ES2618605T3 - Oligopéptidos de metaloproteinasas y su uso terapéutico - Google Patents

Abstract

Un método que comprende: identificar una secuencia oligopeptídica para una metaloproteinasa de la matriz expresada en una enfermedad específica, sintetizar la secuencia oligopeptídica para la metaloproteinasa de la matriz, formular una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de tratamiento usando la secuencia oligopeptídica de la metaloproteinasa de la matriz, preparar una composición farmacéutica usando la composición de tratamiento para tratar a un mamífero que tiene la enfermedad específica que muestra una sobreexpresión de la metaloproteinasa de la matriz, en el que la secuencia oligopeptídica de la metaloproteinasa de la matriz es al menos una de las SEQ ID NO: 2 a 21 o una combinación de las mismas.

Description

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DESCRIPCION

Oligopeptidos de metaloproteinasas y su uso terapeutico

La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado como un archivo ASCII denominado RIPLLC018003CIP1sequence_ST25; fecha de creacion: 5/7/2011, y el tamano del archivo de texto ASCII en bytes es de 6 kb.

Campo tecnologico

La presente divulgacion se refiere, en general, al diseno y a la sintesis de nuevas secuencias oligopeptidicas de metaloproteinasas para su uso como agentes terapeuticos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la matriz extracelular. Mas concretamente, la presente divulgacion se refiere al uso de oligopeptidos de metaloproteinasa de diversas especies como una vacuna, una composicion farmaceutica, una dosis terapeutica y como un agente de diagnostico para el tratamiento del cancer.

Antecedentes

Las metaloproteinasas de la matriz son una familia de endopeptidasas neutras dependientes del cinc que desempenan un papel importante en la angiogenesis tumoral, la remodelacion tisular y la migracion celular. En el cancer, los niveles de algunas de las MMP son anormalmente elevados, lo que permite a las celulas cancerosas degradar la matriz extracelular (ECM), invadir la membrana basal vascular y crear metastasis en sitios distantes. Hay varias afecciones patologicas que se asocian con un aumento de la actividad de las metaloproteinasas (MMP), en particular, MMP-2 y MMP-9. Estas proteasas son capaces de digerir el colageno y otras proteinas de la matriz extracelular (ECM) y como condicion previa para la propagacion de la enfermedad. Asi pues, existe la necesidad de un agente terapeutico para bloquear de manera eficaz estas MMP a partir de la digestion de la ECM, bloqueando de este modo la propagacion del cancer y de otras enfermedades.

Actualmente, la prevention y el tratamiento de las metastasis representan el mayor reto en la terapia contra el cancer. Los tratamientos disponibles en la actualidad son toxicos, inespecificos e imprevisibles para las enfermedades afectadas por las proteinas de la ECM. Existe la necesidad de un agente terapeutico para bloquear de manera eficaz las moleculas de MMP a partir de la digestion de la ECM, evitando asi la degradation de la eCm y la propagacion de enfermedades.

El documento US 2003/139345 A1 desvela el uso de la secuencia oligopeptidica PRKPKWDK derivada de MMP-2 como agente terapeutico, como vacuna y como agente de diagnostico para el tratamiento del cancer y de la metastasis.

Sumario

La presente divulgacion desvela una secuencia y una composicion de oligopeptido de MMP y un metodo de uso del oligopeptido de MMP como vacuna, una composicion farmaceutica, una dosis terapeutica y como agente de diagnostico para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la ECM.

Se disenaron y sintetizaron los analogos de oligopeptidos para las secuencias de MMP-9 y MMP-2. Estos oligopeptidos se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir la invasion de las celulas cancerosas in vitro usando lineas celulares especificas.

Se ensayaron los analogos de oligopeptidos de MMP-9 y MMP-2 para determinar su eficacia para la supresion del crecimiento tumoral in vivo en ratones.

Se usaron las siguientes secuencias oligopeptidicas para producir una vacuna. De acuerdo con la invention, se puede disenar una dosis de tratamiento para una persona que padezca cancer que comprende los analogos de oligopeptidos sinteticos de SEC ID NO: 2-21.

Tabla 1- Secuencias de oligopeptidos sinteticos de MMP-9 (humanos):

SEQ ID NO: 2

MMP-9 A1 C H F P F I F E G R S Y S A C

SEQ ID NO: 3

MMP-9 A2 D T D D R F G F

SEQ ID NO: 4

MMP-9 A3 D R D K L F G F C P T R A D S

CO

Tabla 2- Secuencias de oligopeptidos siinteticos de MMP-9 fOtras especies):

SEQ ID NO:5

Raton MMP-9 A 5 D K D G K F G F

SEQ ID NO: 6

Bovina MMP-9 A 6 D A D R Q F G F

SEQ ID NO: 7

Rata MMP-9 A7 D T D R K Y G F

SEQ ID NO: 8

Carpa MMP-9 A 8 D K D K I F G F

SEQ ID NO: 9

Pez globo MMP-9A9 D K D K K Y G F

SEQ ID NO: 10

Conejo MMP-9 A10 D T D R R F G F

SEQ ID NO: 11

Raton MMP-9 A11 D K D G K F G F

SEQ ID NO: 12

Rata MMP-9 A12 C H F P F T F E G R S Y L S C

SEQ ID NO: 13

Polio MMP-9 A13 C H F P F I F E G R S Y S R c

SEQ ID NO: 14

Carpa euro pea MMP-9 A 14 c H F P F L F E G T S Y S S c

SEQ ID NO: 15

Pez globo MMP-9 A15 c H F P F R F Q N K P Y K H c

SEQ ID NO: 16

Lerguado MMP-9 A16 c H F P F T F E G K S Y T S c

SEQ ID NO: 17

Bovina MMP-9 A17 D Q D K L Y G F C P T R V D A

SEQ ID NO: 18

Rata MMP-9 A18 D K A D G F C P T R A D V T V

SEQ ID NO: 19

Raton MMP-9 A19 D Q D K L Y G F C P T R V D A

SEQ ID NO: 20

Carpa MMP-9 A20 D K K Y G F C P N R D T A V I

SEQ ID NO: 21

Conejo MMP-9 A 21 D K D K L Y G F C P T R A D S

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Tabla 3: Secuencias de oligopeptido de MMP-2:

SEQ ID NO: 1

MMP-2 A 4 C P R K P K W D K C

En una realizacion, la secuencia oligopeptidica puede tener, pero sin limitacion, mutaciones, eliminaciones y sustituciones.

El oligopeptido de MMP-2 se puede usar como una vacuna, una composicion farmaceutica, una dosis terapeutica y como una herramienta de diagnostico. En una realizacion, se puede usar un oligopeptido de MMP-2 en combinacion con uno cualquiera de los oligopeptidos de MMP-9 como una vacuna. En otra realizacion, los veinte oligopeptidos se pueden combinar para producir una vacuna.

Las secuencias oligopeptidicas, en una realizacion, pueden ser de diseno bien lineal o circular. En otra realizacion, el oligopeptido puede ser una repeticion de secuencias.

En otra realizacion, el oligopeptido puede tener bien haptenos o poliglicanos unidos al mismo para el suministro eficaz.

En otra realizacion, se desvela un metodo de inmunizacion de un mamifero, tal como ratones, para generar anticuerpos contra una MMP especifica. En una realizacion, se desvela una seleccion de un oligopeptido adecuado para elevar la antigenicidad. En otra realizacion, se realizo la inhibicion de la invasion de las celulas cancerosas mediante el anticuerpo inducido contra el oligopeptido in vitro.

En otra realizacion, se pueden inmunizar mamiferos tales como ratones y, posteriormente, exponerlos a celulas cancerosas de melanoma murino B16F0 con el fin de ensayar la inhibicion del crecimiento tumoral.

En una realizacion, la inmunizacion de los mamiferos puede no limitarse al cancer, sino que puede incluir todo el tratamiento de las enfermedades basadas en la degradation de la ECM. En otra realizacion, la vacuna se puede realizar una vez o varias veces mediante la medicion de los anticuerpos especificos contra el oligopeptido que se inyecto. En una realizacion, la especie especifica puede ser de un mamifero y/o de un no mamifero.

En una realizacion, una composicion para un oligopeptido en forma de una vacuna y una dosis de tratamiento comprende los oligopeptidos que comprenden las SEC ID 2-21 de forma individual o una combinacion de los mismos.

En una realizacion, la cantidad terapeuticamente eficaz se puede convertir, pero sin limitacion, en una inyeccion. Otras realizaciones pueden incluir formulaciones perorales, topicas, transmucosas, de inhalation, de administration dirigida y de liberation sostenida. La dosis de tratamiento puede componerse de combinaciones terapeuticamente eficaces y farmaceuticamente aceptables.

La composicion, el metodo y el tratamiento desvelados en el presente documento se pueden implantar en cualquier medio para la consecution de diversos aspectos, y se pueden ejecutar de una forma adecuada para el mamifero. Otras caracteristicas seran evidentes a partir las figuras anexas y de la description detallada que figura a continuation.

Breve descripcion de las figuras

Las realizaciones de ejemplo se ilustran a modo ilustrativo y no de limitacion en las figuras adjuntas, en las que las referencias similares indican elementos similares, y en las que:

La Figura 1 ilustra la tecnica anterior de las MMP que digieren la ECM durante un estado patologico.

La Figura 2 muestra el metodo de tratamiento de un mamifero usando la vacuna.

La Figura 3 A-D muestra la vista del experimento de invasion de matrigel en celulas de control HeLa, asi como las celulas de cancer de cuello uterino HeLa y el efecto de los sueros inmunes del oligopeptido de metaloproteinasa de la matriz MMP-9 A 1-3 y MMP-2 A 4.

La Figura 4 ilustra el peso de los ratones antes y despues del tratamiento.

La Figura 5 ilustra un efecto de la inmunizacion usando metalopeptidasa de la matriz MMP-9 A1-3 y MMP-2 A 4 sobre la inhibicion del peso tumoral de xenoinjertos de la linea celular de melanoma B16FO en ratones C57BL/6 macho.

La Figura 6 es una vista del resultado de la carga del peso tumoral (longitud y anchura) sobre el ratones C57BL/6 macho antes y despues del tratamiento de los xenoinjertos de melanoma.

La Figura 7A-E es una vista del crecimiento tumoral en el control y de la inhibicion tumoral en ratones inmunizados. La Figura 8 muestra una vista de la union situada para los diversos peptidomimeticos en una molecula de MMP.

Otras caracteristicas de las presentes realizaciones seran evidentes a partir las figuras anexas y de la descripcion

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detallada que figura a continuacion.

Descripcion detallada

En el presente documento, se describen varias secuencias y metodos de inmunizacion, tratamiento del cancer y reduccion del tamano tumoral usando el oligopeptido de metaloproteinasa de la matriz en forma de una vacuna. Aunque las presentes realizaciones se han descrito con referencia a realizaciones ilustrativas especificas, sera evidente que se pueden realizar diversas modificaciones y cambios en dichas realizaciones sin apartarse del espiritu ni del alcance mas amplios de las diversas realizaciones.

Las celulas cancerosas producen niveles mas elevados de metaloproteinasas de la matriz (MMP), en concreto, de MMP-9 y MMP-2. Estas enzimas son capaces de digerir el tejido conjuntivo de la matriz celular (ECM) adicional que rodea las celulas cancerosas. Las MMP se unen a la ECM a traves de sitios de union especificos. El bloqueo de estos sitios de union de las MMP evita que las MMP se unan a la ECM. La inhibicion de la destruccion de la ECM impide la progresion del cancer y la reduccion del tamano tumoral. En la presente divulgacion, se identificaron varios posibles sitios de union dentro de MMP-9 y MMP-2. La Figura 1 describe las celulas cancerosas 110 productoras de MMP 120 (etapa 1). Las MMP 120 se unen a los sitios de union especificos en la ECM 130 (etapa 2). La etapa 3 de la Figura 1 muestra las MMP 120 que digieren la ECM 140.

La Figura 2 explica la presente divulgacion en etapas de produccion de la vacuna e inmunizacion 200. La identificacion y el diseno de las MMP se llevan a cabo 210 usando las secuencias de MMP. Los oligopeptidos se sintetizan 220 y se representan por oligopeptidos sinteticos 240. Los oligopeptidos formulados para la vacunacion son 222. Los anticuerpos se producen como se muestra en 226. Los ratones 242 se inmunizan 224 usando la vacuna con la jeringa 240. Los oligopeptidos pueden ser de longitud especifica. Se ensayaron varias permutaciones y combinaciones de las secuencias. Las secuencias de la presente divulgacion se muestran en el parrafo [0008] como MMP-9 A1-3 y 5-21 y MMP-2 A 4. Antes de la seleccion de estas veintiuna secuencias como posibles oligopeptidos, se identificaron varios posibles sitios de union para MMP-9 y MMP-2. Se sintetizo un total de ocho oligopeptidos, y se ensayaron usando la linea celular de fibrosarcoma HT-1080 y la linea celular de cancer de cuello uterino DoTC-2. Solo se siguieron las secuencias seleccionadas para la experimentacion adicional. La MMP-9 A1-3 y 5-21 y MMP-2 A 4 se sintetizaron en un formato circular y lineal. Tambien se realizaron muchas modificaciones de estas secuencias en una realization. Las modificaciones fueron las sustituciones de uno o mas restos de aminoacidos en los extremos N-terminal, C-terminal y tanto C- como N- terminal, la sustitucion de restos de aminoacidos basandose en la carga y la polaridad similares, sin tener en cuenta la carga ni la polaridad, omitiendo los aminoacidos del extremo C- y N-terminal, omitiendo solo los del extremo C-terminal y solo los del extremo N- terminal.

En otra realizacion, la sustitucion y la omision se pueden llevar a cabo de forma simultanea. Los oligopeptidos se pueden modificar adicionalmente mediante la repetition de las secuencias y la combination de mas de una SEQ ID NO: 1-3, 5-21 MMP-9 A1-3 y 5-21 y SEQ ID NO: 1, MMP-2 A 4 para la produccion y la formulation de una vacuna. El peptidomimetico de las MMP se puede usar para bloquear el sitio de union de una MMP sobreexpresada en una enfermedad especifica.

En una realizacion, el oligopeptido se puede usar como regulador de retroalimentacion para prevenir o reducir especificamente la velocidad de sintesis de las producciones de MMP-9 y MMP-2 a nivel celular. En una realizacion, se produjo el proceso de bloqueo e inhibicion de la destruccion de la ECM por los antigenos debido a la vacunacion de los ratones.

En otra realizacion, los oligopeptidos sintetizados se biotinilaron en el extremo N-terminal usando veintiun espaciadores de carbono de Genscript (Pitcataway, NJ 08554 EE.UU.) y se conjugaron a la proteina KLH. En un experimento realizado en ratones, los animales se adquirieron, se inmunizaron, se sometieron a induction tumoral y se observaron para determinar la eficacia del tratamiento de la inmunoterapia inducida por oligopeptidos.

Las inyecciones se prepararon usando 100 ^l de peptidos biotinilados conjugados con KLH y 100 ^l de adyuvante completo de Freund (Sigma, St. Louis, MO).

Los ratones C57BL/6 macho de 6 semanas de vida a la llegada se adquirieron en Simonsen Laboratorios, Gilroy, CA y se mantuvieron en jaulas microaislantes en condiciones exentas de patogenos en ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad durante una semana. Todos los animales se cuidaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de experimentacion. Despues del alojamiento durante una semana, los ratones (n = 5/grupo) se inmunizaron mediante inyeccion intraperitoneal el Dia 0, y adyuvante incompleto de Freund (Sigma) el Dia 7, 14 y 28. Se analizaron muestras de sangre para determinar su respuesta inmune mediante ensayo Elisa convencional usando placas de microvaloracion. Las inyecciones repetidas de peptidos sinteticos en ratones producen una respuesta inmune a los peptidos individuales especificos. Se probaron diversas diluciones, siendo los ejemplos de diluciones probados 1:100, 1:1.000 y 1:10.000.

Conjugacion de peptidos

Todos los peptidos de SEQ ID NO: 1-4 se conjugaron covalentemente a la protema hemocianina de lapa californiana (KLH). En un experimento tipico de 1 mg de peptido, se disolvieron 4 mg de KLH en 5 ml de NaHCO3 0,01 M y 2 ml 5 de glutaraldehido, y se agito durante una noche. Al finalizar, se anadieron 100 ml de etilester de glicina 1 M hasta la concentracion final de 0,1 M y se dejaron durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, se produjo la precipitacion con 4-5 vol de acetona fria a -70 °C durante 30 minutos. A continuacion, se calento brevemente a temperatura ambiente y se sedimento a 10.000 g durante 10 min. El sedimento se disolvio en 1 ml de NaHCO3 0,1 M y se almaceno a -20 °C.

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Ensayo de respuesta inmune contra el peptido

Se recubrieron placas de microvaloracion con peptido individual en 100 ^l/pocillo en tampon de carbonato 5 mM, pH 9,5 durante 20 horas a 20 °C. Tras lavar, se incubaron los pocillos con una dilucion en serie de suero de raton en 15 PBS/BSA al 0,5 %, Tween 20 (tampon de union, BB). Tras el lavado, se incubaron los pocillos con anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de raton conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) en BB durante 30 minutos a 37 °C. Tras lavar, se determino el titulo de IgG de raton anti-peptido mediante una reaccion de color con solucion de sustrato TMB a 450 nm.

20 En dilucion 1:100, la intensidad de la respuesta inmune fue mayor para SEQ ID NO: 2-4 MMP-9 A 1-3 y un poco inferior para SEQ ID NO: 1, MMP-2 A 21 como se muestra en la siguiente Tabla 4.

TAB LA. 4

Elisa - Peptido A1-A4

Sir avidina Sin peptido Sin peptido esp. cox Suero de control n.^3 Peptido de ensayo antes de la administration de B16FO Peptido de ensayo despues de la administracion de B16FO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

CONT 1:100

,300 ,166 ,173 ,352 ,863 ,241 ,221 ,267 ,862 1,345 ,213 ,202

1:1000

,149 ,443 ,158 ,215 ,339 ,174 ,164 ,236 ,699 ,234 ,166 ,164

1:10000

,119 ,155 ,154 ,187 ,261 ,231 ,212 ,229 ,287 ,176 ,155 ,143

MMP-9 A-1 1:100

1,248 ,336 ,362 ,418 3,898 3,868 3,843 3,895 3,897 3,864 3,820 3,87

1:1000

,417 ,199 ,299 ,282 3,402 1,901 1,033 2,127 3,624 1,875 ,999 2,01

1:10000

,146 ,210 ,227 ,244 ,394 ,274 ,228 ,330 ,645 ,244 ,226 ,22

MMP-9 A-2 1:100

,927 ,298 ,299 ,335 3,581 3,363 3,870 3,238 3,635 3,609 3,465 3,86

1:1000

,208 ,210 ,189 ,242 ,646 1,339 2,856 ,360 ,526 ,859 ,277 ,274

1:10000

,224 ,178 ,181 ,197 ,224 ,261 ,477 ,175 ,203 ,235 ,161 ,343

MM P-9 A-3 1:100

,706 ,626 ,339 ,285 3,775 3,810 1,991 3,812 3,776 3,814 2,063 3,84

1:1000

,390 ,162 ,167 ,178 ,394 2,157 ,272 2,281 ,448 1,332 ,443 2,34

1:10000

,123 ,142 ,151 ,158 ,159 ,631 ,159 ,267 ,167 ,209 ,153 ,296

MM P-2 A-4 1:100

,926 ,273 ,258 ,240 1,485 2.409 1,811 1,649 1,836 3,172 2,278 1,621

1:1000

,340 ,162 ,162 ,192 ,650 ,974 ,771 ,239 ,706 1,286 ,775 ,294

1:10000

.148 ,142 ,150 ,179 ,220 ,257 ,208 ,168 ,290 ,313 ,230 ,167

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La cantidad terapeuticamente eficaz de oligopeptido se puede administrar al mam^fero de muchas maneras diferentes y no puede limitarse a las inyecciones. Los diversos metodos de administracion son bien conocidos en la tecnica y, a continuacion, se describen algunos de los metodos.

Una "especie concreta" que se va a tratar mediante el presente metodo puede significar un animal humano o no humano, tal como ratones, animales de granja, primates y vertebrados.

Las enfermedades especificas que serian las enfermedades diana de un tratamiento usando secuencias de oligopeptidos de MMP y/o peptidomimetico son enfermedades neoplasicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades de las arterias coronarias, enfermedades cardiovasculares oclusivas, enfermedades degenerativas y enfermedades infecciosas. Algunos ejemplos de enfermedades neoplasicas pueden ser, pero sin limitacion, cancer, linfoma, leucemia y tumores cerebrales. Algunos ejemplos de enfermedades inflamatorias pueden ser, pero sin limitacion, artritis, asma, aterosclerosis, enfermedad de Crohn, colitis, dermatitis, lupus eritematoso, etc. Algunos ejemplos de enfermedades infecciosas pueden incluir, pero sin limitacion, bacterianas, viricas, micoticas, micoplasmas, ciertas enfermedades geneticas y otras infecciones. En la presente solicitud, se identificaron los oligopeptidos senal de la proteina MMP selectiva que median en la funcion patologica clave de la proteina MMP, en concreto, en la digestion del tejido conjuntivo, que es una condicion previa para que las celulas cancerosas migren y formen metastasis. Se sintetizaron los oligopeptidos, se inyectaron a los animales y se generaron anticuerpos. El tamano del tumor se redujo significativamente con el uso de estas vacunas de elevacion de oligopeptidos. El grado de eficacia se puede observar por el nivel de titulacion causado por la vacuna de oligopeptido de MMP, que prueba que las vacunas eran muy eficaces.

Uno de los metodos convencionales de seleccion para aumentar la antigenicidad natural de la/s secuencia/s oligopeptidica/s de una proteina dada es una ligera alteracion en la secuencia de aminoacidos del oligopeptido dado, es decir, mediante sustituciones, eliminaciones, inserciones, etc., de aminoacidos individuales. Se identificaron las SEC ID NO: 5-21 y se disenaron de manera que coincidieran con la hidrofobicidad, hidrofilicidad y carga electrica de las secuencias oligopeptidicas de aminoacidos de SEQ ID NO: 1-3 (MMP). Tambien mantiene las caracteristicas de la senal y la funcionalidad como un epitopo. Dado que estos oligopeptidos son muy similares a SEQ ID NO: 1-3 (MMP), se pueden usar como vacuna para la reduccion del crecimiento tumoral. La presente solicitud presenta estas secuencias como un posible candidato para el desarrollo de vacunas para tratar el cancer. Las SEQ ID NO: 5-21 pueden potenciar la eficacia terapeutica para la inmunizacion cruzada entre especies mediante la mejora de la antigenicidad natural independientemente de si se usan los adyuvantes.

Las formulaciones farmacologicas adecuadas para estas vias de administracion se pueden producir mediante la adicion de uno o mas vehiculos farmacologicamente aceptables al agente y, despues, el tratamiento de la mezcla a traves de un proceso habitual conocido por los expertos en la materia. El modo de administracion incluye, pero sin limitacion, la via peroral no invasiva, topica (por ejemplo, transdermica), enteral, transmucosa, administracion dirigida, administracion de liberacion sostenida, liberacion retardada, liberacion pulsada y metodos parenterales. La administracion peroral puede administrarse tanto en estado liquido como seco.

Las formulaciones adecuadas para la administracion oral pueden estar en forma de capsulas, obleas, pildoras, comprimidos, grageas (usando una base aromatizada, normalmente, sacarosa y goma arabiga o tragacanto), polvos, granulos, o en forma de una solucion o una suspension en un liquido acuoso o no acuoso, o en forma de una emulsion liquida de aceite en agua o de agua en aceite, o en forma de un elixir o jarabe, o en forma de pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga), cada una conteniendo una cantidad predeterminada de una composicion en cuestion como principio activo. Las presentes composiciones tambien se pueden administrar en forma de un bolo, un electuario o una pasta.

Cuando se prepara un producto farmacologico solido oral, se mezcla la secuencia oligopeptidica de MMP y/o un peptidomimetico de las MMP con un excipiente (y, si es necesario, uno o mas aditivos tales como un aglutinante, un disgregante, un lubricante, un agente colorante, un agente edulcorante y un agente saborizante), y la mezcla resultante se procesa a traves de un metodo de rutina, para producir con ello un producto farmacologico solido oral, tal como comprimidos, comprimidos recubiertos, granulos, polvos o capsulas. Los aditivos pueden ser los empleados en general en la tecnica Los ejemplos del excipiente incluyen lactato, sacarosa, cloruro de sodio, glucosa, almidon, carbonato de calcio, caolin, celulosa microcristalina y acido silicico; los ejemplos del aglutinante incluyen agua, etanol, propanol, jarabe simple, solucion de glucosa, solucion de almidon, gelatina licuada, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, almidon de hidroxipropilo, metilcelulosa, etilcelulosa, goma laca, fosfato de calcio y polivinilpirrolidona; los ejemplos del disgregantes incluyen almidon seco, arginato de sodio, agar en polvo, hidrogenocarbonato de sodio, carbonato de calcio, laurilsulfato de sodio, estearato de monoglicerilo y lactosa; los ejemplos del lubricante incluyen talco, sales de acido estearico, borax y polietilenglicol purificado; y los ejemplos del agente edulcorante incluyen sacarosa, piel de naranja, acido citrico y acido tartarico.

Cuando se prepara un producto farmacologico liquido para la administracion oral, se mezcla la secuencia de oligopeptido de MMP y/o un peptidomimetico de MMP con un aditivo tal como un agente edulcorante, un tampon, un estabilizador o un agente saborizante, y la mezcla resultante se procesa a traves de un metodo de rutina para producir con ello un producto farmacologico liquido administrado por via oral tal como una medicina de solucion

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interna, un jarabe o un elixir. Los ejemplos del agente edulcorante incluyen vainillina; los ejemplos del tampon incluyen citrato de sodio; y los ejemplos del estabilizador incluyen tragacanto, goma arabiga y gelatina.

Para los fines de la administracion transdermica (por ejemplo, topica), se pueden preparar soluciones diluidas esteriles, acuosas o parcialmente acuosas (normalmente, a una concentracion del aproximadamente 0,1 % al 5 %), similares por lo demas a las soluciones parenterales anteriores.

Las formulaciones para la administracion rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que se puede preparar mediante la mezcla de una composicion en cuestion con uno o mas vehiculos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un salicilato, y que es solida a temperatura ambiente, pero liquida a la temperatura corporal y, por lo tanto, se fundira en la cavidad corporal adecuada y liberara el/los compuesto/s encapsulado/s y la/s composicion/es. Las formulaciones que son adecuadas para la administracion vaginal tambien incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverizacion que contienen vehiculos tales como los conocidos en la tecnica por su idoneidad.

Se puede anadir una parte liberada diana al sistema de liberacion prolongada por medio de bien la aplicacion de una capa de liberacion inmediata en la parte superior del nucleo de liberacion prolongada; usando procesos de recubrimiento o de compresion, o en un sistema de unidades multiples tales como una capsula que contiene perlas de liberacion prolongada e inmediata.

Cuando se usa con respecto a una composicion farmaceutica u otro material, la expresion "liberacion sostenida" es reconocida en la tecnica. Por ejemplo, una composicion terapeutica que libera una sustancia con el tiempo puede presentar caracteristicas de liberacion sostenida, en contraste con una administracion de tipo bolo, en la que se vuelve biologicamente disponible toda la cantidad de la sustancia a la vez. Por ejemplo, en realizaciones particulares, al entrar en contacto con fluidos corporales incluyendo sangre, liquido cefalorraquideo, secreciones mucosas, linfa o similares, uno o mas de los excipientes farmaceuticamente aceptables pueden sufrir la degradacion gradual o retardada (por ejemplo, a traves de hidrolisis) con la liberacion concomitante de cualquier material incorporado en el mismo, por ejemplo, una sal y/o composicion terapeuticas y/o biologicamente activas, durante un periodo sostenido o prolongado (en comparacion con la liberacion de un bolo). Esta liberacion puede dar lugar a la liberacion prolongada de cantidades terapeuticamente eficaces de cualquiera de los agentes terapeuticos desvelados en el presente documento.

Los esfuerzos actuales en el area de la administracion de farmacos incluyen el desarrollo de la administracion dirigida en la que el farmaco es activo solo en la zona diana del cuerpo (por ejemplo, en los tejidos cancerosos) y formulaciones de liberacion sostenida en las que el farmaco se libera durante un periodo de tiempo de una manera controlada a partir de una formulacion. Los tipos de formulaciones de liberacion sostenida incluyen liposomas, microesferas biodegradables cargadas con farmaco y conjugados de polimero y farmaco.

Las formulaciones farmaceuticas de liberacion retardada se crean mediante el recubrimiento de una forma farmaceutica solida con una pelicula de un polimero que es insoluble en el medio acido del estomago, pero soluble en el ambiente neutro del intestino delgado. Las unidades farmaceuticas de liberacion retardada se pueden preparar, por ejemplo, mediante el recubrimiento de un farmaco o de una composicion que contiene farmaco con un material de recubrimiento seleccionado. La composicion que contiene el farmaco puede ser un comprimido para la incorporacion en una capsula, un comprimido para su uso como un nucleo interior en una forma farmaceutica de "nucleo recubierto" o una pluralidad de perlas que contienen farmaco, particulas o granulos, para la incorporacion en bien un comprimido o una capsula. Los materiales de recubrimiento preferidos incluyen polimeros bioerosionables, gradualmente hidrolizables, gradualmente hidrosolubles y/o enzimaticamente degradables, y pueden ser polimeros “entericos” convencionales. Los polimeros entericos, como sera apreciado por los expertos en la materia, se vuelven solubles en el ambiente de mayor pH del tracto gastrointestinal inferior o se erosionan lentamente cuando la forma farmaceutica pasa por el tracto gastrointestinal, mientras que los polimeros degradables enzimaticamente son degradados por enzimas bacterianas presentes en el tracto gastrointestinal inferior, en particular, en el colon. Como alternativa, un comprimido de liberacion retardada puede formularse mediante la dispersion del farmaco con cubierta dentro de una matriz de un material adecuado, tal como un polimero hidrofilo o un compuesto graso. Los polimeros hidrofilos adecuados incluyen, pero sin limitacion, polimeros o copolimeros de celulosa, ester de celulosa, acido acrilico, acido metacrilico, acrilato de metilo, acrilato de etilo y vinilo, o polimeros o copolimeros enzimaticamente degradables como se ha descrito anteriormente. Estos polimeros hidrofilos son particularmente utiles para proporcionar una matriz de liberacion retardada. Los compuestos grasos para su uso como un material de matriz incluyen, pero sin limitacion, ceras (por ejemplo, cera de carnauba) y triestearato de glicerol. Una vez que el ingrediente activo se mezcla con el material de matriz, la mezcla se puede comprimir en comprimidos.

Una dosificacion liberada por pulsos es aquella que imita un perfil de dosificacion multiple sin dosificacion repetida y, normalmente, permite al menos una reduccion doble en la frecuencia de dosificacion en comparacion con el farmaco presentado como una forma farmaceutica convencional (por ejemplo, como una solucion o forma farmaceutica solida convencional de liberacion del farmaco inmediata). Un perfil de liberacion por pulsos se caracteriza por un periodo de tiempo de no liberacion (tiempo de retardo) o liberacion reducida, seguido de una liberacion rapida del farmaco.

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Las expresiones "administracion parenteral" y "administrado por v^a parenteral", como se usa en el presente documento, se refieren a modos de administracion distintos de la administracion enteral y topica, tales como inyecciones, e incluyen, sin limitacion, inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intrapleural, intravascular, intrapericardica, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradenal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.

Ciertas composiciones farmaceuticas desveladas en el presente documento adecuadas para la administracion parenteral comprenden una o mas composiciones en cuestion en combinacion con una o mas soluciones esteriles, isotonicas, acuosas o no acuosas farmaceuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos esteriles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, solutos que vuelven la formulacion isotonica en la sangre del receptor deseado, o agentes de suspension o espesantes.

Cuando se prepara un producto de inyeccion, se mezcla la secuencia oligopeptidica de MMP y/o un peptidomimetico de MMP con un aditivo tal como un regulador de pH, un tampon, un estabilizador, un agente de isotonicidad o un anestesico local, y la mezcla resultante se procesa a traves de un metodo de rutina, para producir de este modo una inyeccion para inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular o inyeccion intravenosa. Los ejemplos del regulador de pH o tampon incluyen citrato de sodio, acetato de sodio y fosfato de sodio; los ejemplos del estabilizador incluyen pirosulfito de sodio, EDTA, acido tioglicolico y acido tiolactico; los ejemplos de los anestesicos locales incluyen clorhidrato de procaina y clorhidrato de lidocaina; y los ejemplos del agente de isotonicidad incluyen cloruro sodico y glucosa.

Los adyuvantes se usan para potenciar la respuesta inmune. Se dispone de varios tipos de adyuvantes. En La presente divulgacion, se usan los haptenos como adyuvantes. Tambien se pueden usar adyuvantes de Freund para producir emulsiones de agua en aceite de inmunogenos. Los antigenos en emulsiones de agua en aceite estimulan respuestas de anticuerpos altas y de larga duracion que pueden atribuirse a la lenta liberacion del antigeno. Los antigenos (preferentemente, en solucion salina) normalmente se mezclan con un volumen igual del adyuvante para formar una emulsion.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" es reconocida en la tecnica. En ciertas realizaciones, la expresion incluye composiciones, polimeros y otros materiales y/o formas farmaceuticas que estan dentro del alcance del juicio medico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los mamiferos, seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica, u otro problema o complicacion, acorde con una relacion de beneficio/riesgo razonable.

La expresion "vehiculo farmaceuticamente aceptable" es reconocida en la tecnica, e incluye, por ejemplo, materiales, composiciones o vehiculos farmaceuticamente aceptables, tales como una carga liquida o solida, diluyente, disolvente o material de encapsulacion implicada en llevar o transportar cualquier composition en cuestion, desde un organo o parte del cuerpo a otro organo u otra parte del cuerpo. Cada vehiculo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de una composicion en cuestion y no perjudicial para el paciente. En ciertas realizaciones, un vehiculo farmaceuticamente aceptable es no pirogenico. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) azucares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones tales como almidon de maiz y almidon de patata; (3) celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de algodon, aceite de girasol, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de soja; (10) glicoles tales como propilenglicol; (11) polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; (15) acido alginico; (16) agua libre de pirogenos; (17) solucion salina isotonica; (18) solucion de Ringer; (19) alcohol etilico; (20) soluciones tampon de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en formulaciones farmaceuticas.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento se formulan de manera que dichas composiciones se administraran a un mamifero en una cantidad terapeuticamente eficaz, como parte de un tratamiento profilactico, preventivo o terapeutico.

En ciertas realizaciones, la dosificacion de las composiciones de oligopeptidos, que se pueden denominar composicion terapeutica proporcionada en el presente documento se puede determinar por referencia a las concentraciones plasmaticas de la composicion terapeutica o de otros materiales encapsulados. Por ejemplo, las muestras de sangre se pueden ensayar para determinar su respuesta inmune a sus correspondientes oligopeptidos.

Las composiciones terapeuticas proporcionadas por la presente solicitud se pueden administrar a un sujeto que necesita tratamiento por varias vias de administracion convencionales, incluyendo por via oral, topica, parenteral, por ejemplo, por via intravenosa, subcutanea o intramedular. Ademas, las composiciones terapeuticas se pueden administrar por via intranasal, como un supositorio rectal o usando una formulacion "instantanea", es decir, permitiendo que el medicamento se disuelva en la boca sin la necesidad de usar agua. Ademas, las composiciones

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se pueden administrar a un sujeto que necesita tratamiento mediante formas farmaceuticas de liberacion controlada, administracion de farmacos espedfica del sitio, administracion transdermica de farmacos, administracion de farmacos mediada por parche (activo/pasivo), por inyeccion estereotactica o en nanoparticulas.

Expresado en terminos de concentracion, un principio activo puede estar presente en las composiciones terapeuticas de la presente invencion para un uso localizado sobre el cutis, intranasal, faringolaringea, bronquial, intravaginal, rectal u ocular.

Para su uso como aerosoles, los principios activos pueden envasarse en un recipiente de aerosol presurizado junto con un propulsor gaseoso o licuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, dioxido de carbono, nitrogeno, propano y similares, con los coadyuvantes habituales tales como codisolventes y agentes humectantes cuando sea necesario o deseable.

Las vias mas comunes de administracion tambien incluyen las vias transmucosa preferidas (nasal, bucal/sublingual, vaginal, ocular y rectal) y la via de inhalacion.

Ademas, en ciertas realizaciones, las composiciones en cuestion de la presente solicitud pueden estar liofilizadas o sometidas a otra tecnica de secado apropiada tal como secado por pulverizacion. Las presentes composiciones se pueden administrar una vez, o pueden dividirse en un numero de dosis mas pequenas para su administracion a intervalos variables de tiempo, dependiendo, en parte, de la velocidad de liberacion de las composiciones y la dosis deseada.

Las formulaciones utiles en los metodos proporcionados en el presente documento incluyen las adecuadas para la administracion oral, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal, aerosol y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma farmaceutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de la farmacia. La cantidad de una composicion en cuestion que se puede combinar con un material vehiculo para producir una sola dosis puede variar dependiendo del sujeto tratado y del modo particular de administracion.

La cantidad terapeuticamente aceptable descrita en el presente documento se puede administrar en formulaciones de inhalacion o en aerosol. Las formulaciones para inhalacion o en aerosol pueden comprender uno o mas agentes, tales como adyuvantes, agentes de diagnostico, agentes de formacion de imagenes o agentes terapeuticos utiles en la terapia de inhalacion. La formulacion de aerosol final puede contener, por ejemplo, del 0,005 al 90 % p/p, por ejemplo, del 0,005 al 50 %, del 0,005 al 5 % p/p o del 0,01 al 1,0 % p/p de medicamento con relacion al peso total de la formulacion.

Ejemplos de vehiculos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmaceuticas incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

La dosis terapeutica aceptable se puede combinar con otros farmacos y se puede tratar como una combinacion de farmacos.

En la Figura 2, los anticuerpos producidos 241 se comprueban mediante ELISA. La inoculacion de los ratones (228) se realizo usando celulas cancerosas 246 por inyeccion. Se observo el bloqueo de las MMP 230 por el antigeno 248. La ECM intacta 234, mostrada como 250 mediante la inhibicion de la destruccion de la ECM 232 se demostro mediante estudios in vivo e in vitro como se ha descrito anteriormente y se describa a continuacion.

Lineas de celulas cancerosas y cultivo

Se mantuvieron celulas humanas de cancer de cuello uterino (HeLa) y celulas murinas de melanoma B16FO obtenidas a partir de la ATCC (coleccion americana de cultivos tipo, Rockville, MD) en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10 % y antibioticos. Los medios y los sueros usados se obtuvieron de la ATCC, y los antibioticos (penicilina y estreptomicina) eran de Gibco BRL, Long Island, NY.

Invasion en Matrigel

Se realizaron estudios de invasion usando inserciones de Matrigel (Becton Dickinson) en placas de 24 pocillos. Suspendidas en medio que contenia antisueros de los ratones experimentales inmunizados, en dilucion 1:100, se sembraron celulas HeLa de cancer de cuello uterino humanas sobre la insercion en el pocillo. El pocillo tiene medio cebado con fibroblastos dermicos humanos como tastant quimico. A continuacion, se incubaron las placas con las inserciones en un incubador de cultivo equilibrado con aire al 95 % y CO2 al 5 % durante 24 horas. Despues de la incubacion, se retiraron los medios de los pocillos. Se lavaron las celulas de la superficie superior de la insercion

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo que comprende:

   identificar una secuencia oligopeptidica para una metaloproteinasa de la matriz expresada en una enfermedad espedfica,

   sintetizar la secuencia oligopeptidica para la metaloproteinasa de la matriz,

   formular una cantidad terapeuticamente eficaz de una composition de tratamiento usando la secuencia oligopeptidica de la metaloproteinasa de la matriz,

   preparar una composicion farmaceutica usando la composicion de tratamiento para tratar a un mamifero que tiene la enfermedad especifica que muestra una sobreexpresion de la metaloproteinasa de la matriz,

   en el que la secuencia oligopeptidica de la metaloproteinasa de la matriz es al menos una de las SEQ ID NO: 2 a 21 o una combination de las mismas.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la secuencia oligopeptidica de la metaloproteinasa de la matriz es al menos una de las SEQ ID NO: 2 a 4.
3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la composicion farmaceutica es una vacuna.
4. 4. El metodo de una de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad especifica es al menos una de entre enfermedad neoplasica, en especial, cancer, enfermedad inflamatoria, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cardiovascular oclusiva, enfermedad degenerativa y enfermedad infecciosa.
5. 5. El metodo de una de las reivindicaciones anteriores, en el que la composicion farmaceutica se va a administrar usando al menos uno de entre un metodo no invasivo peroral, topico, enteral, transmucoso, de administration dirigida, de administracion de liberation sostenida y parenteral.
6. 6. El metodo de una de las reivindicaciones anteriores que comprende ademas:

   medir ex vivo el nivel de expresion de una metaloproteinasa de la matriz en una especie especifica que tiene una enfermedad especifica, en especial, cancer,

   formular una composicion de tratamiento para producir una cantidad terapeuticamente eficaz de la secuencia oligopeptidica de la metaloproteinasa de la matriz y

   preparar el preparado farmaceutico usando la composicion de tratamiento para inyectar la composicion de tratamiento como una vacuna a la especie especifica para tratar la enfermedad especifica que tiene una sobreexpresion de una metaloproteinasa de la matriz.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que la especie especifica es un mamifero o un no mamifero.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 6 o de la reivindicacion 7, en el que el preparado farmaceutico se va a inyectar directamente en un tumor.
9. 9. El metodo de una de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende ademas:

   acoplar la secuencia de la metaloproteinasa de la matriz con un hapteno para potenciar la respuesta inmune como vacuna.
10. 10. El metodo de una de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende ademas:

    formular la cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion de tratamiento usando una secuencia peptidomimetica de la metaloproteinasa de la matriz.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende:

    un oligopeptido de metaloproteinasa de la matriz, siendo el oligopeptido de metaloproteinasa de la matriz al menos uno de las SEQ ID NO: 2 a 21 o una combinacion de las mismas, preferentemente al menos uno de las SEQ ID NO: 2 a 4, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
12. 12. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 11, que comprende ademas un adyuvante,

    un aditivo para potenciar la estabilidad quimica, una solution salina de tampon fosfato y

    un hapteno para aumentar la inmunogenicidad de la composicion.
13. 13. La composicion farmaceutica de las reivindicaciones 11 o 12, en la que el oligopeptido de metaloproteinasa de la matriz es de forma lineal o circular.
14. 14. Un oligopeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NO: 2 a 21.

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15. 15. El oligopeptido de la reivindicacion 14, en el que la secuencia de aminoacidos es una de las SEQ ID NO: 2 a 4.
16. 16. El oligopeptido de la reivindicacion 14 o la reivindicacion 15, en donde el oligopeptido esta biotinilado y/o unido covalentemente a hemocianina de lapa californiana.

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17. 17. Uso de un oligopeptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 a 16 para la preparacion de una vacuna para inducir una respuesta inmune contra la metaloproteinasa 2 de la matriz humana o la metaloproteinasa 9 de la matriz humana en un mamifero.

    15 18. Uso de un oligopeptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 a 16 para la preparacion de una vacuna

    para tratar el cancer.