基酸序列。

12.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述AOI是包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的VH区和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL区的IgG1单克隆抗体。

13.权利要求12的方法，其中所述AOI具有SEQ ID NO:7的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:8的完全轻链氨基酸序列。

14.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述AOI是包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的VH区和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL区的IgG1单克隆抗体。

15.权利要求14的方法，其中所述AOI具有SEQ ID NO:11的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的完全轻链氨基酸序列。

16.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述AOI是包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的VH区和SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL区的IgG1单克隆抗体。

17.权利要求16的方法，其中所述AOI具有SEQ ID NO:15的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:16的完全轻链氨基酸序列。

18.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述AOI是包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VH区和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL区的IgG1单克隆抗体。

19.权利要求18的方法，其中所述AOI具有SEQ ID NO:19的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的完全轻链氨基酸序列。

20.适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含氨基酸、维生素和微量元素，其中甘氨酸的浓度介于5mM和30mM之间，并且其中除甘氨酸以外的一种或多种氨基酸的浓度为下表中列出的浓度或低于这些浓度：

氨基酸培养基中氨基酸的浓度天冬酰胺 2mM 天冬氨酸 2mM 异亮氨酸 2mM 亮氨酸 2.5mM 赖氨酸 6mM 甲硫氨酸 0.45mM 丝氨酸 4mM 苏氨酸 4mM 色氨酸 0.3mM 酪氨酸 2.5mM 缬氨酸 1.8mM

21.适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含氨基酸、维生素和微量元素，其中甘氨酸的浓度介于5.0mM和30mM之间，并且其中除甘氨酸以外的一种或多种氨基酸的浓度为下表中列出的浓度或低于这些浓度：

氨基酸培养基中氨基酸的浓度天冬酰胺 1.5mM 天冬氨酸 1.5mM 异亮氨酸 1.5mM 亮氨酸 2mM 赖氨酸 4mM 甲硫氨酸 0.4mM 丝氨酸 2mM 苏氨酸 2mM 色氨酸 0.2mM 酪氨酸 1.5mM 缬氨酸 1.5mM

22.权利要求20或权利要求21的培养基，其中除甘氨酸以外的两种或更多种氨基酸分别以选自列于权利要求20或权利要求21中的浓度的浓度存在。

23.权利要求20或权利要求21的培养基，其中除甘氨酸以外的三种或更多种氨基酸分别以选自列于权利要求20或权利要求21中的浓度的浓度存在。

24.权利要求20或权利要求21的培养基，其中除甘氨酸以外的四种或更多种氨基酸分别以选自列于权利要求20或权利要求21中的浓度的浓度存在。

25.权利要求20或权利要求21的培养基，其中除甘氨酸以外的五种或更多种氨基酸分别以选自列于权利要求20或权利要求21中的浓度的浓度存在。

26.权利要求20或权利要求21的培养基，其中除甘氨酸以外的六种或更多种氨基酸分别以选自列于权利要求20或权利要求21中的浓度的浓度存在。

27.权利要求20-26中任一项的培养基，其中甘氨酸的浓度在10mM至25mM的范围之内。

28.权利要求20-26中任一项的培养基，其中甘氨酸的浓度在15mM至20mM的范围之内。

29.权利要求20-26中任一项的培养基，其中甘氨酸的浓度在16mM至18mM的范围之内。

30.权利要求20-29中任一项的培养基，其不含蛋白质。

31.权利要求20-30中任一项的培养基，其具有介于250mOsm/kg和350mOsm/kg之间的重量摩尔渗透压浓度。

32.适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含氨基酸、维生素和微量元素，其中氨基酸具有列于下表的范围中的浓度：

氨基酸培养基中氨基酸的浓度(mM) 丙氨酸 0.01-0.07 精氨酸 0.6-1.6 天冬酰胺 0.08-1.5 天冬氨酸 0.03-0.4 半胱氨酸 0.1-0.9 谷氨酸 0.03-0.1 谷氨酰胺 2-12 甘氨酸 8-35

氨基酸培养基中氨基酸的浓度(mM) 组氨酸 0.09-0.7 异亮氨酸 0.9-1.7 亮氨酸 1-1.8 赖氨酸 0.8-1.6 甲硫氨酸 0.1-0.5 苯丙氨酸 0.2-1 脯氨酸 0.5-4 丝氨酸 0.1-0.8 苏氨酸 0.7-1.5 色氨酸 0.08-0.3 酪氨酸 0.2-3 缬氨酸 0.8-1.6

33.权利要求20-32中任一项的培养基，其中维生素具有列于下表的范围中的浓度:

维生素培养基中维生素的浓度(mM) 维生素B-12 0.00013-0.002 生物素 0.00001-0.01 胆碱 0.016-1.3 叶酸 0.0015-0.02 烟酰胺 0.002-0.07 泛酸钙 0.012-0.02 盐酸吡哆醛 0-0.04 核黄素 0.00015-0.0023 盐酸硫胺素 0-0.3

34.权利要求20-33中任一项的培养基，其中微量元素具有列于下表的范围中的浓度:

35.权利要求20-34中任一项的培养基，其还包含至少一种能量来源。

36.权利要求32-35中任一项的培养基，其中甘氨酸的浓度介于15mM和30mM之间。

37.适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含氨基酸、维生素和微量元素，其中甘氨酸的浓度介于5mM和30mM之间，且赖氨酸的浓度介于0.5mM和5.0mM之间。

38.适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含氨基酸、维生素和微量元素，其中甘氨酸的浓度介于10mM和30mM之间。

39.权利要求37或权利要求38的培养基，其中甘氨酸的浓度在10mM至25mM的范围之内。

40.权利要求37或权利要求38的培养基，其中甘氨酸的浓度在15mM至20mM的范围之内。

41.权利要求37或权利要求38的培养基，其中甘氨酸的浓度在16mM至18mM的范围之内。

42.权利要求37-41中任一项的培养基，其不含蛋白质。

43.权利要求37-42中任一项的培养基，其具有介于250mOsm/kg和350mOsm/kg之间的重量摩尔渗透压浓度。

44.哺乳动物细胞培养物，其包含经工程化以表达抗体的哺乳动物细胞系和权利要求20-43中任一项定义的培养基。

45.权利要求44的哺乳动物细胞培养物，其中所述细胞系选自CHO细胞、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2/0细胞、细胞和细胞。

46.权利要求45的哺乳动物细胞培养物，其中所述细胞系是NS0细胞系。

47.权利要求44-46中任一项的哺乳动物细胞培养物，其中所述培养基中NS0细胞的密度在1.5X 10⁵个细胞/mL至2.5X 10⁵个细胞/mL的范围之内。

48.权利要求44-47中任一项的哺乳动物细胞培养物，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的完全轻链氨基酸序列。

49.权利要求44-47中任一项的哺乳动物细胞培养物，其中所述抗体包含SEQ ID NO:7的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:8的完全轻链氨基酸序列。

50.权利要求44-47中任一项的哺乳动物细胞培养物，其中所述抗体包含SEQ ID NO:15的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:16的完全轻链氨基酸序列。

51.权利要求44-47中任一项的哺乳动物细胞培养物，其中所述抗体包含SEQ ID NO:19的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的完全轻链氨基酸序列。

52.包含抗体分子群的组合物，所述抗体分子包含SEQ ID NO:3的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的完全轻链氨基酸序列，其中所述抗体分子上至少5％的聚糖不含岩藻糖。

53.权利要求52的组合物，其中所述抗体分子上至少3％的聚糖是甘露糖5聚糖。

54.包含抗体分子群的组合物，所述抗体分子包含SEQ ID NO:7的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:8的完全轻链氨基酸序列，其中所述抗体分子上至少4％的聚糖不含岩藻糖。

55.权利要求54的组合物，其中所述抗体分子上至少1.5％的聚糖是甘露糖5聚糖。

56.包含抗体分子群的组合物，所述抗体分子包含SEQ ID NO:15的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:16的完全轻链氨基酸序列，其中所述抗体分子上至少15％的聚糖不含岩藻糖。

57.权利要求56的组合物，其中所述抗体分子上至少9％的聚糖是甘露糖5聚糖。

58.包含抗体分子群的组合物，所述抗体分子包含SEQ ID NO:19的完全重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20的完全轻链氨基酸序列，其中所述抗体分子上至少6％的聚糖不含岩藻糖。

59.权利要求58的组合物，其中所述抗体分子上至少3％的聚糖是甘露糖5聚糖。