CN110950817A - 荧光稀土络合标记物及其制备和用其进行时间分辨荧光分析的方法与试剂盒 - Google Patents

荧光稀土络合标记物及其制备和用其进行时间分辨荧光分析的方法与试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种新型荧光稀土络合标记物及其制备和用其进行时间分辨荧光分析的方法与试剂盒，该类络合标记物可通过采用化学修饰的功能性基团与蛋白质、多肽、激素等生物分子进行共价结合，进而对各种微量生物活性物质进行时间分辨荧光测定；与常规荧光标记物相比，具有高荧光强度、稳定性、容易标记且成本低、制备简单的特点；与现有技术中的络合标记物相比，具有灵敏度高，成本较低，标记率高，使用范围广泛等优点。

Description

荧光稀土络合标记物及其制备和用其进行时间分辨荧光分析 的方法与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物分析化学技术领域，特别涉及一种荧光稀土络合标记物及其制备和用其进行时间分辨荧光分析的方法与试剂盒。
背景技术
时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术是一种新型的以镧系稀土元素络合物作为标记物，测量其发射荧光强度的体外超微量分析技术。由于时间分辨荧光免疫分析法相对于其他放射免疫分析法来说，具有更高的灵敏度和准确度，近年来该技术在临床检测、生命科学、医学等研究领域中的应用越来越广泛，已成为一种极具发展前景的分析手段。
TRFIA利用具有独特荧光特性的三价稀土元素离子及其络合物作为示踪物，得益于稀土络合物荧光寿命长、激发光谱带宽、发射光谱窄及Stokes位移大等荧光特性。稀土元素作为金属离子，不能直接与抗原抗体结合，因此在标记过程中需使用具有双功能基团的络合配体，实现与稀土元素离子形成配位，同时在不影响荧光强度的前提下与生物分子共价结合。
TRFIA技术在30多年的演化和发展过程中，国内外学者对荧光稀土络合配体进行了大量研究，如多氨基多羧基类络合物、芳香羧酸类络合物及β-二酮体类络合物等。上世纪八十年代，Evang elista等人合成含有菲啰啉结构环化合物，这类化合物不仅能与离子形成稳定的络合物，还能与蛋白偶联。也有学者研究合成了DTPA-pAS-Tb3+络合物，这类水杨酸类络合剂的特性是能与稀土离子形成稳定的络合物，其芳环部分能够将激发光的能力传递给稀土离子，从而发出荧光。慈云祥等合成了新型的氯磺酰化的β-二酮类络合剂，作为标记物对体系进行多重标记，极大地提高了灵敏度。而多胺多羧酸类络合物被研究的时间最长，应用也较广泛，比较常见的是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺四乙酸(DTTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA)等化合衍生物，而目前最为常用的解离-增强镧系荧光免疫分析系统采用DTTA这类络合剂。
鉴于荧光稀土络合配体优良的荧光特性，经过各国学者的不懈努力，大量关于荧光稀土络合配体的研究在不同的领域里展开，但是都很难同时满足一下几个要求：①能发出较强的荧光；②理化性质稳定，不易被光漂白；③原料成本低，制备工艺简单；④易与生物分子偶联。所以目前真正商品化应用到时间分辨免疫分析技术检测里面仍然比较少，目前市场上的多氨基多羧基类铕标记络合物N1-(对异硫氰基苄基)-DTTAEuNa，在解离-增强镧系荧光免疫分析系统得到广泛应用。其制备工艺成熟，荧光强度较好，但是在合成过程中涉及分离步骤多，产物分离纯化较为困难，目前国内还不能生产出高纯度、高质量的铕标记络合物，主要还是依赖进口，试剂昂贵，严重限制了时间分辨技术在我国的应用推广。
因此，针对现有技术的不足提供一种荧光稀土络合标记物及其制备和用其进行时间分辨荧光分析的方法与试剂盒以解决现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明目的之一在于避免现有技术的不足之处而提供一种新型荧光稀土络合标记物以解决现有技术不足甚为必要。该新型荧光稀土络合标记物具有性质稳定、容易标记以及标记效率高的特点。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现。
提供一种新型荧光稀土络合标记物，是以稀土元素三价铕离子Eu3+与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的配位体形成的荧光络合物，其中配位体的结构式为：
Figure BDA0002308910710000031
式中R为可与生物分子键合的活性取代基。
优选的，活性取代基为氯磺酰基、异硫氰基、氨基或肼磺酰基。
该新型荧光稀土络合标记物，是以稀土元素三价铕离子Eu3+与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的配位体形成的荧光络合物，是一种三价稀土元素铕络合物，具有性质稳定、容易标记以及标记效率高的特点。
本发明的另一目的是提供一种新型荧光稀土络合标记物的制备方法，此制备方式与普通的荧光稀土络合标记物的制备方式相比，工艺简单、制作成本较低、稳定且易标记。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现。
提供一种新型荧光稀土络合标记物的制备方法，其新型荧光稀土络合标记物具体的制备过程如下：
步骤1，将0.5g化合物轮环藤宁A和0.5g对硝基苄溴溶解在25ml甲苯中，反应8至10小时得到化合物B；
步骤2，再将0.5g化合物B和1g溴乙酸叔丁酯溶解在25ml甲苯中，反应6至-8小时得到化合物C；
步骤3，再将1g化合物C溶解在50ml浓度为3-6mol/L的盐酸中,加热到100℃，搅拌反应2小时过滤得到化合物D；
步骤4，再将0.258g化合物D和0.2g氯化銪溶解在15ml水中，搅拌20至30分钟后，使用层析柱纯化得到化合物E。
优选的，步骤1中的甲苯是经过除掉水分后处理的甲苯。
优选的，步骤2中的溴乙酸叔丁酯的量至少为5个当量。
优选的，步骤4中的氯化铕的当量为1-1.05当量。
更优选的，步骤4中的氯化铕的当量为1.03当量。
该新型荧光稀土络合标记物的制备方法，通过该方法制备的标记物是以稀土元素三价铕离子Eu3+与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的配位体形成的荧光络合物，与普通的荧光稀土络合标记物的制备方法相比，此制备方法具有工艺简单、成本低廉、稳定且易标记的特点。
本发明的第三个目的在于提供一种通过新型荧光稀土络合标记物制备标记蛋白质、氨基酸、多肽、激素及其它生物分子的方法，能够容易制备出标记蛋白质、氨基酸、多肽、激素以及其他生物分子，具有制备效率高易纯化分离、性质稳定的特点。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现。
提供一种通过新型荧光稀土络合标记物制备标记蛋白质、氨基酸、多肽、激素以及其他生物分子的方法，其中，具体的制备过程如下：
步骤1，将待标记物溶解于PH值为7.4浓度为0.05mol/L的三氨基甲烷溶液中，然后加入新型荧光稀土络合标记物，室温震荡孵育2小时后；
步骤2，通过透析或者柱层析的方法除去反应混合液中未反应的标记物；
步骤3，收集已标记的溶液，以体积百分比量计，加入0.5％叠氮化钠，1％BSA和0.05％Tween 20，在2℃-8℃下分装保存。
优选的，制备好的新型荧光稀土络合标记物在时间分辨荧光免疫分析中的应用，通过如下步骤进行：
首先利用新型荧光稀土络合标记物标记反应原料，再利用标记反应原料与待测物反应后，分离去除未反应的标记反应原料，然后通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度，再分析检测标本中待测物的浓度。
本发明的新型荧光稀土络合标记物，能够用于偶联标记蛋白质、氨基酸、多肽、激素及其它生物分子，效率高易纯化分离，性质稳定，将其应用于时间分辨荧光免疫分析中，具有荧光寿命长、强度高的特点，能够进一步提高TRFIA分析方法的灵敏度。
本发明的第四个目的是提供上述新型荧光稀土络合标记物的应用及相关的试剂盒。该新型荧光稀土络合标记物用于制备基于标记蛋白质的临床诊断试剂及试剂盒。上述临床诊断试剂及试剂盒用于肿瘤标志物、传染性疾病、激素或者糖尿病临床蛋白质标志物。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明的一种新型荧光稀土络合标记物的配位体结构示意图。
图2是本发明的异硫氰基修饰新型荧光稀土络合标记物合成路线示意图。
图3是本发明的异硫氰基修饰新型荧光稀土络合标记物标记抗体的采用双抗体夹心法时间分辨荧光免疫测定血清中AFP抗原的工作曲线示意图。
图4是本发明实施例4的回归分析示意图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1。
一种新型荧光稀土络合标记物，是以稀土元素三价铕离子Eu3+与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的配位体形成的荧光络合物。
具体的，如图1所示，上述配位体的结构式为：
Figure BDA0002308910710000071
式中R为可与生物分子键合的活性取代基。具体的，活性取代基为氯磺酰基、异硫氰基、氨基或肼磺酰基。需要说明的是，本领域的技术人员可以视情况选取活性取代基，在此不再一一限定。
取代基是指在有机化学中取代有机化合物中氢原子的基团，不同的取代基会导致不同的效应，如诱导效应、共振效应、电子效应及立体效应等，从而使不同的化合物产生不同的性质。
该新型荧光稀土络合标记物，是一种三价稀土元素铕络合物，能够与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的配位体形成荧光络合物，具有购买成本低廉，容易标记和性质稳定的特点。
实施例2。
一种新型荧光稀土络合标记物的制备方法，用于制备实施例1中的新型荧光稀土络合标记物，具体的制备过程如下所示：
步骤1，首先将0.5g化合物轮环藤宁A和0.5g对硝基苄溴溶解在25ml甲苯中，反应8至10小时得到化合物B。具体的，甲苯是经过除掉水分后处理的甲苯。
步骤2，再将0.5g化合物B和1g溴乙酸叔丁酯溶解在25ml甲苯中，反应6至-8小时得到化合物C。具体的，溴乙酸叔丁酯的量至少为5个当量。
在本实施例中，溴乙酸叔丁酯的量为5个当量。需要说明的是，溴乙酸叔丁酯的量可以为6个、7个或者7个以上，本领域的技术人员可以根据实际情况进行使用，在此不作限定。
具体的，当量是指特定或俗成的数值相当的量，用作物质相互作用时的质量比值的称谓。在任何化学反应中，物质的质量比等于它们的当量比。
步骤3，再将1g化合物C溶解在50ml浓度为3-6mol/L的盐酸中,加热到100℃，搅拌反应2小时过滤得到化合物D。
在本实施例中，盐酸的浓度为4mol/L。需要说明的是，也可以将盐酸的浓度设置为是3mol/L，也可以是5mol/L或者是6mol/L。
步骤4，再将0.258g化合物D和0.2g氯化銪溶解在15ml水中，搅拌20至30分钟后，使用层析柱纯化得到化合物E。具体的，氯化铕的当量为1-1.05当量。
在本实施例中氯化铕的当量为1.03当量。需要说明的是，本领域的技术人员可以自由选择氯化铕的当量，在此不作限定。
具体的，层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，从而分离的一种层析法。
实施例1中的活性取代基可以是氯磺酰基，也可以是异硫氰基、氨基，或者是肼磺酰基。下面以活性取代基异硫氰基修饰新型荧光稀土络合标记物合成为例。具体的合成反应式如图2所示，合成步骤如下：
(1)将0.5g化合物轮环藤宁A1和0.5g对硝基苄溴溶解在25ml甲苯中，然后缓慢加入到二亚甲基三胺甲苯溶液中，在室温下搅拌反应5个小时，直到析出的沉淀达到最大的值，不再变化；
然后过滤得到澄清甲苯溶液，沉淀用甲苯溶液洗涤两次，甲苯溶液用50ml水萃取三次，集合所得水相，加入氯化钠，直到水溶液饱和为止，再将氯化钠溶液用50ml氯仿萃取三次，所得氯仿溶液减压旋干得到淡黄色液体化合物A2。
(2)再将0.5g化合物A2溶解在30ml N,N-二甲基甲酰胺中，将2.0ml溴乙酸叔丁酯和2.9g碳酸钠加入到反应体系中，在室温下搅拌6至8个小时，减压旋干N,N-二甲基甲酰胺，使用柱层析分离得到产物A3。
此时，乙酸乙酯：石油醚的比例为1:4。
(3)将上述反应所得的化合物A3溶解在50ml浓度为6mol/L的盐酸中，加热到100摄氏度，回流直到淡黄色固体不再析出为止，然后过滤得到淡黄色固体，再将淡黄色固体用乙酸乙酯洗涤，抽干得到化合物A4。
(4)将0.50g化合物A4溶解在10ml水中，用氢氧化钠调节PH值为5至6，再将金属盐六水氯化铕加入到水中，用氢氧化钠调节PH值到5至6，混合溶液室温搅拌8个小时。停止反应，加入氢氧化钠溶液调节PH值到9至10，用滤纸过滤所得沉淀，得到澄清溶液，并减压旋干得到0.50g化合物A5。
(5)将上述步骤4中反应所得0.252g化合物A5溶解在10ml水中，加入0.025g钯碳，在氢气的状态下室温搅拌8至10个小时后停止反应，过滤掉钯碳，减压旋干得到0.22g化合物A6。
(6)最后将0.16g硫光气溶解在15ml氯仿中，加入0.09g碳酸氢钠，并将0.22g化合物A6溶解在15ml水中，加入到上述反应体系中，在室温下搅拌30分钟，分液，所得的水相用5ml氯仿洗涤一次，减压低温35℃旋干大部分的水，然后直接使用柱层析分离得到化合物A7(乙腈：水＝4:1)，并分批冻干产品。
通过上述步骤即可制备成新型荧光稀土络合标记物，化合物A7则为制备好的新型荧光稀土络合标记物。
该新型荧光稀土络合标记物的制备方法，通过该方法制备的标记物是以稀土元素三价铕离子Eu3+与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的配位体形成的荧光络合物，与普通的荧光稀土络合标记物的制备方法相比，此制备方法具有工艺简单、成本低廉、稳定且易标记的特点。
实施例3。
一种通过新型荧光稀土络合标记物制备标记蛋白质、氨基酸、多肽、激素及其它生物分子的方法，通过实施例1的新型荧光稀土络合标记物进行，具体的制备过程如下：
步骤1，将待标记物溶解于PH值为7.4浓度为0.05mol/L的三氨基甲烷(Tris-Hcl)溶液中，然后加入新型荧光稀土络合标记物，室温震荡孵育2小时后。具体的，浓度为0.05mol/L也可以写成50mmol/L。mmol/L表示毫摩尔每升，是一个浓度单位，1mmol/L可以转化成0.001mol/L。
步骤2，通过透析或者柱层析的方法除去反应混合液中未反应的标记物。
具体的，柱层析技术又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。柱层析在操作时，其装柱子的方式有两种：湿法装柱和干法装柱。
第三步，收集已标记的溶液，以体积百分比量计，加入0.5％叠氮化钠，1％BSA(牛血清白蛋白)和0.05％Tween 20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)，在2℃-8℃下分装保存。
下面以异硫氰基修饰新型荧光稀土铕络合标记物标记甲胎蛋白(AFP)抗体为例。如图3所示，新型荧光稀土铕络合标记物标记抗AFP抗体制备步骤为：
(1)抗体纯化和浓缩。具体是，将1mg抗AFP单克隆抗体加入0.5ml标记缓冲液，搅拌均匀后，使用带有滤膜的G-50离心管8000rpm离心6分钟，再重复洗涤5次，倒转离心收集抗体，体积控制在200μl左右。
需要说明的是，抗AFP单克隆抗体是美国Meridian Life Science公司产品，编号：H45610M。标记缓冲液是PH值为7.4浓度为0.05mol/L的Tris-Hcl(三氨基甲烷)。
(2)抗体标记。具体是，将纯化的AFP抗体加入实施例2中制备的0.15mg异硫氰基修饰新型荧光稀土络合标记物，充分混匀，在室温下振荡孵育2小时。
(3)上样与洗脱。用Sephadex G-50层析柱(1x30cm)分离纯化,并使用洗脱液(含0.9％NaCl浓度为0.05mol/L的Tris-HCl)洗脱，同时收集流出液(1ml/管)，逐管测量吸光度(A280nm)，合并峰管，测蛋白含量并计算标记率。
(4)保存。具体是，在2℃-8℃温度下冻干后保存。
该通过新型荧光稀土络合标记物制备标记蛋白质、氨基酸、多肽、激素及其它生物分子的方法，容易制备出标记蛋白质，且效率高易于纯化，性质稳定。
实施例4。
一种新型荧光稀土络合标记物分析检测标本中待测物的浓度的方法，具体的检测过程如下：
(1)利用新型荧光稀土络合标记物标记反应原料；
(2)再利用标记反应原料与待测物反应后，分离去除未反应的标记反应原料；
(3)通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度，再分析检测标本中待测物的浓度。
下面使用实施例3中标记的AFP抗体测定人血清中AFP抗原的时间分辨检测，如图4所示，其基本的步骤如下：
(1)样本收集
采静脉血1-2ml于凝血管中，在4℃条件下放置2小时以上，待血清析出后取25ml血清，将取出的血清样品放置在2-8℃温度下可以保存7天。
需要说明的是，血清样品如果需要长期保存，可以放置于零下20℃以下保存，避免反复冻融。血清样品在运输时，需要在含干冰的保温瓶或其它装置条件下进行。
(2)微孔板抗体包被
将包被用AFP抗体在PH值为9.0条件下的碳酸盐包被缓冲液液充分溶解混匀，稀释至浓度为5μg/ml。然后将溶解后的包被抗原100μl/孔加入96微孔板孔中，室温振荡孵育30分钟，放置4℃条件下静置过夜，洗板3次，拍干，加入封闭液300μl/孔，室温静置2小时，倒掉封闭液，拍干微孔板中待用。
(3)操作步骤
首线每孔加入25μl校准品或样品，室温振荡孵育1h；然后洗板4次，加入100μl铕标抗体工作液，室温振荡孵育1h；再洗板4次，每孔加增强液100μl，室温振荡孵育3分钟；最后测定即可。
实施例5。
一种新型荧光稀土络合标记物用于制备基于标记蛋白质的临床诊断用试剂及试剂盒，使用实施例1中的新型荧光稀土络合标记物进行。
本实施例中的用于制备基于标记蛋白质的临床诊断用试剂及试剂盒可以用于肿瘤标志物，也可以用于传染性疾病、激素，或者是用于糖尿病临床蛋白质标志物。
下面是按照常规的制造和检定规程对通过实施例2中制备成的试剂盒进行检定，结果如下：
(1)分析灵敏度和线性范围
以零参考标准品当作样品测量8次，计算其荧光值及标准差，并以该点荧光测定平均值加2倍标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度值为其灵敏度，经测定本试剂分析灵敏度为0.05ng/ml；然后将抗原稀释成不同浓度进行测定，测得标准曲线线性范围为0.1～1000ng/ml。
(2)精密度(CV％)
使用本发明的试剂盒对中国药品生物制品检定所提供的AFP(低中高三个不同浓度分别为11.5ng/ml、30.5ng/ml、78.5ng/ml)进行测定，各设10个复孔。结果表明，本发明试剂盒的批内变异系数(CV％)为2.6％～5.1％和批间变异系数(CV％)为1.9％～5.1％，精密度良好，见表1。
表1精密度测试结果
Figure BDA0002308910710000151
(3)特异性
将高浓度的CEA、CA125、CA19-9及人白蛋白当作样品用本试剂盒测定，结果表明无明显交叉反应，见表2。
表2 AFP特异性检测结果
Figure BDA0002308910710000152
该新型荧光稀土络合标记物能够制备试剂盒应用于临床诊断，具有测量精密度良好的特点。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种新型荧光稀土络合标记物，其特征在于：是以稀土元素三价铕离子Eu3+与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的配位体形成的荧光络合物，其中所述配位体的结构式为：
Figure FDA0002308910700000011
式中R为可与生物分子键合的活性取代基。
2.根据权利要求1所述的新型荧光稀土络合标记物，其特征在于：所述活性取代基为氯磺酰基、异硫氰基、氨基或肼磺酰基。
3.一种用于制备如权利要求1或2所述的新型荧光稀土络合标记物的制备方法，其特征在于：其制备过程如下，
1)将0.5g化合物轮环藤宁A和0.5g对硝基苄溴溶解在25ml甲苯中，反应8至10小时得到化合物B；
2)再将0.5g化合物B和1g溴乙酸叔丁酯溶解在25ml甲苯中，反应6至8小时得到化合物C；
3)再将1g化合物C溶解在50ml浓度为3-6mol/L的盐酸中，加热到100℃，搅拌反应2小时过滤得到化合物D；
4)再将0.258g化合物D和0.2g氯化銪溶解在15ml水中，搅拌20至30分钟后，使用层析柱纯化得到化合物E。
4.根据权利要求3所述的新型荧光稀土络合标记物的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的甲苯是经过除掉水分后处理的甲苯。
5.根据权利要求3所述的新型荧光稀土络合标记物的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的溴乙酸叔丁酯的量至少为5个当量。
6.根据权利要求3所述的新型荧光稀土络合标记物的制备方法，其特征在于：所述步骤4中的氯化铕的当量为1-1.05当量。
7.根据权利要求3所述的新型荧光稀土络合标记物的制备方法，其特征在于：所述步骤4中的氯化铕的当量为1.03当量。
8.一种通过新型荧光稀土络合标记物制备标记蛋白质、氨基酸、多肽、激素及其它生物分子的方法，通过权利要求1或2所述的新型荧光稀土络合标记物进行，其特征在于：具体制备方法如下：
1)将待标记物溶解于PH值为7.4浓度为0.05mol/L的三氨基甲烷溶液中，然后加入新型荧光稀土络合标记物，室温震荡孵育2小时后；
2)通过透析或者柱层析的方法除去反应混合液中未反应的标记物；
3)收集已标记的溶液，以体积百分比量计，加入0.5％叠氮化钠，1％BSA和0.05％Tween20，在2℃-8℃下分装保存。
9.一种新型荧光稀土络合标记物分析检测标本中待测物的浓度的方法，通过权利要求1或2所述的新型荧光稀土络合标记物进行，其特征在于：通过如下步骤进行，
1)利用新型荧光稀土络合标记物标记反应原料；
2)再利用标记反应原料与待测物反应后，分离去除未反应的标记反应原料；
3)通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度，再分析检测标本中待测物的浓度。
10.如权利要求1或2所述新型荧光稀土络合标记物用于制备基于标记蛋白质的临床诊断用试剂及试剂盒，其特征在于：用于肿瘤标志物、传染性疾病、激素或者糖尿病临床蛋白质标志物。
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