CN104334740B - 用于酶体内传感器的改进的隔离膜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测量体内条件下的分析物浓度的电极系统，其包括具有固定的酶分子和改进的扩散屏障的电极，该扩散屏障控制了分析物从围绕该电极系统的体液向该酶分子的扩散。

Description

用于酶体内传感器的改进的隔离膜
本发明涉及用于测量体内条件下的分析物浓度的电极系统，其包括具有固定的酶分子的电极，和控制该分析物从围绕该电极系统的体液向酶分子扩散的改进的扩散屏障。
此外，本发明涉及用于测量体内条件下的分析物浓度的电极系统，其包括具有固定的酶分子的电极，任选地控制该分析物从电极系统的外部向酶分子扩散的扩散屏障，和形成电极系统的至少一部分外层的改进的间隔膜。
具有可植入或可插入电极系统的传感器有利于测量患者体内的生理学上有意义的分析物，诸如例如乳酸或葡萄糖。这类系统的工作电极具有导电性酶层，在其中结合有酶分子，其通过催化转化分析物分子而释放载荷子。在该过程中，作为测量信号产生电流，所述信号的幅度与分析物浓度有关。
这样的电极系统例如从WO 2007/147475和WO 2010/028708中是已知的，其内容通过引用并入本文。
该电极系统的工作电极提供有扩散屏障，其控制了待测定的分析物从围绕该电极系统的体液或组织向固定在酶层中的酶分子的扩散。根据WO 2010/028708，该电极系统的扩散屏障是至少两种不同的聚合物的固溶体，优选丙烯酸酯的固溶体。该聚合物可以是共聚物，例如甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸羟乙酯的共聚物或甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸羟乙酯的共聚物。
WO 2007/147475公开了由具有两性离子结构的聚合物制成的扩散屏障。这样的聚合物的一个实例是聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱-共-甲基丙烯酸正丁酯)。该两性离子聚合物可以与另一种聚合物(例如聚氨酯)混合。
但是，使用聚合物或共聚物的混合物的缺点在于该混合物的制备和它应用于传感器是繁杂的和可能有问题的。通常，将待混合的聚合物分别溶解，然后将所形成的溶液以期望的比例混合。但是，这可能会导致所述组分之一沉淀，从而导致加工性问题，例如在喷雾过程中。当该混合物包含具有离子特性的聚合物时，即，当待混合的聚合物之一包含具有阴离子或阳离子基团的单体时，会产生更大的困难。但是，这样的带电基团的存在对溶解性具有强烈影响，使得难以找到适于带电聚合物和不带电聚合物二者的溶剂。
WO 2006/058779公开了一种基于酶的传感器，其具有组合的包含至少一种聚合物材料的扩散和酶层，且颗粒携带酶，其中该颗粒分散在该聚合物材料中。该聚合物可以包含亲水性以及疏水性聚合物链序列，例如该聚合物可以是高或低吸水性聚醚-聚氨酯共聚物。没有公开使用具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物作为扩散层。
EP-A-2163190描述了一种用于测量体内分析物浓度的电极系统，其包含具有电导体的反电极(counterelectrode)，和具有其上布置有包含固定的酶分子的酶层的电导体的工作电极。扩散屏障控制分析物从周围体液向酶分子的扩散。该扩散屏障可以包含亲水化聚氨酯，其可以通过4,4'-亚甲基-双(环己基异氰酸酯)和二醇混合物(其可以是聚乙二醇和聚丙二醇)的缩聚来获得。该亲水性聚氨酯层可以覆盖有隔离物，例如甲基丙烯酸丁酯与2-甲基丙烯酰氧乙基-磷酰基胆碱的共聚物。没有公开使用具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物作为扩散层。也没有公开使用包含多于50 mol-%亲水性单体的(甲基)丙烯酸单体的亲水性共聚物。
本发明的一个目的是在酶(enzymatic)体内传感器的电极系统上提供扩散屏障，其提供了期望的理化特性，并且其可易于制造。
这个目的是通过提供由具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的单个嵌段共聚物构成的扩散屏障来达到的。该亲水性和疏水性嵌段是彼此共价连接的。优选该嵌段是(甲基)丙烯酸酯聚合物嵌段。
该基于嵌段共聚物的扩散屏障提供了如下的优异理化特性：
(i) 该扩散屏障对于待测定的分析物的渗透性，
(ii) 该扩散屏障的渗透特性，其适于该电极的短期行为(润湿性)和长期行为(传感器漂移)，
(iii) 该扩散屏障的机械柔韧性，其允许制造具有扩展的多电极的体内传感器；
(iv) 离子基团向该扩散层中的有效引入，即，可以有效地调节聚合物内的阳离子或阴离子电荷的密度，这与带电分析物的排斥或吸引和/或对细胞粘附 (例如对来自于周围体液或组织的单核细胞)的控制有关。
本发明的主题是用于测量体内条件下的分析物浓度的电极系统，其包括具有固定的酶分子的电极，和控制分析物从该电极系统外部向酶分子扩散的扩散屏障，特征在于该扩散屏障包含具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物。
优选地，该扩散屏障包含单一的，即，仅仅一种具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物，即，不存在另外的聚合物或共聚物。更优选地，该扩散屏障由具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的单一嵌段共聚物构成。
本发明的电极系统适于插入或植入体内，例如哺乳动物体诸如人体内。该电极系统适用于测量体液和/或体组织中期望的分析物，例如细胞外空间(小间隙)中、血液中或淋巴管中或细胞间空间中期望的分析物。
该插入或植入的电极系统适于短期应用，例如3-14天，或长期应用，例如6-12个月。在该插入或植入期间过程中，可以通过连续或不连续测量来测定期望的分析物。
本发明的电极系统优选是酶非流体(ENF)传感器的部分，其中测定分析物的酶转化。优选该传感器包含工作电极，其具有用于转化分析物的固定的酶分子，该转化导致产生了电信号。该酶可以存在于覆盖该电极的层中。此外，可以存在氧化还原介质和/或电催化剂以及导电颗粒和成孔剂。这种类型的电极描述在例如WO 2007/147475中，其内容通过引用并入本文。
工作电极的区域是传感器的敏感区域。该敏感区域提供有扩散屏障，其控制了分析物从外部例如围绕该电极系统的体液和/或组织向酶分子的扩散。该扩散屏障可以例如是覆盖酶层的覆盖层，即，无酶层。但是，同样可行的是将扩散控制颗粒并入到该酶层中来充当扩散屏障。例如酶层的孔可以用控制分析物分子扩散的聚合物来填充。该扩散屏障的厚度通常是约2-20μm，例如约2-15μm，或约5-20μm，特别是约5-10μm或约10-15μm(在干燥状态下)。
本发明的电极系统的扩散屏障包含嵌段共聚物，优选具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的单一嵌段共聚物。该嵌段共聚物可以包含交替序列的嵌段，即，亲水性嵌段连接到疏水性嵌段上。该亲水性和疏水性嵌段在聚合物分子内彼此共价连接。该聚合物的平均分子量(以重量计)通常是20-70kD，特别是25-60kD，且更特别是30-50kD。该嵌段共聚物中亲水性与疏水性部分的摩尔比通常是约75%(亲水性)：25%(疏水性)-约25%(亲水性)：75%(疏水性)，约65%(亲水性)：35%(疏水性)-约35%(亲水性)：65%(疏水性)或约60%(亲水性)：40%(疏水性)-约40%(亲水性)：60%(疏水性)的范围内。
该嵌段共聚物的亲水性嵌段由至少90%，至少95%且特别是完全由亲水性单体单元组成。它的长度通常是50-400，例如50-200，或150-300，特别是100-150，或200-250个单体分子。该共聚物的疏水性嵌段由至少90%，更特别是至少95%和甚至更特别是完全由疏水性单体单元组成。它的长度通常是50-300，例如50-200或150-250个，特别是80-150或170-200个单体单元。
该亲水性嵌段和/或疏水性嵌段优选由基于(甲基)丙烯酸的单元组成。更优选该亲水性嵌段和疏水性嵌段二者都是由基于(甲基)丙烯酸的单体单元组成。
该亲水性嵌段的亲水性单体单元优选选自亲水性(甲基)丙烯酸酯，即，在酯的醇部分中具有极性基团(即，OH、OCH3或OC2H5)的酯，具有酰胺(NH2)或N-烷基-或N,N-二烷基酰胺基团的亲水性(甲基)丙烯酰胺，其中该烷基包含1-3个C原子和任选的亲水性基团，诸如OH、OCH3或OC2H5，和合适的具有带电基团，例如阴离子或阳离子基团，的(甲基)丙烯酸单元，诸如丙烯酸(丙烯酸酯)或甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)。此外，可以使用单体单元的组合。
用于该亲水性嵌段的优选的单体单元的具体实例选自：
丙烯酸2-羟乙酯，
甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)，
丙烯酸2-甲氧基乙酯，
甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯，
丙烯酸2-乙氧基乙酯，
甲基丙烯酸2-乙氧基乙酯，
丙烯酸2-或3-羟丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)，
丙烯酸2-或3-甲氧基丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-甲氧基丙酯，
丙烯酸2-或3-乙氧基丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-乙氧基丙酯，
丙烯酸1-或2-甘油酯，
甲基丙烯酸1-或2-甘油酯，
丙烯酰胺，
甲基丙烯酰胺，
N-烷基-或N,N-二烷基丙烯酰胺，和
N-烷基-或N,N-二烷基甲基酰胺，其中烷基包含1-3个C原子，诸如甲基、乙基或丙基，
丙烯酸(丙烯酸酯)，
甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)及其组合。
优选的亲水性单体是甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)和/或甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)。更优选地，该亲水性嵌段由至少两种不同的亲水性单体单元组成。例如它可以是至少两种不同的亲水性单体单元(诸如HEMA和2-HPMA)的无规共聚物。
为了将离子基团引入单体中，可以把带电单体单元，诸如丙烯酸(丙烯酸酯)和/或甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)，并入该亲水性嵌段中。因此，在本发明的一个具体实施方案中，该亲水性嵌段可以由至少一种非离子亲水性单体单元(例如，如上所述)和至少一种离子亲水性单体单元制成，其中该离子单体单元以优选1-20mol%的摩尔量存在。在亲水性嵌段包含离子单体单元(诸如丙烯酸或甲基丙烯酸)的情况下，与选自(甲基)丙烯酰胺，特别是N,N-二烷基丙烯酰胺或N,N-二烷基甲基丙烯酰胺的亲水性单体的共聚是优选的。
该疏水性嵌段的疏水性单体单元优选选自疏水性丙烯酸和/或甲基丙烯酸单元、基于苯乙烯的单体单元或其组合。优选地，该疏水性单体单元选自疏水性(甲基)丙烯酸酯，例如具有含1-3个C原子但不含亲水性基团的醇部分的酯。用于该疏水性嵌段的单体单元的具体实例选自：
丙烯酸甲酯，
甲基丙烯酸甲酯(MMA)，
丙烯酸乙酯，
甲基丙烯酸乙酯(EMA)，
丙烯酸正或异丙酯，
甲基丙烯酸正或异丙酯，
丙烯酸正丁酯，
甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)，
丙烯酸新戊酯，
甲基丙烯酸新戊酯及其组合。
该疏水性嵌段优选包含至少两种不同的疏水性单体单元，其例如作为无规共聚物而存在。在一个优选的实施方案中，该疏水性嵌段包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)。在一个特别优选的实施方案中，该疏水性嵌段是MMA和BUMA的无规共聚物。MMA和BUMA之间的摩尔比优选是约60%(MMA)：40%(BUMA)-约40%(MMA)：60%(BUMA)，例如约50%(MMA)：50%(BUMA)。该疏水性嵌段的玻璃转化温度优选是100℃或更低，90℃或更低或80℃或更低，例如约40-80℃。在一个可替代的实施方案中，该疏水性嵌段可以由苯乙烯单元组成，例如由玻璃转化温度为约95℃的聚苯乙烯组成。
本发明中使用的嵌段共聚物可以根据已知方法制造(Böker等人，Macromolecules34(2001)，7477-7488)。
该嵌段共聚物可以通过常规技术施加到电极系统上，例如通过提供该嵌段共聚物在合适的溶剂或溶剂混合物(例如有机溶剂，诸如醚)中的溶液，将该溶液施加到预制的电极系统并在其上干燥。
当该嵌段共聚物与水接触时，它在37℃的温度和7.4的pH(含水磷酸盐缓冲液10mMKH2PO4，10mM NaH2PO4和147mM NaCI)下表现出优选约15重量%-30重量%(基于聚合物干重)的吸水率(water uptake)。
除了该嵌段共聚物之外，该扩散屏障还可以包含另外的组分，特别是非聚合组分，其可以分散和/或溶解在该聚合物中。这些另外的化合物包括增塑剂，特别是生物相容的增塑剂，诸如偏苯三酸三-(2-乙基己基)酯和/或甘油。
本发明的扩散屏障具有对葡萄糖的高有效扩散系数Deff，在37℃的温度和7.4的pH下，其优选≥10-10cm2/s，更优选≥5·10-10cm2/s，且甚至更优选≥10-9 cm2/s，例如高达10-7或10-8 cm2/s。有效扩散系数优选如实施例4所述根据以下方程来测定：
Deff=SEm/F·Lm·5182∙10-8
其中SEm是工作电极的灵敏度，F是工作电极的面积，且Lm是扩散屏障的层厚。SEm和Lm可以如实施例所述来测定。
本发明的电极系统适于在体内条件下(即，当插入或植入体内时)测量分析物的浓度。该分析物可以是存在于组织或体液中的任何分子或离子，例如氧气、二氧化碳、盐(阳离子和/或阴离子)、脂肪或脂肪组分、碳水化合物或碳水化合物组分、蛋白或蛋白组分、或其它类型的生物分子。特别优选的是测定能够在体液，例如血液，和组织之间有效转移的分析物，诸如氧气、二氧化碳、钠阳离子、氯阴离子、葡萄糖、尿素、甘油、乳酸和丙酮酸。
该电极系统包含固定在电极上的酶。该酶适于测定期望的分析物。优选该酶能够催化转化分析物和由此产生可以被工作电极的电导体检测的电信号。用于测量分析物的酶优选是氧化酶，例如葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶或脱氢酶，例如葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。除了酶之外，该酶层还可以包含电催化剂或氧化还原介质，其有利于电子向工作电极的导电组分(例如石墨颗粒)的转移。合适的电催化剂是金属氧化物(诸如二氧化锰)或有机金属化合物(诸如酞菁钴)。在一个优选的实施方案中，该氧化还原介质能够降解过氧化氢，由此抵消工作电极周围的氧消耗。在一个不同的实施方案中，氧化还原介质可以共价结合到酶上，并由此实现向工作电极的直接电子转移。用于直接电子转移的合适的氧化还原介质是辅基(prosthetic group)，诸如吡咯并喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或其它已知辅基。固定在电极上的酶例如描述在WO 2007/147475中，其内容通过引用并入本文。
该电极系统的一个优选的实施方案包括具有电导体的反电极和具有电导体(其上设置酶层和扩散屏障)的工作电极。该酶层优选设计为多个块(field)的形式，其彼此相隔一定距离，例如至少0.3 mm或至少0.5 mm，设置在工作电极的导体上。该工作电极的各块可以形成一系列的各个工作电极。在这些块之间，该工作电极的导体可以被绝缘层覆盖。通过将酶层的块设置在电绝缘层的开口的顶部上，能够改进信噪比。这样的设置公开在WO2010/028708中，其内容通过引用并入本文。
本发明的电极系统可以另外包含能够为工作电极供给参比电势的参比电极，例如Ag/Ag-Cl参比电极。此外，本发明的电极系统可以具有另外的反电极和/或工作电极。
该电极系统可以是传感器的部分，例如通过连接到稳压器和用于放大该电极系统的测量信号的放大器。该传感器优选是酶非流体(ENF)传感器，更优选电化学ENF传感器。该电极系统的电极可以设置在携带稳压器的基底上或附着到携带稳压器的电路板上。
本发明的另一主题涉及具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物作为酶电极的扩散屏障的用途。该嵌段共聚物优选如上所述，例如单一嵌段共聚物。该扩散屏障和酶电极也优选如上所述。
本发明的另外的细节和优点基于示例性实施方案并参考附图来解释。
图1显示了本发明的电极系统的一个示例性实施方案。
图2显示了图1的局部放大视图。
图3显示了图1的另一局部放大视图。
图4显示了沿图2的截面线CC的截面。
图5显示了提供有不同的嵌段聚合物(C、F、D、B)作为屏障层的四种葡萄糖传感器(在10mM葡萄糖中)的灵敏度(和标准偏差)。
图6显示了提供有不同的嵌段聚合物(A、C、D、F)作为屏障层的四种葡萄糖传感器的传感器漂移。
图7显示了嵌段共聚物A的电导率依赖于时间的曲线(2次实验)。
图8显示了嵌段共聚物F的电导率依赖于时间的曲线(3次实验)。
图9显示了分别对于2.77μm或4.43μm的层厚来说，嵌段共聚物H的电导率依赖于时间的曲线。
图10显示了相对于未涂覆的板(空白)的纤维蛋白原在体外向不同隔离膜聚合物(Adapt®和Eudragit E100)的粘附。
图11显示了在与用隔离膜(Adapt®和Lipidure CM5206)涂覆或未涂覆(对照物=未处理的细胞)的传感器孵育之后THP-1细胞对表面蛋白CD54的表达。
图12a和12b显示了在与用隔离膜(Adapt®和Lipidure CM5206)涂覆或未涂覆(对照物=未处理的细胞)的传感器孵育之后THP-1细胞分别对细胞因子IL-8和MCP-1的分泌。
图13显示了在与用隔离膜(Adapt®、Lipidure CM5206和Eudragit E100)涂覆或未涂覆(Polyst.)且具有额外纤维蛋白原层的组织培养板孵育之后THP-1细胞对细胞因子IL-8的分泌。
图14显示了与无传感器的隔离聚合物Adapt®相比，在与用隔离膜(Adapt®和Lipidure CM5206)涂覆或未涂覆的传感器孵育之后的溶血(阴性对照物=仅孵育介质；阳性对照物= 100％渗透裂解)。
图1显示了电极系统的一个示例性实施方案，其用于插入人或动物的体组织中，例如插入真皮或皮下脂肪组织中。图2中显示了A的局部放大图，图3中显示了B的局部放大图。图4显示了沿着图2中的截面线CC的相应的截面图。
所示电极系统具有工作电极1、反电极2和参比电极3。电极的电导体1a、2a、3a以金属导体路径，优选由钯或金制成的路径，的形式设置在基底4上。在所示的示例性实施方案中，基底4是柔性塑料板，例如由聚酯制成。基底4厚度小于0.5mm，例如为100-300微米，并因此易于弯曲，使得在其插入后其可适应于周围体组织的移动。基底4具有用于插入患者体组织内的窄杆(narrow shaft)和用于连接到设置在体外的电子系统上的宽头。基底4的杆优选为至少1cm长，特别是2cm-5cm。
在所示的示例性实施方案中，测量设施的一部分，即，基底的头部，在使用过程中从患者体中伸出来。或者，同样可行的是，将整个测试设施植入并以无线方式将测量数据传输到设置在体外的接收器。
工作电极1携带酶层5，其包含用于催化转化分析物的固定的酶分子。酶层5可以例如以碳颗粒、聚合物粘合剂、氧化还原介质或电催化剂、和酶分子的固化糊状物的形式来施加。生产这种类型的酶层5的细节公开在例如WO 2007/147475中，其在本文上下文中作为参考。
在所示的示例性实施方案中，酶层5不是连续施加到工作电极1的导体1a上的，而是以彼此间隔设置的单个块的形式来施加的。在所示的示例性实施方案中酶层5的单个块是呈一系列排列的。
工作电极1的导体1a在酶层块之间具有狭窄部位，其在图2中尤其清楚可见。反电极2的导体2a具有遵循工作电极1的导体1a的路线(course)的轮廓。这意味着产生了具有有利地短电流路径和低电流密度的工作电极1和反电极2的嵌入或交叉设置。
为了增加其有效表面，反电极2可以具有多孔导电层6，其以单个块的形式位于反电极2的导体2a上。类似于工作电极1的酶层5，该层6可以以碳颗粒和聚合物粘合剂的固化糊状物的形式来施加。层6的块优选具有与酶层5的块相同的尺寸，尽管这不是必须的。但是，增加反电极表面的措施也可是预知的，并且反电极2也可设计为不具有任何类型涂层、或具有由所述嵌段共聚物制成的涂层和任选的隔离物的线性导体路径。
参比电极3设置在工作电极1的导体1a和反电极2的导体2a之间。图3中所示的参比电极由导体3a组成，导体3a上设置有导电的银/氯化银糊状物的块3b。
图4显示了沿图2中的截面线CC的示意性截面图。截面线CC穿过工作电极1的酶层块5之一以及反电极2的导电层6的块之间。在酶层5的块之间，工作电极1的导体1a可以覆盖有电绝缘层7，像导电层6的块之间的反电极2的导体2a一样，以防止否则可能会通过导体路径1a、2a的金属催化的干扰反应。酶层5的块因此位于绝缘层7的开口中。同样，反电极2的导电层6的块也可以置于绝缘层7的开口之上。
酶层5被覆盖层8覆盖，其为待测量的分析物提供了扩散阻力，因此充当了扩散屏障。该扩散屏障8由上述具有交替的亲水性和疏水性嵌段的单一共聚物构成。
覆盖层8的有利厚度例如是3-30μm，特别是约5-10μm或约10-15μm。因为它的扩散阻力，覆盖层8导致每个单位时间内更少的分析物分子到达酶层5。因此覆盖层8降低了分析物分子的转化速率，和由此抵消了工作电极周围的分析物浓度的耗竭。
覆盖层8在工作电极1的导体1a的整个面积上基本连续地延伸。在覆盖层8上，生物相容性膜可以作为隔离物9设置，其在酶层5与周围体组织的细胞之间建立了最小距离。此方式有利地产生了用于分析物分子的存储器，在酶层块5周围的流体交换(fluidexchange)发生短暂扰动的情况下，分析物分子可以从该存储器到达相应的酶层块5。如果电极系统周围的体液交换被暂时限制或甚至被阻止，存储在隔离物9中的分析物分子继续扩散到工作电极1的酶层5，在这里它们被转化。隔离物9因此使得仅在显著更长的时间期间之后才发生分析物浓度的明显耗竭和相应的测量结果失真。在所示示例性实施方案中，形成隔离物9的膜也覆盖了反电极2和参比电极3。
隔离膜9可以例如是透析膜。在本文上下文中，透析膜被理解为是大于最大尺寸的分子不能透过的膜。该透析膜可以在单独的制造方法中预制，然后可以在该电极系统制作过程中施加。选择该透析膜能够透过的分子的最大尺寸，以使得分析物分子能够通过，而更大的分子被截留。
或者，代替透析膜，由对分析物和水具有高渗透性的聚合物制成的涂层，例如基于聚氨酯或丙烯酸酯的涂层，可以作为隔离膜9来施加在该电极系统上。
优选该隔离物是由(甲基)丙烯酸酯的共聚物制成的。优选该隔离膜是至少2或3种(甲基)丙烯酸酯的共聚物。更优选该隔离膜包含大于50mol%，至少60mol%或至少70mol%的亲水性单体单元，例如HEMA和/或2-HPMA，和最多40mol%或最多30mol%的疏水性单元，例如BUMA和/或MMA。该隔离物可以是无规或嵌段共聚物。特别优选的隔离膜包含MMA或BUMA作为疏水性部分和2-HEMA和/或2-HPMA作为亲水性部分。优选地，亲水性单体HEMA和/或HPMA的量为80 mol-%至85 mol-%，且疏水性组分MMA和/或BUMA的量为15 mol-%至20 mol-%。
本发明的非常优选的隔离膜由共聚物Adapt® (BioInteractions Ltd,Reading, England)制成。Adapt®包含作为疏水性部分的BUMA和作为亲水性部分的2-HEMA和2-HPMA，其中所述2-HEMA亲水性单体的量为约80 mol-%。
该隔离膜对分析物是高渗透性的，即，它的确明显降低了每个面积工作电极的灵敏度，例如20%或更低，或5%或更低，并且层厚度小于约20μm，优选小于约5μm。特别优选的隔离膜厚度是约1-约3μm。
该电极系统的酶层5可以包含金属氧化物颗粒，优选二氧化锰颗粒，作为催化氧化还原介质。二氧化锰催化转化过氧化氢，其是例如通过葡萄糖和其它生物分析物的酶氧化形成的。在过氧化氢降解过程中，二氧化锰颗粒将电子转移到工作电极1的导电组分例如酶层5中的石墨颗粒。过氧化氢的催化降解抵消了酶层5中氧浓度的任何降低。有利地，这使得酶层5中待测量的分析物的转化能够不受局部氧浓度的限制。催化氧化还原介质的使用因此抵消了由于氧浓度低而导致的测量结果失真。催化氧化还原介质的另一优点是它防止了产生细胞破坏浓度的过氧化氢。
本文所述优选的隔离膜聚合物可以用作本发明的扩散屏障的外涂层，但是也可以用作一般的电极系统的外涂层，特别是用于测量体内条件下分析物浓度的电极系统的外涂层，该系统包括具有固定的酶分子和扩散屏障的电极，该屏障控制了分析物从所述电极系统外部向所述酶分子的扩散。因此，隔离膜可以被设置在扩散屏障上，但是，隔离膜还可以被直接设置在酶层上。在这最后的情况下，隔离膜也可以充当扩散屏障本身并减缓分析物分子向酶层的扩散。
当本发明的电极系统被插入或植入体内时，隔离膜是植入的传感器和周围体液或组织之间的界面。因此，当暴露于体液或组织中时，本发明的隔离膜必须是机械上坚固的，从而使得它既不变形也不离开传感器。为此，隔离膜共聚物吸水率和该共聚物的伴随溶胀必须限制，虽然该共聚物具有固有亲水性。
优选地，基于共聚物的总速率，隔离膜共聚物的相对吸水率应当不超过50重量%，优选40重量%，更优选30重量%。在本发明的情况下，相对吸水率的测量是通过将干燥共聚物在37℃的温度下经受过量的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)持续48 h而进行的。相对吸水率(WU%)优选根据以下方程确定：
WU% = (m2-m1)/m1 x 100,
其中m1和m2分别表示根据上述测量条件的干燥共聚物和水化后的共聚物的质量。
本发明的发明人确定，由共聚物Adapt®制成的优选的隔离膜在37℃经48 h吸收相对于其自身重量的33 ± 1.8重量%的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。在相同条件下，聚合物Lipidure CM5206 (NOF Corporation, Japan)的膜吸收相对于其自身重量的157 ± 9.7重量%的磷酸盐缓冲液。聚合物的较低吸水率有利地增加了本发明的隔离膜的机械稳定性。相比之下，Lipidure CM5206表现出较高吸水率，且溶胀为更脆弱、容易可变形或离开的水凝胶，特别是当施加在酶体内传感器的电极系统上时。
此外，在插入和实施电极系统的过程中，间隔物与组织和/或体液，如间质液或者血液等(含有生物分子如蛋白)和细胞直接接触。优选地，所述隔离膜必须保护组织和/或体液环境中插入和植入的传感器，并因此使机体与植入物的组织反应最小化。事实上，机体针对植入材料的反应被称为“外来体反应”(FBR)。通过FBR，机体试图破坏植入物，或者，如果它是不可能的，则生成胶囊以便将它与周围组织(外来体肉芽肿)分开。FBR反应的第一步骤是将蛋白(例如，纤维蛋白原、白蛋白、免疫球蛋白、补体)结合至前者材料(即植入物)的表面上。该蛋白涂覆将结合位点呈递至免疫细胞上的受体。例如，纤维蛋白原含有结合至单核细胞受体MAC-1的结构基序。当纤维蛋白原结合至植入物的表面时，其改变其构象并暴露对于MAC-1的结合位点。因此，免疫细胞，如单核细胞，被招募至植入物，并被活化，分泌酶和自由基以攻击植入物。此外，免疫细胞分泌可溶性因子，即细胞因子，以招募并活化其它免疫细胞，并由此扩增免疫应答。如果不能去除植入物，则由结缔组织细胞和蛋白形成纤维囊。但是，该囊是分析物到达传感器的扩散屏障。总之，如上所述的外来体反应的事件可能干扰体内的电极系统功能和其寿命。
因此，酶体内传感器的电极系统上的改进的隔离膜进一步提供了组织对植入物的反应的降低，并抑制将传感器与周围组织和体液分开的囊的形成。
因此，本发明另一目的是提供用于测量体内条件下的分析物浓度的电极系统，其包括具有固定的酶分子和优选地扩散屏障的电极，该扩散屏障控制了分析物从该电极系统外部向该酶分子的扩散，特征在于隔离膜形成了该电极系统的外层的至少一部分，其中该隔离膜包含丙烯酸和/或甲基丙烯酸单体的亲水性共聚物，其中该聚合物包含大于50mol%的亲水性单体。
如上所述，本发明的隔离膜的确具有有限的蛋白结合能力，以保护传感器的电极系统免于蛋白吸附，则可能触发免疫细胞的应答并可能限制或干扰其体内表现。实施例5和6显示本发明的优选的隔离膜提供了与纤维蛋白原的弱结合，并防止纤维蛋白原的构象变化，所述构象变化将导致MAC-1结合基序对单核细胞的暴露。有利地，所述隔离膜共聚物材料不会活化免疫细胞本身。在实施例6中，可以表明本发明的隔离膜共聚物能够减弱植入的传感器对免疫细胞的活化。此外，有利地，隔离膜是生物相容的材料，特别与体液，例如血液，相容。实施例7显示，本发明的隔离膜共聚物能够防止植入的传感器的溶血和补体活化。因此，本发明的隔离膜有利地不仅显示高机械稳定性，而且具有最佳的生物相容性质，这是令人惊讶的，因为当润湿时存在低吸水率。
这个实施方案的特征，特别是在电极系统的结构、分析物和酶分子方面，如本文所述。该扩散屏障优选如本文所述，但是它也可以具有不同的组成或可以不存在。根据一个优选的实施方案，扩散屏障优选包括如上所述具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物。
根据一个进一步优选的实施方案，扩散屏障包括亲水性聚氨酯。被用作扩散膜的亲水性聚氨酯可以通过(聚)二异氰酸酯、优选4-4-亚甲基-双(环己基异氰酸酯)与多元醇、优选二醇混合物的加成聚合(polyaddition)来制备。
二醇混合物的组分优选为聚亚烷基二醇，诸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)和脂肪族二醇，诸如乙二醇。优选地，所述亲水性聚氨酯包含45-55 mol-%，优选50 mol-%异氰酸酯和25-35 mol-%，优选30 mol-%乙二醇。亲水化的程度然后通过PEG与PPG的比率进行调整。优选地，所述聚氨酯包含2-3 mol-%，更优选2.5 mol-% PEG和17-18 mol-%，优选17.5mol-% PPG。为了增加聚氨酯的亲水性，可以将PEG的比例增加，例如，至4.5 - 5.5 mol-%，优选5 mol-% PEG，以获得极端亲水性的聚氨酯。也可以混合聚氨酯的不同的亲水性变体，以优化扩散屏障的特性。
该隔离膜共聚物的优选的丙烯酸和甲基丙烯酸单体如本文所述。
该亲水性单体单元优选选自亲水性(甲基)丙烯酸酯，即，在酯的醇部分中具有极性基团(即，OH、OCH3或OC2H5)的酯，具有酰胺(NH2)或N-烷基-或N,N-二烷基酰胺基团的亲水性(甲基)丙烯酰胺，其中该烷基包含1-3个C原子和任选的亲水性基团，诸如OH、OCH3或OC2H5，和合适的具有带电基团，例如阴离子或阳离子基团，的(甲基)丙烯酸单元，诸如丙烯酸(丙烯酸酯)或甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)。此外，可以使用单体单元的组合。
用于该亲水性嵌段的优选的单体单元的具体实例选自：
丙烯酸2-羟乙酯，
甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)，
丙烯酸2-甲氧基乙酯，
甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯，
丙烯酸2-乙氧基乙酯，
甲基丙烯酸2-乙氧基乙酯，
丙烯酸2-或3-羟丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)，
丙烯酸2-或3-甲氧基丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-甲氧基丙酯，
丙烯酸2-或3-乙氧基丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-乙氧基丙酯，
丙烯酸1-或2-甘油酯，
甲基丙烯酸1-或2-甘油酯，
丙烯酰胺，
甲基丙烯酰胺，
N-烷基-或N,N-二烷基丙烯酰胺，和
N-烷基-或N,N-二烷基甲基酰胺，其中烷基包含1-3个C原子，诸如甲基、乙基或丙基，
丙烯酸(丙烯酸酯)，
甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)及其组合。
优选的亲水性单体是甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)和/或甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)。
该疏水性单体单元优选选自疏水性丙烯酸和/或甲基丙烯酸单元或其组合。优选该疏水性单体单元选自疏水性(甲基)丙烯酸酯，例如具有含1-3个C原子但不含亲水性基团的醇部分的酯。用于该疏水性嵌段的单体单元的具体实例选自：
丙烯酸甲酯，
甲基丙烯酸甲酯(MMA)，
丙烯酸乙酯，
甲基丙烯酸乙酯(EMA)，
丙烯酸正或异丙酯，
甲基丙烯酸正或异丙酯，
丙烯酸正丁酯，
甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)，
丙烯酸新戊酯，
甲基丙烯酸新戊酯及其组合。
在一个优选的实施方案中，该疏水性嵌段包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)。
该外隔离膜优选覆盖了至少该工作电极的包含酶分子的部分和任选地还覆盖其它部分，例如反电极。如果存在，隔离膜还覆盖参比电极。隔离膜优选覆盖电极系统的整个植入表面。隔离膜优选覆盖工作电极，任选反电极，和参比电极(如果以连续层的形式存在)。
包含本发明的改进的隔离膜的电极系统可以是传感器的一部分，例如通过连接到稳压器和用于放大该电极系统的测量信号的放大器。该传感器优选是酶非流体(ENF)传感器，更优选电化学ENF传感器。该电极系统的电极可以设置在携带稳压器的基底上或附着到携带稳压器的电路板上。优选地，传感器用于测量葡萄糖。
本发明的进一步主题涉及丙烯酸和/或甲基丙烯酸单体的亲水性共聚物作为酶电极的隔离膜的用途，其中亲水性共聚物包含多于50 mol-%亲水性单体。亲水性共聚物优选如上所述。优选地，隔离膜用于使当其被插入或植入到体内时针对酶电极的外来体反应(FRB)最小化。
实施例1　具有用于经皮植入的分布式电极的酶非流体(ENF)葡萄糖传感器的渗 透性，所述电极具有由一种单嵌段共聚物构成的扩散层。
将该传感器构建到250μm厚的聚酯基底上的预制钯条导体结构上。将工作电极(WE)和反电极(CE)分布地设置(如图1-2所示)。
用碳糊状物叠印CE的块，对条导体的其余部分绝缘。用交联的葡萄糖氧化酶(酶)、导电聚合物糊状物和电催化剂(在这里是氧化锰(IV)(Technipur))的混合物叠印WE的块。对条导体的其余路径再次绝缘。参比电极(RE)是由Ag/AgCl糊状物构成。这些电极覆盖了约1cm的传感器杆。
该WE块涂覆有由HEMA嵌段和BUMA嵌段组成的嵌段共聚物扩散层。该层的厚度为7μm。
生产了四个传感器批次，每一个都具有特定的嵌段共聚物作为扩散层(参见下面的列表)。所有嵌段共聚物都获自Polymer Source, Montreal，并且列于下表1中。
名称 分子比/% 单体单元 分子量
共聚物 BUMA/HEMA HEMA 共聚物[kD]
C 73/27 92 47
F 60/40 108 37
D 48/52 162 44
B 62/38 169 61
将各自的嵌段共聚物溶解在有机溶剂中(25%浓度)，并且用其涂覆传感器。在借助于带式干燥机干燥后(2min，30-50℃)，将该涂覆的传感器在不同浓度的葡萄糖溶液中进行体外测试。在每个传感器批次中，作为随机样品测量10个传感器。作为用于体外灵敏度的量度，通过在10mM和0mM葡萄糖浓度的测量电流的差值计算了所述信号，其然后除以10mM(参见实施例4)。
所有传感器都在350mV的极化电压(相对于Ag/AgCl)下工作，将测量的温度保持恒定在37℃。用于该测量系列的传感器不包含WO2010/028708中所述隔离物，但是考虑到测试的信号水平，其没有任何不同。图5显示了在对于四个不同扩散层的标准偏差下的传感器灵敏度。
关于嵌段共聚物C、D和F，在体外灵敏度与疏水性嵌段/亲水性嵌段的摩尔比之间存在着清楚的关系。在约相同的共聚物总链长，该灵敏度随着亲水性嵌段(HEMA)的量的增加而增加。
具有嵌段共聚物B的扩散层的传感器是一个例外。即使聚合物B具有类似于聚合物F的疏水性与亲水性量的相对比率，灵敏度和由此对于葡萄糖的渗透性也降低了。经验上可以说在聚合物B的情况下，总链长(对应于共聚物分子的分子量(总分子量))是如此之大，以至于所述层的渗透性降低。这也可以在与其余的聚合物相比，嵌段共聚物B的重量分析测定的吸水率中看到。聚合物B具有10.6%±1.5%(重量百分比指的是聚合物干重)的吸水率。聚合物C在15.6%±0.0%，聚合物F在16.5±3.1%，聚合物D在27%±1.7%。
实施例2　ENF葡萄糖传感器的扩散层的机械柔韧性。
如WO 2010/028708所述制造传感器，但是具有本发明的扩散层。假定玻璃转化温度(Tg)是机械柔韧性的替代参数。此外，假定该玻璃转化温度，其可以分配给疏水性嵌段，决定了在体内应用中的机械柔韧性。应当注意的是一种嵌段共聚物可能鉴别出数个Tg，其对应于嵌段的数目。
用与实施例1相同的电极糊状物涂覆该传感器。然后，将一些传感器用选自 MMA-HEMA(由蒙特利尔的Polymer Source生产)的共聚物涂覆。该聚合物(称作E)的总分子量是41kD，MMA(疏水性量)与HEMA的摩尔比是60%：40%。疏水性嵌段的玻璃转化温度是111℃，其是通过DSC和10℃/min的加热速率测定的。
此外，其它传感器提供有本发明的嵌段共聚物(称作A)扩散层。所述共聚物A的疏水性嵌段包含处于无规次序的等摩尔量的MMA和BUMA。同样，疏水性部分与亲水性部分的摩尔比是60%：40%。分子量是36 kD。疏水性嵌段的Tg降低到73℃，这归因于MMA和BUMA(Tg为约45℃)的无规次序。
两种扩散层都是由各自的所述共聚物在醚中的溶液(25%)产生的，并且如实施例1那样干燥。扩散层的厚度是7μm。随后经由浸涂来施加隔离层，并在室温干燥24h。该隔离层是由日本NOF生产的Lipidure CM5206制成的。
在从组织中移出后，具有共聚物E扩散层的传感器显示出在该扩散层中的零星裂纹。这被认为是机械负荷的作用。与之相反，具有共聚物A扩散层的传感器在相同的负荷下没有表现出任何裂纹。这明显归因于Tg的降低，其提高了共聚物的机械稳定性。不再需要如WO 2010/028708公开的两种共聚物的物理混合物。
实施例3　根据本发明的具有分布式电极和扩散层的ENF葡萄糖传感器的优化的 渗透行为。
如实施例1所述制造传感器，但是在整个传感器杆上具有另外的隔离层。对于实施例1和2的共聚物A、C、D和F，制备了具有各自的扩散层的传感器。为此目的，生成了所述共聚物的24%醚溶液。将每个溶液施加到一组传感器(N=10)上，然后在带式干燥机中干燥。由此获得厚度为7μm的扩散层。
其后，向这些传感器提供实施例2所述的隔离层。
将传感器与传感器头上的测量系统相连，其将测量数据传递到数据存储。如实施例1中那样进行体外测量，但是是在7天的测量周期上进行的。从该测量数据，在各自的测量周期上计算了每个传感器的灵敏度漂移。图6显示了对于每个传感器变体，即，具有扩散层变体的传感器，所述组的体外漂移值的平均值。所述计算排除了测量的初始阶段(第一个6h，所谓的启动阶段)。
对于所有具有疏水性嵌段BUMA的共聚物C、D和F，存在着正漂移，即，灵敏度根据时间而增加。与之相反，具有MMA和BUMA的无规共聚物的疏水性嵌段的共聚物A导致了非常低的稍负的漂移。
这些差异可以通过各自扩散层的长期渗透性响应来解释，其在另外的实验中测得。用上面的聚合物溶液涂覆钯传感器(无WE糊状物，但是具有限定的活性表面，即，也没有酶层，排除了它的溶胀行为对于结果的影响)，并且在干燥后测量该层的厚度。随后，在含钠和氯化物的缓冲溶液中测量电导率。
图7显示了在短的启动阶段后，共聚物A的电导率保持接近恒定。
从图8中可见，对于共聚物F来说，甚至在相同的测量条件下，并非如此。在这种情况下，观察到共聚物F的扩散层的长期的和强的渗透性响应，其实际上与层厚度无关。对于具有BUMA疏水性嵌段的共聚物F以及共聚物C和D(未示出)来说，甚至在长期内导致渗透性增加。当测量时，如果扩散层施加到携带分布式酶层的传感器上，则这导致了灵敏度的持续增加。这解释了所观察到的正的传感器漂移。
反之亦然，具有嵌段共聚物A的传感器表现出可以忽略的漂移，这归因于在电导率测量中非常低的渗透率改变。但是紧接在开始测量之后(持续到之后约1h)，在共聚物A中观察到电导率的猛烈增加。这里，观察到非常快的启动，其在约1小时后终止。此时扩散层完全润湿，并且由于吸水而终止了它的结构重组。结构变化的程度大概取决于Tg。看起来似乎具有提高的Tg的共聚物通过了重组，与具有在环境温度范围内的Tg的共聚物相比，其在时间和幅度上有限。
另外，必须承认具有共聚物A的传感器在测量开始时表现出与具有共聚物F扩散层的传感器相比相当的高灵敏度。由于疏水性和亲水性嵌段之间相同的相对比率，这是可以预期的。所达到的灵敏度范围1-1.5nA/mM(参见实施例1)被认为是理想的。具有由共聚物A构成的扩散层的传感器同样获得了该灵敏度。
关于三种理化特性-渗透性、机械稳定性和渗透性响应的总和，理想的传感器可以优选地用嵌段共聚物的扩散层来获得，该嵌段共聚物具有携带至少两种不同的无规设置的疏水性单体单元的疏水性嵌段，如嵌段共聚物A。其它的嵌段共聚物(它们的疏水性嵌段仅仅由单个单体单元组成)都没有达到了能够在全部三种参数上可与共聚物A相比的品质。
实施例4　嵌段共聚物的表征。
生产了用于连续测量葡萄糖的多-块传感器(工作电极和反电极分别10个块)，并且在体外进行了表征。
该传感器具有由嵌段共聚物构成的扩散层，该嵌段共聚物包含无规共聚的甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)的疏水性嵌段和甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)的亲水性嵌段。这些聚合物(指定为G和H)已经由Polymer Source, Montreal生产，并且比实施例1-3的聚合物A具有更大的渗透性，其通过引用并入本文。
在下表2中，描述了这些共聚物：
聚合物 G H A
分子量Mn [kD] 23.5-b-29 21-b-20.5 21-b-15
重量%HEMA 55.2 49.4 41.6
摩尔%HEMA(化学计量) 53.5 47.4 40
摩尔%HEMA(通过1H，13C NMR测量) 51 46 32.6
Tg [℃]疏水性嵌段 65 68 86
HEMA单体单元 223 157 115
MMA单体单元 194 174 174
每个嵌段的分子量Mn分别表示在上表2中，并且代表了平均值，因为已知的是聚合物具有在特定的中值附近的分子链长分布。这也适用于表2中的导出量。
显示的疏水性嵌段的玻璃转化温度处于期望的范围内，以确保机械柔韧性。
扩散屏障对于分析物的渗透性的决定性的参数是每面积单位工作电极面积(即几何面积)的灵敏度。对于每个分析的传感器，灵敏度SE是由在磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中在10mM和在0mM的葡萄糖浓度下的电流(I)测量值来计算的，单位是nA/mM：
SE = [I(10 mM) - I(0 mM)]/10
从各个测量值(N=8)，确定了平均灵敏度SEm。将所获得的灵敏度值除以所述多-块传感器上的所有工作电极点的显微镜测量的几何总面积F。由此获得了灵敏度密度SEm/F。
体外功能曲线的线性度Y是工作电极上的聚合物覆盖层的扩散控制功能性的指示。对于每个分析的传感器，它是由在20mM、10mM和0mM葡萄糖浓度的电流测量值来计算的，单位是%：
Y20mM = 50·[I(20mM) - I(0mM)]/[I(10mM) - I(0mM)]
从这些各个测量值确定了平均线性度值和它的标准偏差(参见表3)。
最后，对于每个聚合物，通过光学测量确定了传感器的扩散屏障的层厚L。计算了具有相同的聚合物的≥23个传感器的样品的相应平均值。由此可以计算覆盖层的有效扩散系数Deff，单位cm2/s：
Deff=SEm/F·Lm·5.182∙10-8
其中SEm和Lm是灵敏度和层厚的各自平均值，F是所有工作电极点的总面积。
传感器漂移是由7天的体外测量中，重复的葡萄糖浓度阶段来计算的。表现出基本恒定的电导率的聚合物H的结果描绘在图9中。
下表3显示了功能表征的结果：
聚合物 G H
SEm/F [nA/mM*mm²)] 1.85 1.25
漂移[%d] -1.5±0.2 0.3±0.1
Y20mM[%] 88.2±0.7 88.6±0.3
层厚Lm [µm] 11.61 12.69
Deff [cm²/s] 1.11305*10-9 8.22019*10-10
对于更亲水的聚合物G(其对于葡萄糖的渗透性更大)，也用替代方法测定了该扩散系数，例如葡萄糖从具有葡萄糖溶液的室通过聚合物膜向具有无葡萄糖的缓冲液的室的渗透。根据这种方法，获得了类似的扩散系数值(1.17·10-9 cm2/s)。
实施例5　蛋白与隔离层材料的结合。
为了评估蛋白与隔离层材料的结合，将AdaptTM (Biointeractions Ltd,Reading, England)或Eudragit E100 (Evonik Industries)的乙醇溶液填入孵育板(FluoroNunc Maxisorp, Thermo Scientific)。Eudragit E100是基于甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸甲酯的阳离子共聚物。将聚合物在40℃干燥过夜。此后，用纤维蛋白原溶液覆盖隔离材料。该溶液含有与荧光染料Alexa488 (购自Invitrogen)缀合的来自人血浆的纤维蛋白原。孵育4 h之后，抽吸纤维蛋白原溶液，并用硼酸盐缓冲液洗涤隔离层八次。使用荧光读数器(Synergy4, BioTek Instruments)以485 nm的激发波长和528 nm的发射波长测量孵育板中的荧光强度而分析隔离物结合的蛋白的量。使用已知浓度的标记蛋白(6.25 – 500 ng)来制备校准曲线，以便将荧光读数转化为蛋白的量。
如预期，纤维蛋白原结合至未涂覆的孵育板(空白)，导致390 ng结合的蛋白(图10)。用Eudragit E100涂覆的板显示60 ng的降低的蛋白结合。在AdaptTM涂覆的板中几乎没有检测到任何蛋白结合。孵育前的读数是由于背景荧光导致的。这些结果清楚地表明，用隔离物材料涂覆的表面，特别是用AdaptTM涂覆的表面，针对纤维蛋白原粘附得到了很好的保护。
实施例6　与隔离层接触后细胞的细胞因子释放。
如实施例2中所述制造传感器。之后，如实施例2中所述提供具有隔离层的传感器。隔离层由Lipidure CM 5206 (NOF Corporation, Japan)制成或由AdaptTM(Biointeractions Ltd, Reading, England)制成。
将没有隔离层的传感器、具有由Lipidure CM 5206制成的隔离层的传感器、和具有由AdaptTM制成的隔离层的传感器与单核THP-1细胞孵育，并分析炎症标记物的诱导。
将THP-1细胞在37℃在传感器存在的情况下培养24 h。然后通过离心收集细胞。上清液用于测定细胞因子的释放，而将细胞沉淀再悬浮于含有1 %牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，并用于分析细胞表面蛋白CD54(也称为ICAM-1，炎性生物标记物)的表达。将THP-1细胞和与荧光染料藻红蛋白(BD Bioscience)缀合的抗CD54抗体孵育。在4℃孵育45 min之后，将细胞在PBS/ 1 % BSA中洗涤，并使用流式细胞仪(激发波长532 nm，发射波长585 nm)(BDFACSArray, BD Bioscience)测定10000个细胞的平均荧光强度(MFI)。与未处理的THP-1细胞相比，如高MFI读数所示，与没有涂层的传感器孵育导致增加的相对CD54表达(6倍诱导)(图11)。将细胞与用CM 5206或AdaptTM的隔离层覆盖的传感器孵育分别导致CD54表达衰减45％或41％。
上清液用于使用根据制造商的说明书(Flex sets, BD Bioscience)的基于珠粒的免疫测定法和随后的流式细胞术分析(BD FACSArray, BD Bioscience)测定细胞因子白介素-8(IL-8)和“单核细胞趋化蛋白-1” (MCP-1)的量。使用FCAP阵列软件v1.0.1 (Softflow Hungary Ltd.)进行数据分析。
与未处理的THP-1细胞相比，无涂层的传感器诱导了IL-8(49 vs.197 pg/ml) (图12a)和MCP-1(6 vs.48 pg/ml) (图12b)的强烈释放。当用CM 5206或AdaptTM的隔离层覆盖传感器时，降低了IL-8和MCP-1的释放。用AdaptTM覆盖的传感器诱导了100 pg/ml IL-8和25 pg/ml MCP-1的释放。用CM 5206覆盖的传感器导致了125 pg/ml IL-8和18 pg/ml MCP-1的分泌。
总之，这些数据表明，该隔离层衰减了三种众所周知的炎症生物标记物，即CD54、IL-8和MCP-1的诱导。
为了分析蛋白吸附对于活化THP-1细胞的作用，用CM 5206、AdaptTM或EudragitE100涂覆组织培养板。然后将隔离物与人纤维蛋白原(Sigma-Aldrich)孵育。将THP-1细胞与不同的隔离物+纤维蛋白原层孵育。在37℃孵育48 h之后，通过离心沉降细胞，并分析上清液的IL-8释放。作为对照，将细胞在没有隔离物、但用纤维蛋白原(Polyst.=培养板材料)涂覆的培养板中生长。如图13中显示，这些细胞释放89 pg/ml IL-8。在CM 5206 + 纤维蛋白原上或AdaptTM + 纤维蛋白原上培养的细胞分别释放68或49 pg/ml。相比之下，生长在Eudragit E100 +纤维蛋白原上的细胞释放206 pg/ml IL-8。值得注意的是，在无纤维蛋白原涂层的Eudragit E100上生长的细胞仅分泌59 pg/ml IL-8。纤维蛋白原在聚合物表面上的吸附和蛋白中的构象变化可能暴露MAC-1结合位点。经由与其MAC-1受体的结合活化的THP-1细胞释放细胞因子如IL-8，并且由此触发炎症应答。因此，由AdaptTM或CM 5206制成的隔离层避免了表面上(如传感器)的蛋白沉积和结构基序的暴露，并由此使针对植入物的炎症应答最小化。
实施例7　用隔离层涂覆的传感器的有限溶血。
如实施例2中所述制造传感器。之后，如实施例2中所述提供具有隔离层的传感器。隔离层由Lipidure CM 5206 (NOF Corporation, Japan)制成或由AdaptTM(Biointeractions Ltd, Reading, England)制成。
分析没有隔离层的传感器、具有由Lipidure CM 5206制成的隔离层的传感器、或具有由AdaptTM制成的隔离层的传感器的溶血潜力。因此，将总表面积为6 cm2的传感器与红血细胞孵育，然后通过测量血红蛋白向上清液的释放测定裂解。通过离心从人新鲜血液分离红细胞(使用柠檬酸盐以避免凝血)。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤它们，并随后在PBS中1:40稀释。在37℃在旋转平台(350 rpm)上在黑暗中将红细胞悬浮液与传感器孵育24h。之后，通过离心沉降细胞，并通过以575 nm的波长测量上清液的吸收而光谱法测定上清液的血红蛋白含量。结果表示为以%计的裂解指数，这是样品中血红蛋白的释放除以阳性对照物(=蒸馏水中红细胞的完全渗透裂解)中的血红蛋白释放。结果显示于图14中。
无隔离层的传感器显著引起溶血，如47.4％的高溶血指数所示。用Lipidure CM5206的隔离层涂覆传感器降低了传感器的溶血潜能，如14.7 %的裂解指数所表明。用AdaptTM的隔离层涂覆的传感器稍微引起溶血，导致7.5％的裂解指数，这在阴性对照物(=没有任何试验材料情况下孵育的PBS中的红细胞)或单独的AdaptTM的范围内。这些结果表明隔离层降低溶血的保护功能。

Claims (24)

1.用于测量体内条件下的分析物浓度的电极系统，其包括具有固定的酶分子的电极，任选地控制所述分析物从所述电极系统外部向酶分子扩散的扩散屏障，
其特征在于隔离膜形成所述电极系统的外层的至少一部分，其中所述隔离膜包含丙烯酸和/或甲基丙烯酸单体的亲水性共聚物，其中所述亲水性共聚物包含大于50 mol-%的亲水性单体。
2.权利要求1的电极系统，其中所述隔离膜是来自至少2种或3种丙烯酸和/或甲基丙烯酸单体的亲水性共聚物。
3.权利要求1或2的电极系统，其中所述亲水性单体选自具有极性基团例如OH、OCH3或OC2H5的亲水性(甲基)丙烯酸酯，亲水性(甲基)丙烯酰胺，(甲基)丙烯酸或其组合。
4.权利要求3的电极系统，其中所述亲水性单体选自：
丙烯酸2-羟乙酯，
甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)，
丙烯酸2-甲氧基乙酯，
甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯，
丙烯酸2-乙氧基乙酯，
甲基丙烯酸2-乙氧基乙酯，
丙烯酸2-或3-羟丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)，
丙烯酸2-或3-甲氧基丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-甲氧基丙酯，
丙烯酸2-或3-乙氧基丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-乙氧基丙酯，
丙烯酸1-或2-甘油酯，
甲基丙烯酸1-或2-甘油酯，
丙烯酰胺，
甲基丙烯酰胺，
N-烷基-或N,N-二烷基丙烯酰胺，和
N-烷基-或N,N-二烷基甲基酰胺，
其中烷基包含1-3个C原子，
丙烯酸，
甲基丙烯酸及其组合。
5.权利要求3的电极系统，其中所述亲水性单体选自甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸2-羟丙酯(2-HPMA) 及其组合。
6.权利要求1或2的电极系统，其中所述隔离膜的亲水性共聚物包含至少60 mol-%或至少70 mol-%的亲水性单体。
7.权利要求1或2的电极系统，其中所述隔离膜的共聚物进一步包含最高达40 mol-%或最高达30 mol-%的疏水性单体。
8.权利要求7的电极系统，其中所述疏水性单体选自：
丙烯酸甲酯，
甲基丙烯酸甲酯(MMA)，
丙烯酸乙酯，
甲基丙烯酸乙酯(EMA)，
丙烯酸正或异丙酯，
甲基丙烯酸正或异丙酯，
丙烯酸正丁酯，
甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)，
丙烯酸新戊酯，
甲基丙烯酸新戊酯及其组合。
9.权利要求7的电极系统，其中所述疏水性单体选自甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)及其组合。
10.权利要求7的电极系统，其中所述疏水性单体是甲基丙烯酸甲酯(MMA)或甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)，且所述亲水性单体是甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)和/或甲基丙烯酸2-羟丙酯(2 -HPMA)。
11.权利要求7的电极系统，其中所述隔离膜包含来自甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(2-HEMA)和甲基丙烯酸2-羟丙酯(2-HPMA)的共聚物，其中所述共聚物包含多于80 mol-%的2-HEMA单体。
12.权利要求1或2的电极系统，其中所述亲水性共聚物是无规共聚物或嵌段共聚物。
13.权利要求1或2的电极系统，其中所述隔离膜的厚度为小于约20μm。
14.权利要求13的电极系统，其中所述隔离膜的厚度小于5 μm。
15.权利要求14的电极系统，其中所述隔离膜的厚度为约1-3 μm。
16.权利要求1或2的电极系统，其中，基于所述共聚物的总重量，所述亲水性共聚物的相对吸水率不超过50重量％。
17.权利要求16的电极系统，其中，基于所述共聚物的总重量，所述亲水性共聚物的相对吸水率不超过40重量％。
18.权利要求17的电极系统，其中，基于所述共聚物的总重量，所述亲水性共聚物的相对吸水率不超过30重量％。
19.权利要求1或2的电极系统，其中所述扩散屏障包含亲水性聚氨酯或具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物。
20.权利要求1或2的电极系统，其包含具有电导体(2a)的反电极(2)，具有电导体(1a)的工作电极(1)，和隔离膜(9)，在所述电导体(1a)上设置固定的酶分子(5)和任选的扩散屏障(8)，所述隔离膜(9)覆盖至少工作电极(1)和任选地还有反电极(2)。
21.可插入或可植入体内的传感器，其包含权利要求1-20中任一项的电极系统。
22.权利要求21的传感器，其用于测量葡萄糖。
23.丙烯酸和/或甲基丙烯酸单体的亲水性共聚物在制备用于测量体内条件下的分析物浓度的电极系统中的用途，所述电极系统包括具有固定的酶分子的电极，其特征在于隔离膜形成了所述电极系统的外层的至少一部分，其中所述隔离膜包含丙烯酸和/或甲基丙烯酸单体的亲水性共聚物，其中所述亲水性共聚物包含多于50 mol-%亲水性单体。
24.权利要求23的用途，其用于使针对酶电极系统的外来体反应(FRB)最小化。
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