CN103443286A - 用于酶在体传感器的改进的扩散层 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于测量在体条件下的被分析物浓度的电极体系，其包括具有固定的酶分子和改进的扩散阻挡层的电极，该扩散阻挡层控制了被分析物从围绕该电极体系的体液向该酶分子的扩散。

Description

用于酶在体传感器的改进的扩散层
本发明涉及一种用于测量在体条件下的被分析物浓度的电极体系，其包括具有固定的酶分子和改进的扩散阻挡层的电极，该扩散阻挡层控制了被分析物从围绕该电极体系的体液向酶分子的扩散。
具有可植入或可插入电极体系的传感器有利于测量患者体内的生理学上有意义的被分析物，例如乳酸盐或葡萄糖。这类体系的工作电极具有导电性酶层，在其中键合有酶分子，其通过催化转化被分析物分子而释放电荷载流子。在该过程中，作为测量信号产生电流，其幅度与被分析物浓度有关。
这样的电极体系例如从WO2007/147475和WO2010/028708中是已知的，其内容通过引用并入本文。
该电极体系的工作电极具有扩散阻挡层，其控制了待测定的被分析物从围绕该电极体系的体液或组织向固定在酶层中的酶分子的扩散。根据WO2010/028708，该电极体系的扩散阻挡层是至少两种不同的聚合物的固溶体，优选丙烯酸酯的固溶体。该聚合物可以是共聚物，例如甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸羟乙酯的共聚物或甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸羟乙酯的共聚物。
WO2007/147475公开了由具有两性离子结构的聚合物制成的扩散阻挡层。这样的聚合物的一个例子是聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱共聚甲基丙烯酸正丁酯)。该两性离子聚合物可以与另外一种聚合物(例如聚氨酯)混合。
但是，使用聚合物或共聚物的混合物的缺点在于该混合物的制备和它应用于传感器是繁杂的和可能有问题的。通常，将待混合的聚合物单个溶解，然后将所形成的溶液以期望的比例混合。但是，这可能会导致所述组分之一沉淀，从而导致加工性问题，例如在喷雾方法中。当该混合物包含具有离子特性的聚合物时，即，当待混合的聚合物之一包含具有阴离子或阳离子基团的单体时，会产生更大的困难。但是，这种带电基团的存在对溶解性具有明显影响，使得难以找到同时适于带电聚合物和不带电聚合物二者的溶剂。
WO2006/058779公开了一种酶基传感器，其具有组合的包含至少一种聚合物材料和带有酶的颗粒的扩散和酶层，其中该颗粒分散在该聚合物材料中。该聚合物可以包含亲水性以及疏水性聚合物链序列，例如该聚合物可以是高或低吸水性聚醚-聚氨酯共聚物。没有公开使用具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物作为扩散层。
EP-A-2163190描述了一种用于测量在体被分析物浓度的电极体系，其包含具有电导体的对电极，和具有其上布置有包含固定的酶分子的酶层的电导体的工作电极。扩散阻挡层控制被分析物从周围体液向酶分子的扩散。该扩散阻挡层可以包含亲水化聚氨酯，其可以通过4,4'-亚甲基-双(环己基异氰酸酯)和二醇混合物(其可以是聚乙二醇和聚丙二醇)的缩聚来获得。该亲水性聚氨酯层可以覆盖有间隔物，例如甲基丙烯酸丁酯与2-甲基丙烯酰氧乙基-磷酰基胆碱的共聚物。没有公开使用具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物作为扩散层。
本发明的一个目标是在酶(enzymatic)在体传感器的电极体系上提供扩散阻挡层，其提供了令人期望的理化特性，并且其易于制造。
这个目标是通过提供由具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的单个嵌段共聚物构成的扩散阻挡层来达到的。该亲水性和疏水性嵌段是彼此共价连接的。优选该嵌段是(甲基)丙烯酸酯聚合物嵌段。
该嵌段共聚物基扩散阻挡层提供了如下的优异理化特性：
(i) 该扩散阻挡层对于待测定的被分析物的渗透性，
(ii) 该扩散阻挡层的渗透特性，其适于该电极的短期行为(润湿性)和长期行为(传感器漂移)，
(iii) 该扩散阻挡层的机械韧性。其允许制造具有扩展的多电极的在体传感器；
(iv) 离子基团向该扩散层中的有效混入，即，可以有效地调节聚合物内的阳离子或阴离子电荷的密度，这与带电被分析物的排斥或吸引和/或对细胞粘附例(例如对来自于周围体液或组织的单核细胞)的控制有关。
本发明的主题是一种用于测量在体条件下的被分析物浓度的电极体系，其包括具有固定的酶分子和扩散阻挡层的电极，该扩散阻挡层控制了被分析物从该电极体系外部向酶分子的扩散，特征在于该扩散阻挡层包含具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物。
优选该扩散阻挡层包含单个的，即，仅仅一种的具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物，即，不存在另外的聚合物或共聚物。更优选该扩散阻挡层是由具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的单个嵌段共聚物构成的。
本发明的电极体系适于插入或植入身体内，例如哺乳动物身体如人体内。该电极体系适用于测量体液和/或身体组织中的期望的被分析物，例如细胞外空间(interstitium)中、血液中或淋巴组织中或细胞间空间中的被分析物。
该插入或植入的电极体系适于短期应用，例如3-14天，或长期应用，例如6-12个月。在该插入或植入期间，可以通过连续或不连续的测量来测定期望的被分析物。
本发明的电极体系优选是酶非流体(ENF)传感器的一部分，其中测定了被分析物的酶促转化。优选该传感器包含工作电极，其具有用于转化被分析物的固定的酶分子，该转化导致产生了电信号。该酶可以存在于覆盖该电极的层中。此外，可以存在着氧化还原介体和/或电催化剂以及导电颗粒和成孔剂。这种类型的电极描述在例如WO2007/147475中，其内容通过引用并入本文。
工作电极的区域是传感器的敏感区域。该敏感区域具有扩散阻挡层，其控制了被分析物从外部例如围绕该电极体系的体液和/或组织向酶分子的扩散。该扩散阻挡层可以例如是覆盖酶层的覆盖层，即，无酶层。但是，同样可行的是将扩散控制颗粒引入到该酶层中来充当扩散阻挡层。例如酶层的孔可以用控制被分析物分子扩散的聚合物来填充。该扩散阻挡层的厚度通常是大约2-20μm，例如大约2-15μm，或大约5-20μm，特别是大约5-10μm或大约10-15μm(在干燥状态下)。
本发明的电极体系的扩散阻挡层包含嵌段共聚物，优选具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的单个嵌段共聚物。该嵌段共聚物可以包含交替序列的嵌段，即，亲水性嵌段连接到疏水性嵌段上。该亲水性和疏水性嵌段在聚合物分子内彼此共价连接。该聚合物的平均分子量(重量)通常是20-70kD，特别是25-60kD和更特别是30-50kD。该嵌段共聚物中亲水性与疏水性部分的摩尔比通常是大约75%(亲水性)：25%(疏水性)-大约25%(亲水性)：75%(疏水性)，大约65%(亲水性)：35%(疏水性)-大约35%(亲水性)：65%(疏水性)或大约60%(亲水性)：40%(疏水性)-大约40%(亲水性)：60%(疏水性)。
该嵌段共聚物的亲水性嵌段至少90%，至少95%和特别是完全由亲水性单体单元组成。它的长度通常是50-400，例如50-200，或150-300特别是100-150，或200-250个单体分子。该共聚物的疏水性嵌段至少90%，更特别是至少95%和甚至更特别是完全由疏水性单体单元组成。它的长度通常是50-300，例如50-200或150-250个，特别是80-150或170-200个单体单元。
该亲水性嵌段和/或疏水性嵌段优选是由(甲基)丙烯酸基单元组成的。更优选该亲水性嵌段和疏水性嵌段二者都是由(甲基)丙烯酸基单体单元组成的。
该亲水性嵌段的亲水性单体单元优选选自亲水性(甲基)丙烯酯(acryl ester)，即，在酯的醇部分中具有极性基团(，即，OH、OCH3或OC2H5)的酯，具有酰胺(NH2)或N-烷基-或N,N-二烷基酰胺基团的亲水性(甲基)丙烯酰胺，其中该烷基包含1-3个C原子和任选的亲水性基团，如OH、OCH3或OC2H5，和合适的具有带电基团，例如阴离子或阳离子基，的(甲基)丙烯酸单元，例如丙烯酸(丙烯酸酯)或甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)。此外，可以使用单体单元的组合。
用于该亲水性嵌段的优选的单体单元的具体例子选自：
丙烯酸2-羟乙酯，
甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)，
2-甲氧基乙基丙烯酸酯，
2-甲氧基乙基甲基丙烯酸酯，
2-乙氧基乙基丙烯酸酯，
2-乙氧基乙基甲基丙烯酸酯，
丙烯酸2-或3-羟丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)，
2-或3-甲氧基丙基丙烯酸酯，
2-或3-甲氧基丙基甲基丙烯酸酯，
2-或3-乙氧基丙基丙烯酸酯，
2-或3-乙氧基丙基甲基丙烯酸酯，
丙烯酸1-或2-甘油酯，
甲基丙烯酸1-或2-甘油酯，
丙烯酰胺，
甲基丙烯酰胺，
N-烷基-或N,N-二烷基丙烯酰胺，和
N-烷基-或N,N-二烷基甲基酰胺，其中烷基包含1-3个C原子，如甲基、乙基或丙基，
丙烯酸(丙烯酸酯)，
甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)及其组合。
优选的亲水性单体是甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)和/或甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)。更优选该亲水性嵌段由至少两种不同的亲水性单体单元组成。例如它可以是至少两种不同的亲水性单体单元(如HEMA和2-HPMA)的无规共聚物。
为了将离子基团引入单体中，可以把带电单体单元，如丙烯酸(丙烯酸酯)和/或甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)，混入该亲水性嵌段中。因此在本发明的一种具体实施方案中，该亲水性嵌段可以由至少一种非离子亲水性单体单元(例如，如上所述的)和至少一种离子亲水性单体单元制成，其中该离子单体单元以优选1-20mol%的摩尔量存在。在亲水性嵌段包含离子单体单元，如丙烯酸或甲基丙烯酸，的情况下，与选自(甲基)丙烯酰胺，特别是N,N-二烷基丙烯或甲基丙烯酰胺的亲水性单体的共聚是优选的。
该疏水性嵌段的疏水性单体单元优选选自疏水性丙烯酸和/或甲基丙烯酸单元、苯乙烯基单体单元或其组合。优选该疏水性单体单元选自疏水性(甲基)丙烯酯，例如具有含1-3个C原子但不含亲水性基团的醇部分的酯。用于该疏水性嵌段的单体单元的具体例子选自：
丙烯酸甲酯，
甲基丙烯酸甲酯(MMA)，
丙烯酸乙酯，
甲基丙烯酸乙酯(EMA)，
丙烯酸正或异丙酯，
甲基丙烯酸正或异丙酯，
丙烯酸正丁酯，
甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)，
丙烯酸新戊酯，
甲基丙烯酸新戊酯及其组合。
该疏水性嵌段优选包含至少两种不同的疏水性单体单元，其例如作为无规共聚物而存在。在一种优选的实施方案中，该疏水性嵌段包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)。在一种特别优选的实施方案中，该疏水性嵌段是MMA和BUMA的无规共聚物。MMA和BUMA之间的摩尔比优选是大约60%(MMA)：40%(BUMA)-大约40%(MMA)：60%(BUMA)，例如大约50%(MMA)：50%(BUMA)。该疏水性嵌段的玻璃化转变温度优选是100℃或更低，90℃或更低或80℃或更低，例如大约40-80℃。在一种可替代的实施方案中，该疏水性嵌段可以由苯乙烯单元组成，例如由玻璃化转变温度为大约95℃的聚苯乙烯组成。
本发明所用的嵌段共聚物可以根据已知的方法制造(Böker等人，Macromolecules 34(2001)，7477-7488)。
该嵌段共聚物可以通过常规技术施加到电极体系上，例如通过提供该嵌段共聚物在合适的溶剂或溶剂混合物(例如有机溶剂，如醚)中的溶液，将该溶液施加到预制的电极体系和在其上干燥。
当该嵌段共聚物与水接触时，它在37℃的温度和pH 7.4(含水磷酸盐缓冲液10mM KH2PO4，10mM NaH2PO4和147mM NaCI)下表现出优选大约15%-30重量%(基于聚合物干重)的吸水率。
除了该嵌段共聚物之外，该扩散阻挡层还可以包含另外的组分，特别是非聚合物组分，其可以分散和/或溶解在该聚合物中。这些另外的化合物包括增塑剂，特别是生物可相容的增塑剂，如偏苯三酸三(2-乙基己基)酯和/或甘油。
本发明的扩散阻挡层具有对葡萄糖的高有效扩散系数Deff，其优选在37℃的温度和pH 7.4下≥10-10cm2/s，更优选≥5·10-10cm2/s，和甚至更优选≥10-9 cm2/s，例如高到10-7或10-8 cm2/s。有效扩散系数优选是如实施例4所述根据下面的等式来测定的：
Deff=SEm/F·Lm·5182·10-8
其中SEm是工作电极的灵敏度，F是工作电极的面积，和Lm是扩散阻挡层的层厚。SEm和Lm可以如实施例所述来测定。
本发明的电极体系适于在在体条件下(即，当插入或植入体内时)测量被分析物的浓度。该被分析物可以是存在于组织或体液中的任何分子或离子，例如氧、二氧化碳、盐(阳离子和/或阴离子)、脂肪或脂肪组分、碳水化合物或碳水化合物组分、蛋白质或蛋白质组分、或其他类型的生物分子。特别优选的是测定能够在体液，例如血液，和组织之间转移的被分析物，如氧、二氧化碳、钠阳离子、氯阴离子、葡萄糖、尿素、甘油、乳酸盐和丙酮酸盐。
该电极体系包含固定在电极上的酶。该酶适于测定期望的被分析物。优选该酶能够催化转化被分析物和由此产生可以被工作电极的电导体检测的电信号。用于测量被分析物的酶优选是氧化酶，例如葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶或脱氢酶，例如葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。除了酶之外，该酶层还可以包含电催化剂或氧化还原介体，其有利于电子向工作电极导电组分(例如石墨颗粒)的转移。合适的电催化剂是金属氧化物(如二氧化锰)或有机金属化合物(如酞菁钴)。在一种优选的实施方案中，该氧化还原介体能够降解过氧化氢，由此抵销工作电极周围的氧消耗。在一种不同的实施方案中，氧化还原介体可以共价结合到酶上，和由此实现向工作电极 的直接电子转移。用于直接电子转移的合适的氧化还原介体是辅基(prosthetic group)，如吡咯并喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或其他已知的辅基。固定在电极上的酶例如描述在WO2007/147475中，其内容通过引用并入本文。
该电极体系的一种优选实施方案包括具有电导体的对电极和具有电导体的工作电极，其中在该工作电极 的电导体上设置有酶层和扩散阻挡层。该酶层优选设计为多个块(field)的形式，其彼此相隔一定距离，例如至少0.3mm或至少0.5mm，设置在工作电极的导体上。该工作电极的这些单个块可以形成一系列的单个工作电极。在这些块之间，该工作电极的导体可以被绝缘层覆盖。通过将酶层的块设置在电绝缘层的开口之上，能够改进信噪比。这样的设置公开在WO2010/028708中，其内容通过引用并入本文。
本发明的电极体系可以另外包含能够为该工作电极供给参考电势的参比电极，例如Ag/Ag-CI参比电极。此外，本发明的电极体系可以具有另外的对电极和/或工作电极。
该电极体系可以是传感器的一部分，例如通过连接到稳压器和用于放大该电极体系的测量信号的放大器。该传感器优选是酶非流体(ENF)传感器，更优选电化学ENF传感器。该电极体系的电极可以设置在带有稳压器的基底上或附着到带有稳压器的电路板上。
本发明的另一主题涉及具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物作为酶电极的扩散阻挡层的用途。该嵌段共聚物优选如上所述，例如是单个嵌段共聚物。该扩散阻挡层和酶电极也优选如上所述。
本发明的另外的细节和优点基于示例性实施方案并参考附图来解释。
图1显示了本发明的电极体系的一种示例性实施方案。
图2显示了图1的局部放大视图。
图3显示了图1的另一局部放大视图。
图4显示了沿图2的截面线CC的截面。
图5显示了具有不同的嵌段聚合物(C、F、D、B)作为阻挡层的四种葡萄糖传感器(在10mM葡萄糖中)的灵敏度(具有标准偏差)。
图6显示了具有不同的嵌段聚合物(A、C、D、F)作为阻挡层的四种葡萄糖传感器的传感器漂移。
图7显示了嵌段共聚物A与时间相关的电导率(2个实验)。
图8显示了嵌段共聚物F与时间相关的电导率(3个实验)。
图9显示了分别对于2.77μm或4.43μm的层厚来说，嵌段共聚物H与时间相关的电导率。
图1显示了电极体系的一种示例性实施方案，其用于插入人或动物的身体组织中，例如插入真皮或皮下脂肪组织中。图2中显示了放大的细节图A，图3中显示了放大的细节图B。图4显示了沿着图2中的截面线CC的相应的截面图。
所示电极体系具有工作电极1、对电极2和参比电极3。电极的电导体1a、2a、3a以金属导体路径，优选由钯或金制成的路径，的形式设置在基底4上。在所示的示例性实施方案中，基底4是柔性塑料板，例如由聚酯制成。基底4厚度小于0.5mm，例如为100-300微米，并因此易于弯曲，使得在其插入后其可适应于周围身体组织的移动。基底4具有用于插入患者身体组织内的窄杆和用于连接到设置在体外的电子系统上的宽头。基底4的杆优选为至少1cm长，特别是2cm-5cm。
在所示的示例性实施方案中，测量设施的一部分，即，基底的头部，在使用过程中从患者的身体中伸出来。或者，同样可行的是，将整个测试设施植入并以无线方式将测量数据传输到设置在体外的接收器。
工作电极1带有酶层5，其包含用于催化转化被分析物的固定的酶分子。酶层5可以例如以碳颗粒、聚合物粘合剂、氧化还原介体或电催化剂、与酶分子的固化糊的形式来施加施加。生产这种类型的酶层5的细节公开在例如WO2007/147475中，其在本文上下文中作为参考。
在所示的示例性实施方案中，酶层5不是连续施加到工作电极1的导体1a上的，而是以彼此间隔设置的单个块的形式来施加的。在所示的示例性实施方案中酶层5的单个块是呈一系列排列的。
工作电极1的导体1a在酶层块之间具有狭窄的地方，其在图2中尤其清楚可见。对电极2的导体2a具有遵循工作电极1的导体1a的路线(course)的轮廓。这意味着产生了具有有利地短电流路径和低电流密度的工作电极1和对电极2的嵌入或交叉设置。
为了增加其有效表面，对电极2可以具有多孔导电层6，其以单个块的形式位于对电极2的导体2a上。类似于工作电极1的酶层5，该层6可以以碳颗粒和聚合物粘合剂的固化糊的形式来施加。层6的块优选具有与酶层5的块相同的尺寸，但这不是必须的。不过，增加对电极表面的措施也可是预知的，并且对电极2也可设计为不具有任何类型涂层、或具有由所述嵌段共聚物制成的涂层和任选的间隔物的线性导体路径。
参比电极3设置在工作电极1的导体1a和对电极2的导体2a之间。图3所示的参比电极由导体3a构成，导体3a上设置有导电的银/氯化银糊的块3b。
图4显示了沿图2中的截面线CC的示意性截面图。截面线CC穿过工作电极1的酶层块5之一以及对电极2的导电层6的块之间。在酶层5的块之间，工作电极1的导体1a可以覆盖有电绝缘层7，象导电层6的块之间的对电极2的导体2a一样，以防止否则可能会通过导体路径1a、2a的金属催化的干扰反应。酶层5的块因此位于绝缘层7的开口中。同样，对电极2的导电层6的块也可以置于绝缘层7的开口之上。
酶层5被覆盖层8覆盖，其为待测量的被分析物提供了扩散阻力，因此充当了扩散阻挡层。该扩散阻挡层8由上述具有交替的亲水性和疏水性嵌段的单个共聚物构成。
覆盖层8的有利厚度例如是3-30μm，特别是大约5-10μm或大约10-15μm。因为它的扩散阻力，覆盖层8导致单位时间内更少的被分析物分子到达酶层5。因此覆盖层8降低了被分析物分子的转化速率，和由此抵销了工作电极周围的被分析物浓度的贫化。
覆盖层8在工作电极1的导体1a的整个面积上基本连续地延伸。在覆盖层8上，生物相容性膜可以作为间隔物9设置，其在酶层5与周围身体组织的细胞之间建立了最小距离。此手段有利地产生了用于被分析物分子的存储器，在酶层块5周围的液体交换(fluid exchange)发生短暂扰动的情况下，分析物分子可以从该存储器到达相应的酶层块5。如果电极体系周围的体液交换被暂时限制或甚至被阻止，存储在间隔物9中的被分析物分子继续扩散到工作电极1的酶层5，在这里它们被转化。间隔物9因此使得仅在显著更长的时间之后才发生被分析物浓度的明显贫化和相应的测量结果失真。在所示的示例性实施方案中，形成间隔物9的膜也覆盖了对电极2和参比电极3。
间隔物膜9可以例如是透析膜。在本文上下文中，透析膜应理解为是大于最大尺寸的分子不能透过的膜。该透析膜可以在单独的制造方法中预制，然后可以在该电极体系制作过程中施加。选择该透析膜能够透过的分子的最大尺寸，以使得被分析物分子能够通过，而更大的分子被截留。
或者，代替透析膜，由对被分析物和水具有高渗透性的聚合物制成的涂层，例如基于聚氨酯或丙烯酸酯的涂层，可以作为间隔物膜9来施加在该电极体系上。
优选该间隔物是由(甲基)丙烯酸酯的共聚物制成的。优选该间隔物膜是至少2或3种(甲基)丙烯酸酯的共聚物。更优选该间隔物膜包含大于50mol%，至少60mol%或至少70mol%的亲水性单体单元，例如HEMA和/或2-HPMA，和最多40mol%或最多30mol%的疏水性单元，例如BUMA和/或MMA。该间隔物可以是无规或嵌段共聚物。特别优选的间隔物膜包含MMA或BUMA作为疏水性部分和2-HEMA和/或2-HPMA作为亲水性部分。该间隔物膜对被分析物是高渗透性的，即，它确实明显降低了单位面积工作电极的灵敏度，例如20%或更低，或5%或更低，并且层厚度小于大约20μm，优选小于大约5μm。特别优选的间隔物膜厚度是大约1-大约3μm。
该电极体系的酶层5可以包含金属氧化物颗粒，优选二氧化锰颗粒，作为催化氧化还原介体。二氧化锰催化转化过氧化氢，其是例如通过葡萄糖和其他生物被分析物的酶促氧化形成的。在过氧化氢降解过程中，二氧化锰颗粒将电子转移到工作电极1的导电组分例如酶层5中的石墨颗粒。过氧化氢的催化降解抵销了酶层5中氧浓度的任何降低。有利地，这使得酶层5中待测量的被分析物的转化能够不受局部氧浓度的限制。催化氧化还原介体的使用因此抵销了由于氧浓度低而导致的测量结果失真。催化氧化还原介体的另一优点是它防止了产生细胞破坏浓度的过氧化氢。
此处所述优选的间隔物膜聚合物可以用作本发明的扩散阻挡层的外涂层，但是也可以用作一般的电极体系的外涂层，特别是用于测量在体条件下被分析物浓度的电极体系的外涂层，该体系包括具有固定的酶分子和扩散阻挡层的电极，该阻挡层控制了被分析物从所述电极体系外部向所述酶分子的扩散。
因此，本发明另一目标是提供一种用于测量在体条件下的被分析物浓度的电极体系，其包括具有固定的酶分子和优选地扩散阻挡层的电极，该扩散阻挡层控制了被分析物从该电极体系外部向该酶分子的扩散，特征在于间隔物膜形成了该电极体系的外层的至少一部分，其中该间隔物膜包含丙烯酸和/或甲基丙烯酸单体的亲水性共聚物，其中该聚合物包含大于50mol%的亲水性单体。
这种实施方案的特征，特别是在电极体系的结构、被分析物和酶分子方面，如本文所述。该扩散阻挡层优选如本文所述，但是它也可以具有不同的组成或可以不存在。该间隔物膜共聚物的优选的丙烯酸和甲基丙烯酸单体如本文所述。该外间隔物膜优选覆盖了至少该工作电极的包含酶分子的部分和任选地还覆盖其他部分，例如对电极。
实施例 1 　 酶非流体 (ENF) 葡萄糖传感器的渗透性，具有用于经皮植入的分布式电极，该电极具有由一种单嵌段共聚物构成的扩散层。
将该传感器构建到位于250μm厚的聚酯基底上的预制钯条导体结构上。将工作电极(WE)和对电极(CE)分布地设置(如图1-2所示)。
用碳糊叠印CE的块，对条导体的其余部分绝缘。用交联的葡萄糖氧化酶(酶)、导电聚合物糊和电催化剂(在这里是氧化锰(IV)(Technipur))的混合物叠印WE的块。对条导体的其余路径再次绝缘。参比电极(RE)是由Ag/AgCI糊构成。这些电极覆盖了大约1cm的传感器杆。
该WE块涂覆有由HEMA嵌段和BUMA嵌段组成的嵌段共聚物扩散层。该层的厚度为7μm。
生产了四个传感器批次，每一个都具有特定的嵌段共聚物作为扩散层(参见下面的列表)。所有嵌段共聚物都获自蒙特利尔的Polymer Source，并且列于下表1中。
名称 分子比/% 单体单元 分子量
共聚物 BUMA/HEMA HEMA 共聚物[kD]
C 73/27 92 47
F 60/40 108 37
D 48/52 162 44
B 62/38 169 61
将各自的嵌段共聚物溶解在有机溶剂中(25%浓度)，并且用其涂覆传感器。在借助于带式干燥机干燥后(2min，30-50℃)，将该涂覆的传感器在不同浓度的葡萄糖溶液中进行体外测试。在每个传感器批次中，作为随机样品测量10个传感器。作为用于体外灵敏度的量度，通过在10mM和0mM葡萄糖浓度的测量电流的差值计算了所述信号，其然后除以10mM(参见实施例4)。
所有传感器都在350mV的极化电压(相对于Ag/AgCI)下工作，将测量的温度保持恒定在37℃。用于该测量系列的传感器不包含WO2010/028708中所述间隔物，但是考虑到测试的信号水平，其没有任何影响。图5显示了在对于四个不同扩散层的标准偏差下的传感器灵敏度。
对于嵌段共聚物C、D和F，在体外灵敏度与疏水性嵌段/亲水性嵌段的摩尔比之间存在着明显的关系。在大约相同的共聚物总链长gh，该灵敏度随着亲水性嵌段(HEMA)的量的增加而增加。
具有嵌段共聚物B的扩散层的传感器是一个例外。尽管聚合物B具有类似于聚合物F的疏水性与亲水性量的相对比率，灵敏度和由此对于葡萄糖的渗透性却降低了。经验上可以说在聚合物B的情况下，总链长(对应于共聚物分子的分子量(总))是如此之大，以至于所述层的渗透性降低。这也可以在与其余的聚合物相比，嵌段共聚物B的重量分析测定的水吸收中看到。聚合物B具有10.6%±1.5%(重量百分比指的是聚合物干重)的水吸收。聚合物C在15.6%±0.0%，聚合物F在16.5±3.1%，聚合物D在27%±1.7%。
实施例 2 　 ENF 葡萄糖传感器的扩散层的机械韧性
如WO2010/028708所述制造传感器，但是具有本发明的扩散层。假定玻璃化转变温度(Tg)是机械韧性的一个替代参数。此外，假定该玻璃化转变温度，其可以分配给疏水性嵌段，决定了在在体应用中的机械韧性。应当注意的是一种嵌段共聚物可能鉴别出数个Tg，其对应于嵌段的数目。
用与实施例1相同的电极糊涂覆该传感器。然后，将一些传感器用选自 MMA-HEMA(由蒙特利尔的Polymer Source生产)的共聚物涂覆。该聚合物(称作E)的总分子量是41kD，MMA(疏水性量)与HEMA的摩尔比是60%：40%。疏水性嵌段的玻璃化转变温度是111℃，其是通过DSC和10℃/min的加热速率测定的。
此外，其他传感器具有本发明的嵌段共聚物(称作A)扩散层。所述共聚物A的疏水性嵌段包含处于无规次序的等摩尔量的MMA和BUMA。同样，疏水性部分与亲水性部分的摩尔比是60%：40%。分子量是36 kD。疏水性嵌段的Tg降低到73℃，这归因于MMA和BUMA(Tg为大约45℃)的无规次序。
两种扩散层都是由各自的所述共聚物在醚中的溶液(25%)产生的，并且如实施例1那样干燥。扩散层的厚度是7μm。随后经由浸涂来施加间隔物层，并在室温干燥24h。该间隔物层是由日本NOF生产的Lipidure CM5206制成的。
在从组织中移出后，具有共聚物E扩散层的传感器显示出在该扩散层中的零星裂纹。这被认为是机械负荷的作用。与之相反，具有共聚物A扩散层的传感器在相同的负荷下没有表现出任何裂纹。这明显归因于Tg的降低，其提高了共聚物的机械稳定性。不再需要如WO2010/028708公开的两种共聚物的物理混合物。
实施例 3　根据本发明的具有分布式电极和扩散层的 ENF 葡萄糖传感器的优化的渗透行为。
如实施例1所述制造传感器，但是在整个传感器杆上具有另外的间隔物层。对于实施例1和2的共聚物A、C、D和F，制备了具有各自的扩散层的传感器。为此目的，生成了所述共聚物的24%醚溶液。将每个溶液施加到一组传感器(N=10)上，然后在带式干燥机中干燥。由此获得厚度为7μm的扩散层。
其后，向这些传感器提供实施例2所述的间隔物层。
将传感器与传感器头上的测量系统相连，其将测量数据传递到数据存储。如实施例1中那样进行体外测量，但是是在7天的测量周期上进行的。从该测量数据，在各自的测量周期上计算了每个传感器的灵敏度漂移。图6显示了对于每个传感器变体，即，具有扩散层变体的传感器，所述组的体外漂移值的平均值。所述计算排除了测量的初始阶段(第一个6h，所谓的启动阶段)。
对于所有具有疏水性嵌段BUMA的共聚物C、D和F，存在着正漂移，即，灵敏度根据时间而增加。与之相反，具有MMA和BUMA的无规共聚物的疏水性嵌段的共聚物A导致了非常低的稍负的漂移。
这些差异可以通过各自扩散层的长期渗透性响应来解释，其在另外的实验中测得。用上面的聚合物溶液涂覆钯传感器(无WE糊，但是具有限定的活性表面，即，也没有酶层，排除了它的溶胀行为对于结果的影响)，并且在干燥后测量该层的厚度。随后，在含钠和氯化物的缓冲溶液中测量电导率。
图7显示了在短的启动阶段后，共聚物A的电导率保持接近恒定。
从图8中可见，对于共聚物F来说，甚至在相同的测量条件下，并非如此。在这种情况下，观察到共聚物F的扩散层的长期的和强的渗透性响应，其实际上与层厚度无关。对于具有BUMA疏水性嵌段的共聚物F以及共聚物C和D(未示出)来说，甚至在长期内导致渗透性增加。当测量时，如果扩散层施加到带有分散式酶层的传感器上，则这导致了灵敏度的持续增加。这解释了所观察到的正的传感器漂移。
反之亦然，具有嵌段共聚物A的传感器表现出可以忽略的漂移，这归因于在电导率测量中非常低的渗透率改变。但是紧接在开始测量之后(持续到之后大约1h)，在共聚物A中观察到电导率的猛烈增加。这里，观察到非常快的启动，其在大约1小时后终止。此时扩散层完全润湿，并且由于吸水而终止了它的结构重组。结构变化的程度大概取决于Tg。看起来似乎具有提高的Tg的共聚物通过了重组，与具有在环境温度范围内的Tg的共聚物相比，其在时间和幅度上有限。
另外，必须承认具有共聚物A的传感器在测量开始时表现出与具有共聚物F扩散层的传感器可比的高灵敏度。由于疏水性和亲水性嵌段之间相同的相对比率，这是可以预期的。所达到的灵敏度范围1-1.5nA/mM(参见实施例1)被认为是理想的。具有由共聚物A构成的扩散层的传感器同样获得了该灵敏度。
关于三种理化特性-渗透性、机械稳定性和渗透性响应的总和，理想的传感器可以优选地用嵌段共聚物的扩散层来获得，该嵌段共聚物具有带有至少两种不同的无规设置的疏水性单体单元的疏水性嵌段，如嵌段共聚物A。其他的嵌段共聚物(它们的疏水性嵌段仅仅由单个单体单元组成)都没有达到了能够在全部三种参数上可与共聚物A相比的品质。
实施例 4 　 嵌段共聚物的表征
生产了用于连续测量葡萄糖的多-块传感器(工作电极和对电极分别10个块)，并且在体外进行了表征。
该传感器具有由嵌段共聚物构成的扩散层，该嵌段共聚物包含无规共聚的甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)的疏水性嵌段和甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)的亲水性嵌段。这些聚合物(指定为G和H)已经由蒙特利尔的Polymer Source生产，并且比实施例1-3的聚合物A具有更大的渗透性，其通过引用并入本文。
在下表2中，描述了这些共聚物：
聚合物 G H A
分子量Mn [kD] 23.5-b-29 21-b-20.5 21-b-15
重量%HEMA 55.2 49.4 41.6
摩尔%HEMA(化学计量) 53.5 47.4 40
摩尔%HEMA(通过1H，13C NMR测量) 51 46 32.6
Tg [℃]疏水嵌段 65 68 86
HEMA单体单元 223 157 115
MMA单体单元 194 174 174
每个嵌段的分子量Mn分别表示在上表2中，并且代表了平均值，因为已知的是聚合物具有在特定的中值附近的分子链长分布。这也适用于表2中的导出量。
显示的疏水嵌段的玻璃化转变温度处于期望的范围内，以确保机械韧性。
扩散阻挡层对于被分析物的渗透性的决定性的参数是单位工作电极面积(即几何面积)的灵敏度。对于每个分析的传感器，灵敏度SE是由在磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中在10mM和在0mM的葡萄糖浓度下的电流(I)测量值来计算的，单位是nA/mM：
SE = [I(10mM)-I(0mM)]/10
从单个测量值(N=8)，确定了平均灵敏度SEm。将所获得的灵敏度值除以所述多-块传感器上的所有工作电极点的显微镜测量的几何总面积F。由此获得了灵敏度密度SEm/F。
体外功能曲线的线性度Y是工作电极上的聚合物覆盖层的扩散控制功能性的指示。对于每个分析的传感器，它是由在20mM、10mM和0mM葡萄糖浓度的电流测量值来计算的，单位是%：
Y20mM =50·[I(20mM)-I(0mM)]/[I(10mM)-I(0mM)]
从这些单个的测量值确定了平均线性度值和它的标准偏差(参见表3)。
最后，对于每个聚合物，通过光学测量确定了传感器的扩散阻挡层的层厚L。计算了具有相同的聚合物的≥23个传感器的样品的相应平均值。由此可以计算覆盖层的有效扩散系数Deff，单位cm2/s：
Deff=SEm/F·Lm·5.182∙10-8
其中SEm和Lm是灵敏度和层厚的各自平均值，F是所有工作电极点的总面积。
传感器漂移是由7天的体外测量中，重复的葡萄糖浓度阶段来计算的。表现出基本恒定的电导率的聚合物H的结果描绘在图9中。
下表3显示了功能表征的结果：
聚合物 G H
SEm/F [nA/mM*mm²)] 1.85 1.25
漂移[%d] -1.5±0.2 0.3±0.1
Y20mM[%] 88.2±0.7 88.6±0.3
层厚Lm [µm] 11.61 12.69
Deff [cm²/s] 1.11305*10-9 8.22019*10-10
对于更亲水的聚合物G(其对于葡萄糖的渗透性更大)，也用替代方法测定了该扩散系数，例如葡萄糖从具有葡萄糖溶液的室通过聚合物膜向具有无葡萄糖的缓冲液的室的渗透。根据这种方法，获得了类似的扩散系数值(1.17·10-9 cm2/s)。

Claims (20)

1.一种用于测量在体条件下的被分析物浓度的电极体系，其包括具有固定的酶分子和扩散阻挡层的电极，所述扩散阻挡层控制了被分析物从所述电极体系外部向酶分子的扩散，特征在于所述扩散阻挡层包含具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物。
2.权利要求1的电极体系，其中
(i) 所述嵌段共聚物的亲水性嵌段的长度为50-200或150-300个单体单元，特别是100-150或200-250个单体单元，和/或
(ii) 所述嵌段共聚物的疏水性嵌段的长度为50-200或150-250个单体单元，特别是80-150或170-200个单体单元。
3.权利要求1或2的所述电极体系，其中亲水性嵌段是由选自下面的亲水性单体单元制成的：具有极性基团(例如OH、OCH3或OC2H2)的亲水性(甲基)丙烯酯，亲水性(甲基)丙烯酰胺，(甲基)丙烯酸或其组合。
4.权利要求3的电极体系，其中用于亲水性嵌段的单体单元选自：
丙烯酸2-羟乙酯，
甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)，
2-甲氧基乙基丙烯酸酯，
2-甲氧基乙基甲基丙烯酸酯，
2-乙氧基乙基丙烯酸酯，
2-乙氧基乙基甲基丙烯酸酯，
丙烯酸2-或3-羟丙酯，
甲基丙烯酸2-或3-羟丙酯(2-或3-HPMA)，
2-或3-甲氧基丙基丙烯酸酯，
2-或3-甲氧基丙基甲基丙烯酸酯，
2-或3-乙氧基丙基丙烯酸酯，
2-或3-乙氧基丙基甲基丙烯酸酯，
丙烯酸1-或2-甘油酯，
甲基丙烯酸1-或2-甘油酯，
丙烯酰胺，
甲基丙烯酰胺，
N-烷基-或Ν,Ν-二烷基丙烯酰胺，和
N-烷基-或Ν,Ν-二烷基甲基酰胺，其中烷基包含1-3个C原子，
丙烯酸(丙烯酸酯)，
甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯)及其组合。
5.权利要求1-4任一项的电极体系，其中所述亲水性嵌段包含至少两种不同的亲水性单体单元，特别是至少一种非离子亲水性单体单元和至少一种离子亲水性单体单元，其中所述离子单体单元以优选1-20mol%的摩尔量存在。
6.权利要求1-5任一项的电极体系，其中疏水性嵌段是由选自疏水性(甲基)丙烯酯、苯乙烯基单体或其组合的单体单元制成的。
7.权利要求6的电极体系，其中所述用于疏水性嵌段的单体单元选自：
丙烯酸甲酯，
甲基丙烯酸甲酯(MMA)，
丙烯酸乙酯，
甲基丙烯酸乙酯(EMA)，
丙烯酸正或异丙酯，
甲基丙烯酸正或异丙酯，
丙烯酸正丁酯，
甲基丙烯酸正丁酯(BUMA)，
丙烯酸新戊酯，
甲基丙烯酸新戊酯及其组合。
8.权利要求1-7任一项的电极体系，其中所述疏水性嵌段包含至少两种不同的疏水性单体单元。
9.权利要求8的电极体系，其中所述疏水性嵌段的玻璃化转变温度为大约40-80℃。
10.权利要求1-8任一项的电极体系，其中亲水性嵌段：疏水性嵌段的摩尔比为75%(亲水性)：25%(疏水性)-25%(亲水性)：75%(疏水性)，特别是65%(亲水性)：35%(疏水性)-35%(亲水性)：65%(疏水性)，和更特别是60%(亲水性)：40%(疏水性)-40%(亲水性)：60%(疏水性)。
11.权利要求1-10任一项的电极体系，其包括
具有电导体(2a)的对电极(2)，
具有电导体(1a)的工作电极(1)，在所述工作电极(1)的电导体(1a)上设置有固定的酶分子(5)和扩散阻挡层(8)。
12.权利要求1-11任一项的电极体系，其中所述固定的酶分子(5)是以多个块的形式存在的，这些块彼此相隔地设置在工作电极(1)的导体(1a)上。
13.权利要求1-11任一项的电极体系，其中所述扩散阻挡层(8)构成覆盖酶层(5)的层，其厚度优选为2-20μm，更优选5-20μm和甚至更优选10-15μm。
14.权利要求1-13任一项的电极体系，其中所述酶层(5)和扩散层(8)被间隔物(9)覆盖，其中所述间隔物优选是来自(甲基)丙烯酸酯的共聚物，其包含大于50mol%的亲水性单体单元。
15.权利要求1-14任一项的电极体系，其中所述扩散阻挡层包含仅仅一种嵌段共聚物。
16.权利要求1-15任一项的电极体系，其中所述扩散阻挡层进一步包含增塑剂。
17.权利要求1-16任一项的电极体系，其中所述扩散阻挡层对葡萄糖的有效扩散系数 Deff≥10-10cm2/s，更优选≥5·10-10cm2/s，和甚至更优选≥10-9cm2/s。
18.一种可插入或可植入体内的传感器，其包含权利要求1-17任一项的电极体系。
19.权利要求18的传感器，其用于测量葡萄糖。
20.具有至少一种亲水性嵌段和至少一种疏水性嵌段的嵌段共聚物的用途，其用作酶电极的扩散阻挡层。
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