ES2631804T3 - Tetrapéptidos derivados de quimiocinas humanas C-X-C útiles para el tratamiento de diversas afecciones de la piel - Google Patents

Abstract

Un tetrapéptido aislado que presenta actividad de reparación y regeneración de heridas que consiste en la secuencia peptídica (I o V)-X1-K-X2, donde X1 es E, Q o K, y X2 es M, F, I, W, V o L.

Description

DESCRIPCION

Tetrapeptidos derivados de quimiocinas humanas C-X-C utiles para el tratamiento de diversas afecciones de la piel

5 Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/835.424, presentada el 14 de junio de 2013.

CAMPO DE LA INVENClON

10 La presente invencion se refiere a tetrapeptidos que presentan actividad biologica, cosmetica y terapeutica. En particular, la invencion se refiere a tetrapeptidos que derivan de una region conservada de diversas quimiocinas C-X- C. Estos peptidos han mostrado actividad para promover la migracion de las celulas, la angiogenesis, para neutralizar el componente celular bacteriano, tales como las senales proinflamatorias inducidas por LTA, y para estimular la renovacion en la epidermis normal. La invencion tambien se refiere a metodos para usar estos peptidos 15 para promover la reparacion de heridas y tratar diversas afecciones en la piel y otras superficies del cuerpo, tales como la cavidad oral.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

20 Los queratinocitos y las celulas endoteliales dermicas son la principal fuente de factores solubles utiles para regular la cicatrizacion de las heridas y las ulceras en la piel. Las anormalidades debidas a una disminucion en actividades como la produccion de los factores de crecimiento, la respuesta angiogenica, la funcion de los macrofagos, la acumulacion del colageno, la funcion de barrera de la epidermis y la migracion y la proliferacion de los queratinocitos y de los fibroblastos pueden contribuir a una reparacion de heridas defectuosa. En los entornos clfnicos para tratar 25 heridas se han usado factores de crecimiento y citocinas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas (Rees et al, 1999) y GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos- macrofagos) que se ha demostrado que ejercen efectos beneficiosos en la cicatrizacion de heridas en pacientes que padecen diversas heridas y ulceras cutaneas cronicas de diversa etiologfa, incluyendo ulceras en las piernas relacionadas con hidroxiurea (Stagno et al, 1999), ulceras venosas en las piernas (Da Costa et al, 1999), ulceras 30 relacionadas con la hemoglobinopatfa (Voskaridou et al, 1999), y heridas resultantes de una amputacion (Gaches et al, 1998). Por otro lado, la administracion intradermica de GM-CSF en pacientes leprosos con lesiones en la piel conduce a una mayor cicatrizacion de heridas y un aumento del numero y de las capas de queratinocitos (Kaplan et al, 1992; Braunstein et al, 1994).

35 Tanto los factores de crecimiento como las citocinas son protefnas. Las dificultades con el uso de terapias proteicas para tratar heridas epidermicas estan a menudo relacionadas con el gran tamano de las protefnas implicadas. La estructura compleja y el coste de fabricacion de protefnas naturales son prohibitivos para un uso clfnico amplio. La estabilidad y la compatibilidad de tales protefnas naturales en la formulacion son tambien una preocupacion importante. La mala penetracion debido al gran tamano de las protefnas naturales para alcanzar la capa diana de la 40 piel reduce a menudo la eficacia y explica los efectos beneficiosos fallidos de la terapia de protefnas. Para superar estos problemas, los peptidos cortos que llevan la actividad de protefnas grandes deben cumplir la necesidad de una produccion menos costosa y rentable, y un manejo y manipulacion sencillos. Ademas, los peptidos bioactivos cortos son mejor absorbidos y retenidos por el tejido de la herida debido a una menor susceptibilidad a la proteasa. La ventaja de las caracterfsticas de absorcion de peptidos bioactivos cortos tambien los convierte en una opcion viable 45 para usos mas alla del cuidado de heridas agudas y cronicas, tal como para el tratamiento de los problemas de piel asociados con el envejecimiento y la exposicion al sol.

Las quimiocinas estan estructuralmente relacionadas y representan una gran superfamilia de protefnas de 8 a 150 kD que poseen diversas actividades biologicas. Por lo general, se secretan tras la estimulacion celular para controlar 50 el trafico de leucocitos durante la homeostasis, asf como durante la inflamacion, y son necesarias para la union entre la inmunidad innata y adaptativa. Junto con las moleculas de adhesion, tales como las integrinas y las selectinas, las quimiocinas y sus receptores actuan principalmente como parte de una compleja red molecular que facilita el movimiento selectivo de tipos celulares especfficos dentro y fuera del microambiente tisular diana (Key et al., 2003; Ono et al., 2003). Las quimiocinas median selectivamente el reclutamiento regional especffico de neutrofilos, 55 macrofagos y linfocitos. Ademas de ser factores quimiotacticos, las quimiocinas tambien desempenan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis, la angiogenesis/angioestasis, la diferenciacion y activacion celular, la cicatrizacion de heridas, el crecimiento y metastasis tumoral, la localizacion de linfocitos y el desarrollo de tejido linfoide, e influencia del balance general de tipo 1/tipo 2 de la respuesta inmune (Behm et al., 2012; Gillitzer et al., 2001; Raman et al., 2011; Romagnani et al., 2004; Rossi et al., 2000).

Definidas por un motivo de tetracistefna, las quimiocinas se subdividen en cuatro familias distintas de acuerdo con las configuraciones de los residuos de cistefna en su extremo amino. Existen dos subfamilias grandes, la subfamilia CCL (CCL1 a CCL28) y la subfamilia CXCL (CXCL1 a CXCL16), asf como dos subfamilias pequenas, subfamilia XCL (XCL1 a XCL2) y subfamilia CX3CL1 (Bacon et al., 2003). La subfamilia CXC de quimiocinas desempena un 5 papel importante en diversos procesos, incluyendo inflamacion, cicatrizacion de heridas, regulacion del crecimiento, angiogenesis y tumorigenesis (Keeley et al., 2008; 2011). Muchas quimiocinas interaction con los restos de glicosaminoglicano (GAG) de proteoglicanos en las celulas endoteliales y la matriz extracelular (Handel et al., 2005). La heparina, que sirve como compuesto modelo para el sulfato de heparina, es la clase mas ubicua de GAG que se expresa en practicamente todas las celulas del cuerpo. Todas las quimiocinas interaction con la heparina GAG.

10

En los estudios se observo que las quimiocinas C-X-C mostraban algunas similitudes de secuencia en sus secuencias aminoacfdicas primarias aunque altamente conservadas en las estructuras secundarias. El examen de las secuencias aminoacfdicas primarias de nueve quimiocinas C-X-C humanas revela una region altamente conservada situada en la porcion C-terminal que esta implicada en la union GAG usando el numero de acceso NCBI 15 de cada quimiocina mostrada a continuacion en "Descripcion detallada de la invencion, 1er parrafo". Se generan tetrapeptidos a partir de la region de union a GAG y se ensaya la bioactividad. Para mayor sorpresa, los tetrapeptidos mostraron diversas bioactividades incluyendo promover la migracion de queratinocitos, inducir la angiogenesis en las celulas endoteliales de la vena umbilical humana, neutralizar las citocinas proinflamatorias inducidas por LTA, y la modulacion del crecimiento celular y la produccion del factor de crecimiento. Los 20 tetrapeptidos son utiles como productos farmaceuticos y cosmeticos para mejorar diversas afecciones de la piel.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a peptidos bioactivos cortos que son utiles para promover la cicatrizacion de heridas 25 en mamfferos. Las heridas dirigidas preferentemente por los peptidos aislados son aquellas que afectan a la piel y a las superficies mucosas asociadas. Aunque no se limiten a ningun mecanismo particular, los peptidos de la invencion son capaces de efectuar la cicatrizacion de heridas estimulando la migracion celular y la angiogenesis. Los peptidos de la invencion son utiles tanto en formas in vitro como in vivo, y son capaces de inducir las actividades anteriormente mencionadas en queratinocitos.

30

Una realizacion de la presente invencion se dirige hacia los tetrapeptidos aislados de la formula (I o V)-X1-K-X2, donde X1 puede seleccionarse de E, Q y K; y X2 puede seleccionarse de M, F, I, W, V y L. Los peptidos aislados pueden contener formas enantiomericas L o D de aminoacidos, o una combinacion de las mismas. De acuerdo con otra realizacion de la invencion, los peptidos aislados pueden conjugarse con una protefna portadora, o modificarse 35 a traves de amidacion C-terminal o acilacion N-terminal con acidos grasos (es decir, lipidacion). Estas adiciones mejoran la bioactividad de los peptidos cuando se aplican a la piel y heridas de la misma.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas de la presente invencion, los peptidos aislados contienen una lisina en la posicion 3. Las realizaciones especfficas de los peptidos aislados comprenden las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 40 7, cada una de las cuales muestran actividades estimuladoras hacia la migracion celular y el efecto de la reparacion de heridas.

Los tetrapeptidos derivados mostrados a continuacion encajan en la formula (I o V)-X1-K-X2, donde X1 puede seleccionarse de E, Q y K; y X2 puede seleccionarse de M, F, I, W, V y L.

45

SEQ ID NO.

HB NO. Secuencia

1

HB2233 IEKM

2

HB2267 VEKF

3

HB2270 IEKI

4

HB2271 IQKI

5

HB2272 IKKW

6

HB2273 IKKV

7

HB2274 IKKL

Otra realizacion de la presente invencion se traza hacia composiciones terapeuticas o cosmeticas que contienen un vehfculo farmaceuticamente o cosmeticamente aceptable y uno o mas de los peptidos mencionados anteriormente. Las composiciones mencionadas anteriormente son utiles para la fabricacion de medicamentos o composiciones 50 cosmeticas para su uso en la aplicacion para curar heridas de piel de mamfferos. El peptido en tales composiciones vana preferiblemente en una concentracion de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, o de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las formas preferidas de la composicion son aerosoles,

emulsiones, lfquidos, soluciones, lociones, cremas, pastas, unguentos, polvos, geles y espumas.

Ademas, los peptidos de la presente invencion, y composiciones que los contienen, pueden proporcionar caracterfsticas utiles para su inclusion en el cuidado general de la piel y formulaciones cosmeticas, tales como 5 diversos cosmeticos para la piel, cremas para la piel, lociones, filtros solares y lociones o cremas terapeuticas tales como formulaciones anti-acne para el cuidado tras un procedimiento por laser.

La presente invencion tambien se refiere a metodos para usar las composiciones mencionadas anteriormente para curar heridas en mamfferos. Tfpicamente, el metodo de tratamiento implica administrar una cantidad eficaz de 10 composiciones que contienen peptidos a heridas y/o afecciones inflamatorias, especialmente aquellas de la piel (epidermis) y tejidos mucosales asociados, durante una cantidad de tiempo eficaz. Dichas heridas incluyen heridas quirurgicas, abrasiones, ampollas, quemaduras, laceraciones, ulceras, moretones, erupciones cutaneas, cicatrices, estrfas y danos en la piel debido a efectos intrfnsecos y extrfnsecos del envejecimiento y la exposicion ambiental, incluyendo arrugas, flacidez de la piel y foto-dano. Las afecciones inflamatorias de la piel incluyen psoriasis, 15 dermatitis atopica y rosacea e inflamacion derivada de la depilacion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Las quimiocinas modulan la cicatrizacion de heridas, las actividades inflamatorias/antiinflamatorias y 20 angiogenicas/angiostaticas. Estas ejercen su funcion uniendose a la clase de receptores acoplados a protefna G (GPCR) en los leucocitos y los glicosaminoglicanos de la superficie celular (GAG) en los tejidos diana. La union de quimiocinas a GAG esta mediada a traves de fuerzas ionicas generadas por las interacciones de cadenas cargadas negativamente en GAG con grupos de residuos basicos en las quimiocinas (Handel et al., 2005). In vivo, la situacion es mas complicada, y se ha propuesto que las quimiocinas trabajan produciendo gradientes inmovilizados o 25 haptacticos, que dirigen la migracion de las celulas a los sitios de inflamacion (Proudfoot, 2006). Las interacciones GAG-quimiocina pueden desempenar un papel fundamental en el establecimiento de gradientes a lo largo de la matriz extracelular y pueden facilitar la union de las quimiocinas a sus receptores acoplados a protefna G. Los GAG o proteoglicanos de sulfato de heparina (HS) tambien pueden comportarse como correceptores de quimiocinas funcionales para senalizacion, dando lugar a la formacion de un complejo ternario de GAG/quimiocina y receptor de 30 quimiocina (Handel et al., 2005). Los estudios sobre quimiocinas especificas han mapeado los sitios de union de los GAG a las quimiocinas. En un examen detallado de la secuencia aminoacfdica primaria del sitio de union a GAG conservado de nueve protefnas precursoras de quimiocinas C-X-C humanas, incluyendo precursor de GRO-alfa (CXCL-1), precursor de quimiocina 2 (CXCL-2), precursor de quimiocina 3 (CXCL-3), precursor de quimiocina 4 (CXCL-4), precursor de quimiocina 5 (CXCL-5), precursor de quimiocina 6 (CXCL-6), precursor de IL-8 (CXCL8), 35 precursor de quimiocina 9 (CXCL-9), precursor de quimiocina 11 (CXCL-11), se encontro una region de tetrapeptido conservada que es de particular interes. El tramo de tetrapeptido conservado definido en este estudio se localiza dentro de una region de union a GAG parcial. A continuacion se muestra una ilustracion esquematica de la alineacion de las secuencias C-terminales de precursores de quimiocinas C-X-C humanas seleccionadas y destacada del tetrapeptido corto conservado. La alineacion se genera utilizando el programa COBALT para la 40 alineacion de multiples secuencias de protefnas en el sitio web del NCBI (ncbi.nlm.nih.gov). Solo se muestra la porcion C-terminal de cada quimiocina en la alineacion y los numeros son el comienzo y el final de los residuos en las secuencias. A. Precursor GRO-alfa (numero de acceso NCBI P09341.1); B. precursor de quimiocina 2 (numero de acceso NCBI NP_002080.1); C. precursor de quimiocina 3 (numero de acceso NCBI NP_002081.2); D. precursor de quimiocina 4 (numero de acceso NCBI P80162.4); E. precursor de quimiocina 5 (numero de acceso NCBI 45 NP_002985.1); F. precursor de quimiocina 6 (numero de acceso NCBI NP_002984.1); G. precursor de IL-8 (numero de acceso NCBI); H. precursor de quimiocina 9 (numero de acceso NCBI NP_002407.1); I. precursor de quimiocina 11 (numero de acceso NCBI EAX05774.1).

Residuo de inicio Residuo final

74 VIATLKNGR-KACLNPASPIVKKIIEKMLNSD-KSN 107

B.

74 VIATLKNGQ-KACLNPASPMVKKIIEKMLKNG-KSN 107

C.

74 VIATLKNGK-KACLNPASPMVQKIIEKILNKG-STN 107

D.

72 LIATLKNGR-KICLDLQAPLYKKIIKKLLES---- 101

E.

80 VVASLKNGK-EICLDPEAPFLKKVIQKILDGGnKEN 114

F.

80 VVASLKNGK-QVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGnKKN 114

G.

66 IIVKLSDGR-ELCLDPKENWVQRVVEKFLKRA—ENS 99

H.

63 IIATLKNGV-QTCLNPDSADVKELIKKWEKQVsQKK 125

I.

62 VIITLKENKgQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNf— 94

* * * * * * * * *

Se muestra en la alineacion un motivo tetrapeptido corto que esta altamente conservado entre las quimiocinas CXC. * indica un sitio de union a GAG parcial de quimiocinas. Los tetrapeptidos muestran una cadena principal conservada de I-K-. Excepto IL-8 que tiene una valina (V), todos los demas tienen una isoleucina (I) en la posicion 1 5 y una lisina (K) en la posicion 3 del motivo tetrapeptido. Por lo tanto, se puede usar la formula (I o V)-Xi-K-X2 para representar los tetrapeptidos generados y mostrados en la Tabla 1. Cabe senalar que la region de union a GAG de las quimiocinas tambien esta implicada en la formacion de dfmeros ya que la mayorfa de las quimiocinas CXC existen de forma reversible como monomeros y dfmeros, y por lo tanto, el perfil de reclutamiento se vera influenciado no solo por la constante de equilibrio monomero-dfmero, sino tambien por las interacciones de union de monomero y 10 dfmero a los receptores de neutrofilos y a GAG sobre la superficie celular y el espacio intersticial en el tejido diana (Gangavarapu et al., 2012).

Los tetrapeptidos derivados mostrados a continuacion encajan en la formula I(V)-X1-K-X2, donde X1 puede seleccionarse de E, Q y K; y X2 puede seleccionarse de M, F, I, W, V y L.

15

SEQ ID NO.

HB NO. Secuencia

1

HB2233 IEKM

2

HB2267 VEKF

3

HB2270 IEKI

4

HB2271 IQKI

5

HB2272 IKKW

6

HB2273 IKKV

7

HB2274 IKKL

8

HB2268 KMG

Las quimiocinas C-X-C se conocen bien por su actividad quimiotactica hacia muchos tipos de celulas. Para evaluar si los tetrapeptidos recien obtenidos poseen la actividad para estimular la migracion de queratinocitos, se sometieron las SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 a un ensayo de herida por rasguno de queratinocitos, un ensayo aceptado para 20 evaluar la capacidad de compuesto activo para inducir la migracion celular y el cierre de la herida in vitro. El experimento se realizo en el medio de crecimiento de queratinocitos exento de suero en ausencia de complemento con el fin de restringir la proliferacion celular. El area de herida se examino mediante microscopfa de contraste de fase en los momentos indicados. Como se muestra en la Tabla 1, los tetrapeptidos inducen significativamente el cierre de la herida por raspado. A 20 pg/ml, el porcentaje de cierre de la herida inducido por las SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 25 6 y 7 varfa del 165 % al 240 % en comparacion con el de PBS tratado que se tomo como del 100 % (Tabla 1). Un peptido generado aleatoriamente de SEQ ID NO 8 no induce la migracion celular y el cierre de la herida por raspado. Para confirmar que los peptidos no son toxicos para los queratinocitos a las concentraciones ensayadas para el cierre de la herida por raspado, todos los peptidos se sometieron a la prueba de citotoxicidad MTT. Ninguno de los peptidos era citotoxico para los queratinocitos normales de la piel in vitro despues de 24 horas de incubacion a 30 concentraciones de hasta 500 pg/ml. En conclusion, el tratamiento con los tetrapeptidos SEQ ID NOs 1-7, indujo significativamente la migracion de celulas normales de queratinocitos epidermicos humanos en el area de raspado como se indica por el porcentaje de cierre del area herida despues de 7 h de tratamiento en comparacion con las celulas de control tratadas con PBS.

35 La angiogenesis, la formacion de nuevos capilares a partir de la red vascular preexistente, es una etapa esencial de la reparacion de la herida. Los peptidos generados en la presente invencion, SEQ ID NOs 1-7, tambien estimulan la formacion de tubos capilares. El ensayo de angiogenesis in vitro utiliza celulas endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) para medir una serie de eventos que conducen a la formacion de nuevos tubos capilares. Tras la induccion, la HUVEC experimenta migracion para alinearse entonces brotando de celulas individuales. El evento de 40 brotacion conduce a la formacion de nuevos tubos capilares que se desarrollan adicionalmente para formar polfgonos cerrados. Finalmente se desarrolla una estructura tipo malla compleja. El peptido de catelicidina humano, LL-37, es un ejemplo bien estudiado para promover la angiogenesis. Se utiliza como control positivo en la evaluacion. El brote de nuevos tubos capilares se hace visible justo despues de 3 h de tratamiento con LL-37 (Tabla 2). Despues de 5 horas de tratamiento con LL-37, se forman los polfgonos cerrados. En comparacion con LL-37, las 45 SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, indujeron cambios similares en HUVEC dando lugar a nueva formacion de tubos capilares y estructuras poligonales complejas a las 3 y 5 h de tratamiento (Tabla 2). Por el contrario, el peptido SEQ ID NO 8 (KMG) generado aleatoriamente y PBS no inducen tal cambio en el momento en que se observo la actividad angiogenica para LL-37 y los peptidos de la invencion (Tabla 2).

El componente de la pared celular Gram-positivo peptidoglicano (PGN) es bien conocido para estimular la expresion de citocinas proinflamatorias. El acido lipoteicoico (LTA) es la molecula clave en PGN que causa un aumento dependiente de la concentracion y el tiempo en las senales proinflamatorias incluyendo la sintasa de oxido nftrico (iNOS), la ciclooxigenasa 2 (COX-2), la IL-1 beta, el TNF-Alfa y la regulacion por aumento de IL-6 (Lin et al., 2010).

5 Por lo tanto, se trato LTA con los peptidos de la invencion y luego se evaluo la actividad estimuladora de IL-6 tras el contacto con queratinocitos de piel humana. Como se muestra en la Tabla 3, el pretratamiento de LTA con SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 reduce significativamente el nivel de expresion de IL-6 estimulado por LTA en cultivo de queratinocitos de piel humana, sugiriendo que los peptidos pueden neutralizar el efecto toxico de LTA libres. Es muy probable que los residuos cargados positivamente de los tetrapeptidos se unan al LTA cargado negativamente, 10 bloqueando asf la interaccion de LTA con sus receptores. Esto es significativo ya que los componentes de la pared celular bacteriana han estado implicados en afecciones inflamatorias de la piel tales como acne, rosacea, dermatitis atopica, etc.

La modulacion de la proliferacion celular es otro paso importante en la reparacion de heridas. Se ha ensayado el 15 peptido de la invencion para determinar la actividad proliferativa en queratinocitos de piel humana. En comparacion con la actividad quimiotactica medida en el ensayo de rascado, la angiogenesis y el bloqueo de LTA indujeron la expresion de IL-6, y los peptidos de la invencion mostraron varias actividades moderadas sobre la modulacion de la proliferacion de queratinocitos. SEQ ID NO 1 (HB2233) mostro actividad inhibitoria sobre la proliferacion de queratinocitos, se observo tambien dicha actividad inhibidora para la SEQ ID NO 3 (HB2270). La SEQ ID NO 6 20 parece estimular la proliferacion de queratinocitos, pero tal actividad es solo marginal. La actividad inhibidora sobre la proliferacion de queratinocitos induce a ensayar la expresion de TGF-p1, ya que este factor de crecimiento es bien conocido por inhibir la proliferacion celular. Como se muestra en la Tabla 4, tanto la SEQ ID NO 1 como la 3 indujeron un nivel moderado de expresion de TGF-p1 en queratinocitos de cultivo.

25 SOR-300-FT, desarrollado por MatTek Corporation (Ashland MA), es un tejido de psoriasis in vitro altamente diferenciado compuesto por queratinocitos normales y humanos y fibroblastos psoriaticos. Morfologicamente, el tejido es de espesor uniforme y expresa niveles aumentados de celulas hiperproliferadas, asf como marcadores proinflamatorios tales como psoriasina, elafina, beta-defensina-2 humana y LL-37, etc. (Ayehunie et al., 2012). La afeccion proinflamatoria del tejido induce a ensayar los peptidos de la invencion para ver si modulan la respuesta 30 inflamatoria. Debido al alto coste del modelo de tejido, se selecciono un peptido representativo SEQ ID NO 1, HB2233, como ensayo de concepto utilizando el modelo de tejido SOR-300-FT. Los tejidos de SOR-300-FT se trataron con HB2233 por duplicado a 200 pg/ml. Se estudian 12 marcadores genicos asociados con la afeccion de psoriasis. El estudio se realizo en paralelo con calcipotriol. El analisis por qPCR revelo que despues de 72 h de tratamiento, la SEQ ID NO 1 (HB2233) reduce significativamente el nivel de expresion de LL-37 (3,7 veces) que se 35 sobreexpresa en la piel de psoriasis inflamada (Tabla 5). El farmaco psoriasis calcipotriol reduce significativamente HBD-2 (9 veces) y la psoriasina (2,3 veces). Tanto HB2233 como calcipotriol reducen la expresion de Ki67 que es responsable de la hiperproliferacion y la maduracion temprana de queratinocitos en la piel con psoriasis. Ademas, la SEQ ID NO 1 (HB2233) tambien reduce la expresion de CXCL1 (gRo alfa) y CXCL5 (EnA-78), ambas de las cuales se aumentan significativamente en la piel con psoriasis en comparacion con la piel sana normal (Ayehunie S., 2012), 40 sin embargo, el calcipotriol no parece afectar al nivel de ambos genes. Esto sugiere claramente que HB2233 podrfa ser un nuevo farmaco terapeutico que funciona a traves de un mecanismo diferente al del farmaco actual calcipotriol para el tratamiento de afecciones inflamatorias de la piel tales como psoriasis.

Para comprender mejor como el mismo peptido afecta a los tejidos normales de piel sana, se puso la SEQ ID NO:1, 45 HB2233, en un estudio de perfiles geneticos realizado por Sunny Biodiscovery (Santa Paula, CA) usando sustitutos de piel humana normal EPIDERM™, MatTek Corporation (Ashland, MA). Los sustitutos de piel se equilibraron durante una noche antes del tratamiento con peptido o control de agua en duplicados durante 24 horas. Al final del tratamiento, el ARN se extrajo y se sometio a analisis por matriz de PCR. Como se muestra en la Tabla 6, la SEQ ID NO 1, HB2233, estimula los genes que estan implicados en la sfntesis de ECM (colageno e integrinas). Como era de 50 esperar, modula las quimiocinas (CXCL11 y MAPK3, etc.) y los factores de crecimiento (TGF-p1 y VEGF, etc.). El estudio de perfiles geneticos apoya la actividad observada in vitro de que los peptidos de la invencion modulan la proliferacion celular, la angiogenesis y las actividades de cicatrizacion de heridas.

Todos los peptidos incluidos en la presente invencion se sintetizaron usando qufmica de fase solida Fmoc (955 fluorenilmetoxicarbonilo) estandar. Los peptidos se pueden preparar como secuencias amidadas o de acidos libres usando aminoacidos estandar. La amidacion del extremo carboxilo puede hacer que los peptidos de la invencion sean menos susceptibles a la degradacion de proteasas y aumenten su solubilidad en comparacion con la forma de acido libre, proporcionando por lo tanto una potencia terapeutica aumentada. Los peptidos pueden comprender enantiomeros de L- o D-aminoacidos, que contienen residuos de una forma enantiomerica o una combinacion de 60 ambas formas. Los peptidos pueden modificarse tanto en el extremo N como en el extremo C. Por ejemplo, se

analiza que la lipidacion o acetilacion del N-terminal puede mejorar la penetracion peptfdica a traves de la piel sin alterar la funcion bioactiva del peptido (Samah, 2011). Por lo tanto, los peptidos tambien pueden estar lipidados, lo que puede proporcionar una penetracion cutanea mejorada. Los ejemplos de acidos grasos saturados o insaturados que pueden utilizarse para proporcionar el componente lipfdico C12-18 de los compuestos de la invencion incluyen 5 acido laurico, acido mirfstico, acido palmftico, acido estearico, acido miristoleico, acido palmitoleico, acido oleico y acido linoleico. El extremo carboxi de los peptidos puede ser modificado con acido (-COOH) o amidado (por ejemplo, -CONH2, -CONHR o -CONR2). La amidacion del extremo carboxilo puede hacer que los peptidos de la invencion sean menos susceptibles a la degradacion de proteasas y aumenten su polaridad en comparacion con las formas de acido libre, proporcionando por lo tanto una potencia terapeutica aumentada. Ademas, los grupos funcionales 10 peptfdicos que pueden modificarse tfpicamente incluyen anillos de hidroxilo, amino, guanidinio, carboxilo, amida, fenol, imidazol o sulfhidrilo.

Los peptidos tambien pueden conjugarse con moleculas portadoras solubles o insolubles para modificar sus propiedades de solubilidad segun sea necesario y para aumentar las concentraciones locales de peptidos en tejidos 15 diana. Los ejemplos de moleculas portadoras solubles incluyen, pero no se limitan a, polfmeros de polietilenglicol (PEG) y polivinilpirrolidona; los ejemplos de polfmeros insolubles incluyen, pero no se limitan a, silicatos, poliestireno y celulosa. Los peptidos pueden ser microencapsulados usando tecnologfa de liposomas o mediante nano- tecnologfa para mejorar su estabilidad y para liberacion controlada. En general con respecto al protocolo anterior, los peptidos se pueden producir usando cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica tales como los 20 descritos en Merrifield (JAm Chem Soc. 85:2149, 1963); Carpino et al. (J Org Chem. 51:3732, 1986); Merrifield et al. (Anal Chem. 38:1905, 1966); or Kent et al. [High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson, ed.) Almqvist y Wiksell Int., Stockholm (Suecia), pags. 185-188], cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

25

La presente invencion esta dirigida a metodos de utilizacion de los peptidos descritos anteriormente, tales como en formulaciones o como agentes terapeuticos. Estos metodos pueden implicar el uso de un unico peptido o multiples peptidos en combinacion. En ciertos casos, la composicion de la invencion se puede disponer dentro de dispositivos colocados sobre, dentro o debajo de la piel. Dichos dispositivos incluyen parches transdermicos, implantes e 30 inyecciones que liberan las sustancias de tal manera que entran en contacto con la piel o el folfculo piloso mediante mecanismos de liberacion pasivos o activos. Las composiciones utilizadas para administrar los peptidos en los metodos descritos en el presente documento pueden estar en forma de aerosol, emulsion, lfquido, locion, solucion, gel, microencapsulacion, crema, pasta, unguento, polvo, espuma u otra formulacion farmaceuticamente aceptable. Ademas, los peptidos pueden administrarse utilizando formulaciones menos implicadas tales como agua 35 desionizada/destilada, PBS o soluciones salinas medicas estandar.

La formulacion puede tener opcionalmente un atractivo cosmetico, y/o contener otros agentes tales como retinoides, vitamina C u otros peptidos que pueden actuar como adyuvantes para la accion terapeutica de los peptidos de la invencion. Tambien se pueden anadir antibioticos a la formulacion para evitar la infeccion, permitiendo asf que se 40 produzcan procesos de cicatrizacion maximos.

La formulacion puede contener inhibidores de proteasa. Un inhibidor de proteasa puede seleccionarse para dirigirse especfficamente a proteasas que se espera que degraden el peptido bioactivo seleccionado; tal seleccion se determinarfa basandose en la longitud y/o secuencia del peptido bioactivo. Sin embargo, los inhibidores de proteasa 45 no necesariamente deben seleccionarse de una manera especffica; por ejemplo, en la presente invencion, se puede emplear un coctel de inhibidor de proteasa, que contiene dos o mas inhibidores. En la invencion se pueden incorporar los siguientes tipos de inhibidores de proteasa: inhibidores de serina proteasa, inhibidores de cistefna proteasa, inhibidores de aspartato proteasa, inhibidores de metaloproteinasas, inhibidores de tiol proteasas e inhibidores de treonina proteasa. El inhibidor de proteasa utilizado en la invencion puede ser un peptido o una 50 protefna o productos qufmicos. Los ejemplos no limitantes de tales inhibidores son las serpinas, que incluyen alfa-1- antitripsina, inhibidor del complemento 1, antitrombina, alfa-1-antiquimotripsina, inhibidor del activador del plasminogeno 1 y neuroserpina, o productos qufmicos incluyendo, pero no limitado a, acido ursolico y acido tranexamico que pueden actuar como coadyuvante para la accion terapeutica de los peptidos de la invencion.

55 Generalmente, una formulacion farmaceuticamente aceptable incluira cualquier vehfculo adecuado para su uso en la piel humana. Tales vehfculos farmaceuticamente y cosmeticamente aceptables incluyen etanol, dimetilsulfoxido, glicerol, sflice, alumina, almidon y vehfculos y diluyentes equivalentes. La formulacion puede tener opcionalmente un atractivo cosmetico, y/o contener otros agentes tales como retinoides, u otros peptidos que pueden actuar como adyuvantes para la accion terapeutica de los peptidos de la invencion. Tambien se pueden anadir antibioticos a la 60 formulacion para evitar la infeccion, permitiendo asf que se produzcan procesos de cicatrizacion maximos. La

concentracion del peptido en la composicion puede ser de aproximadamente 0,1 |jg/ml a aproximadamente 500 |jg/ml o aproximadamente 0,1 jg/ml a aproximadamente el 10 %; sin embargo, la concentracion final empleada puede variar fuera de estos intervalos, dependiendo de la naturaleza de la herida/afeccion tisular, la bioactividad del peptido de la invencion y el uso de cualquier adyuvante o tecnica para obtener una absorcion mejorada de la 5 composicion. The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992) describe una amplia variedad de ingredientes cosmeticos y farmaceuticos no limitantes usados habitualmente en la industria del cuidado de la piel, que son adecuados para su uso en las composiciones de la presente invencion. Los ejemplos de estas clases de ingredientes incluyen: abrasivos, absorbentes, componentes esteticos tales como fragancias, pigmentos, colorantes, aceites esenciales, sensaciones cutaneas, astringentes, etc. (por ejemplo, aceite de clavo, mentol, alcanfor, aceite 10 de eucalipto, eugenol, lactato de metilo, destilado de avellana de bruja), agentes antiacne, agente antiaglomerante, agentes antiespumantes, agentes antiespumantes, agentes antimicrobianos (por ejemplo, butilcarbamato de yodopropilo), antioxidantes, aglutinantes, aditivos biologicos, agentes tamponantes, agentes de carga, agentes quelantes, aditivos qufmicos, biocidas cosmeticos, desnaturalizantes, astringentes de farmacos, analgesicos externos, formadores de pelfcula o materiales, agentes opacificantes, ajustadores de pH, propulsores, agentes 15 reductores, secuestrantes, blanqueadores de la piel y agentes aclaradores (por ejemplo, hidroquinona, acido kojico, acido ascorbico, ascorbil fosfato de magnesio, ascorbilglucosamina), agentes acondicionadores de la piel (por ejemplo, humectantes), agentes calmantes y/o cicatrizantes de la piel (por ejemplo, pantenol y sus derivados, aloe vera, acido pantotenico y sus derivados, alantofna, bisabolol y glicirrizinato dipotasico), agentes para el tratamiento de la piel, espesantes, y vitaminas y derivados de los mismos.

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La administracion de los peptidos de la invencion y las composiciones asociadas pueden hacerse a seres humanos y animales, incluyendo todos los mamfferos. La aplicacion tambien se puede hacer en combinacion con materiales tfpicos y/o experimentales tales como injertos de tejido, sustitutos de la piel, productos de cultivo tisular y apositos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, gasas (tejidas y no tejidas, impregnadas, no adherentes, empaquetadas, 25 desbridantes); vendajes y sistema de compresion; rellenos y limpiadores para heridas; capas de contacto; colagenos; membranas amnioticas; dermis acelular humana; matrices acelulares y productos de combinacion; y diversos apositos usados comunmente.

Lista de apositos usados comunmente 30

Categorfas de apositos para heridas

Productos

Pelfculas

BIOCLUSIVE™ (Johnson & Johnson Medical, Inc)

OMIDERM™ (Omicron Scientific Ltd.),

OPSITE® (Smith & Nephew United, Inc)

Aposito transparente POLYSKIN®II (Kendall Healthcare)

TEGADERM™ (3M Health Care)

Hidrogeles

INTRASITE™ (Smith & Nephew United, Inc),

NU-GEL™ (Johnson & Johnson Medical, Inc.)

VIGILON® (Bard Medical Division)

Hidrocoloides

COMFEEL® (Coloplast Sween Corp.)

DUODERM®' (ConvaTec)

RESTORE™ (Hollister Incorporated)

Polisacaridos

Aposito de absorcion BARD® (Bard Medical Division)

DEBRISAN (Johnson & Johnson Medical, Inc.)

Granulos dUoDERM® (ConvaTec)

Alginatos

KALTOSTAT® (ConvaTec)

SORBSAN™ (Dow Hicham Pharmaceuticals Inc)

Apositos de espuma

ALLEVYN® (Smith & Nephew United, Inc)

LYOFOAM® (Acme United Corporation)

Laminados

BIOBRANE® (Dow Hickam Pharmaceuticals Inc)

En general, la composicion puede administrarse por via topica, oral, transdermica, sistemica o por cualquier otro metodo conocido por los expertos en la tecnica como util para administrar los peptidos de la invencion al tejido diana. Las composiciones tambien pueden aplicarse de una manera in vitro o ex vivo, ya sea a celulas o injertos de 35 pacientes que crecen en cultivo, por ejemplo.

Las composiciones de la presente invencion pueden contener uno o mas agentes adicionales que ejercen actividad

de cuidado de la piel. Junto al componente peptfdico bioactivo, la presente invencion puede contener otros agentes activos tales como acido hialuronico, niacinamida, fitantriol, farnesol, bisabolol, acido salicflico, retinol, acido retinoico, acidos alfahidroxi, acido ascorbico y acido alguronico. Se espera que ciertos agentes activos adicionales actuen sinergicamente con el componente peptfdico bioactivo, o mejoraran la vida util de la formulacion.

5 Ademas, las abreviaturas para los aminoacidos siguen el uso convencional:

Alanina

Ala A

Arginina

Arg R

Asparagina

Asn N

Acido aspartico

Asp 10

Cistefna

Cys C

Glutamina

Gln Q

Acido glutamico

Glu E

Glicina

Gly G

Histidina

His H

Isoleucina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Fenilalanina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Treonina

Thr T

Triptofano

Trp W

Tirosina

Tyr Y

Valina

Val V

Los detalles sobre las tecnicas para la formulacion y administracion de productos farmaceuticos se pueden encontrar en la ultima edicion de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Aunque la 10 administracion topica local es deseable, existen otros medios de administracion, por ejemplo: administracion oral, parenteral, en aerosol, intramuscular, subcutanea, transcutanea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. La presente invencion puede ser formulada en una serie de vehfculos portadores, por ejemplo, en una pulverizacion; un aerosol; una emulsion de tipo agua y aceite; una emulsion de tipo aceite y agua; una crema para el rostro o crema corporal; una locion para el sol o una locion para despues del sol; u 15 otro vehfculo de administracion topica. Ademas, los peptidos de la presente invencion, y composiciones que los contienen, pueden proporcionar caracterfsticas utiles para su inclusion en el cuidado general de la piel y formulaciones cosmeticas, tales como diversos cosmeticos para la piel, cremas para la piel, lociones, filtros solares y lociones o cremas terapeuticas tales como formulaciones anti-acne.

20 Areas de aplicacion

Los peptidos de la presente invencion se pueden usar para tratar heridas de la piel. El dano del tejido de la piel y de las mucosas se produce cuando la capa epidermica se rompe, tal como de una laceracion, quemadura o ampolla. La lesion tambien puede implicar aplastamiento o moretones, lo que implica dano tisular sin fisura concurrente de la 25 epidermis. Las infecciones de la piel, asf como ciertas enfermedades cronicas tales como el cancer y enfermedades autoinmunes tambien pueden afectar a las superficies epidermicas. Las ulceras, tales como las que afectan a la diabetes o las asociadas con ulceras de presion, son otra forma de dano de la piel; estas heridas son a menudo bastante intratables, se inflaman, son propensas a la infeccion, y requieren un proceso de cicatrizacion de extension. La persistencia de una ulcera u otro tipo de herida cronica se debe a un fracaso de los procesos celulares 30 involucrados en la cicatrizacion y la nueva generacion de vasos sangufneos debido a la alteracion de la capacidad de angiogenesis. La angiogenesis es el proceso de formacion de una nueva red capilar (microvascular) en respuesta a la hipoxia u otros estfmulos (Folkman et al., 1992). El proceso implica la secrecion local de factores angiogenicos tanto del endotelio hipoxico como de pericitos de soporte que inducen la proliferacion endotelial y el brote de neovasos. La angiogenesis insuficiente contribuye a la alteracion de la cicatrizacion de heridas y ulceras cutaneas 35 (Galiano et al., 2004). El fracaso en la cicatrizacion de heridas tambien puede ser el resultado de la incapacidad para epitelizar la lesion parcialmente debido al hecho de que los queratinocitos en el borde de la herida no emigran para cerrar o cubrir la llaga (Enoch y Price, 2004). La cicatrizacion de heridas cutaneas y mucosas esta orquestada, en parte, por la activacion de queratinocitos basales. Tras la activacion, los queratinocitos situados en el perfmetro de la herida migran para formar una unica capa sobre la herida en un proceso denominado epitelizacion. Se ha

demostrado que los queratinocitos en el borde no cicatrizante de las heridas cronicas son hiperproliferativos pero no migratorios, y la falta de migracion conduce a la incapacidad de epitelizar y desempena un papel importante en la patogenesis de las ulceras cronicas (Harsha et al., 2008). La presente invencion tambien se puede usar para tratar los danos asociados con queratinocitos en piel y tejidos mucosos. La expresion "tejidos mucosales asociados" se 5 refiere a cualquier tejido organizado de una manera similar a la piel y que contiene celulas epiteliales/queratinocitos incluyendo, pero sin limitacion, las superficies de revestimiento interno asociadas a la boca, nariz, garganta, oreja, ano, genitales y la conjuntiva palpebral del ojo. Los ejemplos de heridas o lesiones que pueden afectar a estos tejidos y son susceptibles de tratamiento con los peptidos de la invencion son abrasiones, ampollas, quemaduras, laceraciones, punciones, ulceras, moretones, erupciones cutaneas y cicatrices. El trauma posquirurgico tambien se 10 puede tratar con los peptidos.

Otra forma de dano epidermico es sutil y es resultado durante un largo perfodo de tiempo, eventualmente comprometiendo la funcion de la piel, llamada piel envejecida. Hay dos procesos principales que inducen envejecimiento de la piel; intrfnseco (envejecimiento cronologico) en la piel protegida por el sol y extrfnseco (foto- 15 envejecimiento) en areas expuestas al sol. El envejecimiento intrfnseco refleja el origen genetico y depende del tiempo. Sin embargo, el envejecimiento de la piel participa con uno o mas de los siguientes: arrugas, lfneas finas, hiperpigmentacion, eritema, perdida de luminosidad, suavidad, firmeza, claridad y uniformidad del tono de la piel y alteraciones en la apariencia de los poros. Bajo estos signos visibles se encuentran diversos cambios histologicos y citologicos inducidos por la exposicion aguda o cronica de estfmulos ambientales tales como ultravioleta (UV) y 20 contaminacion ademas de la predisposicion genetica. Los problemas cosmeticos tales como arrugas, sequedad, adelgazamiento, flacidez y mayor susceptibilidad a moretones son signos externos de dano epidermico que, ademas del envejecimiento, tambien pueden ocurrir prematuramente debido a la exposicion prolongada a agentes daninos como rayos ultravioleta y contaminacion. Por lo tanto, los peptidos descritos pueden usarse para los problemas asociados con el envejecimiento de la piel causados por estfmulos tanto intrfnsecos como extrfnsecos, para prevenir 25 y reparar el dano, por lo tanto, para regenerar el tejido sano de la piel para revertir los efectos del envejecimiento. De una manera relacionada, los peptidos pueden aplicarse a un tejido que se ha danado por exposicion a diversos agentes externos tales como luz solar. La invencion tambien se puede utilizar como un cosmetico en estos aspectos para dar una apariencia y textura mas jovenes. Los peptidos cortos por sf solos inalterados, o a traves de modificacion qufmica y/o administracion especializada, pueden hacerse penetrar a traves de la epidermis para 30 afectar procesos en contra de aquellos que causan adelgazamiento de la piel, arrugas, fragilidad y rugosidad/endurecimiento. Dado que los queratinocitos son el componente principal de las superficies epidermicas y estan disminuidos en la piel envejecida y danada, se espera que la reposicion de la misma por estimulacion peptfdica invierta el problema mencionado anteriormente.

35 La piel es relativamente elastica, pero hay lfmites a su capacidad de estiramiento. Las estrfas son una forma de cicatrizacion en la piel con un tono de color apagado. Son causadas por el desgarramiento de la dermis, que con el tiempo puede disminuir, pero no desaparecera por completo. Aparecen primero como lfneas rojizas o moradas, pero tienden a desvanecerse gradualmente a un rango mas ligero. Las estrfas son a menudo el resultado del rapido estiramiento de la piel asociado a un rapido crecimiento o perdida rapida de peso. Las estrfas pueden aparecer en 40 cualquier sitio del cuerpo que no sufren estiramientos o distension notable o excesiva. Los lugares mas comunes son el abdomen, los senos, los brazos, las axilas, la espalda, los muslos, las caderas y las nalgas. Las estrfas son a menudo causadas por los cambios hormonales de algunas etapas importantes de la vida como la pubertad y el embarazo, pero el tratamiento con corticosteroides, la obesidad, la cirugfa estetica y la reconstruccion corporal intensiva puede conducir a estrfas. Bajo la accion de corticosteroides, el crecimiento tanto de queratinocitos como de 45 fibroblastos puede ser gravemente danado y, por consiguiente, la sfntesis de colagenos I y III, asf como la sfntesis de fibronectina tambien se reduce significativamente hasta mas del 90 % en comparacion con la piel normal (Rogalski et al., 2002). Se ha demostrado que la combinacion de corticosteroides en dosis altas y la terapia antiangiogenica del factor de crecimiento endotelial puede agravar la condicion de las estrfas y debe evitarse (Wheeler et al., 2012). Reparar y restaurar la funcion de los queratinocitos en la seccion dermica/epidermica podrfa 50 ser la clave para la correccion de las estrfas. Los peptidos de la presente invencion que promueven el cierre de heridas por raspado y estimulan la angiogenesis esencial para la cicatrizacion de heridas son, por lo tanto, ideales para el tratamiento de estrfas.

Los queratinocitos producen y secretan peptidos antimicrobianos (AMP) que funcionan como antibioticos endogenos 55 y como moleculas de senalizacion dentro del sistema inmune innato cutaneo. Los AMP son el componente clave del sistema innato de defensa inmune huesped y proporcionan la primera lfnea de defensa y muerte de microorganismos patogenos. Ademas, tambien modulan y modifican las respuestas inflamatorias huesped mediante una diversidad de mecanismos. Sin embargo, la expresion anormal de estos peptidos se ha asociado a la patogenesis de enfermedades inflamatorias de la piel. Los estudios recientes implican que LL-37 puede desempenar 60 un papel importante en la patogenesis de la psoriasis y la rosacea.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria cronica de la piel que afecta aproximadamente al 2 % de la poblacion general (Lowes et al, 2007). La psoriasis se caracteriza por la acumulacion de linfocitos T de tipo Th1 y neutrofilos, hiperproliferacion y diferenciacion de queratinocitos, y una mayor produccion epidermica de AMP. En las lesiones 5 psoriasicas, muchos AMP estan altamente expresados, tales como catelicidina (LL-37), p-defensinas, protefnas S100, quimiocinas, RNasa 7, lisozima, elafina, lipocalina asociada a gelatinasa de neutrofilos, etc. En particular, la catelicidina LL-37 se sobreexpresa en la piel inflamada de la psoriasis, se une al auto-ADN extracelular liberado de las celulas moribundas y convierte el auto-ADN en un estfmulo potente para las celulas dendrfticas plasmocitoides (Dombrowski et al., 2012). Aunque existen controversia acerca del papel de LL-37 en la psoriasis, es evidente que 10 este peptido induce la proliferacion de queratinocitos y la produccion de citocinas proinflamatorias en queratinocitos cultivados. Ademas de la psoriasis, LL-37 se ha visto recientemente implicado en el desarrollo de lupus eritematoso sistemico y artritis reumatoide (AR). LL-37 esta altamente expresado en la piel de pacientes con lupus eritematoso sistemico (Sun et al., 2011). En la AR, los granulocitos neutrofilos alimentan la inflamacion y danan el tejido de la articulacion liberando agentes citotoxicos, AMP, proteasas y otros mediadores inflamatorios. Se demostro en modelo 15 animal que LL-37 esta fuertemente aumentado en membranas sinoviales de RA y en articulaciones de ratas con artritis en comparacion con articulaciones sanas (Hoffmann et al., 2012). La observacion de que HB2233 disminuye significativamente la expresion de LL-37, asf como varios factores diferentes altamente asociados con la inflamacion sugiere que los peptidos de la invencion podrfan ser agentes terapeuticos potenciales para afecciones inflamatorias incluyendo, pero no limitandose a, psoriasis, lupus eritematoso sistemico y artritis reumatoide.

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La rosacea es una de las dermatosis mas comunes de los adultos. Los conceptos actuales sugieren que los factores desencadenantes clfnicos conocidos tales como la radiacion UV, el calor, el frfo, el estres, los alimentos picantes y los microbios modulan la senalizacion del receptor tipo Toll, inducen especies reactivas de oxfgeno, asf como potencian la produccion de AMP y neuropeptidos (Kenshi et al. 2009, Yamasaki et al., 2009). El exceso de 25 catelicidina en forma de LL-37 se notifico en la rosacea que parece ser resultado de la funcion anormal del reconocimiento del patron inmune innato por TLR, y las proteasas que procesan hCAP18 (Yamasaki et al., 2007; 2011). Al igual que la psoriasis y el lupus eritematoso sistemico, se ha especulado que el exceso de LL-37 en la rosacea permite el reconocimiento de los acidos auto-nucleicos tanto por las celulas dendrfticas plasmacitoides como por los queratinocitos, lo que puede exacerbar la inflamacion contribuyendo asf a la enfermedad permitiendo la 30 senalizacion autoinflamatoria (Gilliet et al., 2008; Ganguly et al., 2009). La reduccion de LL-37 en tejidos de piel SOR-300-FT por los peptidos de la invencion sostiene un tratamiento prometedor y potencialmente util para mejorar la afeccion inflamatoria asociada a LL-37 en la rosacea.

Ademas de las condiciones inflamatorias de la piel, los niveles mas altos de LL-37 tambien se asocian a varios tipos 35 de tumor solido agresivo. Se demostro que el LL-37 se sobreexpresa progresivamente en los tumores de prostata humanos a medida que aumenta la puntuacion de Gleason y en la metastasis osea (Jonathan et al., 2011). Se observo una observacion clfnica similar en carcinomas de cancer de ovario (Coffelt et al., 2008), cancer de mama (Heilborn et al., 2005) y cancer de pulmon (von Haussen et al., 2008). Aunque LL-37 normalmente se escinde de su precursor, la protefna antimicrobiana de la catelicidina humana 18 (hCAP-18), por la proteasa 3 de neutrofilos para 40 activarse, evidencia que las celulas cancerosas tambien producen una enzima para escindir proteolfticamente su hCAP-18 secretada independientemente de los neutrofilos (Sorensen et al., 2001). Esto puede explicar los niveles elevados de LL-37 en los canceres. Aunque la participacion de LL-37 en los canceres aun no se ha aclarado, la propiedad de LL-37 para aumentar la proliferacion, la angiogenesis, la proteccion de la apoptosis y la transicion epitelio-mesenquimal, podrfan servir como caracterfsticas del cancer y pueden utilizarse por celulas 45 transformadas/neoplasicas para promover el crecimiento tumoral y la metastasis. La reduccion de LL-37 por el peptido de la invencion tal como HB2233, puede proporcionar una manera eficaz de reducir el nivel de LL-37 evitando asf la propagacion de celulas cancerosas. El beneficio potencial puede mejorarse adicionalmente en combinacion con farmacos contra el cancer.

50 La infeccion con bacterias puede causar sepsis y conducir a choque septico, caracterizado por hipotension refractaria y, finalmente, fallo multiorganico y muerte (Ulevitvh et al., 1995). La sepsis gram-positiva se ha reconocido como una afeccion clfnica importante (Ulevitvh et al., 1995). Sus agentes causales son componentes de la pared celular de bacterias Gram-positivas, como peptidoglicano (PGN) y acido lipoteicoico (LTA). Ademas del choque septico, el LTA tambien es un agente causante de otras afecciones inflamatorias. La dermatitis atopica (AD) es una 55 enfermedad inflamatoria cronica comun de la piel. La patogenesis de AD no se entiende completamente y el nivel de expresion de la catelicidina (LL-37) y su asociacion con la gravedad de la enfermedad del eccema ha sido controvertida. Los pacientes con AD son particularmente susceptibles a infecciones estafilococicas de la piel, que se asocian con el empeoramiento de sus afecciones de la piel. Aunque los mecanismos por los cuales las bacterias estafilococicas pueden empeorar la AD aun no estan claros, la produccion de citocinas despues de la infeccion 60 directa o la interaccion con componentes bacterianos o restos de queratinocitos o celulas inmunes parece

desempenar un papel importante (Bieber et al., 2008). Las infecciones por S. aureus se conocen como desencadenantes de la inflamacion de la piel y pueden modular las respuestas inmunitarias debidas a la invasion directa por las bacterias o por productos bacterianos. Los estudios indican altos niveles de LTA de S. aureus en las lesiones cutaneas de AD (Travers et al., 2010). El fluido de lavado derivado de lesiones de AD se encuentra que 5 induce la produccion de IL-1p, IL-6, IL-10, y el factor de necrosis tumoral a por DC derivado de medula osea murina (Travers JB et al., 2010). Los peptidos de la presente invencion muestran altos niveles de union a LTA estafilococico in vitro y tal actividad puede proporcionar un tratamiento prometedor para neutralizar el efecto toxico de LTA o LPS de bacterias Gram-negativas liberadas durante la infeccion o tratamiento antibiotico para mejorar las afecciones asociadas a choque septico y piel con AD.

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El potencial de los peptidos de la invencion para modular la expresion de CTGF-p (factor de crecimiento transformante beta) en los queratinocitos es particularmente interesante. CTGF-p es un citocina pleiotropico/factor de crecimiento que regula la proliferacion celular, la diferenciacion, la apoptosis, la remodelacion de la matriz, la adhesion, la invasion y la migracion. Generalmente, TGF-p1 puede producirse por muchos tipos de celulas 15 diferentes. Se ha descubierto que todas las isoformas de CTGF-p estimulan la sfntesis y la renovacion de las protefnas de la matriz extracelular por los fibroblastos.

El folfculo piloso es un componente integral de la piel, y cada cabello es un producto queratinizado del folfculo. Cada folfculo piloso sufre un ciclo de actividad: el cabello crece a una longitud maxima, despues el crecimiento cesa y el 20 cabello es derramado y reemplazado. Las fases del ciclo de crecimiento del cabello se han descrito como anagena, un largo perfodo de crecimiento; catagena, el perfodo de transicion desde el crecimiento hasta el descanso de 2 a 4 semanas; telogena, un periodo de inactividad de 2-4 meses. Aunque la evidencia directa en seres humanos es insuficiente, los estudios en ratones sugieren que la inhibicion de la proliferacion de queratinocitos y la induccion de la produccion de TGF-p1 estan directamente relacionadas con la regresion catagena (Foitzik et al., 2000). La 25 observacion in vitro de que los folfculos capilares aislados, cultivados en organos y anagenos humanos que se inhiben por el crecimiento por el TGF-p1 se asemeja a las primeras etapas de una transformacion tipo catagena en varios aspectos. La actividad de SEQ ID NO 1, HB2233, para inhibir el crecimiento de queratinocitos y la modulacion de la expresion de TGF-p1 puede sugerir que los peptidos de la invencion tienen potencial como terapeuticamente utiles para la depilacion del vello no deseado. Ademas, el aumento de CTGF-p tambien se ha relacionado con la 30 inmadurez de los melanocitos por la reduccion de MITF, asf como genes melanogenicos que dan como resultado el pelo gris (Nishimura et al., 2010). Por lo tanto, los peptidos de la invencion tambien tienen un gran potencial para aplicaciones tales como despigmentacion de manchas oscuras o aclaramiento de la piel.

El papiloma cutaneo (ST), fibromas blandos, polipos fibroepiteliales o acrocordones son terminos alternativos para 35 describir una afeccion cutanea benigna comun, que consiste en un poco de piel que sobresale de la piel circundante. Histologicamente, el ST es una lesion polipoide con epidermis ligeramente acantotica superpuesta, un nucleo fibrovascular edematoso suelto que presenta inflamacion cronica leve y una dermis nerviosa. Los papilomas cutaneos se consideran las lesiones fibrosas mas comunes de la piel. Aunque se desconoce completamente la etiologfa exacta, se ha notificado una relacion con la obesidad, la diabetes mellitus, la friccion, la acromegalia, el 40 trasplante de organos, el virus del papiloma humano y otras afecciones (Zaher et al., 2007). Los factores de crecimiento y las hormonas, asf como sus receptores, se han visto implicados para desempenar un papel significativo en la formacion de etiquetas de piel (Safoury et al., 2010ab). El hecho de que los papilomas cutaneos sean causados por factores que estimulan la proliferacion de queratinocitos epidermicos y fibroblastos dermicos, compuestos tales como los peptidos de la invencion, que suprimen la proliferacion celular pueden ser 45 potencialmente utiles para retardar la progresion e impedir la formacion de papilomas cutaneos.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ciertas realizaciones preferidas de la invencion.

EJEMPLOS

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Ejemplo 1: Identificacion de peptidos que estimulan la migracion celular y el cierre de heridas por raspado

Los queratinocitos de piel humana (ATCC CRL-2404) se hicieron crecer en medio de crecimiento de queratinocitos libre de suero complementado con 5 ng/ml de factor de crecimiento epitelial recombinante humano (EGF) (Life 55 Technologies, Grand Island, N.Y.). Las celulas se sembraron en placas de 12 pocillos y se dejaron alcanzar el 100 % de confluencia. La monocapa celular se privo de alimento durante 24 h, entonces se hizo una herida por raspado usando una punta de pipeta P200 (200 pl). Las heridas por raspado se lavan y se fotograffan en el momento 0. Se anadio peptido a una concentracion final de 20 pg/ml. Las celulas se mantienen en una incubadora a 37 °C, incubadora de CO2 al 5 % con >90 % de humedad, excepto cuando se capturan imagenes durante un corto perfodo 60 a temperatura ambiente. El cierre de la herida por raspado se sigue despues de 7-8 h de tratamiento y los resultados

se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Estimulacion de la migracion celular segun se evalua usando el cierre de heridas por raspado de queratinocitos. Despues de 7 h de tratamiento, el porcentaje de area cerrada tratada con PBS se tomo como del 100 5 %, el cierre de herida tratado con peptido se calculo y se presento como relativo al tratado con PBS.

SEQ ID NO

HB NO# Secuencia (N-C) Porcentaje del cierre de herida por raspado despues de 7 h en comparacion con el tiempo 0 (%) Cierre de herida con respecto a PBS (%) Citotoxicidad (pg/ml)

-

-

PBS 22,22 100

-

1

HB2233 IEKM 51,56 232* >500

2

HB2267 VEKF 31,00 139 >500

3

HB2270 IEKI 45,67 206* >500

4

HB2271 IQKI 50,59 228* >500

5

HB2272 IKKW 51,22 230* >500

6

HB2273 IKKV 36,67 165* >500

7

HB2274 IKKL 38,29 172* >500

8

HB2268 KMG 23,67 106 >500

*: significativo

Ejemplo 2: Citotoxicidad en queratinocitos de piel humana normal

10 Para asegurar que los peptidos no son citotoxicos para las celulas, se sembraron queratinocitos epidermicos humanos normales a una placa de 96 pocillos. La placa se incubo a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % para permitir que las celulas crecieran hasta un >95 % de confluencia. Los peptidos se diluyen en soluciones madre a concentraciones de 50, 100, 200 y 500 pg/ml. Los medios de cultivo celular se reemplazan por medio fresco que contiene peptidos a diversas concentraciones y despues se incuban a 37 °C y CO2 al 5 % durante 24 h. Al final del 15 tratamiento, la viabilidad celular se midio usando el kit de ensayo MTT adquirido de ATCC (Manassas VA). Los resultados se muestran en la Tabla 1. A las concentraciones de 50 a 500 pg/ml, los peptidos no cambian la viabilidad celular segun se mide usando el ensayo MTT.

Ejemplo 3: Identificacion de peptidos que estimulan la angiogenesis

20

El ensayo de angiogenesis se realizo usando el kit de ensayo de angiogenesis in vitro adquirido en Millipore. En resumen, la capa de matriz se preparo con solucion ECMATRIX® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cultivaron celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (ATCC, Manassas, VA) en medio F12K completo (ATCC, Manassas, VA) complementado con 0,1 mg/ml de heparina (Sigma-Aldrich), 30 ug/ml de ECGS - 25 Aldrich) y suero fetal bovino al 10 % (ATCC, Manassas, VA). Las celulas se recogieron y se suspendieron de nuevo en medios completos. El peptido se mezclo con celulas a aproximadamente 5 x 103-1 x 104 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos antes de sembrar celulas sobre la superficie de la solucion polimerizada ECMATRIX™. La placa se incubo a 30 °C, de CO2 al 5 % durante hasta 9-12 h. La formacion del tubo se inspecciono periodicamente bajo un microscopio de luz invertida y se tomaron imagenes a intervalos de 3 y 5 h y se asigno un valor numerico a 30 cada patron como se muestra a continuacion.

Patron

Valor

Celulas individuales, bien separadas

0

Las celulas comienzan a migrar y alinearse

1

Tubos capilares visibles, sin brotes

2

Brotes de nuevos tubos capilares visibles

3

Comienzo de la formacion de los polfgonos cerrados

4

Desarrollo de estructuras de tipo mallas compleias

5

Como se muestra en la Tabla 2. Las SEQ ID NOs 1-7 estimulan significativamente la formacion de tubos capilares en celulas endoteliales de venas umbilicales humanas. Como se espera, LL-37 se utiliza como control positivo y 35 tambien para estimular la angiogenesis. El PBS se usa como control negativo y las celulas comienzan a migrar y se alinean, pero no hay brotes ni se forman polfgonos cerrados en 5 h.

Tabla 2. Resultados de la induccion de la formacion de nuevos tubos capilares. Los valores >3 se consideran como induccion significativa de la angiogenesis

SEQ ID NO

HB NO Secuencia Promover la formacion de tubos

3 h

5 h

-

-

PBS 1 2

1

HB2233 IEKM 3* 4*

2

HB2267 VEKF 3* 4*

3

HB2270 IEKI 3* 4*

4

HB2271 IQKI 3* 4*

5

HB2272 IKKW 3* 4*

6

HB2273 IKKV 3* 4*

7

HB2274 IKKL 3* 4*

8

HB2268 KMG 1 2

9

LL-37 3* 4*

*: significativo

5 Ejemplo 4: Identificacion de peptidos para bloquear la expresion de IL-6 inducida por LTA

Estimulacion de IL-6 inducida por LTA de S. aureus en queratinocitos epidermicos humanos. Los queratinocitos humanos se cultivaron hasta una confluencia >80 % en medios de cultivo de queratinocitos libres de suero. Se preincubaron LTA de S. aureus 10 pg/ml con cada peptido (50 pg/ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos, 10 despues la mezcla se transfirio al cultivo de queratinocitos. Se permitio el tratamiento durante 24 h. Se elimino el sobrenadante. Despues de un breve centrifugado para eliminar posibles desechos celulares, el sobrenadante se sometio a ensayo de IL-6 usando un kit ELISA adquirido en CellSciences (Canton, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como se muestra en la Tabla 3, las SEQ ID NOs 1-7 neutralizan o antagonizan claramente el efecto de LTA para estimular la expresion de IL-6 en queratinocitos de piel humana.

15 Tabla 3. Bloqueo de la expresion de IL-6 inducida por LTA en queratinocitos de piel humana

SEQ ID NO

HB NO# Secuencia Expresion de IL-6 (arbitraria) Expresion porcentual (%) con respecto a IL-6 inducido por LTA Reduccion porcentual (%) de IL-6 en comparacion con tratado con LTA

-

-

LTA en solitario 1,248 100 0

-

-

PBS (inicial) 0,618

-

-

1

HB2233 IEKM+LTA 0,558 44,71* 55,29*

2

HB2267 VEKF+LTA 0,68 54,49* 45,51*

3

HB2270 IEKI+LTA 0,776 62,18* 37,82*

4

HB2271 IQKI+LTA 0,575 46,07* 53,93*

5

HB2272 IKKW+LTA 0,527 42,22* 57,78*

6

HB2273 IKKV+LTA 0,394 31,57* 68,43*

7

HB2274 IKKL+LTA 0,321 25,72* 74,28*

8

HB2268 KMG+LTA 1,023 81,97 18,03

*: significativo

Ejemplo 5: Identificacion de peptidos para modular la proliferacion celular y la expresion de TGF-p en queratinocitos de piel humana.

20

Los queratinocitos de piel humana normal (ATCC CRL-2404) se hicieron crecer en medio de crecimiento de queratinocitos libre de suero complementado con 5 ng/ml de factor de crecimiento epitelial recombinante humano (EGF) (Life Technologies, Grand Island, N.Y.). Las celulas se examinan microscopicamente a diario. A medida que el cultivo se vuelve confluente al 50-75 %, se aspira el medio en la placa y se anade tripsina al 0,25 %/EDTa. 25 Cuando las celulas se redondean y se desprenden, la tripsina se neutraliza por adicion de medio de cultivo fresco. Las celulas son centrifugan entonces y el sedimento se suspende de nuevo en medio de cultivo fresco. Se utiliza un hemacitometro para contar la suspension celular y el numero total de celulas se ajusta a aproximadamente 500-1000 celulas por pocillo anadiendo 100 pl de suspension celular a cada pocillo. Tfpicamente, se u san los 60 pocillos centrales y los pocillos exteriores se rellenan con medio fresco para minimizar la evaporacion. Cuando las celulas se

unen en cada pocillo despues de 6-8 h de incubacion, se anaden por triplicado 100 pi de medio fresco que contiene PBS o 2 x las concentraciones deseadas de peptido. La microplaca se incuba entonces a 37 °C y CO2 al 5 % durante 48-72 horas.

5 Al final de la incubacion, las celulas se someten al ensayo de citotoxicidad celular CYTOSCAN™ SRB (GBiosciences, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las celulas se fijan antes de la tincion con suforrodamina B (SRB). Despues de un lavado extensivo, el color se solubiliza usando tampon de solubilizacion. La absorbancia se midio a 565 nm con un lector de microplacas. Los resultados mostrados en la Tabla 5 son el valor medio del tratamiento por triplicado y los valores sobre ±10 % del control se consideran 10 significativos.

La estimulacion de TGF-p se realizo por Sunny Biodiscovery Lab (Santa Paula, CA). En resumen, se cultivaron queratinocitos epidermicos humanos neonatales normales en medio de crecimiento de queratinocitos cellnTec (Suiza). El medio no contenfa TGF-p segun el proveedor del medio. El dfa del experimento, el medio de crecimiento 15 se renovo y las celulas se trataron con 50 pg/ml de peptido por triplicado durante 72 h. Al final del tratamiento, el sobrenadante se elimino, se activo y se cuantifico usando el kit LEGEND MAXTM TGF-p1 ELISA total (Biolegend, San Diego, CA).

Tabla 4. Actividad de los peptidos de la invencion sobre la proliferacion celular y la produccion de TGF-p en 20 queratinocitos de piel humana

SEQ ID NO

HB NO Secuencia Proliferacion porcentual (%) con respecto a PBS Porcentaje (%) de induccion de CTGF-p con respecto a PBS

-

-

PBS 100 100

1

HB2233 IEKM 77,54* 125*

2

HB2267 VEKF 93,23 109

3

HB2270 IEKI 86,31* 114*

4

HB2271 IQKI 98,00 109

5

HB2272 IKKW 96,46 95,6

6

HB2273 IKKV 112 101

7

HB2274 IKKL 96,31 96

: efectos moderados

Ejemplo 6: Efecto del peptido representative en la construccion de tejido de psoriasis humana SOR-300-FT.

25 Los tejidos SOR-300-FT™ se transfirieron a placas de 6 pocillos que conteman 0,9 ml de medio de ensayo precalentado y se equilibraron en condiciones de cultivo estandar (37 °C, CO2 al 5 %) durante 1 hora. Despues del equilibrio de 1 h, los tejidos se alimentaron de nuevo con medio fresco como se indica a continuacion: 1) para el punto de tiempo de 24 h, los tejidos se alimentaron con 0,9 ml de medio y 2) para los puntos de tiempo >24 h, los tejidos se alimentaron con 5 ml de medio de cultivo colocando los insertos de cultivo celular sobre las arandelas 30 (Parte n.° EPI-WSHR, MatTek Corporation). A continuacion, se aplicaron por via topica 50 pl de los artfculos de ensayo a los tejidos psoriaticos (n = 3) y el artfculo de ensayo se anadio al medio de cultivo a las 3 concentraciones elegidas por el Patrocinador. A las 24 y 48 horas: a) los tejidos se aclararon por via topica 3 veces con 300-400 pl de PBS, b) los insertos que conteman los tejidos se sujetaron firmemente con forceps esteriles y el artfculo de ensayo se aclaro suavemente sumergiendo el inserto en pBs y se decanto el medio del inserto, y c) el articulo de ensayo 35 nuevo se volvio a aplicar al tejido inmediatamente despues del aclarado y la decantacion (50 pl por via topica). El analisis se realizo a t = 72 h (aplicaciones repetidas por triplicado). El cDNA se genero usando el Kit Qiagen RT2 de primera cadena (cat. n.° 330401). La expresion genica relativa se midio utilizando Qiagen RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (cat n.° 330502) y cebadores Qiagen RT2. El analisis se realizo usando el software Bio-Rad CFX.

Tabla 5. Cambio en veces en los niveles de expresion genica despues del tratamiento de HB2233 y calcipotriol en el 40 tejido SOR-300-FT

Marcadores genicos

Cambio en veces

HB2233

Calcipotriol

Calgranulina C

1,2 -1,3

LL-37

-3,7 5,1

GRO alfa

-1,1 1,3

ENA-78

-1,2 1,6

Elafina

1,1 -1,4

HBD-2

1,5 -9,0

IL-8

1,0 1,3

Ki-67

-1,3 -1,1

P63

1,2 -1,4

Psoriasina

1,3 -2,3

SLPI

-1,3 2,1

Transglutaminasa

1,2 1,5

Ejemplo 7: Analisis de perfil genetico en sustitutos normales de piel humana.

Se analizaron los 84 genes que codificaban la matriz extracelular y las moleculas de adhesion usando matrices de 5 PCR realizadas por Sunny Biodiscovery, Inc (Santa Paula, CA). En resumen, los sustitutos cutaneos EPIDERM™ (Cat. EPI-212) se obtuvieron en MatTek (Ashland, MA) y se manipularon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues del equilibrio durante una noche, se cambio el medio y se aplicaron HB2233 (330 pg/ml) o controles de agua sobre el tejido de la piel por duplicado y se dejo el tratamiento durante 24 horas. Al final del tratamiento, los tejidos se recogieron y se conservaron en una solucion de RNAlater (Ambion, Austin, TX). El ARN se 10 extrajo y se purifico con un kit mini ARNspin de Illustra (Cat. n.° 95017-489, GE Healthcare, Piscataway, NJ). El ARN total purificado se evaluo a 260 nm y 280 nm con un espectrofotometro de matriz de diodos Agilent HP-8452A. La concentracion de ARN se igualo a traves de las muestras y la expresion de los genes de interes se midio mediante PCR cuantitativa en tiempo real con el sistema de deteccion BioRad iCycler iQ utilizando matrices de PCR PAHS- 121A, con un kit de sfntesis de 1a cadena. Mezcla maestre SYBR verde y condiciones de realizacion de PCR de 15 Qiagen. El metodo de eficiencia AACT se utilizo para la cuantificacion de los resultados, despues de la normalizacion de la expresion genica a 5 genes constitutivos realizada con el software de analisis de datos de matriz de PCR RT2 Profiler. Se considero que los genes se expresaban diferencialmente si el nivel de expresion era razonablemente alto (menos de 30 ciclos para detectar) y la modulacion era de 1,5 o mas en cada serie duplicada.

20 Tabla 6. Perfil de expresion genica seleccionado en tejido cutaneo EPIDERM™ tratado con HB2233 frente al control tratado con agua, representado como cambio en veces

Sfmbolo del gen

Descripcion Cambio en veces

PROTEiNAS ESTRUCTURALES

ACTA2

Actina-a-12 2,57

COL1A1

Colageno a-1 de tipo 1 2,08

ITGA1

Integrina a-1 2,08

ITGA3

Integrina a-3 1,82

ITG5

Integrina a-5 2,08

ITGB5

Integrina 3-5 2,95

FACTORES DE CRECIMIENTO

CTGF

Factor de crecimiento de tejido conectivo 3,63

TGFB1

Factor de crecimiento transformante 3-1 3,16

VEGFA

Factor de crecimiento endotelial vascular 3,89

HBEGF

Factor de crecimiento tipo EGF de union a heparina 2,75

FGF2

FACTOR DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS 1,69

WISP1

Protefna 1 de la ruta de senalizacion inducible por WNT1 2,95

WNT5A

Miembro 5 A de la familia del sitio de integracion de MMTV de tipo Wingless 2,95

QUIMIOCINAS Y ACTIVADORES TISULARES

CXCL1

Ligando de quimiocina (C-X-C) 1 2,08

CXCL11

Ligando de quimiocina (C-X-C) 11 9,58

MAPK3

Protefna cinasa 3 activada por mitogeno 4,17

PLAT

Activador del plasminogeno tisular 3,63

PLAUR

Receptor de urocinasa del activador de plasminogeno 2,23

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un tetrapeptido aislado que presenta actividad de reparacion y regeneracion de heridas que consiste en la secuencia peptfdica (I o V)-X1-K-X2, donde X1 es E, Q o K, y X2 es M, F, I, W, V o L.

   5
2. 2. El tetrapeptido de la reivindicacion 1 que es SEQ ID NO:l (IEKM), SEQ ID NO:2 (VEKF), SEQ ID NO:3 (IEKI), SEQ ID NO:4 (IQKI), SEQ ID NO:5 (IKKW), SEQ ID NO:6 (IKKV), o SEQ ID NO:7 (IKKL).
3. 3. El tetrapeptido de la reivindicacion 1, que comprende cualquiera o ambos enantiomeros de L- y D- 10 aminoacidos o esta conjugado con una molecula portadora, amidada o lipidada.
4. 4. El tetrapeptido de la reivindicacion 1 que esta en forma de acido libre.
5. 5. Una composicion que comprende al menos un tetrapeptido de acuerdo con una cualquiera de las 15 reivindicaciones 1-4 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
6. 6. La composicion de la reivindicacion 5, donde el tetrapeptido esta presente en una concentracion que varfa de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, o aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 20 mg/ml.

   20
7. 7. La composicion de la reivindicacion 5, donde la composicion esta en forma de aerosol, emulsion, lfquido, locion, solucion, gel, microencapsulacion, crema, pasta, unguento, polvo o espuma o se incorpora en un dispositivo adaptado para su aplicacion sobre la superficie de la piel o debajo del tejido cutaneo.

   25 8. Una composicion para su uso en la cicatrizacion de una herida o tratamiento de una afeccion

   inflamatoria de la piel en un mamffero cuando se aplica en una cantidad terapeuticamente eficaz durante una cantidad eficaz de tiempo, donde dicho medicamento comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y al menos un tetrapeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

   30 9. La composicion para su uso en un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, donde la herida o

   afeccion inflamatoria afecta a la piel o el tejido mucoso asociado de dicho mamffero.
8. 10. La composicion para su uso en un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, donde la herida se debe a una abrasion, ampolla, quemadura, laceracion, ulcera, moreton, erupcion cutanea, distensiones de estrfas, cicatriz,

   35 estrfa o los efectos del envejecimiento o la exposicion ambiental, o la afeccion inflamatoria se debe a psoriasis, dermatitis atopica y rosacea, o su uso para la eliminacion del vello o la eliminacion de papilomas cutaneos.
9. 11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para su uso en el tratamiento de cuidado de la piel.

   40
10. 12. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para su uso en un producto cosmetico.