ES2642805T3 - Sal de un derivado del ácido pirrolidín-3-ilacético y cristales de esta - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Sal de un derivado del acido pirrolidm-3-ilacetico y cristales de esta Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una sal de un derivado del acido pirrolidin-3-ilacetico con accion inhibitoria en una via de fractalcina-CX3CR1, y un cristal de esta.

Tecnica anterior

Las quimiocinas son factores de migracion celular fundamentales y regulan la infiltracion de linfocitos en tejidos mediante la estimulacion del movimiento celular y la activacion de moleculas de adhesion. Las quimiocinas se clasifican en cuatro subfamilias de CC, CXC, C y CX3C segun sus secuencias de los dos primeros residuos de cistema.

La fractalcina es el unico miembro de las quimiocinas CX3C y presenta dos caractensticas distintivas en su estructura y funciones, que no se observan en otras quimiocinas. La fractalcina se une a un receptor, CX3CR1, que puede mediar una adhesion fuerte sin mediacion de selectina o integrina, incluso en presencia de un flujo sangumeo fisiologico. Esto quiere decir que el sistema de fractalcina-CX3CR1 media el mecanismo de infiltracion en varias etapas mediado por selectina o integrina mediante una reaccion en una unica etapa.

La expresion de fractalcina en celulas del endotelio vascular es inducida por las citocinas inflamatorias TNF e IL-1. Por su parte, el CX3CR1 se expresa en monocitos, la mayona de los linfocitos citoffticos espontaneos (NK) y algunos linfocitos T, pero no se expresa en neutrofilos. Por tanto, el sistema de fractalcina-CX3CR1 se considera un mecanismo extremadamente efectivo para movilizar celulas inmunitarias sobre las celulas endoteliales de tejidos danados o en los tejidos.

En lo que respecta a la relacion entre el sistema de fractalcina-CX3CR1 y patologfas, se sugiere que el sistema de fractalcina-CX3CR1 interviene en el desarrollo y patologfas de enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, nefritis lupica y esclerosis multiple (referencia 1 de la bibliograffa no relacionada con patentes). En particular, en lo que respecta a la enfermedad intestinal inflamatoria, hay constancia de que la expresion de la fractalcina aumenta en sitios inflamatorios de tejidos colonicos de pacientes y que el CX3CR1 desempena una funcion importante en la infiltracion de celulas inmunitarias en el tejido del colon (referencia 2 de la bibliograffa no relacionada con patentes).

Los anticuerpos descritos en la referencia 1 de la bibliograffa de patentes y los compuestos de bajo peso molecular descritos en las referencias 2-6 de la bibliograffa de patentes se han descrito previamente como inhibidores de fractalcina.

Ademas, se ha descrito la utilidad de los compuestos descritos en la referencia 7 de la bibliograffa de patentes como antagonistas del receptor de quimiocinas CCR2, pero difieren en la familia de quimiocinas sobre la que actuan estos inhibidores.

Lista de citas

Bibliograffa de patentes

Referencia 1 de la bibliograffa de patentes: Solicitud de patente japonesa abierta a inspeccion publica con N.° de publicacion 2002-345454

Referencia 2 de la bibliograffa de patentes: Documento WO 2006/107257 Referencia 3 de la bibliograffa de patentes: Documento WO 2006/107258 Referencia 4 de la bibliograffa de patentes: Documento WO 2008/039138 Referencia 5 de la bibliograffa de patentes: Documento WO 2008/039139 Referencia 6 de la bibliograffa de patentes: Documento WO 2009/120140

Referencia 7 de la bibliograffa de patentes: Solicitud de patente de los EE. UU. abierta a inspeccion publica con N.° de publicacion 2010/0210633

Bibliograffa no relacionada con patentes

Referencia 1 de la bibliograffa no relacionada con patentes: Umehara et al., "Fractalkine in Vascular Biology", Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., Vol. 24, pags. 34-40, 2004

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Referencia 2 de la bibliograffa no relacionada con patentes: Kobayashi et al., "Exclusive Increase of CX3CR1_CD28_CD4_ T Cells in Inflammatory Bowel Disease and Their Recruitment as Intraepithelial Lymphocytes", Inflamm. Bowel. Dis., Vol. 13, pags. 837-846, 2007

Compendio de la invencion

Problema tecnico

Un objeto de la presente invencion es descubrir un compuesto con actividad inhibitoria en una via de fractalcina- CX3CR1.

Ademas, debido a que las propiedades ffsicas de un compuesto, una sal de este o sus cristales y sus formas amorfas empleados como producto farmaceutico afectan en gran medida a la biodisponibilidad de un farmaco, la pureza de un principio activo farmaceutico, la prescripcion de un preparado y aspectos similares, es necesario estudiar durante el desarrollo de productos farmaceuticos que forma del compuesto mencionado anteriormente, una sal, un cristal o una forma amorfa, es mas idonea como producto farmaceutico. Es decir, otro objeto de la presente invencion es descubrir una sal de un compuesto, sus cristales y sus formas amorfas, que tengan utilidad como principios activos farmaceuticos.

Solucion al problema

Los presentes inventores han descubierto que el compuesto (1) representado por la siguiente formula, a saber, el acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-

metilpirrolidin-3-il]acetico tiene una actividad inhibitoria en una via de fractalcina-CX3CR1. Ademas, los presentes inventores han aislado varios tipos de sales de acidos carboxflicos organicos del compuesto (1), sus cristales y sus formas amorfas, y han llegado a comprender las propiedades ffsicas o formas de estas y han realizado varios estudios sobre tales parametros, y de este modo los presentes inventores han descubierto una sal de un acido carboxflico organico, un cristal de esta y una forma amorfa de esta que tienen utilidad como principio activo farmaceutico, lo cual completa la presente invencion.

imagen1

Espedficamente, la presente invencion se refiere a:

1) una sal de un acido carboxflico organico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex- 1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico;

2) la sal de acuerdo con el punto 1) anterior, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L- mandelico;

3) la sal de acuerdo con el punto 1) anterior, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L- lactico;

4) un cristal de la sal de un acido carboxflico organico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3- {[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico;

5) el cristal de acuerdo con el punto 4) anterior, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L-mandelico;

6) el cristal de acuerdo con el punto 4) anterior, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L-lactico;

7) el cristal de acuerdo con el punto 5) anterior, que se caracteriza por tener un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20 + 0.2°) de 7.2° en difractometna de rayos X en polvo;

8) el cristal de acuerdo con el punto 7) anterior, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 14.4° y 15.7° en difractometna de rayos X en polvo;

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9) el cristal de acuerdo con el punto 8) anterior, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 10.3° y 23.5° en difractometna de rayos X en polvo;

10) el cristal de acuerdo con el punto 9) anterior, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 12.9°, 14.9°, 17.2°, 20.1° y 24.7° en difractometna de rayos X en polvo;

11) el cristal de acuerdo con el punto 5) anterior, que se caracteriza por tener picos en desplazamientos qmmicos (ppm) de 14.1, 52.9, 75.2, 144.7 y 174.0 en el espectro de RMN en estado solido de 13C;

12) el cristal (A) de acuerdo con el punto 6) anterior, que se caracteriza por tener un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20 + 0.2°) de 6.9° en difractometna de rayos X en polvo;

13) el cristal (A) de acuerdo con el punto 12) anterior, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 15.7° y 17.1° en difractometna de rayos X en polvo;

14) el cristal (B) de acuerdo con el punto 6) anterior, que se caracteriza por tener un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20 + 0.2°) de 6.8° en difractometna de rayos X en polvo; y

15) el cristal (B) de acuerdo con el punto 14) anterior, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 13.7° y 16.8° en difractometna de rayos X en polvo.

Efectos ventajosos de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, se puede proporcionar una sal de un acido carboxflico organico del acido 2- [(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-

3- il]acetico que es util como principio activo farmaceutico y un cristal de esta.

Breve descripcion de los dibujos

[Figura 1] La Figura 1 muestra un espectro de RMN en estado solido de 13C de un cristal de una sal del acido L- mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-

il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico.

[Figura 2] La Figura 2 muestra un patron de difraccion de rayos X en polvo de un cristal de una sal del acido L- mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-

il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico. La abscisa indica el angulo de difraccion 20 y la ordenada indica la intensidad del pico.

[Figura 3] La Figura 3 muestra un patron de difraccion de rayos X en polvo de una forma amorfa de una sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4- il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico. La abscisa indica el angulo de difraccion 20 y la ordenada indica la intensidad del pico.

[Figura 4] La Figura 4 muestra un patron de difraccion de rayos X en polvo de un cristal (A) de un solvato de una sal del acido L-lactico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-

4- il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico. La abscisa indica el angulo de difraccion 20 y la ordenada indica la intensidad del pico.

[Figura 5] La Figura 5 muestra un patron de difraccion de rayos X en polvo de un cristal (B) de un solvato de una sal del acido L-lactico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin- 4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico. La abscisa indica el angulo de difraccion 20 y la ordenada indica la intensidad del pico.

[Figura 6] La Figura 6 es una grafica que muestra el efecto de supresion-reduccion de peso del acido 2-[(3S,4R)-1- {[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico en un modelo de colitis por transferencia de linfocitos T. La abscisa indica los dfas transcurridos, siempre que el dfa en el que se administraron celulas positivas para CD4 y muy positivas para CD45RB (5 x 105 celulas/raton), extrafdas del bazo de un raton BALB/c, por via intravenosa a un raton SCID se definiera como el dfa 0.

Descripcion de las realizaciones

Se describiran en detalle una sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) de la presente invencion, un cristal de esta, una forma amorfa de esta y metodos para su produccion.

El compuesto (1), a saber, el acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1- ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-i]acetico, se puede producir sobre la base de la descripcion del Ejemplo de produccion 1 que se menciona mas adelante.

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En la presente descripcion, la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) se refiere a una sal farmaceuticamente aceptable, y es una sal que comprende un acido carboxflico organico seleccionado del grupo constituido por el acido acetico, acido sucdnico, acido glutarico, acido benzoico, acido cinamico, acido malico, acido oxalico, acido glicolico, acido maleico, acido tartarico, acido diacetiltartarico, acido fumarico, acido dtrico, acido malonico, acido L-lactico, acido L-mandelico y similares, y el compuesto (1). El termino "sal" se utiliza en la presente para hacer referencia a un compuesto generado como resultado de una reaccion del compuesto (1) con un acido carboxflico organico que tiene un numero de equivalentes posible desde un punto de vista qmmico, donde el compuesto consiste en una parte positiva de bases en las moleculas del compuesto (1) y una parte negativa del acido carboxflico organico.

Los ejemplos de la sal de un acido carboxflico organico incluyen una sal del acido acetico, sal del acido sucdnico, sal del acido glutarico, sal del acido benzoico, sal del acido cinamico, sal del acido malico, sal del acido oxalico, sal del acido glicolico, sal del acido maleico, sal del acido tartrico, sal del acido diacetiltartrico, sal del acido fumarico, sal del acido dtrico, sal del acido malonico, sal del acido L-lactico y sal del acido L-mandelico. Los ejemplos preferidos de la sal de un acido carboxflico organico incluyen una sal del acido oxalico, sal del acido glicolico, sal del acido L- lactico y sal del acido L-mandelico, y los ejemplos mas preferidos incluyen una sal del acido L-lactico y una sal del acido L-mandelico.

La sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) tambien puede ser un solvato. En la presente descripcion, el solvato de la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) se refiere a un solido formado por la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) junto con moleculas de disolvente. Los ejemplos del solvato incluyen: un solvato formado por la sal un acido carboxflico organico del compuesto (1) junto con un disolvente de tipo cetona tal como acetona, cetona etil metilica o ciclohexanona; un solvato formado por la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) junto con un disolvente de tipo ester tal como acetato de etilo o acetato de metilo; un solvato formado por la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) junto con un disolvente de tipo eter tal como 1,2-dimetoxietano o eter tert-butil medico; un solvato formado por la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) junto con un disolvente de tipo alcohol tal como metanol, etanol, 1-propanol o isopropanol; un solvato formado por la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) junto con un disolvente polar tal como 1-metil- 2-pirrolidona, N,N-dimetilformamida o sulfoxido de dimetilo; y un hidrato formado por la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) junto con agua.

La sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) o un solvato de esta puede ser un cristal o una forma amorfa. Los ejemplos espedficos preferidos de la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) o un solvato de esta incluyen una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) y un solvato de una sal del acido L-lactico del compuesto (1).

Si se describen espedficamente ademas otras formas preferidas de la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) o un solvato de esta, los ejemplos espedficos preferidos incluyen los siguientes cristales.

Los ejemplos espedficos preferidos de estos incluyen:

(a) un cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) caracterizado por que tiene picos de difraccion en difractometna de rayos X en polvo [angulo de difraccion (20 + 0.2°)] a unos angulos de, por ejemplo,

(1) 7.2°,

(2) 10.3°,

(3) 12.9°,

(4) 14.4°,

(5) 14.9°,

(6) 15.7°,

(7) 17.2°,

(8) 20.1°,

(9) 23.5° y

(10) 24.7°

donde los picos de difraccion a los angulos de 7.2°, 10.3°, 14.4°, 15.7° y 23.5°, y entre otros, los picos de difraccion a los angulos de 7.2°, 14.4° y 15.7°, y en particular, el pico de difraccion al angulo de 7.2° es un pico caractenstico del presente cristal, o

un cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) caracterizado por tener picos en desplazamientos qmmicos (ppm) de 14.1, 52.9, 75.2, 144.7 y 174.0 en el espectro de RMN en estado solido de 13C;

(b) un cristal (A) de un solvato de la sal del acido L-lactico del compuesto (1) caracterizado por que tiene picos de difraccion en difractometna de rayos X en polvo [angulo de difraccion (20 + 0.2°)] a unos angulos de, por ejemplo,

(1) 6.9°,

(2) 9.2°,

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(3) 10.0°,

(4) 10.8°,

(5) 13.8°,

(6) 14.8°,

(7) 15.7°,

(8) 17.1°,

(9) 20.5° y

(10) 23.8°

donde los picos de difraccion a los angulos de 6.9°, 14.8°, 15.7°, 17.1° y 23.8°, y entre otros, los picos de difraccion a los angulos de 6.9°, 15.7° y 17.1°, y en particular, el pico de difraccion al angulo de 6.9° es un pico caractenstico del presente cristal; y

(c) un cristal (B) de un solvato de la sal del acido L-lactico del compuesto (1) caracterizado por que tiene picos de difraccion en difractometna de rayos X en polvo [angulo de difraccion (20 + 0.2°)] a unos angulos de, por ejemplo,

(1) 6.8°,

(2) 10.8°,

(3) 13.7°,

(4) 15.1°,

(5) 16.8°,

(6) 18.1°,

(7) 18.9°,

(8) 23.5°,

(9) 24.7° y

(10) 25.6°

donde los picos de difraccion a los angulos de 6.8°, 13.7°, 16.8°, 18.1° y 18.9°, y entre otros, los picos de difraccion a los angulos de 6.8°, 13.7° y 16.8°, y en particular, el pico de difraccion al angulo de 6.8° es un pico caractenstico del presente cristal.

Los picos caractensticos descritos anteriormente en difractometna de rayos X en polvo son unicos para cada uno de entre el cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1), el cristal del solvato (A) de una sal del acido L- lactico del compuesto (1) y el cristal del solvato (B) de una sal del acido L-lactico del compuesto (1).

En general, en lo que respecta al angulo de difraccion (20) en difractometna de rayos X en polvo, debido a que se pueden generar errores en el rango de +0.2°, es necesario tener en cuenta que el valor de los angulos de difraccion descritos anteriormente incluye valores numericos en el rango de aproximadamente +0.2°. Por consiguiente, en la presente invencion no se incluye solamente un cristal en el que el angulo de difraccion del pico en difractometna de rayos X en polvo sea exactamente identico al del cristal de la presente invencion, sino tambien un cristal en el que el angulo de difraccion del pico sea identico al del cristal de la presente invencion con un error de aproximadamente +0.2°. Por tanto, por ejemplo, la frase "que tiene un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20 + 0.2°) de 7.2°" se utiliza en la presente descripcion con el significado de "que tiene un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20) comprendido entre 7.0° y 7.4°". El mismo principio se aplica a otros casos referentes al angulo de difraccion (20) en difractometna de rayos X en polvo.

Los picos caractensticos descritos anteriormente en el espectro de RMN en estado solido de 13C son particulares para el espectro de RMN en estado solido de 13C del cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1).

La descripcion "que tiene picos en desplazamientos qmmicos (ppm) de 14.1, 52.9, 75.2, 144.7 y 174.0" se utiliza en la presente descripcion con el significado de "se mide un espectro de RMN en estado solido de 13C en condiciones de medicion habituales o en condiciones sustancialmente identicas a las descritas en la presente descripcion y, como resultado, el espectro exhibe picos sustancialmente equivalentes a los que tienen desplazamientos qmmicos (ppm) de 14.1, 52.9, 75.2, 144.7 y 174.0".

Para determinar si el espectro exhibe o no "picos sustancialmente equivalentes", debido a que, en general, se pueden generar errores en el rango de +0.5 ppm en lo que respecta a los desplazamientos qmmicos (ppm) en el espectro de RMN en estado solido de 13C, es necesario tener en cuenta que el valor de los desplazamientos qmmicos descritos anteriormente incluye valores numericos en el rango de aproximadamente +0.5 ppm. Por consiguiente, en la presente invencion se incluye un cristal en el que el desplazamiento qmmico en el espectro de RMN en estado solido de 13C sea exactamente identico al del cristal de la presente invencion, sino tambien un cristal en el que el desplazamiento qmmico sea identico al del cristal de la presente invencion con un error de aproximadamente +0.5 ppm. Por tanto, por ejemplo, la frase "que tiene un pico en un desplazamiento qmmico (ppm) de 14.1" se utiliza en la presente descripcion con el significado de "que tiene un pico en un desplazamiento qmmico

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(ppm) comprendido entre 13.6 y 14.6". El mismo principio se aplica a otros casos referentes al desplazamiento qmmico en el espectro de RMN en estado solido de 13C.

A continuacion, se describiran detalladamente metodos para producir una sal del acido L-mandelico del compuesto (1), un cristal de esta, una forma amorfa de esta y un solvato de esta. Cabe destacar que tambien se pueden producir otras sales de acidos carboxflicos organicos del compuesto (1), sus cristales y sus formas amorfas o sus solvatos de acuerdo con los metodos que se describen detalladamente a continuacion o metodos equivalentes a estos. En particular, al producir un solvato de una sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1), es necesario anadir un disolvente para obtener el solvato deseado.

[Metodo para producir una sal del acido L-mandelico del compuesto (1)]

Se puede obtener una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) mediante un metodo convencional para producir una sal de un acido carboxflico organico. Espedficamente, se puede producir una sal del acido L-mandelico del compuesto (1), por ejemplo, como se indica a continuacion: se anade directamente el acido L-mandelico que ha sido disuelto previamente en un disolvente al compuesto (1); o el compuesto (1) se disuelve en un disolvente, segun proceda, con calentamiento, y a continuacion se anade el acido L-mandelico que ha sido disuelto previamente en un disolvente a la solucion obtenida, despues se agita la mezcla obtenida a temperatura ambiente o mientras se enfna en un bano de enfriamiento durante un periodo de aproximadamente varios minutos a 50-60 horas, o despues la mezcla se deja reposar a temperatura ambiente o mientras se enfna en un bano de enfriamiento durante un periodo de aproximadamente varios minutos a 50-60 horas. Como alternativa, tambien se puede producir una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) anadiendo directamente un disolvente al compuesto (1) y al acido L-mandelico, y despues disolviendolos en el disolvente. Mediante estos metodos de produccion, se puede obtener una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) en forma de un cristal o una forma amorfa.

Los ejemplos del disolvente utilizado en la presente incluyen un disolvente y un disolvente mixto constituido por dos o mas disolventes, que se seleccionan del grupo constituido por: disolventes de tipo cetona alqmlica tales como acetona o cetona etil metflica; acetato de etilo; hexano; acetonitrilo; disolventes de tipo eter tales como eter, eter tert- butil medico o 1,2-dimetoxietano; disolventes de tipo alcohol tales como etanol, 1-propanol, isopropanol o alcohol t- budico; y agua. Los ejemplos mas preferidos del disolvente incluyen acetona, cetona etil medica, acetato de etilo, acetona/eter tert-butil medico (en una proporcion en volumen de 1:1), etanol/eter tert-butil medico (en una proporcion en volumen de 1:12) e isopropanol/eter tert-butil medico (en una proporcion en volumen comprendida entre 1.5:8 y 1.5:13.5).

Es mas, se puede seleccionar la cantidad de un disolvente empleado segun proceda, siempre que la cantidad de un disolvente en el que se disuelvan el compuesto (1) y el acido L-mandelico por calentamiento se determine como un lfmite inferior, y que la cantidad de un disolvente en el que el rendimiento de las sales no se reduzca significativamente se determine como un lfmite superior. La relacion entre el volumen del disolvente y el peso del compuesto (1) es preferentemente, por ejemplo, de 5 a 100 veces mas (v/p); y cuando se utiliza acetona, cetona etil medica, acetato de etilo, acetona/eter tert-butil medico (en una proporcion en volumen de 1:1), etanol/eter tert-butil medico (en una proporcion en volumen de 1:12), isopropanol/eter tert-butil medico (en una proporcion en volumen comprendida entre 1.5:8 y 1.5:13.5) o similar como disolvente, la relacion entre el volumen del disolvente y el peso del compuesto (1) es mas preferentemente, por ejemplo, de 5 a 20 veces mas (v/p).

La temperatura, a la que el compuesto (1) y el acido L-mandelico se disuelven en un disolvente, se puede determinar, segun proceda, dependiendo del disolvente empleado. La temperatura esta comprendida preferentemente, por ejemplo, entre la temperatura de reflujo del disolvente empleado hasta y 15 °C, y mas preferentemente, por ejemplo, entre 15 °C y 100 °C.

Si se modifica la velocidad de enfriamiento aplicada durante la cristalizacion, se pueden generar cristales con formas diferentes (polimorfismos). Por tanto, teniendo en cuenta su influencia en la calidad, el tamano de grano y propiedades similares de un cristal, el enfriamiento se lleva a cabo convenientemente, ajustando la velocidad de enfriamiento, segun proceda; y el enfriamiento se puede llevar a cabo preferentemente a una velocidad de enfriamiento comprendida, por ejemplo, entre 5 °C y 40 °C/hora, y mas preferentemente a una velocidad de enfriamiento comprendida, por ejemplo, entre 15 °C y 25 °C/hora. Ademas, la temperatura de cristalizacion final se puede determinar, segun proceda, dependiendo del rendimiento, la calidad y propiedades similares de un cristal, y preferentemente esta comprendida, por ejemplo, entre -25 °C y 30 °C.

Durante la cristalizacion de los cristales, se puede anadir o no un germen cristalino (un cristal de una sal del acido L- mandelico del compuesto (1)). La temperatura, a la cual se anade dicho germen cristalino, no esta particularmente limitada y esta comprendida preferentemente, por ejemplo, entre 0 °C y 60 °C.

El cristal cristalizado se separa mediante una operacion de filtracion habitual y el cristal filtrado se lava posteriormente con un disolvente, segun proceda, y el cristal resultante ademas se seca, para obtener asf un cristal de interes. Los ejemplos preferidos del disolvente empelado en el lavado de un cristal incluyen acetona, cetona etil medica, acetato de etilo, eter tert-butil medico, acetona/eter tert-butil medico (en una proporcion en volumen de 1:1), acetona/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen de 1:9) e isopropanol/eter tert-butil medico (en

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una proporcion en volumen de 1:10); y los ejemplos mas preferidos del disolvente incluyen acetato de etilo, eter tert- butil metilico, isopropanol/eter tert-butil metilico (en una proporcion en volumen de 1:10), acetona/eter tert-butil metilico (en una proporcion en volumen de 1:1) y acetona/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen de 1:9).

A continuacion, se describiran mas detalladamente un metodo para producir un cristal de una sal del acido L- mandelico del compuesto (1) y un metodo para secar el cristal. Cabe destacar que tambien se pueden producir y secar cristales de otras sales de acidos carboxflicos organicos del compuesto (1) o cristales de sus solvatos de acuerdo con los metodos que se describen detalladamente a continuacion o metodos equivalentes a estos.

[Metodo para cristalizar un cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1)]

Un cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) se puede cristalizar como se indica a continuacion: tras producir el compuesto (1) de acuerdo con el Ejemplo de produccion 1, se anade directamente el acido L- mandelico que ha sido disuelto previamente en un disolvente al compuesto (1); o el compuesto (1) se disuelve en un disolvente, segun proceda, con calentamiento, y a continuacion se anade el acido L-mandelico que ha sido disuelto previamente en un disolvente a la solucion obtenida, despues se agita la mezcla a temperatura ambiente o mientras se enfna en un bano de enfriamiento durante un periodo de aproximadamente varios minutos a 50-60 horas, o despues la mezcla se deja reposar a temperatura ambiente o mientras se enfna en un bano de enfriamiento durante un periodo de aproximadamente varios minutos a 50-60 horas, de acuerdo con el [metodo para producir una sal del acido L-mandelico del compuesto (1)] descrito anteriormente. Como alternativa, tambien se puede producir un cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) de este tipo anadiendo directamente un disolvente al compuesto (1) y al acido L-mandelico, y disolviendolos en el disolvente. Como alternativa, una vez que se obtiene la sal del acido L-mandelico del compuesto (1), esta se disuelve a continuacion en un disolvente, para que de este modo se pueda cristalizar un cristal.

A continuacion se describira detalladamente un metodo para recristalizar una sal del acido L-mandelico del compuesto (1).

La sal del acido L-mandelico del compuesto (1) empleada en la cristalizacion puede ser una forma amorfa o un cristal (incluido un cristal que comprende varios polimorfismos cristalinos) y tambien puede ser una mezcla de estas.

Los ejemplos preferidos del disolvente empleado en la cristalizacion incluyen un disolvente y un disolvente mixto constituido por dos o mas disolvente, que se seleccionan del grupo constituido por acetona, acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de isobutilo, hexano, heptano, acetonitrilo, eter tert-butil metilico, tetrahidrofurano, etanol, 1- propanol, isopropanol, sulfoxido de dimetilo y agua; y los ejemplos mas preferidos de estos incluyen acetato de etilo, sulfoxido de dimetilo/acetato de isopropilo/heptano (en una proporcion en volumen de 3:2:10), sulfoxido de dimetilo/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen comprendida entre 1:8 y 1:16), sulfoxido de dimetilo/isopropanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen comprendida entre 3:3:20 y 3:2:25), sulfoxido de dimetilo/acetona/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen de 1.70:3:25), sulfoxido de dimetilo/acetona/heptano (en una proporcion en volumen de 1.65:3:25) y sulfoxido de dimetilo/acetato de etilo/heptano (en una proporcion en volumen de 2.0:10:10).

Es mas, se puede seleccionar la cantidad de un disolvente empleado segun proceda, siempre que la cantidad de un disolvente en el que se disuelva la sal del acido L-mandelico del compuesto (1) por calentamiento se determine como un lfmite inferior, y que la cantidad de un disolvente en el que el rendimiento de los cristales no se reduzca significativamente se determine como un lfmite superior.

La relacion entre el volumen del disolvente y el peso del compuesto (1) es preferentemente, por ejemplo, de 5 a 100 veces mas (v/p); y cuando se utiliza acetato de etilo, sulfoxido de dimetilo/acetato de isopropilo/heptano (en una proporcion en volumen de 3:2:10), sulfoxido de dimetilo/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen comprendida entre 1:8 y 1:16), sulfoxido de dimetilo/isopropanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen comprendida entre 3:3:20 y 3:2:25), sulfoxido de dimetilo/acetona/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen de 1.70:3:25), sulfoxido de dimetilo/acetona/heptano (en una proporcion en volumen de 1.65:3:25), sulfoxido de dimetilo/acetato de etilo/heptano (en una proporcion en volumen de 2.0:10:10) o similar como disolvente, la relacion entre el volumen del disolvente y el peso del compuesto (1) es mas preferentemente, por ejemplo, de 15 a 40 veces mas (v/p).

La temperatura a la que se calienta y se disuelve una sal del acido L-mandelico del compuesto (1) en un disolvente se puede determinar, segun proceda, dependiendo del disolvente empleado. La temperatura esta comprendida preferentemente, por ejemplo, entre 15 °C y la temperatura de reflujo de un disolvente empleado para la recristalizacion, y mas preferentemente, por ejemplo, entre 40 °C y 100 °C. Si se modifica la velocidad de enfriamiento aplicada durante la cristalizacion, se pueden generar cristales con formas diferentes (polimorfismos). Por tanto, teniendo en cuenta su influencia en la calidad, el tamano de grano y propiedades similares de un cristal, el enfriamiento se lleva a cabo convenientemente, ajustando la velocidad de enfriamiento, segun proceda; y el enfriamiento se puede llevar a cabo preferentemente a una velocidad de enfriamiento comprendida, por ejemplo, entre 5 °C y 40 °C/hora, y mas preferentemente a una velocidad de enfriamiento comprendida, por ejemplo, entre 15

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°C y 25 °C/hora. Ademas, la temperatura de cristalizacion final se puede determinar, segun proceda, dependiendo del rendimiento, la calidad y propiedades similares de un cristal, y preferentemente esta comprendida, por ejemplo, entre -25 °C y 30 °C.

Durante la cristalizacion de los cristales, se puede anadir o no un germen cristalino (un cristal de una sal del acido L- mandelico del compuesto (1)). La temperatura, a la que se anade un germen cristalino de este tipo, no esta limitada particularmente y es preferentemente, por ejemplo, menor o igual a 60 °C, mas preferentemente, por ejemplo, esta comprendida entre 0 °C y 60 °C, y mas preferentemente, por ejemplo, entre 15 °C y 60 °C.

El cristal cristalizado se separa mediante una operacion de filtracion habitual y el cristal filtrado se lava posteriormente con un disolvente, segun proceda, y el cristal resultante ademas se seca, para obtener asf un cristal de interes. Los ejemplos preferidos del disolvente empelado en el lavado de un cristal incluyen acetona, cetona etil metilica, acetato de etilo, eter tert-butil metilico, acetona/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:1), isopropanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:10) y acetona/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen comprendida entre 1:4 y 1:9); y los ejemplos mas preferidos de este incluyen acetato de etilo, eter tert-butil metflico, acetona/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:1), isopropanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:10) y acetona/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen de 1:9).

[Metodo para secar un cristal de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1)]

Tal como se ha descrito anteriormente, el cristal separado mediante una operacion de filtracion se puede secar, segun proceda, dejandolo reposar al aire o calentandolo. El tiempo requerido para la operacion de secado es el tiempo requerido hasta que la cantidad del disolvente residual sea inferior a una cantidad predeterminada y se puede determinar, segun proceda, dependiendo de la cantidad de un producto, el dispositivo de secado, la temperatura de secado y parametros similares. Es mas, este secado tambien se puede llevar a cabo con ventilacion o a presion reducida. El grado de presion reducida se puede determinar, segun proceda, dependiendo de la cantidad de un producto, el dispositivo de secado, la temperatura de secado y parametros similares. Una vez finalizada la operacion de secado, el cristal obtenido se puede dejar reposar al aire, segun proceda.

A continuacion, se describiran mas detalladamente un metodo para producir una forma amorfa de la sal del acido L- mandelico del compuesto (1) y un metodo para secar la forma amorfa. Cabe destacar que tambien se pueden producir y secar formas amorfas de otras sales de acidos carboxflicos organicos del compuesto (1) o formas amorfas de sus solvatos de acuerdo con los metodos que se describen detalladamente a continuacion o metodos equivalentes a estos.

Metodo para producir una forma amorfa de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1)]

Se puede obtener una forma amorfa de la sal del compuesto (1) y el acido L-mandelico mediante un metodo convencional para la produccion de una forma amorfa. Espedficamente, la forma amorfa se puede producir como se indica a continuacion: el compuesto (1) producido en el Ejemplo de produccion 1 se disuelve en un disolvente, segun proceda, con calentamiento y a continuacion se anade el acido L-mandelico, despues la mezcla obtenida se agita o deja reposar durante un periodo de aproximadamente varios minutos a 50-60 horas y posteriormente se elimina el disolvente por destilacion a presion reducida. Como alternativa, la forma amorfa tambien se puede producir directamente anadiendo un disolvente al compuesto (1) y el acido L-mandelico, a continuacion disolviendolos en el disolvente y despues eliminando el disolvente por destilacion a presion reducida. Como alternativa, la forma amorfa tambien se puede producir liofilizando la sal del acido L-mandelico del compuesto (1) obtenida de este modo.

Los ejemplos del disolvente utilizado en la presente incluyen un disolvente y un disolvente mixto constituido por dos o mas disolventes, que se seleccionan del grupo constituido por: disolventes de tipo cetona alqrnlica tales como acetona o cetona etil metflica; acetato de etilo; hexano; acetonitrilo; disolventes de tipo eter tales como eter, eter tert- butil metflico o 1,2-dimetoxietano; disolventes de tipo alcohol tales como etanol, 1-propanol, isopropanol o alcohol t- butflico; y agua. Los ejemplos mas preferidos del disolvente incluyen acetona, cetona etil metflica, acetato de etilo, acetona/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:1), etanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:12) e isopropanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen comprendida entre 1.5:8 y 1.5:13.5).

Es mas, se puede seleccionar la cantidad de un disolvente empleado segun proceda, siempre que la cantidad de un disolvente en el que se disuelvan el compuesto (1) y el acido L-mandelico por calentamiento se determine como un lfmite inferior, y que la cantidad de un disolvente en el que el rendimiento de las sales no se reduzca significativamente se determine como un lfmite superior. La relacion entre el volumen del disolvente y el peso del compuesto (1) es preferentemente, por ejemplo, de 5 a 100 veces mas (v/p); y cuando se utiliza acetona, cetona etil metflica, acetato de etilo, acetona/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:1), etanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:12), isopropanol/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen comprendida entre 1.5:8 y 1.5:13.5) o similar como disolvente, la relacion entre el volumen del disolvente y el peso del compuesto (1) es mas preferentemente, por ejemplo, de 5 a 20 veces mas (v/p).

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La temperature a la que se disuelven el compuesto (1) y el acido L-mandelico en un disolvente se puede seleccionar, segun proceda, entre temperatures a las que se disuelven el compuesto (1) y el acido carboxflico organico en un disolvente, dependiendo del disolvente empleado. La temperature esta comprendida preferentemente, por ejemplo, entre 15 °C y la temperatura de reflujo del disolvente empleado, y mas preferentemente, por ejemplo, entre 15 °C y 100 °C.

Una forma amorfa de la sal del acido L-mandelico del compuesto (1) se puede obtener eliminando el disolvente por destilacion a presion reducida a partir de la solucion obtenida de este modo. Es mas, se puede obtener una forma amorfa de la sal del acido L-mandelico del compuesto (1) cuya solubilidad es excelente liofilizando la sal del acido L- mandelico del compuesto (1) obtenida, utilizando un disolvente o un disolvente mixto constituido por dos o mas disolventes seleccionados del grupo constituido por disolventes de tipo alcohol tales como etanol, 1-propanol, isopropanol o alcohol t-butilico, disolventes de tipo eter tales como dioxano, disolventes polares tales como sulfoxido de dimetilo y agua, o preferentemente utilizando, por ejemplo, agua, alcohol t-butilico, dioxano o sulfoxido de dimetilo.

[Metodo para secar una forma amorfa de una sal del acido L-mandelico del compuesto (1)]

La forma amorfa obtenida de este modo se puede secar, segun proceda, dejandola reposar al aire o calentandola. El tiempo requerido para la operacion de secado es el tiempo requerido hasta que la cantidad del disolvente residual sea inferior a una cantidad predeterminada y se puede determinar, segun proceda, dependiendo de la cantidad de un producto, el dispositivo de secado, la temperatura de secado y parametros similares. Es mas, este secado tambien se puede llevar a cabo con ventilacion o a presion reducida. El grado de presion reducida se puede determinar, segun proceda, dependiendo de la cantidad de un producto, el dispositivo de secado, la temperatura de secado y parametros similares. Una vez finalizada la operacion de secado, la forma amorfa obtenida se puede dejar reposar al aire, segun proceda.

La sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) tiene una accion inhibitoria en una via de fractalcina- CX3CR1 y es util como principio activo de agentes terapeuticos para enfermedades intestinales inflamatorias tales como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn.

Cuando la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) se utiliza como agente farmaceutico, se puede administrar por via oral o parenteral, por ejemplo, como agente terapeutico para enfermedades intestinales inflamatorias tales como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn, que son provocadas por la fractalcina- CX3CR1. La dosis del agente farmaceutico de la presente invencion es generalmente diferente dependiendo de los smtomas, la edad, el sexo, el peso corporal, etc., y puede ser una cantidad suficiente para exhibir un efecto deseado. Por ejemplo, cuando el sujeto es un adulto, el agente farmaceutico se administra en una dosis de aproximadamente 0.1 a 5000 mg (preferentemente de 0.5 a 1000 mg y mas preferentemente de 1 a 600 mg) al dfa, durante uno o varios dfas, una vez o dividida en 2-6 administraciones al dfa.

La sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) se puede formular mediante metodos convencionales, y los ejemplos de formas farmaceuticas incluyen formulaciones orales (tales como comprimidos, granulos, polvos, capsulas y jarabes), inyecciones (para la administracion intravenosa, administracion intramuscular, administracion subcutanea y administracion intraperitoneal) y formulaciones externas (tales como formulaciones de absorcion transdermica (tales como pomadas y parches), preparados oftalmicos, preparados nasales y supositorios).

Cuando se produce un preparado solido para la administracion oral, se anaden un excipiente, un aglutinante, un desintegrante, un lubricante, un agente colorante y agentes similares, segun proceda, a la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) y se puede producir un comprimido, un granulo, un agente en forma de polvo o una capsula de acuerdo con un metodo convencional. Es mas, un comprimido, un granulo, un agente en forma de polvo, una capsula o un agente similar de este tipo se puede someter a un recubrimiento pelicular, si procede.

Los ejemplos del excipiente incluyen lactosa, almidon de mafz y celulosa cristalina; los ejemplos del aglutinante incluyen hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa; los ejemplos del desintegrante incluyen carboximetilcelulosa calcica y croscarmelosa sodica; los ejemplos del lubricante incluyen estearato de magnesio y estearato de calcio; los ejemplos del agente colorante incluyen oxido de titanio; y los ejemplos del agente de recubrimiento peliculfgeno incluyen hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y metilcelulosa, pero obviamente los ejemplos de los aditivos no se limitan a estos.

Un preparado solido, tal como un comprimido, una capsula, un granulo o un agente en forma de polvo, puede comprender una cantidad de la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1) comprendida generalmente, por ejemplo, entre un 0.001% y un 99.5% en peso, y preferentemente entre un 0.001% y un 90% en peso.

Cuando se fabrican inyecciones (para la administracion intravenosa, administracion intramuscular, administracion subcutanea y administracion intraperitoneal), estas se pueden fabricar mediante la adicion de reguladores del pH, tampones, agentes de suspension, agentes solubilizantes, antioxidantes, conservantes (antisepticos), agentes reguladores de la tonicidad o agentes similares a la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1), segun proceda, y el tratamiento por metodos convencionales. Las formulaciones liofilizadas que se han de disolver antes

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de usarlas tambien se pueden preparar mediante liofilizacion. Estas inyecciones se pueden administrar por via intravenosa, subcutanea e intramuscular, por ejemplo.

Los ejemplos de reguladores del pH y tampones incluyen acidos organicos o inorganicos y/o sales de estos; los ejemplos de agentes de suspension incluyen metilcelulosa, polisorbato 80 y carboximetilcelulosa sodica; los ejemplos de agentes solubilizantes incluyen polisorbato 80 y monolaurato de sorbitan polioxietilenado; los ejemplos de antioxidantes incluyen a-tocoferol; los ejemplos de conservantes incluyen para-hidroxibenzoato de metilo y para- hidroxibenzoato de etilo; y los ejemplos de agentes reguladores de la tonicidad incluyen glucosa, cloruro de sodio y manitol; sin embargo, los excipientes no se limitan a estos ejemplos, obviamente.

Estas inyecciones pueden contener normalmente entre un 0.000001 y un 99.5% p, preferentemente entre un 0.00001 y un 90% p o un porcentaje similar de la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1).

Cuando se produce un agente externo, se anade un material base a la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1), segun proceda, por ejemplo, se anaden el conservante, estabilizante, regulador del pH, antioxidante y agente colorante descritos anteriormente, y posteriormente, de acuerdo con un metodo convencional, por ejemplo, se pueden producir un preparado de absorcion percutanea (una pomada, un parche, etc.), un colirio, unas gotas nasales, un supositorio y formas similares.

Como materiales base empleados, se pueden utilizar varios tipos de materias primas que se utilizan habitualmente en productos farmaceuticos, productos parafarmaceuticos, productos cosmeticos, etc. Espedficamente, los ejemplos del material base incluyen materias primas tales como aceites animales y vegetales, aceite mineral, aceite de tipo ester, ceras, emulsionante, alcoholes superiores, acidos grasos, aceites siliconicos, surfactante, fosfoftpidos, alcoholes, alcoholes poliddricos, poftmeros hidrosolubles, minerales arcillosos y agua purificada.

Estas formulaciones externas pueden contener normalmente entre un 0.000001 y un 99.5% p, preferentemente entre un 0.00001 y un 90% p o un porcentaje similar de la sal de un acido carboxflico organico del compuesto (1).

Ejemplo

A continuacion, la presente invencion se describira detalladamente con los ejemplos de produccion y los ejemplos. Sin embargo, no se pretende que la presente invencion se limite a estos ejemplos.

Ejemplo de produccion 1

Preparacion del acido 2-r(3S,4E)-1-ft2-cloro-6-(trifluorometil)fenillmetil}-3-ft1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4- illcarbamoilM-metilpirrolidin-3-illacetico

Ejemplo de produccion 1a

(2E)-But-2-enoato de bencilo

Se disolvio acido crotonico (70 g, 812 mmol) en W,A/-dimetilformamida (467 mL), que se enfrio en un bano de hielo en atmosfera de nitrogeno, y se anadio carbonato de potasio (61.6 g, 447 mmol). Se anadio bromuro de bencilo (91.7 mL, 772 mmol) gota a gota a la mezcla de reaccion en 20 minutos. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 horas. Se anadio acetato de etilo a la mezcla de reaccion, la cual se filtro a traves de Celite. La solucion de acetato de etilo filtrada se lavo con agua, una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio y una solucion acuosa saturada de cloruro de sodio. La capa organica se seco con sulfato de magnesio, se filtro y se concentro a presion reducida para obtener el compuesto del tftulo (142 g, rendimiento: 99.4%).

1H-RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm): 1.87-1.90 (3H, m), 5.17 (2H, s), 5.87-5.92 (1H, m), 6.98-7.07 (1H, m), 7.26-7.39 (5H, m).

Ejemplo de produccion 1b

(3ES,4SE)-1-Bencil-4-metilpirrolidin-3-carboxilato de bencilo

El (2E)-but-2-enoato de bencilo obtenido en el Ejemplo de produccion 1a (20.5 g, 116 mmol) se disolvio en diclorometano (5 mL) y la mezcla se enfrio en un bano de hielo con agitacion. Se anadio acido trifluoroacetico (257 |jL, 3.47 mmol) y se anadio W-(metoximetil)-A/-(trimetilsililmetil)bencilamina (33.1 g, 139 mmol) gota a gota al ftquido de reaccion en 15 minutos de tal modo que la temperatura interna no excediera 62 °C, mientras se lavaba con diclorometano (25 mL). El ftquido de reaccion se dejo reposar hasta que alcanzo la temperatura ambiente y se agito durante 15 horas. El ftquido de reaccion se concentro y se purifico mediante cromatografta en columna de gel de sflice (disolvente de elucion: acetato de etilo/heptano) para obtener el compuesto del tftulo (38 g).

1H-RMN (400MHz, CDCla) 8 (ppm): 1.14 (3H, d, J=6Hz), 2.18-2.22 (1H, m), 2.48-2.65 (2H, m), 2.75-2.85 (2H, m), 2.90-2.94 (1H, m), 3.54-3.66 (2H, m), 5.13 (2H, s), 7.20-7.40 (10H, m).

Ejemplo de produccion 1c

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(3RS.4SR)-1-Bencil-3-[2-(terf-butoxi)-2-oxoetil1-4-metil

El (3RS.4SR)-1-bencil-4-metilpirrolidin-3-carboxilato de bencilo obtenido en el Ejemplo de produccion 1b (30 g. 97.4 mmol) se disolvio en tetrahidrofurano (300 mL) y se enfrio hasta -70 °C con agitacion en atmosfera de nitrogeno. Se anadio una solucion 1.11 M de diisopropilamida de litio/n-hexano-tetrahidrofurano (105 mL. 116 mmol) gota a gota en 20 minutos de tal modo que la temperatura interna no excediera -64.3 °C. La mezcla se agito a -70 °C durante 1 hora, y a continuacion se anadieron tetrahidrofurano (30 mL) y bromoacetato de tert-butilo (26.6 g. 136 mmol) gota a gota en 10 minutos de tal modo que la temperatura interna no excediera -60 °C. La mezcla de reaccion se agito a - 70 °C durante una hora mas y a continuacion se anadio una solucion acuosa saturada de cloruro de amonio a la mezcla de reaccion. Justo despues. la mezcla de reaccion se diluyo con agua y se anadio acetato de etilo. La capa organica se lavo con salmuera y una solucion acuosa de acido clorlffdrico 5 N. y despues se seco con sulfato de magnesio. se filtro y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (disolvente de elucion: acetato de etilo/heptano). El residuo se purifico de nuevo mediante cromatograffa en columna de gel de sflice de tipo NH (disolvente de elucion: heptano/acetato de etilo = 98/2) para obtener el compuesto del fftulo (6 g. rendimiento: 14.5%).

1H-RMN (400 MHz. CDCh) 8 (ppm): 0.86 (3H. d. J=6Hz). 1.34 (9H. s). 2.05-2.15 (2H. m). 2.53 (1H. d. J=17Hz). 2.913.00 (3H. m). 3.28 (1H. d. J=10Hz). 3.59-3.72 (2H. m). 5.08-5.16 (2H. m). 7.19-7.39 (10H. m).

Se obtuvieron 18.1 g del compuesto del fftulo mediante el mismo metodo que se ha descrito anteriormente.

Ejemplo de produccion 1d

(3RS.4SR)-3-[2-(terf-butoxi)-2-oxoetil1-4-metilpirrolidin-1.3-dicarboxilato de 1.3-dibencilo

El (3RS.4SR)-1-bencil-3-[2-(tert-butoxi)-2-oxoetil]-4-metilpirrolidin-3-carboxilato de bencilo obtenido de una forma similar al Ejemplo de produccion 1c (11.7 g. 27.6 mmol) se disolvio en diclorometano (117 mL) y se anadio cloroformiato de bencilo (23.7 mL. 166 mmol) gota a gota al ffquido de reaccion en 20 minutos de tal modo que la temperatura interna no excediera 22 °C. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 12 horas y despues el disolvente se elimino por destilacion. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice de tipo NH (disolvente de elucion: acetato de etilo/heptano) para obtener el compuesto del fftulo (9.1 g. rendimiento: 70.5%).

1H-RMN (400 MHz. CDCla) 8 ppm; 0.84-0.90 (3H. m). 1.32-1.46 (9H. m). 2.09-2.16 (1H. m). 2.21-2.27 (1H. m). 3.043.14 (2H. m). 3.33-3.38 (1H. m). 3.60-3.68 (1H. m). 4.32 (1H. t. J=12 Hz). 5.07-5.20 (4H. m). 7.26-7.36 (10H. m).

Analisis por HPLC:

(Condiciones del analisis 1) Columna: CHIRALPAK AD-H (fabricada por Daicel Chemical Industries. Ltd.) (0.46 cm de diametro x 15 cm). eluyente: hexano/etanol = 95/5 (v/v). flujo: 1 mL/min. deteccion: UV (210 nm)

(Resultado del analisis) El compuesto del fftulo resultante se analizo en las condiciones de analisis 1 anteriores. y se observaron un pico con un tiempo de retencion de 8.56 y un pico con un tiempo de retencion de 10.85 minutos.

El compuesto del fftulo obtenido por separado se analizo en una columna quiral diferente a la columna anterior.

(Condiciones del analisis 2) Columna: CHIRALPAK IA (fabricada por Daicel Chemical Industries. Ltd.) (0.46 cm de diametro x 15 cm). eluyente: hexano/etanol = 95/5 (v/v). flujo: 1 mL/min. deteccion: UV (210 nm)

(Resultado del analisis) El compuesto del fftulo resultante se analizo en las condiciones de analisis 2 anteriores. y se observaron un pico con un tiempo de retencion de 6.78 y un pico con un tiempo de retencion de 8.20 minutos.

Ejemplo de produccion 1e

Acido (3S.4R)-3-[2-(tert-butoxi)-2-oxoetil1-4-metilpirrolidin-3-carboxilico

El (3RS.4SR)-3-[2-(tert-butoxi)-2-oxoetil1-4-metilpirrolidin-1.3-dicarboxilato de 1.3-dibencilo obtenido en el Ejemplo de produccion 1d (9.1 g) se resolvio opticamente de forma reiterada en los dos tipos de condiciones A o B siguientes.

Resolucion optica por HPLC;

(Condiciones de fraccionamiento A) Columna: CHIRALPAK AD-H (fabricada por Daicel Chemical Industries. Ltd.) (2 cm de diametro x 25 cm). eluyente: hexano/etanol = 85/15 (v/v). flujo: 8-10 mL/min.

(Condiciones de fraccionamiento B) Columna: CHIRALPAK IA (fabricada por Daicel Chemical Industries. Ltd.) (3 cm de diametro x 25 cm). eluyente: hexano/etanol = 95/5 (v/v). flujo: 22 mL/min.

El pico con un tiempo de retencion menor se fracciono y los tres lotes resultantes se analizaron posteriormente en las siguientes condiciones de analisis.

Analisis por HPLC:

(Condiciones del analisis) Columna: CHIRALPAK AD-H (fabricada por Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0.46 cm de diametro x 15 cm), eluyente: hexano/etanol = 95/5 (v/v), flujo: 1 mL/min, deteccion: UV (210 nm)

(Resultado del analisis) El tiempo de retencion fue de 9.0 minutos a 9.3 minutos, y el exceso enantiomerico fue 5 >99% de ee para todos los lotes.

Se combinaron los tres lotes, la forma quiral resultante (4.04 g) se disolvio en metanol (121 mL), se anadio Pd/C al 10% (0.77 g) y la atmosfera de reemplazo con hidrogeno gaseoso. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 13 horas y a continuacion se agito con la adicion de agua caliente (de 30 a 40 °C, 122 mL), y el precipitado solido se disolvio. Despues se elimino el Pd/C por filtracion, el disolvente se concentro y se seco para obtener el 10 compuesto del tttulo (2.1 g).

1H-RMN (400 MHz, D2O) 8 ppm; 0.97 (3H, d, J=7 Hz), 1.42 (9H, s), 2.15-2.22 (1H, m), 2.30 (1H, d, J=17 Hz), 2.93 (1H, d, J=17 Hz), 3.04 (1H, t, J=12 Hz), 3.18 (1H, d, J=12 Hz), 3.49 (1H, dd, J=8, 12 Hz), 4.03 (1H, d, J=12 Hz).

Cada desplazamiento qrnmico indica un valor que se ha corregido ajustando el desplazamiento qrnmico de un pico residual del disolvente en agua pesada a 4.79.

15 Ejemplo de produccion 1f

Acido (3S.4ffl-1-bencil-3-r2-(terf-butoxi)-2-oxoetill-4-metilpirrolidin-3-carboxilico

Una mezcla del acido (3R*,4S*)-3-[2-(ferf-butoxi)-2-oxoetil]-4-metilpirrolidin-3-carboxflico obtenido en el Ejemplo de produccion 1e (1.8 g, 7.4 mmol), benzaldehfdo (1.51 mL, 14.8 mmol), acido acetico (0.635 mL, 11.1 mmol), triacetoxiborohidruro sodico (3.14 g, 14.8 mmol) y metanol (35 mL) se calento a 40 °C durante 38 horas y 30 20 minutos. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (gel de sflice ODS, disolvente de elucion: agua/metanol) para obtener el compuesto del tttulo como un Lote A (584 mg) y un Lote B (708 mg).

1H-RMN (400 MHz, CDCla) del Lote A 8 ppm; 1.02 (3H, d, J=7 Hz), 1.38 (9H, s), 2.14 (1H, d, J=17 Hz), 2.15-2.28 (1H, a), 2.97 (1H, d, J=17 Hz), 3.10-3.42 (3H, m), 4.00-4.10 (1H, m), 4.30-4.40 (1H, a), 4.46 (1H, d, J=12 Hz), 7.4525 7.53 (5H, m).

1H-RMN del Lote B: identico al RMN del Lote A.

Ejemplo de produccion 1g

4-[(3S,4ffl-1-Bencil-3-[2-(ferf-butoxi)-2-oxoetill-4-metilpirrolidin-3-amidolpiperidin-1-carboxilato de ferf-butilo

Se anadieron 4-aminopiperidin-1-carboxilato de ferf-butilo (849 mg, 4.24 mmol), trietilamina (1.18 mL, 8.48 mmol) y 30 PyBOP (2.21 g, 4.24 mmol) a una solucion de acido (3R*,4s*)-1-bencil-3-[2-(ferf-butoxi)-2-oxoetil]-4-metilpirrolidin-3- carboxflico obtenido mediante un metodo similar al del Ejemplo de produccion 1f (942 mg, 2.83 mmol) en N,N- dimetilformamida (20 mL), y a continuacion se agito a temperatura ambiente durante toda la noche. Se anadio acetato de etilo al lfquido de reaccion, que se lavo con una solucion acuosa 1 N de hidroxido de sodio y salmuera. Este lfquido se seco con sulfato de magnesio anhidro y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatograffa 35 en columna de gel de sflice (disolvente de elucion: heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del tttulo (1.33 g, rendimiento: 91.1%).

1H-RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm): 0.92 (3H, d, J=7Hz), 1.20-1.40 (2H, m), 1.40 (9H, s), 1.48 (9H, s), 1.78-1.88 (1H, m), 1.92-1.98 (1H, m), 1.96 (1H, d, J=16Hz), 2.03-2.09 (1H, m), 2.36 (1H, d, J=10Hz), 2.58-2.68 (2H, m), 2.89-2.95 (2H, m), 3.10 (1H, d, J=16Hz), 3.59 (1H, d, J=10Hz), 3.66 (2H, s), 3.83-4.00 (3H, m), 7.23-7.35 (5H, m), 8.65 (1H, d, 40 J=7 Hz).

MS(ESI) m/z: 538.2 (M+Na)+.

Ejemplo de produccion 1h

4-[(3S,4ffl-3-[2-(ferf-butoxi)-2-oxoetill-4-metilpirrolidin-3-amidolpiperidin-1-carboxilato de ferf-butilo

Se anadio hidroxido de paladio al 20% (724 mg) a una solucion de 4-[(3R*,4S*)-1-bencil-3-[2-(ferf-butoxi)-2-oxoetill-4- 45 metilpirrolidin-3-amidolpiperidin-1-carboxilato de ferf-butilo obtenido en el Ejemplo de produccion 1g (1.33 g, 2.58 mmol) en metanol (30 mL), la cual se agito en atmosfera de hidrogeno durante toda la noche. El lfquido de reaccion se filtro y se concentro a presion reducida para obtener el compuesto del tttulo (1.04 g, rendimiento: 94.7%).

1H-RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm): 0.92 (3H, d, J=7Hz), 1.20-1.52 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.43 (9H, s), 1.80-2.10 (5H, m), 2.00 (1H, d, J=16Hz), 2.55-2.61 (1H, m), 2.80-3.06 (2H, m), 2.92 (1H, d, J=10Hz), 3.12 (1H, d, J=16Hz), 3.35 50 (1H, d, J=9Hz), 3.70 (1H, d, J=10Hz), 3.80-4.00 (3H, m), 8.30 (1H, d, J=7Hz).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

MS(ESI) m/z: 426.1 (M+H)+

Ejemplo de produccion 1i

4-[(3S.4R)-3-[2-(tert-Butoxi)-2-oxoetil1-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil1metil}-4-metilpirrolidin-3-amida1piperidin-1- carboxilato de tert-butilo

Se anadieron 2-(bromometil)-1-cloro-3-(trifluorometil)benceno (443 mg. 1.62 mmol) y carbonato de potasio (244 mg) a una solucion de 4-[(3R ,4S*)-3-[2-(terf-butoxi)-2-oxoetil]-4-metilpirrolidin-3-amido]piperidin-1-carboxilato de tert- butilo obtenido en el Ejemplo de produccion 1h (345 mg. 0.811 mmol) en W,W-dimetilformamida (deshidratada) (10 mL), la cual se agito a 45 °C durante seis horas a 40 °C durante dos dfas. Se anadio acetato de etilo al lfquido de reaccion, que se lavo con una solucion acuosa 1 N de hidroxido de sodio y salmuera. Este lfquido se seco con sulfato de magnesio anhidro y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatograffa en columna de gel de sflice (disolvente de elucion: heptano/acetato de etilo) para obtener el compuesto del tttulo (320 mg. rendimiento: 63.8%).

1H-RMN (400 MHz. CDCla) 8 (ppm): 0.92 (3H. d. J=7Hz), 1.13-1.18 (2H. m). 1.39 (9H. s). 1.49 (9H. s). 1.53-1.65 (1H. m). 1.76-1.86 (1H. m). 1.98 (1H. d. J=16Hz), 2.02-2.10 (1H. m). 2.51 (1H. d. J=10Hz), 2.60-2.80 (3H. m). 2.88 (1H. t. J=10Hz), 3.12 (1H. d. J=16Hz), 3.53 (1H. d. J=10Hz), 4.09-4.25 (5H. m). 7.38 (1H. t. J=8Hz), 7.63 (2H. d. J=8Hz), 7.96 (1H. d. J=8Hz).

MS(ESI) m/z: 640.2 (M+Na)+.

Ejemplo de produccion 1j

Acido 2-[(3S.4R)-1-{[2-Cloro-6-(trifluorometil)fenil1metil}-4-metil-3-[(piperidin-4-il)carbamoil1pirrolidin-3-il1acetico

Se anadio acido trifluoroacetico (8 mL) a una solucion de 4-[(3R*,4S*)-3-[2-(tert-butoxi)-2-oxoetil1-1-{[2-cloro-6- (trifluorometil)fenil1metil}-4-metilpirrolidin-3-amido1piperidin-1 -carboxilato de terf-butilo obtenido en el Ejemplo de produccion 1i (320 mg. 0.518 mmol) en diclorometano (deshidratado) (8 mL) enfriada con hielo, y a continuacion se agito a temperatura ambiente durante 2.5 horas. El lfquido de reaccion se concentro a presion reducida y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna ODS (disolvente de elucion: agua/metanol) para obtener una mezcla que contema el compuesto del fftulo (344 mg).

1H-RMN (400 MHz. CD3OD) 8 (ppm): 0.83 (3H. d. J=5Hz), 1.43-1.63 (2H. m). 1.76-1.89 (1H. m). 1.92-2.00 (1H. m). 2.03-2.19 (2H. m). 2.55-2.68 (2H. m). 2.91-3.10 (4H. m). 3.25-3.36 (2H. m). 3.45-3.59 (1H. m). 3.75-4.18 (3H. m). 7.41-7.76 (3H. m).

MS(ESI) m/z: 462.3 (M+H)+

Ejemplo de produccion 1k

Acido_____2-[(3S.4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-

metilpirrolidin-3-il1acetico

Se anadieron ciclohex-1-en-1-carbaldelffdo (423 jL. 3.73 mmol). acido acetico (300 jL) y triacetoxiborohidruro de sodio (789 mg. 3.73 mmol) a una solucion de la mezcla de acido 2-[(3R.4S)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil1metil}- 4-metil-3-[(piperidin-4-il)carbamoil1pirrolidin-3-il1acetico obtenida mediante el metodo del Ejemplo de produccion 1j (344 mg. 0.745 mmol) en tetrahidrofurano (deshidratado) (10 mL). y a continuacion se agito durante toda la noche. Se anadieron agua y metanol al lfquido de reaccion, que se concentro a presion reducida. y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna ODS (disolvente de elucion: aguar/metanol). El producto purificado se disolvio en diclorometano. se suspendio anadiendo hexano y se concentro para obtener el compuesto del fftulo (180 mg. rendimiento: 43.4%).

1H-RMN (400 MHz. CD3OD) 8 (ppm): 0.89 (3H. d. J=7Hz), 1.23-1.38 (2H. m). 1.44-1.82 (6H. m). 1.82-1.96 (1H. m).

1.96-2.25 (5H. m). 2.30-2.45 (2H. m). 2.55-2.68 (2H. m). 2.92-3.20 (5H. m). 3.54 (1H. d. J=10Hz), 3.64-3.78 (1H. m). 3.95 (1H. d. J=10Hz), 4.05 (1H. d. J=10Hz), 5.76 (1H. s). 7.47-7.52 (1H. m). 7.72 (1H. d. J=7Hz), 7.77 (1H. d. J=8Hz).

MS(ESI) m/z: 578.3 (M+Na)+

Ejemplo 1

Preparacion de un cristal de una sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6- (trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico

Se anadio una solucion en acetato de etilo del acido L-mandelico (20 mg/mL) en una cantidad de 1407 |iL (1 equivalente) al acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1 -(ciclohex-1-en-1 -ilmetil)piperidin-4- il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico (102.8 mg) y a continuacion la solucion mezclada obtenida se sometio

5

10

15

20

25

30

35

posteriormente a un tratamiento con ultrasonidos, despues del cual la solucion mezclada se agito con un agitador magnetico a temperatura ambiente. Tras agitar la solucion mezclada durante toda la noche, debido a la presencia de un solido en la solucion, el solido se recogio por filtracion y se lavo con acetato de etilo y despues se seco para obtener el cristal del tftulo (49.3 mg).

1H-RMN (600 MHz, CD3OD) 8 (ppm): 0.90 (3H, d, J=7Hz), 1.58-1.64 (2H, m), 1.64-1.76 (4H, m), 1.82-1.89 (1H, m),

1.97-2.07 (3H, m), 2.08-2.14 (2H, m), 2.19 (1H, d, J=17Hz), 2.15-2.23 (1H, m), 2.62 (1H, d, J=10Hz), 2.67 (1H, dd, J=10, 7Hz), 2.72-2.84 (2H, m), 3.00 (1H, dd, J=10, 10Hz), 3.10 (1H, d, J=17Hz), 3.25-3.32 (2H, m), 3.43 (2H, s), 3.53 (1H, d, J=10Hz), 3.77-3.85 (1H, m), 3.98 (1H, d, J=13Hz), 4.07 (1H, d, J=13Hz), 4.91 (1H, s), 5.91 (1H, ds a), 7.23 (1H, t, J=7Hz), 7.29 (2H, dd, J=7, 7Hz), 7.46 (2H, d, J=7Hz), 7.51 (1H, dd, J=8, 8Hz), 7.73 (1H, d, J=8Hz), 7.79 (1H, d, J=8Hz).

El espectro de RMN en estado solido de 13C del cristal de la sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2- cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico obtenido mediante el metodo descrito anteriormente se midio en las condiciones que se indican a continuacion.

[Condiciones de medicion]

Dispositivo empleado: AVANCE 400 (fabricado por BRUKER)

Temperatura de medicion: temperatura ambiente (22 °C)

Sustancia patron: glicina (patron externo: 176.03 ppm)

Nucleo de medicion: 13C (100.6248425 MHz)

Tiempo de repeticion del pulso: 6 segundos Modo del pulso: medicion TOSS

El espectro de RMN en estado solido de 13C se muestra en la Figura 1 y el desplazamiento qmmico se muestra a continuacion.

13C-RMN (100 MHz, estado solido) 8 (ppm): 13.8, 14.1, 21.0, 22.8, 24.3, 26.8, 27.8, 30.5, 40.5, 41.6, 42.4, 46.0, 50.9, 51.4, 52.9, 53.3, 54.7, 55.7, 59.5, 60.3, 63.6, 64.4, 75.2, 124.0, 124.4, 126.2, 127.2, 128.1, 133.3, 133.9, 135.5, 137.8, 144.7, 171.5, 174.0, 175.5, 175.8.

El cristal de la sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1- en-1 -ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico obtenido mediante el metodo descrito anteriormente se introdujo en una plataforma para muestras de un difractometro de rayos X en polvo y a continuacion se analizo en las condiciones de medicion que se indican a continuacion. El patron de difraccion de rayos X en polvo obtenido se muestra en la Figura 2.

[Tabla 1]

Condiciones de medicion

Diana

Cobre

Detector

Contador de centelleo

Voltaje del tubo

50 kV

Corriente del tubo

300 mA

Rendija

Rendija de divergencia de 0.5 mm, rendija de dispersion abierta, rendija receptora abierta

Velocidad de barrido

5°/min

Intervalo de muestreo

0.02

Rango de barrido

cn 0 do cn 0

Portamuestras

Portamuestras hecho de aluminio

Ejemplo 2

Preparacion de una forma amorfa de una sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4ffl-1-{[2-cloro-6- (trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico

Se peso la sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en- 1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico (53.61 mg), despues se introdujo en un vaso de precipitados de 200 mL, y a continuacion se anadieron alcohol ferf-butilico (tBA) (20 mL) y agua (4 mL) al vaso de

5

10

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20

25

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45

50

precipitados. Un matraz con forma de pera de 100 mL (matraz de recuperacion) se hizo rotar mientras se sumergfa en etanol enfriado con hielo seco. La solucion de muestra se introdujo por goteo en el matraz y despues se congelo. Tras congelar la cantidad total de la solucion de muestra, se cubrio el orificio del matraz con un pano de limpieza y despues se liofilizo. De este modo se obtuvieron 48.60 mg de la forma amorfa del tttulo.

1H-RMN (600 MHz, CD3OD) 8 (ppm): 0.90 (3H, d, J=7Hz), 1.58-1.64 (2H, m), 1.64-1.76 (4H, m), 1.82-1.90 (1H, m),

1.98-2.07 (3H, m), 2.08-2.15 (2H, m), 2.15-2.23 (1H, m), 2.19 (1H, d, J=17Hz), 2.62 (1H, d, J=10Hz), 2.67 (1H, dd, J=10, 7Hz), 2.74-2.85 (2H, m), 3.00 (1H, dd, J=10, 10Hz), 3.10 (1H, d, J=17Hz), 3.25-3.33 (2H, m), 3.44 (2H, s), 3.53 (1H, d, J=10Hz), 3.78-3.85 (1H, m), 3.98 (1H, d, J=13Hz), 4.07 (1H, d, J=13Hz), 4.91 (1H, s), 5.91 (1H, ds a), 7.23 (1H, t, J=7Hz), 7.29 (2H, dd, J=7, 7Hz), 7.46 (2H, d, J=7Hz), 7.51 (1H, dd, J=8, 8Hz), 7.73 (1H, d, J=8Hz), 7.79 (1H, d, J=8Hz).

La forma amorfa obtenida mediante el metodo descrito anteriormente se coloco sobre una plataforma para muestras de un difractometro de rayos X en polvo, y despues se analizo en las condiciones de medicion descritas en el Ejemplo 1. El patron de difraccion de rayos X en polvo obtenido se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 3

Preparacion de un cristal de un solvato (A) una sal del acido L-lactico del acido 2-[(3S,4ffl-1-{[2-cloro-6- (trifluorometil)fenil1metil}-3-(r1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico

Se anadio una solucion en acetato de etilo del acido L-lactico (10 mg/mL) en una cantidad de 1296 |iL (1 equivalente) al acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1 -(ciclohex-1-en-1 -ilmetil)piperidin-4- il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico (81.38 mg) y la solucion obtenida se sometio posteriormente a un tratamiento con ultrasonidos, despues del cual la solucion de reaccion se agito con un agitador magnetico a temperatura ambiente. Debido a la presencia de un solido en la solucion, el solido se recogio por filtracion y se lavo con acetato de etilo y despues se seco para obtener el cristal del tttulo (78.93 mg).

El cristal del solvato de la sal del acido L-lactico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1- (ciclohex-1 -en-1 -ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico obtenido mediante el metodo descrito anteriormente se introdujo en una plataforma para muestras de un difractometro de rayos X en polvo y a continuacion se analizo en las condiciones de medicion descritas en el Ejemplo 1. El patron de difraccion de rayos X en polvo obtenido se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 4

Preparacion de un cristal de un solvato (B) de una sal del acido L-lactico del acido 2-[(3S,4ffl-1-{[2-cloro-6- (trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico

Se anadio una solucion en cetona etil metflica del acido L-lactico (10 mg/mL) en una cantidad de 1318 |iL (1 equivalente) al acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4- il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico (79.99 mg) y la solucion obtenida se sometio posteriormente a un tratamiento con ultrasonidos, despues del cual la solucion de reaccion se agito con un agitador magnetico a temperatura ambiente. Debido a la presencia de un solido en la solucion, el solido se recogio por filtracion y se lavo con cetona etil metflica y despues se seco para obtener el cristal del tttulo (67.56 mg).

El cristal del solvato de la sal del acido L-lactico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1- (ciclohex-1 -en-1 -ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico obtenido mediante el metodo descrito anteriormente se introdujo en una plataforma para muestras de un difractometro de rayos X en polvo y a continuacion se analizo en las condiciones de medicion descritas en el Ejemplo 1. El patron de difraccion de rayos X en polvo obtenido se muestra en la Figura 5.

Ejemplo 5

Preparacion de un cristal de una sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4ffl-1-{[2-cloro-6- (trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico

Se anadio acido L-mandelico (60.2 mg) disuelto en un disolvente mixto constituido por acetona (0.5 mL) y eter tert- butil metflico (0.5 mL) gota a gota al acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1- ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico (230 mg, contenido: 200 mg) disuelto en un disolvente mixto constituido por acetona (0.75 mL) y eter tert-butil metflico (0.75 mL), y ademas la mezcla obtenida se lavo posteriormente con un disolvente mixto constituido por acetona (0.25 mL) y eter tert-butil metflico (0.25 mL). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante dos noches. A continuacion, el cristal obtenido se filtro y despues se lavo con acetona/eter tert-butil metflico (en una proporcion en volumen de 1:1) (0.4 mL x 3) y eter tert- butil metflico (0.4 mL x 3), para obtener asf 223.0 mg del cristal del tttulo (rendimiento: 88%) en forma de un cristal blanco.

5

10

15

20

25

Recristalizacion de una sal del acido L-mandelico del acido 2-rf3S.4^)-1-(r2-cloro-6-ftrifluorometil)fenil1metil}-3-(n- (ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico

Se anadieron sulfoxido de dimetilo (1.65 mL) y acetona (2.0 mL) a un cristal de una sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-

metilpirrolidin-3-il]acetico (1.00 g). y el cristal se disolvio en ellos calentando la mezcla a 60 °C. Posteriormente, se anadieron mas sulfoxido de dimetilo (0.05 mL) y acetona (1.0 mL) a la solucion obtenida. A la solucion obtenida se anadio acetato de isopropilo (10 mL) y. una vez finalizada la adicion, la solucion resultante se calento a 45 °C. A continuacion, se anadio mas acetato de isopropilo (15 mL) a la solucion de reaccion a 45 °C. La solucion obtenida se enfrio hasta

-20 °C, y despues el cristal generado se filtro y seguidamente se lavo con un disolvente mixto constituido por acetona/acetato de isopropilo (en una proporcion en volumen de 1:9, 5 mL), y el resultante se seco a continuacion a temperatura ambiente para obtener asf 907.1 mg del cristal del tftulo (rendimiento: 90.7%) en forma de un cristal blanco.

Ejemplo 7

Cristalografia de rayos X de una sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4ffl-1-{[2-cloro-6- (trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico

Se peso una sal del acido L-mandelico del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil1metil}-3-{[1-(ciclohex-1- en-1 -ilmetil)piperidin-4-il1carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il1acetico (5.28 mg) en un vial de vidrio, y se anadio metanol (1.0 mL) al vial para disolver la sustancia mencionada anteriormente en metanol. Este vial de vidrio se introdujo dentro de un vial de vidrio mas grande lleno de una cantidad adecuada de acetato de etilo, y el vial de vidrio externo se cerro hermeticamente con un tapon (metodo de difusion de vapor). Tres semanas despues, se descubrio que un cristal habfa precipitado dentro del cristal de vidrio. Utilizando el unico cristal obtenido (0.50 x 0.20 x 0.10 mm), se realizo un experimento de difraccion de rayos X empleando R-AXIS RAPID II (Rigaku Corporation). Los datos cristalograficos y los resultados del analisis estructural se muestran en la Tabla 2, y los datos de las coordenadas atomicas se muestran en la Tabla 3. A partir de estos resultados, se especifico la configuracion absoluta del compuesto del tftulo.

[Tabla 21

Temperatura

100 K

Longitud de onda

1.5418 A

Sistema cristalino, grupo espacial

Sistema monoclmico, P1

Parametro de red

a = 10.5120 (7) A

b = 12.516 (1) A

c = 13.749 (1) A

a = 97.466(5) °

P = 91.637(4) °

y = 100.997(5) °

Volumen

1758.0 (3) A3

valor de Z, densidad calculada

2, 1.338 g/cm3

Coeficiente de absorcion

15.193 cm'1

Tamano del cristal

0.50 x 0.20 x 0.10 mm

Medida maxima 20

136.4°

Numero de reflexiones totales/ Numero de reflexiones unicas

16527/9183 [R (Intensidad) = 0.07341

Integridad

95.80%

Determinacion de la fase

Metodo directo (SHELX97)

Metodo de precision

metodo de los mmimos cuadrados referente a F2

Dato/parametro

9183/915

Bondad del ajuste

1.12

Valor de R (datos totales)

0.1193

Valor de R (I>2o (I))

0.0766

Parametro de Flack

-0.01 (4)

Diferencia entre el pico maximo y el mmimo

0.57 y -0.55 e/A3

[Tabla 3-1]

Atomo

x y z B (eg)

Cl1

0.4119(2) 0.7216(2) 0.2017(2) 3.77(5)

Cl2

1.0126(2) 0.1242(2) 0.8268(2) 3.88(5)

F1

0.6822(5) 0.5796(5) 0.5686(5) 3.9(2)

F2

0.4752(5) 0.5604(5) 0.5619(5) 4.1(2)

F3

0.5696(6) 0.4670(5) 0.4542(5) 4.9(2)

F4

1.2722(6) 0.3815(5) 0.5804(5) 4.4(2)

F5

1.3124(6) 0.2702(5) 0.4582(5) 4.4(2)

F6

1.1195(5) 0.3018(5) 0.4727(5) 4.6(2)

01

0.1661(6) 0.7584(5) 0.6521(5) 2.8(2)

02

-0.0333(6) 0.6958(7) 0.7021(6) 3.7(2)

03

-0.0086(6) 0.8003(5) 0.4720(5) 3.0(2)

04

0.7323(6) 0.0841(5) 0.3764(5) 3.1(2)

05

0.5656(6) 0.1418(6) 0.3084(6) 3.2(2)

06

0.5324(6) 0.0500(5) 0.5451(5) 3.0(2)

07

0.2472(7) 0.8855(6) 0.0505(6) 3.1(2)

08

0.0090(6) 0.9111(6) 0.0180(5) 3.2(2)

09

-0.0080(6) 0.8224(6) -0.1360(5) 3.6(2)

010

0.7535(6) -0.0752(6) 0.9744(5) 2.8(2)

011

0.5020(6) -0.0893(5) 0.9973(5) 3.0(2)

012

0.5310(6) 0.0028(6) 1.1492(5) 3.4(2)

N1

0.2565(6) 0.5984(6) 0.3596(6) 2.8(2)

N2

0.1600(7) 0.7980(6) 0.3731(6) 2.8(2)

N3

0.1570(7) 1.0437(7) 0.1848(7) 2.2(2)

N4

0.8943(6) 0.2493(6) 0.6668(6) 2.7(2)

N5

0.7005(7) 0.0555(7) 0.6545(6) 2.9(2)

N6

0.5917(6) -0.2088(6) 0.8249(6) 2.4(2)

C1

0.4952(8) 0.6468(8) 0.3650(7) 2.6(2)

C2

0.5120(8) 0.7310(8) 0.3065(7) 2.8(2)

C3

0.6126(8) 0.8222(8) 0.3237(8) 3.4(2)

C4

0.6979(8) 0.8277(8) 0.4026(8) 3.1(2)

C5

0.6874(9) 0.7435(9) 0.4592(8) 3.4(2)

C6

0.5857(8) 0.6555(8) 0.4412(8) 2.8(2)

C7

0.5777(9) 0.5675(8) 0.8043(8) 3.0(2)

C8

0.3753(8) 0.5567(8) 0.3399(8) 3.1(2)

C9

0.1384(9) 0.5269(8) 0.3104(8) 3.1(2)

C10

0.0233(8) 0.5488(7) 0.3708(7) 2.6(2)

C11

0.0865(8) 0.6378(7) 0.4574(7) 2.5(2)

C12

0.2265(8) 0.6211(8) 0.4627(7) 2.4(2)

C13

-0.0890(9) 0.5750(9) 0.3129(8) 3.4(2)

C14

0.0145(8) 0.6162(8) 0.5494(7) 2.7(2)

C15

0.0583(8) 0.6970(8) 0.6371(8) 3.0(2)

C16

0.0769(7) 0.7553(7) 0.4356(7) 2.2(2)

C17

0.1495(7) 0.9031(7) 0.3397(7) 2.4(2)

C18

0.0375(8) 0.8917(8) 0.2626(7) 2.8(2)

C19

0.0328(8) 0.9990(7) 0.2266(7) 2.7(2)

C20

0.2679(8) 1.0581(8) 0.2568(7) 2.7(2)

C21

0.2767(8) 0.9531(8) 0.2974(8) 2.9(2)

C22

0.1485(8) 1.1456(8) 0.1405(8) 2.9(2)

C23

0.2704(8) 1.1993(8) 0.0993(8) 3.0(2)

C24

0.338(2) 1.297(1) 0.141(2) 7.0(5)

C25

0.457(2) 1.354(2) 0.102(2) 9.9(6)

C26

0.500(2) 1.296(2) 0.016(2) 7.3(5)

C27

0.412(2) 1.208(2) -0.047(1) 5.7(3)

C28

0.306(1) 1.1450(9) 0.0063(8) 4.0(3)

C29

1.1103(8) 0.2009(7) 0.6631(7) 2.5(2)

C30

1.0966(8) 0.1154(8) 0.7214(8) 2.9(2)

C31

1.1552(9) 0.0232(8) 0.6983(8) 3.1(2)

C32

1.2291(9) 0.0162(8) 0.6186(8) 3.4(2)

C33

1.2512(8) 0.1033(8) 0.5625(8) 3.0(2)

C34

1.1924(8) 0.1936(8) 0.5838(7) 2.7(2)

C35

1.2235(8) 0.2844(9) 0.5233(8) 3.3(2)

C36

1.0351(8) 0.2910(8) 0.6858(8) 2.9(2)

C37

0.8142(8) 0.3275(9) 0.7115(8) 3.3(2)

C38

0.6879(9) 0.3027(9) 0.6470(7) 3.2(2)

C39

0.7039(8) 0.2127(8) 0.5636(7) 2.6(2)

C40

0.8521(8) 0.2246(8) 0.5627(7) 2.6(2)

C41

0.568(1) 0.2831(9) 0.7055(9) 4.2(3)

C42

0.6434(8) 0.2283(8) 0.4665(7) 2.7(2)

C43

0.6513(8) 0.1407(8) 0.3822(7) 2.7(2)

C44

0.6374(8) 0.0972(8) 0.5857(7) 2.9(2)

C45

0.6489(9) -0.0532(8) 0.6813(8) 3.1(2)

C46

0.5365(8) -0.0506(8) 0.7504(8) 2.9(2)

C47

0.4846(8) -0.1669(8) 0.7744(7) 2.7(2)

C48

0.7044(8) -0.2121(8) 0.7584(7) 2.6(2)

C49

0.7547(8) -0.0983(8) 0.7300(8) 3.1(2)

C50

0.5404(9) -0.3241(8) 0.8498(8) 3.4(2)

C51

0.6373(8) -0.3622(8) 0.9137(8) 2.9(2)

C52

0.7227(9) -0.4184(8) 0.8752(8) 3.4(2)

C53

0.828(1) -0.4492(9) 0.9352(8) 3.6(2)

C54

0.821(2) -0.410(2) 1.043(1) 6.6(4)

C55

0.741(2) 1-0.351(2) 1.080(1) 12.3(9)

C56

0.626(1) -0.3309(9) 1.0217(7) 3.4(2)

C57

0.1875(8) 0.7110(8) -0.0513(7) 2.7(2)

C58

0.1750(9) 0.6515(8) 0.0274(8) 3.3(2)

C59

0.175(1) 0.5404(9) 0.0160(8) 3.6(2)

C60

0.188(1) 0.484(1) -0.0740(9) 4.2(3)

C61

0.1991(9) 0.5406(9) -0.1553(8) 3.4(2)

C62

0.1993(8) 0.6546(8) -0.1443(7) 2.8(2)

C63

0.1880(8) 0.8313(8) -0.0423(7) 2.8(2)

C64

0.0513(9) 0.8567(8) -0.0548(8) 3.0(2)

C65

0.7830(8) 0.1032(8) 1.0765(7) 2.6(2)

C66

0.8163(8) 0.1620(8) 1.1705(8) 2.9(2)

C67

0.8731(9) 0.2726(8) 1.1802(9) 3.6(2)

C68

0.898(1) 0.3241(9) 1.0990(9) 4.1(3)

C69

0.866(1) 0.2675(8) 1.0071(9) 3.9(3)

C70

0.8061(9) 0.1562(8) 0.9943(8) 3.3(2)

C71

0.7217(7) -0.0192(7) 1.0641(7) 2.3(2)

C72

0.5727(8) -0.0338(8) 1.0709(7) 2.6(2)

H2

-0.0067 0.7391 0.7396 0.06

H2A

0.2223 0.7565 0.3396 3.76

H3

0.1623 1.0065 0.1437 0.00

H3A

0.6220 0.8783 0.2825 4.05

H4

0.7652 0.8907 0.4185 3.78

H5

0.5766 0.0892 0.2461 5.51

H5A

0.7659 0.0835 0.6906 12.08

H58

0.7508 0.7463 0.5106 4.03

H6

0.6367 -0.1489 0.8990 2.67

H7

0.3077 0.8856 0.0380 3.75

H8A

0.3734 0.5262 0.2697 3.69

H8B

0.3797 0.4966 0.3794 3.69

H9A

0.1455 0.4488 0.3069 3.71

H9B

0.1262 0.5436 0.2427 3.71

H10

0.8221 -0.0844 0.9746 4.22

H10A

-0.0108 0.4803 0.3996 3.10

H12A

0.2853 0.6880 0.4961 2.88

H12B

0.2342 0.5585 0.4982 2.88

H13A

-0.1584 0.5862 0.3569 4.09

H13B

-0.122 0.5137 0.2609 4.09

H13C

-0.0593 0.6419 0.2833 4.09

H14A

-0.0789 0.6140 0.5351 3.20

H14B

0.0233 0.5427 0.5647 3.20

H17

0.1337 0.9548 0.3979 2.85

H18A

0.0482 0.8368 0.2063 3.33

H18B

-0.0457 0.8647 0.2917 3.33

H19A

-0.0388 0.9882 0.1757 3.20

H19B

0.0151 1.0524 0.2818 3.20

H20A

0.2592 1.1154 0.3116 3.21

H20B

0.3493 1.0837 0.2248 3.21

H21A

0.3472 0.9685 0.3495 3.52

H21B

0.2988 0.8993 0.2444 3.52

H22A

0.0790 1.1267 0.0875 3.49

H22B

0.1224 1.1994 0.1915 3.49

H24

0.3077 1.3317 0.1995 8.43

H25A

0.4432 1.4261 0.0872 11.90

H25B

0.5279 1.3681 0.1545 11.90

H26A

0.5735 1.2645 0.0373 8.80

H26B

0.5347 1.3518 -0.0262 8.80

H27A

0.4637 1.1565 -0.0789 6.89

H27B

0.3722 1.2405 -0.0992 6.89

H28A

0.2272 1.1243 -0.0386 4.75

H28B

0.3323 1.0760 0.0189 4.75

H31

1.1431 -0.034 0.7384 3.77

H32

1.2652 -0.0472 0.6012 4.05

H33

1.3070 0.1005 0.5094 3.60

H36A

1.0528 0.3233 0.7557 3.51

H36B

1.0641 0.3497 0.6450 3.51

H37A

0.8595 0.4045 0.7114 3.99

H37B

0.7963 0.3157 0.7800 3.99

H38

0.6850 0.3701 0.6158 3.84

H40A

0.8762 0.1555 0.5325 3.13

H40B

0.8907 0.2850 0.5264 3.13

H41A

4.5676 0.3482 0.7535 5.00

H41B

0.5686 0.2194 0.7399 5.00

H41C

0.4905 0.2692 0.6609 5.00

H42A

0.5509 0.2312 0.4752 3.22

H42B

0.6866 0.3002 0.4490 3.22

H45

0.6152 -0.104 0.6199 3.76

H46A

0.5675 -0.0005 0.8118 3.42

H46B

0.4661 -0.0228 0.7185 3.42

H47A

0.4112 -0.1657 0.8178 3.21

H47B

0.4525 -0.2167 0.7130 3.21

H48A

0.6755 -0.2652 0.6985 3.10

H48B

0.7751 -0.2369 0.7930 3.10

H49A

0.7912 -0.0473 0.7896 3.69

H49B

0.8254 -0.1025 0.6845 3.69

H50A

0.4590 -0.3244 0.8843 4.12

H50B

0.5201 -0.3762 0.7882 4.12

H52

0.7168 -0.4404 0.8061 4.05

H53A

0.9139 -0.4161 0.9129 4.34

H53B

0.8202 -0.53 0.9249 4.34

H54A

0.8072 -0.4773 1.0754 7.89

H54B

0.9094 -0.369 1.0655 7.89

H55A

0.7935 -0.2778 1.1053 14.82

H55B

0.7061 -0.3841 1.1375 14.82

H56A

0.5454 -0.3744 1.0427 4.09

H56B

0.6211 -0.2522 1.0351 4.09

H58

0.1659 0.6884 0.0910 4.00

H59

0.1666 0.5025 0.0717 4.35

H60

0.1888 0.4079 -0.0811 5.05

H61

0.2067 0.5022 -0.2185 4.06

H62

0.2074 0.6927 -0.2 3.35

H63

0.2413 0.8619 -0.095 3.35

H66

0.8000 0.1264 1.2272 3.43

H67

0.8947 0.3130 1.2438 4.38

H68

0.9388 0.3996 1.1065 4.95

H69

0.8844 0.3040 0.9512 4.65

H70

0,7817 0.1176 0.9303 3.92

H71

0.7565 -0.0519 1.1192 2.75

Los ejemplos de prueba siguientes se realizaron para examinar los efectos farmacologicos del compuesto (1). Ejemplo de prueba 1) Inhibicion de la migracion celular en un ensayo de quimiotaxis inducida por fractalcina (1) Metodo

5

10

15

20

25

30

35

Se examinaron los efectos inhibitorios de los compuestos ilustrativos sobre la migracion inducida por fractalcina utilizando celulas B300 en las que se transfecto CX3CR1.

Tras equilibrar la placa Transwell (agrupaciones de 24 pocillos, tamano de poro: 5 pm, fabricada por Corning Incorporated), se anadio una solucion de fractalcina (0.3 nM, fabricada por R&D Systems, Inc.) a los pocillos inferiores. Se colocaron celulas B300 que expresaban CX3CR1, las cuales se preincubaron con el compuesto de prueba (0.001, 0.003, 0.01 o 0.03 pM) durante 30 minutos, en los pocillos de la capa superior y a continuacion se incubaron en unas condiciones de un 5% de CO2 durante 3.5 horas a 37 °C. Se evaluo el numero de celulas que migraron hasta los pocillos inferiores utilizando CellTiter (fabricado por Promega Corporation).

La tasa de inhibicion del compuesto de prueba sobre la migracion de celulas inducida por fractalcina se calculo mediante la siguiente formula, donde [A] es el numero de celulas que migraron en presencia de tanto fractalcina como el compuesto de prueba, [B] es el numero de celulas que migraron en presencia de fractalcina y en ausencia del compuesto de prueba, y [C] es el numero de celulas que migraron en ausencia de tanto fractalcina como el compuesto de prueba; la concentracion de inhibicion del 50% (CI50) se calculo en funcion de la tasa de inhibicion.

Tasa de inhibicion (%) = [1-{(A-C)/(B-C)}] x 100

(2) Resultados

Como resultado del presente ejemplo de prueba, se descubrio que la CI50 del compuesto (1) era de 4 nM.

(Ejemplo de prueba 2) Mejora de la perdida de peso corporal en el modelo de colitis inducida por transferencia de linfocitos T

(1) Metodo

Utilizando ratones SCID con colitis inducida en los que se inyectaron celulas CD4(+), CD45RB(alto) aisladas de esplenocitos de ratones BALB/c, se evaluo la eficacia de los compuestos ilustrativos por cambios en el peso corporal. El experimento se realizo durante el transcurso de 31 dfas. El Dfa 1, se administraron por via intravenosa celulas CD4(+), CD45RB(alto) aisladas del bazo de ratones BALB/c (5 x 105 celulas/raton) a ratones SCID. Desde el Dfa 16 al 31, se administro el compuesto ilustrativo por via oral a los ratones SCID una vez al dfa, posteriormente se midieron los pesos corporales de todos los animales los Dfas 19, 22, 24, 26, 29 y 31.

La eficacia se evaluo por cambios en el peso corporal el Dfa 19, 22, 24, 26, 29 o 31. El cambio en el peso corporal (%) se determino mediante la formula que se muestra a continuacion, donde [A] es el peso corporal el Dfa 16 y [B] es el peso corporal cada dfa en el que se midio el peso corporal (Dfa 19, 22, 24, 26, 29 o 31).

Cambio en el peso corporal (%) = B/A x 100

(2) Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 6. La abscisa en las figuras indica el numero de dfas transcurridos, donde el dfa en el que se administraron las celulas CD4(+), CD45RB(alto) aisladas del bazo de ratones BALB/c (5 x 105 celulas/raton) por via intravenosa a ratones SCID es el Dfa 0.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una sal del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1-ilmetil)piperidin-4- il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico y un acido carboxflico organico.
2. 2. La sal de acuerdo con la reivindicacion 1, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L- mandelico.
3. 3. La sal de acuerdo con la reivindicacion 1, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L- lactico.
4. 4. Un cristal de la sal del acido 2-[(3S,4R)-1-{[2-cloro-6-(trifluorometil)fenil]metil}-3-{[1-(ciclohex-1-en-1- ilmetil)piperidin-4-il]carbamoil}-4-metilpirrolidin-3-il]acetico y un acido carboxflico organico.
5. 5. El cristal de acuerdo con la reivindicacion 4, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L- mandelico.
6. 6. El cristal de acuerdo con la reivindicacion 4, que se caracteriza por que el acido carboxflico organico es el acido L- lactico.
7. 7. El cristal de acuerdo con la reivindicacion 5, que se caracteriza por tener un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20 + 0.2°) de 7.2° en difractometna de rayos X en polvo medido con irradiacion de cobre; detector: contador de centelleo; voltaje del tubo: 50kV; corriente del tubo: 300mA; rendija: rendija de divergencia de 0.5mm, rendija de dispersion abierta, rendija receptora abierta; velocidad de barrido: 5°/min; intervalo de muestreo: 0.02; rango de barrido: 5°-35°; portamuestras hecho de aluminio.
8. 8. El cristal de acuerdo con la reivindicacion 7, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 14.4° y 15.7° en difractometna de rayos X en polvo.
9. 9. El cristal de acuerdo con la reivindicacion 8, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 10.3° y 23.5° en difractometna de rayos X en polvo.
10. 10. El cristal de acuerdo con la reivindicacion 9, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 12.9°, 14.9°, 17.2°, 20.1° y 24.7° en difractometna de rayos X en polvo.
11. 11. El cristal de acuerdo con la reivindicacion 5, que se caracteriza por tener picos en desplazamientos qmmicos (ppm) de 14.1, 52.9, 75.2, 144.7 y 174.0 en el espectro de RMN en estado solido de 13C.
12. 12. Un cristal (A) de acuerdo con la reivindicacion 6, que se caracteriza por tener un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20 + 0.2°) de 6.9° en difractometna de rayos X en polvo medido con irradiacion de cobre; detector: contador de centelleo; voltaje del tubo: 50kV; corriente del tubo: 300mA; rendija: rendija de divergencia de 0.5mm, rendija de dispersion abierta, rendija receptora abierta; velocidad de barrido: 5°/min; intervalo de muestreo: 0.02; rango de barrido: 5°-35°; portamuestras hecho de aluminio.
13. 13. El cristal (A) de acuerdo con la reivindicacion 12, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 15.7° y 17.1° en difractometna de rayos X en polvo.
14. 14. Un cristal (B) de acuerdo con la reivindicacion 6, que se caracteriza por tener un pico de difraccion a un angulo de difraccion (20 + 0.2°) de 6.8° en difractometna de rayos X en polvo medido con irradiacion de cobre; detector: contador de centelleo; voltaje del tubo: 50kV; corriente del tubo: 300mA; rendija: rendija de divergencia de 0.5mm, rendija de dispersion abierta, rendija receptora abierta; velocidad de barrido: 5°/min; intervalo de muestreo: 0.02; rango de barrido: 5°-35°; portamuestras hecho de aluminio.
15. 15. El cristal (B) de acuerdo con la reivindicacion 14, que se caracteriza por tener otros picos de difraccion a unos angulos de difraccion (20 + 0.2°) de 13.7° y 16.8° en difractometna de rayos X en polvo.