ES2631427T3 - Método de ensayo de luminiscencia - Google Patents

Abstract

Un método de bioensayo para detectar y/o cuantificar un analito empleando un primer grupo que comprende un quelato transportador del ión lantánido y un primer elemento de reconocimiento, en donde dicho quelato transportador del ión lantánido comprende un ligando transportador del ión lantánido y un ión lantánido; un segundo grupo que comprende un ligando antena y un segundo elemento de reconocimiento; y se emplea adicionalmente un agente que acompleja dicho ión lantánido a una concentración de al menos 1 pmol/L; en donde dicho quelato transportador del ión lantánido se une a dicho lantánido; y dicho quelato transportador del ión lantánido es una estructura de quelato macrocíclico iónico y tiene un número de coordinación de seis, siete u ocho dientes; y dicho ligando antena es bien monodentado, bidentado, tridentado o tetradentado, y la combinación del quelato transportador iónico y del ligando antena se selecciona para que la suma total de sitios de coordinación del ligando, es decir, recuento de dientes, sea de nueve o diez; en donde el reconocimiento de dicho analito mediante dicho primer elemento de reconocimiento de dicho primer grupo y mediante dicho segundo elemento de reconocimiento de dicho segundo grupo da como resultado o bien i) un quelato de complementación, es decir, la formación de un complejo quelato de lantánido mixto a través de la complementación de dicho quelato transportador del ión lantánido que transporta dicho ión lantánido con dicho ligando antena, y por consiguiente, incrementa la fluorescencia; o bien ii) un quelato de discomplementación, es decir, dicho quelato transportador del ión lantánido que transporta dicho ión lantánido, se separa de dicho ligando antena, y por consiguiente, desciende la fluorescencia.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de ensayo de luminiscencia Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a un metodo de bioensayo para detectar y/o cuantificar un analito.

Antecedentes de la invencion

Se han desarrollado una gran cantidad de ensayos basados en reacciones de union por bioafinidad o reacciones catalizadas enzimaticamente para analizar compuestos importantes biologicamente a partir de su actividad o de su efecto biologico o su modulacion inducida mediante varias muestras biologicas, muestras en estudios medioambientales, procesos industriales y estudios de compuestos. Algunos de estos ensayos se basan en reacciones de reconocimiento por bioafinidad espedfica, donde por ejemplo, se usan componentes de union biologica natural, compuestos de union producidos artificialmente o impresiones de plastico moldeado (impresion molecular) como elementos de reconocimiento para formar el ensayo de union espedfico. Otros estudios se basan en la actividad o modulacion de la actividad de compuestos presentes en la muestra o anadidos en la reaccion (por ejemplo, enzimas activas biologicamente, compuestos qmmicos con actividad sobre moleculas biologicas, sustratos enzimaticos, activadores enzimaticos, inhibidores enzimaticos, compuestos de modulacion enzimatica) etcetera. Tales ensayos se basan generalmente en un marcador o en una combinacion de multiples marcadores que generan senales para, por ejemplo, cuantificar los complejos formados despues del reconocimiento y de reacciones de union. En ensayos heterogeneos generalmente se requiere una etapa de separacion (separaciones como la precipitacion y centrifugacion, filtracion, recoleccion por afinidad hacia, por ejemplo, superficies plasticas, tales como tubos de ensayo recubiertos, portaobjetos o micropardculas, extraccion con disolvente, filtracion en gel, u otros sistemas cromatograficos, etcetera) antes de poder medir, por ejemplo, la fraccion de union o libre de la senal del marcador. En ensayos homogeneos la senal del marcador o marcadores se modula o forma debido a la reaccion de union o a la actividad enzimatica u otro efecto medido, y no es necesaria la etapa de separacion antes de medir la senal del marcador. Tanto en los ensayos heterogeneos como homogeneos, la medicion de la senal del marcador a partir de la fraccion de union o fraccion libre del marcador permite generalmente el calculo del analito o la actividad en la muestra directa o indirectamente, generalmente a traves de la utilizacion de una serie de estandares que se comparan con los no conocidos en las muestras. Se ha revisado varios metodos de ensayo de union en Principles and Practice of Immunoassay, 2a ed., C. P. Price y D. J. Newman, eds., Palgrave Macmillan, Hampshire, Reino Unido, 2001; y The Immunoassay Handbook, 2a ed., David Wild, ed., Nature Publishing Group, Nueva York, NY, 2001.

El desarrollo de ensayos hibridacion de acidos nucleicos multiplexados, simples, sensibles, y cuantitativos, preferiblemente homogeneos, han sido un objetivo importante en la evolucion de marcadores fluorescentes y en tecnicas de deteccion. Los metodos homogeneos han recibido mucha atencion, debido a que eliminan la necesidad de complicadas etapas de separacion del marcador de union o libre, y simplifican significativamente la construccion de un instrumento requerido para realizar un ensayo automaticamente. Ademas, los metodos homogeneos que se requieren para, por ejemplo, tecnicas que implican monitorear el tiempo real de reacciones de amplificacion de acido nucleico [Higuchi, R., et al. (1992) Biotechnology 10: 413-417; Higuchi, R., et al. (1993) Biotechnology 11:10261030]. En la actualidad las tecnologfas disponibles de marcaje adecuadas para monitorizar la hibridacion de acido nucleico no separativa y homogenea, se ven afectadas aun por la interferencia de las matrices de la muestra, las tecnologfas no se pueden utilizar universalmente, por ejemplo, no son adecuadas para ensayos de 5'nucleasas [US 5.210.015], o simplemente no son capaces de realizar una deteccion suficientemente sensible utilizando una lectura rapida requerida, o la instrumentacion requerida para la deteccion es demasiado compleja o cara para construirla o miniaturizarla de forma viable.

Las tecnicas de deteccion homogeneas basadas en la fotoluminiscencia han recibido mucha atencion, ya que se pueden emplear varios tipos de interacciones ffsicas y qmmicas para modular la emision de marcadores fotoluminiscentes debido a la formacion de complejos biomoleculares espedficos. Los metodos que se emplean comunmente se basan en la polarizacion de la luz emitida o de la transferencia de energfa no radiactiva (transferencia de energfa de resonancia) entre dos compuestos fotoluminiscentes (donador y aceptor) o entre un compuesto fotoluminiscente y uno no luminiscente (donador y inactivador (quencher de aqrn en lo sucesivo)) [Hemmila I, Clin Chem 1985;31:359-370].

Transferencia de energfa de resonancia

La transferencia de energfa de resonancia de Forster (FRET) es una distancia fuertemente dependiente (para la razon inversa de la sexta potencia) del mecanismo de transferencia de energfa no radiactiva entre dos moleculas fluorescentes elegidas adecuadamente presentes en una proximidad cercana [Forster, T (1948) Ann Physik 2: 5575]. La transferencia de energfa de resonancia (RET) aparece en la eficacia practica cuando un fluoroforo donador y uno aceptor estan dentro del radio de Forster (valores tfpicos 4-7 nm) y el espectro de emision del donador y el espectro de absorcion del aceptor se superponen. El RET se monitorea normalmente bien mediante la medicion de un descenso de la intensidad de emision del donador o bien mediante un aumento de la intensidad de emision del

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aceptor (conocida como emision del aceptor sensibilizado) [Selvin, PR (1995) Biochem Spectroscopy 246: 300-334] resultantes de la proximidad del donador y el aceptor. En caso de que el aceptor sea no fluorescente (conocido como quencher) se monitorea un cambio en la intensidad de emision del donador.

Aunque la FRET es una tecnica esencial y que se emplea ampliamente en muchas aplicaciones, tiene graves limitaciones de rendimiento [Hemmila, I (1985) Clin Chem 31: 359-370] y, en la practica, las sondas RET no cumplen con los estrictos requerimientos de las sondas de proximidad eficaces. Las sondas de proximidad es una tecnica capaz de detectar la cercama de las dos sondas de proximidad y se emplea para la deteccion espedfica, sensible y rapida de varias biomoleculas. Una sonda de proximidad consiste normalmente en un resto de union (elemento de reconocimiento) u otro lugar de reconocimiento (con afinidad espedfica por la molecula diana, es decir, el analito) y la molecula diana es capaz de dirigir la union directa de dos sondas de proximidad iguales o diferentes dentro de posiciones adyacentes. La proximidad entre las sondas se proporciona, por tanto, cuando las dos sondas se unen, por ejemplo, a sus respectivos sitios de union en una molecula diana. Caractensticas de las sondas de proximidad eficaces es que no generen ninguna senal significativa (es decir, no sean detectables) cuando el par de la sonda no se dirige en una proximidad inmediata mediante la molecula diana, pero el par de la sonda se activa a un estado detectable debido a los sucesos de reconocimiento espedficos en presencia de la molecula diana. Se han descrito sondas de proximidad empleando sondas de proximidad monovalentes, realizadas en disolucion sin etapas de lavado, en WO 01/61037; Schallmeiner et al. (2006) Nature Methods 4:135-137 y WO/2003/044231.

Los ensayos basados en FRET convencional son susceptibles de i) dirigir la excitacion del aceptor (el aceptor se excita debilmente a la misma longitud de onda cuando se excita el donador), ii) solapar la emision del donador (el donador tiene algo de emision en la misma longitud de onda donde se mide la emision del aceptor), iii) transferir la energfa radiactiva (menos dependiente de la distancia; inversa a la segunda potencia) a traves de la absorcion de la emision del donador (fotones) mediante los fluoroforos aceptores no necesariamente en proximidad, y iv) dispersar la excitacion de la luz y la fluorescencia (a partir de la muestra, de otros componentes del ensayo, plasticos y de la deteccion del propio instrumento) generando la senal de fondo. Por tanto, los fluoroforos convencionales y las sondas RET no proporcionan la generacion de la senal espedfica requerida para el principio de union de la sonda de proximidad. Ademas, es diffcil medir mas de dos parametros simultaneamente en un ensayo basado en FRET multiparametrico, debido a la amplia cobertura espectral de un par donador-aceptor individual.

Fluorometna en tiempo resuelto

La sensibilidad de deteccion de las tecnicas basadas en la fluorescencia convencional se limita mediante autofluorescencia, excitacion dispersa de la luz y absorbancia de matrices de una muestra biologica, y a ensayos basados en la transferencia de energfa de resonancia basados en el aceptor, asf como tambien al solapamiento de la emision del donador en la longitud de onda de emision espedfica del aceptor y la excitacion directa del aceptor en la longitud de onda de excitacion espedfica del donador. Muchos compuestos y protemas que se presentan en los fluidos biologicos o en la sangre son fluorescentes de forma natural, y el empleo de fluoroforos convencionales conduce a serias limitaciones de sensibilidad [Soini E y Hemmila I (1979) Clin Chem 25: 353-361; Wu P y Brand L (1994) Anal Biochem 218:1-13]. Otro gran problema cuando se emplean tecnicas de fluorescencia homogeneas basadas en mediciones de intensidad, es el efecto de filtrado interno y la variabilidad de las propiedades opticas de una muestra. La dilucion de la muestra se ha empleado para corregir este inconveniente, pero siempre a expensas de la sensibilidad analftica. La viabilidad de la transferencia de energfa de resonancia por fluorescencia en las aplicaciones de ensayo, se mejoro significativamente cuando se emplearon como donadores criptatos y quelatos de lantanido con una emision de vida larga y con un gran desplazamiento de Stokes, en los anos 90 [Mathis G (1993) Clin Chem 39:1953-1959; Wu P y Brand L (1994) Anal Biochem 218, 1-13; Selvin PR et al. (1994) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91:10024-10028; Stenroos J et al. (1998) Cytokine 10:495-499; WO 98/15830; US. 5.998.146; WO 87/07955; Blomberg, K et al. (1999) Clin Chem 45:855-61].

Los quelatos y criptatos de lantanido, debido a su detectabilidad mejorada en comparacion con los fluoroforos organicos tradicionales, se emplean ampliamente hoy en dfa en el analisis de varias moleculas biologicas. Los quelatos de lantanidos luminiscentes (alcalinoterreos, por ejemplo, europio trivalente, terbio, samario y disprosio) son un grupo excepcional de compuestos fotoluminiscentes [Bunzli, JCG y Piguet, C (2005) Chem Soc Rev 34: 10481077]. Los mismos iones de lantanido tienen una absorcion muy baja y, ademas, el estado excitado del lantanido se extingue eficazmente mediante moleculas de agua coordinadas. Por tanto, la sola disolucion viable para su excitacion se emplea en un ligando coordinador que comprende un resto de fotocaptacion, tal como un cromoforo antena organico en el quelato de lantanido (ill) intnnsecamente luminiscente. En la practica, la eficacia fotoluminiscente (producto del coeficiente de absorcion y rendimiento cuantico) del ion quelato de lantanido para un ligando antena eficiente, que desplaza todas las moleculas de agua coordinadas, puede mejorar facilmente hasta 100.000 veces en comparacion con un ion descubierto. Ademas, las distintas bandas de emision caractensticas del ion lantanido permiten la medicion simultanea de hasta cuatro lantanidos diferentes con un solapamiento espectral mmimo. Las propiedades de luminiscencia de los lantanidos permiten tambien la separacion eficiente del ruido de fondo desde la materia biologica, y por tanto, incrementan la sensibilidad del ensayo [J. Yuan, G. Wang (2005) J Fluoresc. 15, 559].

Los complejos de iones de lantanido para un quelato adecuado (por ejemplo, acido aminopolicarboxflico) que contienen un resto antena de fotocaptacion o cromoforo, poseen caractensticas de fluorescencia inusuales en

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comparacion con los fluoforos convencionales: gran desplazamiento de Stokes (150-300 nm), distintas bandas estrechas de emision y caractensticas para iones lantanidos, y larga vida de luminiscencia (hasta 2000 microsegundos). La excepcional vida de fluorescencia permite una separacion de fondo eficiente mediante la seleccion de tal entrada temporal (normalmente cientos de microsegundos) que realizan la deteccion solo cuando la fluorescencia de fondo (de corta vida) ha decafdo, mientras que la luminiscencia del lantanido es aun razonablemente intensa. Por otra parte, el gran desplazamiento de Stokes y las bandas estrechas de emision permiten que una longitud de onda eficiente se filtre para seleccionar espectralmente el lantanido luminiscente, dando como resultado una tecnologfa marcadora altamente sensible (igual rendimiento para enzima amplificada por quimioluminiscencia) y que posibilita la medicion multiparametrica. La tecnologfa emplea un metodo de deteccion especializado conocido como (microsegundo) fluorometna en tiempo resuelto [Soni E y Kojola H (1983) Clin Chem 29: 65-68]. La gran vida de fluorescencia de los quelatos lantanidos luminiscentes se excita normalmente a una luz ultravioleta o azul visible [Yang C, et al. (2004) Angew Chem Intl Ed 43: 5010-5013] y la emision se detecta en longitudes de onda verde y roja visible. En el caso del erbio, neodimio e iterbio, la excitacion puede ser en longitudes de onda visibles y las emision a longitudes de onda visibles o infrarrojas [Werts, M.H.V., et al. (1997). Chem Phys Lett 276: 196-201]. Tambien debenan considerarse el platino (III) y el paladio (III) por tener similares propiedades espectrales y temporales cuando se acomplejan a porfirinas [de Haas, R.R., et al (1999) J Histochem Cytochem 47: 183-196].

El mecanismo de excitacion de los quelatos de lantanido(III), cuando se emplea una antena de fotocaptacion organica para excitar el ion lantanido(III) emisivo a traves de transferencia de energfa, es excepcional entre marcadores fluorescentes [Hemmila, I. y Laitala, V.(2005) J Fluoresc 15: 529-542]. Los quelatos de lantanido (III) luminiscentes comprenden un grupo reactivo, una antena de fotocapatacion y grupos quelantes, cuyo ion lantanido(III) del quelato se une mediante enlaces de coordinacion. El cromoforo de fotocaptacion organico se excita primero desde un estado singlete fundamental (S0) hasta un primer estado singlete (S1) mediante absorcion de la luz, y el cromoforo experimenta la transicion hasta el estado triplete (T1) mediante cruce intersistema (ISC, de sus siglas en ingles). El estado triplete del cromoforo antena puede transferir la energfa de excitacion hasta un nivel apropiado de energfa 4f del ion lantanido(III). Despues, el ion lantanido produce una luminiscencia de transicion f-f caractenstica con diferentes bandas de emision y con una vida de luminiscencia larga debido a una transicion prohibida.

El desarrollo de una estructura de quelato lantanido estable que contiene una antena de fotocaptacion eficiente resulta diffcil inicialmente. El problema se evito en ensayos heterogeneos mediante el marcaje del enlazador biomolecular con un quelato transportador ionico y empleando una disolucion quelante separada (con pH bajo) para disociar el ion del quelato transportador para formar un nuevo complejo lantanido altamente fluorescente. El quelato transportador ionico empleado para el marcaje contiene, ademas del ion lantanido y el quelato transportador, un grupo reactivo para el acoplamiento covalente.

Los complejos quelato de metales (compuestos de coordinacion) se forman a traves de la union del ligando (o molecula quelante) al ion metalico a traves de grupos coordinados. El numero total de puntos de union del ligando al ion metalico central se denomina numero de coordinacion. Los ligandos se pueden caracterizar por puntos de union, enumerandolos como monodentado, bidentado, etc., donde el concepto de dientes (dent) refleja el numero de atomos unidos al metal central en el quelato. El quelato (o complejo quelato) es un compuesto que comprende al menos un solo ligando, que tiene al menos dos dientes (llamado bidentado), y al menos un ion metalico unido mediante el ligando. La estabilidad de los complejos quelato en disolucion se describe mediante la magnitud de la constante de estabilidad (o formacion) para la asociacion del metal (cationes) a los ligandos (neutral o anionico). La mayor constante de estabilidad (o formacion), se acompleja con la mayor proporcion del metal en presencia del ligando. Para la union de multiples ligandos se pueden definir contantes de estabilidad gradual y la constante de estabilidad es despues el producto de las constantes de estabilidad gradual. Ya que las constantes de estabilidad pueden variar en decenas de magnitudes, el valor se expresa normalmente como logaritmo (log 10). Los ligandos multidentados forman complejos de iones metalicos mas fuertes que los de ligandos monodentados. Normalmente la constante de estabilidad aumenta con el numero dentados de coordinacion del ligando, pero asf mismo la estructura del ligando es importante. Las estructuras en anillo o dclicas reducen la libertad de las conformaciones del ligando de union, a menudo tambien dan como resultado constantes de estabilidad mayores. La determinacion de constantes de estabilidad para complejos de europio(III), se describe por ejemplo, por Wu, SL y Horrocks, WD (1997) Journal of the Chemical Society-Dalton Transactions 1497-1502. Normalmente los lantanidos cercanos en la tabla periodica (por ejemplo, Eu (III) y Gd (III)) tienen constantes de estabilidad muy similares con el mismo ligando.

La constante de estabilidad (o formacion) describe la estabilidad maxima del quelato lantanido en condiciones alcalinas, donde el ligando esta totalmente desprotonado y los protones no compiten significativamente con la union del ion metalico. Las constantes de estabilidad condicional (tambien conocidas como constantes de formacion eficaces), considerando el pH y la protonacion del ligando, son mas apropiadas para describir la estabilidad actual del complejo a, por ejemplo, pH fisiologico y condiciones predominantes normalmente en bioensayos. La descripcion de los terminos “Determinacion de las constantes de estabilidad condicional para complejos de europio(III)” se describe, por ejemplo, por Siaugue, J.M. et al. (2003) J Photochem Photobiol A: Chem 156: 23-29.

Ejemplos de ambas constantes de estabilidad y constantes de estabilidad condicional a pH fisiologico, asf como datos de estabilidad cinetica, se describen en Morcos, S.K. (2007) “Chelates and stability”, pp. 155-160 en Medical

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Radiology, 2a edicion revisada por Thomsen, H.S y Webb, J.A.W, Springer, Berlin, 2009. Se recopila una gran coleccion de constantes de estabilidad para la base de datos de la constante de estabilidad IUPAC (Union Internacional de Qmmica Pura y Aplicada) disponible comercialmente en Academic Software, Yorks, Reino Unido.

La tecnica basada en un quelato transportador ionico y una disolucion quelante separada se conoce como ensayo de fluoroinmunoensayo de disociacion aumentada por lantanidos [US. 4.565.790; Hemmila, I et al. (1984) Anal Biochem 137: 335-343; Soini, E y Lovgren, T (1987) CRC Crit Rev Anal Chem 18: 105-154; y Siitari, H et al. (1983) Nature 301: 258-260]. La tecnologfa se aplica ampliamente en ensayos de union biomoleculares heterogeneos y despues, se mejora la velocidad de la disociacion mediante la utilizacion de un ligando antena que es capaz de formar el complejo lantanido a un pH inferior [WO 2003/076939, US 7.211.440, US 7.381.567 y EP 1 483 582]. Los ensayos basados en el aumento utilizan normalmente quelatos de transportadores ionicos de lantanido (III) basados en un aminopolicarboxilato moderadamente fuerte (tales como los derivados de EDTA y DTPA, descritos en, por ejemplo, US 4.822.594 y US 6.190.923) como reactivos marcadores y ligandos antenas basados en beta-dicetona en disolucion aumentada para crear luminiscencia. Tambien se han presentado quelatos transportadores ionicos y reactivos marcadores basados en DOTA y TETA [Hemmila, I. (1995) J. Alloys Comp 225: 480-485]. Para derivar el ligando del marcador, por ejemplo, un acido carboxflico de DOTA, se puede reemplazar por un grupo que se une a biomoleculas. Sin embargo, la estabilidad de los quelatos del transportador del ion lantanido(III) empleado para el aumento de la disociacion, debena ser solo moderada y las cineticas de disociacion bastante rapida a pH especialmente bajo, ya que en caso contrario, el ion no se libera lo suficientemente rapido para aumentar la fluorescencia. Por otra parte, el desarrollo de quelatos transportadores muy estables para el ion gadolinio(III), han sido el foco del desarrollo de agentes de contraste para imagenes de resonancia magnetica [Brucher, E (2002) Topics in Current Chemistry 221: 103-122; Morcos, S.K (2007) “Chelates and stability”, pp. 155-160 en Medical Radiology, 2a edicion revisada por Thomsen, H.S. y Webb, J.A.W, Springer, Berlin, 2009; y Woods, M. et al. (2006) Journal of Supramolecular Chemistry, Vol 2., 1-15].

Se han desarrollado varios quelatos lantanidos intrmsecamente fluorescentes [Alpha, B et al. (1987) Angew Chem Int Ed Engl 26: 1266-1267; H. Takalo et al. Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278; Takalo, H et al. (1997) Helv Chim Acta 80: 372-387; von Lode, P et al. (2003) Anal Chem 75: 3193-3201, Beeby, A. (2000) J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1281-1283; Hakala, H. et al. (2002) Inorg Chem Comm 5: 1059-1062; Li, M. y Selvin, P.R. (1995) JACS 117: 81328138; y WO 2005/021538]. Estos complejos lantanidos luminiscentes y estables incluyen tanto a criptatos como a quelatos altamente luminiscentes (principalmente estructuras quelantes basadas en aminopolicarboxflico) para varios lantanidos [europio(III), terbio(III), samario(III) y disprosio(III)]. Los ligandos quelantes se disenan para combinar una union moderadamente fuerte o fuerte del ion lantanido (III) y la parte de fotocaptacion a la misma molecula y se pueden utilizar como donadores en ensayos basados en FREt. En muchos de los quelatos, la parte de fotocaptacion (que absorbe la energfa) y la parte mediadora se compone de una piridina derivada o de multiples piridinas. Algunas estructuras de antena contienen otras estructuras en anillo conjugado heteroatomico, tal como pirazol. Ademas del ion lantanido, del resto organico de fotocaptacion y del ligando transportador, los complejos de lantanido intrmsecamente luminiscentes que se emplean para el marcaje, contienen un grupo reactivo para conjugacion covalente.

El rendimiento de luminiscencia del lantanido se puede mejorar mediante co-luminiscencia basado en el aumento utilizando ligandos antena adicionales e iones lantanido no luminiscentes [por ejemplo, itrio(III) o gadolinio(III)] para absorber la excitacion luminosa y transferir la energfa a traves de la migracion triplete-triplete hasta un ligando antena coordinado a un ion lantanido luminiscente [por ejemplo, europio(III)], que se presenta bien en el mismo complejo lantanido polimerico auto-ensamblado o bien en el mismo ambiente micelar. La migracion de la energfa intermolecular mejora enormemente la cantidad de antenas de fotocaptacion eficaces por lantanido luminiscente, y dan como resultado un aumento de la intensidad de luminiscencia de determinados iones lantanidos luminiscentes hasta cien veces o incluso mas [Xu, YY et al. (1991) Analyst 116: 1155-1158; Latva, M et al. (1995) J Chem Soc Perkin Trans 2 995-999].

RET basado en lantanido

Se han introducido dos nuevos metodos basados en la transferencia de energfa de resonancia empleando diferentes marcadores basados en lantanidos fotoluminiscentes [Mathis, G (1993) Clin Chem 39: 1953-1959; Blomberg, K et al. (1999) Clin Chem 45: 855-861] para resolver en gran medida los principales problemas asociados a los ensayos homogeneos basados en FRET convencional. Ambos metodos proporcionan significativamente ventajas en comparacion con los metodos convencionales, pero la especificidad en la generacion de la senal se limita aun por la transferencia de energfa radiactiva (absorcion de la emision del donador), especialmente cuando las sondas marcadas se presentan en una concentracion elevada (por ejemplo, para alcanzar un gran intervalo dinamico, o para facilitar la union en caso de interacciones debiles) [H. Bazin, M. et al. (2001) Spectrochim. Acta, Part A, 57]. El exceso de aceptor sin unir da como resultado una senal de fondo radiactiva que decae lentamente hasta la senal de onda espedfica para el aceptor, pero la interaccion del donador en la longitud de onda de medida puede incrementar la senal de fondo a menos que se utilice una resolucion espectral suficiente. La utilizacion de un aceptor sin solapamiento (sin solapamiento FRET) con un donador quelato lantanido [Hemmila, I. y Laitala, V. (2005) Anal Chem. 77:1483-1487; Laitala, V. y Hemmila I. (2005) Analytica Chimica Acta 551: 73-78] puede eliminar ademas un posible fondo a traves de la reabsorcion de la emision del donador.

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En caso de un quelato (o criptato) lantanido fluorescente de vida larga como un donador en combinacion con un aceptor fluorescente de vida corta, convencional [Mathis, G (1993) Clin Chem 39: 1953-1959; Blomberg, K et al. (1999) Clin Chem 45: 855-861] la transferencia de energfa excitada por la emision del aceptor, se puede resolver temporalmente (con fluorometna en tiempo resuelto) a partir de una vida corta, excitada directamente por la fluorescencia del aceptor y la fluorescencia de fondo. La interaccion de la emision del donador a la longitud de onda de emision del aceptor se evita tambien casi por completo, debido a las estrechas bandas de emision de “similar lmea” de la emision del donador. Se obtiene las mismas ventajas empleando la conversion ascendente de compuestos de matriz de lantanido (fotoluminiscente anti-Stokes) [Heer, S et al. (2004) Adv Mater 16: 2102-2105; Kuningas, K et al. (2005) Anal Chem 77: 7348-7355] como donadores en combinacion con un aceptor fluorescente, convencional, y midiendo la transferencia de energfa excitada espedficamente por la emision del aceptor en longitudes de onda visibles bajo excitacion infrarroja del donador. La iluminacion infrarroja que no excita directamente al aceptor fluorescente convencional no generan ninguna autofluorescencia a longitudes de onda visibles, y la emision del donador de banda estrecha elimina eficazmente la interaccion potencial.

La emision anti-Stokes de nanocristales de matriz de lantanido de conversion ascendente aparece a longitudes de onda mas cortas (a longitudes de onda visibles) que a la excitacion infrarroja, proporcionando un gran desplazamiento anti-Stokes (hasta por encima de los 300 nm) y una separacion espectral eficiente de la luz de excitacion dispersa y autofluorescente (sin resolucion temporal) a partir de la emision a longitudes de onda visibles [Soukka, T. et al. (2005) J Fluorescence 15: 513-528]. La conversion ascendente es una caractenstica unica de determinados materiales basados en lantanido (a excepcion de unos pocos metales de transicion) capaz de convertir el infrarrojo a luz visible a traves de una absorcion no coincidente secuencial de dos fotones infrarrojos con una eficacia enormemente mejorada en comparacion con la absorcion de dos fotones simultaneos. El mecanismo de conversion ascendente se basa bien en un tipo de ion lantanido o bien en dos iones proximos de lantanido diferentes. Los iones de matriz de lantanido tienen estados excitados de vida larga, que funcionan como estados metaestables excitados a partir de un estado fundamental para excitarse de nuevo hasta un estado de emision, o energfa de transferencia, para otro ion lantanido. La conversion ascendente basada en lantanido puede proporcionar una detectabilidad extrema, como la que se observa en la fotoluminiscencia de fondo que es equivalente a la que se alcanza en la luminiscencia limitada incluso unicamente por la oscuridad y la sensibilidad del detector.

La conversion ascendente de quelatos se ha descrito en US 5.891.656, Xiao, X. et al. (2002) Opt Lett. 30: 16741676; y Faris GW y Hryndza M, Proc SPIE - Int Soc Opt Eng 2002; 4626: 449-452. En una conversion ascendente de un quelato de lantanido, un solo ion alcalinoterreo [por ejemplo, Er(III), Tm(III) o Ho(III)] o una combinacion de diferentes iones lantanidos, esta quelada a un ligando complejante mono o multinuclear o a ligandos multiples [WO 2004/086049 y Soukka, T. et al. (2008) Annals of the New York Academy of Sciences 1130: 188-200]. El ligando puede contener o no un ligando de estructura de fotocaptacion. La eficacia de la coleccion luminosa de los iones individuales y de los ligandos quelados sin una estructura de fotocaptacion es pobre, y requiere de una intensidad de excitacion luminosa relativamente alta. Por lo tanto, la conversion ascendente de quelatos alcalinoterreos se puede disenar para que contenga un ligando con estructuras de fotocaptacion organicas o inorganicas, por ejemplo, incorporar otro ion, tal como Yb(III). Las energfas recogidas de dos o mas fotones se transfieren uno despues de otro, mediante procesos no radiactivos intramoleculares desde el estado singlete hasta el estado triplete de la estructura organica, despues del estado triplete hasta el nivel emisivo del ion alcalinoterreo secuencialmente, el cual emite entonces un unico foton de emision caractenstica.

Los ensayos de hibridacion de acido nucleico basado en la fluorescencia homogenea, se basan normalmente o bien en una sonda silenciada (donador y quencher en una sonda oligonucleotida que se disocia) [US 5.538.848] o dos sondas de transferencia de energfa (sondas marcadas separadas, donadora y aceptora, que hibridan una a la otra en posiciones adyacentes). La Figura 1 describe una sonda que transfiere energfa en base a un ensayo de hibridacion, donde las dos sondas oligonucleotidas (1 y 2), marcadas con fluoroforos donador y aceptor (4 y 5, respectivamente) hibridan (6) en posiciones adyacentes en una secuencia diana complementaria (3). El aceptor se excita a una longitud de onda (A1) y se detecta la emision del aceptor sintetizado (transferencia de energfa excitada) (8), que es dependiente de la hibridacion (7), a otra longitud de onda (A2). Aunque, la fluorescencia por transferencia de energfa de resonancia (FRET) es una tecnologfa extremadamente versatil, se limita especialmente en el ensayo basado en la sonda de transferencia de energfa por la eficacia de la transferencia de energfa (senal relativamente baja) y fondo a traves de la reabsorcion de la emision del donador (limitado intervalo dinamico). Ademas, el ensayo basado en la sonda silenciadora requiere el marcaje espedfico con dos tintes diferentes, y es dependiente de la especificidad de solo un unico suceso de hibridacion.

Se han presentado diferentes metodos para la monitorizacion a tiempo real de la amplificacion de acido nucleico por Koch, W.H (2004) Nature Reviews Drug Discovery 3: 749-761. Por ejemplo, se ha presentado un par FRET que emplea un tinte acoplado a un cebador y otro acoplado a una sonda que hibrida adyacentemente, por Lay, M. J. et al. (1997) Clinical Chemistry 43: 2262-2267; un par FRET que emplea dos sondas marcadas de forma diferente que hibridan adyacentemente por Bernard, P.S., et al. (1998) American Journal of Pathology 153: 1055-1061; y el par FRET de hibridacion competitiva marcado con sondas complementarias por Kiviniemi, et al. (2005) Clinical Biochemistry 38: 1015-1022.

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La viabilidad de la tecnologfa de marcaje de lantanidos en ensayos basados en fluorescencia de extincion, ha sido descrita [Karvinen J et al. (2002) J Biomol Screen 7:223-231; Karvinen, J et al. (2004) Anal Chem. 76:1429-36; Karvinen, J et al (2004) Anal Biochem. 325: 317-25].

Se han presentado dos planteamientos para la hibridacion dependiente de la formacion de complejos de lantanido fluorescentes. El primer planteamiento se baso en un par de oligonucleotidos que forman un complejo de terbio(III) fluorescente tras la hibridacion; un oligonucleotido se marco con DTPA-terbio(III) (quelato de terbio no fluorescente) y el otro con salicilato donador de energfa (ligando de fotocaptacion) [Oser A y Valet G (1990) Angew Chem Int Ed Engl 29: 1167-1169]. El segundo planteamiento se baso en la formacion similar de un complejo europio(III) fluorescente pero que requiere la hibridacion de una sola sonda; la sonda oligonucleotida se marco con EDTA- terbio(III) (quelato de europio no fluorescente) y se acoplo un compuesto donador de energfa a un agente intercalante capaz de unirse al ADN bicatenario [Coates et al. (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 2311-2312; Mullins ST et al. (1996) J Chem Soc, Perkin Trans 1 1991: 85-81; Coates J et al. J Chem Soc, Chem Commun 1995: 2311-2312; US 5.827.653 y WO 95/08642]. El primer planteamiento se ha empleado tambien despues [Wang et al. (2001) Analytical Biochesmistry 299, 169-172; Yuang y Wang (2005) Journal of Fluorescence Vol. 15, N° 4, Julio, 559-568; Kitamura Y. et al. (2008) Journal of Inorganic Biochemistry Vol 102, N° 10, 1921-1931; y Kitamura, Y. et al. (2006) Nucleic Acids Symposium Series, N° 50, 105-106].

Las sondas sensor basadas en complejo de lantanido, se han descrito para la deteccion de iones metalicos, por ejemplo, por Leonard, J.P. y Gunnlaugsson, T. (2005) Journal of Fluorescente, 15:585-595 y Viquier y Hulme (2006) Biology, J. Am. Chem. Soc, 128: 11370-11371. Para cationes metalicos estos sensores funcionan de una manera competitiva y empleando un efecto antena, donde la union del ligando antena al ion lantanido se bloquea mediante otro ion metalico presente en la disolucion.

El ensayo de la reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa basada en la 5'-nucleasa (TaqMan; Applied Biosystems, Ciudad de Foster, CA) es un metodo de deteccion de la secuencia de acido nucleico, en donde una sonda oligonucleotida auto-extinguible monocatenaria, que contiene tanto un resto fluorescente como un resto silenciador, se separa por la accion nucleasa de la polimerasa de acido nucleico en la hibridacion durante la amplificacion del acido nucleico [Lie YS, Petropoulos CJ. (1998) Curr Opin Biotechnol. 9: 43-48; y Orlando C et al. (1998) Clin Chem Lab Med. 36: 255-269].

Las balizas moleculares son sondas de hibridacion oligonucleotidas monocatenarias que forman una estructura de horquilla [Tan W et al. (2004) Curr Opin Chem Biol.; 8: 547-553; y Tan W et al. (2000) Chemistry; 6: 1107-1111]. El bucle contiene una secuencia en la sonda de acido nucleico que es complementaria a la secuencia diana, y la horquilla se forma por reasociacion de los brazos de las secuencias complementarias que se localizan en cada lado de la secuencia de la sonda. Un resto fluorescente se une covalentemente al extremo de un brazo, y el quencher se une covalentemente al extremo del otro brazo. Debido a la proximidad de un resto fluorescente y un resto quencher a las balizas moleculares con un resto quencher, no es fluorescente cuando estan en disolucion libre. Sin embargo, cuando se hibridan a una cadena de acido nucleico complementaria que contiene una secuencia diana, se someten a un cambio conformacional que incrementa la distancia entre el resto fluorescente y el resto quencher, que hace posible que la sonda se vuelva fluorescente. En ausencia de una secuencia diana complementaria, la sonda baliza se mantiene cerrada y no hay fluorescencia debido a la extincion intramolecular.

Tanto las sondas fluorescentes auto-extinguibles como las balizas moleculares se utilizan tambien para procesos de amplificacion de acido nucleico en un termociclador, por ejemplo, en una reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa, la cantidad de fluorescencia en cualquier ciclo dado, o tras el ciclo, depende de la cantidad de producto espedfico. Las sondas se unen a la diana amplificada despues de cada ciclo de amplificacion dando como resultado una senal en la hibridacion, y en el caso de sondas Taqman en la separacion, que es proporcional a la cantidad de la secuencia oligonucleotida amplificada. La fluorescencia se mide durante cada etapa de reasociacion, cuando la baliza molecular se une a su diana complementaria, o despues de la etapa de elongacion, cuando se separa la sonda Taqman. Despues se utiliza la informacion durante la PCR cuantitativa o RT-PCR cuantitativa (PCR transcriptasa inversa) en experimentos para cuantificar el numero de copia inicial de la secuencia de acido nucleico diana amplificada basada en un numero de ciclo lfmite. Para el analisis final, las reacciones PCR o RT-PCR que contienen balizas moleculares pueden correr sobre cualquiera de los 96 pocillos del termociclador, y leerse despues en un lector de fluorescencia.

El analisis de protemas basado en sondas de proximidad espedfica y sensitiva, se ha descrito en el diagnostico medico y potencial por Gustafsdottir, S.M. (2005) Anal Biochem 345: 2-9 utilizando la union de proximidad de dos sondas oligonucleotidas.

Objetivo y compendio de la invencion

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo de bioensayo para detectar y/o cuantificar un analito.

La presente invencion proporciona un metodo de bioensayo para detectar y/o cuantificar un analito, como se presenta en la reivindicacion 1 independiente adjunta.

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Un metodo de bioensayo para detectar y/o cuantificar un analito que emplea un primer grupo que comprende un quelato transportador ionico de lantanido y un primer elemento de reconocimiento, en donde dicho quelato transportador de ion lantanido comprende un ligando transportador ionico lantanido y un ion lantanido; y un segundo grupo que comprende un ligando antena y un segundo elemento de reconocimiento; en donde dicho quelato transportador de ion lantanido se une, en las condiciones predominantes en dicho metodo de bioensayo, lo suficientemente fuerte a dicho lantanido, para dar como resultado un ion lantanido presente esencialmente en forma no libre, es decir, que es menos de 1 nmol/L, preferiblemente menos de 10 pmol/L, y un agente que se acompleja a dicho ion lantanido a una concentracion de al menos 1 pmol/L que se emplea adicionalmente; y dicho ligando antena se une debilmente a dicho ion lantanido, es decir, dicho ligando antena es bien monodentado, bidentado, tridentado o tetradentado; y en donde el reconocimiento de dicho analito mediante dicho primer elemento de reconocimiento de dicho primer grupo y mediante dicho segundo elemento de reconocimiento de dicho segundo grupo da como resultado o bien

i) un quelato de complementacion, es decir, la formacion de un complejo quelato de lantanido mixto a traves de la complementacion de dicho quelato transportador de ion lantanido que transporta dicho lantanido con dicho ligando antena, y por consiguiente, incrementa la fluorescencia; o bien

ii) un quelato de discomplementacion, es decir, dicho quelato transportador de ion lantanido que transporta dicho lantanido, se separa de dicho ligando antena, y por consiguiente, desciende la fluorescencia.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 ilustra un ensayo de hibridacion basado en un par de sondas de transferencia de energfa y la medicion de la energfa de transferencia entre el donador y el aceptor despues de la hibridacion. El par de sondas se hibrida a la secuencia diana proxima la una a la otra.

La Figura 2 ilustra un ensayo de complementacion de un quelato lantanido dirigido a un oligonucleotido utilizando dos sondas separadas que hibridan la una a las otra en una secuencia diana (planteamiento de la sonda de proximidad) facilitando que los restos marcados formen un complejo fluorescente.

La Figura 3 ilustra un ensayo de complementacion de un quelato lantanido dirigido a un oligonucleotido utilizando una sonda marcada dualmente con extremos terminales que hibridan la una a la otra en una secuencia diana (sonda tipo candado) facilitando que los restos marcados formen un complejo fluorescente.

La Figura 4 ilustra un ensayo de complementacion de un quelato lantanido dirigido a un oligonucleotido utilizando una sonda marcada dualmente con extremos terminales que tienen secuencias complementarias que hibridan el uno al otro (sonda de tipo baliza molecular) facilitando que los restos marcados formen un complejo fluorescente. Las secuencias de en medio hibridan a una secuencia diana dando como resultado un cambio conformacional de la sonda que retira el complejo fluorescente y da como resultado un descenso de la fluorescencia.

Las Figuras 5/i-iv muestran ejemplos de estructuras qmmicas esquematicas de ligandos antena de fotocaptacion aplicables a la complementacion del quelato lantanido. Las abreviaturas L y Z se emplean para representar partes alternativas de las estructuras qmmicas.

La Figura 6 muestra ejemplos de estructuras esquematicas para partes alternativas L (a-h) y Z (j-l) de las antenas de fotocaptacion presentadas en las Figuras 5/i-iv.

Las Figuras 7/i-iii muestran ejemplos de estructuras qmmicas esquematicas de quelatos transportadores de lantanido(IN), las estructuras f) a n) presentan las estructuras de quelato macrodclico ionico aplicables a la complementacion del quelato de lantanido segun la invencion.

La Figura 8 muestra estructuras esquematicas de a) un quelato transportador de europio(III) N1-(4-iso- tiocianatobenzil)dietilenotriamina-N1, N2, N3, N3-tetrakis(acetato)europio(III) (Eu3+-N1; quelato transportador ionico) y b) un ligando antena de fotocaptacion, acido 4-((isotiocianatofenil)etilnil)piridina-2,6-dicarboxflico (antena-3d) empleado en los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 5; intrmsicamente fluorescente c) quelato de europio(III) {2,2',2",2'"-{[4-[4- isotiocianatofenil)etinil]piridina-2,6-diil]-bis(metileno-nitrilo)}tetraquis(acetato)}europio(III) (Eu3+-7d; quelato de

lantanido fluorescente) empleado en el Ejemplo 2 y d) quelato de transportador de europio(III), quelato de europio(III) de acido 2,2',2"-(10-(3-isotiocianatobenzil)-1,4,7,10-tetraazaciclodecano-1,4,7-triil)-triacetico empleado en el Ejemplo 8.

La Figura 9 presenta los resultados del ensayo de hibridacion homogeneo descrito en el Ejemplo 1. La fluorescencia en tiempo resuelto despues de la hibridacion del par de sonda marcada (10 nM: cuadrado; 50 nM: cfrculo) con incremento de la concentracion del oligonucleotido diana. Cts se refiere a los recuentos. Las barras de error indican la desviacion estandar de la media.

La Figura 10 ilustra el espectro de emision de fluorescencia de un a) complejo dirigido hacia oligonucleotido formado por una sonda A-Eu3+-N1 y una sonda B-antena-3d con 0 nM (lmea discontinua) y 10 nM (lmea continua gruesa) de

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oligonucleotido diana, y b) una sonda C-Eu3+-7d obtenida en el Ejemplo 2. El espectro de extincion de la emision instalada del complejo que se forma de la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d con 10 nM de oligonucleotido diana, y el espectro de extincion de la sonda C-Eu3+-7d, se presentan en los insertos de la figura. A.u se refiere a unidad arbitraria.

La Figura 11 presenta los resultados de un ensayo de hibridacion heterogeneo basado en una sonda de proximidad descrito en el Ejemplo 4. La fluorescencia en tiempo resuelto despues de la incubacion de a) un sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena con un incremento de la concentracion del oligonucleotido diana biotinilado, y b) la sonda A-Eu3+- 7d con incremento de la concentracion del oligonucleotido diana biotinilado. Cts se refiere a recuentos.

La Figura 12 ilustra los conjugados de biotina empleados en el ensayo basado en la sonda de proximidad para estreptavidina y avidina en el Ejemplo 5. a) antena (+)-biotinil-hexanodiamina-3d y b) (+)-biotinil-3,6- dioxaoctanodiamina- Eu3+-N1.

La Figura 13 presenta los resultados del ensayo de estreptavidina y avidina descrito en el Ejemplo 5. La fluorescencia en tiempo resuelto despues de la incubacion de la antena (+)-biotinil-hexanodiamina y b) (+)-biotinil- 3,6-dioxaoctanodiamina- Eu3+-N1 con incremento de la concentracion de a) estreptavidina o b) avidina. Cts se refiere a recuentos.

La Figura 14 muestra las estructuras de a) un quelato transportador de terbio(III) N1-(4-

isotiocianatobenzil)dietilenotriamina-N1, N2, N3, N3-tetraquis(acetato)terbio(III) (Tb3+-N1; quelato transportador), y b) ligando antena de fotocaptacion de acido 4-(3-(4-isotiocianatofenetil)-2,4,6-trimetoxifenil)piridina-2,6-dicarboxflico (antena-TMP) empleado en el Ejemplo 6 y en el Ejemplo 7.

La Figura 15 presenta los resultados de un ensayo de hibridacion homogeneo descrito en el Ejemplo 6. La fluorescencia en tiempo resuelto despues de la hibridacion del par de sonda marcada (10 nM: cuadrado; 50 nM: drculo) con incremento de la concentracion del oligonucleotido diana. Cts se refiere a recuentos.

La Figura 16 muestra el espectro de emision de fluorescencia del oligonucleotido dirigido al complejo formado por la sonda A-Tb3+-N1 y la sonda B-TMP-antena con 0 nM (lmea discontinua) y 10 nM (lmea continua gruesa) del oligonucleotido diana obtenido en el Ejemplo 7. En la figura inserta se presenta el espectro de extincion de emision del complejo formado por la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d con 10 nM del oligonucleotido diana.

La Figura 17 presenta los resultados del ensayo de complementacion del quelato dirigido por el oligonucleotido (OCCA) descrito en el Ejemplo 8. Amplificacion y deteccion de 100.000 (0), 10.000 (+), 1.000 (A), 100 (□) y 0 (x) moleculas patron. La grafica muestra la senal de fluorescencia medida cada segundo del ciclo PCR comenzando en el ciclo 10.

Descripcion detallada de la invencion

Los ensayos bioanaltticos modernos para la medicion del analito, se basan en el reconocimiento biomolecular y el empleo de un resto marcador detectable; por ejemplo, un marcador fluorescente, para facilitar una lectura rapida. Los avances en los marcajes y en las tecnologfas de deteccion, han dado como resultado que el marcador per se no limite la sensibilidad, pero que la senal se genere a traves de interacciones no espedficas del reactivo marcado. Estas interacciones dependen de factores poco controlables, y que son practicablemente imposibles de evitar.

La deteccion del analito de “copia unica” se ha demostrado con tecnologfas innovadoras recientes que facilitan la generacion de una senal con especificidad mejorada. Estos metodos, tales como los ensayos de union por proximidad, donde la generacion de la senal es dependiente de la union de dos sondas oligonucleotidas, es aun demasiado complicada para aplicaciones practicas. El requerimiento absoluto para una modulacion estricta de la senal del marcador desde un estado totalmente oscuro hasta un estado brillante inducido mediante el reconocimiento de dos eventos, es aun un problema sin resolver con tecnologfas de marcaje simple. Solo un contacto molecular basado en un mecanismo de conmutacion del estado completo, permitira una especificidad adecuada para la generacion de la senal, e incluso los metodos de deteccion de proximidad basados en la mejor transferencia de energfa de resonancia de Foster no cumplen con esto.

Los inventores han descubierto que los lantanidos pueden proporcionar un planteamiento unico para realizar una tecnologfa de marcaje con un grado extraordinario de modulacion, mediante la separacion del quelato transportador de ion del lantanido y el ligando antena de fotocaptacion para diferentes restos marcadores. Ellos han resuelto como construir un sistema de marcaje basado en una sonda de proximidad conmutable, donde el estado oscuro del marcador no produce fluorescencia, el cual ha sido un problema en la tecnica descrita anteriormente. El enfoque propuesto supera las limitaciones de las FRET, y hace posible una fluorescencia real basada en una tecnologfa de marcaje dependiente de la proximidad, de alta actividad espedfica. La generacion de la senal es estrictamente dependiente del auto-ensamblado y de la complementacion del quelato (contacto molecular entre los dos restos marcadores) guiado por otros eventos de reconocimiento. Se puede construir, por tanto, un sistema de marcaje basado en un lantanido de complementacion mediante la utilizacion de dos restos marcadores, un quelato transportador de iones no fluorescente, y un ligando antena separado, y auto-ensamblado del quelato luminiscente de larga vida (contacto molecular en la orientacion correcta) a traves de dos eventos de reconocimiento simultaneos

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que gman los restos conjuntamente. Este enfoque basado en la fluorescencia de vida larga del lantanido, proporciona ventajas significativas sobre el estado de la tecnica, y se pueden extender, ademas, a la conversion ascendente y a la fotoluminiscencia anti-Stokes.

Segun una realizacion de la presente invencion, el reconocimiento del analito mediante dos elementos de reconocimiento separados produce una proximidad cercana del quelato transportador del ion lantanido y el ligando antena, permitiendo la complementacion del quelato, es decir, la formacion de un complejo de lantanido mixto, y consecuentemente el incremento de la intensidad de la luminiscencia del lantanido en disolucion acuosa.

Es caractenstico de la presente invencion que se facilite una conmutacion completa de la luminiscencia del lantanido desde el estado oscuro (estado no luminiscente) hasta el estado luminoso (estado luminiscente) (o viceversa) y que no se presente una fluorescencia de fondo significativa, al contrario que en metodos de tecnicas anteriores, donde la modulacion de la luminiscencia del lantanido se limita mucho debido a la fluorescencia de fondo observable.

El principio de la complementacion del quelato de lantanido dirigida mediante hibridacion oligonucleotida, se ilustra en la Figura 2. Una sonda oligonucleotida (1) se marca con un quelato transportador del ion lantanido (4) y otra sonda (2) con un ligando antena de fotocaptacion (5). Cuando se anade una secuencia nucleotida diana (3) con secuencias complementarias adyacentes a las dos sondas marcadas (6), se forma un acido nucleico hubrido bicatenario (7) que dirige el auto ensamblado del quelato mixto, y la formacion de un complejo altamente fluorescente (8). Las secuencias de las sondas (que incluyen el sitio de conjugacion para el ligando) y los ligandos (longitud y composicion, que incluyen orientacion y rigidez) se seleccionan para que las dos partes del marcador, es decir, el quelato transportador ionico y el ligando antena, produzcan una proximidad cercana en la posicion correcta para facilitar el auto ensamblado del quelato mixto. Cuando se forma el complejo, la fluorescencia se excita a una longitud de onda (A-i) y se mide la emision a otra longitud de onda (A2) al mismo tiempo o, en una fluorometna de tiempo resuelto, despues de un breve retraso tras la excitacion. Esta invencion comprende combinaciones de quelatos de lantanido y estructuras de ligandos unidos a oligonucleotidos separados, y su empleo en un ensayo de complementacion mejorado de un quelato de lantanido dirigido por un oligonucleotido. Los inventores han encontrado que la complementacion del quelato de lantanido dirigido por oligonucleotido proporciona un enorme potencial a explorar. Los quelatos, ligandos y condiciones empleados se han seleccionado previamente con los mejores conocimientos, pero proporcionan un rendimiento deficiente (menos de 3 veces la modulacion de la senal). [Oser, A y Valet, G (1990) Angew Chem Int Ed Engl 29: 1167-1169; Wang, GL et al. (2001) Anal Biochem 299: 169172; y US 6.242.268]. El grado de modulacion obtenido en todos los ejemplos anteriores han sido muy modestos (menos de tres veces), es decir, la conmutacion de la fluorescencia del lantanido ha sido incompleta debido a la fluorescencia de fondo significativa y facilmente observable desde el estado oscuro del sistema de marcaje, y no se han descrito mejoras a lo largo de los anos. Los inventores han observado ahora que esta modulacion de la fluorescencia se puede mejorar hasta 1.000 veces mediante la seleccion de una combinacion apropiada del ligando antena de fotocaptacion, del quelato transportador ionico, y de un compuesto quelante ionico adicional. Esto es una mejora enorme, como la mejor modulacion tfpica obtenida en ensayos de hibridacion tipo FRET convencional, alrededor de 20 veces, de la que solo se habfa obtenido previamente una modulacion de 3 veces basada en la formacion de un complejo de quelato lantanido mixto. En ensayos de complementacion de quelato de lantanido se alcanza un alto grado de modulacion, a traves de la utilizacion de un estricto requerimiento del quelato de complementacion para la generacion de la senal. Las mejoras dan como resultado que el ion lantanido que no esta esencialmente libre, se presente disponible en disolucion para formar complejos fluorescentes con multiples ligandos antena. Los inventores han encontrado que estas mejoras son tambien esenciales para permitir que los ensayos de complementacion del quelato se empleen, con un alto grado de modulacion, a temperaturas elevadas, por ejemplo, en condiciones que prevalecen durante la reaccion en cadena de polimerasa.

El complejo mecanismo de excitacion del lantanido se puede considerar el trampolm para la presente invencion de un nuevo sistema de marcaje basado en un lantanido de complementacion: el quelato de lantanido(III) no- fluorescente (quelato transportador ionico) se conmuta a una forma altamente fluorescente mediante complementacion del complejo de quelato con un ligando antena de fotocaptacion adicional. Para el ensayo basado en el principio de la sonda de proximidad, el quelato transportador (que contiene el ion) y el ligando antena, se unen a dos sondas de union biomolecular diferentes (por ejemplo, oligonucleotidos), que no interaccionan en disolucion a concentraciones (submicromolares) que se emplean generalmente en ensayos bioanalfticos y, por tanto, no se observa fluorescencia en la excitacion (el marcador esta en un estado oscuro). Sin embargo, cuando las dos sondas se llevan a posiciones estrechamente proximas, como resultado del reconocimiento simultaneo de la molecula diana (por ejemplo, una secuencia de acido nucleico complementario), el ligando antena se coordina al quelato transportador del ion lantanido (formando un quelato mixto) y el ion lantanido produce una fuerte fluorescencia en la excitacion (el marcador se conmuta al estado fluorescente). La complementacion del quelato transportador con el ligando antena requiere el contacto molecular en la orientacion correcta entre el ligando antena y el ion lantanido central. El proceso es exactamente auto-ensamblante, cuando la concentracion local eficaz favorece la union incluso a traves de interacciones debiles de coordinacion, cuando tanto el quelato transportador como el ligando antena se anclan en una estrecha proximidad.

Segun la invencion, el quelato transportador ionico se tiene que disenar para unir fuertemente el ion lantanido; es decir, para formar un complejo estable tanto termodinamica como cineticamente, con una alta constante de estabilidad; el grado de coordinacion preferido (numero de dientes) es de cinco y preferiblemente mayor, tal como

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seis o siete de un total de sitios de coordinacion del ion lantanido de nueve, dejando por tanto, al menos uno, pero preferiblemente dos o tres sitios de coordinacion, para la union del ligando antena. La estabilidad de los ligando aumenta, por ejemplo, en series de EDTA, DTPA, DO3A, DOTA (el mas estable). En ausencia del ligando antena, los sitios de coordinacion libres del ion lantanido se ocupan por moleculas de agua, extinguiendo eficazmente cualquier fluorescencia del lantanido residual. El ligando antena, sin embargo, debe tener solo una fuerza de union debil; el grado de coordinacion adecuado es el mas similar a dos o tres (referente a ligandos bidentados o tridentados) y las estructuras adecuadas son, por ejemplo, los ligandos de fotocaptacion descritos en una solicitud de patente reciente [WO 2005/021538] para la construccion de quelatos antena triples basados en aza-coronas. La estructura preferida del ligando de fotocaptacion organico (nivel de energfa del estado triplete) es dependiente del lantanido, y por tanto, se prefieren diferentes ligandos antena para, por ejemplo, iones terbio(III) y europio(III).

Segun la invencion, la senal es estrictamente dependiente de la proximidad del quelato transportador ionico y el ligando antena, y para alcanzar la alta especificidad de complementacion del quelato, la concentracion del ion lantanido libre se mantiene minima, mediante la seleccion apropiada del quelato transportador ionico, o mediante la adicion de un agente complejante para quelar el ion lantanido libre, y evitar la formacion de complejos fluorescentes que no comprenden el quelato transportador ionico. El agente complejante se elige preferiblemente para que sea selectivo para el ion lantanido. La inventores han observado, que la union del ligando antena de fotocaptacion al quelato transportador ionico (y tambien al ion quelado mediante el agente complejante) es mas diffcil que la union al ion libre, y por tanto, es esencial mantener la minima concentracion del ion lantanido libre para llevar a cabo la generacion de la senal estrictamente espedfica y dependiente solo de la complementacion del quelato, controlada mediante union molecular y por la proximidad del quelato transportador ionico y del ligando antena.

La combinacion del quelato transportador ionico y el ligando antena, se selecciona para que el ligando transportador ionico sea un ligando multidentado que forme un complejo estable (o muy estable) entre el ion lantanido, dejando al menos uno de los sitios de coordinacion sin ocupar (pero preferiblemente no mas de cuatro), facilitando, por tanto, la union del ligando antena y la formacion de un complejo, donde preferiblemente todos los sitios de coordinacion del lantanido se ocupan por cualquiera de los ligandos, reemplazando de esta manera las moleculas de agua coordinadas. La combinacion se puede seleccionar para que la union completa del ligando antena pueda requerir opcionalmente el desplazamiento de uno o dos dentados del ligando transportador, pero preferiblemente sin dar como resultado la disociacion del ion lantanido del quelato transportador ionico.

En caso de que el quelato transportador ionico no sea muy estable, puede aparecer algo de disociacion del ion lantanido en condiciones predominantes durante el ensayo, y segun la invencion, en tales casos un agente complejante esta presente en disolucion para acomplejar a los iones lantanido libres, previniendo la formacion de complejos fluorescentes entre el ion lantanido libre y el ligando antena. Los inventores han descubierto que esto da como resultado una enorme mejora en el rendimiento del ensayo sobre la tecnica anterior. Esto se puede explicar, por ejemplo, debido a la formacion de complejos multiligando altamente fluorescentes entre el ligando antena y el ion lantanido, es decir, un unico ion lantanido libre se puede unir hasta a tres o cuatro ligandos antena, que producen un complejo que es significativamente mas fluorescente que un unico complejo quelato mixto formado mediante complementacion de quelato del quelato transportador ionico de lantanido y el ligando antena. Los inventores han descubierto actualmente como proporcionar la conmutacion completa de la fluorescencia del lantanido mediante la complementacion del quelato, y resolver esencialmente este problema de la fluorescencia de fondo, que se presenta en los metodos de la tecnica anterior.

Segun una realizacion preferida de la invencion, el quelato transportador del ion lantanido, se selecciona para que sea un complejo inerte, es decir, la disociacion del ion lantanido del complejo debe ser lenta en las condiciones predominantes durante el ensayo. Se sabe que la presencia de otros iones y agentes complejantes en la disolucion acuosa, y el incremento de la temperatura, daran normalmente como resultado un incremento en la disociacion de complejos de coordinacion, y por tanto, para determinadas aplicaciones, por ejemplo, para la monitorizacion de la reaccion en cadena de la polimerasa, es esencial seleccionar un quelato transportador ionico muy estable que proporcione una tasa de disociacion lenta, incluso a temperaturas elevadas. Normalmente el quelato transportador del ion lantanido y el ligando antena se emplean a concentraciones submicromolares, aumentando ademas la importancia de la estabilidad, y especialmente, la tasa de disociacion lenta del complejo. Se prefieren los quelatos transportadores del ion lantanido que contienen estructuras de quelato macrodclico ionico, tales como los derivados de 1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (DO3A) [Mishra, A. et al (2005) Proc Intl. Soc Mag. Reson. Med. 13: 2592] sobre las estructuras de quelato de cadena lineal abierta ionica, para proporcionar una tasa de disociacion lenta [Morcos, S.K. (2007) The British Journal of Radiology 80: 73-76] en condiciones extremas predominantes durante algunas aplicaciones del bioensayo. Segun una realizacion, el quelato transportador del ion lantanido, se selecciona para proporcionar estabilidad cinetica con una vida media de disociacion en las condiciones de ensayo predominantes a lo largo de 2 horas, preferiblemente durante 10 horas, y lo mas preferiblemente durante 24 horas; por ejemplo, la vida media de disociacion estimada de determinados quelatos macrodclicos en condiciones fisiologicas puede ser de varios anos [Schmitt-Willich, H. (2007) British Journal of Radiology 80: 581582]. Las condiciones de bioensayos tfpicos tienen un pH proximo al valor neutral, por ejemplo, entre 6,0-9,0, y tienen una resistencia ionica entre 0,01 M y 1M. La temperatura tfpica predominante en los bioensayos es de 20-40 °C, pero deltas aplicaciones requieren temperaturas de hasta 100 °C. La estabilidad cinetica y termodinamica de ambos quelatos de galodinio(III) de cadena abierta macrodclica, se han descrito por Port M. et al. (2008) Biometals 21: 469-490. Los compuestos macrodclicos, tales como DO3A y DOTA, han mostrado una disociacion

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significativamente mas lenta del ion, que la de los quelatos de cadena abierta, tal como DTPA. Ademas, los quelatos ionicos (carga neta negativa) teman mejor estabilidad que la de los no ionicos (carga neta neutral).

Segun otra realizacion de la presente invencion, se puede anadir en la disolucion del bioensayo un ligando quencher de union debil, para reemplazar el agua coordinada del ion lantanido presente en el quelato transportador ionico, y extinguir la fluorescencia potencialmente remanente del quelato transportador de ion lantanido que no participa en la complementacion del quelato. Se seleccionara el ligando quencher monodentado, bidentado o tridentado, y que se reemplace rapidamente por el ligando antena que los lleva a una proximidad estrecha mediante un suceso de union biomolecular.

Segun otra realizacion de la presente invencion, se emplea mas de un ligando antena diferente en combinacion con uno o multiples quelatos transportadores ionicos que aun contienen el mismo lantanido, dando como resultado pares de quelato mixtos diferentes que producen luminiscencias de vidas caractensticas que facilitan la medicion de parametros adicionales.

Segun algunas realizaciones preferidas de la presente invencion, la tasa de las constantes de estabilidad condicional del complejo formado por el ligando transportador ionico lantanido, y el complejo formado por el ligando antena y el ion lantanido, es al menos 104, preferiblemente al menos 105, y mas preferiblemente al menos 106, bajo las condiciones de la determinacion del analito; es decir, el complejo formado por el ligando transportador del ion lantanido y el ion lantanido, es significativamente mas estable.

Definiciones

El termino “fluorescencia” y “luminiscencia” deberan entenderse que abarcan fotoluminiscente, es decir, la luminiscencia excitada mediante luz, fluorescencia, incluyendo la fluorescencia retardada con una vida de fluorescencia de microsegundos o milisegundos, fotoluminiscencia ionica, fotoluminiscencia anti-Stokes basada en conversion ascendente, y fosforescencia. Ademas, el termino debera abarcar la luminiscencia electrogenerada y la electroquimioluminiscencia.

El termino “lantanido” e “ion lantanido” debera entenderse aqrn por ser equivalente a un “ion metalico alcalinoterreo” y por incluir solo iones de lantanido trivalentes, y cualquier combinacion de los diferentes elementos lantanidos de a continuacion: neodimio, praseodimio, samario, europio, prometio, gadolinio, terbio, disprosio, holmio, erbio, tulio, iterbio e itrio, especialmente erbio, praseodimio, tulio, e iterbio.

En esta divulgacion los terminos “complejo lantanido luminiscente”, “quelato lantanido luminiscente” y “quelato lantanido complementado” se deberan entender por incluir los complejos luminiscentes formados por un quelato transportador del ion lantanido, y un ligando antena de fotocaptacion de complementacion, cuando el ion lantanido se excita a traves del ligando de fotocaptacion u otra estructura ligando excitable o un ion lantanido no luminiscente o un ion lantanido sensibilizador. Un quelato lantanido complementado es un ejemplo de un quelato mixto que comprende un quelato transportador ionico y un ligando antena de fotocaptacion.

El termino “quelato transportador del ion lantanido”, “quelato transportador ionico” y “quelato transportador” debera entenderse por incluir como complejos tales como los de quelato lantanido no luminiscentes y sus derivados, que comprenden un ligando quelante, es decir, un ligando transportador ionico, y un ion lantanido luminiscente o un ion lantanido activador, pero que no comprende una estructura de fotocaptacion eficaz u otra estructura excitable o ion lantanido sensibilizador esencial para la luminiscencia del lantanido. El ion lantanido en el quelato puede ser un unico ion lantanido o una combinacion de varios iones lantanidos iguales o diferentes. Representan ejemplos de quelatos transportadores ionicos lantanidos los quelatos de acido aminopolicarboxflico dclico y no dclico de Eu(III), Sm(III), Tb(III) y Dy(III), con un numero de coordinacion preferiblemente igual a o mayor de 6 dentados, optimamente de 7 u 8, pero que no contienen una estructura de fotocaptacion eficaz u otra estructura excitable o un ion lantanido sensibilizador.

Los terminos “sensibilizador” e “ion lantanido sensibilizador” debera entenderse como el ion lantanido responsable de la absorcion de la luz y que actua como donador de energfa para el ion lantanido activador, el cual actua como aceptor de energfa. Ejemplo de un sensibilizador es el terbio y cerio trivalente.

Los terminos “activador” e “ion lantanido activador” debera entenderse como el ion responsable de la emision luminiscente y que actua como aceptor de energfa, aceptando energfa del ion lantanido sensibilizador, que actua como un donador de energfa. Ejemplos de activadores son el erbio, tulio, holmio, y terbio trivalente.

La “constante de estabilidad” y la “constante de formacion” del complejo entre el ligando transportador ionico y el ion lantanido (o el complejo entre el ligando antena y el ion lantanido; o el complejo entre el agente complejante y el ion lantanido) en disolucion acuosa, debera entenderse como la constante de equilibrio para la reaccion de complejamiento entre el ligando y el ion metalico. Se puede encontrar una explicacion detallada del termino en las pp. 279-304 en Quantitative Chemical Analysis, D.C. Harris, 1991, 3a Edicion, Freeman y Colaboradores, Nueva York. El valor se expresa como el log K, donde K se puede calcular mediante la division de la concentracion del complejo por el producto de las concentraciones de los tres ligandos (normalmente forma completamente desprotonada) y el ion metalico libre, prevaleciendo todo en estado de equilibrio a una temperatura y fuerza ionica

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determinadas. La constante de estabilidad de mayor valor, se acompleja con el ligando del metal mas fuerte. Esto implica que los quelatos transportadores del ion lantanido con mayores constantes de estabilidad, son mas estables que aquellos con una constante de estabilidad mas pequena. Normalmente, las constantes de estabilidad se miden a temperatura ambiente (20-25 °C) y la fuerza ionica de 0,1 M. Se pueden encontrar ejemplos de valores del log K para complejos ionicos de lantanido(lM) en Martell, A.E. y Smith, R.M., Critical stability constants, Vol 1, pp 204-211, Plenum Press, Nueva York, 1974; y Wu, SL Horrocks, WD (1997) Journal of the Chemical Society-Dalton Transactions 1497-1502.

La “constante de estabilidad condicional” y la “constante de formacion condicional” y la “constante de formacion eficaz” del complejo entre el ligando transportador ionico y el ion lantanido (o el complejo entre el ligando antena y el ion lantanido) en disolucion acuosa, debera entenderse como la constante de equilibrio para la formacion de un complejo bajo un estado particular de un grupo de condiciones, tales como pH, fuerza ionica, temperatura y concentracion de especies complejantes auxiliares. Se puede encontrar una explicacion detallada del termino en la pp. 279-304 en Quantitative Chemical Analysis, D.C. Harris, 1991, 3a Edicion, Freeman y Colaboradores, Nueva York.

El termino “ligando de complementacion”, “antena de fotocaptacion” o “ligando antena” se entenderan por incluir como tal a los ligandos quelantes no luminiscentes y a los quelatos lantanidos y sus derivados, que comprende una estructura de fotocaptacion u otra estructura de ligando excitable sin un ion lantanido o complejos quelato de un ion lantanido no luminiscente, o un ion lantanido sensibilizador, y que son capaces de la complementacion de un quelato transportador del ion lantanido para formar un complejo lantanido luminiscente. El ion lantanido que se incluye opcionalmente en el ligando antena, puede ser un unico ion lantanido o una combinacion de varios iones lantanidos iguales o diferentes. Ejemplos de tales iones lantanido que se utilizan para mejorar la absorcion o la intensidad de emision de la luz en el fenomeno de co-fluorescencia o en la conversion ascendente basada en lantanido son, por ejemplo, Gd(III), Y(III) e Yb(III). Ejemplos de ligandos antena [Latva, M. (1997) J. Lumin 75: 149-169] son estructuras organicas de fotocaptacion capaces de coordinar los iones lantanido, preferiblemente con 4 dientes o menos, optimamente de 3 a 2 dientes, y que normalmente pueden transferir su energfa de excitacion a traves del estado triplete para iones lantanidos coordinados, tales como Eu(III), Sm(III), Tb(III) y Dy(III). Se han descrito tambien ejemplos de estructuras de ligandos antena adecuados para lantanidos que emiten cerca del infrarrojo, tales como Yb(III), Er(III) y Nd(III) [Hofstraat, J.W. et al. (1998) J Fluorescence 8: 301-307].

Los terminos “no luminiscente” y “no fluorescente” deberan entenderse como una propiedad del compuesto que absorbe la luz para producir alguna o una cantidad significativa de un tipo de luminiscencia deseada, por ejemplo, luminiscencia de vida larga, cuando se excita y se relaja desde el estado excitado. Al contrario que los compuestos luminiscentes, la energfa del estado excitado de un compuesto no luminiscente se relaja predominantemente a traves de rutas no radiactivas, que producen normalmente calor en vez de luz, o una emision rapida en vez de una emision de extincion lenta o la excitacion eficaz es escasa. El coeficiente de extincion molar o absortividad molar de un compuesto no luminiscente es muy bajo, normalmente por debajo de 10 Lmol'1cm'1, o el rendimiento cuantico de fluorescencia de un compuesto no luminiscente es muy pobre, normalmente por debajo del 5 por ciento, o la vida de la luminiscencia es menor de 1 microsegundo, normalmente menos de 100 nanosegundos. Ejemplos de compuestos no luminiscentes son los quelatos lantanidos, que no contienen una estructura antena de fotocaptacion para su excitacion eficaz.

El termino “luminiscencia de lantanido” y “luminiscencia” debera entenderse como la luminiscencia (es decir, emision de luz) obtenida a partir de la relajacion emisiva de transiciones electronicas del ion lantanido. La luminiscencia del lantanido se puede generar por excitacion del ion lantanido mediante absorcion de luz directa o indirecta, o mediante excitacion qmmica electrogenerada.

El termino “quelato” se define como un complejo de coordinacion donde un unico ion central se coordina (o se coordinan iones centrales multiples) con al menos un ligando con al menos un enlace de coordinacion (cada uno). Estos complejos se pueden nombrar mediante diferentes principios, y se emplean nombres como quelatos, compuestos supramoleculares y complexonas. Tipos de quelatos especiales incluyen, por ejemplo, acidos poliaminocarboxflicos, complejos macrodclicos, esteres corona, criptatos, calixarenos y porfirinas. El termino “quelato mixto” se debera entender como un quelato que comprende al menos dos ligandos diferentes coordinados con al menos un enlace de coordinacion cada uno.

Los terminos “fluorescencia de lantanido en tiempo resuelto”, “fluorescencia en tiempo resuelto”, “luminiscencia de lantanido de vida larga” y “fluorescencia de vida larga” debera entenderse aqrn como luminiscencia de lantanido, donde la vida de luminiscencia del compuesto luminiscente es igual o mayor de 1 microsegundo (la vida se calcula como el tiempo en donde la intensidad de emision de luminiscencia decae hasta un valor relativo de 1/e, es decir, hasta aproximadamente 37% de la intensidad de emision luminiscente original). Ejemplos de compuestos capaces de incluir fluorescencia de larga media incluyen, pero no se limitan a, complejos quelato intrmsicamente fluorescentes de Eu(III), Sm(III), Tb(III) y Dy(III) que contienen una antena de fotocaptacion apropiada.

Los terminos “luz”, “excitacion de luz” y “emision de luz” deberan entenderse por abarcar la radiacion electromagnetica a longitudes de onda de 200 nm hasta 1600 nm. Estas longitudes de onda se llama luz ultravioleta

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por debajo de 400 nm, luz cercana al ultravioleta entre 300-450 nm, luz visible entre 400-750 nm, luz cercana al infrarrojo entre 700-1000 nm y luz infrarroja por encima de 700 nm.

El termino “fluorescencia de vida corta” y “compuesto fluorescente de vida corta” debera entenderse por abarcar la fluorescencia y los compuestos fluorescentes con una vida media luminiscente de menos de 1 microsegundo, preferiblemente menos de 100 nanosegundos.

Los terminos “conversion ascendente de lantanido”, “conversion ascendente” y “fotoluminiscencia anti-Stokes” debera entenderse aqu como una luminiscencia de lantanido, donde la emision fotoluminiscencia a partir de la luminiscencia del compuesto lantanido, se obtiene a una longitud de onda mas corta que a la longitud de onda de excitacion de la luz. La conversion ascendente de los compuestos de lantanido luminiscentes pueden, por tanto, convertir una menor energfa luminosa de la luz incidente para una mayor energfa de luz emitida. Esto se llama tambien fluorescencia anti-Stokes o fotoluminiscencia anti-Stokes. Ejemplos de tales compuestos son materiales completamente inorganicos o Idbridos que contienen Er(III) como activador y Yb(III) como sensibilizador que produce emision verde o roja bajo excitacion infrarroja.

Los terminos “luminiscencia electrogenerada” y “electroquimioluminiscencia” deberan entenderse aqu como la luminiscencia de lantanido producida mediante excitacion qrnmica electrogenerada empleando un electrodo, y aplicando una corriente electrica o voltaje al electrodo. Dependiendo del electrodo donde se produzca la reaccion electroqmmica aparece la electroquimioluminiscencia llamada electroquimioluminiscencia catodica o anodica. Los compuestos luminiscentes electrogenerados son compuestos capacitados con luminiscencia electrogenerada anodica o catodica. Un ejemplo es un compuesto que se calienta con un electron excitado 2,6-bis[N,N-bis(carboxi- metil)-aminometil]-4-benzolfenol-quelato Tb(III) que produce emision verde [Kulmala, S. y Haapakka, K. (1995) J Alloys Comp 225: 502-506] pero hay otros complejos de lantanido capacotados de luminiscencia electrogenerada [Kulmala, S. et al. (1998) Anal Chim Acta 359: 71-86; y Jiang, Q. et al. (2006) Anal Chim Acta 558: 302-309]. La luminiscencia electrogenerada de los complejos de lantanido se puede medir tambien utilizando la resolucion temporal para mejorar el lfmite de deteccion.

En esta divulgacion, el termino “bioensayo” debera entenderse por referirse a la deteccion y/o cuantificacion del analito basado en la luminiscencia del lantanido y la utilizacion de elementos de reaccion. El analito se detecta y/o mide normalmente a partir de una muestra o una almuota de una muestra, cuya muestra es, por ejemplo, una muestra biologica o medioambiental o una reaccion de amplificacion de acido nucleico.

El termino “bioensayo homogeneo” debera entenderse por abarcar los bioensayos que no requieren etapas de separacion. Las unicas etapas que se requieren son etapas simples o multiples de cada una; adicion de reactivos, incubacion y medicion. El termino “etapa de separacion” debera entenderse por ser una etapa donde un reactivo del bioensayo marcado, se une a una fase solida, tal como, por ejemplo, una micropartmula o un pocillo para microtitracion, se separa y afsla fisiologicamente del reactivo marcado sin unir; por ejemplo, el pocillo para microtitracion se lava (el lfquido se elimina, para mejorar la separacion, se anade lfquido adicional y se vada el pocillo) dando como resultado una separacion del reactivo de bioensayo marcado unido a la fase solida, del reactivo de bioensayo marcado no unido en la fase solida.

El termino “analito” debera entenderse como una sustancia de interes, la cual se va medir o se va a medir el efecto de la misma mediante bioensayo. El analito puede ser, por ejemplo, una protema, un antfgeno de membrana celular, un receptor, un acido nucleico, un hapteno, una hormona, un peptido, un oligonucleotido, un producto de amplificacion de acido nucleico, una forma conformacional o cambio de estructura espedfica de una molecula, tal como la separacion a traves de la actividad proteasa o nucleasa, o subunidades estructurales de multimerizacion, asociacion o disociacion de dos biomoleculas a traves de interacciones de union molecular.

El termino “hapteno” debera entenderse por referirse a una molecula pequena que puede provocar una respuesta inmune solo cuando se une a un gran transportador, tal como una protema. Ejemplos de haptenos son hormonas esteroideas, vitaminas, peptidos, sacaridos, medicamentos y farmacos de abuso.

Los terminos “muestra” y “muestra biologica” deberan entenderse por abarcar varias muestras biologicas solidas o lfquidas de las cuales se detecta el analito, tal como suero, sangre, plasma, orina, heces, plasma seminal, sudor, alcohol, lfquido amniotico, tejido homogeneizado, lfquido asdtico, muestras de estudios mediambientales (muestras de agua y suelo), procesos industriales (disoluciones de procesos) y bibliotecas de compuestos (cribado de bibliotecas que comprenden compuestos organicos, compuestos inorganicos, productos naturales, extractos o resultados de la purificacion de fuentes biologicas que contienen protemas, peptidos, o acidos nucleicos). La muestra puede ser tambien una reaccion enzimatica, tal como una reaccion proteasa o nucleasa, u otra reaccion de conversion, reaccion en cadena de la polimerasa u otra reaccion de amplificacion de acido nucleico.

El termino “elemento de reconocimiento” se refiere a cualquier reactivo que se pude considerar que es espedfico para algun compuesto de relevancia en las circunstancias que se refieren, y debena entenderse por abarcar a los reactivos de union bioespedfica, tal como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, armazones proteicos (por ejemplo darfinas, aficuerpos, monocuerpos), peptidos, aptameros, protemas de union a hormonas naturales, sacaridos, lectinas, enzimas, receptores, estreptavidina, biotina, acidos nucleicos naturales y artificiales (tal como acidos

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nucleicos o acidos nucleicos peptidicos bloqueados) y derivados peptfdicos, y anticuerpos genetica o qmmicamente modificados, o composiciones quimericas de cualquiera de lo anterior, que se pueden unir covalentemente o no covalentemente y reconocer biomoleculas a detectar. Los elementos de reconocimiento se emplean normalmente como reactivos de union bioespedfica en inmunoensayos, ensayos de hibridacion de acido nucleico, ensayos de ligando-lectina y ensayos de ligando-receptor.

Los terminos “agente complejante”, “agente complejante” y “agente quelante” deberan entenderse en este contexto como moleculas, que pueden formar varios enlaces de coordinacion con un unico ion metalico, es decir, son ligandos polivalentes. Los agentes complejantes mas comunes y que se emplean mas ampliamente, son aquellos que se coordinan a iones metalicos a traves de atomos donadores de oxfgeno o nitrogeno, o a traves de ambos. Ejemplos de agentes complejantes son el acido nitrilotriacetico (NTA), acido etilenodiaminotetraacetico (EDTA), acido dietilenotriaminopentaacetico (DTPA), acido etilenglicol-O,O'-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA), acido 1,4,7-triazaciclononano-N,N'N"-triacetico (NOTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N'"- tetraacetico (DOTA), acido ciclohexil 1,2-diamina tetra-acetico (CDTA), acido NiN'-bis(hidroxibenzil)-etilenodiamino- N,N'-diacetico (HBED), acido trietileno tetramino hexaacetico (TTHA), acido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano- N,N',N",N'"-tetraacetico (TETA), acido hidroxietildiamino triacetico (HEDTA) y derivados de cualquiera de estos quelantes.

El termino “complejo lantanido de conversion ascendente” en este contexto significa un quelato mixto que comprende un unico ion lantanido o una combinacion de diferentes iones alcalinoterreos. El ligando antena puede contener o no un lantanido sensibilizante y/o una estructura de fotocaptacion.

Realizaciones preferidas de la invencion

Un metodo de bioensayo tfpico para detectar el analito y/o cuantificar la concentracion de analito segun la invencion, emplea un primer grupo que comprende un quelato transportador del ion lantanido y un primer elemento de reconocimiento, en donde dicho quelato transportador del ion lantanido comprende un ligando transportador del ion lantanido y un ion lantanido; y un segundo grupo que comprende un ligando antena y un segundo elemento de reconocimiento; en donde dicho quelato transportador del ion lantanido se une, en las condiciones predominantes en dicho metodo de bioensayo, lo suficientemente fuerte a dicho lantanido, para dar como resultado que esencialmente no haya ion lantanido libre presente, es decir menos de 1 nmol/L, preferiblemente menos de 10 pmol/L, y se emplea adicionalmente un agente complejante de dicho ion lantanido a una concentracion de al menos 1 pmol/L; y dicho ligando antena se une debilmente a dicho ion lantanido, es decir, dicho ligando antena es bien monodentado, bidentado, tridentado o tetradentado; y en donde el reconocimiento de dicho analito mediante dicho elemento de reconocimiento de dicho primer grupo y mediante dicho segundo elemento de reconocimiento de dicho segundo grupo se da como resultado bien

i) un quelato de complementacion, es decir, la formacion de un complejo quelato de lantanido mixto a traves de la complementacion de dicho quelato transportador del ion lantanido que transporta dicho lantanido con dicho ligando antena, y por consiguiente, incrementa la fluorescencia; o

ii) un quelato de discomplementacion, es decir, dicho quelato transportador del ion lantanido que transporta dicho lantanido se separa de dicho ligando antena, y por consiguiente, desciende la fluorescencia.

En realizaciones preferidas del bioensayo

a) el log KLnLi es al menos 12, preferiblemente por encima de 18, en donde KLnLi se refiere a la constante de estabilidad del complejo entre el ligando transportador ionico y el ion lantanido en disolucion; o

b) donde se emplea ademas el agente complejante de dicho ion lantanido

i) log KLnL2 es al menos 12, en donde KLnL2 se refiere a la constante de estabilidad del complejo entre el ligando transportador ionico y el ion lantanido en disolucion; y

ii) log KLnL3 es al menos 8, en donde KLnL3 se refiere a la constante de estabilidad entre dicho agente complejante que acompleja dicho ion lantanido y el ion lantanido en disolucion.

En realizaciones de la invencion el quelato transportador ionico es hexadentado, heptadentado u octadentado.

El ion lantanido del quelato transportador ionico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en praseodimio(III), neodimio(III), samario(III), europio(III), terbio(III), disprosio(III), holmio(III), erbio(III), tulio(III), e iterbio(III). El primer y segundo elementos de reconocimiento son preferiblemente independientes entre sf, seleccionados del grupo que consisten de oligonucleotidos, aptameros, peptidos, protemas, haptenos, oligosacaridos.

El ligando antena es tetradentado, tridentado, bidentado o monodentado, preferiblemente tridentado o bidentado.

El log KLnLi es normalmente de al menos 20, preferiblemente por encima de 22.

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El agente complejante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en CDTA, EDTA, DOTA, DTPA, EGTA, HBED, HEDTA, NOTA, NTA, TETA y TTHA. Cuando se emplea un agente complejante del ion lantanido, dicho agente complejante es normalmente un enlazador mas fuerte de dicho ion lantanido que el ligando antena, es decir, log KLnL3 > log KLnL4, en donde KLnL4 se refiere a la constante de estabilidad del complejo entre dicho ligando antena y dicho ion lantanido en disolucion; y preferiblemente un enlazador mas debil del ion lantanido que el quelato transportador ionico, es decir, log KLnL3 < log KLnL2.

El ligando transportador del ion lantanido se deriva normalmente de EDTA, DTPA, NOTA o DOTA, o se selecciona de las estructuras f) a n) que se presentan en las Figuras 7/i, 7/ii y 7/iii. El ligando antena comprende normalmente una estructura de fotocaptacion que se selecciona del grupo que consiste en las estructuras a) a z) ilustradas en las Figuras 5/i, 5/ii, 5/iii y 5/iv.

El reconocimiento del analito da como resultado un aumento o descenso de la fluorescencia, y dicha fluorescencia se mide normalmente a una longitud de onda de entre 400 y 1600 nm.

El analito detectado y/o cuantificado se selecciona normalmente del grupo que consiste en estreptavidina, protema, hapteno, una secuencia de acido nucleico, celulas, virus y el producto de reacciones de amplificacion del acido nucleico, por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa.

El reconocimiento del analito da como resultado un aumento o descenso de la fluorescencia, y normalmente dicha fluorescencia tiene una vida de fluorescencia larga, es decir, una vida > 1|js.

El reconocimiento del analito da como resultado un aumento o descenso de la fluorescencia, y preferiblemente dicha fluorescencia es una fluorescencia de conversion ascendente (es decir, fotoluminiscencia anti-Stokes, en donde la emision se detecta a una longitud de onda mas corta que la de excitacion).

En muchas realizaciones preferidas las condiciones predominantes comprenden una temperatura de al menos 40 °C o superior.

Segun una realizacion de la invencion la tecnologfa de marcaje basada en lantanido se aplica en ensayos de hibridacion, y en la monitorizacion del tiempo real en “tubo cerrado” de la amplificacion del acido nucleico, por ejemplo, reaccion en cadena de la polimerasa, reaccion en cadena de la ligasa o algun procedimiento de amplificacion del acido nucleico isotermico [Gill, P. y Ghaemi, A. (2008) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27: 224-243]. Los enlazadores biomoleculares son, por ejemplo, oligonucleotidos u oligonucleotidos analogos, tales como acidos nucleicos peptfdicos (PNA) o acidos nucleicos bloqueados (LNA).

El principio del ensayo de complementacion del quelato de lantanido dirigido por oligonucleotido para ensayos de hibridacion de acido nucleico homogeneo se describe en la Figura 2; este principio facilita un ensayo basado en dos sondas (hibridadas una junto a la otra) para realizar sin utilizar FRET. Una de las sondas se marca con un quelato lantanido no fluorescente (4) y la otra con un ligando antena de complementacion (5) acoplado a una estructura de fotocaptacion adecuada; el quelato y el ligando juntos son capaces de formar un complejo lantanido fluorescente. Segun otras realizaciones de la invencion, el metodo se puede ampliar ademas a sondas de tipo candado o baliza molecular, como se describe en la Figura 3 y en la Figura 4, respectivamente.

En la Figura 3, la sonda tipo candado se compone de dos secuencias oligonucleotidas terminales conectadas con un enlazador (9) (por ejemplo, una secuencia oligonucleotida), y una secuencia terminal (1) que se marca con un quelato transportador del ion lantanido (4) y la otra secuencia terminal (2) con un ligando antena de fotocaptacion (5). Cuando se anade una secuencia nucleotida diana (3) con secuencias complementarias adyacentes a los dos extremos terminales marcados (6), se forma un acido nucleico bicatenario hubrido (10) que dirige el auto ensamblado del quelato mixto, y la formacion de un complejo altamente fluorescente (8). La formacion del complejo da como resultado un incremento de la fluorescencia a la longitud de onda de emision (A2) excitada a la longitud de onda de excitacion (A1).

La Figura 4 ilustra un ensayo de hibridacion empleando una sonda de tipo baliza molecular, donde la sonda marcada, ademas de las secuencias espedficas del analito (11b y 12b) contiene dos secuencias complementarias (11a y 12a) que, en ausencia de la secuencia del analito (3) produce que las partes del quelato, el ligando antena (5) y el quelato transportador ionico (4) acopladas cerca de las secuencias complementarias, en una proximidad cercana, permite la complementacion del quelato y la formacion de un complejo fluorescente (8). Cuando la secuencia del analito (3) se lleva en la disolucion (14) las secuencias espedficas del analito reconocen a sus secuencias complementarias formando una cadena bicatenaria parcial (13) que aparta el quelato mixto, y da como resultado una florescencia reducida en la longitud de onda de emision (A2) excitada a la longitud de onda de excitacion (A1).

Segun otra realizacion de la invencion, la tecnologfa de marcaje se aplica en la deteccion proteica y en la medicion de las interacciones protema-protema. En estas aplicaciones el control de la orientacion y la distancia entre las dos sondas puede utilizar ligandos naturales, pequenos peptidos de union, o enlazadores artificiales disenados de novo y/o enlazadores moleculares enriquecidos junto con qmmicas de acoplamiento espedfico de sitio. La invencion es especialmente adecuada para la deteccion de protemas multimericas y complejos de protemas multimericas, que

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incluyen, por ejemplo, protemas de capsidas vmcas y protema C-reactiva como se describe para pinzas moleculares [Heyduk E, et al. (2008) Anal Chem. 80: 5152-5159].

Segun una realizacion de la invencion, el metodo se aplica para la deteccion de la dimerizacion proteica (o multimerizacion) inducida por, por ejemplo, el cambio en la concentracion ionica o en la presencia de un analito o pequenos ligandos, tales como antibioticos o esteroides. Un ejemplo de tal evento es la dimerizacion proteica dependiente del ion calcio [Appelblom H, et al. (2007) J Biomol Screen 12: 842-8]. La dimerizacion puede ser bien la formacion de un heterodfmero, o bien un homodfmero. Se ha descrito otro ejemplo empleando la reasociacion de dominios variables de anticuerpo dependiente de antfgeno [Ueda, H. (2003) J Immunol Methods 279: 209-218].

Segun la invencion, tanto el quelato transportador como el ligando antena, se unen covalentemente al enlazador biomolecular empleando, por ejemplo, la activacion de yodoacetamida, N-hidroxisulfosuccinimida, maleimida o activacion de isotiocinato. Para la construccion de las sondas biomoleculares los restos marcadores se conjugan, por ejemplo, a enlazadores oligonucleotidos que comprenden, por ejemplo, un unico amino de base modificada o con una modificacion amino terminal. En caso de que los enlazadores proteicos recombinantes comprendan varios grupos amino (restos de lisina), la conjugacion espedfica de sitio se puede obtener a traves de grupos tiol (cistemas adicionales) o mediante enfoques de “qmmica-click” [Beatty, KE et al. (2005) J Am Chem Soc 127: 14150-14151; Hahn, ME y Muir, TW (2005) Trends Biochem Sci 30: 26-34]. La conjugacion covalente del quelato transportador y el ligando antena se puede llevar tambien a cabo empleando un bloque de construccion especialmente disenado de un acido nucleico en fase solida o mediante smtesis proteica [Jaakkola et al. (2007) Marcaje de oligonucleotido en fase solida con DOTA. Current protocols in nucleic acid chemistry, editado por Beaucage, S.L. et al.; Capttulo 14: Unidad 4.31; publicacion online por John Wiley e Hijos].

Segun una realizacion preferida de la invencion, el conjugado enlazador biomolecular del quelato transportador ionico o del ligando antena se purifica cuidadosamente a partir de restos no conjugados y especialmente del ion libre presente potencialmente en el reactivo del quelato transportador ionico. Ejemplos de metodos de purificacion eficaces comprenden, la cromatograffa en fase inversa, de afinidad, y de exclusion por tamano (o filtracion en gel) y dialisis. La extraccion del ion libre se puede mejorar mediante la adicion del agente complejante a la sonda en disolucion, antes o durante la purificacion. En ensayos de hibridacion de oligonuleotidos la distancia redproca de las sondas oligonucleotidas, y en mas detalle, las posiciones de la base marcada y la estructura de los ligandos de acoplamiento que se emplean para la conjugacion de los restos marcados, definen como se localizan espacialmente el quelato transportador y el ligando antena, despues de que se hibriden las dos sondas. Si la estructura de la doble helice es ngida y las posiciones de las bases de los dos restos marcados estan demasiado lejos, o, por ejemplo, las longitudes de los enlazadores de acoplamiento son demasiado cortos, la complementacion puede verse dificultada. Ademas de la longitud y de la estructura de los ligandos de acoplamiento y de la posicion de las bases, se puede introducir una secuencia monocatenaria adicional no hibridada dentro del oligonucleotido patron, entre localizaciones de la sonda adyacente. Esto permite ademas el ajuste, entre la libertad de movimiento y el auto ensamblado, del quelato mixto.

Segun otra realizacion de la invencion, la tecnologfa de marcaje se emplea en ensayos heterogeneos basados en el principio de la sonda de proximidad en fase solida, donde la union no espedfica de los marcadores define el rendimiento del ensayo. Mediante la generacion de una senal de restriccion solo para aquellos marcadores presentes en el analito unido a las sondas e ignorando los marcadores (o sondas exactamente) que no se unen espedficamente a la fase solida, se resuelve la actual limitacion del rendimiento. El ensayo en fase solida puede comprender, por ejemplo, las mismas secuencias oligonucleotidas y las mismas sondas marcadas que en el ensayo homogeneo, pero emplea adicionalmente, por ejemplo, un acido nucleico patron biotinilado (analito) y una estreptavidina en fase solida (preferiblemente un pocillo para microtitracion) para capturar los complejos unidos. En lugar de medir la fluorescencia de la disolucion, la lectura se hace ahora a partir de la fase solida despues de la etapa de lavado (separacion de las sondas sin unir). El ensayo refleja el ensayo de union de proximidad a la fase solida [Fredriksson, S et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 473-477; y Gullberg, M et al. (2003) Curr Opin Biotechnol 14: 82-86] y puede proporcionar potencialmente incluso una mayor sensibilidad de deteccion del patron oligonucleotido que el ensayo del modelo homogeneo.

La deteccion proteica es una aplicacion complicada cuando los enlazadores no estan disponibles, no proporcionan una posicion u orientacion facilmente predecible, lo que se traduce, por tanto, en un control mas diffcil del auto- ensamblado del quelato complementado. Una realizacion de la invencion emplea fragmentos de anticuerpo recombinante, armazones proteicos (por ejemplo, darfinas, aficuerpos, monocuerpos), aptameros, enlazadores peptfdicos, ligandos o haptenos como enlazadores combinados con el marcaje espedfico de sitio para facilitar el analisis de protemas basado en la sonda de proximidad empleando la complementacion del quelato lantanido. Se ha descrito el analisis de protemas en base a la sonda de proximidad espedfica y sensitiva, y diagnosticos medicos potenciales por Gustafsdottir, S.M. (2005) Anal Biochem 345: 2-9 empleando la union por proximidad de dos sondas oligonucleotidas.

Otra realizacion de la invencion emplea protema o, por ejemplo, un aptamero dirigido al reconocimiento biomolecular combinado con el oligonucleotido auto-ensamblado asistido por el marcaje fluorescente basado en la complementacion del lantanido. El ultimo enfoque se asemeja a la deteccion basada en la proximidad de union, donde los extremos del oligonucleotido se unen a la protema, o los enlazadores aptameros se conectan en

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presencia de un oligonucleotido complementario corto. Las protemas enlazadoras se pueden derivar con los extremos oligonucleotidos, o mas preferiblemente, se pueden producir como fragmentos de anticuerpo recombinantes con cremalleras de leucina que interactuan debilmente [Ohiro, Y et al. (2002) Anal Chem 74: 57865792] u otro par enlazador que interacciona de forma similar a las pinzas moleculares [Heyduk E, et al. (2008) Anal Chem. 80: 5152-5159], soportando la complementacion del quelato de lantanido basado en el sistema de marcaje. La conjugacion qmmica aleatoria de los anticuerpos es un problema potencial, y se pueden emplear fragmentos de anticuerpos recombinantes y enfoques de “qmmica click” para facilitar la conjugacion espedfica de sitio.

Otra realizacion de la invencion se dirige completamente por una protema que se auto-ensambla por marcaje basado en la complementacion del lantanido, el cual requiere un modelado molecular disenado, pero proporciona un rendimiento mejorado. Un enfoque es un analito dirigido que se controla por la disociacion proteica y el marcaje espedfico de sitio con el marcaje basado en la complementacion del lantanido. La asociacion proteica controlada se ha utilizado originalmente para la complementacion enzimatica con dominios de una cadena ligera y pesada de un fragmento de anticuerpo Fv [Ueda, H et al. (2003) J Immunol Methods 279: 209-218]. La interaccion entre la cadena ligera y pesada se debilita artificialmente, para que la asociacion sea dependiente de la presencia del antfgeno. El marcaje espedfico del sitio se puede dirigir hacia restos de cistema adicionales introducidos en los dominios Fv del C-terminal. Este enfoque, sin embargo, no se limita solo a la estructura del anticuerpo, ya que el ligando que induce la multimerizacion es un fenomeno comun que se observa especialmente con protemas reguladoras, que podnan utilizarse como sensores espedficos para sus ligandos naturales. Otro enfoque incluso mas interesante, es el de utilizar como enlazadores peptidos sinteticos cortos relativamente derivados del marcador, que reconocen las posiciones adyacentes en, por ejemplo, el analito proteico multimerico [Appelblom, H et al. (2007) J Biomol Screen 12: 842-848].

Segun otra realizacion de la invencion, se emplea mas de un ion de lantanido diferente en quelatos transportadores ionicos separados combinados con uno o multiples ligandos antena de fotocaptacion, facilitando de esta manera disenos de ensayo multiparametrico.

Segun otra realizacion, el quelato transportador del ion lantanido y el ligando antena pueden formar un complejo de lantanido de conversion ascendente. Las energfas recogidas de dos o mas fotones se transfieren secuencialmente desde el ligando antena mediante procesos no radiactivos intramoleculares hasta el ion lantanido en el quelato transportador, que despues emite un unico foton de emision caractenstica.

Segun otra realizacion de la invencion, la intensidad de fluorescencia de los marcadores en base a la complementacion de lantanido se pueden mejorar potencialmente mediante el empleo del fenomeno de co- luminiscencia [Xu, YY et al. (1992) Analyst 117: 1061-1069; y Latva, M et al. (1995) J Chem Soc Perkin Trans 2 995999].

Ejemplos de ligandos antena de fotocaptacion preferidos para complementacion que contienen la estructura de fotocaptacion, se ilustran en la Figura 5/i-iv, a)-z). Estas estructuras comprenden ademas un ligando quelante de un metal debil y un grupo reactivo con un enlazador/espaciador opcional que facilita la conjugacion de enlazadores moleculares similares con el quelato transportador ionico. La abreviatura X se refiere a la estructura qmmica descrita que facilita la conjugacion del quelato transportador del ion lantanido(NI) a los enlazadores moleculares, la abreviatura -A- se refiere a una secuencia enlazadora o espaciadora qmmica, la abreviatura L se refiere a un resto qmmico que se selecciona independientemente de las estructuras esquematicas ilustradas en la Figura 6, a)-h) y la abreviatura -Z se refiere al resto qmmico que se selecciona independientemente de la Figura 6, i)-l) o -Z no esta presente (es decir, se reemplaza por hidrogeno). El grupo metoxilo (-OMe) incluido en las estructuras de la Figura 5/ii, i) y j) asf como en la Figura 6, l) se pueden reemplazar con un grupo etoxilo (-OEt). En las Figuras 5/v, w)-z), la abreviatura -G se refiere bien a algun -CF3, -CF2CF3 o -CF2CF2CF3. Normalmente el enlazador se compone de uno o mas cadenas de carbono alifaticas cortas, eter, carbonilo, amida, amina, ester tioeter, y/o fenileno, y el grupo reactivo es un grupo qmmico funcional, que puede ser, pero no se limita a, alcoholes, tioles, acidos carboxflicos, aminas primarias o secundarias, vinilsulfonilos, aldehudos, epoxidos, hidrazidas, esteres succinimidilo, maleimidas, restos carbonilo de halogeno alfa (tal como yodoacetilos), isocianatos, isotiocianatos, y aziridinas. El grupo funcional se elige preferiblemente de N-hidroxisuccinimidas, isotiocianato, maleimida, yodoacetilo y diclorotriazina. La activacion del isotiocianato puede formar un enlace tiourea irreversible con un grupo amino primario de, por ejemplo, el aminoacido lisina, el amino terminal del peptido, o modificacion del amino en el oligonucleotido.

Normalmente el ligando antena es un ligando monodentado, bidentado, tridentado o tetradentado, mas preferiblemente un ligando bidentado o tridentado, la estructura organica de fotocaptacion contiene anillos aromaticos o heterociclos, y las estructuras de fotocaptacion tienen un nivel de energfa en estado triplete adecuado para el ion lantanido trivalente presente en el quelato transportador ionico. Ejemplos de energfas en estado triplete y de estructuras de fotocaptacion para iones lantanido adecuadas, se presentan en la bibliograffa [Latva, M. et al. (1997) J Luminiscence 75: 149-169]. Segun una realizacion de la invencion, la estructura organica de fotocaptacion se basa en 7-amino-4-metil-2(1H)-quinolina (cs124), estructuras similares a quinolona o similares a cumarina [Li, M., y Selvin, P.R. (1997) Bioconj Chem 8.127-132, y US 5.622.821].

Ejemplos de estructuras esquematicas preferidas para quelatos transportadores del ion lantanido(MI) no fluorescentes adecuados para el ensayo de complementacion, se ilustran en la Figura 7/i-iii, a)-p). Estas estructuras

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comprenden un ligando quelante metalico y un grupo reactivo con un enlazador/espaciador opcional que facilita la conjugacion de los enlazadores moleculares, tal como peptidos, protemas o acidos nucleicos a traves de, por ejemplo, grupos amino primarios o grupos tiol. Tambien son posibles otras qmmicas de conjugacion, incluyendo metodos de conjugacion de qmmica click espedficos del sitio. La abreviatura Ln3+ en las estructuras esquematicas se refiere al ion lantanido trivalente y -X al grupo reactivo que facilita la conjugacion del quelato transportador del ion lantanido(NI) a los enlazadores moleculares. En la Figura 7/i-iii, a)-p), la abreviatura -A- se refiere a un enlazador o espaciador, por ejemplo, una cadena alquilo que contiene 1-12 atomos de carbono, y -X a un grupo reactivo, por ejemplo, amino, aminoxilo, halogenoacetamido (donde el haluro es bromuro o yoduro), isotiocianato, 3,5-dicloro- 2,4,6'triazinilamino, maleimido, un tioester o un ester activo de acido carboxflico, tal como N-hidroxisulfosuccinimida. En la Figura 7/ii, f)-g) el valor de n es bien 1 o 2. Estructuras adicionales de quelatos transportadores ionicos para el marcaje de un oligonucleotido, se ilustran, por ejemplo, en US 6.949.639.

Segun una realizacion de la invencion, el quelato transportador ionico contiene uno o una pluralidad de grupos de acido carboxflico, como se ilustra en la Figura 7/i-iii, a)-r). Segun otra realizacion el grupo o pluralidad de grupos de acido carboxflico en el quelato transportador ionico, se reemplaza por grupos quelantes neutrales, tales como - CONH2, -CONHR1 o -CONR1R2, donde R1 y R2 son estructuras qmmicas iguales o diferentes, como se describe en WO 2007/082996.

Las estructuras preferidas del ligando transportador ionico son ligandos hexadentados, heptadentados, u octadentados, capaces de formar preferiblemente complejos muy estables termodinamica y cineticamente, o formar con iones lantanido(IN), como se describe tambien, por ejemplo, en US 5.428.154, Carrera, C. et al. (2007) Dalton Trans. 4980-4987, Morcos, S.K. (2007) The British Journal of Radiology 80: 73-76; US 5.622.688 y EP 0 416 033. Preferiblemente, los atomos quelantes en el ligando transportador ionico son oxfgeno y nitrogeno, y segun una realizacion de la invencion, el ligando quelante contiene una pluralidad de grupos acidos carboxflicos. Metodos de derivacion para ligandos quelantes, tales como DOTA, EDTA y DTPA para conjugar el enlazador y el grupo reactivo, se describen por Brucher, E. (2002) Topics in Current Chemistry 221: 103-122; Mishra, A. et al. (2005) Proc Intl Soc Reson Med 13: 2592; y en US 6.190.923. Por ejemplo, estan disponibles comercialmente ligandos transportadores del ion lantanido macrodclico adecuados que contienen el grupo reactivo (o sus respectivas formas no activadas) de Macrocyclics, Inc. (Dallas, TX); incluyen, por ejemplo, estructuras de acido 3,6,9,15-tetraazabiciclo[9.3.1]pentadeca- 1(15),11,13-trieno-4-S-(4-isotiocianatobenzil)-3,6,9-triacetico; acido 1-Oxa-4,7,10-tetraazaciclododecano-5-S-(4- isotiocianatobenzil)-4,7,10-triacetico; acido[(R)-2-amino-3-(4-isotiocianatofenil)propil]-trans-(S,S)-ciclohexano-1,2- diamina-pentaacetico; y acido 1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecano-1,4,7,10-tetraacetico o ester mono-N- hidroxisuccinimida. Cuando se emplea un agente complejante, el quelato transportador de ion lantanido se puede seleccionar para que tenga una constante de formacion condicional al menos igual o mas que el complejo EDTA a las condiciones predominantes en el bioensayo. En caso de que se prefiera no usar el agente complejante, el quelato transportador ionico se puede seleccionar para que tenga una constante de formacion condicional o al menos igual o superior que el complejo DTPA a las condiciones predominantes en el bioensayo. Cuando no se emplea el agente complejante, el quelato transportador ionico, se selecciona preferiblemente para que tenga una disociacion mas lenta que la del complejo EDTA, mas preferiblemente mas lenta que la del complejo DTPA, a las condiciones predominantes en el bioensayo.

Preferiblemente, el quelato transportador ioico se elige a partir de las estructuras ilustradas en la Figura 7/i-iii y el ion lantanido(IN) (Ln3+) puede ser cualquiera de los iones trivalentes, pero se prefieren Sm3+, Eu3+, Tb3+ y Dy3+ para los ensayos basados en fluorescencia de larga vida empleando fluorometna en tiempo resuelto y Er3+ y Tm3+ para los ensayos basados en la fluorescencia de conversion ascendente. El quelato transportador ionico que se elige preferiblemente, no contiene ninguna estructura de fotocaptacion, en el caso de la fluorometna en tiempo resuelto, que debera coordinarse al ion lantanido y absorberse a una longitud de onda en un intervalo superior a 300 nm, preferiblemente superior incluso a 280 nm.

Preferiblemente, tanto el quelato transportador del ion como el ligando antena, son solubles en agua, y los bioconjugados de los mismos son solubles en agua.

Segun una realizacion de la presente invencion, la solubilidad del ligando de fotocaptacion se mejora mediante la adicion de sustituyentes que mejoran la solubilidad de la estructura, mediante la adicion de acido carboxflico (- COOH, -CH2COOH), acido sulfonico, acido fosfonico o un resto de azucar (por ejemplo, un a-galactopiranoxilo) como se describe en EP 1 447 666 y WO 2008/020113. Preferiblemente, los atomos quelantes en el ligando antena son oxfgeno y nitrogeno y segun una realizacion de la invencion, el ligando antena contiene uno o mas grupos de acido carboxflico.

Preferiblemente, la combinacion optima del quelato transportador del ion lantanido(MI) y el ligando antena, que juntos son capaces de formar el complejo lantanido fluorescente, se selecciona para que la suma total de los sitios de coordinacion del ligando (recuento de dientes) sea bien nueve o diez.

Preferiblemente, para Eu3+ y Sm3+ el ligando antena se elige a partir de las estructuras esquematicas ilustradas en la Figura 5/i-ii, a)-j), y para Tb3+ y Dy3+ a partir de la Figura 5/i-ii, e)-j).

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La tecnolog^a de marcaje fluorescente basado en el lantanido de complementacion es aplicable para la medicion cuantitativa de acidos nucleicos y protemas. Ya que una senal se obtienen solo cuando dos sondas, una marcada con el transportador del ion lantanido, y la otra con la antena que absorbe la luz, se unen de forma precisa en la posicion adyacente a la molecula diana, y solo cuando los componentes marcados estan en un contacto muy estrecho, la generacion de la senal es altamente espedfica. La larga vida de emision del complejo lantanido facilita la medicion en tiempo resuelto, que elimina la autofluorescencia y la union espedfica derivadas de los anteriores. Este enfoque se puede emplear tambien para monitorizar varios analitos simultaneamente (enfoque multianalito) mediante el empleo de otros quelatos de ion lantanido y ligandos de fotocaptacion adecuados, ya que los quelatos de lantanido tienen un espectro unico y caractensticas temporales.

El metodo segun la presente invencion es adecuado para monitorizar tanto reacciones isotermicas de amplificacion de acidos nucleicos [Van Ness, J., et al. (2003) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 100: 4504-4509], como de termociclado [Saiki et al. (1988) Science 239: 487-491]. Para la monitorizacion de la reaccion en cadena de la polimerasa, es preferible utilizar un quelato transportador ionico termodinamica y cineticamente muy estable.

La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), es un metodo para incrementar el numero de copias de una secuencia espedfica de ADN bicatenario (amplicon) determinada mediante oligonucleotidos cortos (cebadores) complementarios a las diferentes hebras del ADN diana. El PCR se basa en el incremento secuencial, exponencial, del numero de copias del amplicon mediante la actividad de la ADNpolimerasa. La reaccion dclica incluye normalmente tres etapas principales, que normalmente se repiten de 30 a 45 ciclos. Esto se realiza en un ciclador automatico, que puede calentar y enfriar la mezcla de reaccion en un tiempo muy corto. Las etapas de reaccion comunes son:

1. Desnaturalizacion a alta temperatura, normalmente 90 °C o superior, tal como 94 °C pero por debajo de 100 °C. Durante la desnaturalizacion, el ADN bicatenario se deshace y se abre hasta un ADN monocatenario, y todas las reacciones enzimaticas se paran (por ejemplo, la extension de un ciclo previo).

2. Re-asociacion a temperatura caliente, normalmente superior a 50 °C, pero inferior a 75 °C, por ejemplo, 54 °C. Durante la re-asociacion, los cebadores se asocian con el ADN diana monocatenario complementario o con las secuencias del amplicon.

3. Extension a temperatura media alta, normalmente superior a 60 °C, pero inferior a 75 °C, por ejemplo, 72 °C. Las bases (complementarias al patron) se acoplan al cebador en el sitio 3' (la polimerasa anade dNTP's de 5'a 3', leyendo el patron de 3' a 5', las bases se anaden complementariamente al patron).

Las etapas 2 y 3 se pueden combinar en una sola etapa con condiciones semejantes a la de la etapa 2, pero combinando funciones de ambas etapas.

Normalmente cada etapa lleva un tiempo que vana desde unos pocos segundos hasta unos pocos minutos, comunmente los tiempos van desde decenas de segundos hasta uno o dos minutos. Por tanto, la longitud de un recorrido PCR y la exposicion de los contenidos de reaccion a temperaturas calientes y altas, vana desde los varios segundos hasta unas pocas horas. Normalmente la longitud del PCR esta entre los 15 minutos y 1 hora 30 minutos.

En el PCR cuantitativo a tiempo real o en el PCR de punto final homogeneo, se puede detectar el aumento del numero de copias o la presencia del amplicon, empleando el metodo de la presente invencion.

Cuando el metodo de la presente invencion se emplea dentro de las condiciones predominantes PCR, es decir, la temperatura vana de 50 °C hasta 98 °C, o mas comunmente, de 60 °C hasta 98 °C, imponen requerimientos significativos en la estabilidad condicional del quelato transportador ionico. La disociacion del ion lantanido desde el quelato transportador del ion debe ser insignificante en estas condiciones durante el PCR completo, es decir, al menos varios minutos, normalmente mas de 15 minutos y hasta 2 horas.

Las realizaciones de la presente invencion proporcionan una estabilidad que permite la deteccion del producto PCR amplificado, tanto mediante tiempo real como por punto final, empleando el metodo de la presente invencion. Las constantes de estabilidad condicional de los quelatos metalicos de los ligandos, son dependientes de las condiciones predominantes, incluyendo la temperatura. Se sabe que normalmente las constantes de estabilidad condicional de los quelatos metalicos descienden con el incremento de la temperatura. Esto es debido a que la disociacion aumenta a temperaturas elevadas. Por tanto, solo son adecuados para PCR los quelatos transportadores del ion que poseen una constante de formacion condicional lo suficientemente alta tambien en las condiciones predominantes, es decir, a alta temperatura, y que son inertes cineticamente, es decir, que tienen una disociacion lenta a temperatura alta. La constante condicional suficientemente alta del quelato transportador ionico, da como resultado que el ion no se disocie del quelato transportador durante el PCR.

El quelato lantanido mixto complementado formado mediante el reconocimiento basado en la proximidad de la sonda, se puede emplear ademas como donador en la transferencia de energfa de resonancia con un compuesto fluorescente luminiscente (aceptor) o no-luminiscente (quencher). El aceptor se puede seleccionar tambien para que no tenga solapamiento espectral con la emision del donador.

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EJEMPLOS

Ejemplo 1

Ensayo de hibridacion homogeneo basado en la proximidad de la sonda

Se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MI) un oligonucleotido de ADN diana sintetico (5'- GATGcAGTAGCAGGAAGAGGATCGTAGCAATG-3'; SEQ ID NO: 1), una sonda A oligonucleotida con amino modificado (5'-CATTGCTACGATCC(C6dT)C-3'; SEQ ID NO: 2), y una sonda B oligonucleotida con amino modificado (5'-T(C2dT)CCTGCTACTGCATC-3'; SEQ ID NO: 3). La sonda A se marco con el quelato transportador del ion Eu3+, (N1-(4-iso-tiocianatobenzil)dietilenotriamina-N1, N2, N3, N3-tetraquis(acetato)europio(III) [Mukkala, V.-M. et al. (1989) Anal Biochem., 176: 319], Eu3+-N1) en la modificacion del grupo amino localizado cerca del extremo 3', y la sonda B se marco con el ligando antena de fotocaptacion (acido 4-((isotio-cianatofenetil)etinil)piridina- 2,6- dicarbox^lico, antena-3d) cerca del extremo 5'. La sonda A, 25 nmol, se incubo con 20 veces mas de exceso molar de Eu -N1 en 50 mM de tampon carbonato, pH 9,8, a +37 °C durante la noche. El volumen total de las reacciones de marcaje fue de 50 pL. Para el marcaje de la sonda B con la antena-3d, la antena-3d se disolvio en N,N- dimetilformamida (Sigma-Aldrich) y se combino con el oligonucleotido disuelto en agua, y despues se anadio el tampon carbonato, pH 9,8, hasta una concentracion de 50 mM. En la reaccion de marcaje, el exceso molar de la antena-3d fue de 50 veces del volumen total de 110 pL. La reaccion se incubo a +50 °C con rotacion lenta durante la noche.

La purificacion de las sondas marcadas se llevo a cabo con HPLC (instrumentacion de Thermo Electron Corp., Waltham, MA, EE.UU.) empleando una columna Hypersil ODS C18 de Thermo Scientific (Waltham, MA, EE.uU.) para la purificacion de la sonda B marcada de la antena-3d, y una columna Luna C18 (2) de Phenomenex (Torrance, CA, EE.UU.) para la purificacion de la sonda A marcada del Eu3+-N1. Ambas columnas eran de una longitud de 150 mm y diametro de 4,6 mm. Las purificaciones se realizaron empleando un gradiente de 86% para A y 14% para B, hasta 70% para A y 30% para B, en 21 minutos con una velocidad de flujo de 0,5 mL min-1 (A, acetato de trietilamonio 50 mM acuoso (TEAA; Fluka Biochemica, Buchs, Suiza); B, TEAA 50 mM en acetonitrilo (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.). El lfquido de las fracciones recolectadas se evaporo a vado (Hetovac VR-1, Heto-Holten A/S, Allerod, Dinamarca) y despues se disolvio de nuevo en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), y NaCl 50 mM. Las sondas marcadas se caracterizaron mediante la medicion de las lecturas de absorbancia a 260 y 330 nm y las concentraciones de Eu total se midieron mediante tecnologfa DELFIA (PerkinElmer Life And Analytical Sciences, Wallac, Turku, Finlandia).

Los ensayos se realizaron empleando una Fluorescencia Baja en 96 pocillos Maxisorp para placas de microtitracion adquiridas de Nunc (Roskilde, Dinamarca) en tampon de ensayo que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,75), NaCl 600 mM, Tween 20 0,1%, NaN3 0,05%, y 30 pM de acido dietilenotriaminopentaacetico (DTPA). La sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d (10 o 50 nM) y el oligonucleotido diana (0-50 nM) se combinaron en un volumen total de 60 pL y se anadio a los pocillos. La placa se incubo primero en agitacion lenta durante un penodo corto de tiempo y despues sin agitacion durante 15 y 60 minutos a temperatura ambiente. Las mediciones de la fluorescencia en tiempo resuelto se realizaron con un Contador Multilabel Victor 1420 (Perkin-Elmer Life And Analytical Life Sciences, Turku, Finlandia) mediante el empleo de un filtro de excitacion a 340 nm, un filtro de emision a 615 nm, 400 ps de retardo, un tiempo de medicion de 400 ps, y un recuento de 1000 ciclos de medicion.

El principio del metodo de ensayo de complementacion del quelato, se presenta en la Figura 1. Dos sondas de 16 monomeros, la sonda A marcada con un quelato transportador del ion europio(III), (N1-(4-iso- tiocianatobenzil)dietilenotriamina-N1, N2, N3, N3-tetraquis(acetato)europio(III) [Mukkala, et al. (1989)] Eu3+-N1, estructura esquematica en la Figura 8a) en una timina con el grupo amino modificado localizado en un nucleotido interno del extremo 3', y la sonda B marcada con una antena de fotocaptacion (acido 4- ((isotiocianatofenil)etinil)piridina- 2,6-dicarboxflico, antena-3d), estructura esquematica en la Figura 8b), en una timina con el amino modificado localizado en un nucleotido interno del extremo 5', se complementaron a un oligonucleotido diana de 32 monomeros. Ya que la afinidad de la sonda A- Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d es minima una hacia la otra, no se puede detectar fluorescencia en ausencia del oligonucleotido diana complementario. En presencia del oligonucleotido diana, la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d hibridan en posiciones adyacentes al oligonucleotido diana, y Eu3+-N1, y la antena-3d forman un complejo quelato mixto que sera fluorescente a una espedfica longitud de onda con un desplazamiento de Stoke grande, un pico de emision fuerte y una vida de fluorescencia larga.

Los resultados del experimento se ilustran en la Figura 9, donde se representa la fluorescencia espedfica de Eu3+ despues de la hibridacion de la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d con el oligonucleotido diana. Los cuadrados representan los resultados medidos a partir de las reacciones con concentraciones de 10 nM de la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d, y los drculos son los resultados de las reacciones con concentraciones de 50 nM de las mismas sondas. La cantidad de la sonda A-Eu -N1 y de la sonda B-antena-3d era constante, mientras que la cantidad del oligonucleotido diana aumento. El lfmite de deteccion, se define como la concentracion que corresponde a los tres tiempos de desviacion estandar de la senal de fondo, es de 13 pM (0,78 fmol por ensayo) cuando la cantidad de la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d era de 50 nM. El lfmite de deteccion de nuestro ensayo fue mejor que el presentado anteriormente [A. Oser, G. Valet (1990) Angew. Chem. 102, 1197; Angew.

(1990) Chem. Int. Ed. Engl. 29, 1167], y especialmente la senal para la razon de fondo sobre mil (hasta 1400:1) y el nivel de la senal en nuestro ensayo destaco en comparacion a la tecnica anterior [Wang, G., Yuan, J., Matsumoto, K., y Hu, Z. (2001) Anal. Biochem. 299: 169], donde se habfan presentado razones menores de 3 (menor de 3:1). Esto se consiguio empleando apropiadamente el quelato transportador ionico, el ligando antena, las secuencias 5 enlazadoras, modificaciones de oligonucleotido seleccionados, y especialmente anadiendo el agente complejante para acomplejar practicamente cualquier ion de europio(III) libre presente en la disolucion. El intervalo dinamico en nuestro ensayo abarca cuatro ordenes de magnitud y la senal de fluorescencia fue estable durante al menos una hora.

En la Tabla 1 se ilustra el sorprendente efecto de la concentracion de DTPA. En el ejemplo la concentracion optima 10 de DTPA fue de 30 pM o superior. En ausencia de DTPA la senal de fondo con una concentracion de la sonda de 10 nM era inferior a dos, mientras que con concentraciones de 30 y 100 pM de DTPA se obtuvieron razones superiores a 70. Esto ilustra la significativa mejora que se obtiene mediante la presente invencion sobre la tecnica anterior, donde se habfa observado el fondo de una forma clara. Los resultados indican que a las condiciones predominantes, la concentracion del ion lantanido libre es originalmente nanomolar en ausencia del agente complejante, mientras 15 que cuando se anade el agente complejante, la concentracion del ion libre se puede reducir en un factor de al menos cien, potencialmente superior a mil, hasta a concentraciones picomolares, o concentraciones inferiores a uno picomolar. Esto dara como resultado un drastico descenso en el ensayo de fondo y un incremento significativo en la senal obtenida para la razon anterior.

Tabla 1. Efecto de la concentracion de DTPA en el rendimiento del ensayo.

Fluorescencia (recuentos)

DTPA/microM

0 5 10 30 100

Sin patron(fondo)

93317 8521 3139 839 649

Patron 10 nM (senal)

166234 58486 55254 60170 49414

Razon S/B

1,8 6,9 17,6 71,7 76,1

20

Ejemplo 2

Especificidad en la generacion de la senal

Se adquirio un oligonucleotido diana no-complementario (5'-CTGCTCTATCCACGGCGCCCGCGGCTCCTCTC-3'; SEQ iD NO: 4) de Biomers.net (Ulm, Alemania). El experimento descrito en el Ejemplo 1 se repitio reemplazando el 25 oligonucleotido diana por el oligonucleotido diana no-complementario. El reemplazo del oligonucleotido diana complementario con concentraciones variables de un oligonucleotido de 32 monomeros no-complementaria, dio como resultado la misma senal de fluorescencia que en la ausencia del oligonucleotido diana complementario; no se observaron diferencias en la senal detectable en presencia de concentraciones variables de oligonucleotidos diana no-complementarios en comparacion con la concentracion nula de oligonucleotidos diana; es decir, control en 30 blanco. Esto indica que el mecanismo de generacion de la senal en la presente invencion es altamente espedfica y dependiente de los dos acontecimientos de reconocimiento biomolecular simultaneos.

Ejemplo 3

Espectro de emision y vida de fluorescencia

Se adquirio una sonda adicional, una sonda C oligonucleotida con amino modificado (5'35 CATTGCTACGATCC(C2dT)C-3'; SEQ ID NO: 5) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MI) y marcada con 2,2',2''.2'''-[[4-[(4- isotiocianatofenil)-etinil]piridin-2,6-diil]bis(metilenonitrilo)]tetraquis(acetato)europio(III) intrmsecamente fluorescente (Eu3+-7d; estructura esquematica en la Figura 8c). La sonda C, 5 nmol, se incubo con un exceso molar de 20 veces de Eu3+-7d en tampon carbonato 50 mM, pH 9,8, a +37 °C durante la noche y se purifico como se describe para A- Eu3+-N1 en el Ejemplo 1.

40 El espectro y la vida de emision de fluorescencia de una sonda C-Eu3+-7d marcada con un quelato-Eu3+ intrmsicamente fluorescente, y separado de un oligonucleotido diana dirigido por un complejo de la sonda A-Eu3+- N1, y una sonda B-antena-3d, se midieron con un espectrofotometro de fluorescencia Varian Cary Eclipse (Varian Scientific Instruments, Mulgrave, Australia). El oligonucleotido diana (0 o 10 nM) se mezclo con una sonda A-Eu3+- N1, y una sonda B-antena-3d (50 nM) en un tampon de ensayo, y se incubo durante 30 minutos a temperatura 45 ambiente antes de la medicion. El espectro de fluorescencia con 0 nM (lmea estrecha) y 10 nM (lmea gruesa) del oligonucleotido diana se ilustra en la Figura 10a. Para comparar las propiedades de fluorescencia del complejo con las propiedades de fluorescencia del quelato-Eu3+fluorescente intrmsicamente, la sonda C-Eu3+-7d se diluyo hasta

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una concentracion de 50 nM en un tampon de ensayo y se midio el espectro. El espectro de fluorescencia de la sonda C-Eu3+-7d se muestra en la Figura 10b. El complejo que se formo en la presencia del oligonucleotido diana a partir de la sonda A-Eu3+-N1 y una sonda B-antena-3d genero un espectro de fluorescencia similar a la sonda intrmsicamente fluorescente C-Eu3+-7d con un pico de emision principal a 615 nm. En ausencia del oligonucleotido diana, se detecto una emision de fluorescencia de vida corta con la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d, dando como resultado una lmea horizontal en el espectro. El tiempo de extincion de fluorescencia del complejo formado por la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena-3d en presencia del oligonucleotido diana 10 nM fue de 618 ps (espectro de extincion insertado en la Figura 10a) y el tiempo de extincion de fluorescencia la sonda C-Eu3+-7d fue de 380 ps (insertado en la Figura 10b). Esto indica que el complejo del quelato mixto se protege mejor de las moleculas de agua que el ion intrmsicamente fluorescente del quelato heptadentado en la sonda C-Eu3+-7d.

Ejemplo 4

Ensayo heterogeneo de hibridacion basado en la proximidad de la sonda

Se adquirieron sondas de oligonucleotidos con grupo amino modificado (sonda A, 5'-CATTGCTACGATCC-(C6dT)C- 3', SEQ ID NO: 2 y la sonda B, 5'-T(C2dT)CCTGCTACTGCATC-3', SEQ ID NO: 31 de Sigma-Aldrich (St. Louis, MI). La sonda A se marco con N1-(4-iso-tiocianatobenzil)dietilenotriamina-N1, N2, N3, N3-tetraquis(acetato)europio(III) [V.- M. Mukkala, et al. (1989) Anal Biochem., 176: 319], (Eu3+-N1; estructura esquemetica en la Figura 8a) y con un 2,2',2'',2'''-[[4-[4-isotiocianatofenil)etinil]piridina-2,6-diil]-bis(metileno-nitrilo)]tetraquis(acetato)europio(III) intrmsecamente fluorescente [H. Takalo et al. (1994) Bioconjugate Chem, 5, 278] (Eu3+-7d; estructura esquematica en la Figura 8c), y la sonda B se marco con acido 4-((isotiocianatofenil)etilnil)piridina-2,6-dicarboxflico (antena; estructura esquematica en la Figura 8b). Se incubaron 25 nmol y 5 nmoles de la sonda A, con un exceso molar de 20 veces de Eu3+-N1 y Eu3+-7d, respectivamente, en tampon carbonato 50 nM, pH 9,8, a +37 °C durante la noche. El volumen total de las reacciones de marcaje fue de 50 pl. Para el marcaje de la sonda B con la antena, la antena se disolvio en N,N-dimetilformamida (Sigma-Aldrich) y se combino con oligonucleotido disuelto en agua, y despues se anadio tampon carbonato, pH 9,8, hasta una concentracion de 50 mM. En la reaccion de marcaje, el exceso molar de la antena fue de 50 veces del volumen total de 110 pL. La reaccion se incubo a +50 °C con rotacion lenta durante la noche.

La purificacion de las sondas marcadas se llevo a cabo con HPLC (instrumentacion de Thermo Electron Corp., Waltham, MA, EE.UU.) empleando una columna Hypersil ODS C18 de Thermo Scientific (Waltham, MA, EE.uU.) para la purificacion de la sonda B marcada de la antena, y una columna Luna C18 (2) de Phenomenex (Torrance, CA, EE.UU.) para la purificacion de la sonda A marcada Eu3+-7d de Eu3+-N1. Las purificaciones se realizaron empleando un gradiente de 86% para A y 14% para B, hasta 70% para A y 30% para B en 21 minutos con una velocidad de flujo de 0,5 mL min-1 [A, acetato de trietilamonio 50 nM acuoso (TEAA; Fluka Biochemica, Buchs, Suiza); B, TEAA 50 mM en acetonitrilo (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.].El lfquido de las fracciones recolectadas se evaporo a vado (Hetovac VR-1, Heto-Holten A/S, Allerod, Dinamarca), y despues se disolvio de nuevo en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y NaCl 50 mM. Las sondas marcadas se caracterizaron mediante la medicion de las lecturas de absorbancia a 260 y 330 nm y las concentraciones de Eu3+ total se medieron mediante sistema DELFIA (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac, Turku, Finlandia).

Se adquirio el oligonucleotido marcado biotinilado (5'-biotina-TTGATGCAGTAGCAGGAAGAGGATCGTAGCAATG- 3'; SEQ ID NO: 6) de Biomers.net GmbH (Ulm, Alemania). Los bioensayos se realizaron en placas Maxisorp White C8 (Nunc, Roskilde, Dinamarca) que se revistieron [L. Valimaa et al. (2008) Anal Bioanal. Chem. 391, 2135] con N- succinimidil S-acetiltioacetato (SATA, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) -activado [J. Ylikotila et al. (2008) Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, doi:10.1016/j.colsurfb.2008.12.042] con estreptavidina (BioSpa, Milan, Italia). Todas las disoluciones se realizaron en un tampon de ensayo que contiene Tris-HCL 50 mM (pH 7,75), NaCl 600 mM, Tween 20 0,1% (v/v), NaN3 0,05% (p/v), acido dietilenotriaminopentaacetico 1 pM. Los pocillos se prelavaron una vez con Una Disolucion de Lavado DELFIA (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac) enriquecido con NaCl hasta una concentracion final de 600 mM. Se anadio el oligonucleotido diana biotinilado, de 0-200 nM en 30 ul, y la placa se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente en agitacion lenta antes de anadir la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena o la sonda A-Eu3+-7d, 200 nM en 30 pl. Despues de 30 minutos de agitacion, la placa se lavo tres veces como anteriormente y se dejo secar a temperatura ambiente antes de la medicion de la fluorescencia en tiempo resuelto con un Contador Multilabel Victor 1420 (Perkin-Elmer Life And Analytical Life Sciences, Turku, Finlandia) mediante el empleo de un filtro de excitacion a 340 nm, un filtro de emision a 615 nm, 400 ps de retardo, un tiempo de medicion de 400 ps.

Los resultados obtenidos con el incremento de la concentracion del oligonucleotido diana biotinilado empleando la sonda A-Eu3+-N1 y la sonda B-antena se ilustran en la Figura 11a y los resultados empleando la sonda A-Eu3+-7d se muestran en la Figura 11b. El ensayo basado en la proximidad de la sonda con el enfoque del quelato de complementacion como se describe en la presente invencion, facilito una menor fluorescencia de fondo con la misma senal de fluorescencia y dio como resultado un mejor lfmite de deteccion. Esto indica que la presente invencion es aplicable a ensayos heterogeneos, que mejoran el rendimiento del ensayo. La generacion de la senal se restringe solo a los complejos de quelato mixtos, que requieren de dos acontecimientos de reconocimiento biomolecular adyacentes para su formacion.

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Ejemplo 5

Ensayo homogeneo basado en la proximidad de la sonda para estreptavidina y avidina

N-(6-aminohexil)-5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida((+)-biotinil-hexanodiamina) se acoplo al acido 4-((isotiocianatofenil)etinil)-piridina-2,6-dicarbox^lico (antena). La estructura esquematica del producto de reaccion de acoplamiento se ilustra en la Figura 12a. Para el acoplamiento, se disolvieron y se combinaron (+)- biotinil-hexanodiamina, y la antena en N,N-dimetilformamida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y despues se anadio tampon carbonato, pH 9,8, hasta una concentracion de 50 mM. En la reaccion de acoplamiento, el exceso molar de (+)-biotinil-hexanodiamina era de 3 veces en un volumen total de 270 pl. La reaccion se incubo a +50 °C con rotacion lenta durante la noche.

La purificacion de la reaccion de acoplamiento se llevo a cabo con HPLC (instrumentacion de Thermo Electron Corp., Waltham, MA, EE.UU.) empleando una columna Hypersil ODS C18 de Thermo Scientific (Waltham, MA, EE.UU.) y un HPLC con Columna Oven 2155 (Pharmacia, LKB, Uppsala, Suecia). La purificacion se realizo empleando un gradiente de 80% para A y 20% para B hasta 0% para A y 100% en B, en 30 minutos con una velocidad de flujo de 0,5 mL min-1 [A, acetato de trietilamonio 50 mM acuoso (TEAA; Fluka Biochemica, Buchs, Suiza); B, TEAA 50 mM en acetonitrilo (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.] a +50 °C. El lfquido de las fracciones recolectadas se evaporo a vado (Hetovac VR-1, Heto-Holten A/S, Allerod, Dinamarca), y despues se disolvio de nuevo en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM, NaN3 0,05% p/v. Las fracciones disueltas se caracterizaron mediante la medicion de las lecturas de absorbancia a 330 nm.

N-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-5-(2-oxohexahidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) ((+)-biotinil-3,6-dioxaoctanodiamina) se conjuga con (N1-(4-iso-tiocianatobenzil)dietilenotriamina-N1, N2, N3, N3-tetraquis(acetato)europio(III) [Mukkala, V.-M. et al. (1989) Anal Biochem., 176: 319], Eu3+I-N1) adquirido de Perkin Elmer Life and Analytical Sciences (Wallac Oy, Turku, Finlandia). La estructura esquematica del producto de la reaccion de acoplamiento se ilustra en la Figura 12b. La reaccion de conjugacion y la purificacion mediante HPLC se llevo a cabo como se describe anteriormente [Kuningas, T. et al. (2005) Anal. Chem. 77, 2826].

Los ensayos se realizaron en placas para microtitracion Maxisorp white C8 adquiridos en Nunc (Roskilde, Dinamarca) en un tampon de ensayo que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM, y acido dietilenotriaminopentaacetico 10pM. Los pocillos se bloquearon previamente con albumina de suero bovino para prevenir la union no espedfica de estreptavidina o avidina en las superficies de los pocillos. La estreptavidina de BioSpa (Milan, Italia) o la avidina de Sigma (0-100 nM) y la antena ((+)-biotinil-hexanodiamina (estructura esquematica del conjugado en la Figura 12a) y (+)-biotinil-3,6-dioxaoctanodiamina-Eu3+-N1 (estructura esquematica del conjugado en la Figura 12b) (20nM) se combinaron en un volumen total de 60 pL y se anadio a los pocillos. La placa se incubo primero a agitacion lenta durante un corto periodo de tiempo, y despues sin agitacion durante 15 y 60 minutos a temperatura ambiente. Las mediciones de la fluorescencia en tiempo resuelto se realizaron con un Contador Multilabel Victor 1420 (Perkin-Elmer Life And Analytical Life Sciences, Turku, Finlandia) mediante el empleo de un filtro de excitacion a 340 nm, un filtro de emision a 615 nm, 400 ps de retardo, y 400 ps de tiempo de medicion.

Los resultados obtenidos con el incremento de concentracion de estreptavidina se muestran en la Figura 13a y los resultados con avidina en la Figura 13b. Los resultados indican que la presente invencion tambien es aplicable para la deteccion de protemas multimericas (estreptavidina y avidina son protemas tetramericas). Los restos marcados, es decir, el quelato transportador del ion lantanido, y el ligando antena, se acoplan a tales elementos de reconocimiento biomolecular, que tienen sitios de union separados en la molecula proteica a la distancia adecuada. En el ejemplo los sitios de union de biotina eran identicos, y habfa uno de ellos en cada monomero de estreptavidina.

Ejemplo 6

Ensayo homogeneo de hibridacion empleando ion terbio(III)

Se adquirieron el oligonucleotido de ADN diana sintetico (5'-GATGCAGTAGCAGGAAGAGGATCGTAGCAATG-3'; SEQ iD NO: 1) y el oligonucleotido de la sonda A con el grupo amino modificado (5'-CATTGCTACGATCC(C2dT)C- 3'; SEQ ID NO: 2) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MI, EE.UU.) y el oligonucleotido de la sonda B con el grupo amino modificado (5'-T(C2dT)CCTGCTACTGCATC-3'; SEQ ID nO: 3) se adquirio de Termo Scientific (Waltham, MA, EE.UU.). La sonda A se marco con el quelato transportador del ion Tb3+, (N1-(4-iso-tiocianatobenzil)dietilenotriamina- N , N , N , N -tetraquis(acetato)terbio(III), Tb -N1) en la modificacion del grupo amino primario localizado cerca del extremo 3' y la sonda B se marco con el ligando antena de fotocaptacion, el acido 4-(3-(4-isotio-cianatofenetil)-2,4,6- trimetoxifenil)piridina-2,6-dicarboxflico (antena-TMP) cerca del extremo 5'. La sonda A, 10 nmol, se incubo con un exceso molar de 20 veces de Tb3+-N1 en tampon carbonato 50 mM, pH 9,8, a +37 °C durante la noche. El volumen total de las reacciones de marcaje fue de 50 pL. Para el marcaje de la sonda B con la TMP-antena, la TMP-antena se disolvio en N,N-dimetilformamida 75% (Sigma-Aldrich), se combino con el oligonucleotido, y se anadio despues tampon carbonato, pH 9,8, hasta una concentracion de 50 mM. En la reaccion de marcaje, el exceso molar de la

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antena-TMP fue de 50 veces en un volumen total de 70 pL. La reaccion se incubo a +50 °C con rotacion lenta durante la noche.

La purificacion de las sondas marcadas a partir de las reacciones de conjugacion primero se llevaron a cabo con filtracion en gel empleando columnas Sephadex NAP-5 (GE Healthgare, Buckinghamshire, Reino Unido) y despues con HPLC (instrumentacion de Thermo Electron Corp., Waltham, MA, EE.UU) empleando una columna Hypersil C18 ODS de Thermo Scientific para la purificacion de la sonda B marcada con la antena-TMP, y una columna Luna C18 (2) de Phenomenex (Torrance, CA, EE.UU.) para la purificacion de la sonda A marcada con Tb3+-N1. El eluido a partir de la filtracion en gel, se evaporo a vacm (Hetovac, VR-1, Heto-Holten A/S, Allerod, Dinamarca), se disolvio en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM y se utilizo purificacion HPLC. Las purificaciones mediante HPLC se realizaron empleando un gradiente del 86% para A y del 14% para B, hasta el 70% para A y del 30% para B en 21 minutos, con una velocidad de flujo de 0,5 mL min-1 (A, acetato de trietilamonio 50 mM acuoso (TEAA; Fluka Biochemica, Buchs, Suiza); B, 50 mM TEAA en acetonitrilo (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.)). El lfquido de las fracciones recogidas, se evaporo a vado y despues se disolvio otra vez en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM. Las sondas marcadas se caracterizaron mediante la medicion de las lecturas de absorbancia a 260 y 330 nm y las concentraciones de Tb total se midieron mediante tecnologfa DELFIA (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac, Turku, Finlandia). La purificacion de las reacciones de acoplamiento inclrnan dos metodos diferentes para mejorar la eficacia de la purificacion.

El ensayo se realizo empleando Fluorescencia Baja en 96 pocillos Maxisorp de placas para microtitracion adquiridos de Nunc (Roskilde, Dinamarca) en un tampon de ensayo que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,75) NaCl 600 mM, Tween 20 0,1%, NaN3 0,05%, y acido dietilenotriaminopentaacetico (DTPA) 30 pM. La sonda A-Tb3+-N1 y la sonda B-antena-TMP (10 o 50 nM) y el oligonucleotido diana (0-50 nM) se combinaron en un volumen total de 60 pL y se anadio a los pocillos. La placa se incubo primero en agitacion lenta durante un corto periodo de tiempo y despues sin agitacion durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las mediciones de la fluorescencia en tiempo resuelto se realizaron con un Contador Multilabel Victor 1420 (Perkin-Elmer Life And Analytical Life Sciences, Turku, Finlandia) mediante el empleo de un filtro de excitacion a 340 nm, un filtro de emision a 545 nm, 400 ps de retardo, un tiempo de medicion de 1200 ps, y un recuento de 2000 ciclos de medicion.

Para el ensayo de complementacion del quelato de terbio, se emplearon dos sondas complementarias de 16 monomeros para un oligonucleotido diana de 32 monomeros: la sonda A marcada con un quelato transportador de un ion terbio (N1-(4-isotiocianatobenzil)dietilenotriamina-N1, N2, N3, N3-tetraquis(acetato)terbio(III), Tb3+-N1, Figura 14a) en una timina con el grupo amino modificado localizado en un nucleotido interno del extremo 3', y la sonda B marcada con una antena de fotocaptacion reactiva de acido(4-(3-(4-isotiocianatofenetil)-2,4,6-trimetoxifenil)piridina- 2,6-dicarboxflico), antena-TMP, Figura 14b) en una timina con el grupo amino modificado localizado en un nucleotido interno del extremo 5'. Ya que la afinidad de la sonda A- Tb3+-N1 hacia la sonda B-antena-TMP es minima, no se puede detectar fluorescencia en ausencia del oligonucleotido diana complementario. En presencia del oligonucleotido diana, la sonda A-Tb3+-N1 y la sonda B-antena-TMP se hibridan a la diana y el Tb3+-N1 y antena- TMP forman un complejo que sera fluorescente a una longitud de onda espedfica, con un desplazamiento Stoke grande, picos de emision fuerte y una vida de fluorescencia larga.

En la Figura 15 se presenta la fluorescencia espedfica de Tb3+ despues de la hibridacion de la sonda A-Tb3+-N1 y la sonda B-antena-TMP con el oligonucleotido diana. La cantidad de la sonda A-Tb3+-N1 y de la sonda B-antena-TMP fue constante (bien para 10 nM, resultados mostrados con cuadrados, o 50 nM, resultados mostrados con drculos) aunque la cantidad de oligonucleotido diana variara. Se midio la emision de tiempo resuelto en el principal pico de emision a 545 nm. El lfmite de deteccion fue menor que la concentracion 100 pmol/L del oligonucleotido diana, y el intervalo dinamico en nuestro ensayo cubrio hasta cuatro ordenes de magnitud. El DTPA estaba presente en una concentracion de 30 pM. El resultado indica que la presente invencion es facilmente transferible a otros iones lantanidos luminiscentes mediante la seleccion adecuada del ligando antena de fotocaptacion.

Ejemplo 7

Espectro de emision y vida de fluorescencia con el ion terbio(III)

Se midio el espectro de fluorescencia y la vida de emision del oligonucleotido diana dirigida por el complejo de la sonda A-Tb3+-N1 y la sonda B-antena-TMP con un espectrofotometro de fluorescencia Varian Cary Eclipse (Varian Scientific Instruments, Mulgrave, Australia). El oligonucleotido diana (0 o 10 nM) se mezclo con la sonda A-Tb3+-N1 (50nM) y la sonda B-antena-TMP (50 nM) en un tampon de ensayo, y se incubo durante 60 minutos a temperatura ambiente antes de la medicion.

El complejo que se formo en presencia del oligonucleotido diana (Figura 16; lmea gruesa) a partir de la sonda A- Tb3+-N1 y la sonda B-antena-TMP genero un espectro de fluorescencia con el pico de emision principal a 545 nm. En ausencia del oligonucleotido diana (lmea fina), no se detecto emision de fluorescencia con la sonda A-Tb3+-N1 y la sonda B-antena-TMP. Se midio el tiempo de extincion del complejo formado por la sonda A-Tb3+-N1 y la sonda B- antena-TMP en presencia del oligonucleotido diana 10 nM. Se encontro que la vida de la emision (vease el espectro de extincion en la Figura 16 inserta) se duplicaba exponencialmente; el componente mas corto tema una vida de 105 ps y el componente mas largo de 400 ps. Esto indica que los enlazadores de acoplamiento (que afectan la distancia

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y la orientacion de los restos marcadores) tienen que optimizarse para, por ejemplo, ligandos antena diferentes, dado que sus dimensiones estructurales vanan afectando la eficacia de complementacion del quelato dirigido por acontecimientos de reconocimiento biomoleculares.

Ejemplo 8

Ensayo de complementacion de quelato dirigido por oligonucleotido (OCCA)

El rendimiento de la tecnologfa de deteccion se estudio por PCR en tiempo real en tubo cerrado mediante la amplificacion de 0-105 moleculas del patron sintetico (5'

CTTCAGCGCTACACACGCTCAAATCATCGAGGAAAACCGTATGAGAAACGGATCTAAGCTTGTCATTTGATAAAG CATCATGCAACATTAACCCGAGATACGATTTGTCCATATCTTTGATACGACGCCGCAAAAGCTCTTCCCAAGCCG AGTCTACAG 3'; SEQ ID NO:7; Thermo Scientific, EE.UU.). El PCR en tiempo real se realizo empleando una placa PCR de 96 pocillos (Placa PCR Robotic 96 Thermo -Fast®, Thermo Scientific) cerrada con tapas opticas (MicroAmp®, tiras de 8 tubos con tapa optica, Applied Biosystems, EE.UU.). Cada 40 pL de la reaccion PCR contema cebadores 500 nM (5' cebador 5'CTGTaGaCTCGGCTTGGGAAGAGC 3', SEQ ID NO: 8 y 3' cebabor 5'AAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC 3', SEQ ID NO 9; Thermo Scientific), sonda A 50 nM (5' AATCGTATCTCGGGTTAATG[AmC7]; SEQ ID NO: 10; Thermo Scientific) marcada con el quelato transportador del ion Eu3+ no luminiscente del acido 2,2',2''-(10-(3-isotiocianatobenzil)-1,4,7,10-tetraazaciclodecano-1,4,7-triil)- triacetico; Figura 8d), sonda B 50 nM (5' T(AmC2dT)GCATGATGCTTTATCAAA 3' con 3'fosfato; SEQ ID NO: 11; Thermo Scientific)) marcada con el ligando antena de fotocaptacion (acido 4-((4-isotiocianatofenil)etinil)piridina-2,6- dicarboxflico) [U. Karhunen et al., Anal Chem, 82 (2010) 751], DTPA 30 pM, dNTPs 400 pM, 0,6 pl de ADN polimerasa Phire Hot Start (Finnzymes, Finlandia), Tampon de Reaccion Phire (Finnzymes) y una cantidad variable del patron de oligonucleotido monocatenario sintetico. El ciclo termico consistio en una desnaturalizacion inicial de 2 minutos y en una etapa de activacion de la polimerasa a 98 °C, seguido de 8 ciclos de 15 segundos a 98 °C, 20 segundos a 60 °C y 15 segundos a 72 °C; 17 ciclos de 15 segundos a 98 °C, 20 segundos a 60 °C, 15 segundos a 72 °C, 15 segundos a 98 °C, 20 segundos a 60 °C, 15 segundos a 72 °C, 15 segundos a 94 °C y 30 segundos a 30 °C. El ciclo termico se realizo empleando un ciclador termico PTC-200 (MJ Research, EE.UU.) y la fluorescencia en tiempo resuelto se midio a 30 °C a partir del ciclo 9 con un contador Multilabel Victor 1420 (Perkin Elmer Life Science, Finlandia) mediante el empleo de un filtro de excitacion a 340 nm, un filtro de emision a 615 nm, 400 ps de retardo, un tiempo de medicion de 400 ps, y un recuento de 1000 ciclos de medicion. La placa PCR se movio temporalmente para cada medicion de fluorescencia del ciclador termico PTC-200 al contador Multilabel Victor 1420.

Se amplificaron y midieron varias cantidades del patron de oligonucleotido mediante PCR en tiempo real. En la Figura 17 se presenta la fluorescencia espedfica de Eu3+ despues de la hibridacion de la sonda A y la sonda B con el oligonucleotido diana. Se generaron graficas de amplificacion mediante el trazado de cada medicion fluorescente como una funcion del numero de ciclos PCR.

Claims (13)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de bioensayo para detectar y/o cuantificar un analito empleando un primer grupo que comprende un quelato transportador del ion lantanido y un primer elemento de reconocimiento, en donde dicho quelato transportador del ion lantanido comprende un ligando transportador del ion lantanido y un ion lantanido; un segundo grupo que comprende un ligando antena y un segundo elemento de reconocimiento; y se emplea adicionalmente un agente que acompleja dicho ion lantanido a una concentracion de al menos 1 pmol/L; en donde dicho quelato transportador del ion lantanido se une a dicho lantanido; y dicho quelato transportador del ion lantanido es una estructura de quelato macrodclico ionico y tiene un numero de coordinacion de seis, siete u ocho dientes; y dicho ligando antena es bien monodentado, bidentado, tridentado o tetradentado, y la combinacion del quelato transportador ionico y del ligando antena se selecciona para que la suma total de sitios de coordinacion del ligando, es decir, recuento de dientes, sea de nueve o diez; en donde el reconocimiento de dicho analito mediante dicho primer elemento de reconocimiento de dicho primer grupo y mediante dicho segundo elemento de reconocimiento de dicho segundo grupo da como resultado o bien

   i) un quelato de complementacion, es decir, la formacion de un complejo quelato de lantanido mixto a traves de la complementacion de dicho quelato transportador del ion lantanido que transporta dicho ion lantanido con dicho ligando antena, y por consiguiente, incrementa la fluorescencia; o bien

   ii) un quelato de discomplementacion, es decir, dicho quelato transportador del ion lantanido que transporta dicho ion lantanido, se separa de dicho ligando antena, y por consiguiente, desciende la fluorescencia.
2. 2. El bioensayo segun la reivindicacion 1, caracterizado en que la estructura del quelato macrodclico ionico se selecciona del grupo que consiste en las estructuras f) a n) presentadas en la Figura 7.
3. 3. El bioensayo segun la reivindicacion 1, caracterizado en que

   i) log KLnL2 es al menos 12, en donde KLnL2 se refiere a la constante de estabilidad del complejo entre el ligando transportador ionico y el ion lantanido en disolucion; y

   ii) log KLnL3 es al menos 8, en donde KLnL3 se refiere a la constante de estabilidad entre dicho agente complejante que acompleja dicho ion lantanido y el ion lantanido en disolucion.
4. 4. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el ion lantanido del quelato transportador ionico se selecciona del grupo que consiste en praseodimio(III), neodimio(III), samario(III), europio(III), terbio(III), disprosio(III), holmio(III), erbio(III), tulio(III), e iterbio(III).
5. 5. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el primer y el segundo elementos de reconocimiento se seleccionan independientemente el uno del otro del grupo que consiste en oligonucleotidos, aptameros, peptidos, protemas, haptenos, oligosacaridos.
6. 6. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que dicho agente complejante se selecciona del grupo que consiste en CDTA, EDTA, DOTA, DTPA, EGTA, HBED, HEDTA, NOTA, NTA, TETA y TTHA.
7. 7. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que dicho agente complejante es un enlazador mas fuerte de dicho ion lantanido que el ligando antena, es decir, log KLnL3 > log KLnL4, en donde KLnL4 se refiere a la constante de estabilidad del complejo entre dicho ligando antena y dicho ion lantanido en disolucion; y preferiblemente, un enlazador mas debil del ion lantanido que el quelato transportador ionico, es decir, log KLnL3 < log KLnL2.
8. 8. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el ligando transportador ionico se deriva de EDTA, DTPA, NOTA o DOTA, o se selecciona de las estructuras f) a n) presentadas en las Figuras 7/i, 7/ii y 7/iii.
9. 9. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el ligando antena comprende una estructura de fotocaptacion que se selecciona del grupo que consiste en las estructuras a) a z) presentadas en las Figuras 5/i, 5/ii, 5/iii y 5/iv.
10. 10. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reconocimiento del analito da como resultado un incremento o descenso de la fluorescencia, caracterizado en que dicha fluorescencia se mide a una longitud de onda entre 400 y 1600 nm.
11. 11. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el analito detectado y/o cuantificado, se selecciona del grupo que consiste en estreptavidina, protema, hapteno, una

    secuencia de acido nucleico, celulas, virus, un producto de reacciones de amplificacion de acido nucleico y un producto de la reaccion en cadena de polimerasa.
12. 12. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reconocimiento del analito da como resultado un incremento o descenso de la fluorescencia, caracterizado en que dicha fluorescencia tiene una vida larga, es decir, una vida > 1|js.
13. 13. El bioensayo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reconocimiento del analito da como resultado un incremento o descenso de la fluorescencia, caracterizado en que dicha fluorescencia es fluorescencia de conversion ascendente, es decir, fotoluminiscencia anti-Stokes, en donde la emision se detecta a una longitud de onda mas corta que la excitacion.