ES2924910T3 - Capa de difusión mejorada para un sensor enzimático in vivo - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un sistema de electrodos para medir la concentración de un analito en condiciones in vivo, que comprende un electrodo 5 con moléculas de enzima inmovilizadas y una barrera de difusión que controla la difusión del analito desde el fluido corporal que rodea el sistema de electrodos a las moléculas de enzima. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Capa de difusión mejorada para un sensor enzimático in vivo
La presente invención se refiere a un sistema de electrodos para medir la concentración de un analito en condiciones in vivo, que comprende un electrodo con moléculas de enzima inmovilizadas y una barrera de difusión que controla la difusión del analito desde el líquido corporal que rodea el sistema de electrodos hasta las moléculas de enzima.
Los sensores con sistemas de electrodos implantables o insertables facilitan las mediciones de analitos fisiológicamente significativos tales como, por ejemplo, lactato o glucosa en el cuerpo de un paciente. Los electrodos de trabajo de sistemas de este tipo tienen capas de enzima eléctricamente conductoras en las que se unen moléculas de enzima que liberan portadores de carga por conversión catalítica de moléculas de analito. En el proceso, se genera una corriente eléctrica como señal de medición con una amplitud que se correlaciona con la concentración de analito.
Dichos sistemas de electrodos son conocidos, por ejemplo, a partir de los documentos WO 2007/147475, WO 2010/028708 y WO 2012/130841.
Los electrodos de trabajo del sistema de electrodos están provistos de una barrera de difusión que controla la difusión del analito que se va a determinar desde el líquido corporal o tejido que rodea el sistema de electrodos hasta las moléculas de enzima que están inmovilizadas en la capa de enzima.
El documento WO 2007/147475 divulga una barrera de difusión preparada a partir de un polímero que tiene una estructura dipolar. Un ejemplo de un polímero de este tipo es poli(metacrilato de 2-metacriloiloxietil-fosforilcolina-co-n-butilo). El polímero dipolar se puede mezclar con otro polímero, por ejemplo, poliuretano.
De acuerdo con el documento WO 2010/028708, la barrera de difusión del sistema de electrodos está formada por mezclas de al menos dos polímeros de acrilato estadísticos diferentes. Los polímeros pueden ser copolímeros, por ejemplo, copolímeros de metacrilato de metilo y metacrilato de hidroxietilo o copolímeros de metacrilato de butilo y metacrilato de hidroxietilo.
Sin embargo, el uso de mezclas de polímeros o copolímeros tiene desventajas en cuanto a que la preparación de la mezcla y su aplicación al sensor es tediosa y potencialmente problemática. Normalmente, los polímeros que se van a mezclar se disuelven individualmente y las soluciones resultantes se mezclan después de esto en la proporción deseada. Esto, sin embargo, puede dar como resultado la precipitación de uno de los componentes y, en consecuencia, problemas de manejabilidad, por ejemplo, en un procedimiento de pulverización. Las dificultades incrementadas se producen cuando la mezcla comprende un polímero con características iónicas, es decir, cuando uno de los polímeros que se van a mezclar comprende un monómero que tiene grupos aniónicos o catiónicos. Sin embargo, la presencia de dichos grupos con carga tiene un fuerte efecto sobre la solubilidad, lo que dificulta encontrar un disolvente adecuado tanto para el polímero con carga como para el polímero sin carga.
El documento WO 2012/130841 divulga una barrera de difusión de un sistema de electrodos que comprende un copolímero de bloque, por ejemplo, un copolímero de bloque único que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo. El bloque hidrófobo tiene una temperatura de transición vítrea en el intervalo de 40 a 80 °C. Los bloques hidrófilos e hidrófobos están enlazados covalentemente entre sí dentro de las moléculas de polímero.
El documento WO 2006/058779 divulga un sensor basado en enzimas con una capa combinada de difusión y enzima que comprende al menos un material polimérico y partículas que portan una enzima, en el que las partículas están dispersas en el material polimérico. El polímero puede comprender secuencias de cadena de polímero hidrófilas así como hidrófobas, por ejemplo, el polímero puede ser un copolímero de poliéter-poliuretano de alta o baja absorción de agua. No se divulga el uso de copolímeros de bloques que tienen al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo como capa de difusión.
El documento EP-A-2163190 describe un sistema de electrodos para la medición de una concentración de analito in vivo que comprende un contraelectrodo con un conductor eléctrico y un electrodo de trabajo con un conductor eléctrico sobre el que se localiza una capa de enzima que comprende moléculas de enzima inmovilizadas. Una barrera de difusión controla la difusión del analito desde los líquidos corporales que rodean a las moléculas de enzima. La barrera de difusión puede comprender poliuretanos hidrofilizados obtenibles por policondensación de 4,4'-metileno-bis-(ciclohexilisocianato) y mezclas de dioles que pueden ser polietilenglicol y polipropilenglicol. La capa de poliuretano hidrófilo se puede cubrir con un espaciador, por ejemplo, un copolímero de metacrilato de butilo y 2-metacriloiloxietil-fosforil colina. No se divulga el uso de copolímeros de bloques que tienen al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo como capa de difusión.
El documento US 2008/0034972 describe un sensor de glucosa implantable que comprende una membrana compuesta por polímeros hidrófilos e hidrófobos íntimamente asociados. La asociación íntima de los polímeros hidrófilos e hidrófobos está en forma de redes de polímeros o combinaciones de polímeros interpenetrantes. Los polímeros hidrófilos e hidrófobos no están directamente enlazados entre sí.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar una barrera de difusión en un sistema de electrodos de un sensor enzimático in vivo que proporcione características fisicoquímicas mejoradas y que se pueda fabricarse fácilmente.
Este objetivo se cumple con el sistema sensor de acuerdo con la reivindicación 1, que proporciona una barrera de difusión que comprende un copolímero de bloque que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo, en el que el copolímero de bloque comprende de un 75 a un 95 % molar de al menos un bloque hidrófilo y de un 5 a un 25 % molar de al menos un bloque hidrófobo, basado en la cantidad total (molar) del copolímero de bloque en estado seco. El % molar del bloque hidrófilo y el bloque hidrófobo en un copolímero de bloque se puede determinar por resonancia magnética nuclear (RMN). En un modo de realización, las mediciones de RMN (medición de RMN de 1H) se realizan con un Bruker DRX300 con cloroformo deuterado para el bloque hidrófobo y piridina deuterada, o dimetilformamida deuterada/metanol deuterado (80/20) (v/v) para el copolímero de bloque como disolvente y una concentración de muestra entre 20 y 30 mg/ml.
Los bloques hidrófilos e hidrófobos están enlazados covalentemente entre sí.
Los bloques hidrófilos e hidrófobos están constituidos por unidades monoméricas de (met)acrilato. En un modo de realización particular el bloque hidrófilo comprende unidades monoméricas de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) y el bloque hidrófobo comprende unidades monoméricas de acrilato de n-butilo (n-BuA).
La barrera de difusión a base de copolímeros de bloque proporciona excelentes características físicoquímicas como sigue:
(i) permeabilidad de la barrera de difusión para el analito que se va a determinar,
(ii) características de permeabilidad de la barrera de difusión que son adecuadas para el comportamiento a corto plazo (humectabilidad) y el comportamiento a largo plazo (variación de sensor) del electrodo,
(iii) flexibilidad mecánica de la barrera de difusión, que permite la fabricación de sensores in vivo con electrodos múltiples extendidos;
(iv) incorporación eficaz de grupos iónicos en la capa de difusión, es decir, la densidad de cargas catiónicas o aniónicas dentro del polímero se puede ajustar eficazmente, esto es pertinente para la repulsión o atracción de analitos con carga y/o el control de la adhesión celular, por ejemplo, de monocitos del tejido o líquido corporal circundante.
En particular, la presente invención proporciona una barrera de difusión que tiene excelente estabilidad mecánica y flexibilidad, así como características de permeabilidad favorables con respecto al comportamiento a corto plazo (humectabilidad) y el comportamiento a largo plazo (variación de sensor) del electrodo. La alta permeabilidad de la barrera de difusión para el analito permite la fabricación de sensores en particular pequeños. Además, cuando se usan bloques hidrófobos con una temperatura de transición vítrea (Tg) considerablemente por debajo de la temperatura corporal, es decir, con una Tg de aproximadamente 0 °C o menos, por ejemplo, de al menos aproximadamente 80 °C por debajo de la temperatura corporal, el copolímero de bloque está en un estado gomoso, donde es suave y flexible, a temperatura ambiente y corporal.
Un objetivo de la presente invención es un sistema de electrodos de acuerdo con la reivindicación 1.
En el contexto de la presente invención, "estado seco" significa que el copolímero de bloque comprende menos de un 2 % en peso de agua, en un modo de realización menos de un 1 % en peso de agua, en un modo de realización menos de un 0,5 % en peso de agua, en el que los porcentajes en peso están basados en el peso total del copolímero de bloque y el agua comprendida.
Preferentemente, la barrera de difusión comprende un único, es decir, sólo un copolímero de bloque que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo, es decir, están ausentes otros polímeros o copolímeros. Más preferentemente, la barrera de difusión consiste en un único copolímero de bloque que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo.
En otro modo de realización preferente, el copolímero de bloque de la barrera de difusión es un copolímero dibloque o un copolímero tribloque. Cuando el copolímero de bloque de la invención es un copolímero dibloque, está compuesto por un bloque hidrófilo y un bloque hidrófobo. Cuando el copolímero de bloque de la invención es un copolímero tribloque, está compuesto por dos bloques hidrófilos y un bloque hidrófobo o por un bloque hidrófilo y dos bloques hidrófobos.
En un modo de realización, en un copolímero de bloque en el sentido de la presente invención, en las macromoléculas constituyentes, los bloques contiguos son constitucionalmente diferentes, es decir, los bloques contiguos comprenden unidades constitucionales derivadas de diferentes especies de monómero o de la misma especie de monómero pero con una diferente composición o distribución de secuencia de unidades constitucionales.
En otro modo de realización, un copolímero de bloque es un polímero que comprende moléculas en las que existe una disposición lineal de bloques, definiéndose un bloque como una porción de una molécula de polímero en la que las unidades monoméricas tienen al menos un rasgo característico constitucional o configuracional ausente de las porciones contiguas.
El sistema de electrodos de la presente invención es adecuado para su inserción o implantación en un cuerpo, por ejemplo, un cuerpo de mamífero tal como un cuerpo humano. El sistema de electrodos se adapta para medir un analito deseado en líquido corporal y/o tejido corporal, por ejemplo, en el espacio extracelular (intersticio), en vasos sanguíneos o linfáticos o en el espacio transcelular.
El sistema de electrodos insertado o implantado es adecuado para una aplicación a corto plazo, por ejemplo, de 3 a 14 días, o para una aplicación a largo plazo, por ejemplo, de 6 a 12 meses. Durante el período de inserción o implantación, se puede determinar un analito deseado por mediciones continuas o discontinuas.
El sistema de electrodos de la invención es preferentemente parte de un sensor enzimático no fluídico (ENF), en el que se determina la conversión enzimática del analito. Preferentemente, el sensor comprende un electrodo de trabajo con moléculas de enzima inmovilizadas para la conversión del analito que da como resultado la generación de una señal eléctrica. Las enzimas pueden estar presentes en una capa que cubre el electrodo. Además, pueden estar presentes mediadores de oxidorreducción y/o electrocatalizadores, así como partículas conductoras y formadores de poros. Este tipo de electrodo se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2007/147475 y WO2010/028708.
El área del electrodo de trabajo es el área sensible del sensor. Esta área sensible está provista de una barrera de difusión que controla la difusión del analito desde el exterior, por ejemplo, líquido corporal y/o tejido que rodea el sistema de electrodos a las moléculas de enzima. La barrera de difusión puede ser, por ejemplo, una capa de cobertura que cubra la capa de enzima, es decir, una capa sin enzima. Sin embargo, también es factible que las partículas que controlan la difusión se incorporen a la capa de enzima para servir como una barrera de difusión. Por ejemplo, los poros de la capa de enzima se pueden llenar con el polímero que controla la difusión de las moléculas de analito. El espesor de la barrera de difusión es normalmente de aproximadamente 5 a 60 |jm o de aproximadamente 10 a 50 jm , por ejemplo, de aproximadamente 10 a 15 jm , o de aproximadamente 10 a 20 jm , en particular de aproximadamente 10 a 25 jm o de aproximadamente 10 a 15 jm (en estado seco).
La barrera de difusión del sistema de electrodos de la presente invención comprende un copolímero de bloque, preferentemente un único copolímero de bloque, que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo, en el que el copolímero de bloque comprende de un 75 a un 95 % molar de al menos un bloque hidrófilo y de un 5 a un 25 % molar de al menos un bloque hidrófobo, basado en la cantidad total del copolímero de bloque en estado seco. De acuerdo con la invención, la temperatura de transición vítrea del al menos un bloque hidrófobo está en el intervalo de aproximadamente -80 °C y aproximadamente 0 °C.
Cabe destacar que se pueden identificar varias temperaturas de transición vítrea para un copolímero de bloque, correspondientes al número de bloques. En el copolímero de bloque de la invención, la temperatura de transición vítrea del bloque hidrófobo y la temperatura de transición vítrea del bloque hidrófilo se pueden determinar individualmente como se describe a continuación.
El copolímero de bloque puede comprender una secuencia alterna de bloques, es decir, un bloque hidrófilo está enlazado a un bloque hidrófobo. Los bloques hidrófilos e hidrófobos están enlazados covalentemente entre sí dentro de una molécula de polímero. El copolímero de bloque es preferentemente un copolímero dibloque o un copolímero tribloque.
El peso molecular promedio en número (Mn) del copolímero de bloque (en peso) está normalmente en el intervalo de 20 a 200 kDa, en particular en el intervalo de 25 a 95 kDa y más en particular en el intervalo de 30 a 70 kDa. El peso molecular promedio en número se determina preferentemente por medio de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) usando polimetilmetacrilato (PMMA) como calibrador.
El peso molecular promedio en número (Mn) de los polímeros hidrófobos se determina preferentemente por medio de SEC con tetrahidrofurano (THF) como disolvente. El peso molecular medio numérico (Mn) del copolímero de bloque se determina con dimetilformamida 3 g/l de LiCl como disolvente. En un modo de realización, el peso molecular promedio en número del copolímero de bloque se determina por medio de SEC del bloque hidrófobo en THF en combinación con mediciones de RMN.
La proporción molar de las porciones hidrófilas con respecto a hidrófobas en el copolímero de bloque está normalmente en el intervalo de aproximadamente 75 % molar (hidrófilo):25 % molar (hidrófobo) a aproximadamente 95 % molar (hidrófilo):5 % molar (hidrófobo), en el intervalo de > 75 % molar (hidrófilo):< 25 % molar (hidrófobo) a aproximadamente 95 % (hidrófilo):5 % molar (hidrófobo), en el intervalo de aproximadamente 80 % molar (hidrófilo):20 % molar (hidrófobo) a aproximadamente 90 % molar (hidrófilo):10 % molar (hidrófobo) o en el intervalo de aproximadamente 85 % molar (hidrófilo):15 % molar (hidrófobo).
En otras palabras, el copolímero de bloque en un modo de realización comprende en el intervalo de un 75 a un 95 % molar del al menos un bloque hidrófilo y en el intervalo de un 5 a 25 % molar del al menos un bloque hidrófobo, basado en la cantidad total (molar) del copolímero de bloque. En un modo de realización, el copolímero de bloque comprende en el intervalo de > 75 a un 95 % molar del al menos un bloque hidrófilo y en el intervalo de un 5 a < 25 % molar del al menos un bloque hidrófobo, basado en la cantidad total (molar) del copolímero de bloque. En un modo de realización, el copolímero de bloque comprende en el intervalo de un 80 a un 90 % molar del al menos un bloque hidrófilo y en el intervalo de un 10 a un 20 % molar del al menos un bloque hidrófobo, basado en la cantidad total (molar) del copolímero de bloque. En un modo de realización, el copolímero de bloque comprende en el intervalo de un 84 a un 86 % molar del al menos un bloque hidrófilo y en el intervalo de un 14 a un 16 % molar del al menos un bloque hidrófobo, basado en la cantidad total (molar) del copolímero de bloque.
El % molar del bloque hidrófilo y el bloque hidrófobo en el copolímero de bloque en un modo de realización suman un 100 % molar.
Un bloque hidrófilo del copolímero de bloque de la invención preferentemente consiste en al menos un 90 % molar, al menos un 95 % molar, basado en la cantidad total (molar) del bloque hidrófilo, de unidades monoméricas hidrófilas. En particular preferentemente, el bloque hidrófilo del copolímero de bloque consiste en unidades monoméricas hidrófilas. Normalmente tiene una longitud (longitud de cadena) de desde 150 a 900, por ejemplo de 150 a 500, o de 200 a 800, en particular de 175 a 450, o de 300 a 600 moléculas monoméricas.
El bloque hidrófilo preferentemente tiene un peso molecular promedio en peso (Mw), que está por encima del peso molecular de entrelazamiento (Me) del bloque hidrófilo. El peso molecular de entrelazamiento es el peso molecular en el que las cadenas poliméricas comienzan a formar un bucle sobre sí mismas (R. P. Wool, Macromolecules 26 (1993), 1564-1569). Con este peso molecular, el modelo de Rouse que describe la dinámica conformacional de una cadena polimérica ideal ya no se ajusta (Rouse, J. Chem. Phys. 21 (1953), 1272 y siguientes). Por ejemplo, el peso molecular de entrelazamiento (Me) del bloque hidrófilo puede estar en el intervalo de 10 a 80 kDa, preferentemente en el intervalo de 20 a 30 kDa. Además, el bloque hidrófilo preferentemente tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de 24000 g/mol o mayor, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 24000 g/mol a aproximadamente 90000 g/mol. El peso molecular promedio en peso (Mw) se puede determinar por medio de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) como se describe anteriormente para el peso molecular promedio en número (Mn).
Un bloque hidrófobo del copolímero de la invención preferentemente consiste en al menos un 90 % molar, más en particular al menos un 95 % molar, basado en la cantidad total del bloque hidrófobo, de unidades monoméricas hidrófobas. En particular preferentemente, el bloque hidrófobo del copolímero de bloque consiste en unidades monoméricas hidrófobas. Normalmente tiene una longitud (longitud de cadena) de 20 a 300, por ejemplo, de 20 a 200 o de 50 a 250, en particular de 50 a 100 o de 80 a 150 unidades monoméricas.
El bloque hidrófobo tiene preferentemente un peso molecular promedio en peso (Mw), que está por debajo del peso molecular de entrelazamiento (Me) del bloque hidrófobo. Para el peso molecular de entrelazamiento (Me) del bloque hidrófobo, son válidas las definiciones como se describe anteriormente para el peso molecular de entrelazamiento (Me) del bloque hidrófilo. Por ejemplo, el peso molecular de entrelazamiento (Me) del bloque hidrófobo está en el intervalo de 10 a 100 kDa, preferentemente en el intervalo de 10 a 20 kDa. Además, el bloque hidrófobo preferentemente tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de 19000 g/mol o menos, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 5000 g/mol a aproximadamente 16000 g/mol. El peso molecular promedio en peso (Mw) se puede determinar por medio de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) como se describe anteriormente para el peso molecular promedio en número (Mn).
La proporción de la longitud de cadena del bloque hidrófilo y la longitud de cadena del hidrófobo del copolímero de bloque está preferentemente en el intervalo de 2:1 a 20:1 o en el intervalo de 3:1 a 10:1, preferentemente en el intervalo de 4:1 a 8:1.
Los bloques hidrófilos y/o los bloques hidrófobos preferentemente consisten en unidades monoméricas de base (met)acrílica. Más preferentemente, tanto los bloques hidrófilos como los bloques hidrófobos consisten en unidades monoméricas de base (met)acrílica.
El término unidades monoméricas de base (met)acrílica dentro del contexto de la presente invención comprende unidades monoméricas de base metacrílica así como unidades monoméricas de base acrílica.
Las unidades monoméricas hidrófobas del bloque hidrófobo se seleccionan de ésteres (met)acrílicos hidrófobos, por ejemplo, ésteres que tienen una porción de alcohol con 1-12 átomos de C sin grupo hidrófilo, por ejemplo, un acrilato de alquilo C1-C12, preferentemente un acrilato de alquilo C4-C12 o un metacrilato de alquilo C6-C12.
Los ejemplos específicos de unidades monoméricas para el bloque hidrófobo se seleccionan de:
acrilato de etilo (EA),
acrilato de n- o i-propilo,
acrilato de n/sec o i-butilo (n-BuA/sec-BuA o i-BuA),
acrilato de 3-pentilo,
acrilato de n-pentilo,
acrilato de n-hexilo,
metacrilato de n-hexilo,
acrilato de 2-etilhexilo,
metacrilato de 2-etilhexilo,
acrilato de n-heptilo,
metacrilato de n-heptilo,
acrilato de n-octilo,
metacrilato de n-octilo,
acrilato de n-nonilo,
metacrilato de n-nonilo,
metacrilato de n/isodecilo,
metacrilato de n-dodecilo,
acrilato de n-dodecilo
y combinaciones de los mismos.
Un monómero hidrófobo preferente es acrilato de n-butilo (n-BuA). Más preferentemente, el bloque hidrófobo consiste en un homopolímero de una única unidad monomérica hidrófoba, por ejemplo, un homopolímero de acrilato de n-butilo (n-BuA).
La temperatura de transición vítrea del bloque hidrófobo de la invención en su estado seco está en el intervalo entre aproximadamente -80 °C y aproximadamente 0 °C. Preferentemente, la temperatura de transición vítrea del bloque hidrófobo está en el intervalo de aproximadamente -80 °C a aproximadamente -20 °C, en el intervalo de aproximadamente -70 °C a aproximadamente -30 °C, o preferentemente en el intervalo de aproximadamente-60 °C a aproximadamente -40 °C. La temperatura de transición vítrea del bloque hidrófobo se puede medir con calorimetría diferencial de barrido (DSC) a un cambio de temperatura de 10 °C/min a presión atmosférica bajo flujo de nitrógeno que implica dos etapas de calentamiento en las que la segunda etapa de calentamiento se usa para determinar la temperatura de transición vítrea. Las mediciones de DSC se pueden realizar con un dispositivo DSC1 de Mettler-Toledo. Las condiciones de DSC adecuadas se describen en la tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000007_0001
La hidrofobia del bloque hidrófobo se puede determinar con un medidor de ángulo de contacto, por ejemplo, Kyowa Interface Science Ltd., modelo CA-A. Las láminas de vidrio recubiertas de polímero se colocan en el medidor de ángulo de contacto. Se colocan secuencialmente de tres a cinco gotas de agua sobre la superficie del polímero y se miden los ángulos de contacto dentro de uno a tres minutos para cada gota. El bloque hidrófobo preferentemente tiene un ángulo de contacto en el intervalo de 70° a 115° medido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (Okouchi et al., Macromolecules 39 (2006), 1156-1159).
Las unidades monoméricas hidrófilas del bloque hidrófilo se seleccionan de ésteres (met)acrílicos hidrófilos, es decir, ésteres con, por ejemplo, un OH y/u OCH3 polar dentro de la porción de alcohol del éster, (met)acrilamidas hidrófilas con una amida (-NH2) o un grupo N-alquil- o N,N-dialquilamida, en el que el grupo alquilo comprende de 1 a 2 átomos de C y, opcionalmente, grupos hidrófilos tales como OH y/u OCH3 y unidades (met)acrílicas adecuadas que tienen un grupo, por ejemplo, aniónico o catiónico con carga, tal como ácido acrílico (acrilato) o ácido metacrílico (metacrilato). Además, se pueden emplear combinaciones de unidades monoméricas.
Los ejemplos específicos de unidades monoméricas preferentes para el bloque hidrófilo se seleccionan de: acrilato de 2-hidroxietilo,
metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA),
acrilato de 2-metoxietilo,
metacrilato de 2-metoxietilo,
acrilato de 2- o 3-hidroxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-hidroxipropilo (2- o 3-HPMA),
acrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
acrilato de 1- o 2-glicerol,
metacrilato de 1- o 2-glicerol,
acrilamida,
metacrilamida,
una N-alquil- o N,N-dialquil-acrilamida, y
una N-alquil- o N,N-dialquil-metacrilamida, en la que el alquilo comprende 1 átomo de C tal como metilo, ácido acrílico (acrilato),
ácido metacrílico (metacrilato),
metacrilato de 2-(2-metoxietoxi)etilo,
acrilato de 2-(2-metoxietoxi)etilo,
acrilato de 2-(2-hidroxietoxi)etilo,
metacrilato de 2-(2-hidroxietoxi)etilo,
y combinaciones de los mismos.
Los monómeros hidrófilos preferentes son metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) y/o metacrilato de 2- o 3-hidroxipropilo (2- o 3-HPMA). El bloque hidrófilo puede consistir en una o más unidades monoméricas hidrófilas diferentes. Por ejemplo, puede ser un copolímero aleatorio de al menos dos unidades monoméricas hidrófilas diferentes, tales como HEMA y 2-HPMA. Lo más preferentemente, el bloque hidrófilo consiste en un homopolímero de una única unidad monomérica hidrófila, por ejemplo, de un homopolímero de HEMA o 2-HPMA.
La temperatura de transición vítrea (Tg) del bloque hidrófilo del copolímero de bloque de la presente invención es preferentemente de aproximadamente 100 °C o superior, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 100 °C a aproximadamente 250 °C o en el intervalo de aproximadamente 150 °C a aproximadamente 200 °C. Preferentemente, la temperatura de transición vítrea (Tg) del bloque hidrófilo está en el intervalo de aproximadamente 105 °C a aproximadamente 140 °C o en el intervalo de aproximadamente 110 °C a aproximadamente 120 °C. La temperatura de transición vítrea (Tg) del bloque hidrófilo se puede medir con DSC a un cambio de temperatura de 10 °C/min a presión atmosférica bajo flujo de nitrógeno que implica dos etapas de calentamiento en las que la segunda etapa de calentamiento se usa para determinar la temperatura de transición vítrea (Tg). Las mediciones de DSC se pueden realizar como se describe anteriormente.
Para introducir grupos iónicos en el monómero, se pueden incorporar al bloque hidrófilo unidades monoméricas con carga tales como ácido acrílico (acrilato) y/o ácido metacrílico (metacrilato). Por tanto, en un modo de realización particular de la presente invención, el bloque hidrófilo se puede preparar con al menos una unidad monomérica hidrófila no iónica (por ejemplo, como se describe anteriormente) y con al menos una unidad monomérica hidrófila iónica, en el que la unidad monomérica iónica está presente en una cantidad molar de preferentemente un 1 a un 20 % molar, basado en la cantidad total del bloque hidrófilo. En caso de que el bloque hidrófilo comprenda una unidad monomérica iónica tal como ácido acrílico o ácido metacrílico, es preferente la copolimerización con un monómero hidrófilo seleccionado del grupo de (met)acrilamidas, en particular N,N-dialquil acril- o metacrilamidas.
La diferencia entre la temperatura de transición vítrea (Tg) del bloque hidrófilo y del bloque hidrófobo del copolímero de la presente invención es preferentemente de al menos aproximadamente 100 °C, por ejemplo, de aproximadamente 120 °C a aproximadamente 250 °C.
Los copolímeros de bloque usados en la presente invención se pueden fabricar de acuerdo con procedimientos conocidos (Boker et al., Macromolecules 34 (2001), 7477-7488), por ejemplo, por polimerización por radicales de transferencia atómica (ATRP).
Los copolímeros de bloque se pueden aplicar al sistema de electrodos por técnicas habituales, por ejemplo, proporcionando una solución del copolímero de bloque en un disolvente o mezcla de disolventes adecuados, por ejemplo, un disolvente orgánico, tal como éter, que se aplica al sistema de electrodos prefabricado y se seca sobre el mismo.
Además del copolímero de bloque, la barrera de difusión también puede comprender otros componentes, en particular componentes no poliméricos, que se pueden dispersar y/o disolver en el copolímero de bloque. Estos compuestos adicionales incluyen plastificantes, en particular plastificantes biocompatibles, tales como trimelitato de tri-(2-etilhexilo) y/o glicerol.
La barrera de difusión de la invención tiene un alto coeficiente de difusión eficaz Deff para la glucosa que es preferentemente > 10' 10 cm2/s, más preferentemente > 5-10' 10 cm 2/s e incluso más preferentemente > 10' 9 cm2/s y, por ejemplo, hasta 10' 7 o 10' 8 cm2/s a una temperatura de 37 °C y un pH de 7,4. El coeficiente de difusión eficaz se determina preferentemente como se describe en el ejemplo 4 de acuerdo con la ecuación:
Deff =SEm/F L m '5,182'10 ' 8
en cm2/s, en la que SEm es la sensibilidad del electrodo de trabajo, F es el área total de los puntos de electrodo de trabajo y Lm es el espesor de capa de la barrera de difusión. SEm y Lm se pueden determinar como se describe en los ejemplos.
Además, la barrera de difusión de la presente invención tiene una baja variación de sensor. En modos de realización preferentes, el sensor de la invención tiene una variación de sensor in vitro en el intervalo de -1,5 %/d a 1,5 %/d o en el intervalo de -1,0 %/d a 1,0 %/d, más preferentemente en el intervalo de -0,5 %/d a 0,5 %/d. Además, debido a la baja temperatura de transición vítrea del bloque hidrófobo, la barrera de difusión de la invención muestra una excelente estabilidad mecánica y flexibilidad así como buenas propiedades de adhesión. El coeficiente de difusión para el analito se puede ajustar a un valor deseado seleccionando copolímeros de bloque con pesos moleculares apropiados y/o bloques hidrófobos con longitud y/o hidrofobia apropiadas. Esto, en asociación con una variación de sensor mejorada, permite la fabricación de sensores pequeños y/o el uso de sensores que comprenden electrodos de trabajo con baja carga de enzima.
El sistema de electrodos de la presente invención es adecuado para medir la concentración de un analito en condiciones in vivo, es decir, cuando se inserta o implanta en un cuerpo. El analito puede ser cualquier molécula o ion presente en un tejido o líquido corporal, por ejemplo, oxígeno, dióxido de carbono, sales (cationes y/o aniones), grasas o componentes de grasas, carbohidratos o componentes de carbohidratos, proteínas o componentes de proteínas, u otro tipo de biomoléculas. Es especialmente preferente la determinación de analitos que se pueden transferir eficazmente entre líquidos corporales, por ejemplo, sangre y tejido, tales como oxígeno, dióxido de carbono, cationes de sodio, aniones de cloruro, glucosa, urea, glicerol, lactato y piruvato. El sistema de electrodos comprende una enzima inmovilizada en un electrodo. La enzima es adecuada para la determinación de un analito deseado. Preferentemente, la enzima puede convertir catalíticamente el analito y generar de este modo una señal eléctrica detectable por el conductor eléctrico del electrodo de trabajo. La enzima para medir el analito es preferentemente una oxidasa, por ejemplo, glucosa oxidasa o lactato oxidasa o una deshidrogenasa, por ejemplo, glucosa deshidrogenasa o lactato deshidrogenasa. Además de la enzima, la capa de enzima también puede comprender un electrocatalizador o un mediador de oxidorreducción que favorezca la transferencia de electrones a los componentes conductores del electrodo de trabajo, por ejemplo, partículas de grafito. Los electrocatalizadores adecuados son óxidos metálicos tales como dióxido de manganeso o compuestos organometálicos tales como ftalocianina de cobalto. En un modo de realización preferente, el mediador de oxidorreducción puede degradar el peróxido de hidrógeno, contrarrestando de este modo el agotamiento del oxígeno en el entorno del electrodo de trabajo. En un modo de realización diferente, un mediador de oxidorreducción se puede unir covalentemente a la enzima y, de este modo, efectuar la transferencia directa de electrones al electrodo de trabajo. Los mediadores de oxidorreducción adecuados para la transferencia directa de electrones son grupos prostéticos, tales como pirroloquinolinaquinona (PQQ), dinucleótido de flavina y adenina (FAD) u otros grupos prostéticos conocidos. Las enzimas inmovilizadas en electrodos se describen, por ejemplo, en el documento WO2007/147475.
Un modo de realización preferente del sistema de electrodos comprende un contraelectrodo con un conductor eléctrico y un electrodo de trabajo con un conductor eléctrico sobre el que se disponen una capa de enzima que contiene moléculas de enzima inmovilizadas y la barrera de difusión. La capa de enzima está diseñada preferentemente en forma de campos múltiples que se disponen sobre el conductor del electrodo de trabajo a una distancia de, por ejemplo, al menos 0,3 mm o al menos 0,5 mm entre sí. Los campos individuales del electrodo de trabajo pueden formar una serie de electrodos de trabajo individuales. Entre estos campos, el conductor del electrodo de trabajo se puede cubrir por una capa aislante. Disponiendo los campos de la capa de enzima en la parte superior de las aberturas de una capa eléctricamente aislante, se puede mejorar la proporción señal-ruido.
De acuerdo con un modo de realización preferente, la capa de enzima y la capa de difusión se cubren además por una membrana de espaciador. Una disposición de este tipo se divulga en los documentos WO 2010/028708, WO 2012/130841 y WO2013/144255.
El sistema de electrodos de la invención puede comprender adicionalmente un electrodo de referencia que puede suministrar un potencial de referencia para el electrodo de trabajo, por ejemplo, un electrodo de referencia de Ag/AgCI. Además, un sistema de electrodos de acuerdo con la invención puede tener contraelectrodos y/o electrodos de trabajo adicionales.
El sistema de electrodos puede ser parte de un sensor, por ejemplo, conectándose a un potenciostato y un amplificador para la amplificación de las señales de medición del sistema de electrodos. El sensor es preferentemente un sensor enzimático no fluídico (ENF), más preferentemente un sensor ENF electroquímico. Los electrodos del sistema de electrodos se pueden disponer sobre un sustrato que porta el potenciostato o estar unidos a una placa de circuito que porta el potenciostato. Por consiguiente, otra materia objeto de la invención es un sensor que es insertable o implantable en un cuerpo y que comprende un sistema de electrodos con una membrana de difusión como se describe anteriormente. En un modo de realización muy preferente, el sensor es para la medición de un analito en condiciones in vivo. El sensor es especialmente preferente para la medición de glucosa.
Otra materia objeto de la invención se refiere al uso de un copolímero de bloque que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo como barrera de difusión para un electrodo enzimático de acuerdo con la reivindicación 15.
Otros detalles y ventajas de la invención se explican en base a un modo de realización ejemplar haciendo referencia a los dibujos adjuntos.
La fig. 1 muestra un modo de realización ejemplar de un sistema de electrodos de acuerdo con la invención.
La fig. 2 muestra una vista en detalle de la fig. 1.
La fig. 3 muestra otra vista en detalle de la fig. 1.
La fig. 4 muestra una sección a lo largo de la línea de sección CC de la fig. 2.
La fig. 5a muestra el coeficiente de difusión eficaz (con desviación estándar) de tres sensores de glucosa (a glucosa 10 mM) provistos de diferentes copolímeros de bloque (A, B y C) como membranas de difusión.
La fig. 5b muestra la variación de sensor de tres sensores de glucosa provistos de diferentes copolímeros de bloque (A, B y C) como membranas de difusión.
La fig. 6 muestra los resultados de pruebas de flexión de sensores de glucosa provistos del copolímero de bloque B (poli(nBuA-b-FIEMA)) y un copolímero de bloque poli(BUMA-r-MMA-b-HEMA) comparativo.
La fig. 7a muestra el coeficiente de difusión (con desviación estándar) de un sensor de glucosa (a glucosa 10 mM) provisto de un copolímero de bloque E como membrana de difusión.
La fig. 7b muestra la variación de sensor del sensor de glucosa provisto del copolímero de bloque E como membrana de difusión.
La fig. 8 muestra la conductividad de los copolímeros de bloque B y E dependiente del tiempo.
La figura 1 muestra un modo de realización ejemplar de un sistema de electrodos para la inserción en el tejido corporal de un ser humano o un animal, por ejemplo, en la piel o tejido adiposo subcutáneo. En la figura 2 se muestra una ampliación de la vista en detalle A, en la figura 3 se muestra una ampliación de la vista en detalle B. La figura 4 muestra una vista en sección correspondiente a lo largo de la línea de sección, CC, de la figura 2.
El sistema de electrodos mostrado tiene un electrodo de trabajo 1, un contraelectrodo 2 y un electrodo de referencia 3. Los conductores eléctricos de los electrodos 1a, 2a, 3a se disponen en forma de pistas conductoras metálicas, preferentemente fabricadas de paladio u oro, sobre un sustrato 4. En el modo de realización ejemplar mostrado, el sustrato 4 es una placa de plástico flexible, por ejemplo, fabricada de poliéster. El sustrato 4 tiene menos de 0,5 mm de espesor, por ejemplo, de 100 a 300 micrómetros (|Jm), y por lo tanto es fácil de doblar de modo que se pueda adaptar a los movimientos del tejido corporal circundante después de su inserción. El sustrato 4 tiene un eje estrecho para su inserción en el tejido corporal de un paciente y un cabezal ancho para su conexión a un sistema electrónico que se dispone fuera del cuerpo. El eje del sustrato 4 preferentemente tiene una longitud de al menos 1 cm, en particular de 2 cm a 5 cm.
En el modo de realización ejemplar mostrado, una parte del dispositivo de medición, a saber, el cabezal del sustrato, sobresale del cuerpo de un paciente durante su uso. Sin embargo, de forma alternativa también es factible implantar todo el dispositivo de medición y transmitir los datos de medición de forma inalámbrica a un receptor que se dispone fuera del cuerpo. El electrodo de trabajo 1 porta una capa de enzima 5 que contiene moléculas de enzima inmovilizadas para la conversión catalítica del analito. La capa de enzima 5 se puede aplicar, por ejemplo, en forma de una pasta de curado de partículas de carbono, un agente aglutinante polimérico, un mediador de oxidorreducción o un electrocatalizador y moléculas de enzima. Los detalles de la producción de una capa de enzima 5 de este tipo se divulgan, por ejemplo, en el documento WO2007/147475.
En el modo de realización ejemplar mostrado, la capa de enzima 5 no se aplica de forma continua sobre el conductor 1a del electrodo de trabajo 1, sino más bien en forma de campos individuales que se disponen a una distancia entre sí. Los campos individuales de la capa de enzima 5 en el modo de realización ejemplar mostrado se disponen en una serie.
El conductor 1 a del electrodo de trabajo 1 tiene sitios estrechos entre los campos de capa de enzima que se ven en particular bien en la figura 2. El conductor 2a del contraelectrodo 2 tiene un contorno que sigue el transcurso del conductor 1a del electrodo de trabajo 1. Este medio da como resultado una disposición intercalada o entrecruzada del electrodo de trabajo 1 y el contraelectrodo 2 con rutas de corriente de forma ventajosa cortos y baja densidad de corriente.
Para incrementar su superficie eficaz, el contraelectrodo 2 puede estar provisto de una capa porosa eléctricamente conductora 6 que está situada en forma de campos individuales sobre el conductor 2a del contraelectrodo 2. Al igual que la capa de enzima 5 del electrodo de trabajo 1, esta capa 6 se puede aplicar en forma de pasta de curado de partículas de carbono y un agente aglutinante polimérico. Los campos de la capa 6 preferentemente tienen las mismas dimensiones que los campos de la capa de enzima 5, aunque esto no es obligatorio. Sin embargo, se puede prescindir de las medidas para incrementar la superficie del contraelectrodo y el contraelectrodo 2 se puede diseñar para que sea una pista conductora lineal sin recubrimientos de ningún tipo, o con un revestimiento fabricado con el bloque de copolímero descrito y opcionalmente un espaciador.
El electrodo de referencia 3 se dispone entre el conductor 1a del electrodo de trabajo 1 y el conductor 2a del contraelectrodo 2. El electrodo de referencia mostrado en la figura 3 consiste en un conductor 3a sobre el que se dispone un campo 3b de pasta conductora de plata/cloruro de plata.
La figura 4 muestra una vista en sección esquemática a lo largo de la línea de sección, CC, de la figura 2. La línea de sección, CC, se extiende a través de uno de los campos de capa de enzima 5 del electrodo de trabajo 1 y entre los campos de la capa conductora 6 del contraelectrodo 2. Entre los campos de la capa de enzima 5, el conductor 1a del electrodo de trabajo 1 se puede cubrir con una capa eléctricamente aislante 7, como el conductor 2a del contraelectrodo 2 entre los campos de las capas conductoras 6, para evitar reacciones de interferencia que de otro modo se pueden catalizar por el metal de las pistas conductoras 1a, 2a. Por lo tanto, los campos de la capa de enzima 5 están situados en las aberturas de la capa de aislamiento 7. Asimismo, los campos de la capa conductora 6 del contraelectrodo 2 también se pueden colocar en la parte superior de las aberturas de la capa aislante 7.
La capa de enzima 5 está cubierta por una capa de cubierta 8 que presenta una resistencia a la difusión del analito que se va a medir y por lo tanto actúa como una barrera de difusión. La barrera de difusión 8 consiste en un único copolímero con bloques hidrófilos e hidrófobos alternos como se describe anteriormente.
Un espesor favorable de la capa de cubierta 8 es, por ejemplo, de 5 a 60 |jm, en particular de aproximadamente 10 a 125 jm o de aproximadamente 10 a 15 jm . Debido a su resistencia a la difusión, la capa de cubierta 8 provoca que menos moléculas de analito alcancen a la capa de enzima 5 por unidad de tiempo. En consecuencia, la capa de cubierta 8 reduce la tasa a la que se convierten las moléculas de analito y, por lo tanto, contrarresta el agotamiento de la concentración de analito en el entorno del electrodo de trabajo.
La capa de cubierta 8 se extiende de forma esencialmente continua sobre toda el área del conductor 1a del electrodo de trabajo 1. En la capa de cubierta 8, se puede disponer una membrana biocompatible como espaciador 9 que establece una distancia mínima entre la capa de enzima 5 y las células del tejido corporal circundante. Este medio genera de forma ventajosa un depósito para moléculas de analito desde el que las moléculas de analito pueden llegar al campo de capa de enzima 5 correspondiente en caso de una perturbación transitoria del intercambio de fluidos en el entorno de un campo de capa de enzima 5. Si el intercambio de líquidos corporales en el entorno del sistema de electrodos se limita transitoriamente o incluso se evita, las moléculas de analito almacenadas en el espaciador 9 continúan difundiéndose a la capa de enzima 5 del electrodo de trabajo 1 donde se convierten. Por lo tanto, el espaciador 9 provoca un notable agotamiento de la concentración de analito y el falseamiento correspondiente de los resultados de medición que se produce solo después de un período de tiempo significativamente más largo. En el modo de realización ejemplar mostrado, la membrana que forma el espaciador 9 también cubre el contraelectrodo 2 y el electrodo de referencia 3.
La membrana de espaciador 9 puede ser, por ejemplo, una membrana de diálisis. En este contexto, se entiende por membrana de diálisis una membrana que es impermeable a moléculas más grandes que un tamaño máximo. La membrana de diálisis se puede prefabricar en un procedimiento de fabricación separado y a continuación se puede aplicar durante la fabricación del sistema de electrodos. El tamaño máximo de las moléculas para las que la membrana de diálisis es permeable se selecciona de modo que las moléculas de analito puedan pasar, mientras que las moléculas más grandes se retienen.
De forma alternativa, en lugar de una membrana de diálisis, se puede aplicar sobre el sistema de electrodos como membrana de espaciador 9 un recubrimiento fabricado con un polímero que es altamente permeable al analito y al agua, por ejemplo, a base de poliuretano o de acrilato.
Preferentemente, la membrana de espaciador se prepara a partir de un copolímero de (met)acrilatos. Preferentemente, la membrana de espaciador es un copolímero de al menos 2 o 3 (met)acrilatos. Más preferentemente, la membrana de espaciador comprende más de un 50 % molar, al menos un 60 % molar o al menos un 70 % molar de unidades monómeras hidrófilas, por ejemplo, HEMA y/o 2-HPMA, y hasta un 40 % molar o hasta un 30 % molar de unidades hidrófilas, por ejemplo, BUMA (metacrilato de butilo) y/o MMA (metacrilato de metilo) basado en la cantidad total de membrana de espaciador, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 2012/130841 y WO 2013/144255. Para el experto en la técnica es evidente que la membrana de espaciador es diferente de la barrera de difusión. La membrana de espaciador puede ser un copolímero aleatorio o de bloque. Una membrana de espaciador especialmente preferente comprende MMA o BUMA como restos hidrófobos y 2-HEMA y/o 2-HPMA como restos hidrófilos. La membrana de espaciador es altamente permeable para el analito, es decir, reduce significativamente la sensibilidad por área del electrodo de trabajo, por ejemplo, un 20 % o menos, o un 5 % o menos con un espesor de capa de menos de aproximadamente 20 jm , preferentemente menos de aproximadamente 5 jm . Un espesor especialmente preferente de la membrana de espaciador es de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 3 jm .
La capa de enzima 5 del sistema de electrodos puede contener partículas de óxido de metal, preferentemente partículas de dióxido de manganeso, como mediador de oxidorreducción catalítico. El dióxido de manganeso convierte catalíticamente el peróxido de hidrógeno que se forma, por ejemplo, por oxidación enzimática de glucosa y otros bioanalitos. Durante la degradación del peróxido de hidrógeno, las partículas de dióxido de manganeso transfieren electrones a los componentes conductores del electrodo de trabajo 1, por ejemplo, a las partículas de grafito en la capa de enzima 5. La degradación catalítica del peróxido de hidrógeno contrarresta cualquier disminución de la concentración de oxígeno en la capa de enzima 5. De forma ventajosa, esto permite que la conversión del analito que se va a detectar en la capa de enzima 5 no esté limitada por la concentración local de oxígeno. Por lo tanto, el uso del mediador de oxidorreducción catalítico contrarresta un falseamiento del resultado de medición debido a que la concentración de oxígeno es baja. Otra ventaja de un mediador de oxidorreducción catalítico es que evita la generación de concentraciones de peróxido de hidrógeno que dañan las células.
El polímero de membrana de espaciador preferente descrito en el presente documento se puede usar como recubrimiento externo para una barrera de difusión de la presente invención, pero también como recubrimiento externo de un sistema de electrodos en general, en particular de un sistema de electrodos para medir la concentración de un analito en condiciones in vivo, que comprenden un electrodo con moléculas de enzima inmovilizadas y una barrera de difusión que controla la difusión del analito desde el exterior del sistema de electrodos hacia las moléculas de enzima.
La membrana de espaciador externa cubre preferentemente al menos la porción de electrodo de trabajo que comprende las moléculas de enzima y, opcionalmente, también otras porciones, por ejemplo, el contraelectrodo.
Ejemplo 1 Permeabilidad de un sensor de glucosa enzimático no fluídico (ENF) con electrodos distribuidos para implantación transcutánea que tiene una capa de difusión que consiste en un único copolímero de bloque.
El sensor se construyó sobre una estructura de conductor de tira de paladio prefabricada sobre un sustrato de poliéster que tiene un espesor de 250 |jm. El electrodo de trabajo (WE) y el contraelectrodo (CE) se dispusieron distribuidos (como se muestra en las figs. 1-2).
Los campos del CE se sobreimprimieron con pasta de carbono, el resto del conductor de tira se aisló. Los campos del WE se sobreimprimieron con una mezcla de glucosa oxidasa (enzima) reticulada, pasta de polímero conductor y catalizador eléctrico, aquí óxido de manganeso (IV) (Technipur). Las pistas restantes del conductor de tira se aislaron de nuevo. El electrodo de referencia (RE) consiste en pasta de Ag/AgCI. Los electrodos cubren aproximadamente 1 cm del eje de sensor.
Los campos de WE se recubrieron con una capa de difusión de copolímero de bloque que consiste en un bloque de HEMA y un bloque de n-BuA. El espesor de la capa está entre 20 y 50 jm .
Se produjeron tres lotes de sensores, cada uno recubierto con un copolímero de bloque específico como capa de difusión (véase la tabla 2 a continuación en el presente documento). Todos los copolímeros de bloque se obtuvieron de Polymer Source, Montreal y TU Darmstadt y se enumeran en la siguiente tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000012_0001
El copolímero de bloque respectivo se disolvió en disolvente orgánico (concentración de un 15-18 %) y los sensores se recubrieron con el mismo. Después de secar en un horno durante 1 hora a 50 °C en condiciones atmosféricas, los sensores recubiertos se sometieron a prueba in vitro en soluciones de glucosa de diferentes concentraciones. De cada lote de sensores, se midieron 4 sensores como muestra aleatoria. Como medida de la sensibilidad in vitro, la señal se calculó por la diferencia de las corrientes medidas a una concentración de glucosa de 10 mM y 0 mM, que a continuación se dividió entre 10 mM (véase el ejemplo 4).
Todos los sensores se hicieron funcionar a un voltaje de polarización de 350 mV frente a Ag/AgCI, la temperatura de medición se mantuvo constante a 37 °C. Los sensores usados para esta serie de mediciones no comprendían el espaciador descrito en el documento WO 2010/028708, que, sin embargo, no hizo ninguna diferencia en vista del nivel de señal sometido a prueba. Las figuras 5a y b muestran el coeficiente de difusión y la variación de sensor de los sensores con desviaciones estándar para las tres capas de difusión diferentes.
El copolímero de bloque A representa un copolímero de bloque comparativo que tiene una proporción molar de 45:55 (hidrófobo:hidrófilo). Muestra un alto coeficiente de difusión asociado con una variación de sensor relativamente alta (como se muestra en las figuras 5a y 5b).
En el copolímero de bloque B de acuerdo con la invención, la cantidad del bloque de HEMA hidrófilo se incrementó a un 85 % molar y el bloque de nBuA hidrófobo se redujo a un 15 % molar. El copolímero de bloque B muestra un coeficiente de difusión algo reducido asociado con una variación de sensor significativamente reducida (como se muestra en las figuras 5a y 5b).
El copolímero de bloque C corresponde esencialmente al copolímero de bloque B con respecto a las porciones hidrófoba e hidrófila y las proporciones molares. Sin embargo, el copolímero de bloque C muestra un peso molecular promedio en número (Mn) total reducido en comparación con el copolímero de bloque B. Esto da lugar a una reducción adicional del coeficiente de difusión y a una variación de sensor muy baja, ligeramente positiva (como se muestra en las figuras 5a y 5b).
Por tanto, se puede ajustar un coeficiente de difusión deseado para el analito, por ejemplo, glucosa dentro de un amplio intervalo. De este modo, se puede obtener un intervalo de sensibilidad preferente de 1 a 1,5 nA/mM de analito, por ejemplo, glucosa.
Ejemplo 2 Flexibilidad mecánica de la capa de difusión de un sensor de glucosa ENF
El sensor se fabricó como se describe en el documento WO 2010/028708, teniendo, sin embargo, una capa de difusión de acuerdo con la presente invención. Se supuso que la temperatura de transición vítrea (Tg) es un parámetro sustituto de la flexibilidad mecánica. Además, se supuso que la temperatura de transición vítrea, que se puede asignar al bloque hidrófobo, determina la flexibilidad mecánica en aplicaciones in vivo.
Los sensores se recubrieron con la capa de difusión del copolímero de bloque B de la invención como se describe en el ejemplo 1 o con un copolímero de bloque poli(BUMA-r-MMA-b-HEMA) comparativo como se describe en el documento WO 2012/130841 en el ejemplo 4. La proporción molar del bloque de BUMA-r-MMA hidrófobo con respecto al bloque de HEMA hidrófilo es 50 %:50 %, el bloque hidrófobo contiene MMA y BUMA en cantidades molares iguales en una secuencia aleatorizada. El peso molecular es de 50 kDa. La temperatura de transición vítrea del bloque hidrófobo aleatorizado es de aproximadamente 73 °C, determinada por DSC y una tasa de calentamiento de 10 °C/min.
Ambas capas de difusión se generaron a partir de la solución respectiva de los copolímeros en disolvente orgánico y se secaron como en el ejemplo 1. El espesor de las capas de difusión fue de aprox. 20 |jm.
Las pruebas de flexión en ambos tipos de sensores con un radio de flexión de 1 mm se realizaron a mano. Los sensores que tenían una capa de difusión de copolímero de bloque B no mostraron grietas en la capa de difusión. Por el contrario, en condiciones de prueba idénticas, los sensores que tenían el copolímero de bloque poli(BUMA-r-MMA-b-HEMA) mostraron anillos de Newton debido a una delaminación de la capa de difusión (como se muestra en la figura 6).
Ejemplo 3 Hidrofobicidad de la capa de difusión de un sensor EC ENF
Los sensores se fabricaron como se describe en el documento WO 2010/028708 con el copolímero de bloque D y el copolímero de bloque E comparativos de la invención que comprenden bloques hidrófilos de HEMA y bloques hidrófobos de acrilato de etilo (EA) (véase la tabla 3). Todas las condiciones de prueba fueron idénticas al ejemplo 1.
Tabla 3
Figure imgf000013_0001
Se descubrió que los sensores recubiertos con el copolímero de bloque D eran inestables con respecto al comportamiento del sensor. Por tanto, no se pudo medir ningún valor para el coeficiente de difusión o la variación de sensor.
En cambio, se observó un buen comportamiento del sensor con el copolímero de bloque E, en el que la fracción de HEMA hidrófila se incrementó hasta aproximadamente un 80 % molar y la fracción de EA hidrófoba disminuyó hasta aproximadamente un 20 % molar. Como se puede ver en las figuras 7a y 7b, el copolímero de bloque E muestra un coeficiente de difusión incrementada, pero también una variación de sensor incrementada en comparación con el copolímero de bloque B del ejemplo 1. Esto se puede deber a la menor hidrofobia de poliEA en comparación con poli(n-BuA).
También se observó un comportamiento diferente de los copolímeros de bloque B y E al comienzo de la medición. Se descubrió que el copolímero de bloque E (poli(EA-b-HEMA)) tiene una fase de inicio relativamente larga (24 h), mientras que el copolímero de bloque B (poli(nBuA-b-HEMA)) solo muestra una fase de inicio muy corta (como se muestra en la figura 8).
Ejemplo 4 Caracterización del copolímero de bloque
Se produjo y caracterizó in vitro un sensor de múltiples campos (10 campos de electrodos de trabajo y contraelectrodos, respectivamente) para la medición continua de la glucosa.
El sensor se proporcionó con una capa de difusión que consistía en un copolímero de bloque que comprendía un bloque hidrófobo de acrilato de n-butilo (n-BuA) y un bloque hidrófilo de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA). Estos polímeros corresponden a los copolímeros de bloque B y C del ejemplo 1.
El parámetro decisivo con respecto a la permeabilidad de la barrera de difusión para el analito es la sensibilidad por unidad de área del electrodo de trabajo (es decir, el área geométrica). La sensibilidad SE se calcula a partir de las mediciones de corriente (I) a una concentración de glucosa de 10 mM y 0 mM en solución tamponada con fosfato (pH 7,4) en nA/mM:
SE = [I(10 mM) - l(0 mM)]/10
para cada uno de los sensores analizados. A partir de los valores de medición individuales (N=8) se determina la sensibilidad media SEm. Los valores de sensibilidad obtenidos se dividen entre el área geométrica total F microscópicamente medida de todos los puntos de electrodos de trabajo en el sensor de múltiples campos. De este modo, se obtiene una densidad de sensibilidad SEm/F.
La linealidad Y de la curva de función in vitro es una indicación de la funcionalidad de control de difusión de la capa de cubierta de polímero en el electrodo de trabajo. Se calcula a partir de mediciones de corriente a una concentración de glucosa de 20 mM, 10 mM y 0 mM en %:
Y20 mM = 50 [l(20 mM) - l(0 mM)]/[l(10 mM) - l(0 mM)]
para cada uno de los sensores analizados. A partir de los valores de medición individuales se determina el valor medio de linealidad y su desviación estándar.
Finalmente, el espesor de capa L de la barrera de difusión de los sensores se determina por medición óptica para cada uno de los polímeros. Los valores medios correspondientes se calculan para una muestra de n=4 sensores con el mismo polímero. A partir de ahí, se puede calcular el coeficiente de difusión eficaz Deff de la capa de cubierta:
Deff =SEm/F L m '5,182'10'8
en cm2/s, en la que SEm y Lm son los valores medios respectivos para la sensibilidad y el espesor de capa, y F es el área total de todos los puntos de electrodos de trabajo.
La variación de sensor se calculó a partir de repeticiones de las fases de concentración de glucosa durante 7 días de mediciones in vitro.
Los resultados se muestran en la tabla 4:
Tabla 4:
Figure imgf000014_0001
n. m. = no medido

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Sistema de electrodos para medir la concentración de un analito en condiciones in vivo, que comprende un electrodo (1) con moléculas de enzima inmovilizadas y una barrera de difusión (8) que controla la difusión del analito desde el exterior del sistema de electrodos hacia las moléculas de enzima, en el que la barrera de difusión (8) comprende un copolímero de bloque que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo, en el que el copolímero de bloque comprende de un 75 a un 95 % molar del al menos un bloque hidrófilo y de un 5 a un 25 % molar del al menos un bloque hidrófobo basado en la cantidad total (molar) del copolímero de bloque en estado seco y en el que la temperatura de transición vítrea del al menos un bloque hidrófobo está en el intervalo de aproximadamente -80 °C a aproximadamente 0 °C, en el que un bloque hidrófobo se prepara a partir de unidades monoméricas seleccionadas de ésteres (met)acrílicos hidrófobos, en el que un bloque hidrófilo se prepara a partir de unidades monoméricas hidrófilas seleccionadas de ésteres (met)acrílicos hidrófilos con, por ejemplo, un grupo OH y/u OCH3 polar, (met)acrilamidas hidrófilas, ácido (met)acrílico o combinaciones de los mismos.
2. El sistema de electrodos de la reivindicación 1, en el que el copolímero de bloque es un copolímero dibloque o un copolímero tribloque.
3. El sistema de electrodos de la reivindicación 1 o 2, en el que
(i) un bloque hidrófilo del copolímero de bloque tiene una longitud de cadena de desde 150 a 900 o de 200 a 800, en particular de 175 a 450 o de 300 a 600 unidades monoméricas y/o
(ii) un bloque hidrófobo del copolímero de bloque tiene una longitud de cadena de desde 20 a 300 o de 50 a 250, en particular de 50 a 100 o de 50 a 150 unidades monoméricas.
4. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la proporción relativa de la longitud de cadena del bloque hidrófilo y la longitud de cadena del bloque hidrófobo está en el intervalo de 2:1 a 20:1 o en el intervalo de 3:1 a 10:1, preferentemente en el intervalo de 4:1 a 8:1.
5. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que un bloque hidrófobo se prepara a partir de unidades monoméricas seleccionadas de:
acrilato de etilo (EA),
acrilato de n- o i-propilo,
acrilato de n/sec o i-butilo (n-BuA/sec-BuA o i-BuA),
acrilato de 3-pentilo,
acrilato de n-pentilo,
acrilato de n-hexilo,
metacrilato de n-hexilo,
acrilato de 2-etilhexilo,
metacrilato de 2-etilhexilo,
acrilato de n-heptilo,
metacrilato de n-heptilo,
acrilato de n-octilo,
metacrilato de n-octilo,
acrilato de n-nonilo,
metacrilato de n-nonilo,
metacrilato de n/isodecilo,
metacrilato de n-dodecilo,
acrilato de n-dodecilo
y combinaciones de los mismos.
6. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el bloque hidrófobo consiste en un homopolímero de una única unidad monomérica hidrófoba.
7. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el bloque hidrófobo tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de aproximadamente 19000 g/mol o menor, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 5000 g/mol a aproximadamente 16000 g/mol.
8. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que un bloque hidrófilo se prepara a partir de unidades monoméricas hidrófilas seleccionadas de:
acrilato de 2-hidroxietilo,
metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA),
acrilato de 2-metoxietilo,
metacrilato de 2-metoxietilo,
acrilato de 2- o 3-hidroxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-hidroxipropilo (2- o 3-HPMA),
acrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
metacrilato de 2- o 3-metoxipropilo,
acrilato de 1- o 2-glicerol,
metacrilato de 1- o 2-glicerol,
acrilamida,
metacrilamida,
una N-alquil- o N,N-dialquil-acrilamida, y
una N-alquil- o N,N-dialquil-metacrilamida, en la que el alquilo comprende 1 átomo de C tal como metilo, ácido acrílico (acrilato),
ácido metacrílico (metacrilato),
metacrilato de 2-(2-metoxietoxi)etilo,
acrilato de 2-(2-metoxietoxi)etilo,
acrilato de 2-(2-hidroxietoxi)etilo,
metacrilato de 2-(2-hidroxietoxi)etilo,
y combinaciones de los mismos.
9. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el bloque hidrófilo tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de aproximadamente 24000 g/mol o mayor, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 24000 g/mol a aproximadamente 90000 g/mol.
10. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el bloque hidrófilo tiene una temperatura de transición vítrea de aproximadamente 100 °C o superior, preferentemente de 105 °C a 140 °C o de 110 °C a 120 °C.
11. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la proporción molar de bloque hidrófilo:bloque hidrófobo está en el intervalo de >75 % molar (hidrófilo):<25 % molar (hidrófobo) a 95 % molar (hidrófilo):5 % molar (hidrófobo), preferentemente en el intervalo de 80 % molar (hidrófilo):20 % molar (hidrófobo) a 90 % molar (hidrófilo): 10 % molar (hidrófobo), más preferentemente en el intervalo de 84 % molar (hidrófilo):16 % molar (hidrófobo) a 86 % molar (hidrófilo): 14 % molar (hidrófobo).
12. El sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el copolímero de bloque tiene un peso molecular promedio en número (Mn) en el intervalo de 20 a 200 kDa, preferentemente en el intervalo de 25 a 95 kDa.
13. Un sensor que es insertable o implantable en un cuerpo que comprende un sistema de electrodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14. El sensor de la reivindicación 13 para la medición de glucosa.
15. Uso de un copolímero de bloque que tiene al menos un bloque hidrófilo y al menos un bloque hidrófobo, en el que el copolímero de bloque comprende de un 75 a un 95 % molar del al menos un bloque hidrófilo y de un 5 a un 25 % molar del al menos un bloque hidrófobo, basado en la cantidad total (molar) del copolímero de bloque en estado seco y en el que la temperatura de transición vítrea del al menos un bloque hidrófobo está en el intervalo de aproximadamente -80 °C a aproximadamente 0 °C, como un barrera de difusión (8) para un electrodo enzimático (1), en el que un bloque hidrófobo se prepara a partir de unidades monoméricas seleccionadas de ésteres (met)acrílicos hidrófobos, en el que un bloque hidrófilo se prepara a partir de unidades monoméricas hidrófilas seleccionadas de ésteres (met)acrílicos hidrófilos con, por ejemplo, un grupo OH y/u OCH3 polar, (met)acrilamidas hidrófilas, ácido (met)acrílico o combinaciones de los mismos.
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