ES2895573T3

ES2895573T3 - Disposición óptica para obtener imágenes de una muestra

Info

Publication number: ES2895573T3
Application number: ES14802080T
Authority: ES
Inventors: Lars Hufnagel; Uros Krzic
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2022-02-21
Anticipated expiration: 2034-11-24
Also published as: JP2017500603A; CN105765438A; DK3074807T3; GB201320733D0; US20160363750A1; WO2015075246A1; EP3074807B1; US10983320B2; PT3074807T; EP3074807A1; GB2520541A; EP3936921A1; JP2021107926A

Abstract

Una disposición óptica (10) para obtener imágenes de una muestra (20) montada en un soporte de muestra (23), que comprende: - una fuente de radiación (36) adaptada para generar un patrón de luz (62); - una lente de objetivo de iluminación (30) adaptada para producir una iluminación (40) en la muestra (20) a partir del patrón de luz (62), en donde la iluminación (40) es una hoja de luz, una línea de luz o una matriz de líneas de luz; - una lente de objetivo de detección (50) adaptada a captar imagen de radiación (60) de la muestra (20); y - un espejo móvil (70) adaptado para ser trasladado en una dirección que se encuentra en un plano formado por la trayectoria de iluminación del patrón de luz (62) y un eje central (32) de la lente de objetivo de iluminación (30), a fin de provocar una traslación del patrón de luz (62) en el plano focal posterior (34) de la lente de objetivo de iluminación (30), para cambiar la dirección, incluyendo una dirección descentrada (38), en donde el patrón de luz (62) se refleja en la lente de objetivo de iluminación (30), de tal manera que la iluminación (40) está situada sustancialmente perpendicular al eje central (52) de la lente de objetivo de detección (50); por lo que el eje central (32) de la lente de objetivo de iluminación (30) está dispuesto alrededor del soporte de muestra (23) en un ángulo obtuso con el eje central (52) de la lente de objetivo de detección (50) alrededor de la montura de muestra (23).

Description

DESCRIPCIÓN

Disposición óptica para obtener imágenes de una muestra

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere a una disposición óptica para obtener imágenes de una muestra.

Antecedentes de la invención

Un microscopio es un instrumento científico que se utiliza para obtener imágenes de objetos, que son demasiado pequeños por sí mismos o que tienen detalles que son demasiado pequeños para ser visibles a simple vista. Hay muchos tipos de microscopios disponibles en el mercado. El más común de estos y el primero en ser inventado es el llamado microscopio óptico, que utiliza luz en un sistema de lentes para ampliar las imágenes de las muestras. La imagen del microscopio óptico se puede ver a través de un ocular o, más comúnmente hoy en día, capturarse por una cámara sensible a la luz para generar una llamada micrografía. Las imágenes fueron capturadas previamente en película fotográfica, pero los desarrollos modernos en cámaras de dispositivo de carga acoplada (CCD) permiten la captura y el almacenamiento de imágenes digitales.

Las fuentes de iluminación utilizadas en los microscopios ópticos se han desarrollado a lo largo de los años y actualmente se dispone de una amplia variedad de fuentes de iluminación, que pueden emitir luz u otros tipos de radiación en diferentes longitudes de onda. Se pueden colocar filtros ópticos entre la fuente de iluminación y la muestra de la que se va a obtener la imagen para restringir la longitud de onda de la radiación que ilumina la muestra.

La microscopía biológica moderna utiliza sondas fluorescentes para obtener imágenes de estructuras específicas dentro de una célula como la muestra. En contraste con la microscopía de luz transiluminada normal, la muestra en microscopía de fluorescencia se ilumina a través de una lente de objetivo con un conjunto estrecho de longitudes de onda de luz. Este conjunto estrecho de longitudes de onda de luz interactúan con fluoróforos en la muestra, que a su vez emiten luz de un longitud de onda diferente. Esta luz emitida/fluorescente se utiliza para construir la imagen de la muestra.

La patente europea EP 1019769 (Carl Zeiss Jena) enseña un microscopio theta confocal compacto que puede usarse como un microscopio con un sistema de objetivo único o de objetivo doble. El microscopio tiene direcciones separadas de iluminación y detección, por lo que la dirección de detección en el objetivo se inclina en un ángulo establecido en relación con la dirección de iluminación. El ángulo establecido se elige de modo que el área de superposición del cono de iluminación y el cono de detección se reduzca en comparación con un microscopio confocal convencional. En la trayectoria óptica entre el objetivo y un plano de imagen del microscopio, se coloca un divisor de haz o reflector para inyectar la luz de iluminación y/o acoplar la luz de detección. El microscopio divulgado en esta patente usa iluminación puntual.

El rendimiento óptico de un microscopio de hoja de luz típico está limitado por restricciones geométricas impuestas por las dimensiones físicas de la lente de objetivo de iluminación y la lente de objetivo de detección. El rendimiento óptico (contraste, resolución óptica y captación de luz) del microscopio de hoja de luz depende de la apertura numérica (NA) de la lente de objetivo de iluminación y la lente de objetivo de detección.

Las figuras 1a y 1b muestran un ejemplo del microscopio de hoja de luz, tal como se conoce en la técnica. Una lente de objetivo de iluminación 30 produce un haz de iluminación 40, que ilumina una muestra 20. La radiación 60 se refleja o emite fluorescencia desde la muestra 20 y entra en la lente de objetivo de detección 50, donde se mide usando un detector (no se muestra) y las imágenes se generan en un ordenador (no se muestra). Los detectores utilizados suelen ser detectores CCD.

La apertura numérica (NA) de la lente de objetivo de detección 50 define el cono máximo de luz que puede entrar en la lente de detección 50. La apertura numérica se define de la siguiente manera: NA = n*sen (0det). El índice de refracción n = 1,33 (agua) para la mayoría de los microscopios de hoja de luz. 0det es la mitad del ángulo del cono máximo de luz que puede entrar o salir de la lente de objetivo de detección 50.

El cono de luz de iluminación 35 de la lente de objetivo de iluminación 30 y el cono de luz de detección 55 de la lente de objetivo de detección 50 pueden no solaparse para disposiciones de hojas de luz perpendiculares. Dicho de otra forma, el ángulo 0íii (medio ángulo del cono de luz de iluminación 35) y 0det (medio ángulo del cono de luz de detección 55) debe ser inferior a 90°. La carcasa mecánica de la lente de objetivo de detección 50 y la lente de objetivo de iluminación 30 normalmente ocupan un cono significativamente mayor que el que se necesita para un valor específico de la apertura numérica. Esto da como resultado una disposición de la lente de objetivo de iluminación 30 y la lente de objetivo de detección 50, que puede ser subóptima.

La Solicitud de Patente Internacional n.° WO 2014/063764 A1 (Karlsruhe Institut für Technologie) muestra un microscopio con una lente de iluminación montada sobre o encima de una mesa de muestras. La lente de iluminación guía al menos un rayo de iluminación en forma de una hoja de luz bidimensional para iluminar una muestra bajo examen que está en la mesa de muestras. Al menos una lente de objetivo de detección está montada debajo de la muestra y detecta un haz de detección reflejado o emitido desde la muestra bajo examen. El eje óptico de la lente de iluminación está dispuesto en un ángulo, mayor de 90° con respecto al eje óptico de la lente de objetivo de detección. El haz de iluminación incide preferentemente sobre la lente de iluminación fuera del eje óptico de la lente de iluminación en un ángulo de incidencia, de manera que la hoja de luz se encuentre dentro del plano de enfoque del objetivo de detección.

La disposición de este microscopio requiere un alto grado de precisión en la disposición de la muestra, la fuente del haz de iluminación y la lente de detección para asegurar que las imágenes de la muestra puedan ser grabadas con precisión por una cámara.

La publicación de patente de EE. UU. n.° US 2012/0320438 A1 (Knebel et. al. asignada a Leica Microsystems GmbH) también enseña un microscopio de barrido que incluye una fuente de luz, una óptica de iluminación y un dispositivo de exploración para mover el foco de iluminación a través de una región objetivo y al hacerlo, variando la dirección de incidencia en la que el haz de iluminación entra en la pupila de entrada de la óptica de iluminación. La lente de iluminación y la lente de objetivo de detección están montadas en un ángulo agudo (de menos de 90°) entre sí, encima de la mesa de muestras y se encuentran en un plano perpendicular al plano de la mesa de muestras.

Sumario de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones 1 y 10.

La divulgación enseña una disposición óptica para obtener imágenes de una muestra, que se monta en un soporte de muestra. La disposición óptica comprende una lente de objetivo de iluminación para producir una iluminación y una lente de objetivo de detección para obtener imágenes de la radiación de la muestra. La lente de objetivo de iluminación y la lente de objetivo de detección están dispuestas alrededor de la montura de muestra en un ángulo obtuso (mayor de 90°) entre sí. En un aspecto de la divulgación, la iluminación tiene la forma de una línea unidimensional proyectada sobre la muestra.

La lente de objetivo de iluminación y la lente de objetivo de detección están situadas en un plano sustancialmente horizontal.

En un aspecto de la divulgación, la disposición óptica comprende además una cámara colocada en una dirección normal al plano de la lente de objetivo de iluminación y la lente de objetivo de detección que coopera con un generador de haz de iluminación trasladable, situado en el plano posterior de la lente de objetivo de iluminación para asegurar que la muestra esté iluminada con la hoja de luz de iluminación paralela al eje óptico de la lente de objetivo de detección. Un procesador de control está conectado tanto a la cámara como al generador de haz de iluminación trasladable para actuar como un bucle de retroalimentación, de modo que la hoja de luz de iluminación esté en la posición correcta.

Un aspecto adicional de la divulgación tiene una lente de detección adicional, que está dispuesta en otro ángulo no perpendicular a la lente de iluminación. En este aspecto adicional, la lente de detección adicional, la lente de objetivo de detección y la lente de objetivo de iluminación están dispuestas aproximadamente en un ángulo equiangular entre sí.

Las lentes de objetivo se pueden utilizar alternativamente como una lente de objetivo de iluminación o una lente de objetivo de detección.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra una disposición óptica, tal como se conoce en la técnica. La figura 1a es una vista general y la figura 1b es una vista en despiece de los conos de luz de la lente de objetivo de detección y de la lente de objetivo de iluminación.

La figura 2 muestra una disposición óptica de esta divulgación. La figura 2a es una descripción general de la disposición óptica. La figura 2b muestra una vista en despiece de los conos de luz de la lente de objetivo de iluminación y de la lente de objetivo de detección.

La figura 3 muestra un ejemplo de una fuente de luz que se refleja en la lente de objetivo de iluminación.

La figura 4 muestra un ejemplo de tres lentes de objetivo que se pueden usar como lentes del objetivo de iluminación y lentes del objetivo de detección.

Descripción detallada de la invención

Ahora se describirá la invención sobre la base de los dibujos. Se entenderá que las realizaciones y los aspectos de la invención descritos en el presente documento son solo ejemplos y no limitan el alcance de protección de las reivindicaciones de ninguna manera. La invención se define por las reivindicaciones y sus equivalentes. Se entenderá que las características de un aspecto o realización de la invención se pueden combinar con una característica de un aspecto o aspectos y/o realizaciones diferentes de la invención.

La figura 2a muestra un ejemplo de una disposición óptica 10 de acuerdo con un aspecto de esta divulgación. Una lente de objetivo de iluminación 30 genera una hoja de luz de iluminación 40, que ilumina una muestra 20 en un soporte de muestra 22. La lente de objetivo de iluminación 30 tiene un cono de luz de iluminación 35 y un eje central 32. Una lente de objetivo de detección 50 recibe radiación radiada o fluorescente de la muestra 20 dentro de un cono de luz de detección 55 y tiene un eje 52. La lente de objetivo de iluminación 30 y la lente de objetivo de detección 50 están sumergidas en la misma cámara con el mismo medio de inmersión 22 y están dispuestas alrededor del soporte de muestra 23 (que no separa el medio de inmersión 22 de la lente de objetivo de iluminación 30 y de la lente de objetivo de detección 50). La figura 2b muestra una vista en despiece del área alrededor de la muestra 20. Puede verse que la lente de objetivo de iluminación 30 está dispuesta en un ángulo no perpendicular a la lente de objetivo de detección 50. En particular, el plano de la hoja de luz de iluminación 40 está en un ángulo no perpendicular al eje central 52 de la lente de objetivo de detección 50. El eje no perpendicular es mayor de 90°. En otro aspecto, de la invención, la lente de objetivo de iluminación 30 genera una línea o una matriz de líneas (iluminación unidimensional), que se puede escanear a través de la muestra 20 moviendo el soporte de muestra 22.

La muestra 20 se sumerge en un medio de inmersión 22 y se monta en un soporte de muestra 23. El medio de inmersión 22 y el material del que están hechos el soporte de muestra 23 tienen el mismo índice de refracción. En un ejemplo no limitativo de la disposición óptica 10, el medio de inmersión 22 es agua y el material del soporte de muestra 23 es etileno propileno fluorado (FEP).

La radiación reflejada o fluorescente que entra en la lente de objetivo de detección 50 se forma en un detector 100 y las imágenes se procesan en un procesador 110 conectado al detector 100. El detector puede ser un detector CCD, pero esto no es limitativo de la invención.

La figura 3 muestra la lente de objetivo de iluminación 30 con más detalle. Una fuente de radiación 36 genera un patrón de luz 62 en el plano focal posterior 34 de la lente de objetivo de iluminación 30. Este patrón de luz 62 da como resultado una hoja de luz 40 o una línea escaneada en la muestra 20.

Un espejo móvil 70 refleja el patrón de luz 62 desde la fuente de radiación 36 hacia la parte trasera de la lente de objetivo de iluminación 30 en una dirección descentrada 38, que está fuera del eje central 32 de la lente de objetivo de iluminación 30. El espejo móvil 70 se puede trasladar en una dirección que se encuentra en un plano formado por la trayectoria de iluminación del patrón de luz 62 y la trayectoria de luz reflejada a lo largo del eje central 32 de la lente de objetivo de iluminación 30 para cambiar la dirección en la que el patrón de luz 62 se refleja en la parte trasera del objetivo de iluminación 30. La traslación del patrón de luz 62 en el plano focal posterior 34 hace que la hoja de luz (o línea escaneada) 40 gire en el espacio del objeto, de manera que la hoja de luz 40 en la muestra 20 ilumine la muestra 20 en un ángulo sustancialmente perpendicular al eje central 52 de la lente de objetivo de detección 50. Esta traslación del espejo móvil 70 se puede controlar manualmente o mediante el uso de un escenario motorizado 90.

La alineación de la hoja de luz 40 (o la línea escaneada) es monitorizada por una cámara 80 que está colocada perpendicularmente respecto al plano tanto de la lente de objetivo de iluminación 30 como de la lente de objetivo de detección 50.

La cámara 80 toma imágenes del haz de iluminación por emisión de fluorescencia de una solución de fluoróforo o por dispersión de luz en el medio de inmersión 22 (normalmente agua, como se ha observado anteriormente, pero también, por ejemplo, aire o aceite) de la muestra 20. El análisis automático de la imagen ejecutado por un procesador de control 95 conectado a la cámara 80 y al escenario motorizado 90 puede usarse para determinar una diferencia angular entre un plano de iluminación y un plano del objeto de la cámara. Esta diferencia angular se puede minimizar mediante un bucle de control por ordenador 93.

Ejemplo 1

Se utilizan lentes del objetivo de detección 30 y lentes de objetivo de iluminación 50 Nikon 25x (o 100x). El ángulo entre el eje central 32 de la lente de objetivo de iluminación 30 y el eje central 52 de la lente de objetivo de detección 50 era de 120°. Una configuración estándar de hoja de luz para iluminación tenía un valor NA de 0,3. Una configuración de hoja de luz inclinada de acuerdo con las enseñanzas de esta divulgación tenía una apertura numérica de 0,6.

Ejemplo 2

Se utilizó una lente de objetivo de detección 50 Nikon 25x (o 100x) con una lente de objetivo de iluminación 30 de 16x. El ángulo entre el eje central 32 de la lente de objetivo de iluminación 30 y el eje 52 de la lente de objetivo de detección 50 era de 105°. Una hoja de luz que usa la disposición óptica 10 de esta divulgación tenía una apertura numérica de 0,6, en comparación con una apertura numérica del punto 0,3 para la disposición óptica de la técnica anterior.

Ejemplo 3

Las lentes del objetivo Nikon 25x (o 100x) se utilizaron alternativamente como lentes del objetivo de detección 50 y lentes del objetivo de iluminación 30. Esto arrojó un total de seis vistas de la misma muestra 20, sin girar o mover de otro modo la muestra 20. Las seis imágenes diferentes se pueden procesar luego en un ordenador para obtener una vista tridimensional de la muestra o de las tareas. Esto se muestra en la figura 4, en la que se muestra otra lente de objetivo 57 y las tres lentes del objetivo 30, 50 y 57 están dispuestas sustancialmente a 120° entre sí. La lente de objetivo 57 adicional también está montada en el mismo plano que la lente de objetivo de detección 50 y la lente de objetivo de iluminación 30.

Números de referencia

10 Disposición óptica

20 Muestra

22 Medio de inmersión

23 Soporte de muestra

30 ^{Lente del objetivo de}

_iluminación

32 Eje central

34 Plano focal posterior

36 Fuente

38 Dirección descentrada

Hoja de luz de iluminación

Lente del objetivo de

detección

52 Eje

55 Cono de luz de detección

57 Lente del objetivo adicional

60 Fuente de radiación

62 Patrón de luz

70 Espejo móvil

80 Cámara

90 Escenario motorizado

95 Procesador de control

100 Detector

110 Procesador de imágenes

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una disposición óptica (10) para obtener imágenes de una muestra (20) montada en un soporte de muestra (23), que comprende:

- una fuente de radiación (36) adaptada para generar un patrón de luz (62);

- una lente de objetivo de iluminación (30) adaptada para producir una iluminación (40) en la muestra (20) a partir del patrón de luz (62), en donde la iluminación (40) es una hoja de luz, una línea de luz o una matriz de líneas de luz;

- una lente de objetivo de detección (50) adaptada a captar imagen de radiación (60) de la muestra (20); y - un espejo móvil (70) adaptado para ser trasladado en una dirección que se encuentra en un plano formado por la trayectoria de iluminación del patrón de luz (62) y un eje central (32) de la lente de objetivo de iluminación (30), a fin de provocar una traslación del patrón de luz (62) en el plano focal posterior (34) de la lente de objetivo de iluminación (30), para cambiar la dirección, incluyendo una dirección descentrada (38), en donde el patrón de luz (62) se refleja en la lente de objetivo de iluminación (30), de tal manera que la iluminación (40) está situada sustancialmente perpendicular al eje central (52) de la lente de objetivo de detección (50);

por lo que el eje central (32) de la lente de objetivo de iluminación (30) está dispuesto alrededor del soporte de muestra (23) en un ángulo obtuso con el eje central (52) de la lente de objetivo de detección (50) alrededor de la montura de muestra (23).

2. La disposición óptica de la reivindicación 1, en la que la lente de objetivo de iluminación (30) y la lente de objetivo de detección (50) están situadas en un plano sustancialmente horizontal.

3. La disposición óptica (10) de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además una cámara (80) posicionada en una dirección normal al plano de la lente de objetivo de iluminación (30) y la lente de objetivo de detección (50).

4. La disposición óptica (10) de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el espejo móvil (70) se puede trasladar por medio de un escenario motorizado (90).

5. La disposición óptica de las reivindicaciones 3 o 4, que comprende además un procesador de control (95) conectado a la cámara (80) y/o al escenario motorizado (90).

6. La disposición óptica (10) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una lente de detección adicional (57) dispuesta en otro ángulo no perpendicular respecto a la lente de iluminación (30) alrededor del soporte de muestra (22).

7. La disposición óptica (10) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una pluralidad de lentes de objetivo (30, 50, 57) que se pueden usar alternativamente como una lente de objetivo de iluminación (30) y una lente de objetivo de detección (50, 57).

8. La disposición óptica (10) de la reivindicación 7, en la que tres de la pluralidad de lentes de objetivo (30, 50, 57) están dispuestas aproximadamente a 120° entre sí y forman la pluralidad de lentes de objetivo (30, 50, 57).

9. La disposición óptica (10) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un procesador de imágenes (110) conectado a un detector (100) en la lente de objetivo de iluminación (30).

10. Un procedimiento para obtener imágenes de una muestra (20) en una disposición óptica que comprende una lente de objetivo de iluminación (30) para producir una iluminación (40) a partir de un patrón de luz (62) generado por una fuente de radiación (36), una lente de objetivo de detección (50) para obtener imágenes de la radiación (60) de la muestra (20) en un medio de inmersión (22), y un espejo móvil (70) que se puede trasladar en una dirección que se encuentra en un plano formado por la trayectoria de iluminación del patrón de luz (62) y un eje central (32) de la lente objetivo de iluminación (30), con el fin de provocar una traslación del patrón de luz (62) en el plano focal posterior (34) de la lente de objetivo de iluminación (30) para cambiar la dirección, incluyendo una dirección descentrada (38), en donde el patrón de luz (62) se refleja en la lente de objetivo de iluminación (30), en donde la iluminación (40) es una hoja de luz, una línea de luz, o una matriz de líneas de luz, y el eje central (32) de la lente de objetivo de iluminación (30) y el eje central (52) de la lente de objetivo de detección (30) están dispuestos en un ángulo obtuso entre sí, comprendiendo el procedimiento:

- generar el patrón de luz (62);

- producir con la lente de objetivo de iluminación (30) la iluminación (40) en la muestra (20) a partir del patrón de luz (62);

- dirigir el patrón de luz (62) hacia la parte trasera de la lente de objetivo de iluminación (30);

- obtener imágenes con la radiación de la lente de objetivo de detección (50) de la muestra (20); y

- cambiar la posición en la que el patrón de luz (62) se refleja en la lente de objetivo de iluminación (30), de manera que la iluminación (40) está colocada sustancialmente perpendicular al eje central (52) de la lente de objetivo de detección (50).

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en donde la radiación de la muestra (20) es captada por una cámara (80) que proporciona señales a un procesador de control (95) y el procesador de control (95) controla el direccionamiento del patrón de luz (62).

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el procesador de control (95) controla la posición del espejo móvil (70).