ES2637811T3 - Membrana espaciadora mejorada para un sensor enzimático in vivo - Google Patents

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Abstract

Sistema de electrodos para la medición de la concentración de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moléculas de enzima inmovilizadas, opcionalmente una barrera de difusión que controla la difusión del analito desde el exterior del sistema de electrodos hasta las moléculas de enzima, caracterizado por que una membrana espaciadora forma por lo menos una parte de la capa externa del sistema de electrodos y en la que la membrana espaciadora comprende un copolímero hidrofílico de monómeros acrílicos y/o metacrílicos, en la que el copolímero hidrofílico comprende más de 50% molar de monómeros hidrofílicos.

Description

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DESCRIPCION
Membrana espaciadora mejorada para un sensor enzimatico in vivo
La presente invencion se refiere a un sistema de electrodos para medir la concentracion de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moleculas de enzima inmovilizadas y una barrera mejorada a la difusion que controla la difusion del analito a partir de ffquido corporal circundante al sistema de electrodos a las moleculas de enzima.
Ademas, la presente invencion se refiere a un sistema de electrodos para medir la concentracion de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moleculas de enzima inmovilizadas, opcionalmente una barrera mejorada a la difusion que controla la difusion del analito a partir del exterior del sistema de electrodos a la molecla de enzima y una membrana espaciadora mejorada que forma por lo menos una parte de la capa externa del sistema de electrodos.
Los sensores con sistemas de electrodos implantables o insertables facilitan la medicion de analitos fisiologicamente significativos, tales como, por ejemplo, lactato o glucosa, en el cuerpo del paciente. Los electrodos de trabajo de los sistemas de este tipo presentan capas de enzimas electricamente conductores en las que se encuentran moleculas de enzima unidas que liberan portadores de cargas mediante conversion catafftica de las moleculas de analito. En el procedimiento, se genera una corriente electrica como senal medible la amplitud de la cual se correlaciona con la concentracion del analito.
Se conocen dichos sistemas de electrodos a partir de, por ejemplo, los documentos n° WO 2007/147475 y n° WO 2010/028708.
Los electrodos de trabajo del sistema de electrodos estan provistos de una barrera de difusion que controla la difusion del analito que debe determinarse desde el ffquido o tejido corporal circundante al sistema de electrodos hasta las moleculas de enzima que se encuentran inmovilizadas en la capa de enzima. Segun el documento n° WO 2010/028708, la barrera de la diffusion del sistema de electrodos es una solucion de solidos de por lo menos dos poffmeros diferentes, preferentemente de acrilatos. Los poffmeros pueden ser copoffmeros, por ejemplo copoffmeros de metacrilato de metilo y metacrilato de hidroxietilo o copoffmeros de metacrilato de butilo y metacrilato de hidroxietilo.
El documento n° WO 2007/147475 da a conocer una barrera de difusion realizada en un poffmero que presenta una estructura zwiterionica. Un ejemplo de dicho poffmero es poli(2-metacriloiloxietil fosforilcolina-co-n-butilmetacrilato).
El poffmero zwiterionico puede mezclarse con otro poffmero, por ejemplo poliuretano.
La utilizacion de mezclas de poffmeros o copoffmeros, sin embargo, adolece de desventajas en el aspecto de que la preparacion de la mezcla y su aplicacion en el sensor resulta tediosa y potencialmente problematica. Habitualmente, los poffmeros que deben mezclarse se disuelven individualmente y las soluciones resultantes seguidamente se mezclan en la proporcion deseada. Sin embargo, lo anterior puede resultar en la precipitacion de uno de los componentes y en consecuencia en problemas de trabajabilidad, por ejemplo en un procedimiento de pulverizacion.
Se producen mayores dificultades en el caso de que la mezcla comprenda un poffmero con caractensticas ionicas, es decir, en el caso de que uno de los poffmeros que debe mezclarse comprenda un monomero con grupos anionicos o cationicos. La presencia de dichos grupos cargados, sin embargo, presenta un fuerte efecto sobre la solubilidad, haciendo diffcil encontrar un solvente que resulte adecuado para tanto el poffmero cargado como para un poffmero no cargado.
El documento n° WO 2006/058779 da a conocer un sensor basado en enzimas con una difusion combinada y una capa de enzima que comprende por lo menos un material polimerico y partfculas portadoras de un enzima, en el que las partfculas se dispersan en el material de poffmero. El poffmero puede comprender secuencias de cadena de poffmero hidrofflicas ademas de hidrofobicas; por ejemplo, el poffmero puede ser un copoffmero de polieter- poliuretano de alta o baja incorporacion de agua. La utilizacion de copoffmeros en bloque que presentan por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico a modo de capa de difusion no se da a conocer.
El documento n° EP-A-2 163 190 describe un sistema de electrodos para la medicion de una concentracion de analito que comprende in vivo un contraelectrodo con un conductor electrico y un electrodo de trabajo con un conductor electrico sobre el que se localiza una capa de enzima que comprende moleculas de enzima inmovilizadas. Una barrera de difusion controla la difusion del analito desde ffquidos corporales circundantes a las moleculas de enzima. La barrera de difusion puede comprender poliuretanos hidrofilizados obtenibles mediante policondensacion de 4,4'-metilen-bis-(ciclohexiliscianato) y mezclas de diol que pueden ser polietilenglicol y polipropilenglicol. La capa de poliuretano hidrofflica puede cubrirse con un espaciador, por ejemplo un copoffmero de metacrilato de butilo y 2- metacriloiloxietil-fosforil-colina. La utilizacion de copoffmeros en bloque que presentan por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico a modo de capa de difusion no se da a conocer. Tampoco se ha da
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a conocer la utilizacion de un copoKmero hidrofilico de monomeros (meta)acnlicos que comprenden mas de 50% molar de monomeros hidrofflicos.
Es un objetivo de la presente invencion proporcionar una barrera de difusion en un sistema de electrodos de un sensor enzimatico in vivo que proporciona caractensticas ffsicoqmmicas deseables y que pueden fabricarse facilmente.
Dicho objetivo se cumple proporcionando una barrera de difusion que consiste de un unico copoKmero en bloque que presenta por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico. Los bloques hidrofflico e hidrofobico se encuentran unidos covalentemente entre st Preferentemente, los bloques son bloques de polfmero (meta)acrilato.
La barrera de difusion basada en copolfmero en bloque proporciona excelentes caractensticas ffsicoqmmicas, de la manera siguiente:
(i) permeabilidad de la barrera de difusion al analito que debe determinarse,
(ii) caractensticas de permeabilidad de la barrera de difusion que resultan adecuadas para el comportamiento a corto plazo (humectabilidad) y el comportamiento a largo plazo (deriva del sensor) del electrodo,
(lii) flexibilidad mecanica de la barrera de difusion, que permite la fabricacion de sensores in vivo con multiples electrodos extendidos,
(iv) incorporacion eficiente de grupos ionicos en la capa de diffusion, es decir, puede ajustarse eficientemente la densidad de las cargas cationicas o anionicas dentro del polfmero; ello resulta relevante para la repulsion o atraccion de los
analitos cargados y/o para el control de la adhesion celular, por ejemplo de monocitos del lfquido o tejido corporal circundante.
Una materia objeto de la presente invencion es un sistema de electrodos para medir la concentracion de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moleculas de enzima inmovilizadas, opcionalmente una barrera mejorada a la difusion que controla la difusion del analito desde el exterior del sistema de electrodos hasta las moleculas de enzima y una membrana espaciadora mejorada que presenta por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico.
Preferentemente, la barrera de difusion comprende un solo, es decir, un unico copolfmero en bloque que presenta por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico, es decir, no se encuentran presentes polfmeros o copolfmeros adicionales. Mas preferentemente, la barrera de difusion que consiste de un unico copolfmero en bloque que presenta por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico.
El sistema de electrodos de la presente invencion resulta adecuado para la insercion o implante en el cuerpo, por ejemplo el cuerpo de un mairnfero, tal como el cuerpo humano. El sistema de electrodos esta adaptado para medir un analito deseado en lfquido corporal y/o tejido corporal, por ejemplo en el espacio extracelular (intersticio), en la sangre o en vasos linfaticos o en el espacio transcelular.
El sistema de electrodos insertado o implantado resulta adecuado para la aplicacion a corto plazo, por ejemplo durante 3 a 14 dfas, o para la aplicacion a largo plazo, por ejemplo durante 6 a 12 meses. Durante el periodo de insercion o implante, puede determinarse un analito deseado mediante mediciones continuas o discontinuas.
El sistema de electrodos e la invencion preferentemente es parte de un sensor enzimatico no fluido (ENF), en el que se determina la conversion enzimatica del analito. Preferentemente, el sensor comprende un electrodo de trabajo con moleculas de enzima inmovilizadas para la conversion del analito que resulta en la generacion de una senal electrica. Los enzimas pueden encontrarse presentes en una capa que cubre el electrodo. Ademas, pueden encontrarse presentes mediadores redox y/o electrocatalizadores, asf como parffculas conductoras y formadores de poros. Este tipo de electrodo se describe en, por ejemplo, el documento n° WO 2007/147475.
La zona del electrodo de trabajo es la zona sensible del sensor. Esta zona sensible se proporciona con una barrera de difusion que controla la difusion del analito desde el exterior, por ejemplo ffquido y/o tejido corporal circundante al sistema de electrodos, hasta las moleculas de enzima. La barrera de difusion puede ser, por ejemplo, una capa de cubricion que cubre la capa de enzima, es decir, una capa sin enzima. Sin embargo, resulta igualmente factible que las parffculas de control de la difusion se incorporen en la capa de enzima a fin de actuar como barrera de difusion. Por ejemplo, pueden llenarse poros de la capa de enzima con el poffmero que controla la difusion de las moleculas de analito. El grosor de la barrera de difusion habitualmente es de entre aproximadamente 2 y 20 pm, por ejemplo de entre aproximadamente 2 y 15 pm, o de entre aproximadamente 5 y 20 pm, particularmente de entre aproximadamente 5 y 10 pm o de entre aproximadamente 10 y 15 pm (en estado seco).
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La barrera de difusion del sistema de electrodos de la presente invencion comprende un copoKmero en bloque, preferentemente un unico copoKmero en bloque que presenta por lo menos un grupo hidrofflico y por lo menos un grupo hidrofobico. El copolfmero en bloque puede comprender una secuencia alternante de bloques, es decir, un bloque hidrofflico se une a un bloque hidrofobico. Los bloques hidrofflico e hidrofobico se unen covalentemente entre sf dentro de una molecula de polfmero. El peso molecular medio del polfmero (en peso) habitualmente es de entre 20 y 70 kD, particularmente de entre 25 y 60 kD y mas particularmente de entre 30 y 50 kD. La proporcion molar de partes hidrofflica a hidrofobica en el copolfmero en bloque habitualmente se encuentra en el intervalo de entre aproximadamente 75% (hidrofflico): 25% (hidrofobico) y aproximadamente 25% (hidrofflico): 75% (hidrofobico), en el intervalo de entre aproximadamente 65% (hidrofflico): 35% (hidrofobico) y aproximadamente 35% (hidrofflico): 65% (hidrofobico) o en el intervalo de entre aproximadamente 60% (hidrofflico): 40% (hidrofobico) y aproximadamente 40% (hidrofflico): 60% (hidrofobico). Un bloque hidrofflico del copolfmero en bloque consiste de por lo menos 90%, de por lo menos 95% y en particular completamente de unidades monomericas hidrofflicas. Habitualmente presenta una longitud de entre 50 y 400, por ejemplo de entre 50 y 200 o de entre 150 y 300, en particular de entre 100 y 150 o de entre 200 y 250 moleculas monomericas. Un bloque hidrofflico del copolfmero en bloque consiste de por lo menos 90%, de por lo menos 95% y todavfa mas en particular consiste completamente de unidades monomericas hidrofflicas. Habitualmente presenta una longitud de entre 50 y 300, por ejemplo de entre 50 y 200 o de entre 150 y 250, en particular de entre 80 y 150 o de entre 170 y 200 moleculas monomericas.
Los bloques hidrofflicos y/o los bloques hidrofobicos preferentemente consisten de unidades basadas en acido metacrilico. Mas preferentemente, tanto los bloques hidrofflicos como los bloques hidrofobicos consisten de unidades monomericas basadas en acido metacrilico.
Las unidades monomericas hidrofflicas del bloque hidrofflico preferentemente se seleccionan de entre esteres (meta)acnlicos hidrofflicos, es decir esteres con un grupo polar, es decir OH, OCH3 o OC2H5 dentro de la parte alcohol del ester, (meta)acrilamidas hidrofflicas con un grupo amida (NH2) o un grupo N-alquilo- o N,N-dialquilamida, en el que el grupo alquilo comprende 1 a 3 atomos de C y opcionalmente grupos hidrofflicos, tales como OH, OCH3 o OC2H5 y unidades (meta)acnlicas adecuadas que presentan un grupo cargado, por ejemplo un grupo anionico o cationico, tal como acido acnlico (acrilato) o acido metacnlico (metacrilato). Ademas, pueden utilizarse combinaciones de unidades monomericas.
Los ejemplos espedficos de unidades monomericas preferentes para el bloque hidrofflico se seleccionan de entre:
acrilato de 2-hidroxietilo,
metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA),
acrilato de 2-metoxietilo,
metacrilato de 2-metoxietilo,
acrilato de 2-etoxietilo,
metacrilato de 2-metoxietilo,
acrilato de 2- o 3-hidroxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-hidroxipropilo (2- o 3-HPMA),
acrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
acrilato de 2- o 3-etoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-etoxipropilo,
acrilato de 1- o 2-glicerol,
metacrilato de 1- o 2-glicerol,
acrilamida,
metacrilamida,
una acrilamida de N-alquilo o N,N-dialquilo, y
una metacrilamida de N-alquilo o de N,N-dialquilo, en la que el alquilo comprende 1 a 3 atomos de C, tal como metilo, etilo o propilo, acido acnlico (acrilato), acido metacnlico (metacrilato) y combinaciones de los mismos.
Los monomeros hidrofflicos preferentes son metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) y/o metacrilato de 2- o 3- hidroxipropilo (2- o 3-HPMA). Mas preferentemente, el bloque hidrofflico consiste de por lo menos dos unidades monomericas hidrofflicas diferentes. Por ejemplo, puede ser un copolfmero aleatorio de por lo menos dos unidades monomericas hidrofflicas diferentes, tales como HEMA y 2-HPMA.
Con el fin de introducir grupos ionicos en el monomero, pueden incorporarse en el bloque hidrofflico unidades monomericas cargadas, tales como acido acnlico (acrilato) y/o acido metacnlico (metacrilato). De esta manera, en una realizacion particular de la presente invencion, el bloque hidrofflico puede prepararse a partir de por lo menos una unidad monomericas hidrofflica no ionica (por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente) y a partir de por lo menos una unidad monomericas hidrofflica ionica, en la que la unidad monomericas ionica se encuentra presente en una cantidad molar de preferentemente 1% a 20% molar. En el caso de que el bloque hidrofflico comprenda una
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unidad monomerica ionica, tal como acido acrilico o acido metacrilico, resulta preferente la copolimerizacion con un monomero hidrofflico seleccionado de entre el grupo de (meta)acrilamidas, en particular acrilamidas o metacrilamidas de N,N-dialquilo.
Las unidades monomericas hidrofobicas del bloque hidrofobico preferentemente se seleccionan de entre unidades acrilicas y/o metacrilicas hidrofobicas, unidades monomericas basadas en el estireno o combinaciones de las mismas. Preferentemente, las unidades monomericas hidrofobicas se seleccionan de entre esteres de (meta)acrilo hidrofobicos, por ejemplo esteres que presentan una parte alcohol con 1a 3 atomos de C sin grupo hidrofilico. Los ejemplos espedficos de unidades monomericas preferentes para el bloque hidrofobico se seleccionan de entre:
acrilato de metilo, metacrilato de metilo (MMA), acrilato de etilo, metacrilato de etilo (EMA), acrilato de n-propilo o i-propilo, metacrilato de n-propilo o i-propilo, acrilato de n-butilo, metacrilato de n-butilo (BUMA), acrilato de neopentilo, metacrilato de neopentilo, y combinaciones de los mismos.
El bloque hidrofobico preferentemente comprende por lo menos dos unidades monomericas hidrofobicas diferentes, que se encuentran presentes, por ejemplo, en forma de un copolimero aleatorio. En una realization preferente, el bloque hidrofobico comprende metacrilato de metilo (MMA) y metacrilato de n-butilo (BUMA). En una realizacion especialmente preferente, el bloque hidrofobico es un copolimero aleatorio de MMA y BUMA. La proportion molar de MMA a BUMA preferentemente es de aproximadamente 60% (MMA): 40% (BUMA)(hidrofobico) y aproximadamente 40% (MMA): 60% (BUMA), por ejemplo de aproximadamente 50% (MMA): 50% (BUMA). La temperatura de transition vrtrea del bloque hidrofobico preferentemente es de 100°C o inferior, de 90°C o inferior o de 80°C o inferior, por ejemplo de entre aproximadamente 40°C y 80°C. En una realizacion alternativa, el bloque hidrofobico puede consistir de unidades estirenicas, por ejemplo de poliestireno con una temperatura de transicion vrtrea de aproximadamente 95°C.
Los copolimeros en bloque utilizados en la presente invention pueden prepararse segun metodos conocidos (Boker et al., Macromolecules 34:7477-7488, 2001).
Los copolimeros en bloque pueden aplicarse al sistema de electrodos mediante tecnicas habituales, por ejemplo proporcionando una solution del copolimero en bloque en un solvente o mezcla de solventes adecuado, por ejemplo un solvente organico, tal como eter, que se aplica al sistema de electrodos prefabricado y se seca sobre el mismo.
Al poner en contacto el copolimero en bloque con agua, muestra una incorporation del agua de preferentemente aproximadamente 15% a 30% en peso (respecto al peso seco de polimero) a una temperatura de 37°C y a un pH de 7,4 (tampon de fosfato acuoso KH2PO4 10 mM, NaH2PO4 10 mM y NaCl 147 mm).
Ademas del copolimero en bloque, la barrera de difusion puede comprender ademas componentes adicionales, en particular componentes no polimericos, que pueden dispersarse y/o disolverse en el polimero. Dichos compuestos adicionales incluyen plastificadores, en particular plastificadores biocompatibles, tales como trimelitato de tri-(2- etilhexilo) y/o glicerol.
La barrera de difusion de la invencion presenta un coeficiente de difusion eficaz Def elevado para la glucosa, que
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preferentemente es > 10 cm /s, mas preferentemente > 510 cm /s y todavia mas preferentemente > 10 cm /s y, por ejemplo, de hasta 10-7 o 10-8 cm2/s a una temperatura de 37°C y a un pH de 7,4. El coeficiente de difusion eficaz preferentemente se determina tal como se indica en el Ejemplo 4 siguiendo la ecuacion:
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en la que SEm es la sensibilidad del electrodo de trabajo, F es la superficie del electrodo de trabajo y Lm es el grosor de capa de la barrera de difusion. SEm y Lm pueden determinarse tal como se indica en los Ejemplos.
El sistema de electrodos de la presente invencion resulta adecuado para medir la concentration de un analito bajo condiciones in vivo, es decir, insertado o implantado en el cuerpo. El analito puede ser cualquier molecula o ion presente en un tejido o liquido corporal, por ejemplo oxigeno, dioxido de carbono, sales (cationes y/o aniones), grasas o componentes lipidicos, carbohidratos o componentes de carbohidratos, protemas o componentes de protemas, u otro tipo de biomoleculas. Resulta especialmente preferente la determination de analitos que pueden
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transferirse eficientemente entre Ifquido corporal, por ejemplo sangre, y tejido, tal como ox^geno, dioxido e carbono, cationes sodio, aniones cloruro, glucosa, urea, glicerol, lactato y piruvato.
El sistema de electrodos comprende un enzima inmovilizado sobre un electrodo. El enzima resulta adecuado para la determinacion de un analito deseado. Preferentemente, el enzima es capaz de convertir catalfticamente el analito y generar de esta manera una senal electrica detectable por el conductor electrico del electrodo de trabajo. El enzima para medir el analito preferentemente es una oxidasa, por ejemplo glucosa oxidasa o lactato oxidasa o una deshidrogenasa, por ejemplo una glucosa deshidrogenasa o una lactato deshidrogenasa. Ademas del enzima, la capa de enzima puede comprender ademas un electrocatalizador o un mediador redox que favorezca la transferencia de electrones a componentes conductores del electrodo de trabajo, por ejemplo partfculas de grafito.
Son electrocatalizadores adecuados, oxidos de metal, tales como dioxido de manganeso, o compuestos organometalicos, tales como ftalocianina de cobalto. En una realizacion preferente, el mediador redox es capaz de degradar el peroxido de hidrogeno, contrarrestando de esta manera el agotamiento del oxfgeno en el medio circundante al electrodo de trabajo. En una realizacion diferente, un mediador redox puede unirse covalentemente al enzima y producir de esta manera la transferencia electronica directa al electrodo de trabajo. Los mediadores redox adecuados para la transferencia electronica directa son grupos prosteticos, tales como la pirroloquinolm quinona (PQQ), el flavin adenrn dinucleotido (FAD) u otros grupos prosteticos conocidos. Los enzimas inmovilizados sobre electrodos se describen en, por ejemplo, el documento n° WO 2007/147475.
Una realizacion preferente del sistema de electrodos comprende un contraelectrodo con un conductor electrico y un electrodo de trabajo con un conductor electrico sobre el que se dispone una capa de enzima y la barrera de difusion. La capa de enzima preferentemente se disena en forma de multiples campos que se disponen en el conductor del electrodo de trabajo a una distancia de, por ejemplo, por lo menos 0,3 mm o a por lo menos 0,5 mm uno de otro, Los campos individuales del electrodo de trabajo pueden formar una serie de electrodos de trabajo individuales. Entre estos campos, el conductor del electrodo de trabajo pude cubrirse con una capa de aislamiento. Mediante la disposicion de los campos de la capa de enzima sobre aberturas en la capa electricamente aislante puede mejorarse la relacion de senal-ruido. Se da a conocer una disposicion tal como la indicada anteriormente en el documento n° WO 2010/028708.
El sistema de electrodos de la invencion puede comprender adicionalmente un electrodo de referencia capaz de producir un potencial de referencia para el electrodo de trabajo, por ejemplo un electrodo de referencia Ag/Ag-Cl.
Ademas, un sistema de electrodos segun la invencion puede presentar contraelectrodos y/o electrodos de trabajo adicionales.
El sistema de electrodos puede ser parte de un sensor, por ejemplo mediante la conexion a un potenciostato y un amplificador para la amplificacion de las senales medidas del sistema de electrodos. El sensor preferentemente es un sensor enzimatico no fluido (ENF), mas preferentemente un sensor ENF electroqmmico. Los electrodos del sistema de electrodos pueden disponerse sobre un sustrato que porta el potenciostato o pueden unirse a una placa de circuito que lleva el potenciostato.
Una materia adicional objeto de la invencion se refiere a la utilizacion de un copolfmero en bloque que presenta por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico como barrera de difusion para un electrodo enzimatico. El copolfmero en bloque preferentemente es tal como se ha indicado anteriormente, por ejemplo un unico copolfmero en bloque. La barrera de difusion y el electrodo enzimatico preferentemente son tal como se ha indicado anteriormente.
Se explican detalles y ventajas adicionales de la invencion basandose en una realizacion ejemplar haciendo referencia a los dibujos adjuntos.
La fig. 1 muestra una realizacion ejemplar de un sistema de electrodos segun la invencion.
La fig. 2 muestra una vista de detalle de la fig. 1.
La fig. 3 muestra otra vista de detalle de la fig. 1.
La fig. 4 muestra una seccion a lo largo de la lmea de seccion CC en la fig. 2.
La fig. 5 muestra la sensibilidad (con desviacion estandar) de cuatro sensores de glucosa (con 10 mM de glucosa) provistos de diferentes polfmeros en bloque (C, F, D y B) como capas de barrera.
La fig. 6 muestra la deriva de cuatro sensores de glucosa provistos de diferentes polfmeros en bloque (A, C, D y F) como capas de barrera.
La fig. 7 muestra la conductividad del copolfmero en bloque A dependiente del tiempo (2 experimentos).
La fig. 8 muestra la conductividad del copolfmero en bloque F dependiente del tiempo (3 experimentos).
La fig. 9 muestra la conductividad del copolfmero en bloque H dependiente del tiempo para un grosor de capa de 2,77 pm o 4,43 pm, respectivamente.
La fig. 10 muestra la adhesion del fibrinogeno a diferentes polfmeros de membrana espaciadora in vitro (Adapt® y Eudragit E100) en comparacion con una placa no recubierta (Blanco).
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La fig. 11 muestra la expresion de la protema de superficie CD54 por parte de celulas THP-1 tras la incubacion con sensores recubiertos con una membrana espaciadora (Adapt® y Lipidure CM5206) o no recubiertos (control = celulas no tratadas).
Las figs. 12a y 12b muestran la secrecion de la citoquina IL-8 y MCP-1, respectivamente, por parte de celulas THP-1 tras la incubacion con sensores recubiertos con una membrana espaciadora (Adapt® y Lipidure CM5206) o no recubiertos (control = celulas no tratadas).
La fig. 13 muestra la secrecion de citoquina IL-8 por parte de celulas THP-1 tras la incubacion en placas de cultivo de tejidos recubiertas con una membrana espaciadora (Adapt®, Lipidure CM5206 y Eudragit E100) o no recubiertas (Polyst.) y una capa adicional de fibrinogeno.
La fig. 14 muestra la hemolisis tras la incubacion en sensores recubiertos con una membrana espaciadora (Adapt® y Lipidure CM5206) o no recubiertos en comparacion con el polfmero espaciador Adapt® sin sensor (control negativo = medio de incubacion unicamente; control positivo = 10o% de lisis osmotica).
La figura 1 muestra una realizacion ejemplar de un sistema de electrodos para la insercion en tejido corporal de un ser humano o animal, por ejemplo en la piel o en tejido subcutaneo adiposo. En la figura 2 se muestra ampliada la vista de detalle A; en la figura 3 se muestra ampliada la vista de detalle B. La fig. 4 muestra una seccion transversal correspondiente a lo largo de la lmea de seccion CC de la fig. 2.
El sistema de electrodos mostrado presenta un electrodo de trabajo 1, un contraelectrodo 2 y un electrodo de referencia 3. Los conductores electricos de los electrodos 1a, 2a y 3a estan dispuestos en forma de caminos conductores metalicos, preferentemente realizados en paladio u oro, sobre el sustrato 4. En la realizacion ejemplar mostrada, el sustrato 4 es una placa de plastico flexible, por ejemplo realizada en poliester. El sustrato 4 presenta un grosor inferior a 0,5 mm, por ejemplo de 100 a 300 micrometres y, por lo tanto, resulta facil de doble de manera que puede adaptarse a los movimientos del tejido corporal circundante tras su insercion. El sustrato 4 presenta un eje de pequeno diametro para la insercion en el tejido corporal del paciente y una cabeza ancha para la conexion a un sistema electronico que se dispone en el exterior del cuerpo. El eje del sustrato 4 preferentemente presenta una longitud de por lo menos 1 cm, en particular de 2 a 5 cm.
En la realizacion ejemplar mostrada, una parte del dispositivo de medicion, es decir la cabeza del sustrato, sobresale del cuerpo del paciente durante su utilizacion. Alternativamente, resulta factible tambien, sin embargo, implantar el dispositivo de medicion entero y transmitir los datos medidos inalambricamente a un receptor que se dispone en el exterior del cuerpo.
El electrodo de trabajo 1 lleva una capa de enzima 5 que contiene moleculas de enzima inmovilizadas para la conversion catalttica del analito. La capa de enzima 5 puede aplicarse, por ejemplo, en forma de una pasta curable de partfculas de carbono, un agente ligante polimerico, un mediador redox o un electrocatalizador y moleculas de enzima. Se da a conocer informacion sobre la produccion de una capa de enzima 5 de dicho tipo en, por ejemplo, el documento n° WO 2007/147475, al que se hace referencia en el presente contexto.
En la realizacion ejemplar mostrada, la capa de enzima 5 no se aplica continuamente sobre el conductor 1a del electrodo de trabajo 1 sino por el contrario en forma de campos individuales que se disponen distanciados entre sf. Los campos individuales de la capa de enzima 5 en la realizacion ejemplar mostrada se disponen en una serie.
El conductor 1a del electrodo de trabajo 1 presenta pequenos sitios entre los campos de la capa de enzima que se observan particularmente bien en la figura 2. El conductor 2a del contraelectrodo 2 presenta un contorno que sigue el curso del conductor 1a del electrodo de trabajo 1. Lo anterior resulta en una disposicion intercalada o interdigitada del electrodo de trabajo 1 y el contraelectrodo 2 con caminos de corriente ventajosamente cortos y baja densidad de corriente.
Con el fin de incrementar su superficie eficaz, puede proporcionarse al contraelectrodo 2 una capa electricamente conductora porosa 6 que se situa en forma de campos individuales sobre el conductor 2a del contraelectrodo 2. Al igual que la capa de enzima 5 del electrodo de trabajo 1, dicha capa 6 puede aplicarse en forma de una pasta curable de paiireulas de carbono y un agente ligante polimerico. Los campos de la capa 6 preferentemente presentan las mismas dimensiones que los campos de la capa de enzima 5, aunque ello no es obligatorio. Sin embargo, tambien pueden omitirse las medidas para incrementar la superficie del contraelectrodo y el contraelectrodo 2 puede disenarse igualmente para que sea un camino conductor lineal sin recubrimiento de ningun tipo, o con un recubrimiento realizado a partir del copolfmero en bloque indicado y opcionalmente un espaciador.
El electrodo de referencia 3 se dispone entre el conductor 1a del electrodo de trabajo 1 y el conductor 2a del contraelectrodo 2. El electrodo de referencia mostrado en la figura 3 consiste de un conductor 3a sobre el que se aplica un campo 3b de pasta conductora de plata/cloruro de plata.
La fig. 4 muestra una seccion transversal esquematica a lo largo de la lmea de seccion CC de la fig. 2. La lmea de seccion, CC, se extiende a traves de uno de los campos de la capa de enzima 5 del electrodo de trabajo 1 y entre los campos de la capa conductora 6 del contraelectrodo 2. Entre los campos de la capa de enzima 5, el conductor 1a del electrodo de trabajo 1 puede recubrirse con una capa electricamente aislante 7, tal como el conductor 2a del
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contraelectrodo 2 entre los campos de las capas conductoras 6 con el fin de evitar reacciones de interferencia que de otra manera podffan resultar catalizadas por el metal de los caminos conductores 1a y 2a. Por lo tanto, se situan los campos de la capa de enzima 5 en aberturas de la capa aislante 7. De manera similar, los campos de la capa conductora 6 del contraelectrodo 2 tambien pueden situarse sobre las aberturas de la capa aislante 7.
La capa de enzima 5 se recubre con una capa de recubrimiento 8 que presenta una resistencia a la difusion del analito que debe medirse y, por lo tanto, actua como una barrera a la difusion. La barrera de difusion 8 consiste de un unico copoffmero con bloques alternantes hidrofflicos e hidrofobicos tal como se ha indicado anteriormente.
Un grosor favorable de la capa de recubrimiento 8 es de, por ejemplo, 3 a 30 pm, en particular de aproximadamente 5 a 10 pm o de aproximadamente 10 a 15 pm. Debido a su resistencia a la difusion, la capa de recubrimiento 8 provoca que menos moleculas de analito alcancen la capa de enzima 5 por unidad de tiempo. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la capa de recubrimiento 8 reduce la tasa a la que las moleculas de analito son convertidas y, por lo tanto, contrarresta el agotamiento de la concentracion de analito en el medio circundante al electrodo de trabajo.
La capa de recubrimiento 8 se extiende continuamente esencialmente sobre la totalidad de la superficie del conductor 1a del electrodo de trabajo 1. Sobre la capa de recubrimiento 8 puede aplicarse una membrana biocompatible como espaciador 9 que fija una distancia minima entre la capa de enzima 5 y las celulas del tejido corporal circundante. De esta manera se genera ventajosamente un reservorio para las moleculas de analito a partir del cual las moleculas de analito pueden alcanzar el campo de la capa de enzima 5 correspondiente en el caso de una perturbacion transitoria del intercambio de ffquidos en el medio circundante al campo de la capa de enzima 5.
En el caso de que el intercambio de ffquido corporal con el medio circundante al sistema de electrodos este limitado transitoriamente o incluso bloqueado, las moleculas de analito almacenadas en el espaciador 9 se difunden continuamente a la capa de enzima 5 del electrodo de trabajo 1, en donde son convertidas. Por lo tanto, el espaciador 9 provoca que se produzca una notable reduccion de la concentracion de analito y la correspondiente falsificacion de los resultados de medicion unicamente despues de un periodo de tiempo significativamente mas largo. En la realizacion ejemplar mostrada, la membrana que forma el espaciador 9 tambien recubre el contraelectrodo 2 y el electrodo de referencia 3.
La membrana espaciadora 9 puede ser, por ejemplo, una membrana de dialisis. En el presente contexto, se entiende que una membrana de dialisis es una membrana que es impermeable a moleculas de tamano superior al tamano maximo. La membrana de dialisis pueden prefabricarse en un procedimiento de fabricacion independiente y despues puede aplicarse durante la fabricacion del sistema de electrodos. El tamano maximo de las moleculas para las que es permeable la membrana de dialisis se selecciona de manera que puedan pasar las moleculas de analito, mientras que las moleculas de tamano mayor resultan retenidas.
Alternativamente, en lugar de una membrana de dialisis puede aplicarse un recubrimiento realizado en un poffmero que es altamente permeable al analito y al agua, por ejemplo basado en poliuretano o en acrilato, sobre el sistema de electrodos a modo de membrana espaciadora 9.
Preferentemente, el espaciador esta realizado en un copoffmero de (meta)acrilatos. Preferentemente, la membrana espaciadora es un copoffmero de por lo menos 2 o 3 (meta)acrilatos. Mas preferentemente, la membrana espaciadora comprende mas de 50% molar, por lo menos 60% molar o por lo menos 70% molar de unidades de monomero hidrofflico, por ejemplo HEMA y/o 2-HPMA, y hasta 40% molar o hasta 30% molar de unidades hidrofobicas, por ejemplo BUMA y/o MMA. El espaciador puede ser un copoffmero aleatorio o en bloque. Una membrana espaciadora especialmente preferente comprende MMA o BUMA como fracciones hidrofobicas y 2- HEMA y/o 2-HPMA como fracciones hidrofflicas. Preferentemente, la cantidad de los monomeros hidrofflicos HEMA y/o HPMA es de entre 80% molar y 85% molar, y la cantidad del componente hidrofobico MMA y/o BUMA es de entre 15% molar y 20% molar.
La membrana espaciadora mas preferente de la invencion esta realizada en copoffmero Adapt® (BioInteractions Ltd., Reading, Inglaterra). Adapt® comprende BUMA como fraccion hidrofobica y 2-HEMA y 2-HPMA como fracciones hidrofflicas, en las que la cantidad de los monomeros hidrofflicos 2-HEMA es de aproximadamente 80% molar.
La membrana espaciadora es altamente permeable al analito, es decir, no reduce significativamente la sensibilidad por unidad de superficie del electrodo de trabajo, por ejemplo 20% o menos, o 5% o menos, con un grosor de la capa inferior a aproximadamente 20 pm, preferentemente inferior a aproximadamente 5 pm. Un grosor especialmente preferente de la membrana espaciadora es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 pm.
La capa de enzima 5 del sistema de electrodos puede contener parffculas de oxido de metal, preferentemente parffculas de dioxido de manganeso, a modo de mediador redox catafftico. El dioxido de manganeso convierte cataffticamente el peroxido de hidrogeno que se forma, por ejemplo, por la oxidacion enzimatica de la glucosa y otros bioanalitos. Durante la degradacion del peroxido de hidrogeno, las parffculas de dioxido de manganeso
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transfieren electrones a componentes conductores del electrodo de trabajo 1, por ejemplo a particulas de grafito en la capa de enzima 5. La degradation catalrtica del peroxido de hidrogeno contrarresta cualquier eduction de la concentration de ox^geno en la capa de enzima 5. Ventajosamente, lo anterior permite que la conversion de analito que debe detectarse en la capa de enzima 5 no se encuentre limitada por la concentracion local de oxigeno. Por lo tanto, la utilization del mediador redox catalUico contrarresta una falsification del resultado de medicion debido a que la concentracion de oxigeno es baja. Otra ventaja del mediador redox catalrtico es que evita la generation de concentraciones daninas para las celulas de peroxido de hidrogeno.
El polimero de membrana espaciadora preferente indicado en la presente memoria puede utilizarse como recubrimiento externo para la barrera de difusion de la presente invention, aunque tambien como recubrimiento externo de un sistema de electrodos en general, en particular de un sistema de electrodos para la medicion de la concentracion de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moleculas de enzima inmovilizadas y una barrera de difusion que controla la difusion del analito desde el exterior del sistema de electrodos a las moleculas de enzima. De esta manera, la membrana espaciadora puede disponerse sobre la barrera de difusion; sin embargo, la membrana espaciadora tambien puede disponerse directamente sobre la capa de enzima. En este ultimo contexto, la membrana espaciadora misma tambien puede actuar como una barrera de difusion y enlentecer la difusion de las moleculas de analito a la capa de enzima.
Al insertar o implantar el sistema de electrodos de la invencion en el cuerpo, la membrana espaciadora constituye la interfaz entre el sensor implantado y el liquido o tejido corporal circundante. En consecuencia, al exponerla al liquido o tejido corporal, la membrana espaciadora de la invencion debe ser mecanicamente robusta de manera que no resulte ni deformada ni empujada fuera del sensor. Con este fin la incorporation de agua del copolimero de la membrana espaciadora y el hinchado concomitante del copolimero deben estar limitados, a pesar de la hidrofilicidad inherente del copolimero.
Preferentemente, la incorporacion de agua relativa del copolimero de la membrana espaciadora no deberia exceder 50% en peso, preferentemente 40% en peso, mas preferentemente 30% en peso, respecto a la tasa total del copolimero. En el contexto de la presente invencion, la medicion de la incorporacion relativa de agua se lleva a cabo sometiendo el copolimero seco a un exceso de tampon fosfato (pH 7,4) durante 48 h a una temperatura de 37°C. La incorporacion relativa de agua (% IA) preferentemente se determina segun la ecuacion:
WU% = (m2-mi)/mi x 100,
en la que m1 y m2 representan, respectivamente, la masa de copolimero seco y el copolimero despues de la hidratacion segun las condiciones de medicion anteriormente indicadas.
Los inventores de la presente invencion han determinado que la membrana espaciadora preferente realizada en el copolimero Adapt® incorpora hasta 33 ± 1,8% en peso de tampon fosfato (pH 7,4) respecto a su propio peso durante 48 h a 37°C. Bajo las mismas condiciones, una membrana de polimero Lipidure CM5206 (NOF Corporation, Japon) incorpora 157 ± 9,7% en peso de tampon fosfato respecto a su propio peso. La incorporacion de agua mas baja del polimero incrementa ventajosamente la estabilidad mecanica de la membrana espaciadora de la presente invencion. En contraste, Lipidure CM5206 muestra una incorporacion de agua mas alta y se hincha formando un hidrogel que es mas fragil, facilmente deformable o expulsable, en particular al aplicarlo sobre un sistema de electrodos de un sensor enzimatico in vivo.
Ademas, durante la insertion e implementation del sistema de electrodos, el espaciador se encuentra en contacto directo con el tejido y/o liquido corporal, tal como liquido intersticial o sangre, que contiene biomoleculas tales como protemas y celulas. Ventajosamente, la membrana espaciadora debe proteger el sensor insertado e implantado en el medio tejido y/o liquido corporal y, de esta manera, minimizar la reaction del tejido en el cuerpo frente al implante. De hecho, las reacciones del cuerpo contra el material implantado se conocen como "respuesta a cuerpos extranos" (RCE). Mediante la RCE, el cuerpo intenta destruir el implante o, en caso de no resultar posible, intenta crear una capsula para separarlo del tejido circundante (granuloma por cuerpo extrano). La primera etapa de la reaccion de RCE es la union de protemas (por ejemplo fibrinogeno, albumina, inmunoglobulinas y complemento) ala superficie del material anterior, es decir, el implante. Este recubrimiento de protemas presenta sitios de union a receptores sobre las celulas inmunologicas. Por ejemplo, el fibrinogeno contiene un motivo estructural que se une al receptor de monocitos MAC-1. Al unirse el fibrinogeno a la superficie del implante, cambia su conformation y expone el sitio de union a MAC-1. En consecuencia, las celulas inmunologicas, tales como los monocitos, son atraidos al implante y activados, secretando enzimas y radicales que atacan al mismo. Ademas, las celulas inmunologicas secretan factores solubles, es decir citoquinas, que atraen y activan otras celulas inmunologicas y, de esta manera, amplifican la respuesta inmunologica. En el caso de que no resulte posible eliminar el implante, las celulas y protemas del tejido conectivo forman una capsula fibrosa. Sin embargo, esta capsula es una barrera de difusion que impide que los analitos alcancen el sensor. Conjuntamente los sucesos de la respuesta a cuerpos extranos tal como se ha descrito anteriormente es probable que interfiera con la funcion del sistema de electrodos in vivo y con su tiempo de vida.
De esta manera, una membrana espaciadora mejorada sobre un sistema de electrodos de un sensor enzimatico in
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vivo proporciona ademas una reduccion de la respuesta del tejido al implante y la inhibicion de la formacion de una capsula que separa el sensor del tejido y ffquidos corporales circundantes.
De esta manera, es un objetivo adicional de la presente invencion proporcionar un sistema de electrodos para medir la concentracion de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moleculas de enzima inmovilizadas y preferentemente una barrera de difusion que controla la difusion del analito desde el exterior del sistema de electrodos hasta las moleculas de enzima, caracterizado porque la membrana espaciadora forma por lo menos una parte de la capa externa del sistema de electrodos, en el que la membrana espaciadora comprende un copoffmero hidrofflico de monomeros acnlicos y/o metacnlicos, en el que el poffmero comprende mas de 50% molar de monomeros hidrofflicos.
Tal como se ha indicado anteriormente, la membrana espaciadora de la invencion efectivamente presenta una capacidad limitada de union a protemas para la proteccion del sistema de electrodos del sensor frente a la adsorcion de protemas que podnan inducir la respuesta de las celulas inmunologicas y podnan limitar o interferir con su rendimiento in vivo. Los Ejemplos 5 y 6 muestran que la membrana espaciadora preferente de la invencion proporciona poca union al fibrinogeno y evita el cambio conformacional del fibrinogeno que podna conducir a que el motivo de union a MAC-1 quedara expuesto a los monocitos. Ventajosamente, el material de copoffmero de la membrana espaciadora no activa las celulas inmunologicas por sf mismo. En el Ejemplo 6, pudo demostrarse que el copoffmero de membrana espaciadora de la invencion es capaz de atenuar la activacion de las celulas inmunologicas por el sensor implantado. Ademas, ventajosamente, la membrana espaciadora es un material biocompatible, en particular es compatible con ffquidos corporales, por ejemplo con la sangre. El Ejemplo 7 demuestra que el copoffmero de membrana espaciadora de la presente invencion es capaz de impedir la hemolisis y la activacion del complemento por parte del sensor implantado. De esta manera, la membrana espaciadora de la invencion ventajosamente no solo muestra una estabilidad mecanica elevada, sino que tambien presenta propiedades biocompatibles optimas, lo que resulta inesperado debido a la baja incorporacion del agua tras humectarse.
Las caractensticas de la presente realizacion en particular con respecto a la estructura del sistema de electrodos, el analito y las moleculas de enzima son tal como se indican en la presente memoria. La barrera de diffusion preferentemente es tal como se indica en la presente memoria. Sin embargo, tambien puede presentar una composicion diferente o puede encontrarse ausente. Segun una realizacion preferente, la barrera de difusion preferentemente comprende un copoffmero en bloque que presenta por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico tal como se indica en la presente memoria.
Segun una realizacion preferente adicional, la barrera de difusion comprende poliuretanos hidrofflicos. Los poliuretanos hidrofflicos utilizados como membrana de difusion pueden producirse mediante poliadicion de un (poli)diisocianato, preferentemente 4,4-metilen-bis(ciclohexilisocianato) con un polialcohol, preferentemente una mezcla de dioles.
Los componentes de la mezcla de dioles preferentemente son polialquilenglicoles, tales como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG) y dioles alifaticos, tales como etilenglicol. Preferentemente, el poliuretano hidrofflico comprende 45% a 55% molar, preferentemente 50% molar de isocianato y 25% a 35% molar, preferentemente 30% molar de etilenglicol. A continuacion, se ajusta el grado de hidrofilizacion utilizando la proporcion de PEG a PPG. Preferentemente, el poliuretano comprende 2% a 3% molar, mas preferentemente 2,5% molar de PEG y 17% a 18% molar, preferentemente 17,5% molar de PPG. Con el fin de incrementar la hidrofilicidad del poliuretano, la proporcion de PEG puede incrementarse, por ejemplo, a 4,5-5,5% molar, preferentemente a 5% molar de PEG, con el fin de obtener un poliuretano extremadamente hidrofflico. Las variantes hidrofflicas diferentes de los poliuretanos tambien pueden mezclarse con el fin de optimizar las propiedades de la barrera de difusion.
Los monomeros acnlicos y metacnlicos preferentes del copoffmero de membrana espaciadora son tal como se indica en la presente memoria.
Las unidades monomericas hidrofflicas preferentemente se seleccionan de entre esteres (meta)acnlicos hidrofflicos, es decir, esteres con un grupo polar, es decir OCH3 o OC2H5 dentro de la parte alcohol del ester, (meta)acrilamidas hidrofflicas con una amida (NH2) o un grupo N-alquil- o N,N-dialquil-amida, en el que el grupo alquilo comprende 1 a 3 atomos de C y opcionalmente grupos hidrofflicos, tales como OH, OCH3 o OC2H5 y unidades (meta)acnlicas adecuadas que presentan un grupo cargado, por ejemplo anionico o cationico, tal como acido acnlico (acrilato) o acido metacnlico (metacrilato). Ademas, pueden utilizarse combinaciones de unidades monomericas.
Los ejemplos espedficos de unidades monomericas preferentes para el bloque hidrofflico se seleccionan de entre:
acrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), acrilato de 2-metoxietilo, metacrilato de 2-metoxietilo, acrilato de 2-etoxietilo,
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acrilato de 2- o 3-hidroxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-hidroxipropilo (2- o 3-HPMA),
acrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
acrilato de 2- o 3-etoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-etoxipropilo,
acrilato de 1- o 2-glicerol,
metacrilato de 1- o 2-glicerol,
acrilamida,
metacrilamida,
una acrilamida de N-alquilo o N,N-dialquilo, y
una metacrilamida de N-alquilo o de N,N-dialquilo, en la que el alquilo comprende 1 a 3 atomos de C, tal como metilo, etilo o propilo, acido acnlico (acrilato), acido metacnlico (metacrilato) y combinaciones de los mismos.
Los monomeros hidrofflicos preferentes son metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) y/o metacrilato de 2- o 3- hidroxipropilo (2- o 3-HPMA).
Las unidades monomericas hidrofobicas preferentemente se seleccionan de entre unidades acrfficas y/o metacrfficas hidrofobicas o combinaciones de las mismas. Preferentemente, las unidades monomericas hidrofobicas se seleccionan de entre esteres de (meta)acrilo hidrofobicos, por ejemplo esteres que presentan una parte alcohol con 1 a 3 atomos de C sin grupo hidrofflico.
Los ejemplos espedficos de unidades monomericas para el bloque hidrofobico se seleccionan de entre:
acrilato de metilo, metacrilato de metilo (MMA), acrilato de etilo, metacrilato de etilo (EMA), acrilato de n-propilo o i-propilo, metacrilato de n-propilo o i-propilo, acrilato de n-butilo, metacrilato de n-butilo (BUMA), acrilato de neopentilo, metacrilato de neopentilo, y combinaciones de los mismos.
En una realizacion preferente, el bloque hidrofobico comprende metacrilato de metilo (MMA) y metacrilato de n-butilo (BUMA).
La membrana espaciadora externa preferentemente cubre por lo menos la parte de electrodo de trabajo que comprende las moleculas de enzima y opcionalmente tambien otras partes, por ejemplo el contraelectrodo. En caso de hallarse presente, la membrana espaciadora tambien cubre el electrodo de referencia. La membrana espaciadora preferentemente cubre la superficie implantada entera del sistema de electrodos. La membrana espaciadora preferentemente cubre el electrodo de trabajo, opcionalmente el contraelectrodo y el electrodo de referencia en caso de hallarse presente, en forma de una capa continua.
El sistema de electrodos que comprende la membrana espaciadora mejorada de la invencion puede ser parte de un sensor, por ejemplo mediante la conexion a un potenciostato y a un amplificador para la amplificacion de las senales medidas del sistema de electrodos. El sensor preferentemente es un sensor enzimatico no fluido (ENF), mas preferentemente un sensor ENF electroqmmico. Los electrodos del sistema de electrodos pueden disponerse sobre un sustrato que porta el potenciostato o unirse a una placa de circuitos que porta el potenciostato. Preferentemente, el sensor esta destinado a la medicion de la glucosa.
Una materia objeto de la invencion adicional se refiere a la utilizacion de un copoffmero hidrofflico de monomeros acnlicos y/o metacnlicos, en la que el copoffmero hidrofflico comprende mas de 50% molar de monomeros hidrofflicos a modo de membrana espaciadora para un electrodo enzimatico. El copoffmero hidrofflico preferentemente es tal como se ha indicado anteriormente. Preferentemente, la membrana espaciadora se utiliza para minimizar la reaccion por cuerpo extrano (RCE) contra el electrodo enzimatico al insertarlo o implantarlo en el cuerpo.
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Ejemplo 1 Permeabilidad de un sensor de glucosa enzimatico no fluido (ENF) con electrodos distribuidos para la implantacion transcutanea con una capa de difusion que consiste de un unico copoffmero en bloque.
El sensor se construyo sobre una estructura de tira conductora de paladio prefabricada sobre un sustrato de poliester con un grosor de 250 pm. El electrodo de trabajo (ET) y el contraelectrodo (CE) se organizaron de manera repartida (tal como se muestra en las figs. 1 y 2).
Los campos del CE se sobreimprimieron con pasta de carbono; el resto de la tira conductora se aislo. Los campos del ET se sobreimprimieron con una mezcla de glucosa oxidasa entrecruzada (enzima), pasta de poffmero conductora y catalizador electrico, en la presente memoria oxido de manganeso (IV) (Technipur). Los caminos restantes de la tira conductora nuevamente fueron aislados. El electrodo de referencia (ER) consistfa de pasta de Ag/AgCl. Los electrodos cubnan aproximadamente 1 cm del eje del sensor.
Los campos del ET se recubrieron con una capa de difusion de copoffmero en bloque que consistfa de un bloque de HEMA y un bloque de BUMA. El grosor de la capa era de 7 pm.
Se produjeron cuatro lotes de sensores, cada uno provisto de un copoffmero en bloque espedfico como capa de difusion (ver la lista en la presente memoria, posteriormente). Todos los copoffmeros en bloque se obtuvieron de Polymer Source, Montreal, y se listan a continuacion.
Tabla 1.
Nombre
proporcion molecular (%) unidades monomericas peso molecular
Copoffmero
BUMA/HEMA HEMA Copoffmero [kDl
C
73/27 92 47
F
60/40 108 37
D
48/52 162 44
B
62/38 169 61
El copoffmero en bloque respectivo se disolvio en solvente organico (concentracion de 25%) y se recubrieron los sensores con el. Tras el secado utilizando secadores de cinta (2 min., 30°C a 50°C), los sensores recubiertos se sometieron a ensayo in vitro en soluciones de glucosa de diferentes concentraciones. De cada lote de sensores se midieron 10 sensores como muestra aleatoria. Como medida de la sensibilidad in vitro, se calculo la senal como la diferencia entre las corrientes medidas a una concentracion de 10 mM y de 0 mM de glucosa, que seguidamente se dividio por 10 mM (ver el Ejemplo 4).
Se hicieron funcionar todos los sensores a un voltaje de polarizacion de 350 mV frente a Ag/AgCl, la temperatura medida se mantuvo constante, a 37°C. Los sensores utilizados para dicha serie de mediciones no comprendfan el espaciador descrito en el documento n° WO 2010/028708, que, sin embargo, no produjo ninguna diferencia en vista del nivel de senal sometido a ensayo. La fig. 5 muestra la sensibilidad de los sensores con desviacion estandar para las cuatro capas de difusion diferentes.
Respecto a los copoffmeros en bloque C, D y F, existe una clara asociacion entre la sensibilidad in vitro y la proporcion molar de bloque hidrofobico en comparacion con la de bloque hidrofflico. Con una longitud de cadena total aproximadamente identica del copoffmero, la sensibilidad se incrementa a medida que se incrementa la cantidad de bloque hidrofflico (HEMA).
Los sensores con una capa de difusion de copoffmero en bloque B son una excepcion. Aunque el poffmero B presenta una proporcion relativa de cantidad hidrofobica a hidrofflica similar a la del poffmero F, la sensibilidad y, de esta manera, la permeabilidad para la glucosa, resulta reducida. Empmcamente puede afirmarse que en el caso del poffmero B, la longitud total de la cadena, correspondiente al peso molecular (total) de la molecula de copoffmero, es suficientemente grande para que resulte reducida la permeabilidad de la capa. Lo anterior tambien puede observarse en la incorporacion de agua determinada gravimetricamente de copoffmero en bloque B en comparacion con la de los poffmeros restantes. El poffmero B presenta una incorporacion de agua de 10,6%±1,5% (porcentaje en peso referido al peso seco de poffmero). El poffmero C se encuentra comprendido en 15,6%±0,0%, el poffmero en 16,5±3,1% y el poffmero D en 27%±1,7%.
Ejemplo 2 Flexibilidad mecanica de la capa de difusion de un sensor ENF de glucosa.
El sensor se fabrico tal como se indica en el documento n° WO2010/028708, presentando sin embargo una capa de difusion segun la presente invencion. Se partio de la premisa de que la temperatura de transicion vftrea (Tg) era un parametro sustitutivo de la flexibilidad mecanica. Ademas, se supuso que la temperatura de transicion vftrea, que puede asignarse al bloque hidrofobico, determinaba la flexibilidad mecanica en las aplicaciones in vivo. Debe indicarse que pueden identificarse varias Tg para un copoffmero en bloque, correspondientes al numero de bloques.
Los sensores se recubrieron con las mismas pastas de electrodo tal como en el Ejemplo 1. A continuacion, se
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recubrieron algunos de los sensores con un copoKmero seleccionado de MMA-HEMA (producido por Polymer Source, Montreal). Este polfmero (denominado E) presentaba un peso molecular total de 41 kD; la proporcion molar de MMA (cantidad hidrofobica) a HEMA era de 60%:40%. La temperatura de transicion vftrea del bloque hidrofobico era de 111°C, determinada mediante DSC (calorimetna diferencial de barrido) y a una tasa de calentamiento de 10°C/min.
Por otra parte, se proporcionaron otros sensores con la capa de difusion de copolfmero en bloque de la invencion (denominado A). El bloque hidrofobico de dicho copolfmero A contema MMA y BUMA a cantidades molares iguales en una secuencia aleatorizada. Nuevamente, la proporcion molar de parte hidrofobica a parte hidrofflica era de 60%:40%. El peso molecular era de 36 kD. La Tg del bloque hidrofobico se redujo, debido a la secuencia aleatorizada de MMA y BUMA (Tg de aproximadamente 45°C), a 73°C.
Se generaron ambas capas de difusion a partir de la solucion respectiva (25%) de los copolfmeros en eter y se secaron tal como en el Ejemplo 1. El grosor de las capas de difusion era de 7 pm. Se aplico una capa espaciadora posteriormente mediante recubrimiento por inmersion y se seco durante 24 h a temperatura ambiente. La capa espaciadora se realizo en Lipidure CM 5206, producido por NOF Japan.
Tras el explante del tejido, los sensores con una capa de difusion de copolfmero E mostraban grietas esporadicas en la capa de difusion. Lo anterior se considero un efecto de la carga mecanica. En contraste con lo anterior, los sensores con una capa de difusion de copolfmero A, no mostraban ninguna grieta bajo una carga identica. Lo anterior se debe evidentemente a la reduccion de la Tg, que incrementa la estabilidad mecanica del copolfmero. Ya no se requiere una mezcla ffsica de dos copolfmeros, tal como se da a conocer en el documento n° WO2010/028708.
Ejemplo 3 Comportamiento de permeacion optimizado de un sensor ENF de glucosa con electrodos distribuidos y capa de difusion segun la invencion.
Se fabrico un sensor tal como se indica en el Ejemplo 1 aunque con una capa espaciadora adicional en el total del eje del sensor. Los sensores con las respectivas capas de difusion se produjeron para los copolfmeros A, C, D y F de los Ejemplos 1 y 2. Con este fin se genero una solucion eterica al 24% del copolfmero. Se aplico cada solucion sobre un juego de sensores (N=10) y despues se seco en un secador de cinta. De esta manera, se obtuvieron capas de difusion con un grosor de 7 pm.
Despues, se proporcionaron los sensores con una capa espaciadora tal como se indica en el Ejemplo 2.
Se conecto el sensor con un sistema de medicion en la cabeza del sensor, que transfiere los datos medidos a un almacen de datos. Las mediciones in vitro se llevaron a cabo tal como se indica en el Ejemplo 1; sin embargo, durante un periodo de medicion de 7 dfas. A partir de los datos medidos, se calculo la deriva de la sensibilidad en todo el periodo de medicion respectivo para cada sensor. La figura 6 muestra para cada variante de sensor, es decir, para los sensores de una variante de capa de difusion, el valor medio del valor de deriva in vitro para el grupo. La etapa inicial de la medicion (las primeras 6 h, la etapa denominada de inicio) se excluyo del calculo.
Para todos los copolfmeros C, D y F con un bloque hidrofobico de BUMA existe una deriva positiva, es decir, la sensibilidad se incrementa con el tiempo. Por el contrario, el copolfmero A con el bloque hidrofobico de un copolfmero aleatorio de MMA y BUMA, conduce a una deriva muy baja, ligeramente negativa.
Dichas diferencias pueden explicarse con la respuesta de permeabilidad a largo plazo de las capas de difusion respectivas, que se midio en experimentos adicionales. Los sensores de paladio sin pasta de ET, pero con una superficie activa definida, es decir, tambien sin una capa de enzima, excluyendo la influencia de su comportamiento de hinchado sobre los resultados, se recubrieron con las soluciones de polfmero anteriormente indicadas y, tras el secado, se midio el grosor de la capa. Posteriormente se midio la conductividad en solucion tampon que contema sodio y cloro.
La fig. 7 demuestra que la conductividad del copolfmero A se mantiene practicamente constante tras una corta etapa de inicio.
Lo anterior no es el caso para el copolfmero F, incluso bajo condiciones de medicion identicas, tal como puede observarse en la fig. 8. En este caso, se observo una respuesta de permeabilidad fuerte y a largo plazo de la capa de difusion de copolfmero F, que era practicamente independiente del grosor de la capa. Para el copolfmero F, y tambien para los copolfmeros C y D (no mostrados), con un bloque hidrofobico de BUMA, resulta un incremento de la permeabilidad incluso durante un periodo de tiempo prolongado. En caso de medirlo, ello lleva a un incremento continuo de la sensibilidad en caso de que se aplique la capa de difusion sobre el sensor con una capa de enzima distribuida. Lo anterior explica la deriva positiva del sensor que se observa.
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A la inversa, un sensor con un copoflmero en bloque A muestra una deriva insignificante, que se debe a una alteration de la permeabilidad muy baja de la medicion de conductividad. Sin embargo, directamente despues de iniciar las mediciones (hasta aproximadamente 1 h despues), se observo un fuerte incremento de la conductividad en el copoflmero A. En este caso, se observo un inicio muy rapido, que se termino despues de aproximadamente 1 hora. En este momento la capa de difusion ha sido completamente humectada y ha finalizado su reorganization estructural debido a la incorporation de agua. El grado de cambio estructural presumiblemente depende de la Tg. Es plausible que un copoflmero con una Tg incrementada experimente una reorganizacion, que sera limitada en el tiempo y en amplitud, en comparacion con un copoflmero con una Tg en el intervalo de la temperatura ambiente.
Ademas, debe indicarse que los sensores con copoflmero A muestran una sensibilidad comparativamente elevada al inicio de las mediciones en comparacion con los sensores con una capa de difusion de copoflmero F. Lo anterior es esperable debido a las proporciones relativas identicas entre bloques hidrofobico e hidrofflico. El intervalo de sensibilidad alcanzado de 1 a 1,5 nA/mM (ver el Ejemplo 1) se considera ideal. De manera similar, dicha sensibilidad se obtiene para sensores con una capa de difusion que consiste de poflmero A.
Con respecto a la suma de las tres caracteristicas flsicoqrnmicas: permeabilidad, estabilidad mecanica y respuesta de permeabilidad, puede obtenerse preferentemente un sensor optimo con una capa de difusion de un copoflmero en bloque, que presenta un bloque hidrofobico con por lo menos dos unidades monomericas hidrofobicas dispuestas aleatoriamente diferentes, tal como el copoflmero en bloque A. Ninguno de los otros copoflmeros en bloque, los bloque hidrofobicos de los cuales consisten de una unica unidad monomerica, alcanzaba una calidad que pudiese compararse en la totalidad de los tres parametros con el copoflmero A.
Ejemplo 4 Caracterizacion de los copoflmeros en bloque.
Se produjo un sensor de multiples campos (10 campos de electrodos de trabajo y contraelectrodos, respectivamente) para la medicion continua de la glucosa y se caracterizo in vitro.
El sensor se proporciono con una capa de difusion que consistfa de un copoflmero en bloque que comprendia un bloque hidrofobico de metacrilato de metilo (MMA) y metacrilato de n-butilo (BUMA) copolimerizados aleatoriamente y un bloque hidrofflico de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA). Dichos poflmeros (llamados G y H) habian sido producidos por Polymer Source, Montreal, y eran mas permeables que el poflmero A de los Ejemplos 1 a 3.
En la Tabla 2 a continuation se indican los copolimeros:
Poflmero
G H A
Pesos moleculares Pm [kD]
23,5-b-29 21-b-20,5 21-b-15
% en peso de HEMA
55,2 49,4 41,6
% molar de HEMA (esquiometrico)
53,5 47,4 40
% molar de HEMA (medido mediante RMN nH, 13C)
51 46 32,6
Tg [°C] bloque hidrofobico
65 68 86
unidades monomericas de HEMA
223 157 115
unidades monomericas de MMA
194 174 174
Los pesos moleculares Pm de cada bloque se han indicado separadamente en la Tabla 2, anteriormente indicada, y representan los valores medios, ya que es conocido que los poflmeros presentan distribuciones de longitudes de cadena molecular en torno a un valor medio especificado. Lo anterior se aplica tambien a las cantidades derivadas en la Tabla 2.
Las temperaturas de transition vflrea indicadas del bloque hidrofobico se encuentran dentro del intervalo deseado a fin de garantizar la flexibilidad mecanica.
El parametro decisivo con respecto a la permeabilidad de la barrera de difusion para el analito es la sensibilidad por unidad de area del electrodo de trabajo (es decir, el area geometrica). Se calculo la sensibilidad SE a partir de las mediciones de corriente (I) a las concentraciones de glucosa de 10 mM y 0 mM en solution tamponada de fosfato (pH 7,4) en nA/mM:
imagen2
para cada uno de los sensores analizados. A partir de los valores medidos individuales (N=8), se determino la sensibilidad promedio SEm. Los valores de sensibilidad obtenidos se dividieron por el area total geometrica F medida mediante microscopia de todos los puntos de electrodo de trabajo en el sensor multicampo. De esta manera se obtuvo una densidad de sensibilidad SEm/F.
La linealidad Y de la curva de la funcion in vitro es una indication de la funcionalidad de control de la difusion de la
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capa de recubrimiento de poKmero sobre el electrodo de trabajo. Se calculo a partir de las mediciones de corriente a una concentration de glucosa de 20 mM, 10 mM y 0 mM, en %:
imagen3
para cada uno de los sensores analizados. A partir de los valores de medicion individuals, se determino el valor de linealidad medio y la desviacion estandar del mismo (ver la Tabla 3).
Finalmente, se determino el grosor de la capa L de la barrera de difusion de los sensores mediante la medicion optica de cada uno de los poKmeros. Se calcularon los valores medios correspondientes para una muestra de > 23 sensores con el mismo polimero. A partir de lo anterior puede calcularse el coeficiente de difusion eficaz Def de la capa de recubrimiento:
Def=SEm/F‘Lm‘5,182-1 O'®
2
en cm /s, en donde SEm y Lm son los valores medios respectivos para la sensibilidad y el grosor de capa, y F es el area total de todos los puntos de electrodo de trabajo.
Se calculo la deriva del sensor a partir de las repeticiones de los tramos de concentracion de glucosa durante 7 dias de mediciones in vitro. En la figura 9 se ilustran los resultados para el poKmero H, que muestran una conductividad sustancialmente constante.
La Tabla 3, a continuation, muestra los resultados de la caracterizacion funcional:
Polimero
G H
SEm/F [nA/mM*mm2)]
1,85 1,25
Deriva [%d]
-1,5±0,2 0,3±0,1
Y20mM[%]
88,2±0,7 88,6±0,3
grosor de la capa Lm [^m]
11,61 12,69
Def [cm2/s]
1,11305*10-9 8,22019*10-lu
Para el poKmero G mas hidrofflico (que es mas permeable a la glucosa), tambien se determino el coeficiente de difusion mediante un metodo alternativo, por ejemplo la permeation de glucosa desde una camara con una solution de glucosa hasta una camara con un tampon sin glucosa a traves de una pelmula del poKmero. Segun dicho metodo se obtuvo un valor similar para el coeficiente de difusion (1,1710-9 cm2/s).
Ejemplo 5 Union de protemas al material de la capa espaciadora.
Para evaluar la union de las proteinas a materiales de la capa espaciadora, se lleno una placa de incubation (FluoroNunc Maxisorp, Thermo Scientific) con soluciones etanolicas de Adapt® (Biointeractions Ltd, Reading, England) o Eudragit E100 (Evonik Industries). Eudragit E100 es un copolimero cationico basado en metacrilato de dimetilaminoetilo, metacrilato de butilo y metacrilato de metilo. Se secaron los polimeros durante la noche a 40°C. Despues, sobre los materiales del espaciador se aplico una solucion de fibrinogeno. La solucion contema fibrinogeno de plasma humano que se conjugo con el pigmento fluorescente Alexa488 (obtenido de Invitrogen). Tras 4 h de incubacion, se aspiro la solucion de fibrinogeno y las capas espaciadoras se lavaron ocho veces con tampon borato.
Se analizo la cantidad de protema unida al espaciador mediante la medicion de la intensidad de fluorescencia en la placa de incubacion a una longitud de onda de excitation de 485 nm y de emision de 528 nm utilizando un lector de fluorescencia (Synergy4, BioTek Instruments). Se utilizaron concentraciones conocidas de protema marcada (6,25500 ng) para preparar una curva de calibration a fin de convertir las lecturas de fluorescencia a cantidades de protema.
Tal como se esperaba, el fibrinogeno unido a la placa de incubacion no recubierta (Blanco) resulto en 390 ng de proteinas unidades (fig. 10). La placa recubierta con Eudragit E100 mostro una union de protema reducida, de 60 ng. Practicamente no era detectable ninguna protema unida a la placa recubierta con Adapt®. Las lecturas antes de la incubacion resultaron de la fluorescencia de fondo. Estos resultados demuestran claramente que las superficies recubiertas con los materiales espaciadores, especialmente los recubiertos con Adapt®, se encuentran bien protegidas frente a la adhesion del fibrinogeno.
Ejemplo 6 Liberation de citoquinas por celulas despues del contacto con capa espaciadora.
Los sensores se fabricaron tal como se indica en el Ejemplo 2. Despues, se proporcionaron los sensores con una capa espaciadora tal como se indica en el Ejemplo 2. La capa espaciadora se preparo con Lipidure CM 5206 (NOF Corporation, Japon) o se preparo con Adapt® (Biointeractions Ltd., Reading, Inglaterra).
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Los sensores sin capa espaciadora, sensores con capa espaciadora realizada en Lipidure CM 5206 o los sensores con una capa espaciadora realizada en Adapt® se incubaron con celulas THP-1 monocfticas y se analizo la induccion de los marcadores inflamatorios. Las celulas THP-1 se cultivaron en presencia de los sensores durante 24 h a 37°C. A continuacion, las celulas se recolectaron mediante centrifugacion. Se utilizo el sobrenadante para determinar la liberacion de citoquinas, mientras que el pellet celular se resuspendio en PBS que contema 1% de albumina de suero bovino (BSA, por sus siglas en ingles) y se utilizo para analizar la expresion de la protema de superficie celular CD54 (tambien conocida como ICAM-1, un biomarcador inflamatorio). Las celulas THP-1 se incubaron con un anticuerpo anti-CD54 conjugado con el pigmento fluorescente ficoeritrina (BD Bioscience). Tras la incubacion durante 45 min. a 4°C, las celulas se lavaron en PBS/BSA al 1% y se determino la intensidad media de fluorescencia (IMF) de 10.000 celulas utilizando un citometro de flujo (longitud de onda de excitacion: 532 nm; longitud de onda de emision: 585 nm) (BD FACSArray, BD Bioscience). En comparacion con las celulas THP-1 no tratadas, la incubacion con sensores sin recubrimiento resulto en una expresion de CD54 relativa incrementada (induccion de 6 veces) tal como indica la elevada IMF (fig. 11). La incubacion de las celulas con sensores recubiertos con capas espaciadoras de CM 5206 o Adapt® resulto en la atenuacion de la expresion de CD54 en 45% y 41%, respectivamente.
Se utilizo el sobrenadante para determinar la cantidad de las citoquinas interleuquina-8 (IL-8) y la protema quimiotactica de monocitos 1 (MCP-1, por sus siglas en ingles) utilizando un inmunoensayo basado en perlas siguiendo las instrucciones del fabricante (Flex sets, BD Bioscience) y el analisis de citometna de flujo posterior (BD FACSArray, BD Bioscience). El analisis de los datos se llevo a cabo utilizando el software FCAP array v1.0.1 (Soft flow Hungary Ltd.).
En comparacion con las celulas THP-1 no tratadas, los sensores sin recubrimiento indujeron una fuerte liberacion de IL-8 (49 frente a 197 pg/ml) (fig. 12A) y de MCP-1 (6 frente a 48 pg/ml) (fig. 12b). La liberacion de IL-8 y MCP-1 resulto reducida al recubrir los sensores con capas espaciadoras de CM 5206 o Adapt®. Los sensores recubiertos con Adapt® indujeron la liberacion de 100 pg/ml de IL-8 y de 25 pg/ml de MCP-1. Los sensores recubiertos con CM 5206 resultaron en la secrecion de 125 pg/ml de IL-8 y de 18 pg/ml de MCP-1.
En conjunto, dichos datos indican que las capas espaciadoras atenuan la induccion de tres biomarcadores de inflamacion bien conocidos: CD54, IL-8 y MCP-1.
Con el fin de analizar el papel de la adsorcion de las protemas en la activacion de las celulas THP-1, se recubrieron placas de cultivo de tejidos con CM 5206, Adapt® o Eudragit E100. A continuacion, se incubo el espaciador con fibrinogeno humano (Sigma-Aldrich). Las celulas THP-1 se incubaron con diferentes espaciadores + capas de fibrinogeno. Tras una incubacion de 48 h a 37°C, las celulas se sedimentaron mediante centrifugacion y se analizo el sobrenadante para la liberacion de IL-8. A modo de control se cultivaron celulas en placas de cultivo sin espaciador aunque recubiertas con fibrinogeno (Polyst. = material de placa de cultivo). Tal como se muestra en la fig. 13, dichas celulas liberaron 89 pg/ml de IL-8. Las celulas cultivadas sobre CM 5206 + fibrinogeno o sobre Adapt® + fibrinogeno liberaron 68 y 49 pg/ml, respectivamente. En contraste, las celulas cultivadas sobre Eudragit E100 + fibrinogeno liberaron 206 pg/ml de IL-8. Cabe destacar que las celulas cultivadas sobre Eudragit E100 sin recubrimiento de fibrinogeno secretaron unicamente 59 pg/ml de IL-8. La adsorcion de fibrinogeno sobre la superficie de polfmero y los cambios conformacionales en la protema podnan exponer el sitio de union de MAC-1. Las celulas THP-1 que resultan activadas mediante la union a su receptor MAC-1 liberan citoquinas tales como IL-8 y de esta manera inducen una respuesta inflamatoria. Por lo tanto, las capas espaciadores realizadas en Adapt® o CM 5206 evitan la deposicion de las protemas y la exposicion de motivos estructuras sobre las superficies (tal como sensores) y, de esta manera, minimizan las reacciones inflamatorias contra los implantes.
Ejemplo 7 Hemolisis limitada de sensores recubiertos con una capa espaciadora.
Se fabricaron sensores tal como se indica en el Ejemplo 2. Despues, se proporcionaron los sensores con una capa espaciadora tal como se indica en el Ejemplo 2. La capa espaciadora se preparo con Lipidure CM 5206 (NOF Corporation, Japon) o se preparo con Adapt® (Biointeractions Ltd., Reading, Inglaterra).
Se analizo el potencial hemolttico de sensores sin capa espaciadora, de sensores con capa espaciadora realizada en Lipidure CM 5206 y de sensores con capa espaciadora realizada en Adapt®. Por lo tanto, se incubaron sensores con una superficie de total de 6 cm2 con globulos rojos y seguidamente se determino la lisis mediante la medicion de la liberacion de hemoglobina al sobrenadante. Se aislaron los eritrocitos a partir de sangre humana recien extrafda, mediante centrifugacion (se utilizo citrato para evitar la coagulacion). A continuacion, se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y despues se diluyeron 1:40 en PBS. La suspension de eritrocitos se incubo con los sensores durante 24 h a 37°C en la oscuridad sobre una plataforma giratoria (350 rpm). Despues, las celulas se sedimentaron mediante centrifugacion y el contenido de hemoglobina del sobrenadante se determino espectroscopicamente mediante la medicion de la absorcion del sobrenadante a una longitud de onda de 575 nm. Los resultados se presentan como mdice lttico, en %, que es la liberacion de hemoglobina en una muestra dividido por la hemoglobina liberada en el control positivo (=lisis osmotica completa de eritrocitos en agua destilada). Se muestran los resultados en la fig. 14.
Los sensores sin una capa espaciadora causaron un nivel significativo de hemolisis, tal como indica un mdice hemolftico elevado, de 47,4%. El recubrimiento de los sensores con una capa espaciadora de Lipidure CM 5206 redujo el potencial hemolftico de los sensores, tal como demuestra un mdice lftico de 14,7%. Los sensores recubiertos con una capa espaciadora de Adapt® causo marginalmente hemolisis, resultando en un mdice lftico de 5 7,5%, que se encuentra en el intervalo del control negativo (=eritrocitos en PBS incubado sin material de ensayo) o
Adapt® solo. Estos resultados indican la funcion protectora de la capa espaciadora, que reduce la hemolisis.

Claims (13)

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REIVINDICACIONES
Sistema de electrodos para la medicion de la concentracion de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moleculas de enzima inmovilizadas, opcionalmente una barrera de difusion que controla la difusion del analito desde el exterior del sistema de electrodos hasta las moleculas de enzima, caracterizado por que una membrana espaciadora forma por lo menos una parte de la capa externa del sistema de electrodos y en la que la membrana espaciadora comprende un copoffmero hidrofflico de monomeros acnlicos y/o metacnlicos, en la que el copoffmero hidrofflico comprende mas de 50% molar de monomeros hidrofflicos.
Sistema de electrodos segun la reivindicacion 1, en el que la membrana espaciadora es un copoffmero hidrofflico de por lo menos 2 o 3 monomeros acnlicos y/o metacnlicos.
Sistema de electrodos segun la reivindicacion 1 o 2, en el que los monomeros hidrofflicos se seleccionan de entre esteres (meta)acnlicos hidrofflicos con un grupo polar, por ejemplo OH, OCH3 o OCH2H2, (meta)acrilamidas hidrofflicas, acido (meta)acnlico o combinaciones de los mismos, preferentemente seleccionados de entre:
acrilato de 2-hidroxietilo,
metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA),
acrilato de 2-metoxietilo,
metacrilato de 2-metoxietilo,
acrilato de 2-etoxietilo,
metacrilato de 2-metoxietilo,
acrilato de 2- o 3-hidroxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-hidroxipropilo (2- o 3-HPMA),
acrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
acrilato de 2- o 3-etoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-etoxipropilo,
acrilato de 1- o 2-glicerol,
metacrilato de 1- o 2-glicerol,
acrilamida,
metacrilamida,
una acrilamida de N-alquilo o N,N-dialquilo, y una metacrilamida de N-alquilo o N,N-dialquilo, en la que el alquilo comprende 1 a 3 atomos de C, acido acnlico, acido metacnlico y combinaciones de los mismos,
mas preferentemente de entre metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), metacrilato de 2-hidroxipropilo (2- HPMA) y combinaciones de los mismos.
Sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el copoffmero hidrofflico de la membrana espaciadora comprende por lo menos 60% molar o por lo menos 70% molar de monomeros hidrofflicos.
Sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el copoffmero de la membrana espaciadora comprende por lo menos hasta 40% molar o hasta 30% molar de monomeros hidrofobicos, preferentemente seleccionados de entre:
acrilato de metilo, metacrilato de metilo (MMA), acrilato de etilo, metacrilato de etilo (EMA), acrilato de n-propilo o i-propilo, metacrilato de n-propilo o i-propilo, acrilato de n-butilo, metacrilato de n-butilo (BUMA), acrilato de neopentilo, metacrilato de neopentilo, y combinaciones de los mismos,
mas preferentemente de entre metacrilato de metilo (MMA), metacrilato de n-butilo (BUMA) y combinaciones de los mismos.
6.
Sistema de electrodos segun la reivindicacion 5, en el que los monomeros hidrofobicos son metacrilato de metilo (MMA) o metacrilato de n-butilo (BUMA) y los monomeros hidrofflicos son metacrilato de 2- hidroxietilo (HEMA) y/o metacrilato de 2-hidroxipropilo (2-HPMA).
5 7.
Sistema de electrodos segun la reivindicacion 5 o 6, en el que la membrana espaciadora comprende un copolfmero de entre metacrilato de n-butilo (BUMA), metacrilato de 2-hidroxietilo (2-HEMA) y metacrilato de 2-hidroxipropilo (2-HPMA), en el que el copolfmero comprende mas de 80% molar de monomeros de 2- HEMA.
10 8.
Sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el copolfmero hidrofflico es un copolfmero aleatorio o un copolfmero en bloque.
9. 15
Sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el grosor de la membrana espaciadora es inferior a aproximadamente 20 pm, preferentemente inferior a 3 pm, mas preferentemente de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 pm.
10.
Sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la incorporacion de agua relativa del copolfmero hidrofflico no excede de 50% en peso, preferentemente 40% en peso, mas
20
preferentemente 30% en peso, respecto al peso total del copolfmero.
11.
Sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la barrera de difusion comprende un poliuretano hidrofflico o un copolfmero en bloque que presenta por lo menos un bloque hidrofflico y por lo menos un bloque hidrofobico.
25 12.
Sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende un contraelectrodo (2) que presenta un conductor electrico (2a), un electrodo de trabajo (1) que presenta un conductor electrico (1a) sobre el que se han dispuesto moleculas de enzima inmovilizadas (5) y opcionalmente la barrera de difusion (8) y una membrana espaciadora (9), que cubre por lo menos el electrodo de trabajo (1) y
30
opcionalmente tambien el contraelectrodo (2).
13.
Sensor que es insertable o implantable en un cuerpo, que comprende un sistema de electrodos segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el sensor preferentemente esta destinado a la medicion de la glucosa.
35 14.
Utilizacion de un copolfmero hidrofflico de monomeros acnlicos y/o metacnlicos, en la que el copolfmero hidrofflico comprende mas de 50% molar de monomeros hidrofflicos a modo de membrana espaciadora para un sistema de electrodos enzimatico.
40 15.
Utilizacion segun la reivindicacion 14 para la minimizacion de la reaccion a cuerpos foraneos (RCF) contra el sistema de electrodos enzimatico.
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