ES2629348T3 - Anticuerpo novedoso contra una anhidrasa carbónica - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une a anhidrasa carbónica XII, en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO 1 (CDR1), 2 (CDR2) y 3 (CDR3) que determinan las CDR de la región VH, y las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO 4 (CDR1), 5 (CDR2) y 6 (CDR3) que determinan las CDR de la región VL.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

típico, útil para células procariotas, que se puede inducir usando el análogo de lactosa isopropil-βtiogalactopiranósido (“IPTG”). Para la expresión recombinante y secreción, el polinucleótido de interés se puede ligar entre, por ejemplo, la señal líder PelB, que dirige la proteína recombinante al periplasma y el gen III en un fagémido llamado pHEN4 (descrito en Ghahroudi et al, 1997, FEBS Letters 414:521-526). Los elementos adicionales podrían incluir potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donantes y aceptores para ayuste de ARN. Se puede alcanzar transcripción muy eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI, y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también se pueden usar elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humana). Alternativamente, el polipéptido recombinante se puede expresar en líneas celulares estables que contienen la construcción génica integrada en un cromosoma. La cotransfección con un marcador de selección tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas. El ácido nucleico transfectado también se puede amplificar para expresar grandes cantidades del polipéptido codificado. Como se ha indicado anteriormente, los vectores de expresión preferiblemente incluirán al menos un marcador de selección. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, resistencia a G418 o neomicina para cultivo de células eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de los huéspedes apropiados incluyen, pero no están limitados a, células bacterianas, tal como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tal como células de levadura; células de insecto tal como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células animales tal como CHO, COS, HEK 293 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las células huésped descritas anteriormente se conocen en la técnica.

Otra forma de realización de la invención se refiere a un huésped no humano que comprende el vector de la invención.

Dicho huésped puede ser una célula procariota o eucariota. El polinucleótido o vector de la invención que está presente en la célula huésped puede estar integrado en el genoma de la célula huésped o se puede mantener de forma extracromosómica. A este respecto, también se debe entender que la molécula de ácido nucleico de la invención se puede usar para “direccionamiento génico” y/o “sustitución génica”, para restablecer un gen mutante o para crear un gen mutante a través de recombinación homóloga; véase, por ejemplo, Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.

Las células huésped procariotas adecuadas comprenden, por ejemplo, bacterias de las especies Escherichia, Bacillus, Streptomyces y Salmonella typhimurium. Las células huésped eucariotas adecuadas son, por ejemplo, células fúngicas, entre otras, levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris o células de insecto tal como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera y células vegetales, así como células de mamífero. Los medios y condiciones de cultivo apropiadas para las células huésped descritas anteriormente se conocen en la técnica. Las células huésped de mamífero que se podrían usar incluyen células Hela, HEK293, H9 y Jurkat humanas, células NIH3T3 y C127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CV1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón, células C2C12 de ratón, BHK (células de riñón de hámster recién nacido) y células de ovario de hámster chino (CHO). También están en el ámbito de la presente invención huéspedes tal como células primarias de mamíferos tal como fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Alternativamente, el anticuerpo recombinante se puede expresar en líneas celulares estables que contienen la construcción génica integrada en un cromosoma. En una forma de realización más preferida, dicha célula es una célula primaria o una línea celular primaria. Las células primarias son células que se obtienen directamente de un organismo.

La invención también se refiere a animales transgénicos no humanos que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de la invención que se pueden usar para producir el anticuerpo de la invención. Los anticuerpos se pueden producir en y recuperar de tejido o líquidos corporales, tal como leche, sangre u orina, de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hámsteres u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957.

En una forma de realización adicional, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo de la invención, que comprende (a) cultivar el huésped de la invención en condiciones que permiten la síntesis de dicho anticuerpo; y (b) recuperar dicho anticuerpo de dicho cultivo.

Los huéspedes transformados se pueden hacer crecer en fermentadores y cultivar según métodos conocidos en la técnica para alcanzar crecimiento celular óptimo. Una vez expresados, los anticuerpos enteros de la presente invención, se pueden purificar según procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). El anticuerpo o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondiente(s) de la invención se puede aislar después del medio de cultivo, lisados celulares, o fracciones de membrana celular. El aislamiento y purificación de, por ejemplo, anticuerpos o cadenas de inmunoglobulinas microbianamente expresados de la invención puede ser por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tal como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra la región constante del anticuerpo de la invención.

7

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

AC-XII se expresa mucho en diferentes tipos de cáncer humano. La sobreexpresión de AC XII es más evidente en cáncer de mama, abogando por los datos descritos en Bernett et al. (2008). (tomados de: http://ist.genesapiens.org).

Ejemplo 2 – Tinción inmunofluorescente de células A549

5 Las células A549 se fijaron durante 10 minutos con paraformaldehído al 4% (v/v) en PBS, se lavaron con PBS y Triton X-100 al 0,5% (v/v) en PBS, y se incubaron con el anticuerpo EXO 6A10 durante 60 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS y PBS/Triton X-100 al 0,5% (v/v), las células se incubaron con un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo (anti-IgG de rata en ratón/Cy3) y el anticuerpo unido se visualizó después

10 mediante un microscopio de barrido laser Leica. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Como resultado, la tinción de AC-XII está claramente asociada con la membrana de las células A549 (figura 3, puntas de flecha).

Ejemplo 3 – Las líneas celulares cancerosas humanas investigadas expresan AC-XII

15 Las líneas celulares cancerosas humanas más permanentes investigadas expresan AC-XII en la superficie celular como se reveló por citometría de flujo; cf. Figura 4 A. Las líneas celulares cancerosas humanas permanentes se incubaron con EXO 6A10 (sobrenadante del hibridoma diluido 1:5 en SFT (es decir, suero fetal de ternera) al 2% (v/v) en PBS) durante 15 min en hielo, se lavaron tres veces en PBS/SFT al 2% (v/v) y después se tiñeron con un anticuerpo secundario específico (anti-IgG de rata en cabra/Cy5) durante otros 15 min en hielo. La unión de 6A10 se

20 midió después por citometría e flujo en un dispositivo FACS Calibur de Becton Dickinson y software FlowJo (Treestar Inc.). Se usó un anticuerpo del isotipo idéntico con especificidad irrelevante (glutatión-S-transferasa) como control (área gris = control de isotipo; línea negra = EXO 6A10). No fue detectable la unión a células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y a dos líneas celulares de melanoma (no mostrado). La figura 4 B muestra que AC-XII también está presente en exosomas aislados de ascitis malignos de una paciente con cáncer ovárico, como se

25 muestra con esta inmunotransferencia. Los exosomas se aislaron de ascitis malignos por centrifugación diferencial (500 x g; 10.000 x g; 70.000 x g) y se resuspendieron en PBS. La concentración de proteína se midió en un ensayo de Bradford estándar. Se pipetearon 2 µg de proteína en una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con los diferentes anticuerpos primarios. Después de lavar, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario específico (anti-IgG de rata/peroxidasa). Se detectó gangliósido GM1 con la subunidad B de

30 la toxina del cólera/peroxidasa. Las membranas se revelaron con el sistema ECL.

Ejemplo 4 – Inhibición de AC-XII por EXO 6A10 y acetazolamida

EXO 6A10 inhibe AC-XII (CI50 = 6,14 x 10-9 M) mucho más eficazmente comparado con la sulfonamida

35 acetazolamida (CI50 = 2,38 x 10-7 M); cf. Figura 5, parte superior. En contraste EXO 6A10 no inhibe significativamente AC-II; cf. Figura 5, parte inferior.

Ejemplo 5 – Unión de EXO 6A10 a AC-XII

40 Estructura tridimensional del dominio catalítico de AC-XII. Se muestran los residuos de aminoácidos relevantes (tomado de Whittington et al., 2001).

Ejemplo 6 – Inhibición por EXO 6A10 de la actividad metabólica en esferoides tumorales tridimensionales

45 Se sembraron células de cáncer pulmonar A549 en un colchón consistente en agarosa al 1% (v/v) en PBS en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. En estas condiciones, la mayoría de las líneas celulares que crecen como monocapa en cultivo celular estándar no se adhieren a la agarosa. En su lugar las células espontáneamente forman estructuras tridimensionales denominadas esferoides tumorales.

50 Figura 7, parte superior: Algunos de los esferoides se cultivaron en presencia de EXO 6A10 (concentración final 10 µg/ml), mientras que otros se cultivaron con acetazolamida (AAZ, concentración final 100 µM). Los esferoides control se cultivaron sin ningún tratamiento adicional (sin tratar). Se midió la actividad metabólica de los esferoides dos días después por medio de un ensayo MTT como se ha descrito y lectura de la extinción a 595 nm (Cory et al. 1991). Para cada grupo, se incluyeron 10 esferoides, se calcularon el valor medio, la desviación estándar. Todos los datos

55 se representan como media ± error estándar. Las comparaciones entre esferoides no tratados y tratados se realizaron usando pruebas de la t, calculadas usando Prism4 (GraphPad Software, La Jolla).

Figura 7, parte inferior: Se cultivaron esferoides de A549 durante dos días con EXO 6A10 o se dejaron sin tratar. A continuación, se añadió bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio y se tomaron imágenes. Es obvio

60 que los esferoides tratados con EXO 6A10 son mucho más pequeños y mucho más densos que los esferoides sin tratar.

Ejemplo 7 – Transfección de células L929 murinas con un plásmido de expresión que codifica AC-XII humana

65

12

Claims (1)

1. imagen1