ES2634944T3 - Polipéptido de fusión frente a un tumor inducido por el virus de EB y un mutante de la colicina Ia - Google Patents

Polipéptido de fusión frente a un tumor inducido por el virus de EB y un mutante de la colicina Ia Download PDF

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Abstract

Un polipéptido para su uso en un método para el tratamiento de un tumor provocado por el virus de EB, en el que el polipéptido está formado por la unión operativa de un polipéptido mutante de la colicina que puede formar canales iónicos con un polipéptido de un anticuerpo anti virus de EB o un polipéptido de un mimético de anticuerpo anti virus de EB, en el que el polipéptido mutante de la colicina que puede formar canales iónicos se obtiene mediante la mutación de los restos de aminoácido G11A, H22G, A26G, V31L y H40D, en la cadena peptídica de la colicina Ia de tipo silvestre, la secuencia de aminoácidos del polipéptido del anticuerpo anti virus de EB es la misma que la del polipéptido del anticuerpo monoclonal que secreta el hibridoma HB-168 de la ATCC y en el que el polipéptido del mimético de anticuerpo es un péptido conectado de la región CDR1 de la cadena pesada, que une el segmento peptídico de las CDR1-CDR2 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo anti virus de EB que secreta el hibridoma HB-168 de la ATCC.

Description

DESCRIPCION
Polipeptido de fusion frente a un tumor inducido por el virus de EB y un mutante de la colicina la 5 Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de los agentes antitumorales y, de forma mas concreta, a un polipeptido nuevo frente a un tumor provocado por el virus de EB, y al uso y un metodo de preparacion del mismo.
10 Tecnica relacionada
En el area de la investigacion sobre antibioticos, se han dirigido los estudios hacia el desarrollo de nuevos antibioticos que estimulan las mecanismos de interdestruccion entre cepas heterologas homogeneas. Existen muchas toxinas bacterianas en la naturaleza, las cuales destruyen celulas mediante la formacion de canales ionicos 15 directamente en la membrana de las bacterias. El modelo ejemplar de tales toxinas es la colicina, una toxina bacteriana que secreta E. coli. En 1952 Jacob descubrio la colicina la, desde entonces, a traves del duro trabajo de generaciones, Qiu et al. (Major transmembrane movement associated with colicin la channel gating. J. Gen. Physiology, 107:313-328 (1996)) revelo finalmente la estructura espacial transmembrana de la colicina la cuando los canales ionicos formados en membranas de bicapa lipfdica artificiales estan cerrados o abiertos, lo que proporciona 20 una base fundamental para el diseno y la preparacion de antibioticos nuevos a nivel molecular. Con posterioridad, hay moleculas polipeptfdicas fabricadas mediante la conexion del polipeptido de la colicina con un peptido senal, tal como las feromonas de Streptococcus albus o Staphylococcus, que dirigen a la colicina a la membrana celular de la bacteria de interes y destruyen la celula debido a la filtracion de contenidos celulares a traves de los canales ionicos transmembrana formados.
25
Los tumores malignos representan una gran amenaza para la salud humana. Cada ano fallecen en el mundo siete millones de personas por tumores malignos, de los que la sexta parte se producen en China. Los tumores malignos son actualmente la segunda causa principal de muerte en el pafs. Dado que la etiologfa, la patogenia y las manifestaciones clmicas de un tumor maligno no estan claramente dilucidadas, lo prevencion y el tratamiento no son 30 eficaces. Los agentes antitumorales son importantes en el tratamiento de un tumor. Aunque logran efecto terapeutico en algunos tumores, sigue habiendo algunas desventajas, tales como una selectividad tumoral insuficiente, supresion inmunitaria, reacciones adversas, resistencia a farmacos, etc.
La superficie de las celulas de linfoma de Burkitt, de linfoma de Hodgkin y de carcinoma nasofarmgeo provocado por 35 el virus de Epstein-Barr (EB), porta un antfgeno de superficie espedfico del virus de EB. Por lo tanto, el antfgeno de superficie del virus de EB puede considerarse como un marcador de superficie de tales celulas tumorales. Para los agentes frente al tumor provocado por el virus de EB, la invencion con el N.° de patente china ZL200410081446.8 divulga un polipeptido antitumoral formado por la conjugacion de la colicina y el mimetico de anticuerpo que reconoce el antfgeno de superficie del virus de EB. El polipeptido antitumoral puede destruir de forma espedfica en 40 el cuerpo las celulas cancerosas provocadas por el virus de EB, no provoca dano a las celulas normales, su capacidad de destruccion es varias veces superior a la de otros agentes tumorales y supera los problemas tales como la selectividad tumoral, resistencia a farmacos, deterioro del tejido normal cuando se matan las celulas cancerosas. Xiao-Qing Qiu et al. (Xiao-Qing Qiu et al., 2007, Small antibody mimetics comprising two complementarity-determining regions and a framework region for tumor targeting, Nature Biotechnology 25, 921-929, 45 1 de agosto de 2007), compara el efecto destructor de los polipeptidos antitumorales construidos mediante una serie de anticuerpos mimeticos y la colicina, y descubre que los polipeptidos antitumorales construidos mediante un mimetico de anticuerpo de VhCDR1-VhFR2-VlCDR3 y VlCDR1-VhFR2-VhCDR3 con la colicina tienen una capacidad de destruccion superior. Este trabajo proporciona mas mimeticos de anticuerpo candidatos para la preparacion de polipeptidos frente al tumor provocado por el virus de EB.
50
El documento WO 2007/083175 divulga una construccion que comprende el mimetico de anticuerpo de la presente solicitud conjugado a una colicina la de tipo silvestre utilizada para el tratamiento del cancer. Los documentos US 2006/233813 y US 2006/193867 describen la misma construccion que el documento WO 2007/083175 y su uso en el tratamiento del cancer inducido por el VEB.
55
Sin embargo, para el polipeptido antitumoral descrito anteriormente, dado que el extremo terminal hidrofobo de la colicina tiene algunos restos de aminoacidos que pueden incluir hipersensibilidad, es posible que los medicamentos que comprenden polipeptidos de la colicina produzcan mas facilmente respuestas inmunitarias anomalas in vivo. Se ha descrito que el mecanismo metabolico de muchos pacientes con cancer es anomalo debido a la alteracion de las 60 celulas cancerosas, es facil que padezcan una respuesta alergica frente al medicamento de polipeptidos y, por lo tanto, no puedan tratarse con tal medicamento. Por lo tanto, es necesario mejorar el polipeptido de colicina para obtener un medicamento anticanceroso que sea seguro y adecuado para mas pacientes.
Sumario de la invencion
A base de la desventaja de la tecnica anterior indicada anteriormente, la presente invencion proporciona un polipeptido nuevo frente a un tumor provocado por el virus de EB, y el uso y metodo de preparacion del mismo, por 5 lo tanto, proporciona un medicamento para el tratamiento de un tumor provocado por el virus de EB que tiene alta capacidad de destruccion, alta especificidad y una baja posibilidad de alergia, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Un polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB, que esta formado por la union operativa de un 10 polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales ionicos, con un polipeptido de un anticuerpo anti virus de Eb o un polipeptido de un mimetico de anticuerpo anti virus de EB, en el que el polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales ionicos se obtiene mediante la mutacion de los restos de aminoacido G11A, H22G, A26G, V31L y H40D, en la cadena peptfdica de la colicina la de tipo silvestre, la secuencia de aminoacidos del polipeptido del anticuerpo anti virus de EB es la misma que la del polipeptido del anticuerpo monoclonal que secreta el 15 hibridoma HB-168 de la ATCC y en el que el polipeptido del mimetico de anticuerpo es un peptido conectado de la region CDR1 de la cadena pesada, que une el segmento peptfdico de las CDR1-CDR2 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo anti virus de EB que secreta el hibridoma HB-168 de la ATCC.
El polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales ionicos se obtiene mediante la mutacion de la colicina 20 la de tipo silvestre.
El polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO. 29.
25 Un gen que codifica el polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB.
El gen que tiene la secuencia de nucleotidos mostrada en SEQ ID NO. 30.
Un plasmido recombinante que comprende dicho gen.
30
Un metodo de preparacion del polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB, que comprende las etapas de: transformar dicho plasmido recombinante en un sistema de expresion para la expresion y aislar el polipeptido expresado.
35 El uso de dicho polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y la prevencion del tumor provocado por el virus de EB.
Un polipeptido mutante de la colicina la; su secuencia de aminoacidos se muestra en SEQ ID NO. 24.
40 Un gen que codifica un polipeptido mutante de la colicina la.
Uso de dicho gen en la preparacion de un medicamento de peptido, uniendo operativamente dicho gen con un gen que expresa el peptido, clonando en un vector de expresion, transformando despues el vector de expresion en un sistema de expresion y aislando el polipeptido expresado.
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La invencion proporciona un polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB, que esta formado por un polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales ionicos con un polipeptido de un anticuerpo anti virus de EB o un polipeptido de un mimetico de anticuerpo anti virus de EB. Dado que hay algunos restos de aminoacido en el polipeptido de la colicina de tipo silvestre que pueden incluir hipersensibilidad, en la construccion de la molecula 50 poiipeptfdica de la colicina que puede formar canales ionicos la invencion muta de forma selectiva los restos de aminoacido de la region hidrofoba que pueden producir facilmente una respuesta alergica. Los sitios mutantes del polipeptido de la colicina la son: G11A, H22G, A26G, V31L y H40D. En ratones inmunizados con una inyeccion de un polipeptido de la colicina la o un polipeptido de la mutante, respectivamente, los datos experimentales muestran que el tftulo del suero producido por los ratones a los que se les inyecto el polipeptido de la la mutante es varios 55 ordenes de magnitud inferior que el primero, es decir, el nivel de la respuesta inmunitaria es inferior, lo que
demuestra que el polipeptido mutante reduce la posibilidad de alergia, mientras conserva la funcion de formar
canales ionicos en la membrana celular. El experimento demostro que la capacidad de destruccion del polipeptido recombinante de la invencion no esta afectada, lo que significa que los restos de aminoacido mutantes no afectan la funcion de la colicina de formar canales ionicos. En el polipeptido nuevo proporcionado por la invencion frente al 60 tumor provocado por el virus de EB, a traves del reconocimiento de las celulas tumorales provocadas por el virus de EB por parte del polipeptido del anticuerpo anti virus de EB o del polipeptido del mimetico de anticuerpo anti virus EB, el polipeptido mutante de la colicina se dirige a la membrana celular de las celulas diana, la region hidrofoba del dominio transmembrana del canal ionico del polipeptido mutante de la colicina se inserta en la membrana celular de las celulas tumorales y forma un canal ionico, por lo tanto, las celulas tumorales mueren por la filtracion de los
65 contenidos celulares. La secuencia de aminoacidos del polipeptido del anticuerpo anti virus de EB se refiere
completamente a la secuencia de aminoacidos del polipeptido del anticuerpo secretado por el hibridoma HB-168 de la ATCC.
En una realizacion de la invencion, es preferente un polipeptido anti tumoral de bajo peso molecular de la invencion, 5 el cual se obtiene mediante la union operativa del polipeptido del mimetico de anticuerpo anti virus de EB descritos anteriormente, con el extremo carboxilo del polipeptido mutante de la colicina. Es decir, tal polipeptido mimetico de bajo peso molecular comprende una cadena peptfdica de VHCDR1-VHFR2-VLCDR3, que se obtiene por la conexion de la region VHCDR1, la region VLCDR3, uniendo el segmento peptfdico de VHCDRl-VHCDR2 y VLCDR3 de la cadena ligera del polipeptido del anticuerpo anti virus de EB. La secuencia de aminoacidos del peptido 1 antitumoral 10 nuevo del mimetico de anticuerpo se muestra en SEQ ID NO. 25. El mimetico de anticuerpo solo comprende menos de 30 aminoacidos y tiene un peso molecular mucho menor que el anticuerpo natural de 150 aminoacidos. Cumple con el requisito de reconocimiento del antfgeno mientras reduce substancialmente el peso molecular del polipeptido antitumoral, y contribuye a la capacidad de penetracion tisular del polipeptido antitumoral de la presente invencion.
15 Otro objeto de la presente invencion es proporcionar un secuencia genica que codifique el polipeptido antitumoral de la presente invencion. El gen del polipeptido antitumoral de la presente invencion esta formado por la union operativa de un gen que codifica un polipeptido mutante de la colicina con un gen que codifica un polipeptido de un anticuerpo anti virus de EB o un polipeptido de un mimetico de anticuerpo del mismo, en el que el polipeptido de la colicina y la secuencia genica del anticuerpo anti virus de EB son conocidos en la tecnica, el gen del polipeptido mutante de la 20 colicina se obtiene mediante las siguientes mutaciones puntuales en los correspondientes codones del gen del polipeptido de la colicina: G11A, H22G, A26G, V31L y H40D. Como resultado de la degeneracion del codigo genetico, un experto en la materia puede ajustar la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido antitumoral de la presente invencion, sin modificar la secuencia de aminoacidos.
25 El plasmido recombinante de la presente invencion significa que el vector original que porta el gen de la colicina de tipo silvestre tiene mutaciones por mutagenesis dirigida en los nucleotidos bicatenarios y tiene inserciones de codones mutantes en el sitio de la mutacion diana, obteniendo asf un vector mutante que comprende el gen del polipeptido mutante de la colicina. El mismo procedimiento de mutagenesis dirigida inserta un gen que codifica un mimetico de anticuerpo de un anticuerpo anti virus de EB, en el extremo carboxilo de un gen del polipeptido mutante 30 de la colicina, obteniendo asf un plasmido recombinante de la presente invencion. El vector original pSELECTTM-1 se adquiere en Promega Corp., el cual porta genes de la colicina la y una protema inmunitaria. El procedimiento de mutagenesis dirigida sigue las instrucciones del kit de Strategene Corp. La presente invencion lleva a cabo algunas mutagenesis dirigidas para preparar un polipeptido mutante de la colicina, en el que se mutan por mutagenesis dirigidas cinco codones. Por lo tanto, se disenan 5 parejas de secuencias de cebadores (SEQ ID NO. 1-10). En el 35 ejemplo de la presente invencion, se disenan 6 parejas de secuencias de cebadores para el gen del mimetico de anticuerpo (SEQ ID NO. 11-22).
La presente invencion tambien proporciona un metodo para la preparacion del polipeptido antitumoral de la presente invencion, que comprende transformar el vector recombinante obtenido anteriormente en una bacteria E. coli BL21 40 (DE3) tecnicamente disenada, seleccionar un clon positivo, aislar y purificar la protema que expresa el clon positivo, obteniendo asf el polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de eB de la presente invencion.
El polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB proporcionado por la presente invencion, puede utilizarse en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y la prevencion de un tumor provocado por el 45 virus de EB. Puede fabricarse una composicion clmica farmaceutica adecuada anadiendo el polipeptido de los antibioticos nuevos obtenidos en la presente invencion a un excipiente o vehmulo farmaceuticamente aceptable, u otros componentes opcionales.
La presente invencion tambien proporciona la secuencia de aminoacidos y la secuencia genica del polipeptido 50 mutante de la colicina la. En la presente invencion puede utilizarse el polipeptido mutante, tambien puede utilizarse en la construccion de un polipeptido de anticuerpo con otros polipeptidos de direccionamiento. Los datos experimentales del ejemplo 3 en la invencion demuestran que el medicamento de peptido que comprende el polipeptido mutante tiene un baja inmunogenicidad y que el polipeptido del anticuerpo formado por el polipeptido mutante con otro polipeptido de direccionamiento tiene una capacidad bactericida. El metodo de preparacion es un 55 procedimiento experimental rutinario en la tecnica.
El polipeptido antitumoral nuevo que proporciona la invencion tiene la ventaja del polipeptido antitumoral divulgado en la patente n.° ZL200410081446.8, es decir, un direccionamiento altamente espedfico y seguridad para celulas normales, y no proclive a desarrollar resistencia al farmaco. Al mismo tiempo, el polipeptido antitumoral de la 60 presente invencion se ha mutado en los restos aminoacido que tienden a producir una respuesta alergica, la inmunogenicidad del polipeptido antitumoral que comprende tal polipeptido mutante es reducida, es decir, la posibilidad de reaccion alergica es reducida. La seguridad en el uso y el efecto de destruccion del tumor del medicamento de tales polipeptidos estan mejorados. Este puede ser tambien un buen ejemplo para la mejora de otros medicamentos que comprendan un polipeptido de colicina.
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Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Ilustracion esquematica de la estructura del plasmido recombinante pCHCEB11, que comprende el gen del polipeptido del mimetico de anticuerpo de VhCDR1-VhFR2-VlCDR3 y el gen del polipeptido mutante de la colicina la.
Figura 2. Ilustracion esquematica de la estructura del plasmido recombinante pCHCEB22, que comprende el gen del polipeptido del mimetico de anticuerpo de VHCDRl-VHFR2-(Rev)VLCDR3 y el gen del polipeptido mutante de la colicina Ia.
Figura 3. El experimento 1 del efecto de sensibilizacion del polipeptido mutante de la colicina la.
(A) Se inyectan ratones Kunming por via intraperitoneal con una dosis letal de SARM (ATCC BAA42) y se agrupan al azar en (1) el grupo de control, (2) el grupo de ampicilina, (3) el grupo del polipeptido frente a S. aureus (ZL 01128836.1), (4) el grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus.
(B) Despues de 14 dfas, se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en un grupo de control y un grupo de ampicilina. Los ratones del grupo del polipeptido frente a S. aureus y del grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus que sobreviven se agrupan en un grupo del polipeptido frente a S. aureus y un grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus, y el experimento se repite.
(C) Despues de 41 dfas, se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en (1) el grupo de control, (2) el grupo de levofloxacina, (3) el grupo de ceftriaxona de sodio, (4) el grupo del polipeptido frente a S. aureus, y (5) los ratones del grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus que sobreviven se agrupan con el grupo del polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa, y un grupo del polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa.
Figura 4. El experimento 3 del bajo efecto de sensibilizacion del polipeptido mutante de la colicina la.
(A) el suero del grupo del polipeptido frente a S. aureus/polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa, tttulo de 1:50.000;
(B) el suero del grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus/polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa, tftuio de 1:50.000.
(1) Semana 1, (2) Semana 2, (3) suero de la semana 7, (4) control negativo.
Figura 5. Comparacion del efecto de destruccion del polipeptido antitumoral nuevo contra el linfoma de Burkitt provocado por el virus de EB.
(A) grupo de control, (B) grupo tratado con el polipeptido 1 antitumoral nuevo, (B) grupo tratado con el polipeptido 2 antitumoral nuevo.
Figura 6. Efecto de destruccion in vitro del polipeptido antitumoral nuevo contra celulas del linfoma de Burkitt provocado por el virus de EB y otras celulas tumorales.
(A) celulas de linfoma de Burkitt positivas para el VEB,
(B) celulas de linfoma de Burkitt negativas para el VEB,
(C) celulas de linfosarcoma maligno de pacientes con SIDA positivas para el VEB.
(1) grupo de control, (2) grupo tratado con el polipeptido 1 antitumoral nuevo.
Figura 7. Efecto de destruccion del polipeptido antitumoral nuevo contra el tumor solido crecido en ratones desnudos a los que se les ha implantado celulas del linfoma de Burkitt provocado por virus de EB.
(A) grupo de control.
(B) se inoculan en ambos flancos axilares ratones inmunodeficientes IDCG del grupo tratado con el polipeptido 1 antitumoral nuevo, con celulas del linfoma de Burkitt. Flecha en el lado izquierdo, linfosarcoma negativo para VEB, flecha en el lado derecho, linfosarcoma positivo para VEB.
Figura 8. Efecto de destruccion del polipeptido antitumoral nuevo contra el tumor solido crecido en ratones desnudos a los que se les ha implantado celulas del linfoma de Burkitt provocado por virus de EB.
(A) corte de linfosarcoma negativo para VEB del raton de control, (B) corte de linfosarcoma positivo para VEB del raton de control, (C) corte de linfosarcoma negativo para VEB del raton tratado con el polipeptido 1 antitumoral nuevo, (D) corte de linfosarcoma positivo para VEB del raton tratado con el polipeptido 1 antitumoral nuevo.
Realizaciones
La invencion se describira ahora mediante la descripcion de las realizaciones preferentes de la invencion y con
5
referencia a los dibujos adjuntos.
El vector original pSELECT™-1 utilizado en la invencion se adquiere en Promega Corp.
5 La bacteria E. coli BL21(DE3) tecnicamente disenada se adquiere en Novagen Corp.
Ejemplo 1. Construccion del plasmido recombinante que comprende el gen que codifica la colicina la mutante.
El vector original es el plasmido pSELECTTM-1 (8,3 kb) (adquirido en Promega Corp.) que porta genes de la colicina 10 la y una protema inmunitaria. Las secuencias de los cebadores oligonucleotidicos mostradas en las SEQ ID NO. 110, que codifican los aminoacidos mutantes, se unen respectivamente de forma operativa al gen de la colicina la de tipo silvestre mediante la tecnologfa de mutagenesis dirigida de oligonucleotidos bicatenarios (QuickChangeTM Kit, Strategene Corp.), obteniendo un gen mostrado en SEQ ID NO. 23, que codifica un polipeptido mutante de la colicina la y un plasmido mutante. Despues de esto, el gen de SEQ ID NO.26 o SEQ ID No.28 se inserta en el 15 plasmido mutante detras del codon I626 del gen del polipeptido mutante de la colicina Ia, obteniendo dos plasmidos recombinantes pCHCEB11 (mostrado en la Figura 1) y pCHCEB22 (mostrado en la Figura 2), para el polipeptido nuevo frente al tumor provocado por el virus de EB. En SEQ ID NO.11-22 se muestran las secuencias de 6 parejas se cebadores oligonucleotfdicos, los cuales estan disenados para la preparacion del gen que codifica el anticuerpo frente al virus de EB en el plasmido recombinante. Para preparar el polipeptido el plasmido recombinante se 20 transfecta en la bacteria tecnicamente disenada E. coli BL21 (DE3) (adquirido en Novagen Corp.). Los polipeptido obtenidos se muestran en SEQ ID NO.29 (en lo sucesivo en el presente documento denominado "polipeptido 1 antitumoral nuevo") y SEQ ID NO.31 (en lo sucesivo en el presente documento denominado "polipeptido 2 antitumoral nuevo") en el listado de secuencias.
25 El procedimiento de mutagenesis dirigida de oligonucleotidos bicatenarios es segun el kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis de Strategene (n.° de catalogo 200518).
1. Preparacion de los reactantes para la mutagenesis dirigida:
30 5 |jl de tampon 10X
2 |jl (10 ng) de plasmido original pSELECT™-1 que porta que porta los genes de los polipeptidos de la colicina Ia de tipo silvestre y una protema inmunitaria.
1.25 jl (125 ng) del cebador oligonucleotfdico 5'-3' disenado
1.25 jl (125 ng) del cebador oligonucleotfdico 3'-5' disenado
35 1 jl de dNTP
50 jl agua bidestilada 1 jl de pfu
(proporcionado con el kit, excepto el plasmido, los cebadores y el agua bidestilada)
40 2. Amplificacion por PCR, condiciones de amplificacion: 25 ciclos de desnaturalizacion a 95 °C durante 35
segundos, hibridacion a 53 °C durante 70 segundos, y extension a 68 °C durante 17 minutos;
3. Se anade 1 jl de endonucleasa Dpn 1 para digerir la cadena de ADN parental (37 °C, 1 hora), se incuban juntos 1 jl de los reactantes y 50 jl de celulas competentes XL1-Blue en hielo durante 30 minutos, tras el choque termico a 42 °C durante 45 segundos se incuba en hielo durante 2 minutos;
45 4. Se anaden 0,5 ml de medio de cultivo NZY, se agita a 37 °C y 220 rpm durante 1 hora. Se siembran en placa
50-100 jl (medio LB mas agar al 1 % y ampicilina 50 jg/ml, durante una noche a 37 °C);
5. Tras 18 horas se toman colonias. El plasmido se extrae, se secuencia, se confirma que la mutacion es satisfactoria;
6. Los 50 ng de plasmido recombinante finalmente obtenidos mediante la mutacion en multiples sitios se incuban 50 en hielo durante 5 minutos con 40 jl celulas competentes E. coli BL-21(DE3), se trata con choque termico a
42 °C durante 30 segundos y se incuba en hielo durante 2 minutos. Se anaden 160 jl de medio ce cultivo SOC de Novagen Corp. y se siembra en placa tras agitar a 37 °C y 220 rpm durante 1 hora (medio LB mas agar al 1 % y ampicilina 50 jg/ml, durante una noche a 37 °C).
7. Se toman colonias individuales para la amplificacion, 8-16 litros de medio FB, 250 rpm, a 30 °C durante 4-5 55 horas, se somete a choque termico a 42 °C y 250 rpm durante 30 minutos, y a 37 °C durante 2 horas. La bacteria
se precipita mediante centrifugacion a 6000g y 4 °C durante 20 minutos. Se le anaden 250 ml de PMSF 0,2 M al tampon borato 50 mM (EDTA 2 mM + DTT 2 mM) a 4 °C y a 50-80 ml de suspension de bacteria, y se trata con ultrasonido (4 °C, 400 W, 2 minutos). Los residuos de la bacteria se centrifugan a alta velocidad (4 °C, 75.000g, 90 minutos). Se le anade al sobrenadante 5 millones de unidades de sulfato de estreptomicina para precipitar el 60 ADN. Tras la precipitacion mediante centrifugacion a 15000g y 4 °C durante 10 minutos, el sobrenadante se dializa durante una noche en una bolsa para dialisis de peso molecular 15.000 en tampon borato 50 mM a 4 °C. Tras precipitacion otra vez mediante centrifugacion a 15000g y 4 °C durante 10 minutos, el sobrenadante se carga en un columna de intercambio ionico CM. La columna se eluye utilizando un gradiente de NaCl 0,1-0,3 M + tampon borato 50 mM, obteniendo el polipeptido antitumoral recombinante.
5
10
15
20
25
30
35
40
Las secuencias de los cebadores disenados para la mutagenesis dirigida son las siguientes:
SEQ ID NO. 1, cebador oligonucleotidico 5’-3’ disenado para la mutacion G11A en el gen de la colicina: cgt att aca aat ccc GCA gca gaa teg ctg ggg
SEQ ID NO. 2, cebador oligonucleotidico 3’-5’ disenado para la mutacion G11A en el gen de la colicina: ccc cag ega ttc tgc TGC ggg att tgt aat aeg
SEQ ID NO. 3, cebador oligonucleotidico 5’-3’ disenado para la mutacion H22G en el gen de la colicina: gat tea gat ggc GGT aaa tta tgg gtg
SEQ ID NO. 4, cebador oligonucleotidico 3’-5’ disenado para la mutacion H22G en el gen de la colicina: cac cca taa ttt ACC gcc ate tga ate
SEQ ID NO. 5, cebador oligonucleotidico 5’-3’ disenado para la mutacion A26G en el gen de la colicina: gaaa ttatgGGTgt tgatatttat
SEQ ID NO. 6, cebador oligonucleotidico 3’-5’ disenado para la mutacion A26G en el gen de la colicina: ataaatatacaacACCcataatttc
SEQ ID NO. 7, cebador oligonucleotidico 5’-3’ disenado para la mutacion V31L en el gen de la colicina: gt tgatatttat CTC aaccctc cacgtgtc
SEQ ID NO. 8, cebador oligonucleotidico 3’-5’ disenado para la mutacion V31L en el gen de la colicina: gacacgtggagggttGAGataaatatcaac
SEQ ID NO. 9, cebador oligonucleotidico 5’-3’ disenado para la mutacion H40D en el gen de la colicina: cgtgtcga tgtctttGATggtaccccgc ctgcat
SEQ ID NO. 10, cebador oligonucleotidico 3’-5’ disenado para la mutacion H40D en el gen de la colicina: atgcaggcggggtaccATCaaagacatcgacacg
SEQ ID NO. 11, cebador 5’-3’ para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB11:
geg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGTCAGtaa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO. 12, cebador 3’-5’ para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB11: gcc tgt ett ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ett att ege SEQ ID NO. 13, cebador 5’-3’ para el gen de VhFR2 en el plasmido recombinante pCHCEB11:
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO. 14, cebador 3’-5’ para el gen de VhFR2 en el plasmido recombinante pCHCEB11:
gcc tgt ett ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg aeg cac cca atg cat acc SEQ ID NO. 15, cebador 5’-3’ para el gen de (Rev)V1CDR3 en el plasmido recombinante pCHCEBU: aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc ACC TAC CCC TAC TCC TAC GGT CAG GGT taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO. 16, cebador 3’-5’ para el gen de (Rev)VLCDR3 en el plasmido recombinante pCHCEBU: gcc tgt ett ata ttt tat tta ACC CTG ACC GTA GGA GTA GGG GGT ggc cac cca etc cag acc ttt SEQ ID NO. 17, cebador 5’-3’ para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB22:
geg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO. 18, cebador 3’-5’ para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB22: gcc tgt ett ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ett att ege SEQ ID NO. 19, cebador 5’-3’ para el gen de VhFR2 en el plasmido recombinante pCHCEB22:
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ataaaa tat aag aca ggc SEQ ID NO. 20, cebador 3’-5’ para el gen de VhFR2 en el plasmido recombinante pCHCEB22:
gcc tgt ett ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg aeg cac cca atg cat acc SEQ ID NO. 21, cebador 5'-3' para el gen de VLCDR3 en el plasmido recombinante pCHCEB22:
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO. 22, cebador 3’-5’ para el gen de VLCDR3 en el plasmido recombinante pCHCEB22: gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca etc cag acc ttt
5 Ejemplo 2. Observacion del efecto inmunitario de los polipeptidos antitumorales nuevos procedentes de los plasmidos recombinante pCHCEB11 y pCHCEB22.
Se inmunizan ratones con el polipeptido 1 antitumoral nuevo y el polipeptido 2 antitumoral nuevo preparados a partir de los plasmidos recombinante pCHCEB11 y pCHCEB22 obtenidos en el Ejemplo 1, y el polipeptido 1 antitumoral y 10 el polipeptido 2 antitumoral procedentes de la invencion anterior propiedad del inventor (documento ZL200410081446.8). Cada una de las protemas descritas anteriormente se mezcla con adyuvante. La dosis de sensibilizacion y la dosis de refuerzo son una inyeccion intraperitoneal de 50 pg (0,5 ml) para cada raton, en total cinco inyecciones a intervalos de 2 semanas. El tttulo de los sueros se determino mediante el metodo de ELISA indirecto. Los tftulos de los ratones inmunizados con los polipeptidos 1 y 2 antitumorales nuevos preparados por la 15 presente invencion variaban de 10-3 a 10-4, mientras que los tftulos de los ratones inmunizados con el polipeptido 1 antitumoral y con el polipeptido 2 antitumoral variaban de 10-4 a 10-5.
Puede observarse que la posibilidad de que se produzca una reaccion de hipersensibilidad inducida por el polipeptido antitumoral nuevo de la presente invencion es de 1 orden a 2 ordenes de magnitud mas bajos que la 20 posibilidad de que se produzca una reaccion de hipersensibilidad inducida por el polipeptido antitumoral que comprende la colicina la de tipo silvestre.
Ejemplo 3. Experimento del bajo efecto de sensibilizacion del polipeptido mutante de la colicina la que forma el polipeptido antitumoral nuevo.
25
El plasmido mutante para el polipeptido mutante de la colicina la (que esta mutada en los restos de aminoacido G11A, H22G, A26G, V31L y H40D en la cadena peptfdica del dominio del canal acuoso) del Ejemplo 1 esta unido operativamente a la feromona AgrD1 (YSTCDFlM) de S. aureus en el extremo N o el extremo C del polipeptido mutante, obteniendose dos polipeptidos antibacterianos. El polipeptido obtenido por la union de AgrD1 al extremo 30 carboxilo de la colicina la mutante se denomina polipeptido 1 frente a S. aureus, y el polipeptido obtenido por la union de AgrD1 al extremo amino de la colicina la mutante se denomina polipeptido 1 frente a S. aureus. El plasmido para la colicina la de tipo silvestre esta unido en el extremo amino a la feromona AgrD1(YSTCDFlM) de S. aureus, obteniendose el polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa.
35 Experimento 1: Se le inyecta a un lote de ratones Kunming una dosis letal de SARM (ATCC BAA42) por via intraperitoneal y se agrupan al azar en (1) el grupo de control, (2) el grupo de ampicilina, (3) el grupo del polipeptido frente a S. aureus, (4) el grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus. Cada grupo consiste en 10 ratones.
Metodo de tratamiento:
40
Una hora despues de la inyeccion intraperitoneal de la dosis letal de SARM (ATCC BAA42):
grupo de control: inyectados una vez con 0,5 ml de NaCl 0,3 M + tampon borato 50 mM a traves de la vena de cola;
45 grupo de ampicilina: inyectados una vez con ampicilina 2,5 mg/kg a traves de la vena de cola;
grupo del polipeptido frente a S. aureus: inyectados una vez con polipeptido frente a S. aureus propiedad del inventor (Zl 01128836.1) 6 mg/kg a traves de la vena de cola;
grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus: inyectados una vez con polipeptido 1 frente a S. aureus 6 mg/kg a traves de la vena de cola;
50 Resultado: Todos los ratones del grupo de control y del grupo de ampicilina murieron al cabo de dos dfas.
Sobrevivio el 85 % de los ratones del grupo del polipeptido frente a S. aureus y del grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus.
Experimento 2: 14 dfas despues del experimento 1 se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en un grupo de 55 control y un grupo de ampicilina. Los ratones del grupo del polipeptido frente a S. aureus y del grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus que sobrevivieron se agrupan en un grupo del polipeptido frente a S. aureus y un grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus, para repetir el experimento descrito anteriormente. Todos los ratones del grupo de control y del grupo de ampicilina murieron al cabo de dos dfas. Sobrevivio el 75 % de los ratones del grupo del polipeptido frente a S. aureus y el 90 % de los ratones del grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus.
60 Experimento 3: 41 dfas despues del experimento 1 se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en un grupo de control, un grupo de levofloxacina y un grupo de ceftriaxona de sodio. Los ratones del grupo del polipeptido frente a S. aureus y del grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus que sobrevivieron se agrupan en un grupo del
polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa y un grupo del polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa.
Se inyectaron ratones por via intraperitoneal con una dosis letal de Pseudomonas aeruginosa de resistencia a multiples farmacos (aislado clmico 13578 del Departamento de Medicina Experimental, Hospital de China Occidental 5 de la Universidad de Sichuan). Despues de una hora, se inyectaron una vez 0,5 ml de NaCl 0,3 M + tampon borato 50 mM, al grupo de control a traves de la vena de cola;
se inyecto una vez levofloxacina 5 mg/kg al grupo de levofloxacina a traves de la vena de cola; se inyecto una vez ceftriaxona de sodio 30 mg/kg al grupo de ceftriaxona de sodio a traves de la vena de cola; se inyecto polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa 8 mg/kg al grupo del polipeptido 2 frente a Pseudomonas 10 aeruginosa a traves de la vena de cola;
se inyecto polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa 8 mg/kg al grupo del polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa a traves de la vena de cola.
Todos los ratones del grupo de control y del grupo de levofloxacina murieron al cabo de un dfa. El 25% de los 15 ratones del grupo de ceftriaxona de sodio sobrevivieron. El 60 % de los ratones del grupo del polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa sobrevivieron. Todos los ratones del grupo del polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa sobrevivieron. Esta demostrado que los anticuerpos del hospedador interfieren con el efecto de destruccion del polipeptido mutante en menor grado que con el del polipeptido de tipo silvestre.
20 Vease la Figura 3.
A la semana 1, la semana 2 y la semana 7 del experimento, para detectar el anticuerpo en sangre se ensayo por el metodo de ELISA indirecto el suero de los ratones que sobrevivieron del grupo del polipeptido frente a S. aureus/grupo del polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa, y del grupo del polipeptido 1 frente a S. 25 aureus/grupo del polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa. Se recubren los pocillos de una placa marcada con enzima con 100 ng/pocillo de colicina la de tipo silvestre y de polipeptido de la colicina la mutante. Los primeros anticuerpos son los sueros de los ratones que sobrevivieron del grupo del polipeptido frente a S. aureus/grupo del polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa, y el grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus/grupo del polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa. El segundo anticuerpo es un anticuerpo de cabra anti raton marcado. El primer 30 anticuerpo de control negativo es leche al 5%-PBS. Los resultados del tftulo 1:50.000 son los siguientes (vease la Figura 4):
A (grupo del polipeptido frente a S. aureus /grupo del polipeptido 2 frente a Pseudomonas aeruginosa) B (grupo del polipeptido 1 frente a S. aureus/grupo del polipeptido 1 frente a Pseudomonas aeruginosa
1 (Semana 1)
0,914 0,254
2 (Semana 2)
1,623 0,598
3 (Semana 7)
2,911 1,41
4 (control)
0,065 0,069
Esta demostrado que la posibilidad de que se produzca una reaccion de hipersensibilidad del hospedador inducida 35 por el polipeptido de la colicina la mutante preparado por la presente invencion es menor que la posibilidad de que se produzca una reaccion de hipersensibilidad del hospedador inducida por la colicina la de tipo silvestre.
Ejemplo 4. Efecto de destruccion in vitro del polipeptido antitumoral nuevo contra el linfoma de Burkitt provocado por el virus de EB.
40
La cepa de celulas positivas para el VEB y la cepa de celulas negativas para el VEB son cepas de celulas convencionales de la ATCC, EE.UU.
Cultivos de celulas: Se anaden lentamente 0,1 ml de celulas Raji reactivadas en suspension en 3 ml de medio 45 lfquido 1640 (mas suero al 10%) en una placa de cultivo (tasa de dilucion, 1:30), se mezcla y se cultiva en una incubador de 37 °C con CO2. La cepa de celulas positivas para el VEB es ATCC CCL-86 (unas celulas de linfoma de Burkitt convencionales utilizadas en los laboratorios de todo el mundo, las celulas Raji, aisladas en 1963 de un nino africano de 12 anos).
50 Las celulas de prueba se agrupan en 3 grupos.
El grupo 1 es un grupo de blanco, al que se anade una solucion de conservacion (tampon fosfato PB 10 mM+NaCl 0,2 M (pH 7,4)) sin el polipeptido antitumoral.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Al grupo 2 se le anade el polipeptido 1 antitumoral nuevo 200 |jg/ml (plasmido pCHCEB11, solucion de conservacion, tampon fosfato pB 10 mM + NaCl 0,2 M, pH 7,4).
Al grupo 3 se le anade el polipeptido 2 antitumoral nuevo conservacion, tampon fosfato pB 10 mM + NaCl 0,2 M, pH 7,4).
200 jg/ml (plasmido pCHCEB22, solucion de
Despues del cultivo durante 24 horas se anaden a la placa de cultivo los agentes de tratamiento descritos anteriormente. 72 horas despues de la adicion de los agentes de tratamiento se anadieron a la placa de cultivo 20 jl de ioduro de propidio (IP) 100 jMol y 10 minutos mas tarde se observo al microscopio. El resultado muestra que las celulas del grupo de blanco crecen bien y que la mayona de las celulas del grupo del polipeptido 1 antitumoral nuevo se tinen de rojo por el IP, lo que demuestra que el polipeptido antitumoral destruye la membrana celular, lo que conduce a la muerte de las celulas tumorales. Al comparar el numero de celulas muertas, el efecto del polipeptido 2 antitumoral nuevo no es tan bueno entre los dos polipeptidos antitumorales nuevos, vease la Figura 5.
Ejemplo 5. Observacion de la tincion de fluorescencia multiple para el efecto de destruccion in vitro del polipeptido antitumoral nuevo contra celulas del linfoma de Burkitt provocado por el virus de EB y otras celulas tumorales.
Las condiciones del cultivo celular son las mismas que en el Ejemplo 2. En este experimento se utilizan tres cepas celulares: Cepa de celulas positivas para el virus de EB: ATCC CCL-86 (celulas Raji, celulas de linfoma de Burkitt); ATCC CRL-2230, una cepa de celulas de linfosarcoma maligno procedente un hombre de 46 anos con SIDA, que es positivo para virus de EB y virus del sarcoma de Kaposi; cepa de celulas negativas para el virus de EB: ATCC CRL- 1648(CA-46, unas celulas aisladas de lfquido ascftico de un paciente estadounidense con linfoma de Burkitt).
Cada cepa se agrupa en el grupo de ensayo 2. Al grupo 1 se le anade una solucion de conservacion (tampon fosfato PB 10 mM+NaCl 0,2 M (pH 7,4)) sin el polipeptido antitumoral nuevo. Al grupo 2 se le anade el polipeptido 1 antitumoral nuevo 200 jg/ml (plasmido pCHCEB11), la solucion de conservacion es tampon fosfato PB 10 mM+NaCl 0,2 M pH 7,4.
Despues del cultivo durante 24 horas se anaden a la placa de cultivo los agentes de tratamiento de los grupos descritos anteriormente. 72 horas despues de la adicion de los agentes de tratamiento se anaden a la placa de cultivo dos tipos de colorantes fluorescentes, es decir, 20 jl de FITC 50 jMol y 20 jl de Rodamina-123 50 uMol y 10 minutos mas tarde se observan con un microscopio Olympus IX-71.
El resultado muestra que la cepa de celulas tumorales negativas para VEB crece bien tras el tratamiento con el polipeptido 1 antitumoral nuevo y que en la mayor parte de las celulas de todas las cepas de celulas tumorales positivas para el VEB aparece la desaparicion de mitocondrias y nucleos, estan hinchadas y hay necrosis, la mayor parte de ellas estan muertas. Aparentemente, en comparacion con el experimento de tincion con IP del Ejemplo 4, el resultado del experimento de tincion de fluorescencia multiple muestra de forma mas clara el potente efecto de destruccion del polipeptido 1 antitumoral nuevo frente a las celulas tumorales positivas para virus de EB, vease la Figura 6.
Las celulas tumorales negativas para el VEB crecen bien, lo que significa que el polipeptido antitumoral nuevo no ataca a las celulas sin el antfgeno de superficie del virus de EB en la membrana celular. Se sugiere que el polipeptido antitumoral nuevo de la presente invencion tiene una especificidad de direccionamiento y una seguridad ideales.
Ejemplo 6. Efecto de destruccion del polipeptido antitumoral nuevo contra un tumor solido crecido en ratones desnudos a los que se les ha implantado celulas de linfoma de Burkitt provocado por virus de EB.
Los ratones inmunodeficientes IDCG se adquirieron en el Shanghai Laboratory Animal Center, Chinese Academy of Sciences. Los ratones se alimentan siguiendo los requisitos de alimentacion convencionales. El agua, la paja de las camas y el pienso se esterilizan con temperaturas altas o con luz UV. Se alimenta a los ratones una semana en condiciones asepticas relativas y se utilizan en el experimento de inoculacion si no hay anomalfas.
Las suspensiones de celulas Raji (ATCC CCL-86) y 1648 (ATCC CRL-1648) en fase de crecimiento exponencial se recogen en tubos de centnfuga de 50 ml y se centrifugan a 4 °C. Despues se descarta el sobrenadante. Las celulas se resuspenden en medio de cultivo lfquido 1640 (mas suero de ternera) hasta 1,0 x 107 celulas/ml. Se inyecta a los ratones 0,1 ml de suspension de celulas Raji en la axila izquierda y 0,1 ml de suspension de celulas 1648 (ATCC CRL-1648) en la axila derecha por via subcutanea.
3-4 dfas tras la inyeccion el tumor crece hasta aproximadamente 2 x 2 mm. Los ratones que portan tumor se agrupan en:
(grupo A) solucion de conservacion (tampon fosfato PB 10 mM+NaCl 0,2 M (pH 7,4)) sin el polipeptido antitumoral, como grupo de control;
(grupo B) el polipeptido 1 antitumoral nuevo (plasmido pCHCEB11), como grupo de tratamiento, 300 jg/raton^a (calculado como 25 g), durante 20 dfas consecutivos.
Se inyectaron diez ratones de cada grupo con 0,5 ml via subcutanea dos veces al dfa por durante 20 dfas 5 consecutivos. Cada dfa se observa y documenta el comportamiento de los ratones. Se determina el tamano del tumor y se fotograffa cada dos d^as.
El resultado (vease la Figura 7) muestra que el crecimiento del tumor en el grupo B del polipeptido antitumoral nuevo esta significativamente inhibido, en el que los tumores desaparecen en 7 ratones y los tumores de los otros 3 ratones 10 son claramente mas pequenos que los del grupo de control. El polipeptido antitumoral nuevo es eficaz para inhibir en ratones el crecimiento de un tumor solido provocado por celulas de linfosarcoma positivas para el VEB. Sin embargo, el polipeptido antitumoral nuevo es ineficaz para inhibir en ratones el crecimiento de un tumor solido provocado por celulas de linfosarcoma negativas para el VEB.
15 Ejemplo 7. Observacion patologica de un experimento de eliminacion tumoral in vivo
Observacion histopatologica de tumores: Al final del experimento del Ejemplo 6 de sacrifican los ratones. Los tumores se extraen y se fijan en formalina al 10%. Los cortes de parafina se tinen con HE y se observan con microscopfa optica rutinaria.
20
Observados al microscopio los tumores solidos de los ratones del grupo de control proliferan vigorosamente; las celulas de los tumores solidos positivos para el VEB de los ratones del grupo del polipeptido antitumoral nuevo se reducen de forma notable. La mayor parte de las masas celulares del corte son celulas tumorales necroticas y se observa una gran cantidad de infiltracion linfocitica peritumoral. El resultado de la histopatologfa sugiere que durante 25 el tratamiento de 20 dfas el polipeptido antitumoral nuevo destruye casi todas las celulas tumorales del tumor solido (vease la Figura 8, D).
LISTADO DE SECUENCIAS
30 <110> Protein Design Lab, Ltd.,
<120> Un polipeptido nuevo frente a un tumor provocado por el virus de EB, y el uso y un metodo de preparacion del mismo.
35 <130> EP82366HV163pau
<140> EP10836940.6 <141> 26/02/2010
40 <150> PCT/CN2010/070762
<151> 26/02/2010
<150> CN200910242838.0 <151> 17/12/2009 45
<160> 32
<170> BiSSAP 1.0
50 <210> 1
<211> 33 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
55 <220>
<221> fuente <222> 1..33
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotfdico 5j--3j-disenado para la mutacion G11 A en el gen de la colicina"
60 /organismo="Secuencia artificial"
<400> 1
cgtattacaa atcccgcagc agaatcgctg ggg 33 65 <210>2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 33 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..33
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 3j--5j-disenado para la mutacion G1 1A en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>2
ccccagcgat tctgctgcgg gatttgtaat acg 33
<210> 3 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..27
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 5j--3j- disenado para la mutacion H2 2G en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>3
gattcagatg gcggtaaatt atgggtg 27
<210> 4 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..27
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 3j--5j- disenado para la mutacion H2 2G en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>4
cacccataat ttaccgccat ctgaatc 27
<210> 5 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..24
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 5j--3j- disenado para la mutacion A2 6G en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>5
gaaattatgg gtgttgatat ttat 24
<210> 6 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<221> fuente <222> 1..25
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 3j--5j" disenado para la mutacion A2 6G en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>6
alaaatalac aacacccata atttc 25
<210>7 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..30
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 5j--3j- disenado para la mutacion V3 1L en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>7
gttgatattt atctcaaccc tccacgtglc 30
<210>8 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..30
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 3j--5j- disenado para la mutacion V3 1L en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>8
gacacgtgga gggttgagat aaatatcaac 30
<210>9 <211> 34 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..34
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 5j--3j- disenado para la mutacion H4 0D en el gen de la colicina" /organismo="Secuencia artificial"
<400>9
cgtgtcgatg tctttgatgg taccccgcct goat 34
<210> 10 <211> 34 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..34
<223> /mol_type="ADN"
/nota="cebador oligonucleotidico 3j--5j- disenado para la mutacion H4 OD en el gen de la colicina"
/organismo-'Secuencia artificial"
<400> 10
atgcaggcgg ggtaccatca aagacatcga cacg 34 5
<210> 11 <211> 69 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<221> fuente <222> 1..69
<223> /mol_type="ADN"
15 /nota="cebador 5j--3j- para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB11"
/organismo-'Secuencia artificial"
<400> 11
gcgaataagt tctggggtat ttccttcggt atgcattggg tgcgtcagta aataaaatat 60
aagacaggc 6 9
20
<210> 12 <211> 69 <212> ADN
25 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <222> 1..69
30 <223> /mol_type-"ADN"
/nota="cebador 3j--5j- para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB11" /organismo-"Secuencia artificial"
<400> 12
35
gcctgtctta tattttattt actgacgcac ccaatgcata ccgaaggaaa taccccagaa 60
cttattcgc 69
<210> 13 <211> 72
40 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 45 <222> 1..72
<223> /mol_type-"ADN"
/nota="cebador 5j--3j- para el gen de VHFR2 en el plasmido recombinante p CHCEB11" /organismo-"Secuencia artificial"
50 <400> 13
ggtatgcatt gggtgcgtca ggcccccgag aaaggtctgg agtgggtggc ctaaataaaa 60
tataagacag gc 72
<210> 14 55 <211> 73
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..73
<223> /molJype="ADN"
/nota-'cebador 3j--5j- para el gen de VHFR2 en el plasmido recombinante p CHCEB11" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 14
imagen1
<210> 15 <211> 69 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..69
<223> /molJype="ADN"
/nota-'cebador 5j--3j- para el gen de (Rev)VlCDR3 en el plasmido recombinante pCHCEB11" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 15
aaaggtctgg agtgggtggc cacctacccc tactcctacg gtcagggtta aataaaatat 60 aagacaggc 69
<210> 16 <211> 66 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..66
<223> /mol_type="ADN"
/nota-'cebador 3j--5j-para el gen de (Rev)VLCDR3 en el plasmido recombinante pCHCEB11" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 16
gcctgtctta tattttattt aaccctgacc gtaggagtag ggggtggcca cccactccag 60
accttt 66
<210> 17 <211> 69 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..69
<223> /mol_type="ADN"
/nota-'cebador 5j--3j- para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB22"
15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
/organismo="Secuencia artificial" <400> 17
imagen2
<210> 18 <211> 69 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..69
<223> /molJype="ADN"
/nota-'cebador 3j--5j- para el gen de VHCDR1 en el plasmido recombinante pCHCEB22" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 18
imagen3
<210> 19 <211> 72 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..72
<223> /mol_type="ADN"
/nota-'cebador 5j--3j- para el gen de VHFR2 en el plasmido recombinante p CHCEB22" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 19
imagen4
<210> 20 <211> 73 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..73
<223> /mol_type="ADN"
/nota-'cebador 3j--5j- para el gen de VHFR2 en el plasmido recombinante p CHCEB22" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
imagen5
<210> 21 <211> 69 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..69
<223> /molJype="ADN"
/nota-'cebador 5j--3j- para el gen de VLCDR3 en el plasmido recombinante pCHCEB22" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 21
imagen6
<210> 22 <211> 69 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..69
<223> /mol_type="ADN"
/nota-'cebador 3j--5j- para el gen de VLCDR3 en el plasmido recombinante pCHCEB22" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 22
gcctgtctta tattttattt aggtgtaggg gtaggagtaa ccctgaccgg ccacccactc 60
cagaccttt 69
<210> 23 <211> 1878 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<221> fuente <222> 1..1878 <223> /mol_type="ADN"
/nota-'El gen que codifica el polipeptido mutante de la colicina la" /organismo="Secuencia artificial"
<400> 23

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipeptido para su uso en un metodo para el tratamiento de un tumor provocado por el virus de EB, en el que el polipeptido esta formado por la union operativa de un polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales
    5 ionicos con un polipeptido de un anticuerpo anti virus de EB o un polipeptido de un mimetico de anticuerpo anti virus de EB, en el que el polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales ionicos se obtiene mediante la mutacion de los restos de aminoacido G11A, H22G, A26G, V31L y H40D, en la cadena peptfdica de la colicina la de tipo silvestre, la secuencia de aminoacidos del polipeptido del anticuerpo anti virus de EB es la misma que la del polipeptido del anticuerpo monoclonal que secreta el hibridoma HB-168 de la ATCC y en el que el polipeptido del 10 mimetico de anticuerpo es un peptido conectado de la region CDR1 de la cadena pesada, que une el segmento peptfdico de las CDR1-CDR2 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo anti virus de EB que secreta el hibridoma HB-168 de la ATCC.
  2. 2. El polipeptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polipeptido frente al tumor provocado 15 por el virus de EB tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO. 29.
  3. 3. Un gen que codifica el polipeptido como se define en la reivindicacion 1 o 2.
  4. 4. El gen de acuerdo con la reivindicacion 3, que tiene la secuencia de nucleotidos mostrada en SEQ ID NO. 30.
    20
  5. 5. Un plasmido recombinante que comprende el gen de la reivindicacion 3.
  6. 6. Un metodo para preparar el polipeptido como se define en la reivindicacion 1 o 2, que comprende las etapas de: transformar el plasmido recombinante de la reivindicacion 5 en un sistema de expresion para la expresion y aislar el
    25 polipeptido expresado.
  7. 7. Uso de un polipeptido como se define en la reivindicacion 1 o 2 en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y la prevencion de un tumor provocado por el virus de EB.
    30 8. Un polipeptido mutante de la colicina la, que tiene la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO. 24.
  8. 9. Un gen que codifica el polipeptido mutante de la colicina la de la reivindicacion 8.
    35 10. Uso del gen de la reivindicacion 9 en la preparacion de un medicamento peptfdico, uniendo operativamente dicho gen con un gen que expresa el peptido, clonando en un vector de expresion, transformando despues el vector de expresion en un sistema de expresion y aislando el polipeptido expresado.
  9. 11. Un polipeptido frente al tumor provocado por el virus de EB, que esta formado por la union operativa de un 40 polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales ionicos con un polipeptido de un anticuerpo anti virus de
    EB o un polipeptido de un mimetico de anticuerpo anti virus de EB, en el que el polipeptido mutante de la colicina que puede formar canales ionicos se obtiene mediante la mutacion de los restos de aminoacido G11A, H22G, A26G, V31L y H40D, en la cadena peptfdica de la colicina la de tipo silvestre, la secuencia de aminoacidos del polipeptido del anticuerpo anti virus de Eb es la misma que la del polipeptido del anticuerpo monoclonal que secreta el 45 hibridoma HB-168 de la ATCC y en el que el polipeptido del mimetico de anticuerpo es un peptido conectado de la region CDR1 de la cadena pesada, que une el segmento peptfdico de las CDR1-CDR2 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo anti virus de EB que secreta el hibridoma HB-168 de la ATCC.
  10. 12. El polipeptido frente al tumor provocado por el virus de EB de la reivindicacion 11, en el que el polipeptido frente 50 al tumor provocado por el virus de EB tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO. 29.
    imagen1
    Gen con las mutadones G11A, H22G, A2GG, VAIL y H4UD
    Gen con b mscrcion de SFGM H W V RQ A P EKGL E W V AT YP Y S YGQC
    F i LLIU'L'S 2
    imagen2
    imagen3
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    Figura 4
    imagen5
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    Figura 5
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    Figura 7
    Figura 8
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION
    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es unicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilacion de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.
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    • US 2006233813 A [0005]
    • US 2006193867 A [0005]
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    • EP 10836940 A [0061]
    • CN 2010070762 W [0061]
    • CN 200910242838 [0061]
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