ES2622714T3

ES2622714T3 - Agonistas de los receptores TLR 4 y 9 para prevenir las complicaciones sépticas de la inmunodepresión post-traumática en los pacientes hospitalizados por traumatismos severos

Info

Publication number: ES2622714T3
Application number: ES10790854.3T
Authority: ES
Inventors: Karim Asehnoune
Original assignee: Universite de Nantes
Current assignee: Universite de Nantes
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: WO2011080126A1; EP2519259B1; EP2519259A1; CA2785909C; ES2622714T8; FR2954703B1; US20130028936A1; CA2785909A1; US8636979B2; FR2954703A1

Abstract

Composición farmacéutica que comprende por lo menos un agonista del receptor de tipo Toll 4 (TLR 4), para su utilización en el tratamiento profiláctico de complicaciones sépticas de la inmunodepresión sistémica post-traumática en un paciente hospitalizado que padece uno o varios traumatismos severos, siendo dicho agonista seleccionado de entre el lípido A monofosforilo (MPLA) y el lípido A monofosforilo 3-O desacilado (3D-MPLA).

Description

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SEM (A.,B.) o unos porcentajes ± SEM (C.). El límite de detección del procedimiento era de 0,7 UFC por gramo de tejido.

5: - Figura 5: La IS post-hemorrágica acentúa las lesiones histológicas de una neumopatía por SASM. Se han estudiado cuatro grupos de ratones: Sin tratamiento, control (grupo C); neumopatía por SASM sola (grupo P) y hemorragia seguida de una neumopatía por SASM (grupo HP). Los tejidos fijados en el formol se acoplaron y después tiñeron por hematoxilina y eosina antes del análisis microscópico (aumento x 20).

15: Aspecto histológico representativo de los pulmones de (A.) ratones sin tratamiento que tienen un pulmón sano; (B) ratones del grupo control a la 24ª hora. El parénquima pulmonar se presenta después por una serie de imágenes obtenidas sobre unos animales a diferentes tiempos de la neumopatía: 12, 24, 96 y 168 horas (C.E.G.I.) para el grupo P; y (D.F.H.J) para el grupo HP. Los agregados de células inmunes aparecen a partir de la 12ª hora de la infección (flechas) y eran más numerosos en el grupo HP que en el grupo P en todos los plazos.

-: Figura 6: La IS post-hemorrágica agrava las lesiones inflamatorias de una neumopatía por SASM

Cada grupo de ratones comprendía 5 animales. Los datos son expresados en media ± 25-75º percentiles y son representativos de tres experimentos independientes, teniendo cada uno el mismo significado estadístico. (* p ≤ 0,05).

25: A. Acumulación de polinucleares neutrófilos en los pulmones. La actividad mieloperoxidásica (MPO) se midió en los dos pulmones. B. Lesiones pulmonares endoteliales. La permeabilidad endotelial se determinó mediante la medición del porcentaje de albúmina FITC que pasa a través de los capilares pulmonares.

C.D.E. Concentraciones pulmonares de las citoquinas. Las concentraciones en TNF alfa (C.), IL-1 beta (D.) y MIP-2 (E.) se midieron en los triturados de pulmones.

-: Figura 7: La IS post-hemorrágica incrementa la hiporreactividad sanguínea al LPS durante una neumopatía por SASM.

35: Se ha cultivado una muestra de sangre total durante 24 horas con LPS procedente de E.coli O111B4 y se han medido las citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos celulares. Cada grupo comprendía 5 animales. Los datos se han expresado en media ± 25-75º percentiles y son representativos de tres experimentos independientes, teniendo cada uno el mismo significado estadístico. (* p ≤ 0,05).

Las concentraciones en TNF alfa (A.), IL-1 beta (B.) y MIP-2 (C.) en los cultivos celulares no estimulados por LPS estaban todas por debajo del límite de detección de determinación.

45: - Figura 8: Número y estado de maduración de las células esplénicas CD11Chigh durante una neumopatía por SASM precedida o no de un choque hemorrágico. Cada grupo de ratones comprendía 6 animales. Los datos se expresaron en media ± 25-75º percentiles y son representativos de dos experimentos independientes, teniendo cada uno el mismo significado estadístico. (** p ≤ 0,01).

A. Numeración de las células CD11chigh en el bazo. En cada grupo, la suspensión celular obtenida por digestión enzimática de los bazos ha dado lugar a una numeración, después se ha determinado el porcentaje de células CD11chigh por FACS. El número absoluto de células CD11chigh se ha calculado entonces.

55: - B. Expresión de los marcadores de maduración de CD11chigh. Los marcadores membranarios siguientes se analizaron por FACS: CMH-Clase II, CD40, CD80, CD86. Figura 9: La IS post-hemorrágica disminuye la transcripción: (A.) de una citoquinas dependiente de Nuclear Factor-kB (NF-kB), (B.) de una citoquina dependiente del interferón Regulatory Factor (IRF-7), (C.) de la interleucina (IL-10) y (D.) de la IL-12 en las CD esplénicas después de una neumopatía por SASM.

Cada grupo de ratones comprendía 6 animales. Los datos se expresan en media ± 25-75º percentiles y son representativos de dos experimentos independientes, teniendo cada uno el mismo significado estadístico. (* p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01).

65: A. B. C. D. Análisis en RT-PCR cuantitativa de (A.) Tumor Necrosis Factor (TNF alfa) ARNm; (B.) Interferón (IFN beta) ARNm; (C.) IL-10 ARNm y (D.) IL-12 ARNm en las CD esplénicas. Los ARNm se han extraído de las células CD11 c+ seleccionadas positivamente de entre las suspensiones celulares

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aguja de calibre 29 para extraer en 45 segundos un 30% de la masa sanguínea (0,3 ml de sangre/10 g de peso de cuerpo). La sangre se extrajo en una jeringa heparinada (heparinato de sodio, 5U) y conservada bajo agitación a 37°C durante 60 minutos. Después, el volumen de san gre se restituyó en el plexo venoso retro-orbital.

1.3. Procedimiento de realización de la neumopatía con Staphylococcus aureus

Se ha cultivado una cepa de Staphyloccocus aureus sensible a meticilina o "SASM" (cepa ATCC 29213) durante 16 horas a 37°C en un medio tríptico soja (Grosseron, Saint Herblain, Francia). Inmediatamente antes de la utilización, los cultivos se lavaron dos veces (centrifugados durante 10 minutos a 1000 g) y diluidos en suero salado isotónico estéril para ser calibrados por espectroscopía. La concentración bacteriana se controló sistemáticamente por cultivo cuantitativo.

Los ratones se anestesiaron por Isoflurane® (Baxter, Francia), y se colocaron en decúbito dorsal. Se utilizó una aguja de nutrición enteral (calibre 24) para el cateterismo de la tráquea y la inyección de 70 µl de solución bacteriana. Los ratones se suspendieron entonces durante 30 segundos por los incisivos para mejorar la penetración del inóculo. La tasa de instilación intratraqueal alcanzaba un 100%.

1.4. Seguimiento clínico

Se evaluó la mortalidad dos veces por día durante 7 días. Se pesaron los ratones una vez por día durante 5 días. Se midió la glicemia capilar por un hemaglucotest (Boehringer Ingelheim Francia). Se midió la gasometría venosa, reflejo de la intensidad del choque y de la calidad de su reanimación, sobre sangre venosa central extraída de la aurícula derecha.

1.5. Medición de la diseminación bacteriana de la infección

Después del sacrificio, los pulmones y el bazo de los animales se homogeneizaron mecánicamente de manera estéril. Los homogeneizados se sometieron a una serie de diluciones al 1/10 y se cultivaron a 37°C sob re medio selectivo Chapman (Grosseron, Saint Herblain, Francia). Después de 48 horas de incubación, se contaron las colonias bacterianas y los resultados se expresaron en log10 Unidad Formadora de Colonias (CFU) por gramo de órgano. Se utilizó el "staphylo slide reactif" (Biorad, Francia) para diferenciar S. aureus de S. no aureus.

1.6. Análisis histológico

Se extrajeron los pulmones e inmediatamente se colocaron en formol al 4%. Los tejidos fijados se recortaron y después tiñeron por hematoxilina y eosina antes del análisis microscópico.

1.7. Medición de la actividad mieloperoxidásica

Como se ha descrito anteriormente en la bibliografía (Kim et al. 2005), después de la extracción, los pulmones se pesaron y después se homogeneizaron mecánicamente a +4°C durante 25 segundos en 1 ml de tampón (fosfat o de potasio a 50 mM con du N-etilmaleimida (10 mM), pH=6). El homogenizado proteico se lavó dos veces en el mismo tampón helado. Antes de la sonicación sobre hielo (180 segundos), se suspendió el residuo proteico en 1 ml de fosfato de potasio (50 mM, pH=6) que contiene un 0,5% de hexadeciltrimetilamonio. Después de un choque térmico de 2 horas a +56°C, se determinó la actividad mielo peroxidásica del sobrenadante por medición del poder de oxidación dependiente del agua oxigenada de o-ianisida (Kim et al. 2005).

1.8. Medición de la permeabilidad endotelial pulmonar

Como se ha descrito anteriormente (Boutoille et al. 2009), la albúmina marcada con fluoresceína isotiocianato (albúmina FITC, Sigma, Alemania) se ha utilizado para medir la permeabilidad pulmonar endotelial. Dos horas después de una inyección intraperitoneal de 2 mg de albúmina FITC, se eutanisarón los ratones por exsanguinación. Se extrajeron entonces los pulmones, se homogeneizaron mecánicamente en 1 ml de suero salado isotónico y después se centrifugaron (4000 g durante 10 minutos). La sangre se centrifugó durante 10 minutos a 4000 g para recuperar el plasma. La medición de la cantidad de albúmina FITC se realizó por fluorimetría (excitación 487 nm y emisión 520 nm) en el plasma y el triturado pulmonar. La permeabilidad endotelial pulmonar se calculó entonces según la fórmula validada siguiente:

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en la que FLHS es la fluorescencia del sobrenadante pulmonar; FLN es la fluorescencia natural de este sobrenadante medida sin albúmina-FITC; FBS es la fluorescencia del plasma; We x 0,07 x (1 -Hte) es el volumen plasmático (We: peso de los ratones; Hte: hematocrito); FBN es la fluorescencia natural del plasma medida sin administración de

albúmina-FITC; WH es el peso de los pulmones; QFB, que es la proporción de fluorescencia que corresponde a la sangre intrapulmonar residual, se calcula de la siguiente manera:

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5 en la que HbHS es la tasa residual de hemoglobina en el sobrenadante pulmonar y Hg es la hemoglobina del ratón antes del sacrificio.

1.9. Preparación de los homogeneizados pulmonares para el análisis de las citoquinas por el procedimiento ELISA

10 Los pulmones se homogeneizaron en un tampón helado (1 X PBS, pH 7,4, 0,1 % Triton X-100) que contiene 1 mM de inhibidor de proteasas (Sigma, Francia) (24). Los sobrenadantes obtenidos después de la centrifugación a +4°C durante 20 minutos a 12000 g se conservaron a -80°C hasta el análisis. La concentración proteica de cada muestra se determinó por el kit de medición proteica micro-BCA con estandarización con albumina sérica bovina (Pierce,

15 Inglaterra).

1.10. Cultivo celular para medición de la reactividad sanguínea con LPS

Se extrajo una muestra de 0,5 ml de sangre durante el sacrificio de los animales. La muestra se diluyo al 1/5 en

20 RPMI-1640 (Laboratoire de biotechnologies, Reims) con suplementación en penicilina/estreptomicina. La sangre se diluyó, se cultivaron 500 µl por pocillo, sin o con LPS (Escherichia coli O111:B4 a 1 µg/ml) a 37,0°C en una estufa al 5% de CO2 (20). El sobrenadante de los cultivos celulares se centrifugó a 12000 g durante 2 minutos y se conservó a -80°C antes de la dosificación ELISA. Las concent raciones de TNFalfa, de interleucina (IL)-1β y de la proteína inflamatoria del macrófago-2 (MIP-2) se cuantificaron por ELISA según las instrucciones del proveedor (R&D

25 Systems, Francia).

1.11. Aislamiento de las células CD11c positivas esplénicas

Se digirieron las ratas por colagenasa D (Roche Diagnostic, Alemania) en RPMI 1640/1% suero fetal de ternera

30 durante 25 minutos a 37°C. Se añadió EDTA a 10 mM p ara los 5 últimos minutos antes de la filtración (80 µm). Las células se lavaron en PBS antes de la incubación durante 15 minutos a +4°C con un anticuerpo anti-rato nes anti CD11c acoplado a una bola metálica. Después del lavado, la suspensión celular se enriqueció en células CD11c+ por selección positiva sobre columna de separación MACS (Miltenyi, Francia). La pureza de las células CD11c+ alcanzaba rutinariamente del 85 al 95%.

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1.12. Reacción de polimerasa en cadena con transcripción inversa en tiempo real (Real Time RT-PCR)

El ARN total de las células CD11 c+ esplénicas se aisló con TRIzol (Invitrogen, Francia) y se trató durante 45 minutos a 37°C con 2 U de RQ1 ADNasa (Promega, Fran cia). Un microgramo de ARN sufrió una retrotranscripción

40 con Superscript III transcriptasa inversa (Invitrogen). Se sometió un microlitro de solución de ADN complementario a una PCR cuantitativa en tiempo real en un sistema BioRad iCycler iQ utilizando el QuantiTect SYBR Green PCR kit (Qiagen, Francia). La PCR cuantitativa consistía en 45 ciclos de 30 segundos a 95°C seguido de 30 segu ndos a 60°C. Las secuencias de los cebadores para el TNFal fa, el interferón beta (IFNbeta), la IL-10, la IL-12 y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se seleccionaron gracias al programa "pick primer" de NCBI (tabla

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Tabla 1: Secuencias de los cebadores para la RT-PCR cuantitativa

Cebador: Cebador directo (5'-3') Cebador inverso (3'-5')

TNF alfa: AAAGGGAGAGTGGTCAGGTTGC GGCTGGCTCTGTGAGGAAGG

IFN beta: CCCTATGGAGATGACGGAGA CTGTCTGCTGGTGGAGTTCA

IL-10: TGGCATGAGGATCAGCAGGG GGCAGTCCGCAGCTCTAGG

IL-12p40: TGTGGAATGGCGTCTCTGTCTG CAGTTCAATGGGCAGGGTCTCC

GAPDH: ACCACAGTCCATGCCATCAC ACCTTGCCCACAGCCTTG

50 La expresión de GAPDH se utilizó como referencia para normalizar el nivel de expresión de cada gen. La expresión génica cuantitativa se calculó con el procedimiento de 2-∆∆Ct utilizando las células CD11c+ esplénicas de los ratones control como calibrador (Livak et al. 2001).

1.13. Análisis por FACS

55 El número total de células esplénicas vivas en suspensión (PBS-suero fetal de ternera-Azida) se completó sobre células de Malassez utilizando la exclusión de la eosina. Los anticuerpos anti-ratones procedentes de la rata utilizadas se obtuvieron a partir de la colección europea de cultivo celular. La mezcla de anticuerpos utilizada para excluir las células no dendríticas se obtuvieron de BD biosciences (Estados Unidos): CD3-PE, CD19-PE, TCRb-PE,

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NK1.1-PE, Ter119-PE. Las subpoblaciones de CD se caracterizaron por los anticuerpos siguientes: SiglecH-APC Biosciences (Estados Unidos), CD11 c-PECy7, CD8-FITC, B220-PerCPCy5.5. La maduración de CD se apreció por los anticuerpos biotinilados siguientes: anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40 y anti-CMH de clase II. La aspecificidad de los anticuerpos se midió mediante la adición de estreptavidina-APC Cianina 7 BD Biosciences (Estados Unidos): Se contaron un total de 4x106 células para cada anticuerpo.

1.14. Cocultivo de linfocitos T/células dendríticas (Ouabed et al. 2008)

Las subpoblaciones de DC se clasificaron por FACS y se maduraron (CD estimuladas) o no (CD no estimuladas) 24 horas por CpG 1668 (Invivogen, Francia). Las CD se cultivaron después con unos linfocitos T CD4+ y CD8+ alogénicos en una placa de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo. Después de tres días de cultivo a 37°C al 5% de CO2, las células se pusieron durante 8 horas en contacto con 0,5 µCi de [3H]TdR (GE Healthcare) por pocillo. Las células se recogieron entonces sobre un filtro de fibras de vidrio para medir la incorporación de timidina por centelleo (Packard Institute).

1.15. Análisis estadístico

El programa GraphPad prism (GraphPad Software, San Diego, California) se utilizó para los análisis estadísticos. Las tasas de supervivencia se compararon mediante un ensayo de logrank. Las variables continuas no paramétricas se expresaron en promedio ± SEM o ± 25-75º percentiles y se compararon mediante un ensayo de Kruskall Wallis seguido de un Mann-Whitney. p ≤ 0,05 era el límite de significatividad estadística.

2 Resultados

2.1. Estudio piloto: implementación de un modelo murino de inmunodepresión sistémica (IS) post-hemorrágica expuesto de manera secundaria a una neumopatía con S. aureus.

2.1.1 Efecto del inóculo y del intervalo de tiempo entre el choque hemorrágico y la neumopatía por SASM sobre la mortalidad

Con el objetivo de poner en evidencia los efectos de IS post-hemorrágica sobre la mortalidad, se realizó una neumopatía por SASM con 7·105, 7·106 y 7·107 UFC de S. aureus 24 horas después de la realización de un choque hemorrágico (grupo HP) y se comparó con la realización de una neumopatía sola (grupo P). La mortalidad era superior en el grupo HP comparada con el grupo P para los 2 inoculados más débiles (Figura 1.A.B). El inóculo superior conllevaba una mortalidad del 100% en los dos grupos (Figura 1.C.). Como la IS post-hemorrágica es un proceso dinámico, se ha evaluado la evolución en el tiempo de IS. Se realizó una neumopatía por SASM 2, 4, 8, 24, 48 o 96 horas después del choque hemorrágico (grupo HP-H2; -H4; -H8; H-24; H-48; H-96, respectivamente). Comparada con una neumopatía sola (grupo P), la tasa de supervivencia en el grupo HP disminuía significativamente con el aumento del plazo entre choque y neumopatía de 4 a 24 horas, y se observaba una recuperación progresiva para duraciones superiores (Figura 1.D). Un inóculo de S. aureus de 7·106 UFC (grupo P) y un plazo entre el choque hemorrágico y la neumopatía de 24 horas (grupo HP) eran los parámetros óptimos para el estudio de IS. Por lo tanto, se utilizaron para el estudio principal (Figura 2). En el grupo control (C), una punción cardiaca sin extracción sanguínea ni reanimación estaba seguida de una instilación intra-traqueal de suero salado estéril 24 horas más tarde. La hemorragia a volumen controlado se realizó por punción cardiaca (0,3 ml/10 g) seguida de una reinyección de la sangre extraída 60 minutos más tarde (grupo Hemorragia Neumopatía, HP). Veinticuatro horas después de la reanimación, se instilaron 70 µl, o bien 7·106 UFC de SASM (grupo Neumopatía, P y grupo HP), o bien de suero fisiológico estéril (grupo C) en la tráquea. Veinticuatro horas (salvo que se precise de otra manera) después de la infección, los ratones se eutanasiaron y realizaron las extracciones.

2.1.2 El choque hemorrágico agrava la pérdida de peso y las consecuencias biológicas de una neumopatía por SASM.

Se midieron también las consecuencias clínicas y biológicas de la IS post-hemorrágica sobre el devenir de la infección. Los ratones del grupo HP padecieron una mayor pérdida de peso (Figura 3.A), una acidosis metabólica más severa y una caída menos importante de la glucemia (Figura 3.B) que la del grupo P.

2.1.3. La IS post-hemorrágica induce unas bacteriemias durante una neumopatía por SASM.

La diseminación local y sistémica de la invención se evaluó 12, 24 y 48 horas después de la neumopatía con (grupo HP) y sin choque hemorrágico (grupo P). No se ha puesto en evidencia ningún SASM en los pulmones y el bazo de los ratones control (grupo C). El aclaramiento pulmonar bacteriano estaba sin alterar en el grupo HP en comparación con el grupo P (Figura 4.A). Por el contrario, la diseminación sistémica de la infección, evaluada por los cultivos de los triturados de bazos, aumentaba en intensidad en las horas 24 y 48 en el grupo HP comparado con el grupo P (Figura 4.B). Las bacteriemias eran también más frecuentes después de un choque hemorrágico a la hora 24ª y 48ª de la infección (Figura 4.C).

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Claims

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