ES2640284T3 - Polipéptidos MT-SP1 mutantes - Google Patents
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Abstract
Una proteasa serina proteasa 1 de tipo de membrana (MT-SP1) muteína, que comprende al menos una mutación en un polipéptido MT-SP1 armazón, por lo que la especificidad de sustrato o actividad del polipéptido MT-SP1 muteína está aumentada en comparación con el polipéptido MT-SP1 armazón, donde: el polipéptido MT-SP1 armazón comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica o es idéntica a la secuencia de aminoácidos de un MT-SP1 de tipo silvestre cuya secuencia se expone en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o es una porción catalíticamente activa del mismo; y la MT-SP1 muteína comprende una mutación en una posición seleccionada entre las posiciones de aminoácido 41, 58, 59, 60b, 60c, 61, 62, 63, 97, 98, 100, 146, 151, 169, 170, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179, 181 y 224; y la numeración se basa en la numeración de la quimotripsina.
Description
El armazón de proteasa es la proteína MT-SP1 descrita más adelante en la Tabla 2.
- Código
- Nombre Gen Enlace Locus
- S01.087
- serina proteasa de tipo de membrana MT-SP1 84000 11q23
El polipéptido de MT-SP1 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 se proporciona en la Tabla 3 y se denomina TADG-15.
Tabla 3 Polipéptido MT-SP1 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1)
9
5 Prácticamente cada aspecto de una proteasa, incluyendo MT-SP1, se puede someter nuevamente a ingeniería genética, incluyendo la especificidad de secuencia sustrato, termoestabilidad, perfil de pH, eficacia catalítica, estabilidad oxidativa y función catalítica de la enzima.
La proteasa MT-SP1 de tipo silvestre se usa de acuerdo con los métodos de la invención como un armazón para
10 incorporar diversas mutaciones que cambian su especificidad de sustrato. Entre los determinantes de especificidad de secuencia sustrato en serina proteasas provienen de las posiciones S1-S4 en el sitio activo, donde la proteasa está en contacto con los restos P1-P4 de la secuencia sustrato peptídica. En algunos casos, existe poca (si existe alguna) interacción entre los bolsillos S1-S4 del sitio activo, de forma que cada bolsillo parece reconocer y unirse al resto correspondiente en la secuencia sustrato peptídica independiente de otros bolsillos. Por tanto, los
15 determinantes de especificidad generalmente se pueden cambiar en un bolsillo sin afectar la especificidad de los otros bolsillos.
Por ejemplo, una proteasa MT-SP1 con especificidad baja por un resto en un sitio de unión particular o por una secuencia particular se altera en su especificidad realizando mutaciones puntuales en el bolsillo de unión de 20 secuencia sustrato. En algunos casos, la muteína de MT-SP1 resultante tiene un aumento de más de 2 veces en la especificidad en un sitio o por una secuencia particular que el tipo silvestre. En otra realización, la muteína de MT-SP1 resultante tiene un aumento de más de 5 veces en la especificidad en un sitio o para una secuencia particular con respecto al tipo silvestre. En otra realización, la muteína de MT-SP1 resultante tiene un aumento de más de 10 veces en la especificidad en un sitio o para una secuencia particular con respecto al tipo silvestre. En otra
25 realización, la muteína de MT-SP1 resultante tiene un aumento de más de 100 veces en especificidad en un sitio o para una secuencia particular con respecto al tipo silvestre. En otra realización, la muteína de MT-SP1 resultante tiene un aumento de más de 1000 veces en la especificidad en un sitio o por una secuencia particular con respecto al tipo silvestre.
30 En una realización de este ejemplo, la especificidad se mide observando cuántas secuencias sustrato dispares escinden una proteasa de muteína a una actividad dada en comparación con el número en la proteasa de tipo silvestre. Si la proteasa de muteína escinde menos secuencias sustrato que el tipo silvestre, entonces la proteasa de muteína tiene una especificidad mayor que el tipo silvestre. Una muteína que tiene especificidad más de 10 veces mayor que una proteasa de tipo silvestre escinde 10 veces menos secuencias sustrato que la proteasa de tipo
35 silvestre.
La invención también contempla bibliotecas de armazones de MT-SP1 con diversas mutaciones que se generan y seleccionan usando métodos conocidos en la técnica y aquéllos detallados en el presente documento. Las bibliotecas se exploran para determinar la especificidad de secuencias sustrato de los miembros. Las bibliotecas de 40 armazones de MT-SP1 se ensayan para determinar la especificidad exponiendo los miembros a secuencias sustrato peptídicas. El miembro de MT-SP1 con las mutaciones que permite que el mismo escinda la secuencia sustrato se identifica. La biblioteca de armazón del MT-SP1 se construye con una diversidad de mutación suficiente en el armazón de forma que una diversidad de secuencias sustrato peptídicas se escinden por diversos miembros de la biblioteca de armazón de MT-SP1. Por tanto, se puede generar proteasas específicas para cualquier proteína diana.
45 En el presente documento se describen restos de proteasa particulares que, tras mutación, influyen sobre la actividad y especificidad de la proteasa de armazón de MT-SP1. MT-SP1 es una serina proteasa. Las serina proteasas son miembros de la misma familia que quimotripsina. En una realización de la invención, se generan muteínas de MT-SP1 con especificidad alterada mediante un enfoque de diseño en base a estructura. Cada
50 proteasa tiene una serie de aminoácidos que se alinea con el bolsillo de sitio activo y establece contacto directo con el sustrato. A través de la familia de quimotripsina, la interacción de la estructura principal entre el sustrato y la enzima se conserva completamente, pero las interacciones de cadena lateral varían considerablemente. La identidad de los aminoácidos que comprenden los bolsillos S1-S4 del sitio activo determina la especificidad de sustrato de ese bolsillo particular. El injerto de aminoácidos de una serina proteasa en otra del mismo pliegue
12
modifica la especificidad de una a la otra. Los restos de armazón de serina proteasa se identifican usando numeración de quimotripsina. Por ejemplo, una mutación en la posición 99 en el bolsillo S2 a un aminoácido más pequeño confiere una preferencia por restos hidrófobos más grandes en la posición de sustrato P2. Usando este proceso de mutagénesis selectiva, seguido por exploración de biblioteca de sustrato, se pueden generar e identificar
5 proteasas con especificidades de sustrato novedosas hacia proteínas implicadas en diversas enfermedades.
Los aminoácidos de la proteasa que comprenden los bolsillos S1-S4 son aquellos que tienen cadenas laterales dentro de 4 a 5 Angstroms del sustrato. Las interacciones que estos aminoácidos que tienen con el sustrato de proteasas generalmente se denominan interacciones de “primera capa” debido a que las mismas contactan
10 directamente el sustrato. También existen interacciones de “segunda capa” y “tercera capa” que posicionan en última instancia los aminoácidos de primera capa. La invención también contempla la mutación de esos aminoácidos que experimentan interacciones de segunda y tercera capa con el fin de cambiar la especificidad de índice d de reacción de la muteína de proteasa de la invención.
15 Los miembros de familia de quimotripsina comparten secuencia y homología estructural con quimotripsina. En base a la numeración de quimotripsina, los restos de sitio activo son Asp102, His57 y Ser 195. La secuencia de aminoácidos lineal se puede alinear con la de quimotripsina y numerar de acuerdo con las láminas de quimotripsina. Las inserciones y supresiones ocurren en los bucles entre las láminas beta, pero a través de la familia estructural, las láminas de núcleo están conservadas. Las serina proteasas interaccionan con un sustrato de una
20 manera de lámina conservada. Hasta 6 enlaces de hidrógeno conservados pueden ocurrir entre el sustrato y la enzima. Todas las serina proteasas de la familia de quimotripsina tienen una región conservada en su extremo N que es necesaria para la actividad catalítica. Es generalmente IIGG, WGG o IVGG (SEQ ID NO: 5, 6 y 7 respectivamente). Cuando el primer aminoácido en este cuarteto se enumera de acuerdo con la numeración de quimotripsina, se le asigna la denominación de Ile16. Esta numeración no refleja la longitud de la región precursora.
25 También, en una realización, las muteínas descritas en el presente documento están en el armazón de MT-SP1 de rata. En otra realización, las muteínas descritas en el presente documento están en el armazón humano. La numeración de quimotripsina y los restos a los que se hace referencia en el presente documento se aplican al armazón de MT-SP1 de rata y humano. Las muteínas tanto humanas como de rata se pueden preparar usando los sistemas de expresión de la invención. Los armazones de MT-SP1 aislados o clonados a partir de otras especies
30 también están incluidos dentro de la presente invención.
Los sitios de reconocimiento de sustrato de serina proteasa se marcan de acuerdo con el método de Schecter y
35 Berger Bioche. Biophys. Res. Commun. 27(1967) 157-162. Los marcadores aumentan el número de P1, P2…. Pn para los aminoácidos sustrato N terminales al enlace escindible y P1’, P2’, …. Pn’ para los aminoácidos sustrato C terminales al enlace escindible. Los bolsillos de reconocimiento de sustrato correspondientes en la enzima se marcan, Sn….S2, S1, S1’, S2’… Sn’. Por tanto, P2 interacciona con S2, P1 con S1, P1’ con S1’, etc. Los aminoácidos en el armazón de MT-SP1 se enumeran de acuerdo con su alineación con la quimotripsina de serina
40 proteasa. Véase, Blow, D. M. (1976) Acc. Chem. Res. 9, 145-152.
Para serina proteasas, los siguientes aminoácidos en la secuencia primaria son determinantes de especificidad: 195, 102, 58 (la triada catalítica); 189, 190, 191, 192 y 226 (P1); 57, el bucle entre 58 y 64 y 99 (P2); 192, 217, 218 (P3), el bucle entre Cys 168 y Cys182, 215 y 97 a 100 (P4). La posición 189 en una serina proteasa es un resto internado 45 en el fondo del bolsillo que determina la especificidad de P1. Para preparar una proteasa variante con un perfil de reconocimiento de sustrato alterado, los aminoácidos en la estructura tridimensional que contribuyen a la selectividad del sustrato (determinantes de especificidad) se dirigen para mutagénesis. Para las serina proteasas, numerosas estructuras de miembros de familia han definido los restos de superficie que contribuyen a la especificidad de sustrato extendida (Wang et al., Biochemistry 28 de agosto de 2001 Agosto; 40(34): 10038-46;
50 Hopfner et al., Structure Fold Des. 1999 Agost 15; 7(8): 989-96; Friedrich et al., J Biol Chem. 2002 Jan 18; 277(3): 2160-8; Waugh et al., Nat Struct Biol. 2000 Sep; 7(9): 762-5).
Los determinantes estructurales de MT-SP1 se enumeran en la Tabla 7 siguiendo la numeración de quimotripsina. El número debajo de Cys168-Cys182 y los encabezados de columnas de bucle de 60 indican el número de
55 aminoácidos en el bucle entre los dos aminoácidos. La denominación sí/no debajo del encabezado de la columna Cys191-Cys220 indica si el puente disulfuro está presente en esta proteasa. Estas regiones son variables dentro de la familia de serina proteasas similares a quimotripsina y representan determinantes estructurales en las mismas.
13
14
- CB0043
- Y146A CB0153 F99V/M180e
- CB0044
- Y146w CB0154 F99V/Y146D
- CB0045
- Y146R CB0155 Y146D/K224F
- CB0046
- L172A CB0156 Y146D/M180E
- CB0047
- L172V CB0157 Y146D/L172D/Q175D
- CB0048
- L172F CB0158 F99V/Y146D/L172D/Q175D
- CB0049
- L172R CB0159 F99I/L172D/Q175D
- CB0050
- Q175A CB0160 F99L/L172D/Q175D
- CB0051
- Q175V CB0161 F99T/L172d/Q175D
- CB0052
- Q175F CB0162 F99A/L172D/Q175D
- CB0053
- Q175R CB0173 F99I/K224F
- CB0054
- D217E CB0174 F99L/K224F
- CB0055
- D217F CB0175 F99T/K224F
- CB0056
- W215F CB0176 F99V/Y146D/K224F
- CB0057
- W215Y CB0177 F99I/Y146D/K224F
- CB0058
- W215I CB0178 F99L/Y146D/K224F
- CB0059
- W215D CB0179 F99T/YI46D/K224F
- CB0060
- W215R
En la Tabla 11, se identifican mutaciones usando el sistema de numeración de quimotripsina. Por tanto, W215Y significa que un triptófano en la posición 215 de MT-SP1 de acuerdo con el sistema de numeración de quimotripsina se cambia a una tirosina en esa posición.
5 En cualquier realización dada, un polipéptido de MT-SP1 mutado (“muteína”) puede contener una mutación única por polipéptido o puede contener dos o más restos mutados por polipéptido, en cualquier combinación. Los reemplazos ilustrativos de restos de tipo silvestre se proporcionan en la Tabla 10. En una realización ilustrativa, un resto de Leu en la posición 172 se reemplaza con un resto de Asp, donde la muteína se denomina L172D. En otra
10 realización ilustrativa, un resto de Asp60b se reemplaza por uno de Ala, Arg, Ile o Phe. En una realización ilustrativa adicional una MT-SP1 variante incluye al menos uno de Y146F, L172D, N175D y D217F y puede contener dos, tres, cuatro o más reemplazos de tales residuos.
15 En una realización, la proteasa se expresa en una forma activa. En otra realización, la proteasa se expresa en una forma inactiva de zimógeno. En una realización, la proteasa se expresa mediante un sistema de expresión heterólogo tal como un sistema de expresión de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae o baculovirus. En una realización preferida, la proteasa se expresa en un sistema de expresión de cultivo de células de mamífero. Los
20 cultivos de mamífero ilustrativos se obtienen a partir de células de rata, ratón o preferentemente humanas. La proteína se puede expresar en un entorno intracelular o excretarse (secretarse) en el medio. La proteasa también se puede expresar en un sistema de expresión in vitro.
Para purificar proteasas de MT-SP1 variantes, se puede usar cromatografía en columna. La proteasa se puede
25 someter a ingeniería genética para contener una etiqueta 6-His para purificación en una columna de Níquel. Dependiendo del pI de la proteasa, se puede usar una columna de intercambio catiónico o aniónico en el método de purificación para la proteasa. La purificación también se puede conseguir a través de inmunoabsorción, filtración en gel o cualquier otro método de purificación usado en la técnica. La proteasa se puede almacenar en un tampón de pH bajo que minimiza su actividad catalítica de forma que la misma no se degrade así misma. Esto se ilustra
30 adicionalmente en el Ejemplo 2.
Síntesis de bibliotecas para caracterización de muteínas de MT-SP1
Los expertos en la materia reconocerán que se pueden usar muchos métodos para preparar los péptidos y las 35 bibliotecas de la invención. Las realizaciones adecuadas se ilustran adicionalmente en el Ejemplo 3.
Determinación de cambios de cambios de especificidad para muteínas de MT-SP1
Los aminoácidos esenciales en las muteínas de MT-SP1 generada usadas los métodos descritos en el presente
40 documento se identifican de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de saturación de restos de sitio activo o se divulgan en el presente documento. En una técnica, los restos que forman los bolsillos S1-S4 que se ha demostrado que son determinantes importantes de especificidad se mutan a cada aminoácido posible, solos o en combinación. Véase, por ejemplo, Legendre, et al., JMB (2000) 296: 87-102. Las especificidades de sustrato de los mutantes resultantes se determinarán usando bibliotecas de
45 exploración posicional ACC y mediante ensayos cinéticos de sustrato único. Véase, por ejemplo, Harris, et al. PNAS, 2000, 97: 7754-7759.
17
Se realizan múltiples sustituciones de aminoácidos y se ensayan usando métodos conocidos de mutagénesis y exploración, tales como los que se divulgan en el presente documento o los ya conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson y Sauer 1988 Science 241: 53-57 o Bowie y Sauer 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156. En resumen, estos autores divulgan métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en 5 un polipéptido, seleccionar polipéptido funcional y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permitibles en cada posición. Otros métodos que se pueden usar incluyen métodos en base a presentación en fago (por ejemplo, Legendre et al., JMB 2000: 296: 87-102; Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Huse, Publicación PCT WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Los métodos de mutagénesis como se divulgan anteriormente se pueden combinar con métodos de exploración de alto rendimiento automatizados para detectar la actividad de polipéptidos clonados mutagenizados en células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican proteínas proteolíticamente activas o precursores de las mismas se recuperan a partir de las células hospedadoras y se secuencian rápidamente usando
15 equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de restos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.
En una realización, se usa presentación en fago de proteasa para explorar las bibliotecas de proteasas mutantes de la invención para determinar afinidades diversas a secuencias sustrato específicas como se describe en la técnica. Véase, por ejemplo, Legendre et al., JMB, 2000: 296: 87-102 y Corey et al., Gene, 1993 Jun 15; 128(1): 129-34.
En el presente documento también se describen métodos para detectar y cuantificar una proteasa enzimáticamente activa de la invención. El método incluye: (a) poner en contacto una muestra con una proteasa, de una manera tal que el resto fluorogénico se libera de la secuencia sustrato peptídica tras la acción de la proteasa, produciendo de
25 ese modo un resto fluorescente; y (b) observar si la muestra experimenta un cambio detectable en fluorescencia, siendo el cambio detectable un indicio de la presencia de la proteasa enzimáticamente activa de la muestra.
En una realización, estos métodos se usan para seleccionar una muteína de MT-SP1 que escinde específicamente una secuencia diana en VEGF o VEGFR y preferentemente para una proteasa enzimáticamente activa. En otra realización, estos métodos se usan para determinar la especificidad de secuencia de una muteína de MT-SP1. Los métodos adecuados para determinar especificidad de muteína de MT-SP1 se ilustran adicionalmente en los Ejemplos 3-5.
Los métodos ilustrados en los Ejemplos 1-5 se pueden repetir de forma iterativa o en paralelo para crear una
35 proteasa variante que tiene la especificidad y selectividad deseada en cada uno de los subsitios de unión extendidos, P2, P3 y P4. En algunos casos, las mutaciones en serina proteasas han demostrado que cada uno de los subsitios que forman el sitio activo (S1-S4) funcionan independientemente los unos de los otros, de forma que la modificación de especificidad en un subsitio tiene poca influencia sobre la especificidad en subsitios adyacentes. Por tanto, la ingeniería genética de especificidad de sustrato y selectividad a través del sitio de unión extendido se puede conseguir de una manera gradual.
Las proteasas mutantes que coinciden con los perfiles de especificidad deseados, determinados mediante bibliotecas de sustrato, después se ensayan usando sustratos peptídicos individuales que corresponden a la secuencia de escisión deseada. Las proteasas variantes también se ensayan para determinar que ellas escindirán la
45 secuencia deseada cuando se presente en el contexto de proteínas de longitud completa. La actividad de la proteína diana también se ensaya para verificar que su función se ha destruido mediante el acontecimiento de escisión. El acontecimiento de escisión se supervisa mediante SDS-PAGE después de incubar la proteína de longitud completa purificada con la proteasa variante. En otra realización, las mutaciones se combinan para adquirir la especificidad de múltiples proteasas. Una mutación en un resto de un armazón, que produce especificidad en un sitio, se combina en la misma proteasa con otra mutación en otro sitio en el armazón para preparar una proteasa de especificidad combinada.
Se puede usar cualquier número de mutaciones en sitios específicos en el mismo armazón para crear una proteasa de especificidad combinada. En una realización, el armazón de MT-SP1 comprende un polipéptido que tiene una
55 identidad del 95 % con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de MT-SP1 de SEQ ID NO: 1 y el polipéptido tiene al menos una mutación en una o más de las posiciones 171, 174, 180, 215, 192, 218, 99, 57, 189, 190, 226, 146, 172, 175, 41, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 97, 98, 100, 102, 151, 169, 170, 171A, 173, 176, 177, 178, 179, 181, 191, 195 o 224 o 217, donde la numeración es para quimotripsina.
Estos sitios pertenecen a los siguientes bolsillos S:
S1’: 146, 151, S1: 189, 190, 226, 191, 195 S2: 99, 41, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 97, 98, 100, 102
65 S3: 192, 218, 146 S4: 171, 174, 179, 180, 215, 99,172, 175, 97. 98,169, 170, 171A, 173, 176, 177, 178, 181, 224, 217
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CA2562729C (en) * | 2004-04-12 | 2013-11-12 | Sandra Waugh Ruggles | Cleavage of vegf and vegf receptor by wildtype and mutant mt-sp1 |
KR101393946B1 (ko) * | 2005-10-21 | 2014-05-12 | 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 보체 활성화를 억제하는 변형된 프로테아제 |
WO2007149406A2 (en) | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Nautilus Technology Llc | Modified coagulation factor ix polypeptides and use thereof for treatment |
KR101778174B1 (ko) * | 2006-07-05 | 2017-09-13 | 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제 |
AT504159A1 (de) * | 2006-08-16 | 2008-03-15 | Marlyn Nutraceuticals Inc | Verwendung von proteasen |
SG174077A1 (en) * | 2007-04-13 | 2011-09-29 | Catalyst Biosciences Inc | Modified factor vii polypetides and uses thereof |
TWI465247B (zh) * | 2008-04-11 | 2014-12-21 | Catalyst Biosciences Inc | 經修飾的因子vii多肽和其用途 |
TWI557135B (zh) | 2010-11-03 | 2016-11-11 | 介控生化科技公司 | 經修飾之第九因子多胜肽及其用途 |
BR112014008863A2 (pt) * | 2011-10-14 | 2019-08-20 | Genentech Inc | peptídeo ativador de zimogene (zap) isolado, fusão de zap, métodos |
MX365612B (es) | 2012-07-25 | 2019-06-07 | Catalyst Biosciences Inc | Polipeptidos de factor x modificados y usos de los mismos. |
CN107135653A (zh) * | 2014-10-01 | 2017-09-05 | 安迅生物制药公司 | 大肠杆菌素变体 |
EP3546574A4 (en) | 2016-11-28 | 2020-09-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | ANTIGEN AND POLYPEPTIDE BINDING AREA INCLUDING A TRANSPORT SECTION |
US10781435B2 (en) | 2017-06-22 | 2020-09-22 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified membrane type serine protease 1 (MTSP-1) polypeptides and methods of use |
WO2020109343A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy for treatment of macular degeneration |
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US20210069306A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-03-11 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment |
Family Cites Families (80)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1541435A (en) | 1975-02-04 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
US4046784A (en) | 1975-04-04 | 1977-09-06 | Texaco Development Corporation | Boride catalyst for epoxidizing olefinic compounds |
US4361544A (en) | 1980-03-03 | 1982-11-30 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers |
US4444744A (en) | 1980-03-03 | 1984-04-24 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens |
US4331647A (en) | 1980-03-03 | 1982-05-25 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers |
US4460561A (en) | 1980-03-03 | 1984-07-17 | Goldenberg M David | Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers |
US4348376A (en) | 1980-03-03 | 1982-09-07 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled anti-CEA antibody |
US4468457A (en) | 1981-06-01 | 1984-08-28 | David M. Goldenberg | Method for producing a CSAp tryptic peptide and anti-CSAp antibodies |
US4671958A (en) | 1982-03-09 | 1987-06-09 | Cytogen Corporation | Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites |
US4818709A (en) | 1983-01-21 | 1989-04-04 | Primus Frederick J | CEA-family antigens, Anti-CEA antibodies and CEA immunoassay |
US4460459A (en) | 1983-02-16 | 1984-07-17 | Anschutz Mining Corporation | Sequential flotation of sulfide ores |
US4624846A (en) | 1983-07-29 | 1986-11-25 | Immunomedics, Inc. | Method for enhancing target specificity of antibody localization and clearance of non-target diagnostic and therapeutic principles |
US4932412A (en) | 1986-12-18 | 1990-06-12 | Immunomedics, Inc. | Intraoperative and endoscopic tumor detection and therapy |
US5541297A (en) | 1988-04-01 | 1996-07-30 | Immunomedics, Inc. | Therapeutic conjugates of toxins and drugs |
US4925648A (en) | 1988-07-29 | 1990-05-15 | Immunomedics, Inc. | Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5332567A (en) | 1989-08-24 | 1994-07-26 | Immunomedics | Detection and treatment of infections with immunoconjugates |
NL8902454A (nl) | 1989-10-03 | 1991-05-01 | Stichting Centraal Lab | Mutanten van de humane plasminogeen activator inhibitor 1 (pai-1), hun bereiding en toepassing, en recombinante polynucleotiden die voor deze mutanten coderende genetische informatie omvatten. |
US6271012B1 (en) * | 1989-10-11 | 2001-08-07 | Genencor International, Inc. | Protease muteins and their use in detergents |
KR0162259B1 (ko) | 1989-12-05 | 1998-12-01 | 아미 펙터 | 감염성 병변 및 염증성 병변을 검출 및 치료하기 위한 키메라 항체 |
IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
WO1994026297A1 (en) | 1993-05-17 | 1994-11-24 | Immunomedics, Inc. | Improved detection and therapy of lesions with biotin/avidin-metal chelating protein conjugates |
US5443953A (en) | 1993-12-08 | 1995-08-22 | Immunomedics, Inc. | Preparation and use of immunoconjugates |
US6335160B1 (en) * | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US5686578A (en) | 1994-08-05 | 1997-11-11 | Immunomedics, Inc. | Polyspecific immunoconjugates and antibody composites for targeting the multidrug resistant phenotype |
AU3272695A (en) | 1994-08-12 | 1996-03-07 | Immunomedics Inc. | Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells |
GB9618960D0 (en) * | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Medical Science Sys Inc | Proteases |
US7083786B2 (en) * | 1997-04-03 | 2006-08-01 | Jensenius Jens Chr | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
WO1999009206A1 (en) | 1997-08-18 | 1999-02-25 | Center For Blood Research, Inc. | Methods for using granzymes and binding molecules thereof for treating diseases characterized by abnormal apoptosis |
DE19743683A1 (de) * | 1997-10-02 | 1999-04-08 | Basf Ag | Verfahren zur Änderung der Substratspezifität von Enzymen |
US7022821B1 (en) * | 1998-02-20 | 2006-04-04 | O'brien Timothy J | Antibody kit for the detection of TADG-15 protein |
US5972616A (en) | 1998-02-20 | 1999-10-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | TADG-15: an extracellular serine protease overexpressed in breast and ovarian carcinomas |
EP1161266A4 (en) | 1999-03-12 | 2007-09-19 | Univ Georgetown | MATRIPTASE, SERINE PROTEASE, AND USE THEREOF |
US20030186329A1 (en) | 1999-03-22 | 2003-10-02 | The Scripps Research Institute | Use of substrate subtraction libraries to distinguish enzyme specificities |
WO2000068247A2 (en) | 1999-05-07 | 2000-11-16 | Human Genome Sciences, Inc. | Serine proteases |
US20020068320A1 (en) * | 2000-03-14 | 2002-06-06 | Yanggu Shi | Serine protease polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
DE19943177C2 (de) * | 1999-09-09 | 2002-10-24 | Dieter Jenne | Verfahren zur Herstellung von aktiven Serienproteasen und inaktiven Varianten |
US7030231B1 (en) * | 1999-09-30 | 2006-04-18 | Catalyst Biosciences, Inc. | Membrane type serine protease 1 (MT-SP1) and uses thereof |
US7700341B2 (en) * | 2000-02-03 | 2010-04-20 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon |
ATE496123T1 (de) | 2000-02-03 | 2011-02-15 | Dendreon Corp | Nukleinsäuren, welche für tramsmembran serin proteasen kodieren, die kodierten proteine und darauf basierende methoden |
EP1282727A1 (en) * | 2000-02-25 | 2003-02-12 | Biofocus Discovery Limited | Methods for identifying candidate polynucleotide molecules encoding a protease |
US20020031801A1 (en) * | 2000-03-24 | 2002-03-14 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 18806, a novel trypsin serine protease-like molecule and uses thereof |
US6680178B2 (en) * | 2000-06-02 | 2004-01-20 | The Regents Of The University Of California | Profiling of protease specificity using combinatorial fluorogenic substrate libraries |
WO2001097794A2 (en) | 2000-06-21 | 2001-12-27 | Georgetown University | Inhibitors of matriptase for the treatment of cancer |
WO2002008392A2 (en) | 2000-07-25 | 2002-01-31 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human matriptase-like serine protease |
US7157596B2 (en) * | 2000-09-08 | 2007-01-02 | Dendreon Corporation | Inhibitors of serine protease activity of matriptase or MTSP1 |
DE10045496A1 (de) * | 2000-09-14 | 2002-03-28 | Degussa | Neue für das ptsi-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
US20030068792A1 (en) * | 2000-12-14 | 2003-04-10 | Yiyou Chen | Targeted enzymes |
US20030049689A1 (en) * | 2000-12-14 | 2003-03-13 | Cynthia Edwards | Multifunctional polypeptides |
AU2002315525A1 (en) | 2001-07-03 | 2003-01-21 | Dendreon San Diego Llc | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 20, the encoded polypeptides and methods based thereon |
JP2004535202A (ja) | 2001-07-17 | 2004-11-25 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | アポトーシス促進性蛋白質を含む治療剤 |
WO2003031585A2 (en) | 2001-10-09 | 2003-04-17 | Dendreon Corporation | Transmembrane serine protease 25 |
AU2002357004A1 (en) | 2001-11-20 | 2003-06-10 | Dendreon San Diego Llc | Nucleic acid molecules encoding serine protease 17, the encoded polypeptides and methods based thereon |
EP1499733B1 (en) * | 2002-04-22 | 2010-03-10 | Novozymes, Inc. | Methods for preparing variants of a dna sequence in filamentous fungi |
EP1361284A1 (en) | 2002-05-10 | 2003-11-12 | Direvo Biotech AG | Process for generating sequence-specific proteases by directed evolution and use thereof |
US20040072276A1 (en) * | 2002-05-10 | 2004-04-15 | Direvo BioTech AG. | Process for generating sequence-specific proteases by directed evolution and use thereof |
US20040001801A1 (en) | 2002-05-23 | 2004-01-01 | Corvas International, Inc. | Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof |
WO2004005471A2 (en) | 2002-07-02 | 2004-01-15 | Dendreon Corporation | Serine protease 16 |
US7479270B2 (en) * | 2002-07-23 | 2009-01-20 | Vegenics Limited | Methods and compositions for activating VEGF-D and VEGF-C |
WO2004019878A2 (en) * | 2002-08-27 | 2004-03-11 | Compound Therapeutics, Inc. | Adzymes and uses thereof |
US20060024289A1 (en) * | 2002-10-02 | 2006-02-02 | Ruggles Sandra W | Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wild-type and mutant proteases |
US7939304B2 (en) * | 2002-10-02 | 2011-05-10 | Catalyst Biosciences, Inc. | Mutant MT-SP1 proteases with altered substrate specificity or activity |
CN101124484A (zh) * | 2002-10-02 | 2008-02-13 | 催化剂生物科学有限公司 | 制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法 |
US20040115727A1 (en) * | 2002-12-11 | 2004-06-17 | Allergan, Inc., A Corporation | Evolved clostridial toxins with altered protease specificity |
EP1633866A1 (en) | 2003-06-18 | 2006-03-15 | Direvo Biotech AG | New biological entities and the pharmaceutical or diagnostic use thereof |
ATE526399T1 (de) * | 2003-06-18 | 2011-10-15 | Bayer Pharma AG | Neue biologische einheiten und deren verwendung |
US7439226B2 (en) * | 2003-09-30 | 2008-10-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Serine protease inhibitors |
EP1735438A2 (en) | 2004-04-12 | 2006-12-27 | Catalyst Biosciences | Cleavage of vegf and vegf receptor by wild-type and mutant proteases |
CA2562729C (en) | 2004-04-12 | 2013-11-12 | Sandra Waugh Ruggles | Cleavage of vegf and vegf receptor by wildtype and mutant mt-sp1 |
US20060029590A1 (en) | 2004-06-10 | 2006-02-09 | Christopher Thanos | Administration of neutral endopeptidase to treat inflammatory bowel disease |
EP1827486A2 (en) | 2004-12-22 | 2007-09-05 | Direvo Biotech AG | Targeted use of engineered enzymes |
EP1726643A1 (en) | 2005-05-27 | 2006-11-29 | Direvo Biotech AG | Method for the provision, identification and selection of proteases with altered sensitivity to activity-modulating substances |
KR101393946B1 (ko) * | 2005-10-21 | 2014-05-12 | 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 보체 활성화를 억제하는 변형된 프로테아제 |
CN101374856A (zh) * | 2005-11-29 | 2009-02-25 | 斯克里普斯研究学院 | 抑制肿瘤细胞浸润、转移和血管生成 |
WO2007149406A2 (en) * | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Nautilus Technology Llc | Modified coagulation factor ix polypeptides and use thereof for treatment |
KR101778174B1 (ko) | 2006-07-05 | 2017-09-13 | 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제 |
SG174077A1 (en) | 2007-04-13 | 2011-09-29 | Catalyst Biosciences Inc | Modified factor vii polypetides and uses thereof |
TWI465247B (zh) | 2008-04-11 | 2014-12-21 | Catalyst Biosciences Inc | 經修飾的因子vii多肽和其用途 |
TWI557135B (zh) | 2010-11-03 | 2016-11-11 | 介控生化科技公司 | 經修飾之第九因子多胜肽及其用途 |
MX365612B (es) | 2012-07-25 | 2019-06-07 | Catalyst Biosciences Inc | Polipeptidos de factor x modificados y usos de los mismos. |
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