ES2617449T3 - Método de observación de la emisión de luz desde una muestra por microscopía óptica dinámica - Google Patents
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Abstract
Método para observar una emisión de luz (14, 15) de una muestra (10) en un medio (11) de índice de refracción nL, estando la muestra dispuesta contra una superficie (20a) de un soporte transparente (20) de índice de refracción ns superior a nL, comprendiendo la emisión de luz unos componentes luminosos de amplitud y de fase dadas, orientadas hacia el soporte y que forman un ángulo θ con una dirección (20b) perpendicular a la superficie (20a), entre las que están, por un lado, unos componentes luminosos supercríticos para los que el ángulo θ es estrictamente superior a un ángulo crítico θc >= arcsen(nL/ns) y, por otro lado, unos componentes luminosos críticos o subcríticos, para los que el ángulo θ es inferior o igual al ángulo crítico θc, implementando el método un dispositivo de observación (100) capaz de: - recoger al menos una parte de la emisión de luz de una región de interés de la muestra y obtener una señal luminosa recogida que incluye unos componentes luminosos procedentes de los componentes luminosos supercríticos de la emisión de luz; - aplicar unos filtros (170) a la señal luminosa recogida para disminuir selectivamente la amplitud y/o modificar la fase de ciertos componentes luminosos de la señal luminosa recogida para obtener una señal luminosa filtrada; y - transformar la señal luminosa filtrada en una zona de imagen de la región de interés de la muestra; estando el método caracterizado por que: - se realiza una modulación de la señal luminosa filtrada, en la que se dejan pasar unos componentes luminosos procedentes de los componentes luminosos críticos o subcríticos de la emisión de luz, para obtener unas zonas de imagen (6a, 6b) de una misma región de interés de la muestra, tratando la modulación sobre todos o parte de los componentes luminosos de la señal luminosa recogida procedente de los componentes luminosos supercríticos de la emisión de luz; y - se produce al menos una zona de imagen útil (6c) de la muestra por combinación de las zonas de imagen (6a, 6b), poniendo en evidencia la combinación unas diferencias entre las zonas de imagen (6a, 6b) vinculadas a la modulación.
Description
vinculada a los componentes luminosos procedentes de la parte supercrítica de la señal recogida, es decir que el filtro utilizado ha ocultado estos componentes. La tercera zona de imagen se toma en unas condiciones idénticas a la primera. Una combinación posible de estas tres zonas de imagen sucesivas es calcular el valor absoluto de la diferencia entre, por un lado, una media de la primera y tercera zonas de imagen y, por otro lado, la segunda zona
5 de imagen. Esto puede permitir reducir el ruido en la zona de imagen útil (fenómeno de fotoblanqueo, fluctuación de la intensidad de excitación, movimiento de la muestra).
Las imágenes contienen una información vinculada a la intensidad (positiva) del campo eléctrico global. Una diferencia entre dos píxeles puede por tanto ser positiva o negativa, esto es por lo que se utiliza un valor absoluto para obtener un resultado positivo que represente una intensidad, la de la zona de imagen útil.
Según otro modo particular, se toman en la etapa a) dos zonas de imagen de una misma región de interés de la muestra. La primera se toma utilizando un filtro que deja pasar unos componentes luminosos procedentes de la parte supercrítica de la emisión de luz. La segunda se toma con un filtro que actúa de modo diferente al primer filtro
15 sobre todos o parte de los componentes supercríticos de la señal recogida, y sustancialmente de modo idéntico sobre los componentes críticos o subcríticos de la señal recogida. En la etapa b), se combinan las dos zonas de imagen calculando para cada píxel el valor absoluto de la diferencia entre la primera y la segunda zonas de imagen. Este resultado representa una intensidad, la de la zona de la imagen útil. La ventaja de este modo de realización reside en la simplicidad de la combinación de las zonas de imagen, es decir la simplicidad y la rapidez de los cálculos.
Según un modo particular, se pueden atenuar en las dos zonas de imagen de manera idéntica parcialmente todos o parte de los componentes luminosos de la señal luminosa recogida procedente de los componentes luminosos críticos o subcríticos de la emisión de luz. Esto es importante cuando la luz procedente de las radiaciones subcríticas
25 es muy grande frente a las procedentes de las radiaciones supercríticas.
En general, los filtros utilizados respetan la simetría de revolución y tratan de la misma manera los componentes luminosos de la señal luminosa recogida procedentes de los componentes luminosos de la emisión de luz que forman el mismo ángulo θ. En efecto, una modulación sobre el azimut de los componentes de la luz emitida no presenta mucho interés. Por el contrario, el hecho de no modular sobre el azimut permite no introducir astigmatismo en la zona de imagen útil.
Si la muestra evoluciona en el tiempo (por ejemplo una membrana celular) con un tiempo característico dado, se toman unas zonas de imágenes sucesivas (bastante representativas de la muestra en profundidad) con un periodo
35 inferior a la mitad del tiempo característico (cadencia de video) de manera que puedan seguirse estas evoluciones. El método permite normalmente obtener las zonas de imágenes útiles (bastante representativas de la interfaz de la muestra) con la misma cadencia que la de las zonas de imagen sucesivas, es decir a la cadencia de video y no a la mitad de la cadencia de video como en el método descrito por el documento FR-A-2943428.
El añadido de un diafragma en el plano focal posterior del objetivo y/o en un plano conjugado puede realizarse de manera simple y particularmente ponerse en práctica con unos microscopios comerciales. Da como resultado un dispositivo cuyo coste de la mejora es muy modesto.
La función del diafragma consiste en ocultar los componentes luminosos de la señal luminosa recogida procedentes
45 de los componentes luminosos de la emisión de luz de la muestra en las direcciones angulares θ superiores o iguales a un cierto ángulo que depende de la apertura del diafragma. Las figuras 5a y 5b recuerdan los principios de emisión de fluorescencia. Una ventaja del método es que la información subcrítica está siempre disponible en las zonas de imagen utilizadas para la combinación. Esta información es frecuentemente interesante, porque está vinculada a las regiones más internas de la muestra.
Surgirán otras particularidades y ventajas de la presente invención en la descripción que sigue a continuación de ejemplos de realizaciones no limitativas, en referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
55
- -
- la figura 1 ilustra una vista esquemática de un dispositivo de microscopía que permite implementar un método según la invención;
- -
- la figura 2 ilustra una variante según la invención del dispositivo según la figura 1, adaptado a la microscopía confocal;
- -
- la figura 3 ilustra una variante según la invención del dispositivo según la figura 1, adaptado a la microscopía TIRF;
65 -la figura 4 ilustra un ejemplo de filtro para la implementación de un método según la invención;
7
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