ES2639542T3 - Métodos para analizar una muestra en presencia de interferentes - Google Patents

Abstract

Un método para reducir el efecto de interferente en un ensayo para la concentración de analito, que comprende: (a) introducir una muestra fisiológica en una célula electroquímica (61), comprendiendo la célula electroquímica: (i) electrodos primero y segundo (166, 164) en una relación de separación; y (ii) un primer reactivo (72), comprendiendo el reactivo un mediador y una enzima; (b) aplicar un primer potencial de ensayo que tiene una primera polaridad a la célula y medir la corriente de la célula para obtener un primer valor de intensidad de pico; (c) aplicar un segundo potencial de ensayo que tiene una segunda polaridad y una corriente de célula de medición para obtener un segundo valor de corriente máxima, en el que la primera polaridad es opuesta a la segunda polaridad; (d) calcular un factor de corrección de interferencia basado en el primero y segundo valores de la corriente de pico, en el que el factor de corrección de interferencia se usa para reducir la influencia de los interferentes en un cálculo de concentración de glucosa.

Description

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Metodos para analizar una muestra en presencia de interferentes DESCRIPCION

Antecedentes de la invencion

Las tiras de ensayo de glucosa electroqmmicas, tales como las usadas en el kit de analisis de sangre entera OneTouch® Ultra®, que esta disponible en LifeScan, Inc., estan disenadas para medir la concentracion de glucosa en una muestra de sangre de pacientes con diabetes. La medicion de la glucosa se basa en la oxidacion espedfica de la glucosa por la flavoenzima glucosa oxidasa (GOx(0x)). Durante esta reaccion, la enzima se reduce, indicado como (GOx(red)). La enzima se vuelve a oxidar mediante la reaccion con el mediador oxidado ferricianuro (Fe(CN)63-), que se reduce durante el curso de la reaccion. Estas reacciones se resumen a continuacion.

D-Glucosa + GOx(ox) ^ Acido gluconico + GOx(red)

GOx(red) + 2 Fe(CN)63- ^ GOx(ox) + 2 Fe(CN)a4-

Cuando la reaccion expuesta anteriormente se realiza con un potencial de ensayo aplicado entre dos electrodos, se puede crear una corriente de electrica por la reoxidacion electroqmmica del mediador reducido (ferrocianuro o Fe(CN)64-) en la superficie del electrodo. De esta manera, como en un entorno ideal, la cantidad de ferricianuro creada durante la reaccion qmmica descrita anteriormente es directamente proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra situada entre los electrodos, la corriente generada sena proporcional al contenido de glucosa de la muestra. Un mediador, tal como el ferricianuro, es un compuesto que intercambia electrones entre una enzima redox, tal como glucosa oxidasa, y un electrodo. En un tipo diferente de tira de ensayo de glucosa, se puede usar la enzima glucosa deshidrogenasa usando un cofactor de pirroloquinolina quinona (PQQ) en lugar de glucosa oxidasa. A medida que se incrementa la concentracion de glucosa, la cantidad de mediador reducido que se forma tambien se incrementa, por tanto, hay una relacion directa entre la corriente de glucosa y la corriente resultante de la reoxidacion del mediador reducido. En particular, la transferencia de electrones a traves de la interfase electrica da lugar a un flujo de corriente (2 moles de electrones por cada mol de glucosa que se oxida). La corriente resultante de la introduccion de glucosa puede, por lo tanto, denominarse corriente de analito o, mas particularmente, corriente de glucosa.

Debido a que el control de los niveles de glucosa en la sangre es una herramienta importante en el tratamiento de enfermedades como la diabetes, los medidores de ensayo que usan los principios expuestos anteriormente se han hecho muy populares. La corriente de glucosa generada durante una prueba es registrada por el medidor de ensayo y se convierte en una lectura de la concentracion de glucosa usando un algoritmo predeterminado que relaciona la corriente con una concentracion de glucosa por medio de una formula matematica sencilla. En general, los medidores de ensayo funcionan junto con una tira de ensayo desechable que incluye una camara de recepcion de la muestra y al menos electrodos y un reactivo. Durante el uso, el usuario deposita una pequena muestra de sangre en la camara de reaccion de la muestra, que analiza el medidor de ensayo para proporcionar al usuario un nivel de azucar en sangre.

En terminos electroqmmicos, la funcion del medidor de ensayo es doble. Primero, proporciona un potencial polarizante de ensayo (por ejemplo, 0,4 V) que polariza la interfase electrica y permite el flujo de una corriente celular entre dos la superficies de del electrodo de trabajo. En segundo lugar, el medidor de ensayo puede medir la corriente celular. Por lo tanto, puede considerarse que el medidor de ensayo es un sistema electroqmmico simple que funciona en modo de dos electrodos aunque, en la practica, puede usarse un tercero o incluso un cuarto electrodo para facilitar la medicion de la glucosa y/o llevar a cabo otras funciones del medidor del ensayo.

En la mayona de las situaciones, se considera que las ecuaciones expuestas anteriormente son una aproximacion suficiente de la reaccion qmmica que tiene lugar en la tira de ensayo, de modo que se obtiene una representacion razonablemente exacta de la concentracion de glucosa. Sin embargo, en ciertas circunstancias y para ciertos fines, puede ser ventajoso mejorar la precision de la medicion, por ejemplo, cuando una parte de la corriente medida en el electrodo es el resultado de la presencia de otros productos qmmicos o compuestos en la muestra. Cuando tales compuestos o compuestos qmmicos adicionales estan presentes, pueden denominarse interferentes y la corriente adicional resultante puede denominarse corriente interferente.

Ejemplos de potenciales interferentes (es decir, compuestos que se encuentran en fluidos fisiologicos, como la sangre, pueden generar una corriente de interferencia en presencia de un potencial ensayo) incluyen ascorbato, urato y acetaminofen (Tylenol™ o Paracetamol). Un primer mecanismo para generar una corriente de interferencia en un medidor de ensayo implica la oxidacion de uno o mas compuestos interferentes mediante la reduccion del mediador (por ejemplo, ferricianuro). A su vez, el mediador reducido resultante puede oxidarse despues en el electrodo de trabajo. Este primer mecanismo tambien puede denominarse corriente interferente indirecta. Un segundo mecanismo para generar una corriente interferente en un medidor de ensayo implica la oxidacion de uno o mas interferentes en el electrodo de trabajo. El segundo mecanismo puede denominarse corriente interferente directa. Por lo tanto, la corriente celular medida incluye contribuciones no deseadas de los interferentes.

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Una estrategia que puede usarse para disminuir el efecto interferente es usar un segundo electrodo de trabajo junto con un primer electrodo de trabajo y un electrodo de referencia. Si el segundo electrodo de trabajo esta desnudo, el segundo electrodo de trabajo puede medir una corriente interferente directa. El primer electrodo de trabajo debe tener una enzima y un mediador para medir una corriente que incluye la suma de una corriente de glucosa, una corriente interferente directa y una corriente interferente indirecta. La corriente interferente directa medida en el segundo electrodo de trabajo puede restarse de la corriente en el primer electrodo de trabajo para reducir el efecto de los interferentes.

Como alternativa, o adicionalmente, el segundo (o tercero) electrodo de trabajo puede recubrirse con un mediador (pero no una enzima) para permitir que el segundo electrodo de trabajo mida una corriente que incluya una suma de la corriente interferente directa e indirecta (pero no glucosa). En este caso, la corriente interferente directa e indirecta medida en el segundo electrodo de trabajo puede restarse de la corriente en el primer electrodo de trabajo para reducir el efecto de los interferentes.

Una desventaja del uso de un segundo (o tercero) electrodo de trabajo para compensar los efectos de los interferentes es que el segundo electrodo de trabajo aumenta de forma incremental el volumen de la camara de reaccion de la muestra y es preferente que la camara de reaccion de la muestra sea pequena para que los usuarios no tengan que proporcionar una muestra de sangre grande. Una desventaja adicional del uso de un segundo electrodo de trabajo es que aumenta el coste de fabricacion y la complejidad. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar metodos para medir la glucosa independientemente de los interferentes usando solamente dos electrodos.

Sumario

De acuerdo con la presente invencion se proporciona un metodo como se define en las reivindicaciones 1 y 12.

Breve descripcion de los dibujos

Las nuevas caractensticas de la invencion se exponen, en particular, en las reivindicaciones adjuntas. Puede obtenerse una mejor comprension de las caractensticas y ventajas de la presente invencion por referencia a la siguiente descripcion detallada que expone formas de realizacion ilustrativas, en las que se usan los principios de la invencion y sus figuras adjuntas.

La figura 1A ilustra una vista en perspectiva de una tira de ensayo montada adecuada para su uso en los metodos divulgados en el presente documento;

La figura 1B ilustra una vista en perspectiva en despiece ordenado de una tira de ensayo no montada adecuada para su uso en los metodos divulgados en el presente documento;

La figura 1C ilustra una vista en perspectiva ampliada de una parte proximal de la tira de ensayo adecuada para su uso en los metodos divulgados en el presente documento;

La figura 2 es una vista en planta desde abajo de una realizacion de una tira de ensayo divulgada en el presente documento;

La figura 3 es una vista en planta lateral de la tira de ensayo de la figura 2;

la figura 4A es una vista en planta desde arriba de la tira de prueba de la Figura 3;

la figura 4B es una vista lateral parcial de una parte proximal de la tira de ensayo de la figura 4A:

La figura 5 es un esquema simplificado que muestra un medidor de ensayo que se conecta electricamente con partes de una tira de ensayo divulgada en el presente documento;

la figura 6 muestra un ejemplo de una forma de onda de potencial en la que un medidor de ensayo aplica un potencial de circuito abierto y una pluralidad de potenciales de ensayo para intervalos de tiempo prescritos; la figura 7 muestra una primera y un segundo transitorio de corriente generado analizando una muestra fisiologica que contiene 62 mg / dl de concentracion de glucosa sin interferentes anadidos (lmea continua) y con una concentracion de ascorbato de 20 mg / dl (lmea discontinua);

la figura 8 es una vista ampliada de la figura 7 que muestra un primer transitorio de corriente;

la figura 9 es una representacion grafica de un gradiente de concentracion de mediador reducido dentro de una

camara de reaccion de la muestra;

la figura 10 es un grafico que muestra el % de perturbacion del gradiente de mediador reducido en el primer electrodo como una funcion del segundo intervalo de tiempo de circuito abierto;

la figura 11 es un grafico que muestra la polarizacion absoluta de los resultados de glucosa para un primer algoritmo de glucosa y un segundo algoritmo de glucosa;

la figura 12 es un grafico que muestra el sesgo absoluto de los resultados de glucosa para un primer algoritmo de glucosa y un tercer algoritmo de glucosa; y

la figura 13 muestra un sesgo absoluto para la concentracion de hemoglobina en presencia de un interferente particular usando un primer algoritmo de hemoglobina y un segundo algoritmo de hemoglobina.

Descripcion detallada de realizaciones ilustrativas de la invencion

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Los metodos y dispositivos objeto son adecuados para usar en la determinacion de una amplia variedad de muestras y son particularmente adecuados para usar en la determinacion de analitos en sangre entera, plasma, suero, lfquido intersticial o derivados de los mismos, cuando un analito de interes concreto es la glucosa. La presente invencion proporciona metodos para determinar un valor de concentracion de analito en una muestra fisiologica de una manera rapida y con resultados precisos. En el presente documento se describen estructuras de ejemplos de ejemplos de tiras ensayo que pueden usarse para medir un valor de concentracion del analito. Adicionalmente, en el presente documento se describen metodos de uso de la tira de ensayo en la que se mide un transitorio de corriente y se recoge mediante un medidor conectado electricamente a la tira de ensayo. En el presente documento se describen todavfa adicionalmente algoritmos que se usan para procesar el transitorio de corriente de una manera rapida y que proporciona valores precisos de la concentracion del analito. En un aspecto adicional, en el presente documento se describen metodos para determinar la concentracion del analito de una manera que reduce la influencia de los interferentes.

Los metodos objeto se pueden usar, en principio, con cualquier tipo de celula electroqmmica que tenga un primero y un segundo electrodos separados. Para ilustrar la invencion, en el presente documento se describe una realizacion particular que utiliza electrodos opuestos. Sin embargo, debe entenderse que la invencion es igualmente aplicable a celulas con electrodos en otras configuraciones, por ejemplo, tambien pueden usarse celulas con electrodos en el mismo plano. La unica limitacion de la configuracion que se tiene que aplicar es que los electrodos deben estar colocados de tal manera que la medicion de la corriente interferente este sustancialmente libre de contribuciones de especies electroactivas formadas por la reaccion del analito (por ejemplo, glucosa). Esto se logra normalmente separando los electrodos por una distancia suficiente de manera que las especies electroactivas formadas por reaccion del analito no tengan tiempo suficiente para alcanzar el electrodo donde se esta midiendo la corriente interferente antes o durante la medicion de la corriente interferente.

A continuacion se describen e ilustran en las figuras 1A a 4B varios ejemplos de uno de tales dispositivos en forma de una tira de ensayo 62 que incluye un cuerpo alargado 59 que se extiende a lo largo de un eje longitudinal L desde un extremo proximal 80 hasta un extremo distal 82 y que tiene bordes laterales 56, 58. El cuerpo 59 puede incluir una camara de reaccion 61 de la muestra proximal que contiene los electrodos 164, 166 y un reactivo 72. El cuerpo de la tira de ensayo 59 puede incluir ademas contactos electricos posicionados distalmente 63, 67 para comunicarse electricamente con un medidor de ensayo (no ilustrado).

En un aspecto, la tira de ensayo 62 esta formada por multiples capas que incluyen una primera capa conductora de electricidad 66, un separador 60, una segunda capa conductora de electricidad 64. La primera capa conductora de electricidad 66 y / o la segunda capa conductora de electricidad 64 pueden estar formadas por diversos materiales conductores que estan, en un ejemplo, colocados sobre una lamina aislante (no mostrada). La capa separadora 60 puede estar formada por diversos materiales electricamente aislantes y puede incluir, o estar formada por, un adhesivo. Un experto en la tecnica apreciara que aunque se ilustra una tira de ensayo de tres capas, se podnan usar capas adicionales conductoras de la electricidad o aislantes para formar el cuerpo de la tira de ensayo 59.

Como se ilustra en las Figuras 1A a 1C, la camara de reaccion de muestra proximal 61 puede estar definida por la primera capa conductora de electricidad 66, la segunda capa conductora electricamente 64 y la capa separadora 60. Como se describe con mas detalle a continuacion, la camara de reaccion 61 puede incluir tambien un reactivo 72 y el primero y segundo electrodos 166, 164. Por ejemplo, un area recortada 68 en el espaciador 60 puede exponer una parte de la segunda capa conductora de electricidad 64 y la primera capa conductora de electricidad 66, y por lo tanto, define el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164, respectivamente. El reactivo 72 puede estar en forma de una capa colocada sobre el primer electrodo 166.

En un ejemplo, la camara de reaccion 61 esta adaptada para analizar muestras de pequeno volumen. Por ejemplo, la camara de reaccion de la muestra 61 puede tener un volumen que vana de aproximadamente 0,1 microlitros a aproximadamente 5 microlitros, preferentemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3 microlitros y, mas preferentemente, de aproximadamente 0,3 microlitros a aproximadamente 1 microlitro. Para acomodar un volumen de muestra pequeno, los electrodos estan preferentemente muy separados. Por ejemplo, cuando el separador 60 define la distancia entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164, la altura del separador 60 puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 micrometro a aproximadamente 500 micrometres, preferentemente entre aproximadamente 10 micrometros y aproximadamente 400 micrometros, y mas preferentemente entre aproximadamente 40 micrometros y aproximadamente 200 micrometros.

Para ayudar aun mas con la reduccion del volumen de la camara de reaccion 61, se puede ajustar la dimension longitudinal y / o lateral de la zona de recorte 68 y / o del cuerpo 59. Por ejemplo, el cuerpo de la tira de ensayo 59 puede incluir partes recortadas 51, 52 de manera que la anchura lateral de la camara de reaccion 61 sea menor que la anchura total (anchura mas ancha) del cuerpo de la tira de ensayo 59. Las partes recortadas 51 tambien pueden facilitar el suministro de una muestra a la camara de reaccion 61. Por ejemplo, la porcion recortada 51, 52 puede tener una forma correspondiente a una parte de un dedo de un usuario. Cuando un usuario exprime una gota de sangre con un punzon digital, las partes cortadas 51, 52 pueden ayudar al usuario a alinear una muestra colocada sobre el dedo con un puerto receptor de la muestra (por ejemplo, aberturas 70) en el borde lateral 56, 58 del cuerpo 59. Un experto en la tecnica apreciara que mientras se ilustran dos porciones recortadas, el cuerpo de la tira de

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ensayo 59 podna incluir solamente una sola porcion recortada o ninguna porcion recortada.

Como se ha indicado anteriormente, la parte proximal del cuerpo de la tira de ensayo 59 puede incluir al menos un puerto de liberacion de la muestra de una muestra a la camara de reaccion 61. Por ejemplo, el area recortada 68 puede extenderse transversalmente a los bordes laterales 56, 58 del cuerpo de la tira de ensayo 59 para proporcionar dos aberturas 70 para la liberacion del fluido fisiologico a la camara de reaccion de la muestra 61. Cuando hay dos aberturas 70 presentes, una puede actuar como un puerto de recepcion de la muestra para suministrar una muestra de fluido mientras que la otra puede actuar como ventilacion.. Un experto en la tecnica apreciara que la muestra puede suministrarse a la camara de reaccion de la muestra 61 usando estructuras alternativas que incluyen puertos de recepcion de muestras y / o ventilaciones situados en diferentes posiciones en el cuerpo de la tira de ensayo 59, tales como, por ejemplo, puertos de recepcion de la muestra y/o ventilaciones posicionados en las capas primera y / o segunda conductoras de la electricidad 66, 64.

En un ejemplo, la tira de ensayo 62 esta adaptada para extraer la muestra a la camara de reaccion 61 por accion capilar. Por ejemplo, las dimensiones y las caractensticas de la superficie de la camara de reaccion 61 y las aberturas 70 pueden adaptarse para producir una fuerza capilar cuando una muestra lfquida (por ejemplo, sangre entera) se pone en contacto con una de las aberturas 70. Un experto en la tecnica apreciara que la camara de reaccion 61 puede incluir estructuras adicionales para ayudar / crear fuerzas capilares, tales como, por ejemplo, perlas, una membrana porosa y / u otras cargas.

Como se ha mencionado anteriormente, puede disponerse un reactivo, tal como el reactivo 72, dentro de la camara de reaccion 61. La composicion del reactivo 72 puede variar dependiendo del analito deseado y de la forma esperada de la muestra. En un aspecto, el reactivo 72 incluye al menos un mediador y una enzima y se deposita sobre el primer electrodo 166. Entre los ejemplos de mediadores adecuados se incluyen ferricianuro, ferroceno, derivados de ferroceno, complejos de osmio bipiridilo y derivados de quinona. Entre los ejemplos de enzimas adecuadas se incluyen glucosa oxidasa, glucosa deshidrogenasa (GDH) a base de cofactor de pirroloquinolina quinona (PQQ), y GDH basada en el cofactor del dinucleotido nicotinamida adenina. Una formulacion de reactivo de ejemplo, que sena adecuada para fabricar la capa de reactivo 72, se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos pendiente de tramitacion N.° 10 / 242.951, titulada Metodo de fabricacion de un dispositivo medico basado en biosensor esterilizado y calibrado, publicada como la solicitud de patente publicada de Estados Unidos n.° 2004/0120848.

Distal a la camara de muestra proximal 61, el cuerpo 59 puede incluir pistas de conexion que conectan electricamente los electrodos primero y segundo 166, 164 con contactos electricos distales 63, 67. En un aspecto, la primera capa conductora de electricidad 66 incluye una primera pista de conexion 76 que conecta electricamente el primer electrodo 166 con un primer contacto electrico 67. De manera similar, la segunda capa conductora de la electricidad 64 puede incluir una segunda pista de conexion 78 que conecta el segundo electrodo 164 con un segundo contacto electrico 63 (figura 2).

Las capas conductoras de la electricidad primera y segunda tambien pueden definir un primer y un segundo contactos electricos 67, 63 que facilitan el contacto electrico de la tira de ensayo 62 con un medidor de ensayo. En un ejemplo, una parte de la primera capa conductora de la electricidad 66 se extiende distalmente desde el extremo distal de la capa separadora 60 y la segunda capa conductora de la electricidad 64 para definir el primer contacto electrico 67. El segundo contacto electrico puede definirse mediante una muesca 65 en forma de U en la primera capa conductora de la electricidad 66 que expone una porcion de la segunda capa conductora de la electricidad 64. Un experto en la tecnica apreciara que la tira de ensayo 62 puede incluir diversas configuraciones alternativas de contacto electrico para conectarse electricamente a un medidor de ensayo. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.379.513 divulga estructuras de conexion de celulas electroqmmicas.

La figura 5 proporciona un esquema simplificado que muestra un medidor de ensayo 100 que se interconecta con el primer contacto electrico 67 y el segundo contacto electrico 63 que estan en comunicacion electrica con el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 respectivamente de la tira de ensayo 62. El medidor de ensayo 100 esta adaptado para conectarse electricamente al primer electrodo 166 y al segundo electrodo 164, a traves del primer contacto electrico 67 y el segundo contacto electrico 63, respectivamente (como se muestra en las figuras 2 y 5). En un aspecto, el medidor de ensayo 100 contacta con el segundo contacto electrico 63 a traves de la muesca en forma de U 65.

Como se ilustra en la figura 5, el contacto electrico 67 puede incluir dos puntas denotadas como 67a y 67b. En un ejemplo ejemplar, el medidor de ensayo 100 se conecta por separado a las puntas 67a y 67b, de tal manera que cuando el medidor de ensayo 100 interacciona con la tira de ensayo 62, se completa un circuito. El medidor de ensayo 100 puede medir la resistencia o continuidad electrica entre las puntas 67a y 67b para determinar si la tira de ensayo 62 esta conectada electricamente al medidor de ensayo 100. Un experto en la tecnica apreciara que el medidor de ensayo 100 puede usar diversos sensores y/o circuitos alternativos para determinar cuando la tira de ensayo 62 esta posicionada apropiadamente con respecto al medidor de ensayo 100.

El medidor de ensayo 100 tambien se puede adaptar para detectar la presencia de fluido dentro de la camara de

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reaccion 61. Por ejemplo, una vez que el medidor de ensayo 100 reconoce que la tira 62 se ha insertado, el medidor de ensayo 100 puede aplicar una corriente constante (por ejemplo, una corriente de 1 microamperio) entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164. Debido a que la camara de reaccion 61 esta inicialmente seca, el medidor de ensayo 100 puede aplicar un voltaje maximo en un intento de conseguir el flujo de corriente deseado. Sin embargo, una vez que un usuario dosifica una muestra fisiologica sobre la entrada 70, esta camara de reaccion de muestra 61 se llena. Cuando la muestra fisiologica atraviesa el espacio entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164, el medidor de ensayo 100 medira una disminucion en el voltaje medido (por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 6.193, 873) que esta por debajo de un umbral predeterminado.

En algunos casos, reconocer que el fluido fisiologico se aplico no indica necesariamente que la camara de reaccion de la muestra 61 esta completamente llena, sino que solo puede confirmar la presencia de algun fluido fisiologico en la camara de reaccion de la muestra 61. Una vez que el medidor de ensayo 100 determina que se ha aplicado fluido fisiologico a la tira de ensayo 62, puede dejarse que transcurra un tiempo corto, pero finito, de modo que el fluido fisiologico llene completamente la camara de reaccion de la muestra 61.

Una vez que se ha dosificado una muestra fisiologica sobre la tira de ensayo 62, el medidor de ensayo 100 puede realizar una prueba de glucosa aplicando un potencial de circuito abierto y una pluralidad de potenciales de ensayo durante los periodos de tiempo prescritos. Por ejemplo, se puede realizar una prueba de glucosa a lo largo de un intervalo de tiempo de ensayo de glucosa Tg que puede incluir secuencialmente un intervalo de tiempo de circuito abierto Toc, un primer intervalo de tiempo de potencial Ti, y un segundo intervalo de tiempo de potencial de ensayo T2. La figura 6 proporciona una representacion grafica de una prueba de ejemplo que tiene tres intervalos de tiempo.

En el siguiente ejemplo de la presente invencion, se describira una serie de intervalos de tiempo que representan colectivamente un intervalo de tiempo del ensayo de glucosa Tg de 5 segundos. Sin embargo, debe apreciarse que el intervalo de tiempo de la glucosa puede variar, incluyendo, por ejemplo, intervalos de tiempo de mas o menos de 5 segundos. En un aspecto, los intervalos de tiempo de ensayo de glucosa Tg pueden variar desde aproximadamente 1 segundo a 10 segundos, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 2 a 8 segundos, y, mas preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 3 a 6 segundos. Una prueba de glucosa puede estar con un intervalo de tiempo de circuito abierto Toc para permitir que la camara de reaccion de muestra 61 se llene. El intervalo de tiempo de circuito abierto Toc puede variar dependiendo de la naturaleza de la muestra (por ejemplo, viscosidad, composicion, etc.), las dimensiones y caractensticas ffsicas de la camara de reaccion de la muestra y / o variaciones en el metodo de llenado (por ejemplo, la fuerza de la accion capilar). Por ejemplo, cuando la temperatura ambiente es fna (por ejemplo, aproximadamente 5 °C) y / o cuando una muestra de sangre puede ser viscosa debido a un alto hematocrito (por ejemplo,> 60 % de hematocrito) podna requerirse un tiempo extra de circuito abierto. En un ejemplo de la presente invencion, el intervalo de tiempo de circuito abierto Toc puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 segundos a aproximadamente 2 segundos y preferentemente entre aproximadamente 0,3 segundos a aproximadamente 1,5 segundos, y mas preferentemente entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 segundo.

Una vez transcurrido el intervalo de tiempo de circuito abierto Toc, el medidor de ensayo 100 puede aplicar un primer potencial de ensayo Ti. entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 para un primer intervalo de tiempo de potencial de ensayo Ti. Despues de que haya transcurrido el primer intervalo de tiempo de potencial de ensayo Ti el medidor de ensayo 100 puede aplicar un segundo potencial de ensayo E2 entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 para un segundo intervalo de tiempo de potencial de prueba T2. Durante Ti y T2, el medidor de ensayo 100 puede medir la corriente de la celula como una funcion del tiempo, denominada en el presente documento transitorio de corriente en el tiempo o un transitorio de corriente y denominado ia(t) durante el primer intervalo de tiempo de potencial de ensayo Ti y /*(t) durante el segundo intervalo de tiempo de potencial de ensayo T2.

En un ejemplo, el primer potencial de ensayo Ei tiene una primera polaridad y el segundo potencial de ensayo E2 tiene una segunda polaridad y la primera polaridad es opuesta a la segunda polaridad. Ademas, el primer potencial de ensayo Ei puede ser suficientemente negativo en magnitud con respecto al segundo electrodo 164, de tal manera que el segundo electrodo 164 funcione como un electrodo de trabajo en el que se mide una corriente de oxidacion limitante. Por lo tanto, las especies oxidables se agotan localmente en la superficie del electrodo de trabajo de tal manera que la corriente de oxidacion medida es proporcional al flujo de especies oxidables que se difunde desde la solucion en masa hacia la superficie del electrodo de trabajo. El termino “solucion en masa” se refiere a una porcion de la solucion lo suficientemente alejada del electrodo de trabajo donde la especie oxidable no estaba situada dentro de la zona de agotamiento. De forma similar, el segundo potencial de ensayo E2 puede ser suficientemente positivo en magnitud con respecto al segundo electrodo 164, de tal manera que el primer electrodo 166 funcione como un electrodo de trabajo en el que se mide una corriente de oxidacion limitante. En un ejemplo, el primer potencial de ensayo Ei y el segundo potencial de ensayo E2 pueden oscilar desde aproximadamente -0,6 voltios hasta aproximadamente +0,6 voltios. Cuando el primer potencial de ensayo Ei es negativo, el reactivo 72 puede estar dispuesto sobre el primer electrodo 166.

La figura 6 ilustra un ejemplo de intervalo de tiempo de ensayo de glucosa Tg con el primer potencial de ensayo Ei de -0,3 voltios y el segundo potencial de ensayo E2 puede ser de +0,3 voltios. El primer intervalo de tiempo de

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potencial de ensayo Ti fue de 3 segundos y el segundo intervalo de tiempo de potencial de ensayo T2 fue de 1 segundo. El segundo potencial de ensayo E2 se aplica inmediatamente despues de la aplicacion del primer potencial de ensayo Ei.

La figura 7 muestra una primera y una segunda corrientes transitorias generadas en base al intervalo de tiempo del ensayo de glucosa Tg de la figura 6 para una muestra fisiologica que contiene 62 mg / dl de concentracion de glucosa sin interferentes anadidos (lmea continua) y con una concentracion de ascorbato de 20 mg / dl (lmea discontinua). La figura 8 muestra una vista ampliada de un primer transitorio de corriente en la figura 7.

Suponiendo que una tira de ensayo tiene una disposicion opuesta o en oposicion como se muestra en las Figuras 1A a 4B, se puede calcular una concentracion de glucosa usando un primer algoritmo de glucosa como se muestra en la Ecuacion (Ec.). 1.

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En la ecuacion 1, [G] es la concentracion de glucosa, ii es un primer valor de corriente, i2 es un segundo valor de corriente, e 13 es un tercer valor de corriente, y los terminos p, Z y a son constantes de calibracion derivadas empmcamente. Una derivacion de la Ec. 1 se puede encontrar en una solicitud de patente de Estados Unidos pendiente de tramitacion n.° 11 / 240.797 que se presento el 30 de septiembre de 2005 y titulada "Metodo y aparato para analisis electroqmmico rapido".

El primer valor de corriente ii y el segundo valor de corriente 12 se pueden calcular a partir de el segundo transitorio de corriente y el tercer valor de corriente i3 se calcula a partir de el primer transitorio de corriente. Un experto en la tecnica apreciara que los nombres "primero", "segundo" y "tercero" se eligen por conveniencia y no reflejan necesariamente el orden en el que se calculan los valores de la corriente. Todos los valores de la corriente (por ejemplo, ii, 12 e 13) indicados en la Ec. 1 y en las ecuaciones posteriores puede utilizar el valor absoluto de la corriente.

El primer valor de corriente ii y el segundo valor de corriente 12 pueden ser, en un aspecto, una integral de los valores de la corriente en un intervalo de tiempo de el segundo transitorio de corriente, una suma de los valores de la corriente en un intervalo de tiempo de el segundo transitorio de corriente o un promedio o unico valor de la corriente de el segundo transitorio de corriente multiplicado por un intervalo de tiempo de el segundo transitorio de corriente. De forma similar, el tercer valor de corriente 13 puede ser, en un aspecto, una integral de los valores de la corriente en un intervalo de tiempo de el primer transitorio de corriente, una suma de los valores de la corriente en un intervalo de tiempo de el primer transitorio de corriente o un promedio o unico valor de la corriente de el primer transitorio de corriente multiplicado por un intervalo de tiempo de el primer transitorio de corriente. Para la suma de los valores de la corriente, un intervalo de la medicion consecutiva de la corriente se puede sumar a partir de solo dos valores de la corriente o a todos los valores de la corriente.

En otro ejemplo, el primer valor de corriente ii, el segundo valor de corriente 12, y el tercer valor de corriente 13 se pueden sustituir por un valor coulombico. En lugar de medir una corriente, se puede medir la carga pasada. La carga total pasada proporciona la misma informacion que la integracion de un transitorio de corriente. Por ejemplo, la carga pasada se puede medir a lo largo de un intervalo de tiempo predeterminado y utilizarse para el primer, segundo y / o tercer valor de corriente.

En un ejemplo de un metodo divulgado en el presente documento, la cinetica de la reaccion de glucosa se contabiliza usando valores de la corriente (por ejemplo, ii, 12, y/o 13). El resultado es menos dependiente de la concentracion del hematocrito y la temperatura y se puede lograr una exactitud y una precision mejoradas en la determinacion de la concentracion de glucosa.

En un aspecto, la capa de reactivo 72 esta dispuesta en el primer electrodo 166 y, por lo tanto, permanece generalmente proxima al primer electrodo 166 despues de su disolucion con la muestra fisiologica. Esto da como resultado, al menos inicialmente, que una proporcion mayoritaria del mediador reducido este proxima al primer electrodo 166. Despues de que transcurra un cierto penodo de tiempo, el mediador reducido, generado en la capa de reactivo 72 por la reaccion de la glucosa, difundira pasivamente lejos del primer electrodo 166. Durante este proceso, la magnitud de la concentracion del mediador entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 forma un gradiente en el que la concentracion del mediador reducido es mayor en el primer electrodo 166 y menor en el segundo electrodo 164. Una mayor concentracion de mediador reducido en el primer electrodo 166 hara que la magnitud del gradiente se vuelva mas pronunciada. La magnitud de el primer transitorio de corriente es proporcional a la magnitud de este gradiente. Por lo tanto, la cantidad de mediador reducido generada por la capa de reactivo 72 impulsa la difusion del mediador reducido al segundo electrodo 164. La velocidad de cambio de la corriente medida en los electrodos es, por tanto, indicativa de la velocidad de cambio de la concentracion del mediador reducido en la capa de reactivo 72 y tambien de la cinetica de la reaccion de glucosa (es decir, la velocidad de reaccion de la glucosa que genera mediador reducido).

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La cinetica de la reaccion de glucosa depende de varios factores que incluyen la separacion del electrodo (en relacion con la distancia maxima que la glucosa tiene que difundir para llegar a la capa de reactivo 72), la viscosidad de la muestra fisiologica, la concentracion de hematocrito y la temperature.

Se puede producir un aumento de la viscosidad en la muestra fisiologica con incrementos del hematocrito, las protemas, el contenido de lfpidos o combinaciones de los mismos. Hematocrito se refiere a la proporcion de globulos rojos en una muestra de sangre. Tfpicamente, una mayor proporcion de globulos rojos hace que la sangre sea mas viscosa y da como resultado una mayor proporcion de la glucosa total dentro de los globulos rojos. Para que la glucosa dentro de los globulos rojos reaccione con la capa de reactivo 72, la glucosa debe transportarse a traves de la membrana de los globulos rojos. En ciertas condiciones, este transporte puede ser relativamente lento para limitar la cinetica de la reaccion de glucosa. Por lo tanto, un hematocrito mas alto ralentiza la cinetica de la reaccion de glucosa. La viscosidad generalmente ralentiza el proceso de difusion general dentro de la camara de reaccion de la muestra 61. Una temperatura mas alta generalmente aumenta la velocidad de reaccion de la glucosa con la capa de reactivo 72 dentro de la camara de reaccion de la muestra 61 a medida que acelera los procesos de transporte implicados.

Los valores de corriente (ii, i2 y/o 13), y, particularmente, una relacion de valores de la corriente, pueden usarse para corregir las variaciones en la cinetica de reaccion de la glucosa. Por ejemplo, la magnitud de el segundo transitorio de corriente sera generalmente mayor que la magnitud absoluta del transitorio de corriente. Por lo tanto, la relacion 12 / 13 sera generalmente mayor que la unidad, mientras que la reaccion de glucosa esta en curso dentro de la camara de reaccion de muestra 61 y se convertira en unidad cuando la reaccion de glucosa este completa. La desviacion de la relacion i2 / i3 de la unidad sera, por lo tanto, un factor que indica el grado de terminacion de la reaccion. Valores relativamente altos de i2 / i3 indicaran que la reaccion de glucosa esta lejos de haber finalizado, mientras que los valores de i2 / i3 cercanos a la unidad indicaran que la reaccion de glucosa esta casi completa. Por lo tanto, la relacion i2 / i3 proporciona generalmente informacion sobre el progreso de la reaccion de glucosa y puede usarse para eliminar el efecto del hematocrito, la viscosidad y la temperatura en la medicion de la concentracion de glucosa.

Para refinar aun mas los calculos, pueden usarse uno o mas factores de calibracion. Por ejemplo, como se muestra en la Ec. 1, la relacion i2 / i3 se ajusta a la p exponencial en la que p es un factor de calibracion que puede usarse para un lote particular de tira de ensayo. El uso del exponente p se encontro a traves de medios empmcos para mejorar la precision y permitir tiempos de ensayo rapidos. En un ejemplo de la invencion, p puede oscilar de entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 4, y, preferentemente, de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1.

Como se muestra en la Ec. 1, se puede utilizar un factor de calibracion a para tener en cuenta posibles variaciones en el area de recorte 68 y la altura del separador 60. Las variaciones en el area de recorte 68 pueden causar un cambio proporcional en la magnitud de la corriente medida. En ciertas circunstancias, los procesos de fabricacion pueden hacer que el area del electrodo vane de un lote de tiras de ensayo a otro lote de tiras de ensayo. De forma similar, la altura del separador 60 tambien puede variar entre lotes. Las variaciones en la altura del separador 60 tienen un impacto proporcional sobre la corriente de ensayo. Por ejemplo, un aumento de la altura del separador 60 conduce a una disminucion de la corriente de ensayo. El calculo de un factor de calibracion a para cada lote de tiras de ensayo ayuda a compensar las variaciones en el area del electrodo y la altura del separador 60. El termino a puede calcularse durante el proceso de calibracion de un lote de tiras de ensayo.

En un ejemplo, como se muestra en la Ec. 1, se utiliza un factor de calibracion Z para tener en cuenta las variaciones en el fondo. Una presencia de una especie oxidable dentro de la capa de reactivo 72 antes de anadir fluido fisiologico a la tira de ensayo 62 puede contribuir a una senal de fondo.. Por ejemplo, si la capa de reactivo 72 debfa contener una pequena cantidad de ferrocianuro (por ejemplo, mediador reducido) antes de anadir fluido fisiologico a la tira de ensayo, se producina un incremento en la corriente de ensayo medida que no se atribuina a la concentracion de glucosa. Debido a que esto provocana un sesgo constante en la corriente de ensayo medida global para un lote particular de tiras de ensayo, este sesgo puede corregirse para el uso del factor de calibracion Z. Similar a los terminos p y a, Z tambien se puede calcular durante el proceso de calibracion.

Aunque el metodo divulgado en el presente documento se describe con el uso de factores de calibracion, p, a y Z, un experto en la tecnica apreciara que no se requiere su uso. Por ejemplo, en un ejemplo, la concentracion de glucosa podna calcularse sin p, a, y / o Z (en la Ec. 1 p y/o a podnan fijarse en igual a uno y Z podna fijarse en igual a cero).

La seleccion de los intervalos de tiempo en los que se calculan ii, i2 e 13 se puede determinar con un algoritmo de preparacion para un tipo concreto de tira de ensayo (es decir, determinado empmcamente). Durante el algoritmo de preparacion se probanan varias tiras de ensayo sobre una serie de condiciones que un usuario puede encontrar durante el ensayo. Tales condiciones pueden incluir un intervalo de concentracion de glucosa de 20 mg / dl a 600 mg / dl, un intervalo del hematocrito de 0 % a 70 %, un intervalo de temperatura de 5 °C a 45 °C, un intervalo de humedad de 5 % de humedad relativa (HR de 5 %) a 95 % de HR e interferentes endogenos y exogenos. Ejemplos de interferentes endogenos y exogenos y sus intervalos de concentracion fisiologica pueden encontrarse en una

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publicacion titulada "Comite Nacional de Normas de Laboratorio Clmico: Analisis de Interferentes en Qmmica Clmica; directriz propuesta EP7-P". Wayne, PA.: NCCLS, 1986. Usando tecnicas estandar de minimizacion o error, se definio una seleccion optimizada de intervalos de tiempo o ii, i2 e 3 de tal manera que la concentracion de glucosa calculada usando la Ec. era exacta (por ejemplo, dentro de +/-10 % de una medida de referencia) y precisa (por ejemplo, variacion de tira a tira de aproximadamente 2 % o menos a 1 a). Un experto en la tecnica apreciara que el intervalo de tiempo elegido para el primer valor de corriente, el segundo valor de corriente y el tercer valor de corriente pueden ser, de este modo, iguales o diferentes, y en un ejemplo, solo se calculan dos valores de corriente. Por ejemplo, se puede definir que el segundo valor de corriente i2 sea el mismo que el primer valor de corriente ii

Despues de seleccionar el intervalo de tiempo de ii, i2 e i3 se puede calibrar el lote de tiras. Los metodos de ejemplo para calibrar lotes de tiras se describen en la Patente de Estados Unidos N.° 6.780.645. Mas particularmente, los factores de calibracion a, p, y / o Z se pueden calcular para un lote particular de tiras de ensayo. Tfpicamente, se evalua un intervalo de concentraciones de glucosa en sangre de donantes multiples usando las tiras de ensayo de glucosa y, tambien, en un instrumento de referencia conocido como exacto y preciso. El error entre los resultados de las tiras de ensayo de la presente invencion y el metodo de referencia se minimiza encontrando la combinacion optima de a, p y / o Z. En un ejemplo, la informacion de calibracion puede transmitirse y / o almacenarse en un medidor de ensayo 100 antes de usar una tira de ensayo del lote de tira de ensayo.

Se describen otros metodos de calculo de la concentracion del analito que pueden explicar la presencia de interferentes en una muestra. Por ejemplo, ciertas enfermedades, tales como la gota, haran que la concentracion de urato de una persona se eleve, lo que puede afectar la precision de una medicion de glucosa. El urato es un interferente potencial para muchas mediciones electroqmmicas porque puede ser facilmente oxidado en una superficie de electrodo de trabajo y / o por un mediador oxidado. En una realizacion de la presente invencion, la Ec. 1 se modifico para aumentar la precision de la medicion de glucosa en presencia de interferentes tales como urato. Con el fin de desarrollar un algoritmo modificado, se encontro una relacion matematica basada en la oxidacion de los interferentes durante el primer transitorio de corriente y el segundo transitorio de corriente.

Si se supone que la concentracion global del mediador reducid no cambia dentro de la camara de reaccion de la muestra 61 durante el intervalo de tiempo del ensayo de glucosa Tg, se puede describir una magnitud de la corriente para el primer transitorio de corriente como una funcion del tiempo por la Ec. 2.

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El termino iss es la corriente en equilibrio tras la aplicacion del primer potencial de ensayo Ei, D es el coeficiente de difusion del mediador, L es el espesor del separador. Cabe destacar que en la Ec. 2, t hace referencia al tiempo transcurrido despues de aplicar el primer potencial de ensayo Ei. Por ejemplo, para ser consistente con la figura 7, el valor t usado en la Ec. 2 debe tener 1 segundo restado del tiempo real. Una magnitud de la corriente para el segundo transitorio de corriente se puede describir como una funcion del tiempo mediante la Ec. 3.

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Existe un factor de dos diferencias para el termino exponencial en la Ec. 3 en comparacion con el termino exponencial en la Ec. 2 debido a que el segundo transitorio de corriente se genera a partir del segundo potencial de ensayo E2, que era de polaridad opuesta al primer potencial de ensayo Ei, y se aplico inmediatamente despues del primer potencial de ensayo Ei. Cabe senalar que en la Ec. 3, t hace referencia al tiempo transcurrido despues de aplicar el segundo potencial de ensayo E2. Por ejemplo, para ser consistente con la figura 7, el valor t usado en la Ec. 3 debe tener 4 segundos restados del tiempo real. Durante un primer potencial de ensayo Ei de -0,3 V, el interferente se oxida en el segundo electrodo 164 y, a su vez, genera mediador reducido en el primer electrodo 166. Es esta acumulacion de mediador reducido en el primer electrodo 166 lo que hace que la corriente inicial en el segundo potencial de ensayo E2 sea dos veces mas grande para el termino exponencial.

La Figura 9 muestra una representacion grafica de un gradiente de concentracion dentro de la camara de reaccion de muestra 61 que puede usarse para explicar el factor de dos diferencias para el termino exponencial en la Ec. 3 en comparacion con el termino exponencial en la Ec. 2. Si se supone que una concentracion de mediador reducido dentro de la camara de reaccion de la muestra 61 no cambia durante el intervalo de tiempo de ensayo de glucosa Tg, la concentracion de especies oxidables debe ser uniforme a lo largo de la camara de reaccion de muestra 61 antes de aplicar el primer potencial de ensayo Ei a la tira de ensayo 62. Los drculos de la Figura 9 indican que la concentracion normalizada de las especies oxidables era uniforme mostrando la concentracion como unidad. Esta concentracion inicial tambien puede denominarse concentracion en masa. Una vez aplicado el primer potencial de ensayo Ei, la concentracion normalizada de especies oxidables en el segundo electrodo 164 se agota

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inmediatamente, haciendo que la concentracion sea cero. Observese que la superficie del segundo electrodo 164 se representa como cero en el eje X y que la distancia normalizada desde el segundo electrodo 164 al primer electrodo 166 se representa como una en el eje X, segun la figura 9.

Despues de aplicar el primer potencial de ensayo Ei, la concentracion normalizada de especies oxidables se hace dos veces mayor que la concentracion en masa en el primer electrodo 166, que en este caso es dos. Ademas, se forma un gradiente de concentracion lineal dentro de la camara de reaccion de muestra 61 como se indica mediante los cuadrados, segun la Figura 9, donde la concentracion normalizada de especies oxidables es mas alta en el primer electrodo 166 y mas baja en el segundo electrodo 164. Debido a que existe una conservacion de la carga dentro de la camara de reaccion de la muestra 61, cada especie oxidable consumida en el segundo electrodo 164 debe dar lugar a una especie oxidable generada en el primer electrodo 166. Por lo tanto, la concentracion normalizada de especies oxidables en el primer electrodo 166 es dos despues de la aplicacion del primer potencial de ensayo Ei.

Al aplicar el segundo potencial de ensayo E2, la corriente un corto tiempo despues sera el doble de la corriente al mismo tiempo despues de la aplicacion de Ei menos la corriente en estado estacionario. La razon para el factor de dos es porque la concentracion inicial de especies oxidables en el primer electrodo 166 sera el doble de la concentracion en masa. Por el contrario, la concentracion inicial normalizada de especies oxidadas en el segundo electrodo 164 antes de aplicar el primer potencial de ensayo Ei era solo la mitad, que en este caso era la concentracion en masa. La razon de la resta de la corriente en estado estacionario es que existe un gradiente de especies oxidables entre los dos electrodos que hace que el flujo de electrones se aleje del primer electrodo 166.

La figura 7 muestra que hay un pico de corriente para el primer intervalo de tiempo del potencial de ensayo Ti que se indica como ipa, y un pico de corriente para el segundo intervalo de tiempo del potencial de ensayo T2, que se indica como ipb. Si tanto en el primer pico de corriente ipa como en el segundo pico de corriente ipb se midieran en el mismo tiempo corto despues de la aplicacion del primer potencial de ensayo Ei y el segundo potencial de ensayo E2 respectivamente, por ejemplo 0,1 segundos, la Ec. 2 puede restarse de la Ec. 3 para dar la Ec. 4.

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Cabe senalar que la Ec. 2 se multiplico por dos para permitir cancelar los terminos de la suma. La Ec. 4 describe una relacion entre el primer transitorio de corriente y un segundo transitorio de corriente cuando la tira de ensayo 62 se analiza con una muestra que contiene un interferente y no glucosa. Dado que no hay glucosa en la muestra, la capa de reactivo 72 no genera mediador reducido durante el intervalo de tiempo de ensayo de glucosa Tg. Por lo tanto, los transitorios de corriente primero y segundo reflejanan solo la oxidacion de los interferentes. De la discusion anterior se desprende que la relacion entre los picos de corriente primero y segundo y la corriente en estado estacionario pueden derivarse recurriendo a las ecuaciones electroqmmicas fundamentales o mediante argumentos heunsticos verbales / graficos. Ambos enfoques pueden conducir a la Ec. 4.

El intervalo de tiempo de circuito abierto Toc puede utilizarse para mejorar la nitidez del primer valor del pico de corriente ipa en el que el pico se forma inmediatamente despues de la aplicacion del primer potencial de ensayo Ei. Un intervalo nominal de tiempo de circuito abierto Toc permite que la camara de reaccion de la muestra se llene completamente. Ademas, un intervalo nominal de tiempo de circuito abierto Toc tambien permite que la capa de reactivo 72 se disuelva, lo que permite que el mediador oxidado sea reducido por el primer electrodo 166 de manera que se pueda medir una corriente de oxidacion limitante en el segundo electrodo 164.

La magnitud de los transitorios de corriente primero y segundo tiene una relacion mas complicada si la capa de reactivo 72 genera mediador reducido durante el intervalo de tiempo de ensayo de glucosa Tg. A un regimen de escala de tiempo temprano de aproximadamente 1,1 segundos, se supone que la capa de reactivo 72 no genera una cantidad significativa de mediador reducido debido a la reaccion de glucosa. Ademas, se supone que el mediador reducido que se genera permanecera en su mayor parte cerca del primer electrodo 166, donde la capa de reactivo 72 se deposito inicialmente y no se difundio significativamente al segundo electrodo 164. Por lo tanto, la magnitud del ipa se atribuye predominantemente a la oxidacion del interferente en el segundo electrodo 164 que es una corriente interferente directa.

A un regimen de escala de tiempo posterior de aproximadamente 4,1 segundos, la capa de reactivo 72 genera una cantidad significativa de mediador reducido en el primer electrodo 166 en presencia de glucosa debido a la reaccion de glucosa. Tambien se puede generar una cantidad significativa de mediador reducido debido a una posible oxidacion de un interferente con el mediador oxidado. Como se menciono anteriormente, el interferente que reduce el mediador oxidado contribuye a una corriente que se puede denominar corriente indirecta. Ademas, los interferentes tambien se pueden oxidar directamente en el primer electrodo 164, que puede denominarse corriente directa. Para la situacion en la que el mediador puede oxidarse en el electrodo de trabajo, se puede suponer que la suma de la oxidacion directa y la oxidacion indirecta es aproximadamente igual a una corriente de oxidacion directa que habna sido medida si no hubiera mediador oxidado dispuesto sobre el electrodo de trabajo. En resumen, la

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magnitud del ipb se atribuye a oxidacion del interferente tanto directa como indirecta y a la reaccion de glucosa en el segundo electrodo 164. Debido a que se ha determinado que ipa esta controlado principalmente por interferentes, ipb se puede usar con ipa para determinar un factor de correccion. Por ejemplo, como se muestra a continuacion ipb se puede utilizar con ipa en una funcion matematica para determinar una corriente corregida que es proporcional a la glucosa y menos sensible a los interferentes.

La Ec. 5 se derivo empmcamente para calcular una corriente i4 que es proporcional a la glucosa y tiene una fraccion relativa de la corriente eliminada que se atribuye a los interferentes.

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El termino iss se anadio tanto al numerador como al denominador para permitir que el numerador se acerque a cero cuando no hay glucosa presente. Se puede estimar iss usando la ecuacion 5B, para corrientes a veces mayores que un tiempo mmimo, donde un tiempo mmimo adecuado se puede estimar a partir de la ecuacion 5C.

Ec. 5B

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Ec. 5C

-j} ln0,01

12 n2D

en la que, iss es la corriente en estado estacionario despues de la aplicacion del segundo potencial electrico; i es la corriente medida que es una funcion del tiempo; D es el coeficiente de difusion de la molecula redox activa, donde este coeficiente puede determinarse a partir de la primera ley de Fick, es decir, J(x,t)=-D dC(x,t) /dx; L es el espesor separador; y t es el tiempo para la aplicacion del segundo potencial electrico donde t = 0 para el comienzo del segundo intervalo de tiempo.

La Ec. 1 puede ser modificado reemplazando el termino ii para el termino i4 para dar un segundo algoritmo de glucosa que se muestra en la Ec. 6.

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Por tanto, la Ec. 6 permitira mediciones precisas de la glucosa en presencia de interferentes utilizando solo dos electrodos

En otra realizacion de la presente invencion, un algoritmo de glucosa como se muestra en la Ec. 7 puede usarse para medir glucosa en presencia de interferentes. En la ecuacion 7 la concentracion inicial Co se multiplica por un factor de correccion. El producto es proporcional a la concentracion de glucosa reaccionada mas mediador reducido de fondo. Como tal, el termino Z se resta y el resultado se multiplica por (iss/ipp)Ap para llegar a la medida de la glucosa total en la muestra.

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El termino ipp es un valor de la corriente derivado del primer transitorio de corriente. En un aspecto, ipp es una corriente promedio durante un periodo de tiempo corto cerca del fin del primer transitorio de corriente. Por ejemplo, la corriente promedio se puede encontrar entre 3,8 y 4,0 segundos. Co es una concentracion estimada de la glucosa que se define mediante la Ec. 8,

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en la que F es una constante de Faraday, es decir 96.485 Culombios/mol, y A es el area del primer electrodo.

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Ciertos agentes interferentes no se oxidan facilmente directamente en la superficie de un electrodo. Por ejemplo, el acetaminofen puede no oxidarse facilmente en el segundo electrodo 164 donde esta hecho de oro pulverizado y el primer electrodo se mantiene a -0,3 V. Si no es posible medir una corriente interferente directa en el segundo electrodo 164, la relacion de ipa e ipb debido a los interferentes ya no seguira la Ec. 4 en ausencia de glucosa. A su vez, la Ec. 6 y la Ec. 7 no proporcionara una medida tan precisa de glucosa en presencia de interferentes. Para remediar el problema de no medir una corriente interferente en el segundo electrodo 164, se puede disponer una segunda capa de reactivo, que incluye un mediador oxidado y esta sustancialmente exenta de enzima, en el segundo electrodo 164. Un mediador oxidado tal como, por ejemplo, ferricianuro puede a continuacion oxidar facilmente el acetaminofen, permitiendo que se mida una corriente interferente indirecta en el segundo electrodo 164. Permitiendo la medicion de la oxidacion de los interferentes en el segundo electrodo 164, ello permite que las Ec. 6 y 7 calculen concentraciones precisas de glucosa en presencia de interferentes.

En otro ejemplo, para remediar este problema, el mediador oxidado secado sobre el primer electrodo puede estar en cantidad suficiente y / o secarse de tal manera que una porcion del mediador oxidado se mezcla en el volumen de la muestra mientras llena la celda, al tiempo que no permite que una cantidad significativa de enzima se mezcle en la mayor parte de la muestra. puede conseguirse, por ejemplo, teniendo suficiente mediador oxidado en la formulacion y secandolo lo suficientemente lentamente para que al menos una porcion del mediador oxidado cristaliza sustancialmente libre de enzima. Los cristales pueden disolverse y mezclarse en la muestra en una mayor extension que la enzima, ayudado asegurando que el mediador tenga un tamano sustancialmente menor en comparacion con la enzima. De esta manera, los potenciales interferentes pueden ser oxidados por el mediador oxidado para formar un mediador reducido que puede medirse como parte de la corriente interferente, obviando una segunda capa de reactivo.

En otra realizacion, se introduce un potencial de circuito abierto entre el primer potencial de ensayo Ei y el segundo potencial de ensayo E2. Aunque este potencial de circuito abierto se denomina en el presente documento "segundo" circuito abierto, el uso del termino "segundo" se utiliza por conveniencia y no requiere un "primer" potencial de circuito abierto. El segundo potencial de circuito abierto permite que el gradiente electroqmmico vuelva al estado no perturbado (es decir, el mediador oxidado que se acumulo en el primer electrodo 166 debido a la aplicacion del primer potencial Ei puede difundir de nuevo en la solucion a granel). Bajo estas condiciones, el efecto interferente puede eliminarse restando el primer transitorio de corriente directamente del segundo transitorio de corriente. Como se ha mencionado anteriormente, la corriente inicial, que resulta cuando se aplica un segundo potencial de ensayo E2 inmediatamente despues del primer potencial de ensayo Ei, es mayor, lo que esta avalado por los terminos en la Ec. 3. Sin embargo, si se introduce un segundo potencial de circuito abierto suficientemente largo permitiendo que el mediador reducido acumulado en el primer electrodo 166 se disipe nuevamente dentro de la solucion a granel, la corriente inicial para el segundo potencial de ensayo E2 sera la misma que la corriente inicial para el primer potencial de ensayo Ei. Por lo tanto, si no se genera mediador reducido durante el intervalo de tiempo de ensayo y hay un segundo potencial de circuito abierto suficientemente largo, el transitorio de corriente para los potenciales de ensayo primero y segundo sera el mismo.

El tiempo requerido para permitir que el mediador reducido se disipe del primer electrodo 166 puede predecirse usando ecuaciones de difusion estandar. En general, la fraccion de mediador reducido que se disipara en la superficie del primer electrodo 166 es proporcional a

(~4n2Dt\

exP -----71----

\ ^ J

como una funcion del tiempo. As Como ejemplo, se puede suponer que L es 95 micrometros y D es 4,5 x 10-6 cm2/s. La figura 10 muestra un grafico que indica el % de perturbacion del gradiente del mediador reducido como una funcion del segundo intervalo de tiempo de circuito abierto. En este caso, la perturbacion se refiere a la cantidad de mediador reducido que todavfa tiene que disiparse antes de que la concentracion del mediador reducido se aproxime a la concentracion en masa. Utilizando los parametros asumidos de L y D, se requeriran aproximadamente 2,5 segundos (es decir, 5x L2/(4n2D)) para que el potencial de circuito abierto sea lo suficientemente largo. En una realizacion de esta invencion, el segundo intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto puede estar comprendido entre aproximadamente 1 segundo y aproximadamente 5 segundos, y preferentemente esta comprendido entre aproximadamente 2 segundos y aproximadamente 4 segundos. Dependiendo de los parametros de una tira de ensayo dada, un experto en la tecnica puede determinar facilmente cual sena un intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto suficientemente largo de modo que el transitorio de corriente para el primer y el segundo potencial de ensayo sea el mismo en ausencia de una reaccion de glucosa.

Se puede usar un algoritmo simplificado para calcular una concentracion de glucosa en presencia de interferentes, cuando se utiliza un intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto suficientemente largo como se muestra en la Ec. 9.

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9 [G] = interseccion+pendiente X (ipb~ ipa)

En la ecuacion 9 la interseccion y la pendiente son factores de calibracion. En este caso, ipb sera proporcional a la concentracion de glucosa y la concentracion interferente e ipa sera proporcional a la concentracion interferente solamente. La diferencia entre ipb e ipa sera una corriente que es proporcional a la glucosa con una correccion para los interferentes. La Ec. 9 puede usarse cuando la celda electroqmmica utilizada para realizar un ensayo tiene electrodos coplanares.

Otra realizacion del algoritmo simplificado para calcular una concentracion de glucosa en presencia de interferentes con un intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto suficientemente largo se muestra en la Ec. 10.

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( ■ i,

V

La Ec. 10 es similar a la Ec. 9 excepto que tiene un factor de correccion (es decir,) cinetica de la reaccion de glucosa.

para tener en cuenta la

En otro ejemplo divulgado en el presente documento, se pueden preparar tiras de ensayo para medir la hemoglobina en la sangre. En este ejemplo, la capa de reactivo 72 de una tira de ensayo 62 se sustituye por una nueva capa de reactivo que contiene ferricianuro y un agente de lisis tal como desoxicolato de sodio. Cuando la sangre se dosifica sobre la nueva capa de reactivo, los globulos rojos se lisan, permitiendo que el ferricianuro oxide la hemoglobina. Se puede encontrar una descripcion de un sensor de hemoglobina en la patente de Estados Unidos N.° 6.632.349. El ferrocianuro generado posteriormente puede medirse a continuacion como una corriente de hemoglobina. Similar a la glucosa, se supone que el ferrocianuro no alcanza el segundo electrodo 164 durante la etapa inicial del ensayo Una vez que se detecta sangre en una tira de ensayo mediante un medidor de ensayo, el medidor de ensayo puede aplicar en serie un potencial de circuito abierto de un segundo, un primer potencial de ensayo de 3 segundos de -0,3 V y un potencial de ensayo de 5 segundos de +0,3 V.

La concentracion de hemoglobina H puede medirse usando un primer algoritmo de hemoglobina como se muestra en la siguiente Ec. 11.

Ec 11 H — interseccion+pendiente x Co

En este caso, Co es proporcional a la concentracion de hemoglobina y puede calibrarse a una tecnica de referencia utilizando el analisis de regresion estandar (pendiente e interseccion). Sin embargo, se puede realizar una modificacion de la Ec. 11 de manera que el ensayo de hemoglobina se pueda realizar con precision en presencia de interferentes. La ec. 12 muestra un segundo algoritmo de hemoglobina para mejorar la precision de un sensor de hemoglobina.

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donde issa e issb son las corrientes en estado estacionario desde el transitorio de la primera corriente y los segundos transitorios de corriente, respectivamente.

Ejemplo 1

Se preparo un tampon que contema citraconato 67 mM a pH 6,8, 0,1 % de antiespumante (2 partes de Pluronic P103 y 1 parte de Pluronic F87), sacarosa 60 mM y CaCh 7 mM. A continuacion, se anadio GDH que uso un cofactor PQQ, al tampon, de manera que fue de 15 mg / ml. A continuacion se anadio PQQ al tampon para que pudiera activar el GDH,. Despues de la adicion de PQQ, la formulacion se dejo incubar aproximadamente a la hora. A continuacion, se anadio ferricianuro de potasio a la mezcla tal que era 600 mM. La formulacion se repartio sobre la primera capa conductora de electricidad 66 como se muestra en la Figura 1 por medio de un proceso de recubrimiento de ranura que se describe en la patente de Estados Unidos N.° 6.749.887; 6.689.411; y 6.676.995. Tras recubrir la formulacion y secarla de tal manera que forma la capa de reactivo 72, el separador 60 y el segundo

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electrodo 164 se ensamblan sobre el mismo para formar la tira de ensayo 62.

Ejemplo 2

Se analizaron varias tiras de ensayo 62 con sangre que contema una concentracion de glucosa que oscilaba entre aproximadamente 83 a 88 mg / dl y se introdujeron interferentes en la muestra de sangre. Las tiras de ensayo 62 se analizaron en el medidor de ensayo 100 usando un intervalo de tiempo de ensayo de glucosa Tg de 5 segundos. El medidor de prueba 100 aplico una forma de onda potencial como se muestra en la Figura 6. Se recogio una corriente de ensayo para cada tira de ensayo y se convirtio a una concentracion de glucosa utilizando un primer algoritmo de glucosa, como se muestra en la Ec. 1, y un segundo algoritmo de glucosa, como se muestra en la Ec. 6. Se calculo un sesgo promedio para cada tira de ensayo con respecto al metodo de referencia en unidades de mg / dl. La Figura 11 muestra que el sesgo global se redujo en presencia de interferentes, tales como ascorbato y urato, cuando se usa el segundo algoritmo de glucosa en oposicion al uso del primer algoritmo de glucosa.

Ejemplo 3

El experimento del Ejemplo 3 se repitio de manera similar con un conjunto diferente de tiras de ensayo 62. Para este experimento, se recogio la corriente de ensayo para cada tira de ensayo y se convirtio a una concentracion de glucosa utilizando un primer algoritmo de glucosa, como se muestra en la Ec. 1, y un tercer algoritmo de glucosa, como se muestra en la Ec. 7. La Figura 12 muestra que el sesgo global se redujo en presencia de interferentes cuando se usa el tercer algoritmo de glucosa en oposicion al uso del primer algoritmo de glucosa. El uso del termino Co en lugar de la simple suma de corriente puede permitir una medicion mas precisa en presencia de interferentes.

Ejemplo 4

Se prepararon varias tiras de ensayo 62 para la medicion de la hemoglobina. Se analizaron varias tiras de ensayo 62 con sangre que contema una concentracion de hemoglobina de 16.3 g7dl y se introdujeron interferentes en la muestra de sangre. Se recogio una corriente de ensayo para cada tira de ensayo y se convirtio a una concentracion de hemoglobina utilizando una primera ecuacion de hemoglobina, como se muestra en la Ec. 11, y una segunda ecuacion de hemoglobina, como se muestra en la Ec. 12. Se calculo un sesgo promedio para cada tira de ensayo con respecto al metodo de referencia en unidades de g / dl. La figura 13 muestra que el sesgo global se redujo en presencia de interferentes. tales como ascorbato (AA = 10 mg / dl), urato (UA = 10 mg / dl) y acetaminofen (Acet = 20 mg / dl) cuando se usa la segunda ecuacion de hemoglobina en lugar de usar la primera ecuacion de hemoglobina.

Un experto en la materia apreciara otras caractensticas y ventajas de la invencion en base a las realizaciones descritas anteriormente. De acuerdo con esto, la invencion no debe limitarse a lo que se ha mostrado y descrito particularmente, a excepcion de lo indicado en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para reducir el efecto de interferente en un ensayo para la concentracion de analito, que comprende:

   (a) introducir una muestra fisiologica en una celula electroqmmica (61), comprendiendo la celula electroqmmica:

   (i) electrodos primero y segundo (166, 164) en una relacion de separacion; y

   (ii) un primer reactivo (72), comprendiendo el reactivo un mediador y una enzima;

   (b) aplicar un primer potencial de ensayo que tiene una primera polaridad a la celula y medir la corriente de la celula para obtener un primer valor de intensidad de pico;

   (c) aplicar un segundo potencial de ensayo que tiene una segunda polaridad y una corriente de celula de medicion para obtener un segundo valor de corriente maxima, en el que la primera polaridad es opuesta a la segunda polaridad;

   (d) calcular un factor de correccion de interferencia basado en el primero y segundo valores de la corriente de pico, en el que el factor de correccion de interferencia se usa para reducir la influencia de los interferentes en un calculo de concentracion de glucosa.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa (c) incluye ademas la medicion de la corriente de la celula como una funcion del tiempo para obtener un segundo transitorio de corriente y el calculo de un primer valor de corriente basado en valores de corriente durante un intervalo de tiempo del segundo transitorio de corriente, en el que el intervalo de tiempo se determina empmcamente de manera que la concentracion de glucosa calculada sea precisa dentro de ± 10 % de una medida de referencia, y tiene una variacion de 2 % a 1 a.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, que comprende ademas la etapa de calcular un primer valor de corriente corregido eliminando un valor de corriente de interferencia del primer valor de corriente.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la etapa de calcular un primer valor de corriente corregido incluye multiplicar el primer valor de corriente por un factor de correccion de interferencia, en el que el factor de correccion de interferencia es

   imagen1

   donde ipa es el primer valor de corriente maxima, ipb es el segundo valor de corriente maxima, e iss es un valor de la corriente en estado estacionario.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el metodo incluye ademas las etapas de calcular un segundo valor de corriente basado en los valores de corriente en un intervalo de tiempo de la segunda intensidad de corriente y medir la corriente de la celula en funcion del tiempo en la etapa (b) para obtener un primer transitorio de corriente y el calculo de un tercer valor de corriente basado en valores de corriente durante un intervalo de tiempo del primer transitorio de corriente, en el que el intervalo de tiempo se determina empmcamente de manera que la concentracion de glucosa calculada sea exacta dentro de ± 10% variacion del 2% a 1a.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, que comprende ademas la etapa de calcular una concentracion de analito basada en una ecuacion

   imagen2

   en la que[C] es una concentracion de analito, i4 es el primer valor de corriente corregido, i2 es el segundo valor de corriente, i3 es el tercer valor de corriente, y a, p, y Z son factores de calibracion.
7. 7. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la primera capa de reactivo esta dispuesta sobre el primer electrodo.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la primera polaridad es negativa con respecto al segundo electrodo y la segunda polaridad es positiva con respecto al segundo electrodo.
9. 9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que una segunda capa de reactivo esta dispuesta sobre el segundo electrodo, en el que la segunda capa de reactivo comprende un mediador redox y esta sustancialmente libre de la enzima y el mediador redox es capaz de oxidar un interferente presente en la muestra fisiologica.

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   la medicion de la corriente de la celula en

   analito se calcula sobre la base de una

   A

   -Z

   )

   en la que [C] es una concentracion de analito, ipp es un valor de corriente derivado del primer transitorio de corriente, Co es una concentracion de glucosa estimada, ipa es el primer valor de corriente maxima, ipb es el segundo valor de corriente maxima e iss es un valor de corriente en estado estacionario y Z es un factor de calibracion, en el que el termino ipp es una suma de valores promedio de la corriente durante un corto penodo de tiempo cerca del final del primer transitorio de corriente.
10. 12. Un metodo para determinar una concentracion de analito en una muestra fisiologica que contiene tanto un analito como un interferente, comprendiendo el metodo,

    (a) introducir una muestra fisiologica en una celula electroqmmica, comprendiendo la celula electroqmmica:

    (i) electrodos primero y segundo en una relacion de separacion; y

    (ii) una primera capa de reactivo que comprende una enzima y un mediador;

    (b) aplicar un primer potencial de ensayo que tiene una primera polaridad a la celula, medir la corriente de la celula y determinar un primer valor de la corriente maxima;

    (c) permitir que transcurra un intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto para permitir que un gradiente electroqmmico decaiga de nuevo a un estado no perturbado;

    (d) aplicar un segundo potencial de prueba despues del intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto, teniendo el segundo potencial de prueba una segunda corriente de polaridad de medicion, y determinar un segundo valor de corriente maxima;

    (e) restar el primer valor de corriente maxima del segundo valor de corriente maxima para determinar una corriente corregida que es proporcional a la concentracion de analito dentro de la muestra; y

    (f) usar la corriente corregida para calcular la concentracion del analito.
11. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que el intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto esta en el intervalo de aproximadamente 1 segundo a 5 segundos.
12. 14. El metodo de la reivindicacion 12, en el que el intervalo de tiempo de potencial de circuito abierto esta en el intervalo de aproximadamente 2 segundo a 3 segundos.
13. 15. El metodo segun la reivindicacion 12, en el que la concentracion de analito se calcula sobre la base de una ecuacion [C] = interseccion + pendiente * (ipb - ipa) donde [C] es una concentracion del analito, ipa ipa es el primer valor de corriente maxima, ipb es el segundo valor de corriente maxima y la pendiente y la interseccion son factores de calibracion.
14. 10. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa (c) incluye ademas funcion del tiempo para obtener un segundo transitorio de corriente.
15. 11. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que la concentracion de ecuacion

    imagen3
16. 16. El metodo de la reivindicacion 12, que comprende ademas medir un primer transitorio de corriente en la etapa (b) y medir un segundo transitorio de corriente es la etapa (c).
17. 17. El metodo segun la reivindicacion 16, en el que la concentracion de analito se calcula sobre la base de una ecuacion

    imagen4

    en la que [C] es una concentracion de analito, ipa es el primer valor de corriente maxima, ipb es el segundo valor de corriente maxima, i2 es un valor de corriente derivado del segundo transitorio de corriente, i3 es un valor de corriente derivado del primer transitorio de corriente y la pendiente y la interseccion son factores de calibracion.