ES2634693T3 - Derivados de espiro[2.4]heptano puenteados sustituidos con difluoroetil¿oxazol como agonistas del receptor de ALX - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** en la que los sustituyentes en el anillo piperidina están en disposición trans; o una sal de dicho compuesto.

Description

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DESCRIPCION

Derivados de espiro[2.4]heptano puenteados sustituidos con difluoroetil-oxazol como agonistas del receptor de ALX

La presente invencion se refiere a derivados de espiro[2.4]heptano puenteados sustituidos con difluoroetil-oxazol de formula (I) y a su uso como agentes farmaceuticos. La invencion tambien se refiere a aspectos relacionados, que incluyen procedimientos para la preparacion de los compuestos, composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos de formula (I), y en especial a su uso como agonistas del receptor de ALX (ALXR).

ALXR (tambien conocido como receptor de la lipoxina A4, FPRL1, FPR2; divulgado en el documento WO2003/082314 como la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO:1 y como la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:2) es un miembro de la familia de receptores acoplados a la protema G. Se ha descubierto que ALXR participa en la movilizacion del calcio en respuesta a una alta concentracion del peptido formil-metionina-leucil-fenilalanina. Mas aun, se descubrio que un metabolito lipfdico, la lipoxina A4 (LXA4), y sus analogos, se unen al ALXR con alta afinidad y aumentan la produccion de acido araquidonico y la activacion de protema G en celulas transfectadas con ALXR (Chiang y col., Pharmacol. Rev., 2006, 58, 463-487). Los efectos de la LXA4 se han evaluado en una diversidad de modelos animales de enfermedades; y se ha demostrado que la LXA4 tiene potentes actividades antiinflamatorias y proresolucion. Los modelos de enfermedades en los que la LXA4, o sus derivados o analogos estables, demostraron actividades in vivo son, por ejemplo, inflamacion dermica, bolsa de aire dorsal, lesion por isquemia/reperfusion, peritonitis, colitis, nefritis mesangioproliferativa, pleuritis, asma, fibrosis qrnstica, sepsis, lesion de cornea, angiogenesis, periodontitis, hiperalgesia inducida por carragenina y enfermedad de injerto contra huesped (EICH) (Schwab y Serhan, Current Opinion in Pharmacology, 2006, 414-420). La lipoxina A4 inhibio la expresion de IL-6 en sinoviocitos tipo fibroblastos humanos (Sodin-Semrl y col., Int J Immunopathol Pharmacol (2004) 17:15-25) y un agonista de FPR2 estable, BML-111, redujo la severidad de la artritis inducida por colageno (Zhang y col., (2008) Inflamm Res 57:157-162), lo que demuestra un posible uso de los agonistas de FPR2 en el tratamiento de la artritis reumatoide. Los ratones con lesion pulmonar aguda (ALI) mostraron una reduccion de la inflamacion pulmonar cuando fueron tratados con lipoxina A4 estable (Jin y col., (2007) Anesth Analg 104:369-377). Se han descrito niveles mas bajos de lipoxina A4 en el asma grave (Celik y col., (2007) Clin Exp Allergy 37:14941501; Planaguma y col., (2008) Am J Respir Crit Care Med 178:574-582) y una mejora en las respuestas del asma en modelos de animales por parte de analogos de lipoxina A4 estable (Levy y col., (2002) Nat Med 8:1018-1023; Levy y col., (2007) FASEb J 21:3877-3884). En la fibrosis qrnstica se demostro que los niveles de lipoxina A4 pulmonar estan disminuidos tanto en el pulmon de los pacientes con fibrosis qrnstica como en modelos de animales de la enfermedad (Karp y col., (2004) Nat Immunol 5:388-392); el tratamiento con un analogo de lipoxina estable mejoro la acumulacion de celulas inflamatorias dentro del pulmon enfermo y redujo la perdida de peso corporal en los mismos animales (Karp y col., (2004) Nat Immunol 5:388-392). El tratamiento topico con lipoxina A4 aumenta la reepitelizacion y disminuye la inflamacion de la superficie de la cornea seca (Gronert, (2005) Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 73:221-229; Gronert y col., (2005) J Biol Chem 280:15267-15278), lo que demuestra un posible uso de los agonistas de FPR2 en el tratamiento de la queratoconjuntivitis seca. La administracion oral de analogos de lipoxina A4 redujo la gravedad de la colitis en un modelo de enfermedad intestinal inflamatoria en ratones (Gewirtz y col., (2002) Eicosanoids and other Bioactive Lipids in Cancer, Inflammation, and Radiation Injury, Kluwer Academic/Plenum Publishers, 229-236). Tambien se identifico al ALXR como un receptor funcional de diversos peptidos, incluyendo un fragmento de la protema prion, un peptido derivado de la gp120 de la cepa del virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 lai, y beta amiloide 1-42 (Ab42) (para una recapitulacion, vease Le y col., Protein Pept Lett., 2007, 14, 846-853), y se ha sugerido que participa en la patogenia de la enfermedad de Alzheimer (EA) de diversas maneras cruciales (Yazawa y col., FASEB J., 2001, 15, 2454-2462). La activacion de ALXR en macrofagos y en celulas microgliales inicia una cascada de senalizacion mediada por la protema G que aumenta la migracion celular direccional, la fagocitosis y la liberacion de mediadores. Estos acontecimientos pueden explicar el reclutamiento de celulas mononucleares en la cercama de las placas seniles en las areas enfermas del cerebro con EA, en el que se sobreproduce y se acumula Ab42. Aunque la acumulacion de leucocitos en los sitios de lesion tisular se puede considerar una respuesta de huesped innata dirigida a la eliminacion de agentes nocivos, los fagocitos mononucleares activados tambien liberan una diversidad de sustancias, tales como aniones de superoxido, que pueden ser toxicas para las neuronas. De esta manera, el ALXR puede participar en las respuestas proinflamatorias generadas por Ab42 en el cerebro con EA y exacerbar la evolucion de la enfermedad. Ademas, la humanina es un ligando de alta afinidad para el ALXR y es neuroprotector en modelos de enfermedad de Alzheimer (Mamiya y col., (2001) Br J Pharmacol 134:1597-1599; Ying y col., (2004) J Immunol 172:7078-7085; Miao y col., (2008) Neuropeptides 42:557-567).

Las propiedades biologicas de los agonistas de ALXR incluyen, pero sin limitacion, migracion/ activacion de celulas monocitos/macrofagos/microglfa/dendnticas, migracion/activacion de neutrofilos, regulacion de la activacion, proliferacion y diferenciacion de linfocitos, regulacion de la inflamacion, regulacion de la produccion y/o liberacion de citocinas, regulacion de la produccion y/o liberacion de mediadores proinflamatorios, regulacion de la reaccion inmunitaria.

La presente invencion proporciona derivados de espiro[2.4]heptano puenteados sustituidos con difluoroetil-oxazol, que son agonistas no peptfdicos del receptor de aLx humano. Otros derivados de espiro[2.4]heptano puenteados con actividad agonista sobre el receptor de ALX humano se han divulgado en los documentos Wo 2010/134014, WO2011/163502, WO2012/066488, WO2013/009543, WO2013/171694 y WO2013/171687. Se han divulgado

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diferentes derivados de espiro[2.4]heptano puenteados en el documento WO95/02587. Los compuestos son utiles para la prevencion o el tratamiento de enfermedades que responden a la modulacion del receptor de ALX, tales como enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias, afecciones alergicas, infecciones retrovirales mediadas por el VIH, trastornos cardiovasculares, neuroinflamacion, trastornos neurologicos, dolor, enfermedades mediadas por priones y trastornos mediados por amiloides (en especial, la enfermedad de Alzheimer); asimismo, son utiles para la prevencion o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y para la modulacion de respuestas inmunitarias (en especial, aquellas generadas por la vacunacion).

A continuacion en el presente documento, se presentan diversas realizaciones de la invencion:

1) La presente invencion se refiere a compuestos de formula (I),

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en la que los sustituyentes en el anillo piperidina estan en disposicion trans; y a las saltes (en particular, las sales farmaceuticamente aceptables) de tales compuestos.

Para evitar cualquier duda, la configuracion de los compuestos de formula (I) segun una realizacion 1) es tal que los dos sustituyentes de amida en el resto espiro[2.4]heptano puenteado estan en disposicion trans y que el resto ciclopropilo esta en relativa proximidad a la amida sustituida con piperidina (posicion exo).

Para evitar cualquier duda, los compuestos de formula (I) se denominan por analogfa con el siguiente ejemplo:

el estereoisomero puro de estructura

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se denomina (1S,2R,3R,4R)-W2-((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-W3-((3S,4S)-3-fluoropiperidin-4-

il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida.

Los compuestos de formula (I) segun la realizacion 1) pueden contener uno o mas centros estereogenicos o asimetricos, tales como uno o mas atomos de carbono asimetricos. Los sustituyentes en un doble enlace pueden estar presentes en la configuracion (Z) o (E), a menos que se indique lo contrario. De este modo, los compuestos de formula (I) pueden estar presentes como mezclas de estereoisomeros o, preferentemente, como estereoisomeros puros. Las mezclas de estereoisomeros se pueden separar de una manera conocida por el especialista en la materia.

2) Una realizacion preferida de la invencion se refiere a compuestos de formula (I) segun la realizacion 1), que

tambien son compuestos de formula (Isti),

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en la que los sustituyentes en el anillo de piperidina estan en disposicion trans; y a las saltes (en particular, las sales farmaceuticamente aceptables) de tales compuestos.

3) Un compuesto preferido de formula (I) segun se define en la realizacion 1) es:

(1S,2R,3R,4R)-N2-((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-N3-((3S,4S)-3-fluoropiperidin-4-

il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida;

o una sal (en particular, una sal farmaceuticamente aceptable) de tal compuesto.

4) Otro compuesto preferido de formula (I) segun se define en la realizacion 1) es:

(1S,2R,3R,4R)-N2-((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-N3-((3R,4R)-3-fluoropiperidin-4-

il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida;

o una sal (en particular, una sal farmaceuticamente aceptable) de tal compuesto.

La presente invencion tambien incluye compuestos isotopicamente marcados, en especial los compuestos de formula (I) marcados con 2H (deuterio), compuestos que son identicos a los compuestos de formula (I), salvo que uno o mas atomos han sido reemplazados, cada uno, por un atomo que tiene el mismo numero atomico pero una masa atomica diferente de la masa atomica encontrada habitualmente en la naturaleza. Los compuestos de formula (I) isotopicamente marcados, en especial los marcados con 2H (deuterio) y las sales de los mismos se encuentran dentro del alcance de la presente invencion. La sustitucion de hidrogeno con el isotopo 2H (deuterio) mas pesado puede conducir a una mayor estabilidad metabolica, lo que da como resultado, por ejemplo, una mayor semivida in vivo o menores requisitos de dosificacion, o puede conducir a una menor inhibicion de las enzimas del citocromo P450, lo que da como resultado, por ejemplo, un mejor perfil de seguridad. En una realizacion de la invencion, los compuestos de formula (I) no estan marcados isotopicamente, estan marcados unicamente con uno o mas atomos de deuterio. En una subrealizacion, los compuestos de formula (I) no estan marcados isotopicamente en absoluto. Los compuestos de formula (I) isotopicamente marcados se pueden preparar por analogfa con los procedimientos descritos mas adelante en el presente documento, pero usando una variante isotopica adecuada de los reactivos o materias primas.

La expresion “sales farmaceuticamente aceptables” se refiere a sales que conservan la actividad biologica deseada del presente compuesto y presentan mmimos efectos toxicologicos no deseados. Tales sales incluyen sales de adicion de acidos y/o bases inorganicas u organicas, dependiendo de la presencia de grupos basicos y/o acidos en el presente compuesto. A modo de referencia, vease, por ejemplo, 'Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use', de P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.), Wiley-VCH, 2008 y 'Pharmaceutical Salts and Co-crystals', de Johan Wouters y Luc Quere (Eds.), RSC Publishing, 2012.

Cuando se usa la forma plural para los compuestos, sales, composiciones farmaceuticas, enfermedades y similares, se pretende decir tambien un unico compuesto, sal, composicion farmaceutica, enfermedad o similar.

Los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para su uso como medicamentos. En particular, los compuestos de formula (I) modulan el receptor de ALX, es decir, actuan como agonistas del receptor de ALX, y son utiles para la prevencion o el tratamiento de enfermedades que responden a la activacion del receptor de ALX, tales como enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias, afecciones alergicas, infecciones retrovirales mediadas por el VIH, trastornos cardiovasculares, neuroinflamacion, trastornos neurologicos, dolor, enfermedades mediadas por priones, leucemias y trastornos mediados por amiloides (en especial, la enfermedad de Alzheimer); asimismo, son utiles para la modulacion de respuestas inmunitarias (en especial, aquellas generadas por la vacunacion).

En particular, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de enfermedades seleccionadas entre enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias y afecciones alergicas.

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Las enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las v^as respiratorias y afecciones alergicas incluyen, pero sin limitacion, uno, varios o todos los siguientes grupos de enfermedades y trastornos:

1) Lesion pulmonar aguda (ALI); smdrome de dificultad respiratoria aguda/edema pulmonar fulminante (ARDS); enfermedad pulmonar obstructiva cronica, de las v^as respiratorias o del pulmon (EPOC, COAD o COLD), incluyendo bronquitis cronica o disnea asociada a la misma; enfisema; asf como la exacerbacion de la hiperreactividad de las vfas respiratorias consecuente de otra terapia farmacologica, en particular otra terapia farmacologica inhalatoria. En especial, las enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias y afecciones alergicas incluyen EPOC, COAD y COLD.

2) Otras enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias y afecciones alergicas incluyen bronquitis de cualquier tipo u origen.

3) Otras enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias y afecciones alergicas incluyen bronquiectasia y neumoconiosis de cualquier tipo u origen.

4) Otras enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias y afecciones alergicas incluyen asma de cualquier tipo u origen, incluyendo asma intrmseca (no alergica) y asma extrmseca (alergica), asma leve, asma moderada, asma grave, asma bronquftica, asma inducida por ejercicio, asma ocupacional y asma inducida posterior a una infeccion bacteriana.

5) En una realizacion adicional, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o sus las farmaceuticamente aceptables de los mismos, son particularmente adecuados para la prevencion o el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Las enfermedades inflamatorias incluyen uno, varios o todos los siguientes grupos de enfermedades y trastornos:

5a) En particular, las enfermedades inflamatorias se refieren a trastornos relacionados con los neutrofilos, en especial trastornos relacionados con los neutrofilos de las vfas respiratorias, incluyendo hiperneutrofilia, ya que afecta las vfas respiratorias y/o los pulmones. Otros trastornos relacionados con los neutrofilos tambien incluyen gingivitis, periodontitis, glomerulonefritis y fibrosis qmstica.

5b) Otras enfermedades inflamatorias incluyen enfermedades cutaneas, tales como soriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atopica, dermatitis herpetiforme, escleroderma, vasculitis por hipersensibilidad, urticaria, lupus eritematoso, lupus discoide y epidermolisis.

5c) Otras enfermedades inflamatorias tambien se refieren a enfermedades o afecciones que tienen un componente inflamatorio. Las enfermedades o afecciones que tienen un componente inflamatorio incluyen, pero sin limitacion, enfermedades y afecciones que afectan al ojo, tales como uveitis (anterior, intermedia y posterior), uveitis del smdrome de Behget, conjuntivitis, queratoconjuntivitis seca, smdrome de queratoconjuntivitis seca de Sjogren, y conjuntivitis primaveral; enfermedades que afectan a la nariz, incluyendo rinitis y rinitis alergica (y especialmente rinitis alergica); y enfermedades inflamatorias en las que estan implicadas reacciones autoinmunitarias o que poseen un componente o una etiologfa autoinmunitaria, tales como lupus sistemico eritematoso, espondilitis anquilosante, smdrome de Behget, smdrome de Sjogren, policondritis, escleroderma, granulomatosis de Wegener, arteritis de celulas gigantes, dermatosis neutrofflicas, dermatomiositis, hepatitis activa cronica, miastenia grave, smdrome de Stevens-Johnson, esprue idiopatico, enfermedad intestinal inflamatoria autoinmunitaria (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), oftalmopatia endocrina, neumonitis cronica por hipersensibilidad, cirrosis biliar primaria, queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis pulmonar intersticial, artritis soriasica y glomerulonefritis.

5d) Otras enfermedades inflamatorias en las que estan implicadas reacciones autoinmunitarias o que tienen un componente o una etiologfa autoinmunitaria incluyen artritis reumatoide, tiroides de Hashimoto y diabetes tipo I o II.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales

farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento del rechazo al

trasplante de organos o tejidos, por ejemplo, para el tratamiento de los receptores de trasplantes de corazon, pulmon, corazon y pulmon combinados, hugado, rinon, pancreas, piel o cornea, y para la prevencion de la enfermedad de injerto frente a huesped, tal como la que a veces se produce tras el trasplante de medula osea, en particular, en el tratamiento del rechazo agudo o cronico de aloinjertos y xenoinjertos o en el trasplante de celulas productoras de insulina, por ejemplo, celulas de islotes pancreaticos.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales

farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de infecciones retrovirales mediadas por el VIH. Las infecciones retrovirales mediadas por el VIH incluyen, pero sin limitacion, uno, varios o todos los grupos de enfermedades y trastornos causados por las cepas VIH-1 y VIH-2, tales como GUN- 4v, GUN-7wt, AG204, AG206, AG208, HCM305, HCM308, HCM342, mSTD104 y HCM309.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales

farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de trastornos cardiovasculares. Los trastornos cardiovasculares se refieren a uno o mas estados de enfermedad del arbol cardiovascular (incluyendo el corazon) y a enfermedades de los organos dependientes. Los estados de enfermedad del arbol cardiovascular y las enfermedades de los organos dependientes incluyen, pero sin limitacion, trastornos del musculo cardfaco (cardiomiopatfa o miocarditis), tales como cardiomiopatfa idiopatica, cardiomiopatfa metabolica

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que incluye cardiomiopatfa diabetica, cardiomiopatfa alcoholica, cardiomiopatfa inducida por farmacos, cardiomiopatia isquemica y cardiomiopatfa hipertensiva; trastornos ateromatosos de los vasos sangumeos mayores (enfermedades macrovasculares), tales como la aorta, las arterias coronarias, las arterias carotidas, las arterias cerebrovasculares, las arterias renales, las arterias iftacas, las arterias femorales y las arterias poplfteas; trastornos toxicos, inducidos por farmacos y metabolicos (incluidos hipertensivos y/o diabeticos) de los vasos sangumeos pequenos (enfermedades microvasculares), tales como las arteriolas retinianas, las arteriolas glomerulares, los vasos nerviosos, las arteriolas ca^acas, y los lechos capilares asociados del ojo, el rinon, el corazon, y los sistemas nerviosos central y periferico; y la ruptura de placas de lesiones ateromatosas en vasos sangumeos mayores, tales como la aorta, las arterias coronarias, las arterias carotidas, las arterias cerebrovasculares, las arterias renales, las arterias iftacas, las arterias femorales y las arterias poplfteas.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de la neuroinflamacion. La neuroinflamacion se refiere a produccion de moleculas de senalizacion celular, activacion de la glia o vfas y respuestas de activacion gliales, citocinas o quimiocinas proinflamatorias, activacion de astrocitos o vfas y respuestas de activacion de astrocitos, activacion de microglia o vfas y respuestas de activacion microgliales, respuestas relacionadas con estres oxidativas tales como produccion de oxido nftrico sintasa y acumulacion de oxido nftrico, protemas de fase aguda, perdida de sinaptofisina y protema post sinaptica de densidad 95 (PSD-95), componentes de la cascada de complementos, perdida o reduccion de la funcion sinaptica, actividad de la protema quinasa (por ejemplo, actividad de la protema quinasa asociada a la muerte), deficiencias conductuales, dano celular (por ejemplo, dano celular neuronal), muerte celular (por ejemplo, muerte celular neuronal), y/o deposicion de p amiloide de placas amiloides.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de trastornos neurologicos. En particular, los trastornos neurologicos incluyen, pero sin limitacion, epilepsia, apoplejfa, isquemia cerebral, paralisis cerebral, esclerosis multiple remitente reincidente, esclerosis multiple progresiva, neuromielitis optica, smdrome cftnicamente aislado, enfermedad de Alpers, esclerosis lateral amiotrofica (ALS), demencia senil, demencia con cuerpos de Lewy, smdrome de Rett, traumatismo de medula espinal, lesion cerebral traumatica, neuralgia del trigemino, polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica, smdrome de Guillain-Barre, neuralgia glosofarmgea, paralisis de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, atrofia muscular progresiva, atrofia muscular bulbar progresiva hereditaria, smdromes de discos vertebrales herniados, rotos o prolapsados, espondilosis cervical, trastornos del plexo, smdromes de destruccion de salida toracica, neuropatfas perifericas, deterioro cognitivo leve, deterioro cognitivo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y corea de Huntington.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales

farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento del dolor. El dolor

incluye, pero sin limitacion, dolor neuropatico ejemplificado por afecciones tales como neuropatfa diabetica, neuralgia postherpetica, neuralgia del trigemino, polineuropatfa diabetica dolorosa, dolor postapoplejfa, dolor postamputacion, dolor mielopatico o radiculopatico, dolor facial atfpico y smdromes tipo causalgia.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales

farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de enfermedades mediadas por priones. Las enfermedades mediadas por priones, tambien conocidas como encefelopatfas espongiformes transmisibles (TSE), incluyen, pero sin limitacion, kuru, smdrome de Gerstmann-Straussler- Scheinker (SGS), insomnio familiar letal (ILF) y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ).

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales

farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para el tratamiento de trastornos mediados por amiloides. Los trastornos mediados por amiloides se definen como enfermedades y trastornos que son causados por amiloides o protemas tipo amiloides, o que se asocian con ellos. Las enfermedades y los trastornos causados por amiloides o protemas tipo amiloides, o que se asocian con ellos, incluyen, pero sin limitacion, enfermedad de Alzheimer (AD), incluyendo enfermedades o afecciones caracterizadas por una perdida de la capacidad cognitiva de la memoria, tales como, por ejemplo, deterioro cognitivo leve (MCI); demencia con cuerpos de Lewy; smdrome de Down; hemorragia cerebral con amiloidosis. En otra realizacion, las enfermedades y los trastornos causados por amiloides o protemas tipo amiloides, o que se asocian con ellos, incluyen paralisis supranuclear progresiva, amiloidosis de amiloide de cadena liviana, neuropatfas amiloides familiares, esclerosis multiple, enfermedad de Creutzfeld Jakob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, esclerosis lateral amiotrofica (ALS), miositis de cuerpos de inclusion (IBM), diabetes de inicio en la edad adulta y amiloidosis cardfaca senil.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la modulacion de las respuestas inmunitarias. La modulacion de las respuestas inmunitarias incluye, pero sin limitacion, procedimientos basados en la administracion a un sujeto de una composicion de al menos un antfgeno y al menos un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. En algunos casos, la composicion que contiene el antfgeno se administra primero, seguida de la administracion de una composicion de al menos un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente

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aceptables de los mismos. En otros casos, la composicion que contiene el antigeno se administra en ultimo lugar. Las diferentes composiciones se pueden administrar de manera simultanea, cercanas en secuencia, o separadas en el tiempo. Estos procedimientos y composiciones se proporcionan para fines de inmunizacion terapeutica y profilactica (es decir, la deliberada provocacion, potenciacion, intensificacion o modulacion de una respuesta inmunitaria adaptativa y/o innata). Las ventajas particulares pueden incluir una o mas de las siguientes:

1) una respuesta inmunitaria acelerada tras la administracion de al menos un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y el antigeno, en comparacion con la administracion del antigeno unicamente;

2) una mayor sensibilidad a pequenas cantidades de antfgeno (por ejemplo, una toxina o patogeno) o antfgenos que habitualmente no inducen respuestas inmunitarias fuertes; y

3) terapias antitumorales mas eficaces.

Ademas, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de fibrosis qrnstica, fibrosis pulmonar, hipertension pulmonar, curacion de heridas, nefropatfa diabetica, reduccion de la inflamacion en tejido trasplantado y enfermedades inflamatorias causadas por organismos patogenos.

En especial, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de enfermedades seleccionadas entre uno, varios o todos los siguientes grupos de enfermedades y trastornos:

1) enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias y afecciones alergicas tales como lesion pulmonar aguda (ALI); smdrome de dificultad respiratoria aguda/edema pulmonar fulminante (ARDS); enfermedad pulmonar obstructiva cronica, de las vfas respiratorias o del pulmon (EPOC, COAD o COLD), incluyendo bronquitis cronica o disnea asociada con la misma; y asma de cualquier tipo u origen, incluyendo asma intrmseca (no alergica) y asma extrmseca (alergica), asma leve, asma moderada, asma grave, asma bronqmtica, asma inducida por ejercicio, asma ocupacional y asma inducida tras una infeccion bacteriana;

2) enfermedades inflamatorias tales como trastornos relacionados con los neutrofilos, en especial trastornos relacionados con los neutrofilos de las vfas respiratorias, incluyendo hiperneutrofilia, ya que afecta a las vfas respiratorias y/o los pulmones; periodontitis; glomerulonefritis; fibrosis qrnstica; y enfermedades cutaneas, tales como soriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atopica, dermatitis herpetiforme, escleroderma, vasculitis por hipersensibilidad, urticaria, lupus eritematoso y epidermolisis;

3) enfermedades que tienen un componente inflamatorio, tales como enfermedades y afecciones que afectan al ojo, tales como conjuntivitis, queratoconjuntivitis seca y conjuntivitis primaveral; enfermedades inflamatorias en las que estan implicadas reacciones autoinmunitarias o que poseen un componente o una etiologfa autoinmunitaria; y enfermedad intestinal inflamatoria autoinmunitaria (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn);

4) infecciones retrovirales mediadas por el VIH, tales como enfermedades y trastornos causados por cepas VIH- 1 y VIH-2, tales como GUN-4v, GUN-7wt, AG204, AG206, AG208, HCM305, HCM308, HCM342, mSTD104 y HCM309;

5) neuroinflamacion, que se refiere a produccion de moleculas de senalizacion celular, activacion de glia o vfas y respuestas de activacion gliales, citocinas o quimiocinas proinflamatorias, activacion de astrocitos o vfas y respuestas de activacion de astrocitos, activacion de microglia o vfas y respuestas de activacion microgliales, respuestas relacionadas con estres oxidativas tales como deposicion de p amiloide de placas amiloides;

6) trastornos neurologicos, tales como apoplejfa, isquemia cerebral, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson;

7) enfermedades mediadas por priones, tambien conocidas como encefalopatfas espongiformes transmisibles (TSE), tales como kuru, smdrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), insomnio familiar letal (FFI) y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD);

8) trastornos mediados por amiloides;

9) fibrosis qrnstica, curacion de heridas y enfermedades inflamatorias causadas por organismos patogenos.

Mas preferentemente, los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, son adecuados para la prevencion o el tratamiento de enfermedades seleccionadas entre el grupo que consiste en lesion pulmonar aguda (ALI); asma; fibrosis qrnstica; queratoconjuntivitis seca; enfermedad intestinal inflamatoria; artritis reumatoide; y enfermedad de Alzheimer.

La invencion tambien se refiere al uso de un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a

4) para la preparacion de composiciones farmaceuticas para el tratamiento y/o la profilaxis de las enfermedades mencionadas anteriormente.

La presente invencion tambien se refiere a sales farmaceuticamente aceptables y a composiciones y formulaciones farmaceuticas de compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4).

Una composicion farmaceutica segun la presente invencion contiene al menos un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4) (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo) como agente activo y

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opcionalmente vetuculos y/o diluyentes y/o adyuvantes.

Los compuestos de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4) y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos se pueden usar como medicamentos, por ejemplo, en forma de composiciones farmaceuticas para administracion enterica (tal como administracion oral especialmente) o parenteral (incluida la aplicacion topica o inhalacion).

La produccion de las composiciones farmaceuticas se puede efectuar de una manera que sea conocida para cualquier experto en la materia (vease, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21a edicion (2005), Parte 5, “Pharmaceutical Manufacturing” [publicado por Lippincott Williams & Wilkins]) combinando los compuestos de formula (I) descritos, o sus sales farmaceuticamente aceptables, opcionalmente en combinacion con otras sustancias terapeuticamente valiosas, hasta dar una forma de administracion galenica junto con materiales de vetuculo adecuados, no toxicos, inertes, terapeuticamente compatibles, solidos o lfquidos, y, si asf se desea, adyuvantes farmaceuticos utiles.

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno mencionado en el presente documento, que comprende administrar a un sujeto una cantidad farmaceuticamente activa de un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las realizaciones 1) a 4), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Toda referencia a un compuesto de formula I o Isti en este texto debe entenderse como una referencia tambien a las sales (y especialmente a las sales farmaceuticamente aceptables) de tales compuestos, segun corresponda y resulte conveniente. Las preferencias indicadas para los compuestos de formula I por supuesto se aplican mutatis mutandis a los compuestos de formula Isti, asf como a las sales y las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de formula I o de formula Isti. Lo mismo se aplica a estos compuestos como medicamentos, a composiciones farmaceuticas que contienen estos compuestos como principios activos o a los usos de estos compuestos para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades segun la presente invencion.

A menos que se use con referencia a temperaturas, el termino “aproximadamente” (o alternativamente “alrededor de”), ubicado antes de un valor numerico “X”, se refiere en la presente solicitud a un intervalo que se extiende desde X menos el 10 % de X hasta X mas el 10 % de X, y preferentemente a un intervalo que se extiende desde X menos el 5 % de X hasta X mas el 5 % de X. En el caso particular de las temperaturas, el termino “aproximadamente” (o alternativamente “alrededor de”), ubicado antes de una temperatura “Y”, se refiere en la presente solicitud a un intervalo que se extiende desde la temperatura Y menos 10 °C hasta Y mas 10 °C, y preferentemente a un intervalo que se extiende desde Y menos 5 °C hasta Y mas 5 °C. Ademas, el termino “temperatura ambiente” (ta), segun se usa en el presente documento, se refiere a una temperatura de aproximadamente 25 °C.

Siempre que se use el termino “entre” para describir un intervalo numerico, se entiende que los puntos finales del intervalo indicado estan explfcitamente incluidos en el intervalo. Por ejemplo, si un intervalo de temperatura se describe como entre 40 °C y 80 °C, esto significa que los puntos finales 40 °C y 80 °C estan incluidos en el intervalo; o si una variable se define como un numero entero entre 1 y 4, esto significa que la variable es el numero entero 1, 2, 3 o 4.

Los compuestos de formula (I) se pueden fabricar mediante los procedimientos proporcionados en los Ejemplos o mediante procedimientos analogos. Las condiciones de reaccion optimas pueden variar en funcion de los reactivos o disolventes particulares usados, pero tales condiciones podran ser determinadas por el experto en la materia a traves de procedimientos de optimizacion de rutina.

Parte experimental

Abreviaturas (segun se usan en el presente documento y en la descripcion anterior)

Ac

acetilo

AcCN

acetonitrilo

AcOH

acido acetico

ac.

acuoso

Boc

terc-butoxicarbonilo

p.eb.

punto de ebullicion

ca.

circa (aproximadamente)

COAD

enfermedad obstructiva cronica de las vfas respiratorias

COLD

enfermedad obstructiva cronica del pulmon

EPOC

enfermedad pulmonar obstructiva cronica

DAD

detector de matriz de diodos

DEA

dietilamina

Deoxo-Fluor

trifluoruro de bis(2-metoxietil)aminoazufre

DIPEA

diisopropiletilamina

DMEM

medio Eagle modificado por Dulbecco

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EDC

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Et2O

EtaN

EtOH

FC

FLIPR

FPRL1

FPRL2

h

Hank's BSS

HEPES

hept

VIH

HOBt

HPLC

IpAc

LC-MS

lem

lex

Me

MeOH

min

(m)M

|iM

MPLC

MS

nm

nM

RMN

org.

p

PG

rf

rpm

ta

sat.

TFA

THF

TLC

TMS

tR

UV

Vis

I. Quimica

dimetilformamida dimetilsulfoxido acetato de etilo

concentracion semimaxima eficaz

N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida

deteccion por dispersion de luz evaporativa

equivalente(s)

etilo

dietileter

trietilamina

etanol

cromatograffa en columna ultrarrapida en gel de sflice lector de placas de imagenes fluorescentes receptor de formil-peptido tipo 1 receptor de formil-peptido tipo 2 hora(s)

solucion salina equilibrada de Hank

acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfonico

heptano

virus de inmunodeficiencia humana hidroxibenzotriazol

cromatograffa ffquida de alto rendimiento acetato de isopropilo

cromatograffa ffquida - espectrometffa de masas

longitud de onda de emision

longitud de onda de excitacion

metilo

metanol

minuto(s)

(mili)molar

micromolar

cromatograffa ffquida de presion media espectrometffa de masas nanometro nanomolar

resonancia magnetica nuclear

organico

para

grupo protector factor de retencion revoluciones por minuto temperatura ambiente saturado

acido trifluoroacetico

tetrahidrofurano

cromatograffa en capa fina

trimetil-sililo

tiempo de retencion

ultravioleta

visible

General. Todas las temperaturas se indican en grados Celsius (°C). A menos que se indique lo contrario, las reacciones se llevan a cabo a ta.

La cromatograffa de capa fina (TLC) anafftica se realizo con placas de 0,2 mm: Merck, gel de sflice 60 F254. La cromatograffa de capa fina (TLC) preparativa se realizo con placas de 0,2 o 0,5 mm: Merck, gel de sflice 60 F254. La deteccion se llevo a cabo con uV o con una solucion de KMnO4 (3 g), K2CO3 (20 g), NaOH al 5 % (3 ml) y H2O (300 ml), con posterior calentamiento.

La cromatograffa ultrarrapida en columna (FC) y la filtracion se realizaron usando gel de sflice 60 Merck (0,0630,200 mm) o gel de sffice Macherey-Nagel (0,063-0,200 mm): elucion con EA, Et2O, hept., hexano, eter de petroleo, CH2Cl2, CHCl3, MeOH, NH4OH o mezclas de los mismos.

La MPLC se realizo usando columnas Isolute® SPE Flash SI II, de International Sorbent Technology, elucion con EA, Et2O, hept., hexano, CH2Cl2, CHCh, MeOH, NH4OH o mezclas de los mismos.

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Condiciones de LC-MS 01 (si no se indica lo contrario): analfticas: Thermo Finnigan MSQ Plus MS con bomba binaria Agilent 1100 y DAD. Columna: Zorbax SB-AQ 5 pm, 4,6 x 50 mm de DI de Agilent Technologies. Eluyentes: A: H2O + 0,04 % de TFA; B: CH3CN; Gradiente: 5 % de B ^ 95 % de B en 1 min. Flujo: 4,50 ml/min. Deteccion: UV/Vis y/o ELSD, y MS, tR se proporciona en min.

Condiciones de LC-MS 02 (si no se indica lo contrario): analfticas: bomba binaria Dionex HPG-3000, MS: Thermo MSQ MS, DAD: dionex 3000RS, ELSD: Sedere Sedex 85. Columna: Atlantis T3, 5 um, 4,6 x 30 mm de Waters, con termostato en el compartimento Dionex TCC-3200. Eluyentes: A: H2O + 0,04 % de TFA; B: CH3CN; Gradiente: 5 % de B ^ 95 % de B en 1,00 min. Flujo: 4,5 ml/min. Deteccion: UV/Vis y/o ELSD, y MS, tR se proporciona en min.

Condiciones de LC-MS 03 (si no se indica lo contrario): analfticas: bomba: Dionex HPG-3200RS, MS: Thermo MSQ Plus, DAD: Dionex DAD-3000RS, ELSD: Sedere Sedex 85. Columna: Zorbax SB-AQ 3,5 pm, 4,6 x 50 mm de DI de Agilent Technologies, con termostato en el compartimento Dionex TCC-3200. Eluyentes: A: H2O + 0,04 % de TFA; B: CH3CN. Procedimiento: gradiente: 5 % de B ^ 95 % de B en 1,00 min. Flujo: 4,5 ml/min. Deteccion: UV/Vis y/o ELSD, y MS, tR se proporciona en min.

Condiciones de LC-MS 04 (si no se indica lo contrario): analfticas: bomba: Agilent _G4220A_, MS: Thermo MSQ Plus, DAD: Agilent _G4212A_, ELSD: Sedere Sedex 90. Columna: Zorbax SB-AQ 3,5 pm, 4,6 x 50 mm de DI de Agilent Technologies, con termostato en el compartimento Dionex TCC-3200. Eluyentes: A: H2O + 0,04 % de TFA; B: CH3CN. Elaboracion del eluyente: CH3CN / H2O 7:3 a 0,250 ml/min. Procedimiento: gradiente: 5 % de B ^ 95 % de B en 1,07 min. Flujo: 4,5 ml/min. Deteccion: UV/Vis y/o ELSD, y MS, tR se proporciona en min.

HPLC preparativa: X-Bridge C18 5 pm, 50 x 19 mm de DI de Waters. Eluyentes: A: H2O + 0,5% de NH4OH; B: CH3CN; Gradiente: 10 % de B ^ 90 % de B en 5 min. Flujo: 40,0 ml/min. Deteccion: UV/Vis y/o ELSD, y MS, tR se proporciona en min.

HPLC quiral, analftica: (R,R) Whelk-01 250 x 4,6 mm de DI, 5 pm. Eluyente A (80 %): heptano + 0,05 % de DEA. Eluyente B (20 %): etanol + 0,05 % de DEA. Flujo: 0,8 ml/min. Deteccion: UV/Vis, tR se proporciona en min.

RMN: Bruker Avance 400 (400 MHz); Varian Mercury 300 (300 MHz); los desplazamientos qmmicos se proporcionan en ppm relativos al disolvente usado; multiplicidades: s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuadruplete, p = pentuplete, hex = hexteto, hept = hepteto, m = multiplete, br = ancho; las constantes de acoplamiento se dan en Hz.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion, pero no limitan el alcance de la misma en absoluto.

Sintesis de intermediarios:

Procedimiento general A: desproteccion de Boc

En un vial de vidrio, en atmosfera inerte (N2), una solucion de la amina Boc protegida (1,0 eq.) en CH2Cl2 se trato con HCl 4N en dioxano (10,0 eq.), y la mezcla de reaccion se agito a 0 °C o a ta hasta que se completo la reaccion. La mezcla de reaccion se concentro despues a presion reducida, y el residuo se purifico, cuando fue necesario, por FC o HPLC para proporcionar el compuesto deseado.

Espiro[2.4]hepta-4,6-dieno:

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), una mezcla de cloruro de benciltrietilamonio (18,0 g, 78 mmol) en solucion acuosa al 50 % de NaOH (1,2 l) se calento hasta 45 °C. Una solucion enfriada de ciclopentadieno (formada por ruptura del dfmero de ciclopentadieno a 180 °C, 140 ml, 1,70 mol) en 1,2-dicloroetano (122 ml, 1,55 mol) se anadio a la solucion agitada de NaOH mientras se mantema la temperatura interna por debajo de 55 °C. Tras completarse la adicion (ca. 1,75 h), la mezcla de reaccion se agito a 50 °C durante 2 h y se dejo enfriar hasta ta. Las capas se separaron, la capa organica se lavo con 1M NaOH, se seco (Na2SO4) y se filtro. El ftquido marron en bruto se destilo a presion reducida (0,085 MPa- 0,095 MPa (85-95 mbar)) y se obtuvo el compuesto del tftulo en forma de ftquido incoloro (bp = 45-50 °C a 0,008 MPa (80 mbar)). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 6,58 (m, 2H), 6,19 (m, 2H), 1,71 (s, 4H).

Reaccion de Diels Alder: formacion de (5R,6R)-5,6-bis-[(1-(1S)-etoxicarboml)-etoxi-carboml]-(4S,7R)-[4,7- etenilen-espiro[2.4]heptano]:

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En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de (£)-1,2-bis-[((1S)-1-etoxicarbonil)-etoxi-carbonil]-eteno (7,40 g, 22,7 mmol) en n-hexano (76 ml) se le anadio espiro[2.4]hepta-4,6-dieno (3,14 g, 34,0 mmol) a ta. La mezcla de reaccion se agito a esta temperature durante una noche. La mezcla se concentro a presion reducida y el residuo en bruto se purifico por FC (hept/EA, 9:1). Se obtuvo el compuesto del tftulo en forma de aceite amarillo palido. TLC: rf (hept/EA, 9:1) = 0,25. Condiciones de LC-MS 01: tR = 1,12 min; [M+H]+ = 409,00. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 6,44 (dd, J = 5,5, 3,0 Hz, 1 H), 6,32 (dd, J = 5,5, 2,8 Hz, 1 H), 5,12 (q, J = 7,1 Hz, 1 H), 5,06 (q, J = 7,1 Hz, 1 H), 4,28-4,14 (m, 4 H), 3,76 (app, t, J = 4,0 Hz, 1 H), 2,92 (d, J = 4,8 Hz, 1 H), 2,86 (m, 1 H), 2,80 (m, 1 H), 1,55-1,47 (m, 6 H), 1,29 (t, J = 7,3 Hz, 3 H), 1,29 (t, J = 7,3 Hz, 3 H), 0,70 (m, 1 H), 0,56-0,44 (m, 3 H).

Saponificacion: formacion de acido (4S,7R)-[4,7-etenMen-espiro[2.4]heptan]-(5R,6R)-5,6-bis-carboxnico:

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A una solucion de (5R,6R)-5,6-bis-[(1-(1S)-etoxicarbonil)-etoxi-carbonil]-(4S,7R)-[4,7-etenilen-

espiro[2.4]heptano] (9,51 g, 23,28 mmol) en THF/H2O (1:1, 232 ml) se le anadio LiOH (3,91 g, 93,13 mmol). La mezcla de reaccion se agito a ta durante una noche. Se anadio HCl 1N a fin de ajustar el pH de la mezcla de reaccion a pH = 3, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con EA (3x). Los extractos organicos combinados se secaron en MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por FC (CH2Cl2/MeOH, 9:1) para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de aceite incoloro. TLC: rf (CH2Cl2/MeOH, 9:1) = 0,31. Condiciones de LC-MS 01: tR = 0,72 min; [M+CHaCN+H]+ = 250,18.

Yodolactonizacion: formacion de acido 6-yodo-2-oxohexahidroespiro[3,5-metanciclopenta[b]furan-4,1'- ciclopropan]-7-carboxflico:

OH

A una solucion de acido (4S,7R)-[4,7-etenilen-espiro[2.4]heptan]-(5R,6R)-5,6-bis-carboxflico (5,60 g, 22,32 mmol) en CH2Cl2 (33 ml) se le anadio NaHCO3 (2,06 g, 24,56 mmol), agua (100 ml), KI (1,37 g, 82,60 mmol) e I2 (6,80 g, 26,79 mmol). La mezcla de reaccion se agito a ta durante 3 h. La reaccion se interrumpio mediante la adicion de solucion acuosa saturada de Na2S2O3. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con CH2O2 (3x). Los extractos organicos combinados se secaron en MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida.

La espuma en bruto se purifico por FC (EA) para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de solido blanco. TLC: rf (EA) = 0,33.

Esterificacion: formacion de 6-yodo-2-oxohexahidroespiro[3,5-metanciclopenta[b]furan-4,1'-ciclopropan]- 7-carboxilato de metilo:

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En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de acido 6-yodo-2-oxohexahidroespiro[3,5-metanciclopenta[b]furan-4,1'-ciclopropan]-7- carboxflico (5,00 g, 14,96 mmol) en MeOH seco (75 ml) se le anadio TMSCH2N2 (2,0 M en hexanos, 37,0 ml, 74,83 mmol). La mezcla de reaccion se agito a ta durante una noche, se concentro a presion reducida y se purifico por FC (hept/EA, 4:1) para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de solido blanco. TLC: rf (hept/EA, 4:1) = 0,18.

Retro-yodolactonizacion: formacion de acido (6R)-6-metoxicarbonN-(4S,7R)-[4,7-etenMen-

espiro[2.4]heptan]-(5R)-5-carboxflico:

imagen8

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de 6-yodo-2-oxohexahidroespiro[3,5-metanciclopenta[b]furan-4,1'-ciclopropan]-7-carboxilato de metilo (2,86 g, 8,21 mmol) en acido acetico (29 ml) se le anadio polvo de zinc (8,06 g, 123,23 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 65 °C durante 4 h, se enfrio hasta ta, se filtro, y se repartio entre agua y EA. Las capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo con EA (3x). Los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron en MgSO4, se filtraron, y se concentraron a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por FC (hept/EA, 1:1) y se obtuvo el compuesto del tftulo en forma de aceite incoloro. TLC: rf (hept/EA, 1:1) = 0,41.

Reduccion de doble enlace: formacion de acido (6R)-6-metoxicarbonN-(4S,7R)-[4,7-etMen-

espiro[2.4]heptan]-(5R)-5-carboxflico:

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En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), una suspension desoxigenada de acido (6R)-6-metoxicarbonil-(4S,7R)-[4,7-etenilen-espiro[2.4]heptan]- (5R)-5-carboxflico (220 mg, 0,99 mmol), Pd/C 10 % (44 mg) y ciclohexeno (0,20 ml, 1,98 mmol) en THF seco (2,5 ml) se agito a reflujo durante 2 h. La mezcla de reaccion se filtro a traves de Celite, y la torta de filtracion se lavo con THF. El filtrado se concentro a presion reducida, y se obtuvo el compuesto del tftulo en forma de solido blanco. TLC: rf (hept/EA, 2:3) = 0,48.

2-(dorometil)oxazol-4-carbaldehido:

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion enfriada a -78 °C de 2-(clorometil)oxazol-4-carboxilato de metilo (25,00 g, 142,00 mmol) en CH2Cl2 (475 ml) se le anadio una solucion 1M de hidruro de diisobutilaluminio en CH2Cl2 (285,00 ml, 285,00 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 3 horas a -78 °C. Se anadio metanol (125 ml) cuidadosamente, y la mezcla de reaccion se calento hasta ta. La mezcla de reaccion se diluyo despues con CH2O2 (500 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de sal de Rochelle. La capa organica se seco en MgSO4, se filtro, y el disolvente se retiro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de aceite color naranja. Condiciones de LC- MS 02: tR = 0,40 min; [M+CH3CN+H]+ = 187,44.

1-(2-(clorometil)oxazol-4-il)etanol:

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), una solucion de 2-(clorometil)oxazol-4-carbaldel'ndo (18,10 g, 124,36 mmol) en CH2Cl2 (625 ml) se trato a 0 °C con trimetilaluminio (311,00 ml de una solucion 2M en heptano, 621,80 mmol). La mezcla de reaccion se agito despues a 0 °C durante 60 min. Despues se anadio solucion acuosa saturada de NH4O y la capa acuosa se extrajo

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dos veces con CH2CI2 y dos veces con EA. Los extractos organicos combinados se secaron en MgSO4, se filtraron, y los disolventes se retiraron a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por FC (hept/EA, 3:7), y se obtuvo el compuesto del tftulo en forma de aceite amarillo. TLC: rf (hept/EA, 3:7) = 0,38. Condiciones de LC-Ms 02: tR = 0,43 min, [M+H]+ = 162,12.

1- (2-(dorometN)oxazol-4-N)etanona:

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), una solucion de 1-(2-(clorometil)oxazol-4-il)etanol (14,90 g, 92,20 mmol) en AcCN (458 ml) se trato a ta con MnO2 (44,54 g, 461,00 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 5 horas a ta antes de filtrarse a traves de Celite. El disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por MPLC (hept/EA,1:1), y se obtuvo el compuesto del tftulo en forma de solido blanco. TLC: rf (hept/EA, 1:1) = 0,50. Condiciones de LC-MS 02: tR = 0,47 min, [M+H]+ = 160,11.

2- (dorometM)-4-(1,1-difluoroetN)oxazol:

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), 1-(2-(clorometil)oxazol-4-il)etanona (1,55 g, 9,71 mmol) en CH2Cl2 (2,5 ml) se trato con Deoxo-Fluor (14,30 ml de una solucion al 50 % en tolueno, 38,90 mmol) y se agito a 45 °C durante 72 horas. La solucion se enfrio hasta 0 °C, se anadio NaOH 1M acuoso (35 ml) cuidadosamente (exotermico), y la mezcla resultante se diluyo con CH2Cl2. Las capas se separaron y la capa organica se lavo con solucion acuosa saturada de NaCl y agua, se seco en MgSO4, se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo se purifico por FC (hept/IpAc 5:1) para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de aceite amarillo. Condiciones de LC-MS 03: tR = 0,72 min, [M+H]+ = 182,06.

2-(azidometil)-4-(1,1-difluoroetil)oxazol:

En un matraz de fondo redondo, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), se anadio azida sodica (380 mg, 5,78 mmol) a una solucion de 2-(clorometil)-4-(1,1-difluoroetil)oxazol (1,00 g, 5,51 mmol) en DMF (25 ml) y se calento hasta 80 °C durante 4 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con agua y se extrajo con Et2O. La fase organica se seco en MgSO4, se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de aceite amarillo. Condiciones de LC-MS 04: tR = 0,73 min, [M+H]+ = 189,35.

(4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metanamina:

En un matraz de fondo redondo, equipado con barra de agitacion magnetica y condensador, a una solucion de 2- (azidometil)-4-(1,1-difluoroetil)oxazol (1,253 g, 6,66 mmol) en THF (90 ml) se le anadio trifenilfosfina en poliestireno (1,60 mmol/g, malla de 100-200, 2,096 g, 7,99 mmol) y agua (5 ml). La mezcla resultante se calento hasta 60 °C durante 3 horas. La mezcla se filtro y el filtrado se seco en MgSO4, se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo. Condiciones de LC-MS 04: tR = 0,24 min, [M+H]+ = 163,21.

Acoplamiento con (4-(1,1-difluoroetN)oxazol-2-N)metanamma: formacion de 3-(((4-(1,1-difluoroetil)oxazol- 2-N)metM)carbamoM)espiro[biddo[2.2.1]heptan-7,1'-ddopropan]-2-carboxMato de (1R,2R,3R,4S)-metilo:

imagen10

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de acido (6R)-6-metoxicarbonil-(4S,7R)-[4,7-etilen-espiro[2.4]heptan]-(5R)-5-carboxflico (1,00 g, 4,46 mmol) en CH2Cl2 seco (16 ml) se le anadieron 3 gotas de DMF y cloruro de oxalilo (0,426 ml, 4,93 mmol). La mezcla de reaccion se agito a ta durante 60 minutos y se concentro a presion reducida. A una solucion de (4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metanamina (0,723 g, 4,46 mmol) en piridina (1,08 ml) se le anadio una solucion de cloruro de acilo en acetona (6 ml). La mezcla de reaccion se agito a ta durante 1 h, se diluyo con EA y se lavo sucesivamente con HCl 1N acuoso, NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La capa organica se seco en MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por FC (hept -> hept/EA, 7:3) para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de aceite amarillo. Condiciones de LC-MS 04: tR = 0,84 min; [M+H]+ = 369,20.

Acido (1R,2R,3R,4S)-3-(((4-(1,1-difluoroetN)oxazol-2-N)metM)carbamoM)espiro[biddo[2.2.1]heptan-7,1'-

ddopropan]-2-carboxflico:

5

10

15

20

25

30

35

40

imagen11

A una solucion de 3-(((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)carbamoil)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-cidopropan]-

2- carboxilato de (1R,2R,3R,4S)-metilo (1,27 g, 3,45 mmol) en THF (20 ml) se le anadio NaOH 2N acuoso (16,0o ml, 32,00 mmol). La mezcla de reaccion se agito a ta hasta que se completo la reaccion. La mezcla se vertio despues en HCl 1N acuoso y se extrajo con EA (3x). Los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron en MgSO4, se filtraron, y se concentraron a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de espuma de color blanco. Condiciones de LC-MS 04: tR = 0,75 min; [M+H]+ = 355,25.

3- fluoro-4-oxopiperidm-1-carboxilato de ferc-butilo:

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de 4-oxopiperidin-1-carboxilato de ferc-butilo (5,00 g, 25,09 mmol) en dMf seca (25 ml) se le anadio cloruro de trimetilsililo (5,77 ml, 45,17 mmol), seguido de Et3N (8,38 ml, 60,23 mmol) a ta. La mezcla de reaccion se agito a 80 °C durante 24 h. La mezcla luego se enfrio hasta ta, se diluyo con hexanos y se lavo con NaHCO3 acuoso saturado. Las capas se separaron y la capa organica se seco en MgSO4, se filtro, y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por FC (hexanos/EA, 9:1) para proporcionar 4-((trimetilsilil)oxi)-5,6- dihidropiridin-1(2H)-carboxilato de ferc-butilo en forma de aceite incoloro. TLC: rf (hexanos/EA, 9:1) = 0,50.

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de 4-((trimetilsilil)oxi)-5,6-dihidropiridin-1(2H)-carboxilato de ferc-butilo (5,00 g, 18,40 mmol) en acetonitrilo seco (25 ml) se le anadio ditetrafluoroborato de 1-(clorometil)-4-fluoro-1,4- diazoniabiciclo[2.2.2]octano (7,55 g, 20,3 mmol) a ta. La mezcla de reaccion se agito a ta durante 2 horas, despues se vertio en EA y se lavo sucesivamente con NaHCO3 al 1 % acuoso y salmuera. La capa organica se seco en MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por FC (hexanos/EA, 4:1) para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de solido de color amarillo palido. Condiciones de LC-MS 03: tR = 0,55 min; [M- CH3+H]+ = 203,23; TLC: rf (hexanos/EA, 4:1) = 0,17.

4- amino-3-fluoropiperidin-1-carboxilato de frans-ferc-butilo y 4-amino-3-fluoropiperidin-1-carboxilato de c/s-ferc-butilo:

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de 3-fluoro-4-oxopiperidin-1-carboxilato de ferc-butilo (0,80 g, 3,68 mmol) en MeOH (10 ml) se le anadio acetato de amonio (1,99 g, 25,80 mmol), y la solucion resultante se agito a ta durante 2 horas. Despues se anadio NaCNBH3 (0,29 g, 4,42 mmol), y la solucion se agito a ta durante la noche. La mezcla de reaccion se concentro hasta la sequedad y los organicos se extrajeron con EA a partir de una solucion acuosa al 1 % de Na2CO3. Los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron en MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. El residuo se purifico con FC (CH2Ch/MeOH, 9:1) para proporcionar 4-amino-3- fluoropiperidin-1-carboxilato de frans-ferc-butilo como primer diastereomero de elucion y 4-amino-3- fluoropiperidin-1-carboxilato de c/'s-ferc-butilo como segundo diastereomero de elucion, ambos en forma de aceites incoloros, que se solidificaron tras dejarse en reposo. Diastereomero frans: condiciones de LC-MS 03: tR = 0,48 min; [M-CH3+H]+ = 204,25; TLC: rf (C^C^/MeOH, 9:1) = 0,30. Diastereomero c/s: condiciones de LC-MS 03: tR = 0,46; [M+H]+ = 219,26; TLC: rf (CH2Ch/MeOH, 9:1) = 0,09.

Preparacion de los Ejemplos:

4-((1R,2R,3R,4S)-3-(((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-N)metM)carbamoM)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'- ciclopropan]-2-ilcarboxamido)-3,4-frans-fluoropiperidin-1-carboxilato de ferc-butilo:

imagen12

imagen13

En un matraz de fondo redondo secado al fuego, equipado con barra de agitacion magnetica y en atmosfera inerte (N2), a una solucion de acido (1R,2R,3R,4S)-3-(((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-

il)metil)carbamoil)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2-carboxflico (0,200 g, 0,564 mmol) en CH2Cl2 (8,5

ml) se le anadio 4-amino-3-fluoropiperidin-1-carboxilato de trans-terc-butilo (0,148 g, 0,677 mmol), EDC.HCl (0,224 g, 1,130 mmol), HOBt (0,092 g, 0,68 mmol) y DIPEA (0,29 ml, 1,69 mmol). La mezcla de reaccion se agito a ta hasta que se completo la reaccion. Despues se anadio agua, las capas se separaron, y la capa organica se seco en MgSO4, se filtro, y se concentro a presion reducida. Los diastereomeros se separaron por fC (EA/hexanos, 7:3). 5 Primer diastereomero de elucion: condiciones de LC-MS 04: tR = 0,90 min; [M+H]+ = 555,29; TLC: rf (hexanos/EA, 3:7) = 0,54. Segundo diastereomero de elucion: condiciones de LC-MS 04: tR = 0,90 min; [M+H]+ = 555,30; TLC: rf (hexanos/EA, 3:7) = 0,35.

Ejemplo 1: (1S,2R,3R,4R)-W2-((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-W3-(trans-3-fluoropiperidm-4-

il)espiro[biciclo[2.2.l]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida (diastereoisomero 1):

10 Siguiendo el procedimiento general A, partiendo del primer diastereoisomero de elucion 4-((1R,2R,3R,4S)-3-(((4- (1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)carbamoil)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2-ilcarboxamido)-3,4- trans-fluoropiperidin-1-carboxilato de terc-butilo. Condiciones de LC-MS 04: tR = 0,62 min; [M+H]+ = 455,28. HPLC quiral, analftica: tR = 15,91 min.

Ejemplo 2: (1S,2R,3R,4R)-W2-((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-W3-(trans-3-fluoropiperidm-4-

15 il)espiro[biciclo[2.2.l]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida (diastereoisomero 2):

Siguiendo el procedimiento general A, partiendo del segundo diastereoisomero de elucion, 4-((1R,2R,3R,4S)-3- (((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)carbamoil)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2-ilcarboxamido)- 3,4-trans-fluoropiperidin-1-carboxilato de terc-butilo. Condiciones de LC-MS 04: tR = 0,61 min; [M+H]+ = 455,29. HPLC quiral, analftica: tR = 13,043 min.

20 II. Ensayos biologicos

Ensayo FLIPR (receptor de ALX)

Procedimiento experimental:

Mediciones de calcio intracelular:

Las celulas que expresan el receptor de ALX humano recombinante y la protema G Ga16 (HEK293-hALXR-Ga16) 25 se cultivaron hasta el 80 % de confluencia en medio de crecimiento (Gm). Las celulas se separaron de las placas de cultivo con un tampon de disociacion celular (Invitrogen, 13151-014) y se recogieron por centrifugacion a 1.000 rpm a ta durante 5 minutos en tampon de ensayo (AB) (partes iguales de BSS de Hank (Gibco, 14065-049) y DMEM sin rojo fenol (Gibco, 11880-028)). Despues de 60 minutos de incubacion a 37 °C en el 5% de CO2 en AB suplementado con 1 pM de Fluo-4 (AM) (Invitrogen, F14202) y 20 mM de HEPES (Gibco, 15630-056), las celulas 30 se lavaron y se resuspendieron en AB. Despues se sembraron en placas de ensayo FLIPR de 384 pocillos (Greiner, 781091) a razon de 50.000 celulas en 70 pl por pocillo y se sedimentaron por centrifugacion a 1.000 rpm durante 1 min. Se prepararon soluciones madre de los compuestos de ensayo a una concentracion de 10 mM en DMSO, y se diluyeron en serie en AB hasta las concentraciones requeridas para las curvas de respuesta a la dosis de activacion. Se uso WKYMVm (Phoenix Peptides) como agonista de referencia. Se opero un instrumento FLIPR Tetra (Molecular 35 Devices) segun las instrucciones estandar del fabricante, anadiendo 4 pl del compuesto de ensayo disuelto a 10 mM en DMSO y diluido antes del experimento en tampon de ensayo para obtener la concentracion final deseada. Los cambios en la fluorescencia se supervisaron antes y despues de la adicion de los compuestos de ensayo a lex=488 nm y lem=540 nm. Los valores pico de emision sobre el nivel de base tras la adicion de los compuestos se exportaron tras la sustraccion del valor basal. Los valores se normalizaron a un control de alto nivel (compuesto 40 WKYMVm, concentracion final de 10 nM) tras la sustraccion del valor basal (adicion de AB).

Las actividades agonistas con respecto al receptor de ALX (valores de EC50, mediana de n replicas) de los compuestos ejemplificados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

EC50

Compuesto

[nM]

Ejemplo 1:

6.6

(1S,2R,3R,4R)-W2-((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-W3-(trans-3-fluoropiperidm-4- il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida (diastereomero 1)

(n = 6)

Ejemplo 2:

3.6

(1S,2R,3R,4R)-W2-((4-(1,1-difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-W3-(trans-3-fluoropiperidm-4- il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida (diastereoisomero 2)

(n = 8)

5

10

15

20

25

30

35

Ensayo FLIPR (receptor de FPR1)

Procedimiento experimental:

Mediciones de calcio intracelular:

Las celulas que expresan el receptor de FPR1 humano recombinante y la protema G Ga16 (HEK293-hFPR1-Ga16) se cultivaron hasta el 80 % de confluencia en medio de crecimiento (GM). Las celulas se separaron de las placas de cultivo con un tampon de disociacion celular (Invitrogen, 13151-014) y se recogieron por centrifugacion a 1.000 rpm a ta durante 5 minutos en tampon de ensayo (AB) (partes iguales de BSS de Hank (Gibco, 14065-049) y DMEM sin rojo fenol (Gibco, 11880-028)). Despues de 60 minutos de incubacion a 37 °C en el 5 % CO2 en AB suplementado con 1 |jM de Fluo-4 (AM) (Invitrogen, F14202) y 20 mM de HEPES (Gibco, 15630-056), las celulas se lavaron y se resuspendieron en AB. Despues se sembraron en placas de ensayo FLIPR de 384 pocillos (Greiner, 781091) a razon de 50.000 celulas en 70 jl por pocillo, y se sedimentaron por centrifugacion a 1.000 rpm durante 1 min. Se prepararon soluciones madre de los compuestos de ensayo a una concentracion de 10 mM en DMSO, y se diluyeron en serie en AB hasta las concentraciones requeridas para las curvas de respuesta a la dosis de activacion. Se uso WKYMVm (Phoenix Peptides) como agonista de referencia. Se opero un instrumento FLIPR Tetra (Molecular Devices) segun las instrucciones estandar del fabricante, anadiendo 4 jl del compuesto de ensayo disuelto a 10 mM en DMSO y diluido antes del experimento en tampon de ensayo para obtener la concentracion final deseada. Los cambios en la fluorescencia se monitorearon antes y despues de la adicion de los compuestos de ensayo a lex=488 nm y lem=540 nm. Los valores pico de emision sobre el nivel de base tras la adicion de los compuestos se exportaron tras la sustraccion del valor basal. Los valores se normalizaron a un control de alto nivel (compuesto WKYMVm, concentracion final de 10 nM) tras la sustraccion del valor basal (adicion de AB).

Las actividades agonistas con respecto al receptor de FPR1 (valores de EC50, mediana de n replicas) de los compuestos ejemplificados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

EC50

Compuesto

[nM]

Ejemplo 1:

> 6000

(1S,2R,3R,4R)-W2-((4-(1,1-difluoroetN)oxazol-2-N)metM)-W3-(trans-3-fluoropiperidin-4- il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida (diastereomero 1)

(n = 4)

Ejemplo 2:

> 7000

(1S,2R,3R,4R)-W2-((4-(1,1-difluoroetM)oxazol-2-N)metM)-W3-(trans-3-fluoropiperidin-4- il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1'-ciclopropan]-2,3-dicarboxamida (diastereoisomero 2)

(n = 5)

Ensayo de estabilidad en plasma

El suero de rata o humano, ajustado a pH 7,4 con acido lactico o hidroxido de amonio, se equilibro a 37 °C en agitacion orbital en una incubadora que contema el 5 % de CO2. La reaccion se inicio mediante la adicion de 1 pM de los compuestos (1 pl de solucion madre 1 mM en DMSO en 999 pl de plasma). Al cabo de 0,01 h, 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h y 6 h, se transfirieron alfcuotas (30 pl) en una placa de 96 pocillos que contema 90 pl de MeOH colocada sobre hielo para detener la reaccion. Despues de someter a vortex durante 20 minutos a 1.400 rpm en una termomezcladora Eppendorf, las placas se centrifugaron a 3.220 g durante 20 minutos a 4 °C, y los sobrenadantes se analizaron por LC-MS/MS. Se prepararon muestras de calibracion en suero que conteman el 0,1 % de diclorvos (2,2-diclorovinildimetil fosfato) y se analizaron en paralelo hasta las muestras de incubacion para permitir la cuantificacion. Despues se calcularon las semividas (T1/2) en horas. Ademas, se determino la concentracion restante del respectivo compuesto despues del tiempo Tlast relativo a la concentracion del comienzo (Tabla 3).

Tabla 3: estabilidad en suero

compuesto

numero de replicas especie T1/2 [h] Tlast [h] concentracion restante a Tlast [%]

Ejemplo 1

1 humano >6 6 97

Ejemplo 1

1 rata >6 6 >100

(continuacion)

compuesto

numero de replicas especie T1/2 [h] Tlast [h] concentracion restante a Tlast [%]

Ejemplo 2

1 humano >6 6 >100

Ejemplo 2

1 rata >6 6 >100

Ensayo de union a proteinas plasmaticas

Los compuestos se anadieron a plasma humano ajustado a pH 7,4 con acido lactico o hidroxido de amonio 5 (concentracion final de 1 pM) y se dializaron mediante instrumentos de RED (dialisis de equilibrio rapida) frente a solucion salina con tampon de fosfato (0,1 M fosfato de sodio y 0,15M cloruro de sodio) 0,1 M, pH 7,4 durante 4 horas a 37 °C en una incubadora que contema el 5 % de CO2. Despues de la dialisis, se diluyo una alfcuota de plasma y tampon con igual volumen de la matriz opuesta para anular el efecto de la matriz, y se preparo una calibracion en la matriz mixta. Se transfirieron alfcuotas de muestras y calibraciones (30 pl) a una placa de 96 10 pocillos que contema 90 pl de MeOH para precipitar las proteinas. Despues de someter a vortex durante 20 minutos a 1400 rpm en una termomezcladora Eppendorf, las placas se centrifugaron en 3.220 g durante 20 min a 4 °C y los sobrenadantes se analizaron por LC-MS/MS. Las concentraciones del analito se usaron para el calculo de la fraccion unida al plasma. Se corrio propranolol [(±)-1-isopropilamino-3-(1-naftiloxi)-2-propanol], un compuesto de referencia, en paralelo.

compuesto

numero de replicas especie union a proteinas plasmaticas (%)

Ejemplo 1

3 Humana 54,8

Ejemplo 1

3 Rata 50,7

Ejemplo 2

3 Humana 63,8

Ejemplo 2

3 Rata 47,7

15

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de formula (I):

   imagen1

   en la que los sustituyentes en el anillo piperidina estan en disposicion trans; o una sal de dicho compuesto.
2. 2. Un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 1, que tambien es un compuesto de formula (Isti):

   imagen2

   en la que los sustituyentes en el anillo piperidina estan en disposicion trans; o una sal de dicho compuesto.
3. 3. Un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto es (1 S,2R,3R,4R)-N2-((4-(1,1- difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-N3-((3S,4S)-3-fluoropiperidin-4-il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1-ciclopropan]-2,3- dicarboxamida;

   o una sal de dicho compuesto.
4. 4. Un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto es (1S,2R,3R,4R)-N2-((4-(1,1- difluoroetil)oxazol-2-il)metil)-N3-((3R,4R)-3-fluoropiperidin-4-il)espiro[biciclo[2.2.1]heptan-7,1-ciclopropan]-2,3- dicarboxamida;

   o una sal de dicho compuesto.
5. 5. Un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso como medicamento.
6. 6. Una composicion farmaceutica que contiene, como principio activo, un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y al menos un excipiente terapeuticamente inerte.
7. 7. El uso de un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias, afecciones alergicas, infecciones retrovirales mediadas por el VIH, trastornos cardiovasculares, neuroinflamacion, trastornos neurologicos, dolor, enfermedades mediadas por priones y trastornos mediados por amiloides; y para la modulacion de las respuestas inmunitarias.
8. 8. Un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre enfermedades inflamatorias, enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias, afecciones alergicas, infecciones retrovirales mediadas por el VIH, trastornos cardiovasculares, neuroinflamacion, trastornos neurologicos, dolor, enfermedades mediadas por priones y trastornos mediados por amiloides; y para la modulacion de las respuestas inmunitarias.